Специальные среды.

В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин). Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышлен­ность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.

Термостаты

Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.

Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется тер­морегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.

ЗАНЯТИЕ 7

ТЕМА: МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ. ЭТАПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ МЕХАНИЧЕСКОГО РАЗОБЩЕНИЯ

План занятия

1. Понятие «чистая культура» бактерий

2. Методы выделения чистых культур путем механического разобщения

3. Биологические методы выделения чистых культур

4. Методы идентификации бактерий

Цель занятия: Ознакомить студентов с различными методами выделения чистых культур, научить делать посевы петлей, штрихами, уколом

Методические указания к демонстрации

В естественной среде обитания бактерии находятся в ассоциациях. С целью определения свойств микробов, их роли в развитии патологического процесса необходимо иметь бактерии в виде однородных по­пуляций (чистых культур). Чистая культура - это совокупность бак­териальных особей одного вида, выращенная на питательной среде.

Методы выделения чистых культур аэробных бактерий

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых разводок)

Значение)

Химический Метод

Щукевича

Современные

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур:

1. Методы механического разобщения, основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясопептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри.

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2-3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами.

2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии), в других случаях - он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика приготовления пластинчатого агара

МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10-15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.

Посев петлей

Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5-6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.

Посев по методу Дригальского

Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3-4). Шпатель – это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.

Если на основании определенных симптомов на растениях и по результатам микроскопического исследования возникло предположение, что возбудителем болезни является бактерия, следующим шагом должно быть ее выделение.

При этом исходят из того, что возбудитель загрязнен сопутствующими организмами, т. е. налицо смешанная популяция. Чтобы получить возбудителя в виде отдельной растущей колонии, мацерат ткани следует посеять на среду штрихом.

Посев штрихом . Прокаленной инокуляционной петлей берут небольшое количество содержащего бактерии мацерата растительной ткани и легкими движениями, не повреждая поверхности агара, наносят на подготовленную питательную среду 4-6 штрихами. Повторно прокалив петлю, чашку со средой поворачивают на 90° вправо и затем от второго штриха наносят еще 4-6 штрихов, вновь прокаливают иглу и проводят третий посев. Этим достигается такое разведение исходного материала, при котором бактерии после инкубации в термостате в течение 48-72 ч при 28 °С формируют отдельные колонии различной формы и окраски. Затем колонии переносят для дальнейшего исследования в пробирки с косым агаром. Прокаленной петлей берут колонию и осторожным движением в виде змейки или зигзага наносят на питательный агар.

Метод разлива в чашки по Коху . Метод разлива в чашки по Коху обеспечивает формирование каждой колонии из одной единственной бактериальной клетки. Лучше всего приготовить из исходного материала суспензию в стерильной воде и применять метод Коха только с этим разведением. Небольшое количество суспензии переносят в первую пробирку с питательной средой, охлажденной до 60 °С. Затем содержимое пробирки перемешивают с инокулюмом, вращая ее между ладонями. Далее, берут вторую пробирку, осторожно открывают над пламенем горелки и большими петлями переносят в нее из первой пробирки три порции субстрата. Содержимое пробирки после обжига горлышка и пробки выливают в первую чашку Петри, приоткрывая крышку чашки ровно настолько, чтобы ввести под нее горлышко пробирки. Сразу после выливания чашку закрывают и осторожными движениями равномерно распределяют питательную среду.

Тщательно перемешав содержимое второй пробирки, берут третью пробирку и петлей переносят в нее из второй шесть порций субстрата. Содержимое пробирки выливают в чашку, а содержимое пробирки после перемешивания - в чашку. Чашки со средой инкубируют в термостате при 28°С, через несколько дней содержавшиеся в исходном материале бактерии формируют колонии.

Последовательное разведение . Если, например, необходимо изолировать бактерии из почвы, то используют последовательное разведение. Стерильную питательную среду (15 мл на чашку) разливают по чашкам, на затвердевший агар наносят по 0,1 мл последних трех разведений суспензии и стеклянным шпателем распределяют по поверхности.

Для выделения бактерий 1 г почвы суспендируют в 9 мл воды, хорошо взбалтывают, дают несколько секунд отстояться и из суспензии готовят последовательные разведения. С помощью этого метода можно определить число микроорганизмов в каждой пробе.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Метод Пастера Метод Коха Биологический Физический

(имеет историческое (пластинчатых

значение) разводок) Химический Метод Щукевича

Современные

Посев петлей Посев шпателем

(Метод Дригальского)

Методы выделения чистых культур (схема 11):

1. Методы механического разобщения основаны на разъединении микробов путем последовательного растирания исследуемого материа­ла по поверхности агара.

