RASTERSONDENMIKROSKOPE: ARTEN UND FUNKTIONSPRINZIP

Kuvaytsev Alexander Wjatscheslawowitsch
Dimitrovgrad Institute of Engineering and Technology Branch der National Research Nuclear University "MEPhI"
Schüler

Anmerkung
Dieser Artikel beschreibt das Funktionsprinzip eines Sondenmikroskops. Dies ist eine grundlegend neue Technologie, die Probleme in so unterschiedlichen Bereichen wie Kommunikation, Biotechnologie, Mikroelektronik und Energie lösen kann. Die Nanotechnologie in der Mikroskopie wird den Ressourcenverbrauch deutlich reduzieren und die Umwelt nicht belasten, sie wird eine führende Rolle im Leben der Menschheit einnehmen, da beispielsweise der Computer aus dem Leben der Menschen nicht mehr wegzudenken ist.

RASTERSONDENMIKROSKOPIE: ARTEN UND FUNKTIONSPRINZIPIEN

Kuvaytsev Aleksandr Wjatscheslawowitsch
Dimitrovgrad Engineering and Technological Institute der National Research Nuclear University MEPHI
Schüler

Abstrakt
Dieser Artikel beschreibt das Prinzip eines Sondenmikroskops. Es ist eine neue Technologie, die Probleme in so unterschiedlichen Bereichen wie Kommunikation, Biotechnologie, Mikroelektronik und Energie lösen kann. Nanotechnologie in der Mikroskopie wird den Ressourcenverbrauch deutlich reduzieren und die Umwelt nicht belasten, sie wird eine führende Rolle im menschlichen Leben einnehmen, da beispielsweise der Computer aus dem Leben der Menschen nicht mehr wegzudenken ist.

Im 21. Jahrhundert erfreuen sich Nanotechnologien großer Beliebtheit, die in alle Bereiche unseres Lebens vordringen, aber ohne neue experimentelle Forschungsmethoden, von denen eine der aufschlussreichsten ist, die Methode der Rastersondenmikroskopie, gäbe es keinen Fortschritt wurde 1986 von den Nobelpreisträgern Prof. Heinrich Rohrer und Dr. Gerd Binnig erfunden und vertrieben.

Mit dem Aufkommen von Methoden zur Visualisierung von Atomen fand in der Welt eine echte Revolution statt. Gruppen von Enthusiasten tauchten auf und entwarfen ihre eigenen Geräte. Als Ergebnis wurden mehrere erfolgreiche Lösungen zur Visualisierung der Ergebnisse der Wechselwirkung der Sonde mit der Oberfläche erhalten. Technologien zur Herstellung von Sonden mit den erforderlichen Parametern wurden geschaffen.

Was ist also ein Sondenmikroskop? Das ist zunächst die Sonde selbst, die die Oberfläche der Probe untersucht, außerdem ist ein System zur Bewegung der Sonde relativ zur Probe in zweidimensionaler oder dreidimensionaler Darstellung (Bewegung entlang X-Y- oder X-Y-Z-Koordinaten) erforderlich. All dies wird durch ein Aufzeichnungssystem ergänzt, das den Wert einer Funktion festlegt, die vom Abstand der Sonde zur Probe abhängt. Das Registrierungssystem legt fest und merkt sich den Wert einer der Koordinaten.

Die Haupttypen von Rastersondenmikroskopen lassen sich in 3 Gruppen einteilen:

1. Rastertunnelmikroskop - entwickelt, um das Relief von leitfähigen Oberflächen mit hoher räumlicher Auflösung zu messen.
   Beim STM wird eine scharfe Metallnadel in sehr kurzer Entfernung über die Probe geführt. Wenn ein kleiner Strom an die Nadel angelegt wird, entsteht zwischen ihr und der Probe ein Tunnelstrom, dessen Wert vom Aufzeichnungssystem aufgezeichnet wird. Die Nadel wird über die gesamte Oberfläche der Probe geführt und erfasst die kleinste Änderung des Tunnelstroms, wodurch eine Reliefkarte der Probenoberfläche entsteht. Das STM ist das erste einer Klasse von Rastersondenmikroskopen, der Rest wurde später entwickelt.
2. Rasterkraftmikroskop - wird verwendet, um die Oberflächenstruktur der Probe mit einer Auflösung von bis zu Atomen aufzubauen. Im Gegensatz zum STM können mit diesem Mikroskop sowohl leitfähige als auch nicht leitfähige Oberflächen untersucht werden. Aufgrund der Fähigkeit, Atome nicht nur zu scannen, sondern auch zu manipulieren, wird es Macht genannt.
3. Ein optisches Nahfeldmikroskop ist ein "fortgeschrittenes" optisches Mikroskop, das eine bessere Auflösung als ein herkömmliches optisches Mikroskop bietet. Eine Erhöhung der Auflösung der Stückliste wurde erreicht, indem Licht vom untersuchten Objekt in Abständen kleiner als die Wellenlänge erfasst wurde. Ist die Sonde des Mikroskops mit einer Einrichtung zum Scannen des Raumfeldes ausgestattet, so wird ein solches Mikroskop als optisches Rastermikroskop des Nahfeldes bezeichnet. Ein solches Mikroskop ermöglicht es, Bilder von Oberflächen mit sehr hoher Auflösung zu erhalten.

Das Bild (Abb. 1) zeigt das einfachste Schema des Sondenmikroskops.

Abbildung 1. - Funktionsschema eines Sondenmikroskops

Seine Arbeit basiert auf der Wechselwirkung der Probenoberfläche mit einer Sonde, dies kann ein Cantilever, eine Nadel oder eine optische Sonde sein. Mit einem geringen Abstand zwischen Sonde und Untersuchungsobjekt können die Wirkungen von Wechselwirkungskräften wie Abstoßung, Anziehung usw. und die Manifestation von Effekten wie Elektronentunneln mit Registrierungswerkzeugen aufgezeichnet werden. Um diese Kräfte zu erfassen, werden sehr empfindliche Sensoren verwendet, die kleinste Veränderungen erkennen können. Als Koordinaten-Abtastsystem werden Piezoröhren oder planparallele Scanner verwendet, um ein Rasterbild zu erhalten.

Zu den wichtigsten technischen Schwierigkeiten bei der Herstellung von Rastersondenmikroskopen gehören:

1. Gewährleistung der mechanischen Integrität
2. Detektoren müssen eine maximale Empfindlichkeit aufweisen
3. Das Ende der Sonde muss eine Mindestabmessung haben
4. Erstellen Sie ein Sweep-System
5. Gewährleistung der Glätte der Sonde

Fast immer ist das von einem Rastersondenmikroskop erhaltene Bild aufgrund von Verzerrungen beim Erhalten der Ergebnisse schwer zu entziffern. In der Regel ist eine zusätzliche mathematische Bearbeitung erforderlich. Dazu wird spezialisierte Software verwendet.

Derzeit werden Rastersonden- und Elektronenmikroskopie aufgrund einer Reihe physikalischer und technischer Merkmale als komplementäre Forschungsmethoden eingesetzt. Der Einsatz der Sondenmikroskopie hat in den vergangenen Jahren einzigartige wissenschaftliche Erkenntnisse in den Bereichen Physik, Chemie und Biologie ermöglicht. Die ersten Mikroskope waren nur Geräte - Indikatoren, die bei der Forschung halfen, und moderne Proben sind vollwertige Arbeitsplätze, einschließlich bis zu 50 verschiedener Forschungsmethoden.

Die Hauptaufgabe dieser fortschrittlichen Technik besteht darin, wissenschaftliche Ergebnisse zu erzielen, aber die Anwendung der Fähigkeiten dieser Geräte in der Praxis erfordert eine hohe Qualifikation eines Spezialisten.

7. Anwendung eines Rastersondenmikroskops zur Untersuchung biologischer Objekte

7. Anwendung eines Rastersondenmikroskops zur Untersuchung biologischer Objekte 1

7.1. Arbeitsziele 2

7.2. Informationen für den Lehrer 3

7.4. Richtlinien 31

7.5. Sicherheit 32

7.6. Aufgabe 32

7.7. Sicherheitsfragen 32

7.8. Literatur 32

Die Laborarbeit wurde von der Staatlichen Universität Nischni Nowgorod entwickelt. N.I. Lobatschewski

7.1 Ziele der Arbeit

Die Untersuchung der morphologischen Parameter biologischer Strukturen ist eine wichtige Aufgabe für Biologen, da die Größe und Form einiger Strukturen weitgehend ihre physiologischen Eigenschaften bestimmen. Durch den Vergleich morphologischer Daten mit funktionellen Merkmalen kann man vollständige Informationen über die Beteiligung lebender Zellen an der Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichts des menschlichen oder tierischen Körpers erhalten.

Bisher hatten Biologen und Mediziner die Möglichkeit, ihre Präparate nur auf Licht- und Elektronenmikroskopen zu untersuchen. Diese Untersuchungen ergaben ein gewisses Bild der Morphologie von fixierten, gefärbten und durch Sputtern erhaltenen dünnen Metallbeschichtungen. Es war nicht möglich, die Morphologie lebender Objekte zu studieren, ihre Veränderungen unter dem Einfluss verschiedener Faktoren, aber es war sehr verlockend.

Die Rastersondenmikroskopie (SPM) hat neue Möglichkeiten bei der Untersuchung von Zellen, Bakterien, biologischen Molekülen und DNA unter möglichst naturnahen Bedingungen eröffnet. Mit SPM können Sie biologische Objekte ohne spezielle Fixiermittel und Farbstoffe an der Luft oder sogar in einem flüssigen Medium untersuchen.

Derzeit wird SPM in einer Vielzahl von Disziplinen eingesetzt, sowohl in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung als auch in angewandten Hightech-Entwicklungen. Viele Forschungsinstitute des Landes sind mit Sondenmikroskopiegeräten ausgestattet. Dabei wächst die Nachfrage nach hochqualifizierten Fachkräften stetig. Um dieser Anforderung gerecht zu werden, hat NT-MDT (Zelenograd, Russland) ein spezialisiertes pädagogisches und wissenschaftliches Labor für Rastersondenmikroskopie entwickelt NanoEducator.

SPM NanoEducator speziell für Studenten zur Durchführung von Laborarbeiten konzipiert. Dieses Gerät richtet sich an ein studentisches Publikum: Es wird vollständig von einem Computer gesteuert, verfügt über eine einfache und intuitive Benutzeroberfläche, Animationsunterstützung, beinhaltet die schrittweise Entwicklung von Techniken, das Fehlen komplexer Einstellungen und kostengünstiger Verbrauchsmaterialien.

In dieser Laborarbeit lernen Sie die Rastersondenmikroskopie kennen, lernen ihre Grundlagen kennen, studieren den Aufbau und die Prinzipien der Ausbildung SPM NanoEducator, lernen Sie, wie Sie biologische Präparate für die Forschung vorbereiten, machen Sie Ihr erstes SPM-Bild eines Komplexes von Milchsäurebakterien und lernen Sie die Grundlagen der Verarbeitung und Präsentation von Messergebnissen kennen.

