Selama studi sitologi, struktur sel dipelajari untuk mendeteksi tumor ganas, jinak dan lesi yang bersifat non-tumor. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengkonfirmasi atau menyangkal fakta keganasan sel yang diambil untuk dianalisis.

Metode penelitian sitologi didasarkan pada studi di bawah mikroskop struktur sel, komposisi seluler cairan dan jaringan.

Ada metode studi sitologi seperti itu:

• mikroskop cahaya;
• mikroskop elektron;
• metode sentrifugasi. Ini digunakan ketika perlu untuk memisahkan membran sel dari struktur umum;
• metode atom berlabel. Mereka digunakan untuk mempelajari proses biokimia dalam sel: untuk ini, isotop radioaktif berlabel dimasukkan ke dalamnya;
• studi seumur hidup. Metode penelitian ini memungkinkan untuk mempelajari proses dinamis yang terjadi di dalam sel.

Kesimpulan dari studi sitologi didasarkan pada ciri-ciri perubahan sitoplasma, inti sel, rasio nuklir-sitoplasma, pembentukan kompleks dan struktur sel.

Analisis sitologi digunakan selama pemeriksaan pencegahan, untuk memperjelas diagnosis, selama operasi, untuk deteksi kekambuhan yang tepat waktu, dan kontrol selama pengobatan.

Pemeriksaan sitologi apusan

Sebagai bahan untuk analisis gunakan:

• cairan: urin, sekresi prostat, dahak, usapan yang diperoleh selama endoskopi berbagai organ, keluarnya cairan dari puting susu, cetakan dan goresan dari permukaan ulseratif dan erosi, luka dan fistula, cairan dari rongga serosa dan artikular;
• punctates: bahan biologis yang diperoleh selama tusukan diagnostik dilakukan dengan jarum tipis;
• apusan dari rongga dan serviks.

Sebagian besar studi sitologi apusan ini dilakukan jika perlu, untuk menetapkan dan memperjelas diagnosis. Tetapi pemeriksaan sitologi apusan dari serviks (Pap smear) direkomendasikan: setahun sekali - untuk wanita berusia di atas 19 tahun yang aktif secara seksual; dua kali setahun - wanita yang menggunakan kontrasepsi hormonal menderita herpes genital; lebih dari dua kali setahun - wanita yang menderita infertilitas, pendarahan rahim, obesitas, yang sering berganti pasangan seksual, mengambil estrogen, yang memiliki kutil pada alat kelamin, memiliki herpes genital.

Pemeriksaan sitologi serviks

Untuk pemeriksaan sitologi serviks, apusan diambil dari bagian luar dan dalam serviks dan dari kubah vagina menggunakan spatula kayu khusus. Kemudian dipindahkan ke kaca dan diperbaiki.

Pemeriksaan sitologi serviks dilakukan untuk mendeteksi perubahan sel kanker, dan sebagai kesimpulan, dokter menunjukkan salah satu dari lima tahap keadaan sel:

• tahap 1. Sel dengan penyimpangan tidak ditemukan;
• stadium 2. Ada perubahan kecil pada struktur sel yang disebabkan oleh peradangan pada organ genital internal. Kondisi sel ini tidak menimbulkan rasa takut, tetapi wanita tersebut dianjurkan untuk menjalani pemeriksaan dan pengobatan tambahan;
• tahap 3. Sejumlah kecil sel dengan penyimpangan struktural ditemukan. Dalam hal ini, dianjurkan untuk mengambil apusan lagi atau melakukan pemeriksaan histologis pada jaringan yang berubah;
• stadium 4. Ditemukan sel individu dengan perubahan keganasan. Diagnosis akhir tidak dibuat, pemeriksaan tambahan ditentukan;
• stadium 5. Sejumlah besar sel kanker ditemukan pada apusan.

Keandalan studi sitologi seperti itu tinggi, tetapi hanya dapat memberikan informasi tentang area dari mana sel diambil untuk analisis. Untuk menilai kondisi saluran tuba, ovarium, rahim, Anda harus menjalani pemeriksaan komprehensif.

Fitur utama dari metode morfo-fungsional untuk mempelajari sel adalah keinginan untuk memahami dasar struktural dari proses biokimia yang menentukan fungsi tertentu, yaitu, untuk mengaitkan proses ini dengan struktur seluler tertentu.

Tujuan akhir dari metode ini identik dengan yang dikejar oleh biologi molekuler dan biokimia struktural seluler. Namun, metode yang digunakan oleh ilmu-ilmu ini untuk memecahkan masalah umum pada dasarnya berbeda. Jika dalam biologi molekuler dan biokimia struktural kondisi yang sangat diperlukan adalah penghancuran sel dan isolasi struktur yang diteliti dalam bentuk fraksi yang kurang lebih murni, maka dalam studi sitologi, sebaliknya, pelestarian integritas sel adalah prasyarat. Dalam hal ini, perlu untuk berusaha mengurangi gangguan eksternal seminimal mungkin, dan mencoba untuk menyelidiki organisasi struktural dan biokimia dari komponen-komponen tertentu secara tepat dalam batas-batas sistem seluler yang tidak terpisahkan.

Studi morfofungsional telah berkembang pesat selama beberapa dekade terakhir. Pada saat itu, sejumlah besar metode baru yang fundamental untuk analisis kualitatif dan kuantitatif struktur seluler dikembangkan. Pendekatan ini terkait erat dengan cabang-cabang baru ilmu biologi dan, khususnya, biologi molekuler, yang menentukan kontribusi yang sangat signifikan dari studi semacam itu terhadap kemajuan pengetahuan kita tentang pola umum organisasi sel.

mikroskop elektron

Salah satu yang paling umum, yang telah menjadi metode klasik yang digunakan dalam studi struktural dan biokimia, adalah metode mikroskop elektron dalam berbagai modifikasinya. Modifikasi ini disebabkan oleh kedua pendekatan yang berbeda untuk analisis struktur yang diteliti dan kekhasan persiapan sel untuk studi ultrastruktural. Resolusi tinggi mikroskop transmisi (transmisi) konvensional memungkinkan untuk menganalisis tidak hanya semua organel aparatus nukleus dan sitoplasma, tetapi juga beberapa struktur yang terletak pada tingkat organisasi supramolekul, misalnya, mikrofibril pendukung dan kontraktil, mikrotubulus, dan beberapa multienzim. kompleks. Saat ini, untuk mempelajari sel pada tingkat sistemik dan subsistemik dari organisasi mereka, metode mikroskop elektron tegangan tinggi semakin berhasil digunakan. Karena energi yang jauh lebih tinggi dari berkas elektron penetrasi dibandingkan dengan mikroskop elektron transmisi, metode ini memungkinkan untuk mempelajari bagian "tebal" atau bahkan seluruh sel yang tersebar di bawah mikroskop, yang memungkinkan, misalnya, untuk menganalisis kompleks. sistem fibril submembran dari peralatan permukaan sel secara keseluruhan.

Dalam studi tentang fungsi peralatan permukaan sel, hubungan subsistem individu dari peralatan permukaan nukleus dan sejumlah masalah lain dari sitologi umum, metode pemindaian mikroskop elektron, yang memungkinkan untuk mempelajari permukaan suatu benda dalam volume, menjadi penting.