а) Метод Пастера – имеет историческое значение, предусматривает последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде методом переката

б) Метод Коха – метод пластинчатых разводок – основан на последовательном разведении исследуемого материала мясо-пептонным агаром с последующей разливкой пробирок с разведенным материалом в чашки Петри

в) Метод Дригальского – при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, используют 2–3 чашки для последовательного посева шпателем.

г) Посев петлей параллельными штрихами .

2. Биологические методы основаны на биологических свойствах возбудителей.

а) Биологический – заражение высокочувствительных животных, где микробы быстро размножаются и накапливаются. В одних случаях, этот метод является единственным, позволяющим вы­делить культуру возбудителя от больного человека (например, при туляремии),в других случаях – он более чувствителен (например, выделение пневмококка на белых мышах или воз­будителя туберкулеза на морских свинках).

б) Химический – основан на кислотоустойчивости микобактерий. Для освобождения материала от сопутствующей флоры, его
обрабатывают раствором кислоты. Вырастут только туберкулезные палочки, так как кислотоподатливые микробы погибли под действием кислоты.

в) Физический метод основан на устойчивости спор к нагреванию. Для выделения культуры спорообразующих бактерий из
смеси материал прогревают при 80°С и засевают на питательную среду. Вырастут только споровые бактерии, так как споры их остались живыми и дали рост.

г) Метод Щукевича – основан на высокой подвижности вуль­гарного протея, способного давать ползучий рост.

Методика пересева из колоний на скошенный агар и МПБ:

а) Пересев из колоний на скошенный агар

Приоткрывают крышку чашки, прокаленной остуженной петлей снимают часть отдельной колонии, открывают пробирку со стерильным скошенным агаром, держа ее в левой руке в наклонном положении, так, чтобы можно было наблюдать поверхность среды. Переносят петлю с культурой в пробирку, не прикасаясь к стенкам, растирают по питательной среде, скользя по поверхности от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи до верхушки среды – посев штрихом. Пробирку закрывают и, не выпуская из рук, подписывают название посеянного микроба и дату посева.

б) Пересев из колонии на мясо-пептонный бульон

Техника пересева на МПБ в основном такая же, как и при посеве на плотную среду. При посеве на МПБ петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый стерильной пастеровской или градуированной пипеткой, вливают в питательную среду.

В результате самостоятельной работы студент должен знать:

1. Методы выделения чистой культуры микроорганизмов

2. Методы культивирования микроорганизмов

Уметь:

1. Навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности

2. Обеззараживать материал, проводить обработку рук

3. Приготовить препараты из колоний бактерий

4. Микроскопировать колоний

5. Окрашивать по Граму микроорганизмы

ЗАНЯТИЕ 8

ТЕМА. Методы выделения чистых культур (продолжение). Ферментативная активность бактерий и методы ее изучения.

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений ). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха ), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха ). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов.

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 4.2, А ). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 4.2, Б ). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 4.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 4.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.

Рисунок 4.2 – Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний

Последовательные разведения в твердой среде – самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром, среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15–20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.

Чистой культурой считается совокупность микроорганизмов, принадлежащих к одному виду. Получение данного материала является необходимым моментом исследования в выполнении лабораторных диагностических методик. Для выделения чистых культур бактерий используют мазки из крови, мокроты, фекалий, исследуют гнойный, а также другой биологический материал. В естественных условиях (в воздухе, воде, почве), продуктах пищевого назначения, в трупах (человеческих, животных) содержатся ассоциации различных видов микроорганизмов.

Отделение чистой культуры важно для подробного изучения свойств микробов: морфологических, культуральных, биохимических, а также антигенных. По результатам данных методик исследования можно установить принадлежность возбудителя к определенному виду и типу, иными словами, выполнить его идентификацию.

Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.

1. Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
2. Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
3. Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
4. Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
5. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
6. Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
7. Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
8. Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Методики проведения оценки возбудителя

Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.

Методика Пастера

Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.

Методика Коха

Известна также как методика «пластинчатых разводок». Представляет собой разведение материала для исследования в агаре (в расплавленном состоянии с температурой 48-50°С). Далее полученный состав разливают по чашкам Петри, где он должен застыть.

Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.

Методика Шукевича

Используется при необходимости выделить чистую культуру аэробов протея либо каких-либо других микробов, характеризующихся «ползучим» ростом. Сеют культуры на воду, конденсированную у основания скошенного агара.

При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.

Методика Дригальского

Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.

Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.

Методика Вейнберга

Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.

При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.

Методика Хангейта

Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.

Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.

Микроманипулятор

Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.

Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.