7.2 Informationen für Lehrer 1

Die Laborarbeit wird in mehreren Schritten durchgeführt:

1. Die Probenvorbereitung erfolgt durch jeden Schüler individuell.

2. Die Aufnahme des ersten Bildes erfolgt auf einem Gerät unter Aufsicht eines Lehrers, dann untersucht jeder Schüler seine Probe selbstständig.

3. Die Bearbeitung der Versuchsdaten durch jeden Studierenden erfolgt individuell.

Probe für die Forschung: Milchsäurebakterien auf einem Deckglas.

Vor Arbeitsbeginn muss eine Sonde mit der charakteristischsten Amplituden-Frequenz-Charakteristik (einfaches symmetrisches Maximum) ausgewählt werden, um ein Bild der Oberfläche der zu untersuchenden Probe zu erhalten.

Der Laborbericht sollte enthalten:

1. theoretischer Teil (Antworten auf Kontrollfragen).

2. Ergebnisse des experimentellen Teils (Beschreibung der Forschung, der erzielten Ergebnisse und der gezogenen Schlussfolgerungen).

1. Methoden zur Untersuchung der Morphologie biologischer Objekte.

2. Rastersondenmikroskop:

SPM-Design;

Sorten von SPM: STM, AFM;

SPM-Datenformat, Visualisierung von SPM-Daten.

3. Probenvorbereitung für SPM-Studien:

Morphologie und Struktur von Bakterienzellen;

Vorbereitung von Präparaten zum Studium der Morphologie mit SPM.

4. Bekanntschaft mit dem Design- und Steuerungsprogramm von SPM NanoEducator.

5. Erhalten eines SPM-Bildes.

6. Verarbeitung und Analyse der empfangenen Bilder. Quantitative Charakterisierung von SPM-Bildern.

Methoden zum Studium der Morphologie biologischer Objekte

Der charakteristische Durchmesser von Zellen beträgt 10  20 µm, Bakterien - von 0,5 bis 3  5 µm, diese Werte sind 5-mal kleiner als das kleinste mit bloßem Auge sichtbare Partikel. Daher wurde die erste Untersuchung von Zellen erst nach dem Aufkommen optischer Mikroskope möglich. Ende des 17. Jahrhunderts. Antonio van Leeuwenhoek stellte das erste optische Mikroskop her, bevor die Menschen die Existenz pathogener Mikroben und Bakterien nicht vermuteten [Ref. 7-1].

optische Mikroskopie

Schwierigkeiten bei der Untersuchung von Zellen sind darauf zurückzuführen, dass sie farblos und transparent sind, sodass die Entdeckung ihrer Grundstrukturen erst nach der Einführung von Farbstoffen in die Praxis erfolgte. Die Farbstoffe lieferten einen ausreichenden Bildkontrast. Mit einem optischen Mikroskop kann man Objekte unterscheiden, die 0,2 µm voneinander entfernt sind, d.h. Die kleinsten Objekte, die im Lichtmikroskop noch unterschieden werden können, sind Bakterien und Mitochondrien. Bilder kleinerer Zellelemente werden durch Effekte verzerrt, die durch die Wellennatur von Licht verursacht werden.

Zur Herstellung langlebiger Präparate werden Zellen mit einem Fixiermittel behandelt, um sie zu immobilisieren und zu konservieren. Außerdem erhöht die Fixierung die Zugänglichkeit der Zellen für Farbstoffe, weil. Zellmakromoleküle werden durch Quervernetzungen zusammengehalten, was sie stabilisiert und in einer bestimmten Position fixiert. Am häufigsten wirken Aldehyde und Alkohole als Fixiermittel (zB bilden Glutaraldehyd oder Formaldehyd kovalente Bindungen mit freien Aminogruppen von Proteinen und vernetzen benachbarte Moleküle). Nach der Fixierung wird das Gewebe normalerweise mit einem Mikrotom in sehr dünne Schnitte (1 bis 10 µm dick) geschnitten, die dann auf einen Objektträger aus Glas gelegt werden. Bei dieser Zubereitungsmethode kann die Struktur von Zellen oder Makromolekülen beschädigt werden, daher ist Schockgefrieren die bevorzugte Methode. Gefrorenes Gewebe wird mit einem in einer Kältekammer platzierten Mikrotom geschnitten. Nach dem Schneiden werden die Zellen gefärbt. Grundsätzlich werden hierfür organische Farbstoffe verwendet (Malachitgrün, schwarzer Sudan etc.). Jeder von ihnen zeichnet sich durch eine bestimmte Affinität zu Zellbestandteilen aus, beispielsweise hat Hämatoxylin eine Affinität zu negativ geladenen Molekülen und ermöglicht daher den Nachweis von DNA in Zellen. Wenn das eine oder andere Molekül in geringer Menge in der Zelle vorhanden ist, ist es am bequemsten, die Fluoreszenzmikroskopie zu verwenden.

Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszierende Farbstoffe absorbieren Licht einer Wellenlänge und emittieren Licht einer anderen, längeren Wellenlänge. Wenn eine solche Substanz mit Licht bestrahlt wird, dessen Wellenlänge mit der Wellenlänge des vom Farbstoff absorbierten Lichts übereinstimmt, und dann zur Analyse ein Filter verwendet wird, der Licht mit einer Wellenlänge durchlässt, die dem vom Farbstoff emittierten Licht entspricht, kann das fluoreszierende Molekül nachgewiesen werden durch Leuchten in einem dunklen Feld. Die hohe Intensität des emittierten Lichts ist ein charakteristisches Merkmal solcher Moleküle. Die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen zum Anfärben von Zellen beinhaltet die Verwendung eines speziellen Fluoreszenzmikroskops.Ein solches Mikroskop ähnelt einem herkömmlichen optischen Mikroskop, aber das Licht eines leistungsstarken Illuminators passiert zwei Filtersätze – einen, um einen Teil der Strahlung des Illuminators zu stoppen vor der Probe und der andere, um das von der Probe empfangene Licht zu filtern. Der erste Filter ist so gewählt, dass er nur Licht der Wellenlänge durchlässt, die einen bestimmten Fluoreszenzfarbstoff anregt; Gleichzeitig blockiert der zweite Filter dieses einfallende Licht und lässt Licht der Wellenlänge durch, die der Farbstoff emittiert, wenn er fluoresziert.

Fluoreszenzmikroskopie wird häufig verwendet, um spezifische Proteine ​​oder andere Moleküle zu identifizieren, die fluoreszierend werden, nachdem sie kovalent an fluoreszierende Farbstoffe gebunden wurden. Zu diesem Zweck werden normalerweise zwei Farbstoffe verwendet - Fluorescein, die nach Anregung mit hellblauem Licht eine intensive gelbgrüne Fluoreszenz ergibt, und Rhodamin, nach Anregung mit gelbgrünem Licht dunkelrot fluoresziert. Indem sowohl Fluorescein als auch Rhodamin zum Färben verwendet werden, kann die Verteilung verschiedener Moleküle erhalten werden.

Dunkelfeldmikroskopie

Der einfachste Weg, die Details der Zellstruktur zu sehen, besteht darin, das Licht zu beobachten, das von den verschiedenen Komponenten der Zelle gestreut wird. Bei einem Dunkelfeldmikroskop werden die Strahlen der Beleuchtung von der Seite gerichtet, und nur gestreute Strahlen treten in das Mikroskopobjektiv ein. Dementsprechend sieht die Zelle wie ein beleuchtetes Objekt in einem dunklen Feld aus. Einer der Hauptvorteile der Dunkelfeldmikroskopie ist die Fähigkeit, die Bewegung von Zellen während der Teilung und Migration zu beobachten. Zellbewegungen sind in der Regel sehr langsam und in Echtzeit schwer zu beobachten. In diesem Fall wird eine bildweise (Zeitraffer-)Mikroverfilmung oder Videoaufzeichnung verwendet. In diesem Fall werden aufeinanderfolgende Frames zeitlich getrennt, aber wenn die Aufzeichnung mit normaler Geschwindigkeit wiedergegeben wird, beschleunigt sich das Bild realer Ereignisse.

In den letzten Jahren haben Videokameras und verwandte Abbildungstechnologien die Möglichkeiten der optischen Mikroskopie stark erweitert. Dank ihrer Anwendung konnten die durch die Besonderheiten der menschlichen Physiologie verursachten Schwierigkeiten überwunden werden. Das sind sie:

1. Unter normalen Bedingungen nimmt das Auge sehr schwaches Licht nicht wahr.

2. Das Auge kann kleine Unterschiede in der Lichtintensität vor einem hellen Hintergrund nicht erkennen.

Das erste dieser Probleme wurde überwunden, indem ultrahochempfindliche Videokameras an das Mikroskop angebracht wurden. Dadurch war es möglich, Zellen lange Zeit bei schwacher Beleuchtung zu beobachten, ohne dass sie längere Zeit hellem Licht ausgesetzt waren. Bildgebungssysteme sind besonders wichtig für die Untersuchung fluoreszierender Moleküle in lebenden Zellen. Da das Bild von einer Videokamera in Form elektronischer Signale erzeugt wird, kann es in geeigneter Weise in numerische Signale umgewandelt, an einen Computer gesendet und dann einer zusätzlichen Verarbeitung unterzogen werden, um verborgene Informationen zu extrahieren.

Der mit der Computer-Interferenz-Mikroskopie erreichbare hohe Kontrast ermöglicht die Beobachtung auch sehr kleiner Objekte, wie etwa einzelner Mikrotubuli, deren Durchmesser weniger als ein Zehntel der Lichtwellenlänge (0,025 µm) beträgt. Unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie können auch einzelne Mikrotubuli gesehen werden. Allerdings sind in beiden Fällen Beugungseffekte unvermeidbar, die das Bild stark verändern. In diesem Fall wird der Durchmesser der Mikrotubuli überschätzt (0,2 μm), was es unmöglich macht, einzelne Mikrotubuli von einem Bündel mehrerer Mikrotubuli zu unterscheiden. Zur Lösung dieses Problems wird ein Elektronenmikroskop benötigt, dessen Auflösungsgrenze weit über die Wellenlänge des sichtbaren Lichts hinaus verschoben ist.

Elektronenmikroskopie

Auch für Elektronen bleibt der Zusammenhang zwischen Wellenlänge und Auflösungsgrenze erhalten. Für ein Elektronenmikroskop ist die Auflösungsgrenze jedoch viel niedriger als die Beugungsgrenze. Die Wellenlänge eines Elektrons nimmt mit zunehmender Geschwindigkeit ab. In einem Elektronenmikroskop mit einer Spannung von 100.000 V beträgt die Wellenlänge eines Elektrons 0,004 nm. Die Auflösung eines solchen Mikroskops liegt laut Theorie bei 0,002 nm im Limit. In der Realität beträgt die Auflösung moderner Elektronenmikroskope jedoch aufgrund der kleinen numerischen Aperturen von Elektronenlinsen bestenfalls 0,1 nm. Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung und deren Schädigung durch Strahlung verringern die normale Auflösung, die für biologische Objekte 2 nm beträgt (etwa 100-mal höher als die eines Lichtmikroskops), erheblich.