Metode pemotongan beku

Tempat khusus dan penting secara fundamental dalam studi sitologi dari arah morfobiokimia ditempati oleh metode pembelahan-beku. Ini adalah metode yang paling hemat dalam mempersiapkan objek biologis untuk analisis ultrastruktural, yaitu, menyebabkan perubahan minimal dalam struktur seluler dibandingkan dengan keadaan aslinya. Inti dari metode ini adalah sebagai berikut. Objek ditempatkan di atmosfer nitrogen cair, yang segera menghentikan semua proses metabolisme. Kemudian keripik dibuat dari benda beku. Dari permukaan chip, replika diperoleh dengan menerapkan film logam pada mereka. Film-film ini diperiksa lebih lanjut di bawah mikroskop elektron. Keuntungan dari metode pembelahan beku adalah bahwa bidang pembelahan biasanya melewati fase hidrofobik membran, dan ini memungkinkan untuk mempelajari jumlah, ukuran, dan susunan protein membran integral pada pembelahan, yaitu secara langsung bagian dalam. organisasi morfobiokimia membran. Metode ini memberikan hasil yang sangat berharga dalam mempelajari berbagai jenis struktur membran dan formasi khusus, misalnya jenis kontak sel tertentu.

Metode sitokimia

Untuk tugas utama aspek struktural-biokimia dari studi sitologi - penjelasan signifikansi fungsional struktur melalui analisis organisasi biokimia mereka - metode sitokimia memainkan peran yang sangat penting. Saat ini, mereka terus ditingkatkan baik dalam hal identifikasi kualitatif yang akurat dari senyawa kimia dalam struktur yang diteliti, dan dalam hal penilaian kuantitatif mereka. Dengan bantuan instrumen khusus yang memungkinkan sitospektrofotometri kuantitatif, dimungkinkan untuk menentukan kandungan zat tertentu, seperti RNA dan DNA, tidak hanya di sel secara keseluruhan, tetapi juga pada tingkat struktur inti atau sitoplasma. Berkat mikroskop interferensi, dimungkinkan untuk menilai jumlah total protein dalam sel dan perubahannya selama hidupnya.

Ada metode identifikasi sitokimia enzim, yang memungkinkan untuk menilai tidak hanya lokalisasi dan jumlah senyawa tertentu dalam struktur seluler, tetapi juga proses sintesis dan transportasi intraseluler senyawa ini.

Sitokimia enzim didasarkan pada prinsip interaksi substrat-enzim dengan penggunaan senyawa penanda yang mengendap dalam hal ini. Menentukan lokalisasi, dan dalam beberapa kasus aktivitas sistem enzimatik, kita dapat menilai lokalisasi proses biokimia tertentu dalam struktur seluler.

Autoradiografi

Metode autoradiografi, serta sitokimia enzim, membuka kemungkinan mempelajari sintesis dan transportasi intraseluler, tetapi pada saat yang sama memiliki kemungkinan yang lebih luas. Metode penulis-diografi didasarkan pada penggunaan prekursor radioaktif dari sintesis makromolekul yang diberi label dengan isotop buatan (3 H, 14 C, 35 S, dll.). Hal ini memungkinkan tidak hanya untuk melokalisasi situs sintesis makromolekul tertentu, tetapi juga untuk melacak rute spesifik transportasi intraseluler senyawa ini, untuk memberikan penilaian kuantitatif relatif dari intensitas sintesis dan laju pergerakan makromolekul dalam struktur seluler. Dengan cara ini, khususnya, pergerakan RNA dari nukleus ke sitoplasma sel ditunjukkan untuk pertama kalinya, lokalisasi sintesis dan transpor sekresi intraseluler dalam sel sekretori ditelusuri secara rinci, dan banyak fakta lain yang penting untuk sitologi umum. terungkap. Pada intinya, metode ini adalah salah satu karakteristik metode paling khas dari arah penelitian struktural-biokimia, karena memungkinkan Anda untuk secara langsung mempelajari proses metabolisme dalam struktur intraseluler dalam sel integral yang tidak dihancurkan (seperti dalam studi biokimia). Inti dari metode ini didasarkan pada deteksi molekul yang diberi label dengan isotop buatan menggunakan emulsi fotografi, yang mencakup bagian sel dan jaringan yang difiksasi pada waktu yang berbeda setelah pengenalan prekursor berlabel.

Metode imunositokimia

Saat ini, analisis kualitatif yang sangat tepat dari protein individu struktur seluler dalam sistem seluler integral juga dimungkinkan. Analisis semacam itu dilakukan dengan menggunakan metode imunositokimia. Inti dari metode ini terletak pada kenyataan bahwa protein spesifik berfungsi sebagai antigen, di mana antibodi spesifik diproduksi dalam tubuh mamalia mana pun. Yang terakhir dikombinasikan dengan pewarna fluoresen atau penanda lainnya. Kemudian, sel yang diteliti diperlakukan dengan serum dengan antibodi berlabel. Dalam hal ini, antibodi bertanda spesifik mengikat secara selektif ke struktur yang mengandung protein yang dipelajari. Dengan menggunakan metode ini, khususnya, lokalisasi protein kontraktil utama dan tambahan dari sistem aktin-miosin dalam aparatus fibrilar sel submembran terungkap, dan modifikasi distribusinya selama pembentukan aparatus mitosis dan selama sitotomi ditunjukkan. . Metode yang sama berhasil digunakan untuk membuktikan validitas model organisasi membran fluid-mosaic.

Metode penelitian sel yang kompleks

Baru-baru ini, kemajuan besar khususnya dalam studi tentang organisasi struktural dan biokimia sel telah dicapai dengan penggunaan kompleks metode analisis ultrastruktural, metode sitokimia dan autoradiografi. Keberhasilan ini terutama disebabkan oleh pengembangan metode khusus sitokimia dan autoradiografi pada tingkat ultrastruktural, yang memungkinkan untuk menganalisis secara langsung proses metabolisme pada tingkat organisasi sel yang disebutkan, proses biokimia "struktur", dan menemukan signifikansi spesifik dari struktur seluler tertentu dalam hubungan terpisah dari proses kompleks metabolisme intraseluler. Dalam hal ini, bahan yang luas telah terakumulasi pada peran berbagai varietas fase membran sitoplasma dalam proses anabolik sintetis dan proses katabolisme intraseluler.

Keberhasilan besar telah dicapai, khususnya, dalam studi tentang organisasi dan fungsi aparatus lisosom sel. Fakta-fakta baru yang penting diperoleh dalam studi aparatus inti sel. Dengan bantuan metode sitokimia, adalah mungkin untuk mengidentifikasi ribonucleoproteins (RNPs) dan deoxyribonucleoproteins (DNPs) pada tingkat ultrastruktural dan dengan demikian membuat kemajuan yang signifikan dalam mempelajari organisasi transkripsi, pematangan, dan transportasi intranuklear dari berbagai jenis RNP dalam sel eukariotik. , dan penggunaan autoradiografi elektron memungkinkan untuk merinci peran struktur seluler individu dalam proses ini. Misalnya, dimungkinkan untuk mempelajari secara rinci fungsi nukleolus dan secara khusus menyusun proses pembentukan RNA ribosom di dalamnya.