Die Elektronenquelle in Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ist ein Kathodenfaden, der sich an der Spitze einer etwa zwei Meter hohen zylindrischen Säule befindet. Um die Streuung von Elektronen bei Kollisionen mit Luftmolekülen zu vermeiden, wird in der Säule ein Vakuum erzeugt. Die vom Kathodenfilament emittierten Elektronen werden von einer nahe gelegenen Anode beschleunigt und treten durch ein winziges Loch ein und bilden einen Elektronenstrahl, der in den Boden der Säule gelangt. Entlang der Säule befinden sich in einiger Entfernung Ringmagnete, die den Elektronenstrahl fokussieren, wie Glaslinsen, die den Lichtstrahl in einem optischen Mikroskop fokussieren. Die Probe wird durch die Luftschleuse in der Säule in den Weg des Elektronenstrahls gebracht. Ein Teil der Elektronen im Moment des Durchgangs durch die Probe wird entsprechend der Dichte der Substanz in diesem Bereich gestreut, der Rest der Elektronen wird fokussiert und bildet ein Bild (ähnlich der Bilderzeugung in einem Lichtmikroskop). auf einer fotografischen Platte oder auf einem phosphoreszierenden Schirm.

Einer der größten Nachteile der Elektronenmikroskopie ist, dass biologische Proben einer speziellen Aufarbeitung unterzogen werden müssen. Zuerst werden sie zuerst mit Glutaraldehyd und dann mit Osminsäure fixiert, die die Doppelschicht aus Lipiden und Proteinen bindet und stabilisiert. Zweitens haben Elektronen eine geringe Durchdringungskraft, man muss also hauchdünne Schnitte machen, und dafür werden die Proben entwässert und mit Harzen imprägniert. Drittens werden die Proben zur Kontrastverstärkung mit Salzen von Schwermetallen wie Osmium, Uran und Blei behandelt.

Um ein dreidimensionales Bild der Oberfläche zu erhalten wird verwendet Rasterelektronenmikroskop (REM), wobei Elektronen verwendet werden, die von der Oberfläche der Probe gestreut oder emittiert werden. Die Probe wird in diesem Fall fixiert, getrocknet und mit einem dünnen Schwermetallfilm bedeckt und dann mit einem schmalen Elektronenstrahl abgetastet. Dabei wird die Anzahl der bei der Oberflächenbestrahlung gestreuten Elektronen abgeschätzt. Der erhaltene Wert wird verwendet, um die Intensität des zweiten Strahls zu steuern, der sich synchron mit dem ersten bewegt und ein Bild auf dem Monitorbildschirm erzeugt. Die Auflösung des Verfahrens beträgt etwa 10 nm und ist nicht auf die Untersuchung intrazellulärer Organellen anwendbar. Die Dicke der mit dieser Methode untersuchten Proben wird durch die Durchdringungskraft der Elektronen bzw. deren Energie bestimmt.

Die wichtigsten und wesentlichen Nachteile all dieser Methoden sind die Dauer, Komplexität und die hohen Kosten der Probenvorbereitung.

Rastersondenmikroskopie

In einem Rastersondenmikroskop (SPM) wird anstelle eines Elektronenstrahls oder optischer Strahlung eine spitze Sonde, eine Nadel, verwendet, die die Oberfläche der Probe abtastet. Bildlich gesprochen können wir sagen, wenn eine Probe im Licht- oder Elektronenmikroskop untersucht wird, dann spürt man das im SPM. Dadurch ist es möglich, dreidimensionale Bilder von Objekten in unterschiedlichen Medien zu erhalten: Vakuum, Luft, Flüssigkeit.

Spezielle SPM-Designs, die für die biologische Forschung angepasst sind, ermöglichen es, gleichzeitig mit optischer Beobachtung sowohl lebende Zellen in verschiedenen flüssigen Medien als auch fixierte Präparate in Luft zu scannen.

Rastersondenmikroskop

Der Name des Rastersondenmikroskops spiegelt sein Funktionsprinzip wider - das Scannen der Oberfläche der Probe, bei dem Punkt für Punkt der Grad der Wechselwirkung zwischen der Sonde und der Oberfläche abgelesen wird. Die Größe des Scanbereichs und die Anzahl der darin enthaltenen Punkte N X N Y können eingestellt werden. Je mehr Punkte Sie angeben, desto höher ist die Auflösung des Oberflächenbildes. Der Abstand zwischen Signallesepunkten wird als Abtastschritt bezeichnet. Der Scanschritt sollte geringer sein als die untersuchten Oberflächendetails. Die Bewegung der Sonde beim Scannen (siehe Abb. 7-1) erfolgt linear in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung (in Richtung des schnellen Scannens), der Übergang zur nächsten Zeile erfolgt in senkrechter Richtung (in der Richtung langsames Scannen).

Reis. 7 1. Schematische Darstellung des Scanvorgangs
(Signallesung erfolgt auf direktem Weg des Scanners)

Abhängig von der Art des Lesesignals haben Rastermikroskope unterschiedliche Namen und Zwecke:

Rasterkraftmikroskop (AFM), die Kräfte der interatomaren Wechselwirkung zwischen Sondenatomen und Probenatomen werden abgelesen;

Tunnelmikroskop (STM), Ablesen des zwischen der leitfähigen Probe und der leitfähigen Sonde fließenden Tunnelstroms;

Magnetkraftmikroskop (MFM), die Wechselwirkungskräfte zwischen der mit magnetischem Material beschichteten Sonde und der Probe, die magnetische Eigenschaften detektiert, werden abgelesen;

Mit dem elektrostatischen Kraftmikroskop (ESM) kann man sich ein Bild der elektrischen Potentialverteilung auf der Probenoberfläche machen. Es werden Sonden verwendet, deren Spitze mit einem dünnen leitfähigen Film (Gold oder Platin) bedeckt ist.

SPM-Design

Das SPM besteht aus den folgenden Hauptkomponenten (Abbildung 7-2): einer Sonde, piezoelektrischen Aktoren, um die Sonde in X, Y, Z über die Oberfläche der Testprobe zu bewegen, einem Rückkopplungskreis und einem Computer, um den Scanvorgang zu steuern und zu steuern Bildaufnahme.

Abbildung 7 2. Schema eines Rastersondenmikroskops

Sondensensor - eine Komponente eines Power-Sonden-Mikroskops, das die Präparation scannt. Der Sondensensor enthält einen Ausleger (Federkonsole) in rechteckiger (I-Form) oder dreieckiger (V-Form) Form (Abb. 7-3), an dessen Ende sich eine spitze Sonde befindet (Abb. 7-3) , die normalerweise eine konische oder pyramidenförmige Form hat . Das andere Ende des Cantilevers wird mit dem Substrat (mit dem sogenannten Chip) verbunden. Sondensensoren bestehen aus Silizium oder Siliziumnitrid. Die Haupteigenschaft des Auslegers ist die Kraftkonstante (Steifigkeitskonstante), sie variiert von 0,01 N/m bis 1020 N/m. Zur Untersuchung biologischer Objekte werden „weiche“ Sonden mit einer Härte von 0,01  0,06 N/m verwendet.

Reis. 7 3. Bilder von pyramidenförmigen AFM-Sonden
erhalten mit einem Elektronenmikroskop:
a - I-förmiger Typ, b - V-förmiger Typ, c - Pyramide an der Spitze des Auslegers

Piezoelektrische Aktoren oder Scanner - zur kontrollierten Bewegung der Sonde über die Probe oder der Probe selbst relativ zur Sonde in ultrakleinen Abständen. Piezoelektrische Aktoren verwenden piezokeramische Materialien, die ihre Abmessungen ändern, wenn eine elektrische Spannung an sie angelegt wird. Der Vorgang der Änderung geometrischer Parameter unter Einwirkung eines elektrischen Feldes wird als inverser piezoelektrischer Effekt bezeichnet. Das gebräuchlichste Piezomaterial ist Blei-Zirkonat-Titanat.

Der Scanner ist eine piezokeramische Struktur, die eine Bewegung entlang dreier Koordinaten bereitstellt: x, y (in der lateralen Ebene der Probe) und z (vertikal). Es gibt verschiedene Arten von Scannern, von denen die gebräuchlichsten Stative und Röhren sind (Abb. 7-4).

Reis. 7 4. Scanner-Designs: a) – Stativ, b) – Rohr

In einem Stativscanner werden Bewegungen in drei Koordinaten durch drei unabhängige piezokeramische Stäbe bereitgestellt, die eine orthogonale Struktur bilden.

In einem Röhrenscanner biegt sich eine hohle piezoelektrische Röhre in den XZ- und ZY-Ebenen und dehnt sich aus oder zieht sich entlang der Z-Achse zusammen, wenn geeignete Spannungen an die Elektroden angelegt werden, die die Bewegungen der Röhre steuern. Elektroden zur Steuerung der Bewegung in der XY-Ebene befinden sich an der Außenfläche des Rohrs, um die Bewegung in Z zu steuern, werden gleiche Spannungen an die X- und Y-Elektroden angelegt.

Rückkopplungsschaltung - ein Satz von SPM-Elementen, mit deren Hilfe die Sonde während des Scannens in einem festen Abstand von der Probenoberfläche gehalten wird (Abb. 7-5). Während des Scanvorgangs kann sich die Sonde auf Bereichen der Probenoberfläche mit unterschiedlichem Relief befinden, wobei sich der Sonden-Proben-Abstand Z und der Wert der Sonden-Proben-Wechselwirkung entsprechend ändern.

Reis. 7 5. Rückkopplungsschema eines Rastersondenmikroskops

Wenn sich die Sonde der Oberfläche nähert, nehmen die Sonden-Proben-Wechselwirkungskräfte zu und das Signal der Aufzeichnungsvorrichtung nimmt ebenfalls zu v(t), welche ausgedrückt in Spannungseinheiten. Der Komparator vergleicht das Signal v(t) mit Referenzspannung v Basic und erzeugt ein Korrektursignal v korr. Korrektursignal v korr wird dem Scanner zugeführt, und die Sonde wird von der Probe zurückgezogen. Referenzspannung - die Spannung, die dem Signal des Aufzeichnungsgeräts entspricht, wenn sich die Sonde in einem bestimmten Abstand von der Probe befindet. Durch Beibehalten dieses vorbestimmten Sonden-Proben-Abstands während des Scannens hält das Rückkopplungssystem die vorbestimmte Sonden-Proben-Wechselwirkungskraft aufrecht.

Reis. 7 6. Die Trajektorie der relativen Bewegung der Sonde im Prozess der Aufrechterhaltung einer konstanten Kraft der Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe durch das Rückkopplungssystem

Auf Abb. 7-6 zeigt die Trajektorie der Sonde relativ zu der Probe, während eine konstante Wechselwirkungskraft zwischen Sonde und Probe aufrechterhalten wird. Wenn sich die Sonde über der Fovea befindet, wird eine Spannung an den Scanner angelegt, bei der sich der Scanner verlängert und die Sonde absenkt.

Die Reaktionsgeschwindigkeit der Rückkopplungsschleife auf eine Änderung des Sonden-Proben-Abstands (Sonden-Proben-Wechselwirkungen) wird durch die Konstante der Rückkopplungsschleife bestimmt K. Werte K hängen von den Designmerkmalen eines bestimmten SPM (Design und Eigenschaften des Scanners, der Elektronik), dem SPM-Betriebsmodus (Größe des Scanbereichs, der Scangeschwindigkeit usw.) sowie den Merkmalen der untersuchten Oberfläche (Skala der Reliefmerkmale) ab , Materialhärte usw.).

Sorten von SPM

Rastertunnelmikroskop

Beim STM misst das Registriergerät (Abb. 7-7) den zwischen den Metallsonden fließenden Tunnelstrom, der je nach Potential auf der Probenoberfläche und der Topographie ihrer Oberfläche variiert. Die Sonde ist eine scharf geschärfte Nadel, deren Spitzenradius mehrere Nanometer erreichen kann. Als Material für die Sonde werden meist Metalle mit hoher Härte und chemischer Beständigkeit verwendet: Wolfram oder Platin.

Reis. 7 7. Schema des Tunnelsondensensors

Zwischen der leitfähigen Sonde und der leitfähigen Probe wird eine Spannung angelegt. Wenn die Sondenspitze etwa 10 A von der Probe entfernt ist, beginnen Elektronen aus der Probe, je nach Vorzeichen der Spannung, durch den Spalt in die Sonde zu tunneln oder umgekehrt (Abb. 7-8).

Reis. 7 8. Schematische Darstellung der Wechselwirkung der Sondenspitze mit der Probe

Der resultierende Tunnelstrom wird von einem Aufzeichnungsgerät gemessen. Dessen Wert ich T proportional zur an den Tunnelkontakt angelegten Spannung v und hängt exponentiell vom Abstand der Nadel zur Probe ab d.

Somit sind kleine Änderungen des Abstands von der Spitze der Sonde zur Probe möglich d entsprechen exponentiell großen Änderungen des Tunnelstroms ich T(Spannung vorausgesetzt v konstant gehalten). Dadurch reicht die Empfindlichkeit des Tunnelsondensensors aus, um Höhenänderungen von weniger als 0,1 nm zu registrieren und damit ein Bild von Atomen auf der Oberfläche eines Festkörpers zu erhalten.

Rasterkraftmikroskop

Der gebräuchlichste Sondensensor für Atomkraftwechselwirkung ist ein Federausleger (vom englischen Ausleger - Konsole) mit einer Sonde an seinem Ende. Die Biegung des Auslegers aufgrund der Kraftwechselwirkung zwischen der Probe und der Sonde (Abb. 7-9) wird unter Verwendung eines optischen Registrierungsschemas gemessen.

Das Funktionsprinzip des Kraftsensors basiert auf der Nutzung atomarer Kräfte, die zwischen den Atomen der Sonde und den Atomen der Probe wirken. Wenn sich die Kraft der Sondenprobe ändert, ändert sich der Betrag der Auslegerbiegung, und eine solche Änderung wird durch das optische Registrierungssystem gemessen. Der Rasterkraftsensor ist somit eine hochempfindliche spitze Sonde, die es ermöglicht, die Wechselwirkungskräfte zwischen einzelnen Atomen zu erfassen.

Bei kleinen Biegungen das Verhältnis zwischen Sonden- und Probenkraft F und Durchbiegung der Cantilever-Spitze x bestimmt durch das Hookesche Gesetz:

wo k ist die Kraftkonstante (Steifigkeitskonstante) des Cantilevers.

Zum Beispiel, wenn ein Cantilever mit einer Konstante verwendet wird k etwa 1 N/m, dann beträgt die Auslenkung des Cantilevers unter Einwirkung einer Sonden-Probe-Wechselwirkungskraft von etwa 0,1 Nanonewton etwa 0,1 nm.

Zur Messung solch kleiner Verschiebungen wird üblicherweise ein optischer Wegsensor verwendet (Abb. 7-9), bestehend aus einem Halbleiterlaser und einer vierteiligen Fotodiode. Wenn der Cantilever gebogen wird, verschiebt sich der von ihm reflektierte Laserstrahl relativ zum Zentrum des Photodetektors. Somit kann die Biegung des Auslegers aus der relativen Änderung der Beleuchtung der oberen (T) und unteren (B) Hälfte des Fotodetektors bestimmt werden.

Abb. 7 9. Schema des Kraftsensors

Abhängigkeit der Wechselwirkungskräfte Spitze-Probe vom Abstand Spitze-Probe

Wenn sich die Sonde der Probe nähert, wird sie aufgrund der vorhandenen Anziehungskräfte (Van-der-Waals-Kräfte) zunächst von der Oberfläche angezogen. Wenn sich die Sonde weiter der Probe nähert, beginnen sich die Elektronenhüllen von Atomen am Ende der Sonde und Atomen auf der Oberfläche der Probe zu überlappen, was zum Auftreten einer Abstoßungskraft führt. Mit weiter abnehmendem Abstand wird die Abstoßungskraft dominant.

Im Allgemeinen die Abhängigkeit der Stärke der interatomaren Wechselwirkung F aus dem Abstand zwischen den Atomen R sieht aus wie:

.

Konstanten a und b und Exponenten m und n hängen von der Art der Atome und der Art der chemischen Bindungen ab. Für Van-der-Waals-Streitkräfte m=7 und n=3. Qualitativ ist die Abhängigkeit F(R) in Abb. 7-10.

Reis. 7 10. Abhängigkeit der Wechselwirkungskraft zwischen Atomen vom Abstand

SPM-Datenformat, Visualisierung von SPM-Daten

Die Daten zur Oberflächenmorphologie, die während der Untersuchung mit einem optischen Mikroskop erhalten wurden, werden als vergrößertes Bild eines Oberflächenbereichs dargestellt. Die mit dem SPM erhaltenen Informationen werden als ein zweidimensionales Array von ganzen Zahlen A ij geschrieben. Für jeden Wert ij entspricht einem bestimmten Punkt auf der Oberfläche innerhalb des Scanfeldes. Die grafische Darstellung dieser Zahlenreihe wird als SPM-gescanntes Bild bezeichnet.

Gescannte Bilder können entweder zweidimensional (2D) oder dreidimensional (3D) sein. Bei der 2D-Visualisierung ist jeder Punkt der Oberfläche Z= f(x, y) wird entsprechend der Höhe des Oberflächenpunktes ein bestimmter Farbton zugeordnet (Abb. 7-11 a). In der 3D-Visualisierung ist das Oberflächenbild Z= f(x, y) wird in einer axonometrischen Perspektive mit Hilfe von Pixeln oder auf bestimmte Weise berechneten Relieflinien aufgebaut. Die effektivste Art, 3D-Bilder zu kolorieren, besteht darin, die Bedingungen der Oberflächenbeleuchtung durch eine Punktquelle zu simulieren, die sich an einem bestimmten Punkt im Raum über der Oberfläche befindet (Abb. 7-11 b). In diesem Fall ist es möglich, einzelne kleine Merkmale des Reliefs hervorzuheben.

Reis. 7 11. Menschliche Blutlymphozyten:
a) 2D-Bild, b) 3D-Bild mit seitlicher Beleuchtung

Vorbereitung von Proben für die SPM-Forschung

Morphologie und Struktur von Bakterienzellen

Bakterien sind einzellige Mikroorganismen, die eine vielfältige Form und komplexe Struktur haben, die die Vielfalt ihrer funktionellen Aktivität bestimmt. Bakterien sind durch vier Hauptformen gekennzeichnet: sphärisch (sphärisch), zylindrisch (stäbchenförmig), gewunden und fadenförmig [Ref. 7-2].

Kokken (Kugelbakterien) - je nach Teilungsebene und Standort der einzelnen Individuen werden sie in Mikrokokken (getrennt liegende Kokken), Diplokokken (gepaarte Kokken), Streptokokken (Kokkenketten), Staphylokokken (mit dem Aussehen von Traubenbüscheln) unterteilt ), Tetrakokken (Ansammlungen von vier Kokken) und Sarcinen (Pakete von 8 oder 16 Kokken).

Stabförmig - Bakterien befinden sich in Form von Einzellern, Diplo- oder Streptobakterien.

Sammlung - Vibrionen, Spirilla und Spirochäten. Vibrios haben das Aussehen von leicht gebogenen Stäben, Spirilla - eine verschlungene Form mit mehreren spiralförmigen Locken.

Bakteriengrößen reichen von 0,1 bis 10 µm. Die Zusammensetzung einer Bakterienzelle umfasst eine Kapsel, eine Zellwand, eine zytoplasmatische Membran und ein Zytoplasma. Das Zytoplasma enthält das Nukleotid, Ribosomen und Einschlüsse. Einige Bakterien sind mit Geißeln und Zotten ausgestattet. Eine Reihe von Bakterien bilden Sporen. Sporen, die die anfängliche Quergröße der Zelle überschreiten, verleihen ihr eine Spindelform.

Um die Morphologie von Bakterien im Lichtmikroskop zu untersuchen, werden daraus native (Vital-)Präparate oder mit Anilinfarbstoff gefärbte fixierte Ausstriche hergestellt. Es gibt spezielle Färbemethoden zum Nachweis von Flagellen, Zellwänden, Nukleotiden und verschiedenen zytoplasmatischen Einschlüssen.

Für die SPM-Untersuchung der Morphologie von Bakterienzellen ist eine Färbung des Präparats nicht erforderlich. SPM ermöglicht es, Form und Größe von Bakterien mit hoher Auflösung zu bestimmen. Bei sorgfältiger Vorbereitung des Präparats und der Verwendung einer Sonde mit kleinem Krümmungsradius können Flagellen nachgewiesen werden. Gleichzeitig ist es aufgrund der großen Starrheit der bakteriellen Zellwand unmöglich, die intrazellulären Strukturen zu "sondieren", wie dies in einigen tierischen Zellen möglich ist.

Vorbereitung von Präparaten für SPM-Untersuchungen der Morphologie

Für die ersten Erfahrungen mit SPM wird empfohlen, ein biologisches Präparat zu wählen, das keine komplexe Vorbereitung erfordert. Gut geeignet sind gut zugängliche und nicht pathogene Milchsäurebakterien aus Sauerkrautlake oder fermentierten Milchprodukten.

Für SPM-Untersuchungen in Luft ist es erforderlich, das zu untersuchende Objekt fest auf der Oberfläche des Substrats zu fixieren, beispielsweise auf einem Deckglas. Außerdem sollte die Bakteriendichte in der Suspension so sein, dass die Zellen bei der Abscheidung auf dem Substrat nicht verkleben, und der Abstand zwischen ihnen sollte nicht zu groß sein, damit mehrere Objekte beim Scannen in einem Bild aufgenommen werden können. Diese Bedingungen sind erfüllt, wenn der Probenvorbereitungsmodus richtig gewählt ist. Wenn ein Tropfen einer Bakterien enthaltenden Lösung auf das Substrat aufgetragen wird, erfolgt deren allmähliche Ausfällung und Anhaftung. In diesem Fall sollten die Konzentration der Zellen in der Lösung und die Zeit der Sedimentation als Hauptparameter betrachtet werden. Die Bakterienkonzentration in der Suspension wird durch einen optischen Trübungsstandard bestimmt.