Sintesis aspek dan metode molekuler-biologis dan struktural-biokimia juga sangat khas untuk pengembangan banyak pertanyaan penting lainnya tentang organisasi yang baik dari komponen sel individu. Pada saat yang sama, hubungan erat antara biologi molekuler dan analisis sitologi morfobiokimia dimanifestasikan tidak hanya dalam sintesis hasil akhir, tetapi juga dalam interaksinya dalam proses penelitian itu sendiri. Interaksi semacam itu dilakukan baik dengan melakukan pekerjaan kompleks menggunakan metode biokimia dan sitologi oleh spesialis, ahli biokimia dan sitologi, atau dengan menggunakan metode kompleks khusus yang berada di perbatasan analisis biokimia dan sitologi struktur seluler.

Contoh dari jenis pertama adalah kombinasi metode untuk isolasi biokimia komponen sel dengan analisis ultrastruktural yang halus. Dengan cara ini, foto-foto gen yang bekerja diperoleh untuk pertama kalinya dengan identifikasi DNA, RNA polimerase dan molekul RNA yang ditranskripsikan pada mereka. Penyempurnaan metode ini sekarang memungkinkan dalam beberapa kasus untuk memperhitungkan intensitas transkripsi dengan menghitung secara langsung jumlah kompleks RNA polimerase. Dengan menggunakan mikroskop elektron, Anda dapat langsung mempelajari pola replikasi DNA pada molekul DNA yang diisolasi secara biokimia, melingkar atau linier. Metode analisis ultrastruktural juga banyak digunakan dalam studi imunositokimia lokalisasi protein individu, dalam subpartikel ribosom, dalam studi berbagai tingkat organisasi DNP, dan dalam banyak kasus lainnya.

Contoh khas dari metode kompleks yang dikembangkan secara khusus adalah hibridisasi DNA dan RNA pada bagian. Esensinya adalah sebagai berikut. DNA, yang merupakan bagian dari DNP seluruh sel, didenaturasi, dan kemudian diproses oleh fraksi RNA yang diberi label dengan isotop radioaktif. Akibatnya, DNA autoradiografi mengungkapkan daerah yang melengkapi fraksi RNA yang diberikan, yaitu, situs transkripsi yang terakhir, dengan kata lain, menjadi mungkin untuk secara akurat menentukan lokalisasi gen tertentu.

Dalam kerangka metode eksperimental, organisasi fungsional sel secara keseluruhan atau komponen individualnya dipelajari dengan mengubah keadaannya dengan bantuan pengaruh eksternal. Mengamati kemudian perubahan dalam aktivitas vital sel atau komponennya, seseorang dapat menarik kesimpulan tentang sifat-sifat tertentu dari mekanisme yang dipelajari. Metode semacam ini sekarang sangat luas di beberapa bagian sitologi, dan di beberapa wilayahnya, aspek sitofisiologis dari analisis struktur seluler masih menempati posisi dominan.

Inilah tepatnya keadaan masalah fungsi transportasi peralatan permukaan sel. Di satu sisi, kemajuan signifikan telah dibuat dalam studi masalah ini: berdasarkan hasil analisis sitofisiologis, dimungkinkan untuk mengidentifikasi varietas transpor zat transmembran, untuk mengkarakterisasi berbagai sifat sistem transportasi. Di sisi lain, solusi akhir dari pertanyaan tentang mekanisme transpor trans-membran hanya mungkin jika organisasi spesifik dari sistem lipid-protein membran diklarifikasi dan pengetahuan yang tepat tentang sifat dan peran komponen yang tersisa dari membran. sistem transpor membran, yaitu, pada tingkat analisis struktural dan biokimia membran plasma dan seluruh peralatan permukaan sel.

Kemungkinan terbatas dari studi sitofisiologis transportasi transmembran jelas dimanifestasikan oleh contoh keadaan masalah organisasi saluran ion, yang memainkan peran utama dalam banyak proses penting, seperti, misalnya, perambatan saraf. impuls. Dengan bantuan seluruh gudang berbagai metode sitofisiologis, ditunjukkan bahwa dalam membran plasma terdapat saluran khusus untuk ion Na, K, Cl, yang berbeda dalam sifatnya. Namun, pengetahuan khusus tentang organisasi struktural mereka masih dibatasi oleh data tidak langsung tentang sifat protein mereka. Dengan demikian, solusi dari pertanyaan tentang organisasi saluran ion pada khususnya dan sistem transpor membran pada umumnya tampaknya jatuh ke tangan para ilmuwan yang mahir dalam metode biokimia struktural, karena dalam hal ini, banyak dan sangat berharga fakta diperoleh dalam sitofisiologis. studi hanya tahap fenomenologis pertama dalam analisis mekanisme seluler umum. Namun demikian, dalam aspek-aspek tertentu dari studi sel, pendekatan sitofisiologis dapat memberikan banyak hal.

Saat ini, berbagai metode studi sitofisiologis ditentukan baik oleh gudang agen yang terus meningkat yang muncul di ahli sitologi, dan dengan menggunakan metode halus untuk menganalisis perubahan yang terjadi sebagai akibat dari aksi agen ini pada sel. Jika sebelumnya, untuk menganalisis perubahan sel di bawah aksi agen eksternal, metode seperti itu akrab bagi ahli fisiologi seperti pendaftaran potensi listrik, penilaian respirasi seluler dengan penyerapan oksigen, penilaian kuantitatif penyerapan pewarna, pendaftaran perubahan kualitatif dalam pewarnaan sel, dll. digunakan. , sekarang untuk tujuan seperti itu, metode karakteristik arah struktural dan fungsional semakin banyak digunakan: studi mikroskopis elektron tentang perubahan ultrastruktur, analisis autoradiografi proses sintetis, dll.

Di antara agen yang digunakan dalam studi eksperimental, dua kelompok utama dapat dibedakan. Kelompok pertama terdiri dari zat yang "titik aplikasi" di dalam sel kurang lebih diketahui - ini adalah zat yang memblokir tautan individu metabolisme intraseluler (misalnya, aktinomisin D, yang menghambat transkripsi, atau puromisin, yang menghalangi sintesis protein, 2,4-dinitrophenol, yang memisahkan respirasi dan fosforilasi oksidatif), zat yang secara selektif menghancurkan struktur seluler tertentu (misalnya, colchicine, yang menghancurkan mikrotubulus, atau cytochalasin B, yang bekerja pada mikrofibril). Kelompok kedua terdiri dari agen yang disebut tindakan kompleks yang mengubah metabolisme sel secara umum - suhu, tekanan osmotik, pH, dll. Penggunaan agen seperti, misalnya, 2,4-dinitrofenol, memungkinkan untuk memperjelas sejumlah pertanyaan tentang konjugasi respirasi dan fosforilasi dalam rantai respirasi mitokondria; penggunaan inhibitor RNA dan sintesis protein memungkinkan untuk mempelajari beberapa hubungan dalam sintesis protein di ribosom dan proses transkripsi; menggunakan colchicine dan cytochalasin, peran mikrotubulus dan mikrofilamen dalam proses transportasi intraseluler telah dijelaskan.

Agen dari kelompok kedua (tindakan kompleks) memiliki keuntungan bahwa mereka, seolah-olah, lebih alami untuk sel, karena sel dalam kondisi alami mengalami perubahan serupa di lingkungan eksternal. Pada saat yang sama, mereka mempengaruhi hampir semua aspek metabolisme sel, sehingga sulit untuk menganalisis perubahan yang terjadi dalam kasus ini. Namun demikian, studi tentang efek agen tersebut pada sel sangat penting dan mutlak diperlukan untuk mempelajari mekanisme adaptasi sel terhadap perubahan faktor lingkungan, menyelesaikan masalah rasio proses spesifik dan nonspesifik dalam respons sel terhadap pengaruh eksternal dan tugas serupa lainnya. , yang memainkan peran penting dalam mengembangkan masalah integrasi seluler.