In unserem Fall spielt nur ein Parameter eine Rolle – die Inkubationszeit. Je länger der Tropfen auf dem Glas bleibt, desto größer ist die Dichte der Bakterienzellen. Beginnt gleichzeitig ein Flüssigkeitstropfen einzutrocknen, wird das Präparat durch die ausgefallenen Lösungsbestandteile zu stark verunreinigt. Ein Tropfen einer Lösung, die Bakterienzellen enthält (Salzlösung), wird auf ein Deckglas aufgetragen und 5-60 Minuten (je nach Zusammensetzung der Lösung) inkubiert. Dann, ohne auf das Trocknen der Tropfen zu warten, werden sie gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen (mehrmaliges Eintauchen der Zubereitung mit einer Pinzette in ein Glas). Nach dem Trocknen ist das Präparat bereit für die Messung auf dem SPM.

Beispielsweise wurden Präparate von Milchsäurebakterien aus Sauerkrautsole hergestellt. Die Einwirkzeit des Soletropfens auf dem Deckglas wurde zu 5 min, 20 min und 1 Stunde gewählt (der Tropfen hatte bereits begonnen auszutrocknen). SPM - Rahmen sind in Abb. 7-12, Abb. 7-13,
Reis. 7-14.

Aus den Abbildungen ist ersichtlich, dass für diese Lösung die optimale Inkubationszeit 510 min beträgt. Eine Erhöhung der Zeit, während der ein Tropfen auf der Oberfläche des Substrats gehalten wird, führt zur Adhäsion von Bakterienzellen. Für den Fall, dass ein Tropfen der Lösung auszutrocknen beginnt, lagern sich die Bestandteile der Lösung auf dem Glas ab, das nicht abgewaschen werden kann.

Reis. 7 12. Bilder von Milchsäurebakterien auf einem Deckglas,
mit SPM erhalten.

Reis. 7 13. Bilder von Milchsäurebakterien auf einem Deckglas,
mit SPM erhalten. Inkubationszeit der Lösung 20 min

Reis. 7 14. Bilder von Milchsäurebakterien auf einem Deckglas,
mit SPM erhalten. Inkubationszeit der Lösung 1 Stunde

An einem der ausgewählten Präparate (Abb. 7-12) haben wir versucht zu überlegen, was Milchsäurebakterien sind, welche Form in diesem Fall für sie charakteristisch ist. (Abb. 7-15)

Reis. 7 15. AFM - Aufnahme von Milchsäurebakterien auf einem Deckglas.
Inkubationszeit der Lösung 5 min

Reis. 7 16. AFM - Abbildung einer Kette von Milchsäurebakterien auf einem Deckglas.
Inkubationszeit der Lösung 5 min

Die Sole ist durch die Form stäbchenförmiger Bakterien und die Anordnung in Form einer Kette gekennzeichnet.

Reis. 7 17. Fenster des Steuerprogramms des Bildungs-SPM NanoEducator.
Symbolleiste

Mit den Werkzeugen des Bildungsprogramms SPM NanoEducator haben wir die Größe von Bakterienzellen bestimmt. Sie reichten von etwa 0,5 × 1,6 µm
bis zu 0,8 × 3,5 µm.

Die erhaltenen Ergebnisse werden mit den in der Bakteriendeterminante Bergey [Lit. 7-3].

Milchsäurebakterien gehören zu den Laktobazillen (Lactobacillus). Die Zellen sind stäbchenförmig und haben normalerweise eine regelmäßige Form. Die Stäbchen sind lang, manchmal fast coccoid, meist in kurzen Ketten. Abmessungen 0,5 - 1,2 x 1,0 - 10 Mikrometer. Der Streit entsteht nicht; in seltenen Fällen sind sie aufgrund von peritrichen Geißeln mobil. Weit verbreitet in der Umwelt, vor allem in Lebensmitteln tierischen und pflanzlichen Ursprungs. Milchsäurebakterien sind Teil der normalen Mikroflora des Verdauungstraktes. Jeder weiß, dass Sauerkraut neben dem Vitamingehalt auch zur Verbesserung der Darmflora beiträgt.

Aufbau eines Rastersondenmikroskops NanoEducator

Auf Abb. 7-18 zeigt das Aussehen des Messkopfes SPM NanoEducator und die Hauptelemente des in der Arbeit verwendeten Geräts sind angegeben.

Reis. 7 18. Aussehen des Messkopfes SPM NanoEducator
1-Basis, 2-Probenhalter, 3-Wechselwirkungssensor, 4-Sensor-Befestigungsschraube,
5-Schrauben für den manuellen Ansatz, 6-Schrauben zum Bewegen des Scanners mit einer Probe in einer horizontalen Ebene, 7-Schutzabdeckung mit einer Videokamera

Auf Abb. 7-19 zeigt den Aufbau des Messkopfes. Auf der Basis 1 befindet sich ein Scanner 8 mit einem Probenhalter 7 und einem Mechanismus, um die Probe auf der Grundlage eines Schrittmotors zu der Sonde 2 zu bringen. Im pädagogischen SPM NanoEducator die Probe wird auf dem Scanner fixiert und die Probe wird relativ zu der fixierten Sonde gescannt. Die Sonde 6, befestigt am Kraftwechselwirkungssensor 4, kann ebenfalls mit der Handanfahrschraube 3 an die Probe herangeführt werden. Mit der Schraube 9 erfolgt eine Vorauswahl des Untersuchungsortes auf der Probe.

Reis. 7 19. Aufbau des SPM NanoEducator: 1 – Sockel, 2 – Ansatzmechanismus,
3 – manuelle Zugangsschraube, 4 – Interaktionssensor, 5 – Sensorbefestigungsschraube, 6 – Sonde,
7 - Probenhalter, 8 - Scanner, 9, 10 - Schrauben zum Bewegen des Scanners mit der Probe

Ausbildung SPM NanoEducator besteht aus einem über Kabel verbundenen Messkopf, einem SPM-Controller und einem Steuerrechner. Das Mikroskop ist mit einer Videokamera ausgestattet. Das Signal des Wechselwirkungssensors gelangt nach Umwandlung im Vorverstärker in den SPM-Controller. Arbeitsmanagement SPM NanoEducator erfolgt vom Computer über den SPM-Controller.

Kraftinteraktionssensor und Sonde

Im Gerät NanoEducator Der Sensor ist in Form eines piezokeramischen Rohrs mit einer Länge hergestellt l=7 mm, Durchmesser d=1,2 mm und Wandstärke h\u003d 0,25 mm, an einem Ende starr befestigt. Auf der Innenfläche des Rohrs wird eine leitfähige Elektrode aufgebracht. Auf der Außenfläche der Röhre sind zwei elektrisch isolierte halbzylindrische Elektroden aufgebracht. Am freien Ende der Röhre ist ein Wolframdraht mit einem Durchmesser angebracht
100 µm (Abb. 7-20).

Reis. 7 20. Das Design des Universalsensors des NanoEducator

Das freie Ende des als Sonde verwendeten Drahtes wird elektrochemisch geerdet, der Krümmungsradius beträgt 0,2  0,05 µm. Die Sonde hat elektrischen Kontakt mit der inneren Elektrode des Rohrs, das mit dem geerdeten Körper des Instruments verbunden ist.

Das Vorhandensein von zwei Außenelektroden auf dem Piezorohr ermöglicht es, einen Teil des Piezorohrs (oben, gemäß Abb. 7-21) als Kraftwechselwirkungssensor (Sensor für mechanische Schwingungen) und den anderen Teil zu verwenden als Piezovibrator. Dem Piezoschwinger wird eine elektrische Wechselspannung zugeführt, deren Frequenz gleich der Resonanzfrequenz des Leistungssensors ist. Die Schwingungsamplitude bei großem Abstand Spitze-Probe ist maximal. Wie aus Abb. 7-22 weicht die Sonde während des Oszillationsprozesses von der Gleichgewichtsposition um einen Betrag A o ab, der gleich der Amplitude ihrer erzwungenen mechanischen Oszillationen ist (es sind Bruchteile eines Mikrometers), während eine elektrische Wechselspannung auf dem zweiten Teil von erscheint das Piezorohr (Schwingungssensor), proportional zur Verschiebung der Sonde, die vom Instrument gemessen wird.

Wenn sich die Sonde der Oberfläche der Probe nähert, beginnt die Sonde, die Probe während der Oszillation zu berühren. Dies führt zu einer Verschiebung der Amplituden-Frequenz-Kennlinie (AFC) der Sensorschwingungen nach links gegenüber der weit von der Oberfläche gemessenen AFC (Abb. 7-22). Da die Frequenz der Antriebsschwingungen des Piezorohrs konstant und gleich der Schwingungsfrequenz о im freien Zustand gehalten wird, nimmt die Amplitude ihrer Schwingungen ab, wenn sich die Sonde der Oberfläche nähert, und wird gleich A. Diese Schwingungsamplitude ist vom zweiten Teil der Piezoröhre aufgenommen.

Reis. 7 21. Das Funktionsprinzip der piezoelektrischen Röhre
als Kraftinteraktionssensor

Reis. 7 22. Ändern der Schwingfrequenz des Kraftsensors
beim Annähern an die Probenoberfläche

Scanner

Die im Gerät verwendete Methode zur Organisation von Mikrobewegungen NanoEducator, basiert auf der Verwendung einer um den Umfang geklemmten Metallmembran, auf deren Oberfläche eine piezoelektrische Platte geklebt wird (Abb. 7-23 a). Eine Änderung der Abmessungen der piezoelektrischen Platte unter Einwirkung einer Steuerspannung führt zu einer Durchbiegung der Membran. Indem man solche Membranen auf drei senkrechte Seiten des Würfels legt und ihre Zentren mit Metallschiebern verbindet, erhält man einen 3-Koordinaten-Scanner (Abb. 7-23 b).

Reis. 7 23. Funktionsprinzip (a) und Design (b) des NanoEducator-Scanners

Jedes piezoelektrische Element 1, das an den Seiten des Würfels 2 befestigt ist, kann, wenn eine elektrische Spannung daran angelegt wird, den daran befestigten Drücker 3 in einer von drei zueinander senkrechten Richtungen – X, Y oder Z – bewegen In der Abbildung sind alle drei Schieber an einem Punkt 4 verbunden. Mit einiger Näherung können wir annehmen, dass sich dieser Punkt entlang dreier Koordinaten X, Y, Z bewegt. An derselben Stelle ist das Gestell 5 mit dem Probenhalter 6 befestigt, so dass sich die Probe unter der Einwirkung von drei unabhängigen Spannungsquellen entlang dreier Koordinaten bewegt. Bei Geräten NanoEducator Die maximale Verschiebung der Probe beträgt etwa 5070 µm, was den maximalen Scanbereich bestimmt.

Mechanismus zur automatisierten Annäherung der Sonde an die Probe (Rückkopplungserfassung)

Der Bewegungsbereich des Scanners entlang der Z-Achse beträgt etwa 10 µm, daher ist es notwendig, die Sonde vor dem Scannen in diesem Abstand näher an die Probe zu bringen. Zu diesem Zweck ist der Anfahrmechanismus ausgelegt, dessen Schema in Abb. 7-19. Wenn elektrische Impulse an ihn angelegt werden, dreht der Schrittmotor 1 die Vorschubschraube 2 und bewegt die Stange 3 mit der Sonde 4, wodurch sie näher oder weiter weg von der auf dem Scanner 6 installierten Probe 5 gebracht wird. Der Wert von einem Schritt ist etwa 2 μm.

Reis. 7 24. Schema des Mechanismus zum Annähern der Sonde an die Probenoberfläche

Da der Schritt des Annäherungsmechanismus den Wert des erforderlichen Sonden-Proben-Abstands während des Scannens deutlich überschreitet, um eine Verformung der Sonde zu vermeiden, wird seine Annäherung bei gleichzeitigem Betrieb des Schrittmotors und Bewegungen des Scanners entlang der Z durchgeführt Achse nach folgendem Algorithmus:

1. Das Feedback-System wird ausgeschaltet und der Scanner „fährt zurück“, d. h. senkt die Probe auf die untere Extremposition.

2. Der Sondenannäherungsmechanismus macht einen Schritt und stoppt.

3. Das Rückkopplungssystem wird eingeschaltet und der Scanner hebt die Probe sanft an, während die Sonden-Proben-Wechselwirkung analysiert wird.

4. Erfolgt keine Interaktion, wird der Vorgang ab Punkt 1 wiederholt.

Wenn ein Nicht-Null-Signal erscheint, während der Scanner hochgezogen wird, stoppt das Rückkopplungssystem die Aufwärtsbewegung des Scanners und fixiert das Ausmaß der Interaktion auf einem bestimmten Niveau. Die Größe der Kraftinteraktion, bei der die Sondenannäherung stoppt und der Scanvorgang im Gerät stattfindet NanoEducator gekennzeichnet durch den Parameter Amplitudenunterdrückung (AmplitudeUnterdrückung) :

A=Ao. (1-Amplituden-Unterdrückung)

Abrufen eines SPM-Images

Nach Aufruf des Programms NanoEducator das Hauptprogrammfenster erscheint auf dem Computerbildschirm (Abb. 7-20). Die Arbeit sollte über den Menüpunkt gestartet werden Datei und darin wählen Offen oder Neu oder die entsprechenden Schaltflächen in der Symbolleiste (, ).

Teamauswahl Datei Neu bedeutet den Übergang zu SPM-Messungen und die Wahl des Befehls Datei Offen bedeutet einen Übergang zur Betrachtung und Verarbeitung zuvor empfangener Daten. Das Programm ermöglicht es Ihnen, Daten parallel zu Messungen anzuzeigen und zu verarbeiten.

Reis. 7 25. Hauptfenster von NanoEducator

Nach Ausführung des Befehls Datei Neu Auf dem Bildschirm erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie einen Arbeitsordner auswählen oder erstellen können, in dem die Ergebnisse der aktuellen Messung standardmäßig gespeichert werden. Im Laufe der Messungen werden alle gewonnenen Daten nacheinander in Dateien mit den Namen aufgezeichnet ScanData+i.spm, wo der Index ich wird beim Programmstart auf Null zurückgesetzt und bei jeder neuen Messung inkrementiert. Dateien ScanData+i.spm werden im Arbeitsordner abgelegt, der vor Beginn der Messungen festgelegt wird. Während der Messung kann ein anderer Arbeitsordner ausgewählt werden. Drücken Sie dazu die Taste , befindet sich in der Symbolleiste des Hauptprogrammfensters und wählen Sie den Menüpunkt aus Arbeitsordner ändern.

Um die Ergebnisse der aktuellen Messung zu speichern, drücken Sie die Taste Speichern als Wählen Sie im Fenster Scannen im angezeigten Dialogfeld einen Ordner aus und geben Sie einen Dateinamen an, während die Datei ScanData+i.spm, die während der Messungen als temporäre Datenspeicherdatei dient, wird in den von Ihnen angegebenen Dateinamen umbenannt. Standardmäßig wird die Datei in dem vor Beginn der Messungen zugewiesenen Arbeitsordner gespeichert. Wenn Sie den Vorgang zum Speichern der Messergebnisse nicht ausführen, werden die Ergebnisse beim nächsten Start des Programms in temporären Dateien aufgezeichnet ScanData+i.spm, werden nacheinander überschrieben (es sei denn, das Arbeitsverzeichnis wird geändert). Über das Vorhandensein von temporären Dateien mit Messergebnissen im Arbeitsordner wird vor dem Schließen und nach dem Start des Programms eine Warnung ausgegeben. Durch das Ändern des Arbeitsordners vor Beginn der Messungen können Sie die Ergebnisse des vorherigen Experiments vor dem Löschen schützen. Standardname ScanDaten kann durch Angabe im Arbeitsordner-Auswahlfenster geändert werden. Durch Drücken der Schaltfläche wird das Fenster zur Auswahl eines Arbeitsordners aufgerufen. , befindet sich in der Symbolleiste des Hauptprogrammfensters. In dem Fenster können Sie auch Messergebnisse speichern Scan-Browser, wählen Sie die erforderlichen Dateien einzeln aus und speichern Sie sie im ausgewählten Ordner.

Es ist möglich, die mit dem NanoEducator erzielten Ergebnisse in die Formate ASCII und Nova (NTMDT) zu exportieren, die von NTMDT Nova, Image Analysis und anderen Programmen importiert werden können. Scanbilder, Daten ihrer Querschnitte, Ergebnisse spektroskopischer Messungen werden im ASCII-Format exportiert. Um Daten zu exportieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Export befindet sich in der Symbolleiste des Hauptanwendungsfensters oder wählen Sie aus Export im Menüpunkt Datei diesem Fenster und wählen Sie das entsprechende Exportformat aus. Daten zur Verarbeitung und Analyse können sofort an das vorab gestartete Bildanalyseprogramm gesendet werden.

Nach dem Schließen des Dialogfensters wird das Instrumentenbedienfeld auf dem Bildschirm angezeigt.
(Abb. 7-26).

Reis. 7 26. Bedienfeld des Instruments

Auf der linken Seite des Bedienfelds des Instruments befinden sich Schaltflächen zur Auswahl der SPM-Konfiguration:

SSM– Rasterkraftmikroskop (SFM)

STM– Rastertunnelmikroskop (STM).

Die Durchführung von Messungen am Trainings-SPM NanoEducator besteht aus der Durchführung der folgenden Vorgänge:

1. Installieren des Beispiels

BEACHTUNG! Vor dem Einbringen der Probe ist es notwendig, den Sensor mit der Sonde zu entfernen, um die Sonde nicht zu beschädigen.

Es gibt zwei Möglichkeiten, die Probe zu reparieren:

auf einem Magnettisch (in diesem Fall muss die Probe auf einem magnetischen Substrat befestigt werden);

auf doppelseitigem Klebeband.

BEACHTUNG! Um die Probe auf doppelseitigem Klebeband anzubringen, muss die Halterung vom Gestell abgeschraubt werden (um den Scanner nicht zu beschädigen) und dann wieder bis zum Anschlag eingeschraubt werden.

Bei einer Magnethalterung kann die Probe gewechselt werden, ohne den Probenhalter abzuschrauben.

2. Installation der Sonde

BEACHTUNG! Installieren Sie den Sensor immer mit der Sonde, nachdem Sie die Probe platziert haben.

Nach Auswahl des gewünschten Sondensensors (Sonde an den Metallkanten des Sockels halten) (siehe Abb. 7-27), Sondensonden-Befestigungsschraube 2 am Messkopfdeckel lösen, Sonde bis zum Anschlag in die Aufnahmebuchse einführen , drehen Sie die Befestigungsschraube im Uhrzeigersinn bis zum leichten Anschlag .

Reis. 7 27. Installation der Sonde

3. Auswählen eines Scan-Standorts

Verwenden Sie bei der Auswahl eines Standorts für die Untersuchung einer Probe die Schrauben, um den Zwei-Koordinaten-Tisch zu bewegen, der sich an der Unterseite des Geräts befindet.

4. Vorläufige Annäherung der Sonde an die Probe

Die Vorannäherung ist nicht für jede Messung obligatorisch, die Notwendigkeit ihrer Durchführung hängt vom Abstand zwischen Probe und Sondenspitze ab. Es ist wünschenswert, den vorläufigen Annäherungsvorgang durchzuführen, wenn der Abstand zwischen der Spitze der Sonde und der Probenoberfläche 0,51 mm überschreitet. Bei einer automatisierten Annäherung der Sonde an die Probe aus großer Entfernung zwischen ihnen dauert der Annäherungsprozess sehr lange.

Verwenden Sie die Handschraube, um die Sonde abzusenken, während Sie den Abstand zwischen ihr und der Probenoberfläche visuell kontrollieren.

5. Aufbau einer Resonanzkurve und Einstellung der Arbeitsfrequenz

Dieser Vorgang wird zwangsläufig zu Beginn jeder Messung durchgeführt und bis zu seiner Durchführung ist der Übergang zu weiteren Messschritten gesperrt. Außerdem treten während des Messvorgangs manchmal Situationen auf, die eine erneute Durchführung dieses Vorgangs erfordern (z. B. wenn der Kontakt verloren geht).

Das Resonanzsuchfenster wird durch Drücken der Taste auf dem Bedienfeld des Instruments aufgerufen. Bei dieser Operation wird die Amplitude der Sondenschwingungen gemessen, wenn sich die vom Generator eingestellte Frequenz der erzwungenen Schwingungen ändert. Drücken Sie dazu die Taste LAUF(Abb. 7-28).

Reis. 7 28. Betriebsfenster Resonanzsuche und Betriebsfrequenzeinstellung:
a) - automatischer Modus, b) - manueller Modus

Im Modus Auto die Oszillatorfrequenz wird automatisch gleich der Frequenz gesetzt, bei der die maximale Amplitude der Sondenschwingungen beobachtet wurde. Ein Diagramm, das die Änderung der Amplitude der Sondenschwingungen in einem bestimmten Frequenzbereich zeigt (Abb. 7-28a), ermöglicht es Ihnen, die Form der Resonanzspitze zu beobachten. Wenn die Resonanzspitze nicht ausgeprägt genug ist oder die Amplitude bei der Resonanzfrequenz klein ist ( weniger als 1V), dann ist es notwendig, die Messparameter zu ändern und die Resonanzfrequenz neu zu bestimmen.

Dieser Modus ist vorgesehen für Handbuch. Wenn dieser Modus im Fenster ausgewählt ist Bestimmung der Resonanzfrequenz zusätzliches Panel erscheint
(Abb. 7-28b), mit dem Sie die folgenden Parameter einstellen können:

Sondenhubspannung vom Generator gegeben. Es wird empfohlen, diesen Wert auf das Minimum (bis auf Null) und nicht mehr als 50 mV einzustellen.