Dalam studi tentang organisasi fungsional sel, analisis mekanisme interaksi sistem sel individu sangat penting. Dalam banyak kasus, masalah ini dapat diselesaikan dengan membuat model eksperimen khusus. Contoh paling khas dari jenis ini adalah transplantasi nuklir pada objek yang berbeda (protozoa, telur amfibi); hibridisasi sel somatik; transplantasi bagian sel pada protozoa; penelitian menggunakan sejumlah teknik bedah mikro lainnya, yang dilakukan pada objek protozoologis dan sel mamalia yang dikultur secara in vitro.

Dengan bantuan model seperti itu, masalah sitologi umum yang paling penting dipelajari. Sebagai contoh, hasil eksperimen tentang transplantasi nukleus sel amfibi yang berdiferensiasi menjadi ovum yang tidak memiliki nukleusnya sendiri adalah salah satu argumen paling meyakinkan yang mendukung teori aktivitas gen diferensial. Inti dari yang terakhir adalah untuk menyatakan identitas struktural genom sel-sel yang berbeda dari organisme multiseluler. Ini menyiratkan posisi penting yang mendasar bahwa proses diferensiasi terjadi bukan melalui perubahan ireversibel dalam peralatan herediter sel, tetapi melalui regulasi aktivitas satu set gen yang sama untuk semua sel organisme tertentu.

Fakta yang sangat menarik ditemukan pada model eksperimental untuk mempelajari proses diferensiasi sel hibrida — eritrosit ayam dan sel kanker mamalia. Keunikan heterokaryon ini terletak pada kenyataan bahwa ketika eritrosit ayam bergabung dengan sel kanker, hemolisis hemoglobin terjadi dan inti eritrosit normal yang hampir tidak aktif ditemukan di sitoplasma sel kanker. Dengan demikian, transplantasi nukleus yang berbeda ke dalam kondisi yang tidak biasa dari sitoplasma aktif dilakukan di sini. Pengamatan yang cermat terhadap perubahan dalam organisasi struktural inti-inti ini menunjukkan bahwa dalam kondisi baru ada peningkatan volume yang signifikan. Protein yang berasal dari sitoplasma memainkan peran penting dalam pembengkakan inti. Perubahan eksternal pada aparatus nukleus eritrosit ini mencerminkan proses restrukturisasi organisasi internal yang mendalam, yang mengakibatkan dimulainya kembali transkripsi RNA pembawa pesan "ayam". Namun, implementasi informasi yang terkandung di dalamnya dalam bentuk sintesis protein "ayam" tidak terjadi sampai nukleolus terbentuk di aparatus nukleus eritrosit ayam dan sintesis RNA ribosom dimulai. Dengan demikian, analisis menyeluruh dari model eksperimental menunjukkan adanya kontrol sitoplasma yang kompleks atas aktivitas peralatan nuklir.

Dengan bantuan model eksperimental, dimungkinkan untuk memecahkan sejumlah masalah sitologi umum penting lainnya. Misalnya, pertanyaan tentang mekanisme pergerakan kromosom anafase berhasil dipelajari pada aparatus mitosis asli yang diisolasi dari blastomer bulu babi yang menghancurkan dan bekerja di luar sel. Sebagian besar pada model eksperimental, dimungkinkan untuk menetapkan pola umum organisasi sel yang tersebar luas, yaitu, tidak adanya prinsip sebab-akibat yang kaku dalam hubungan proses intraseluler yang kompleks. Ternyata proses multi-komponen seperti reproduksi sel, proses sintesis dan transportasi intraseluler senyawa polimer tinggi, dll., Terdiri dari tahap terpisah yang relatif otonom yang tidak dihubungkan oleh hubungan sebab akibat yang kaku. Penjelasan pola ini, di satu sisi, menciptakan prasyarat untuk memahami mekanisme plastisitas organisasi seluler yang menakjubkan. Di sisi lain, keteraturan yang sama adalah dasar untuk mempelajari mekanisme integrasi proses tersebut dalam sistem seluler integral dalam kondisi normal.

Saat ini, jumlah dan variasi model eksperimental yang dirancang untuk memecahkan masalah sitologi umum tertentu semakin meningkat. Ini secara signifikan berkontribusi pada kemajuan pengetahuan kita di bidang sitologi yang relatif kurang dipelajari - mekanisme interaksi dan integrasi kerja sistem subseluler.

Harus ditekankan bahwa kekhususan penelitian yang dilakukan dalam kerangka pendekatan eksperimental untuk analisis pola-pola organisasi sel adalah pendalaman yang lebih besar dari kriteria dan tanda-tanda yang digunakan untuk menganalisis mekanisme integrasi dan fungsi spesifik individu. struktur seluler dilakukan Pada saat yang sama, menjadi jelas bahwa solusi yang berhasil dari tugas-tugas yang dihadapi penelitian semacam itu hanya mungkin dilakukan dengan pengenalan luas metode pendekatan struktural-fungsional ke dalam praktik.

Inti dari metode penelitian sitologi komparatif dalam sitologi umum adalah penjelasan tentang pola umum organisasi sel dengan menggunakan seluruh varietas varietasnya yang diberikan kepada ilmuwan oleh alam yang hidup. Metode komparatif memiliki dua aspek. Di satu sisi, secara tradisional digunakan untuk mengidentifikasi hubungan terkait antara jenis sel individu (terutama untuk organisme uniseluler). Berdasarkan sistematika filogenetik sel prokariotik dan sel eukariotik rendah dan tinggi yang dibuat dengan cara ini dan dilakukan dengan menggunakan kriteria sitologi yang baik, menjadi mungkin untuk melacak pembentukan kedua sistem sel khusus individu dan mekanisme umum regulasi dan integrasi sel. sel sebagai sistem integral Sebagai contoh, aplikasi analisis sitologi komparatif semacam ini dalam penelitian sel dapat memberikan data menarik tentang organisasi halus aparatus nuklir dalam sel prokariotik, sel eukariotik bawah dan tinggi.

Ciri-ciri utama organisasi aparatus inti sel eukariotik adalah adanya aparatus permukaan yang kompleks dari nukleus, jumlah DNA yang secara signifikan lebih besar terkonsentrasi dalam kromosom dibandingkan dengan sel prokariotik, dan, akhirnya, semacam pengemasan DNA menggunakan protein utama - histon Analisis peralatan nuklir eukariota rendah memungkinkan untuk mengidentifikasi di antara mereka sel-sel yang, dalam hal struktur nukleus, menempati posisi perantara antara sel pro dan eukariotik. Flagellata lapis baja memiliki aparatus permukaan khas nukleus, tetapi kromosom mereka, seperti dalam kasus prokariota, dibentuk oleh molekul DNA berbentuk cincin, yang disusun dalam struktur kompak tanpa partisipasi histon, karakteristik semua eukariota.

Baru-baru ini, sehubungan dengan penemuan fitur-fitur mendasar dalam organisasi genom sel pro dan eukariotik, perbandingan proses transkripsi dan pematangan RNA dalam organisme ini, serta dalam mesokariota dan sel eukariota rendah, telah Menjadi penting Sebagai hasil dari perbandingan tersebut, mungkin ada perubahan signifikan telah dibuat untuk ide-ide tradisional kita tentang hubungan kekerabatan dalam kelompok utama organisme dan, khususnya, hubungan antara sel pro dan eukariotik.

Contoh kedua dari penerapan tradisional pendekatan evolusioner untuk masalah sitologi dapat dicoba untuk mengajukan hipotesis komplikasi mekanisme distribusi kromosom yang sama-sama turun-temurun antara sel anak dalam proses evolusi, yang dikembangkan atas dasar perbandingan analisis berbagai varian divergensi kromosom pada protozoa dan tumbuhan tingkat rendah. Dalam kasus ini, membran selubung nukleus mengambil bagian aktif dalam proses pemisahan kromosom, yang memungkinkan homologi tertentu dengan sel prokariotik, di mana membran sel memainkan peran utama dalam distribusi seragam kromosom saudara di antara sel anak. .

Akhirnya, hipotesis simbiosis yang diterima secara luas tentang asal usul mitokondria dan kloroplas dapat menjadi contoh ketiga dari pendekatan evolusioner tradisional untuk masalah sitologi umum. Esensinya terletak pada asumsi bahwa organel penting metabolisme energi ini muncul dari organisme prokariotik yang menginvasi sel eukariotik pada tahap evolusi eukariotik yang relatif awal.

Terlepas dari pentingnya konstruksi biologis umum semacam ini untuk pengembangan sitologi umum, pendekatan historis tradisional untuk pengembangan masalah sitologi umum sekarang masih agak terbatas penggunaannya. Salah satu alasan utama untuk situasi ini adalah adanya fitur spesifik dan masih kurang dipelajari dari proses evolusi pada tingkat organisasi seluler dan subseluler, yang membuatnya sangat sulit untuk menentukan hubungan antara kelompok individu organisme uniseluler, dan, akibatnya , konstruksi hipotesis nyh evolusioner yang masuk akal di bidang sitologi umum.

Saat ini, aspek lain dari penggunaan metode sitologi komparatif lebih luas, tidak mengejar tujuan klarifikasi langsung dari persyaratan historis dari struktur atau proses seluler tertentu. Dalam sitologi umum modern, aspek penerapan metode komparatif ini telah mengalami beberapa modifikasi.

Pada tahap pertama, selama pengenalan metode morfobiokimia baru yang mendasar ke dalam praktik analisis sitologi, pilihan objek penelitian ditentukan oleh pertimbangan berikut. Pertama, kenyamanan objek ini atau itu untuk penerapan metode yang digunakan penting. Kedua, tingkat ekspresi sifat ini dalam sel yang dipelajari memainkan peran penting. Jadi, untuk mempelajari pola umum organisasi sel eukariotik, sel hati mamalia dengan sistem organel membran yang berkembang secara harmonis adalah objek favorit mamalia.

Untuk studi sitologi dan biologi molekuler yang kompleks tentang organisasi sel prokariotik, Escherichia coli banyak digunakan; Model untuk mempelajari organisasi eukariota rendah adalah ragi dan jamur. Pada saat yang sama, ternyata keteraturan yang ditetapkan pada objek-objek ini memiliki makna universal, karena dalam banyak kasus mereka pada dasarnya serupa di semua sel eukariotik atau semua sel prokariotik. Selain itu, sejumlah pola organisasi subselular, terutama pada tingkat molekuler dan supramolekul, ternyata bersifat universal untuk sel baik tipe pro maupun eukariotik (organisasi membran, prinsip struktur ribosom, dll.), meskipun fakta bahwa jenis sel ini pada dasarnya berbeda satu sama lain dalam beberapa hal. Keadaan ini memunculkan gagasan bahwa adalah mungkin untuk mengembangkan masalah sitologi umum utama pada rentang objek terbatas yang secara metodologis nyaman, dan kemudian memperluas pola yang ditetapkan ke sel lain karena organisasi mereka yang secara fundamental serupa.

Namun, dalam beberapa tahun terakhir penggunaan pendekatan komparatif yang disederhanakan seperti itu mulai dikritik karena metode sitologi modern diperkenalkan ke dalam ilmu biologi khusus sel - sitologi tertentu, protozoologi, botani tumbuhan tingkat rendah. Analisis morfobiokimia yang diterapkan dalam bidang ilmu ini memungkinkan untuk menetapkan fakta yang membuktikan keragaman yang sangat besar dari implementasi spesifik dari satu atau beberapa fitur umum lainnya dari organisasi sel, keragamannya jauh lebih besar daripada yang mengikuti dari hasil yang diperoleh sebelumnya pada "model " objek. Keragaman ini terutama besar pada subsistem tertinggi dan tingkat sistemik organisasi sel. Ini juga khas untuk proses kompleks dan multikomponen seperti proses metabolisme dan transportasi intraseluler atau distribusi materi genetik yang sama secara turun-temurun selama pembelahan sel.

Generalisasi bahan sitologi komparatif besar, yang diperoleh pada tingkat kemampuan metodologis modern, memaksa kami untuk meninggalkan gagasan sederhana yang disebutkan di atas tentang peran metode komparatif. Dalam hal ini, dalam sitologi umum (terutama yang berkaitan dengan sel eukariotik), posisi dominan diperoleh dengan gagasan tentang perlunya menggunakan metode komparatif untuk analisis sistem sel individu atau proses yang serupa dalam aktivitas fungsional di semua berbagai manifestasinya dalam sel tertentu.RES tidak disebabkan oleh sel "khas", "rata-rata", tetapi, sebaliknya, oleh sel yang menyimpang tajam dari jenis organisasi rata-rata, sel di mana tanda-tanda tertentu mengalami hipertrofi.

Jumlah terbesar dari varian "penghindaran" tersebut ditemukan di antara sel-sel organisme multiseluler yang lebih tinggi, di mana spesialisasi sel yang luas sebagai bagian dari sistem jaringan individu dikembangkan. Kasus "penyimpangan" dari tipe menengah juga tersebar luas di antara protozoa tingkat tinggi, yang telah mengalami evolusi, sambil mempertahankan tingkat organisasi uniseluler. Selama studi jenis sel atipikal inilah dimungkinkan untuk mengungkapkan sejumlah besar fakta menarik baru yang secara signifikan memperdalam pemahaman kita tentang hukum umum organisasi seluler dan plastisitas evolusionernya, yang menentukan keragaman yang diamati dari sistem seluler. . Pada saat yang sama, seperti yang telah disebutkan di atas, dalam kasus ilmu-ilmu khusus, manifestasi khusus dari ciri-ciri umum yang menjadi ciri semua sel di berbagai objek adalah yang paling menarik.