Amplitudenverstärkung ( Amplitudenverstärkung). Wenn die Amplitude der Sondenschwingung nicht ausreicht (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Amplitudenverstärkung.

Um den Resonanzsuchlauf zu starten, drücken Sie die Taste Start.

Modus Handbuch ermöglicht es Ihnen, die ausgewählte Frequenz manuell zu ändern, indem Sie den grünen Cursor mit der Maus auf dem Diagramm bewegen, sowie die Art der Änderung der Schwingungsamplitude in einem engen Wertebereich um die ausgewählte Frequenz verdeutlichen (dazu Sie müssen den Schalter einstellen Manueller Modus in Position Genau und drücken Sie die Taste Start).

6. Interaktionserfassung

Um die Wechselwirkung zu erfassen, wird das Verfahren der kontrollierten Annäherung der Sonde und der Probe unter Verwendung des automatisierten Annäherungsmechanismus durchgeführt. Das Bedienfenster für diesen Vorgang wird durch Drücken der Taste auf dem Bedienfeld des Instruments aufgerufen. Bei der Arbeit mit CCM wird diese Schaltfläche verfügbar, nachdem der Suchvorgang durchgeführt und die Resonanzfrequenz eingestellt wurde. Fenster CCM, Leitung(Abb. 7-29) enthält Sondenannäherungssteuerungen sowie Parameteranzeigen, mit denen Sie den Fortschritt des Verfahrens analysieren können.

Reis. 7 29. Sondenannäherungsfenster

Im Fenster liefern Der Benutzer hat die Möglichkeit, die folgenden Werte zu überwachen:

Scannererweiterung ( ScannerZ) entlang der Z-Achse relativ zum maximal möglichen, als Einheit genommen. Der Wert der relativen Dehnung des Scanners wird durch den Füllstand des linken Indikators mit der Farbe gekennzeichnet, die dem Bereich entspricht, in dem sich der Scanner gerade befindet: grün - Arbeitsbereich, blau - außerhalb des Arbeitsbereichs, rot - der Scanner zu nahe an die Probenoberfläche gekommen ist, was zu einer Verformung der Sonde führen kann. Im letzteren Fall gibt das Programm eine akustische Warnung aus;

Schwingungsamplitude der Sonde relativ zur Amplitude seiner Schwingungen ohne Kraftwechselwirkung, als Einheit genommen. Der Wert der relativen Amplitude der Sondenschwingungen wird auf der rechten Anzeige durch den Füllstand in Burgund angezeigt. Horizontale Markierung auf der Anzeige Schwingungsamplitude der Sonde gibt die Ebene an, bei deren Durchlaufen die Analyse des Zustands des Scanners durchgeführt wird, und seine automatische Ausgabe an die Arbeitsposition;

Anzahl der Schritte ( Wagi) in eine bestimmte Richtung übergeben: Annäherung - Annäherung, Rückzug - Entfernung.

Bevor Sie mit dem Absenken der Sonde beginnen, müssen Sie:

Überprüfen Sie, ob die Anfahrparameter richtig eingestellt sind:

Rückkopplungsgewinn OS-Gewinn Wert setzen 3 ,

Stellen Sie sicher, dass der Parameter UnterdrückungAmplitude (Kraft) hat einen Wert von etwa 0,2 (siehe Abb. 7-29). Andernfalls drücken Sie die Taste Gewalt und im Fenster Einstellen von Interaktionsparametern (Abbildung 7-30) Wert einstellen UnterdrückungAmplitude gleich 0.2. Für einen feineren Ansatz der Parameterwert UnterdrückungAmplitude vielleicht weniger .

Überprüfen Sie, ob die Einstellungen im Parameterfenster korrekt sind Optionen, Seite Annäherungsparameter.

Ob eine Interaktion vorliegt oder nicht, kann anhand des linken Indikators festgestellt werden ScannerZ. Vollständiger Auszug des Scanners (der gesamte Indikator ScannerZ blau eingefärbt) sowie ein komplett schattierter weinroter Blinker Schwingungsamplitude der Sonde(Abb. 7-29) weisen auf keine Wechselwirkung hin. Nach Durchführung der Resonanzsuche und Einstellung der Arbeitsfrequenz wird die Amplitude der freien Schwingungen der Sonde als Einheit angenommen.

Wenn der Scanner vor oder während der Annäherung nicht vollständig ausgefahren ist oder das Programm eine Meldung anzeigt: „Fehler! Die Sonde ist zu nah an der Probe. Überprüfen Sie die Anflugparameter oder den physikalischen Knoten. Sie sich an einen sicheren Ort begeben wollen, wird empfohlen, das Anflugverfahren auszusetzen und:

a. Ändern Sie eine der Optionen:

Erhöhen Sie die Menge an Interaktion, Parameter UnterdrückungAmplitude, oder

Wert steigern OS-Gewinn, oder

Erhöhen Sie die Verzögerungszeit zwischen den Anfahrschritten (Parameter Integrationszeit Auf der Seite Annäherungsparameter Fenster Optionen).

b. Erhöhen Sie den Abstand zwischen der Spitze der Sonde und der Probe (befolgen Sie dazu die im Abschnitt beschriebenen Schritte und führen Sie den Vorgang aus Resonanz, dann kehren Sie zum Verfahren zurück liefern.

Reis. 7 30. Fenster zum Einstellen des Interaktionswerts zwischen Sonde und Probe

Nach dem Erfassen der Interaktion wird die Meldung „ Führung abgeschlossen“.

Wenn es notwendig ist, um einen Schritt näher zu kommen, drücken Sie die Taste. In diesem Fall wird zunächst der Schritt ausgeführt und anschließend die Kriterien zur Erfassung der Interaktion geprüft. Um die Bewegung zu stoppen, drücken Sie die Taste. Um den Einfahrvorgang durchzuführen, müssen Sie die Taste für Schnelleinzug drücken

oder drücken Sie die Taste für langsames Einfahren. Ggf. um einen Schritt zurückfahren, Taste drücken. In diesem Fall wird zunächst der Schritt ausgeführt und anschließend die Kriterien zur Erfassung der Interaktion geprüft.

7. Scannen

Nach Abschluss des Anflugverfahrens ( liefern) und Interaktionserfassung wird das Scannen verfügbar (Schaltfläche im Fenster des Instrumentenbedienfelds).

Durch Drücken dieser Schaltfläche (die Ansicht des Scanfensters ist in Abb. 7-31 dargestellt) gelangt der Benutzer direkt zur Messung und zum Abrufen der Messergebnisse.

Bevor Sie den Scanvorgang durchführen, müssen Sie die Scanparameter einstellen. Diese Optionen sind auf der rechten Seite der oberen Leiste des Fensters gruppiert. Scannen.

Beim ersten Mal nach dem Start des Programms werden sie standardmäßig installiert:

Bereich scannen - Region (Xnm*Ynm): 5000*5000nm;

Anzahl PunkteMessungen entlang der Achsen- X, Y: NX=100, New York=100;

Scan-Pfad - Richtung definiert die Scanrichtung. Das Programm ermöglicht es Ihnen, die Richtung der schnellen Scanachse (X oder Y) auszuwählen. Wenn das Programm startet, wird es installiert Richtung

Nachdem Sie die Scanparameter eingestellt haben, müssen Sie auf die Schaltfläche klicken Anwenden um die Parametereingabe zu bestätigen und die Schaltfläche Start Scannen zu starten.

Reis. 7 31. Fenster zum Verwalten des Vorgangs und Anzeigen der Ergebnisse des CCM-Scannens

7.4. Richtlinien

Lesen Sie vor der Verwendung des NanoEducator-Rastersondenmikroskops das Benutzerhandbuch [Ref. 7-4].

7.5.Sicherheit

Das Gerät wird mit einer Spannung von 220 V betrieben. Das NanoEducator Rastersondenmikroskop sollte gemäß PTE und PTB für elektrische Verbraucherinstallationen mit einer Spannung bis 1000 V betrieben werden.

7.6 Aufgabe

1. Bereiten Sie Ihre eigenen biologischen Proben für SPM-Studien vor.

2. Üben Sie den allgemeinen Aufbau des NanoEducator.

3. Machen Sie sich mit dem Steuerungsprogramm NanoEducator vertraut.

4. Holen Sie sich das erste SPM-Bild unter Aufsicht eines Lehrers.

5. Verarbeiten und analysieren Sie das resultierende Bild. Welche Bakterienformen sind typisch für Ihre Lösung? Was bestimmt die Form und Größe von Bakterienzellen?

6. Nehmen Sie Burgey's Bacteria Key und vergleichen Sie die Ergebnisse mit den dort beschriebenen.

7.7. Kontrollfragen

1. Welche Methoden gibt es, um biologische Objekte zu untersuchen?

2. Was ist Rastersondenmikroskopie? Welches Prinzip liegt ihr zugrunde?

3. Nennen Sie die Hauptkomponenten des SPM und deren Zweck.

4. Was ist der piezoelektrische Effekt und wie wird er in SPM angewendet? Beschreiben Sie die verschiedenen Designs von Scannern.

5. Beschreiben Sie das allgemeine Design des NanoEducator.

6. Beschreiben Sie den Kraftwechselwirkungssensor und sein Funktionsprinzip.

7. Beschreiben Sie den Mechanismus zum Annähern der Sonde an die Probe im NanoEducator. Erklären Sie die Parameter, die die Stärke der Wechselwirkung zwischen Sonde und Probe bestimmen.

8. Erklären Sie das Prinzip des Scannens und die Funktionsweise des Feedback-Systems. Teilen Sie uns die Kriterien für die Auswahl von Scanoptionen mit.

7.8 Literatur

Zündete. 7 1. Paul de Kruy. Mikrobielle Jäger. Herr Terra. 2001.

Zündete. 7 2. Leitfaden für praktische Übungen in der Mikrobiologie. Unter der Redaktion von Egorov N.S. Moskau: Nauka, 1995.

Zündete. 7 3. Holt J., Krieg N., P. Sneath, J. Staley, S. Williams. // Determinante von Bakterien Burgey. M.: Mir, 1997. Bd. Nr. 2. C. 574.

Zündete. 7 4. Bedienungsanleitung des Instruments NanoEducator.. Nizhny Novgorod. Wissenschafts- und Bildungszentrum...

Skript zur Vorlesung "Rastersondenmikroskopie in der Biologie" Vorlesungsplan

Abstrakt

... scannenSondeMikroskopie in Biologie" Vorlesungsplan: Einführung, Geschichte der SPM. Grenzen Anwendungen... und Nanostrukturen, ForschungbiologischObjekte: Nobelpreisträger... zumForschung spezifische Probe: B scannenSondeMikroskopiezum ...

Vorläufiges Programm der xxiii. Russischen Konferenz über Elektronenmikroskopie 1. Juni Dienstagmorgen 10.00 – 14.00 Uhr Eröffnung der Konferenz Einführungsrede

Programm

BP Karadzhyan, Yu.L. Ivanova, Yu.F. Ivlev, W.I. Popenko AnwendungSonde und konfokal scannenMikroskopiezumForschung Reparaturprozesse mit nanodispersen Transplantaten...