Berbeda dengan ilmu-ilmu khusus, dengan pendekatan sitologi umum, pertanyaan ini diajukan dalam bidang yang sedikit berbeda, karena peneliti berusaha untuk mengetahui seberapa luas manifestasi spesifik dari suatu sifat tertentu dalam sel yang berbeda, kombinasi mekanisme umum dan apa. apa sebenarnya itu karena. Jadi, misalnya, ahli protozoologi berhasil menemukan dinamika yang sangat menarik dari pembentukan makronukleus setelah konjugasi pada ciliata gastrociliary. Dalam makronukleus yang muncul, peningkatan yang signifikan dalam jumlah DNA terjadi, dan kemudian terjadi pengurangan tajam dalam bahan herediter (hingga 93%). Proses reduksi materi genetik semacam itu juga terjadi di sel somatik sejumlah kelompok hewan multiseluler (beberapa serangga, nematoda). DNA yang tersisa, dalam jumlah total kecil, tetapi mengandung semua informasi yang diperlukan untuk fungsi makronukleus, direplikasi berkali-kali. Akibatnya, makronukleus definitif dibuat, yang berbeda dari mikronukleus tidak hanya dalam jumlah DNA, tetapi juga dalam komposisi kualitatifnya. Sebagian besar gen yang tidak berfungsi tidak ada di sini, sementara lokus yang berfungsi diwakili oleh sejumlah besar salinan.

Fakta-fakta ini menjadi perhatian sitologi umum yang besar justru karena, sebagai aturan, fenomena yang diamati di sini bukan hanya fitur paradoks yang hanya menjadi ciri organisme uniseluler yang lebih tinggi. Dengan demikian, proses politenisasi, replikasi selektif bagian-bagian individu DNA kromosom, dan, akhirnya, pengurangan selektif bagian-bagian penting dari genom - semua fenomena ini juga terjadi dalam sel-sel khusus organisme multiseluler. Mereka dilakukan, mungkin, berdasarkan mekanisme dasar yang umum. Dan kekhususan dari proses kompleks perubahan pada aparatus nuklir selama pembentukan makronukleus pada ciliates gastrociliated terutama disebabkan oleh kombinasi khusus dari mekanisme dasar universal umum untuk sel eukariotik. Gagasan semacam ini sekarang banyak digunakan dalam sitologi umum. Mereka sangat merangsang studi sitologi komparatif diarahkan ditujukan untuk penjelasan masalah sitologi umum yang penting. bahan dari situs

Contoh studi sitologi komparatif yang ditargetkan adalah studi tentang mekanisme distribusi herediter yang sama dari kromosom selama mitosis pada eukariota dengan menganalisis mitosis berbagai jenis diatom: pada objek ini, berbeda dengan mitosis khas sel metazoa, itu adalah dimungkinkan untuk secara jelas melacak perubahan kompleks secara morfologis di pusat pengorganisasian mikrotubulus, pembentukan dan divergensi timbal balik semi-spindel mikrotubulus, divergensi kromosom ke kutub sel dengan bantuan pembentukan dalam metafase struktur aneh - kerah.

Mengingat data terbaru tentang peran utama sistem mekanokimia tubulin-dynein dalam pergerakan anafase kromosom dalam sel metazoan, sangat mungkin bahwa sistem ini juga hadir dalam diatom, yaitu di sini juga, hanya ada yang aneh. kombinasi mekanisme dasar yang umum untuk semua sel dan menyebabkan proses mekanokimia selama mitosis.

Jelas, untuk analisis mekanisme ini, yang penjelasannya merupakan salah satu masalah paling mendesak dari sitologi umum, akan menjanjikan untuk memiliki objek seperti itu di mana mereka secara jelas dibedakan dan diekspresikan secara morfologis.

Jumlah contoh seperti itu terus bertambah. Hal ini disebabkan, di satu sisi, dengan semakin meluasnya pengenalan metode modern yang kompleks ke dalam praktik studi sitologi, protozoologi dan botani tertentu, di sisi lain, akumulasi dalam studi sitologi komparatif itu sendiri dari fakta-fakta yang semakin meningkat. penting untuk sitologi umum dan menjadi pusat perhatiannya. Dan semua ini, pada gilirannya, mengarah pada fakta bahwa analisis sitologi komparatif mulai menempati tempat yang sangat penting dalam sitologi.

Deskripsi singkat tentang arah utama dan aspek penelitian sitologi umum modern menunjukkan bahwa pada tahap ini dalam pengembangan sitologi, ada perbedaan yang cukup jelas antara area individu dan sintesisnya. Ada perbedaan baik dalam istilah metodologis maupun dalam hal logika pemecahan masalah tertentu yang ditetapkan dalam setiap arah dan pendekatan. Dalam aspek morfofungsional studi sitologi, pendekatan diskrit untuk analisis struktur seluler mendominasi. Salah satu fitur terpenting dari pendekatan eksperimental untuk mempelajari pola organisasi seluler adalah fokusnya pada analisis mekanisme integrasi umum organisasi sistem seluler dan seluruh sel. Pada saat yang sama, seperti yang telah ditekankan di atas, pemecahan masalah yang dihadapi studi semacam itu tidak mungkin tanpa meluasnya penggunaan metode yang melekat pada pendekatan morfofungsional. Analisis eksperimental memberikan karakterisasi fenomenologis dari sifat-sifat mekanisme seluler tertentu dan proses intraseluler, sehingga menciptakan dasar yang diperlukan untuk penerapan gudang kaya metode struktural dan biokimia.

Jadi, pada tahap perkembangan sitologi umum saat ini, ada prasyarat untuk kombinasi yang sangat dekat dari kedua aspek studi sitologi ini. Ini wajar, karena pada akhirnya kedua pendekatan mengejar tujuan yang sama - untuk menjelaskan organisasi fungsional struktur seluler dan mekanisme pengaturan proses dalam sistem seluler integral.

Pendekatan sitologi komparatif untuk analisis masalah sitologi umum menempati posisi khusus dalam sitologi umum modern. Analisis sitologi komparatif dilakukan berdasarkan data yang diperoleh berdasarkan pendekatan morfofungsional dan eksperimental, yaitu, secara metodis, semua aspek utama studi sitologi terkait erat satu sama lain.

Kekhususan pendekatan sitologi komparatif, kekhususan yang menentukan posisi khususnya, adalah penggunaan yang disengaja dari berbagai objek satwa liar untuk mempelajari pola umum organisasi struktur seluler individu, proses intraseluler dan mekanisme integrasi dalam semua variasi manifestasinya di berbagai jenis sel.

Jadi, seperti dapat dilihat di atas, arah utama penelitian sitologi sangat menentukan kekhususan tahap saat ini dalam pengembangan sitologi umum dan menentukan hubungannya yang erat dengan ilmu biologi terkait. Salah satu ciri paling khas dari tahap ini adalah keterkaitan yang erat dari semua bidang penelitian sitologi yang paling penting dalam arti metodologis. Selain itu, integrasi metodis seperti itu sering melampaui lingkup sitologi umum.

Dalam pekerjaan sitologi, metode biokimia murni dan biologi molekuler banyak digunakan, dan sebaliknya, dalam studi biokimia dan biologi molekuler, metode morfologi sitologi banyak digunakan. Integrasi metodis dari ilmu-ilmu terkait dan kesatuan tujuan akhir mereka mengarah pada pembentukan ilmu sintetis baru dari biologi sel - sel. Ini menggabungkan sitologi, biokimia struktural, biologi molekuler, genetika molekuler dan ilmu biologi swasta tentang tingkat seluler organisasi. Persatuan ilmu-ilmu terkait seperti itu tidak diragukan lagi merupakan fenomena progresif. Namun, terlepas dari sintesis semacam itu, masing-masing ilmu mempertahankan kekhususan metodologis dan spesifiknya dalam perumusan dan metode pengembangan masalah organisasi sel. Saat ini, posisi dominan dalam ilmu sintetik ini adalah milik penelitian di bidang biologi molekuler dan genetika molekuler. Situasi ini disebabkan oleh kemajuan pesat pengetahuan kita tentang tingkat organisasi sel yang lebih rendah, tetapi ini hanya fenomena sementara.

Faktanya, tempat terdepan dalam ilmu sintetis sel yang baru harus ditempati oleh sitologi umum - ilmu tentang pola umum tingkat seluler organisasi materi hidup. Dari ilmu biologi modern yang berurusan dengan tingkat organisasi materi hidup ini, sitologi umum, memperluas pendekatan sitologi komparatif yang bertujuan berdasarkan metode biokimia struktural, paling siap untuk generalisasi biologis umum yang mendalam dari sejumlah besar bahan faktual pada analisis diskrit struktur sel individu-ny dalam berbagai jenis sel. Posisi terdepan harus diambil oleh sitologi umum dalam analisis mekanisme integrasi seluler umum. Prasyarat penting untuk ini adalah perkembangan pesat model eksperimental baru. Analisis mendalam mereka dengan metode modern dan pengenalan luas model eksperimental dalam studi sitologi komparatif yang ditargetkan harus memastikan kemajuan dalam memecahkan salah satu masalah utama organisasi sel - masalah integrasi sel.

Dengan akumulasi materi faktual tentang mekanisme universal dasar integrasi sel dan ruang lingkup modifikasinya, sitologi umum dihadapkan pada tugas untuk melakukan analisis mendalam tentang persyaratan historis organisasi sistem seluler dan organisasi seluler tertentu. secara keseluruhan, serta kekhasan proses evolusi pada tingkat seluler dan subseluler organisasi materi hidup. Pemecahan masalah ini difasilitasi oleh kecenderungan yang sekarang muncul dengan jelas dalam studi sitologi umum untuk menggabungkan analisis diskrit komponen individu sel dengan studi kg-nya. ke sistem yang lengkap.

Di halaman ini, materi tentang topik:

Rencana:

1. Apa yang dipelajari sitologi.

2. Gagasan bahwa organisme terdiri dari sel.

3. Metode penelitian yang digunakan dalam sitologi.

4. Fraksinasi sel.

5. Otografi radio.

6. Menentukan durasi beberapa tahapan siklus sel dengan autoradiografi.

Sitologi adalah ilmu tentang sel. Itu menonjol dari lingkungan ilmu biologi lainnya hampir 100 tahun yang lalu. Untuk pertama kalinya, informasi umum tentang struktur sel dikumpulkan dalam buku oleh J.-B. The Biology of the Cell karya Carnoy, diterbitkan pada tahun 1884. Sitologi modern mempelajari struktur sel, fungsinya sebagai sistem kehidupan dasar: fungsi komponen seluler individu, proses reproduksi sel, perbaikannya, adaptasi terhadap kondisi lingkungan, dan banyak proses lainnya dipelajari, yang memungkinkan untuk menilai sifat dan fungsi umum untuk semua sel. Sitologi juga mempertimbangkan fitur struktural sel khusus. Dengan kata lain, sitologi modern adalah fisiologi sel. Sitologi terkait erat dengan pencapaian ilmiah dan metodologis biokimia, biofisika, biologi molekuler, dan genetika. Ini menjadi dasar untuk studi mendalam tentang sel dari sudut pandang ilmu-ilmu ini dan munculnya ilmu sintetis tertentu dari sel - biologi sel, atau biologi sel. Saat ini, istilah sitologi dan biologi sel bertepatan, karena subjek studinya adalah sel dengan pola organisasi dan fungsinya sendiri. Disiplin "Biologi Sel" mengacu pada bagian dasar biologi, karena mempelajari dan menjelaskan satu-satunya unit dari semua kehidupan di Bumi - sel.

Sebuah studi panjang dan dekat sel seperti itu menyebabkan perumusan generalisasi teoretis penting dari signifikansi biologis umum, yaitu munculnya teori sel. Pada abad ke-17 Robert Hooke, seorang fisikawan dan ahli biologi yang sangat cerdas, menciptakan mikroskop. Saat memeriksa bagian tipis gabus di bawah mikroskopnya, Hooke menemukan bahwa gabus itu terdiri dari sel-sel kecil yang kosong yang dipisahkan oleh dinding tipis, yang, seperti yang kita ketahui sekarang, terdiri dari selulosa. Dia menyebut sel-sel kecil ini sel. Kemudian, ketika ahli biologi lain mulai memeriksa jaringan tanaman di bawah mikroskop, ternyata sel-sel kecil yang ditemukan oleh Hooke di gabus kering yang mati juga ditemukan di jaringan tanaman hidup, tetapi mereka tidak kosong, tetapi masing-masing berisi tubuh kecil agar-agar. . Setelah pemeriksaan mikroskopis jaringan hewan, ditemukan bahwa mereka juga terdiri dari tubuh agar-agar kecil, tetapi tubuh ini jarang dipisahkan satu sama lain oleh dinding. Sebagai hasil dari semua studi ini, pada tahun 1939, Schleiden dan Schwann secara independen merumuskan teori sel, yang menyatakan bahwa sel adalah unit dasar dari mana semua tumbuhan dan semua hewan pada akhirnya dibangun. Untuk beberapa waktu, makna ganda dari kata sel masih menyebabkan beberapa kesalahpahaman, tetapi kemudian tertanam kuat di tubuh kecil seperti jeli ini.

Pemahaman modern tentang sel erat kaitannya dengan kemajuan teknis dan perbaikan metode penelitian. Selain mikroskop cahaya konvensional, yang tidak kehilangan perannya, mikroskop polarisasi, ultraviolet, fluoresensi, dan kontras fase telah menjadi sangat penting dalam beberapa dekade terakhir. Di antara mereka, tempat khusus ditempati oleh mikroskop elektron, yang resolusinya memungkinkan untuk menembus dan mempelajari struktur submikroskopik dan molekul sel. Metode penelitian modern telah memungkinkan untuk mengungkapkan gambaran rinci tentang organisasi seluler.

Setiap sel terdiri dari nukleus dan sitoplasma, dipisahkan satu sama lain dan dari lingkungan luar oleh membran. Komponen sitoplasma adalah: membran, hialoplasma, retikulum endoplasma dan ribosom, aparatus Golgi, lisosom, mitokondria, inklusi, pusat sel, organel khusus.

Bagian dari organisme yang melakukan fungsi tertentu disebut organ. Setiap organ - paru-paru, hati, ginjal, misalnya - masing-masing memiliki struktur khusus sendiri, berkat itu ia memainkan peran tertentu dalam tubuh. Dengan cara yang sama, ada struktur khusus dalam sitoplasma, struktur khusus yang memungkinkan mereka untuk melakukan fungsi-fungsi tertentu yang diperlukan untuk metabolisme sel; struktur ini disebut organel ("organ kecil").

Penjelasan tentang sifat, fungsi dan distribusi organel sitoplasma menjadi mungkin hanya setelah pengembangan metode biologi sel modern. Yang paling berguna dalam hal ini adalah: 1) mikroskop elektron; 2) fraksinasi sel, dengan bantuan ahli biokimia yang dapat mengisolasi fraksi sel yang relatif murni yang mengandung organel tertentu, dan dengan demikian mempelajari reaksi metabolisme individu yang menarik bagi mereka; 3) autoradiografi, yang memungkinkan studi langsung reaksi metabolisme individu yang terjadi di organel.