1. Allrussische wissenschaftliche Konferenz Methoden zur Untersuchung der Zusammensetzung und Struktur von Funktionsmaterialien

Dokumentieren

MEHRELEMENT OBJEKTE NICHT-REFERENZ... Lyakhov N.Z. FORSCHUNG NANOKOMPOSITE BIOLOGISCH AKTIV... Aliev V.Sh. ANWENDUNG METHODE SONDEMIKROSKOPIENZUMFORSCHUNG WIRKUNG... SCANNEN Kalorimetrie und thermostimulierte Ströme ZUMFORSCHUNG ...

(Englisch) Rasterelektronenmikroskop, SEM) ist ein Gerät, mit dem Sie Bilder der Probenoberfläche mit hoher Auflösung (weniger als ein Mikrometer) erhalten können. Bilder, die unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops erhalten werden, sind dreidimensional und praktisch zum Untersuchen der Struktur einer abgetasteten Oberfläche. Eine Reihe weiterer Verfahren (EDX-, WDX-Verfahren) ermöglichen es, Aussagen über die chemische Zusammensetzung oberflächennaher Schichten zu erhalten.

Arbeitsprinzip

Die zu untersuchende Probe wird unter industriellen Vakuumbedingungen von einem fokussierten Elektronenstrahl mittlerer Energie abgetastet. Je nach Signalaufnahmemechanismus werden mehrere Betriebsmodi eines Rasterelektronenmikroskops unterschieden: Auflichtelektronenmodus, Sekundärelektronenmodus, Kathodolumineszenzmodus usw. Die entwickelten Techniken erlauben es, die Eigenschaften der Probenoberfläche nicht nur zu untersuchen, sondern auch zu visualisieren und Informationen über die Eigenschaften von Strukturen unter der Oberfläche zu erhalten, die sich in einer Tiefe von mehreren Mikrometern von der gescannten Oberfläche befinden.

Betriebsarten

Sekundärelektronen-Detektion

Die Strahlung, die bei den meisten Instrumentenmodellen das Bild der Probenoberfläche bildet, sind genau die Sekundärelektronen, die in den Detektor vom Everhart-Thornley-Typ eintreten, wo das Primärbild gebildet wird, das nach Verarbeitung durch einen Softwareprozessor auf den Monitorbildschirm eintritt. Wie bei Trwurde früher Film für die Fotografie verwendet. Die Kamera nahm Bilder auf einem hochauflösenden Schwarzweiß-Kathodenstrahlröhrenbildschirm auf. Jetzt wird das erzeugte Bild einfach im Schnittstellenfenster des Computerprogramms angezeigt, das das Mikroskop steuert, und kann nach dem Fokussieren durch den Bediener auf der Festplatte des Computers gespeichert werden. Das von Rastermikroskopen erzeugte Bild zeichnet sich durch hohen Kontrast und Tiefenschärfe aus. Bei einigen Modellen moderner Geräte ist es dank der Verwendung der Multibeam-Technologie und der Verwendung spezieller Software möglich, ein 3D-Bild der Oberfläche des zu untersuchenden Objekts zu erhalten. Solche Mikroskope werden beispielsweise von der japanischen Firma JEOL hergestellt.

Erlaubnis

Die räumliche Auflösung eines Rasterelektronenmikroskops hängt von der transversalen Größe des Elektronenstrahls ab, die wiederum von den Eigenschaften des elektronenoptischen Systems abhängt, das den Strahl fokussiert. Die Auflösung wird auch durch die Größe der Wechselwirkungsfläche zwischen der Elektronensonde und der Probe, also vom Targetmaterial, begrenzt. Die Größe der Elektronensonde und die Größe des Wechselwirkungsbereichs zwischen der Sonde und der Probe sind viel größere Abstände zwischen den Zielatomen, sodass die Auflösung des Rasterelektronenmikroskops nicht groß genug ist, um atomare Skalen wie möglich darzustellen. beispielsweise in einem Transmissionselektronenmikroskop. Das Rasterelektronenmikroskop hat jedoch seine Vorteile, darunter die Fähigkeit, einen relativ großen Bereich der Probe sichtbar zu machen, die Fähigkeit, massive Ziele (nicht nur dünne Filme) zu untersuchen, und eine Vielzahl von Analysemethoden, mit denen man die untersuchen kann grundlegende Eigenschaften des Zielmaterials. Abhängig vom spezifischen Gerät und den Parametern des Experiments ist es möglich, Auflösungswerte von zehn bis zu Einheiten von Nanometern zu erreichen.

Anwendung

Rastermikroskope werden hauptsächlich als Forschungswerkzeug in Physik, Materialwissenschaften, Elektronik und Biologie verwendet. Hauptsächlich, um ein Bild des Prüflings zu erhalten, das je nach verwendetem Detektortyp stark variieren kann. Diese Unterschiede in den erhaltenen Bildern ermöglichen es, Rückschlüsse auf die physikalischen Eigenschaften der Oberfläche zu ziehen, um Untersuchungen der Oberflächentopographie durchzuführen. Das Elektronenmikroskop ist praktisch das einzige Instrument, das ein Bild der Oberfläche eines modernen Mikroschaltkreises oder eines Zwischenstadiums des Fotolithografieprozesses geben kann.

Für eine detaillierte Untersuchung der Oberfläche von Festkörpern gibt es viele verschiedene Methoden. Die Mikroskopie als Mittel zur Gewinnung eines vergrößerten Bildes entstand im 15. Jahrhundert. als zum ersten Mal einfache Lupen zum Studium von Insekten hergestellt wurden. Ende des 17. Jahrhunderts. Antonio van Leeuwenhoek baute ein optisches Mikroskop, das es ermöglichte, die Existenz einzelner Zellen, pathogener Mikroben und Bakterien festzustellen. Bereits im 20. Jahrhundert wurden Mikroskopieverfahren mit Elektronen- und Ionenstrahlen entwickelt.

Bei allen beschriebenen Verfahren wird folgendes Prinzip angewendet: Bestrahlung des Untersuchungsobjekts mit einem Partikelstrom und dessen anschließende Transformation. Die Rastersondenmikroskopie arbeitet nach einem anderen Prinzip – statt Partikel zu untersuchen, verwendet sie eine mechanische Sonde, eine Nadel. Bildlich gesprochen können wir sagen, wenn eine Probe in einem Licht- oder Elektronenmikroskop untersucht wird, dann wird sie in einem SPM gefühlt.

Ein weiteres wichtiges Prinzip, das sich im Namen der SPM-Methode widerspiegelt, ist das Prinzip des Scannens, d.h. Erhalten nicht durchschnittlicher Informationen über das Untersuchungsobjekt, sondern diskrete (von Punkt zu Punkt, von Zeile zu Zeile) Bewegung der Sonde und Lesen von Informationen an jedem Punkt.

Der allgemeine Aufbau eines Rastersondenmikroskops ist in Abb. 1 dargestellt.

Arten von Sensoren.

Die Rastersondenmikroskopie basiert auf dem Nachweis der lokalen Wechselwirkung, die zwischen der Sonde und der Oberfläche der Testprobe auftritt, wenn sie sich bis zu einem Abstand von ~l annähern, wobei l die charakteristische Zerfallslänge der „Sonde-Probe“ ist. Interaktion. Je nach Art der „Sonde-Probe“-Wechselwirkung gibt es: Rastertunnelmikroskop (STM, Tunnelstrom wird nachgewiesen), Rasterkraftmikroskop (SFM, Kraftwechselwirkung wird nachgewiesen), optisches Nahfeld-Rastermikroskop (SNOM, elektromagnetische Strahlung erkannt wird) usw. Die Rasterkraftmikroskopie wiederum wird je nach Art der Kraftwechselwirkung in Rasterkraftmikroskopie (AFM), Magnetkraftmikroskopie (MSM), elektrische Kraftmikroskopie (ESM) und andere unterteilt.

Reis. 2.

Bei der Messung des Tunnelstroms in einem Tunnelsensor (Abb. 2) wird ein Strom-Spannungs-Wandler (CVT) verwendet, der in den Stromflusskreis zwischen den Sonden und der Probe eingebunden wird. Zwei Schaltmöglichkeiten sind möglich: bei geerdeter Sonde, wenn an der Probe eine Vorspannung relativ zur geerdeten Sonde anliegt, oder bei geerdeter Probe, wenn an der Sonde eine Vorspannung relativ zur Probe anliegt.

Reis. 2.

Ein herkömmlicher Kraftwechselwirkungssensor ist ein Silizium-Mikrobalken, ein Cantilever oder Cantilever (vom englischen Cantilever - Cantilever) mit einem optischen Schema zum Erfassen der Größe der Cantilever-Biegung, die aufgrund der Kraftwechselwirkung zwischen der Probe und der an der Sonde befindlichen Sonde auftritt Ende des Auslegers (Abb. 3).

Es gibt Kontakt-, berührungslose und intermittierende Kontakt-(”Halbkontakt”)-Methoden zur Durchführung von Kraftmikroskopie. Die Verwendung der Kontaktmethode setzt voraus, dass die Sonde an der Probe anliegt. Wenn der Cantilever unter Einwirkung von Kontaktkräften gebogen wird, wird der von ihm reflektierte Laserstrahl relativ zum Zentrum des Quadranten-Photodetektors verschoben. Somit kann die Auslenkung des Auslegers aus der relativen Änderung der Beleuchtung der oberen und unteren Hälfte des Photodetektors bestimmt werden.

Bei der berührungslosen Methode wird die Sonde von der Oberfläche entfernt und befindet sich im Wirkungsbereich weitreichender Anziehungskräfte. Anziehende Kräfte und ihre Gradienten sind schwächer als abstoßende Kontaktkräfte. Daher wird üblicherweise eine Modulationstechnik verwendet, um sie zu detektieren. Dazu schwingt der Cantilever mit einem Piezovibrator vertikal mit der Resonanzfrequenz. Weit entfernt von der Oberfläche hat die Amplitude der Cantilever-Schwingungen einen Maximalwert. Wenn er sich der Oberfläche nähert, ändert sich aufgrund der Wirkung des Gradienten der Anziehungskräfte die Resonanzfrequenz der Auslegerschwingungen, während die Amplitude seiner Schwingungen abnimmt. Diese Amplitude wird mit einem optischen System durch die relative Änderung der variablen Beleuchtung der oberen und unteren Hälfte des Fotodetektors erfasst.

Bei der Messmethode „Semi-Contact“ wird zusätzlich ein Modulationsverfahren zur Messung der Kraftwechselwirkung eingesetzt. Im Modus "Halbkontakt" berührt die Sonde teilweise die Oberfläche und befindet sich abwechselnd sowohl im Bereich der Anziehung als auch im Bereich der Abstoßung.

Es gibt andere, einfachere Verfahren zur Erfassung von Kraftwechselwirkungen, bei denen die Kraftwechselwirkung direkt in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. Eines dieser Verfahren basiert auf der Nutzung des direkten piezoelektrischen Effekts, wenn die Biegung eines piezoelektrischen Materials unter Einwirkung einer Kraftwechselwirkung zum Auftreten eines elektrischen Signals führt.