Metode di mana organel diisolasi dari sel disebut fraksinasi. Metode ini terbukti sangat bermanfaat, memberikan ahli biokimia kemampuan untuk mengisolasi berbagai organel sel dalam bentuk yang relatif murni. Ini juga memungkinkan untuk menentukan komposisi kimia organel dan enzim yang terkandung di dalamnya dan, berdasarkan data yang diperoleh, untuk menarik kesimpulan tentang fungsinya di dalam sel. Sebagai langkah pertama, sel-sel dihancurkan dengan homogenisasi dalam beberapa media yang sesuai yang mempertahankan organel dan mencegah agregasinya. Sangat sering, larutan sukrosa digunakan untuk ini. Meskipun mitokondria dan banyak organel sel lainnya tetap utuh, kekusutan membran seperti retikulum endoplasma dan membran plasma terurai menjadi fragmen-fragmen. Namun, fragmen membran yang dihasilkan sering menutup sendiri, menghasilkan gelembung bulat dengan berbagai ukuran.

Pada tahap berikutnya, homogenat sel dikenai serangkaian sentrifugasi, kecepatan dan durasi yang meningkat setiap kali; proses ini disebut sentrifugasi diferensial. Organel sel yang berbeda disimpan di bagian bawah tabung sentrifugasi pada kecepatan sentrifugasi yang berbeda, tergantung pada ukuran, kepadatan dan bentuk organel. Endapan yang dihasilkan dapat diambil sampelnya dan diperiksa. Struktur yang lebih besar dan lebih padat seperti nukleus mengendap paling cepat, sementara struktur yang lebih kecil dan kurang padat, seperti vesikel retikulum endoplasma, membutuhkan kecepatan yang lebih tinggi dan waktu yang lebih lama. Oleh karena itu, pada kecepatan sentrifugasi rendah, inti diendapkan, sementara organel sel lainnya tetap dalam suspensi. Pada kecepatan yang lebih tinggi, mitokondria dan lisosom diendapkan, dan dengan sentrifugasi yang lama dan kecepatan yang sangat tinggi, bahkan partikel kecil seperti ribosom mengendap. Endapan dapat diperiksa menggunakan mikroskop elektron untuk mengetahui kemurnian fraksi yang dihasilkan. Semua fraksi terkontaminasi sampai batas tertentu dengan organel lain. Namun, jika memungkinkan untuk mencapai kemurnian fraksi yang cukup, maka fraksi tersebut kemudian dikenai analisis biokimia untuk menentukan komposisi kimia dan aktivitas enzimatik dari organel yang diisolasi.

Untuk kemajuan histologi, sitologi dan embriologi, pengenalan pencapaian fisika dan kimia, metode baru ilmu terkait - biokimia, biologi molekuler, rekayasa genetika sangat penting.

Metode penelitian modern memungkinkan untuk mempelajari jaringan tidak hanya secara keseluruhan, tetapi juga untuk mengisolasi jenis sel individu dari mereka untuk mempelajari aktivitas vital mereka untuk waktu yang lama, untuk mengisolasi organel sel individu dan makromolekulnya (misalnya, DNA), dan untuk mempelajari fitur fungsional mereka.

Peluang tersebut telah terbuka sehubungan dengan penciptaan instrumen dan teknologi baru - berbagai jenis mikroskop, teknologi komputer, analisis difraksi sinar-X, penggunaan resonansi magnetik nuklir (NMR), isotop radioaktif dan autoradiografi, elektroforesis dan kromatografi, fraksinasi isi sel menggunakan ultrasentrifugasi, pemisahan dan budidaya sel, memperoleh hibrida; penggunaan metode bioteknologi - memperoleh hibridoma dan antibodi monoklonal, DNA rekombinan, dll.

Dengan demikian, objek biologis dapat dipelajari pada tingkat jaringan, seluler, subseluler, dan molekuler. Terlepas dari pengenalan berbagai metode biokimia, biofisika, fisik dan teknologi ke dalam ilmu alam yang diperlukan untuk memecahkan banyak masalah yang berkaitan dengan aktivitas vital sel dan jaringan, histologi pada dasarnya tetap merupakan ilmu morfologi dengan serangkaian metodenya sendiri. Yang terakhir memungkinkan untuk mengkarakterisasi proses yang terjadi dalam sel dan jaringan, fitur strukturalnya.

Tahap utama analisis sitologi dan histologis adalah pilihan objek penelitian, persiapannya untuk pemeriksaan di bawah mikroskop, penggunaan metode mikroskop, dan analisis gambar kualitatif dan kuantitatif.

Objek penelitian adalah sel dan jaringan hidup dan tetap, gambarnya diperoleh dalam mikroskop cahaya dan elektron atau pada layar tampilan televisi. Ada sejumlah metode yang memungkinkan analisis objek-objek ini.

Metode mikroskopi preparat histologis

Metode utama untuk mempelajari objek mikro biologis adalah mikroskop cahaya dan elektron, yang banyak digunakan dalam praktik eksperimental dan klinis.

Mikroskopi adalah metode utama mempelajari benda-benda mikro yang digunakan dalam biologi selama lebih dari 300 tahun. Sejak penciptaan dan penggunaan mikroskop pertama, mereka terus ditingkatkan. Mikroskop modern adalah berbagai sistem optik kompleks dengan resolusi tinggi. Ukuran struktur terkecil yang dapat dilihat di bawah mikroskop ditentukan oleh jarak terkecil yang dapat diselesaikan (d o ), yang terutama bergantung pada panjang gelombang cahaya. (\) dan panjang gelombang osilasi elektromagnetik dari aliran elektron, dll. Ketergantungan ini kira-kira ditentukan oleh rumus d 0 = 1 / 2 \. Dengan demikian, semakin kecil panjang gelombang, semakin kecil jarak yang dapat dipecahkan dan semakin kecil struktur mikro yang dapat dilihat pada preparasi. Berbagai jenis mikroskop cahaya dan mikroskop elektron digunakan untuk mempelajari preparat histologis.

Beras. 1. Mikroskop untuk penelitian biologi.

A - mikroskop biologis ringan "Biolam-S": 1 - alas; 2 - pemegang tabung; 3 - tabung miring; 4 - lensa mata, 5 - revolver; 6 - lensa; 7 - meja; 8 - kondensor dengan diafragma iris; 9 - sekrup kondensor; 10 - cermin; 11 - sekrup mikrometer; 12 - sekrup makrometrik. B - mikroskop elektron EMV-100AK dengan sistem pemrosesan gambar otomatis: 1 - kolom mikroskop (dengan sistem elektron-optik dan kamera untuk sampel); 2 - panel kontrol; 3 - kamera dengan layar bercahaya; 4 - blok analisis gambar; 5 - sensor sinyal video.

mikroskop cahaya. Untuk mempelajari objek mikro histologis, mikroskop cahaya biasa dan varietasnya digunakan, yang menggunakan sumber cahaya dengan panjang gelombang berbeda. Dalam mikroskop cahaya konvensional, sumber penerangan adalah cahaya alami atau buatan (Gbr. 1, A). Panjang gelombang minimum dari bagian spektrum yang terlihat adalah sekitar 0,4 m. Oleh karena itu, untuk mikroskop cahaya konvensional, yang terkecil jarak resolusi sekitar 0,2 m ( melakukan = "/, - 0,4 m = 0,2 m), dan perbesaran total (hasil kali perbesaran lensa dan perbesaran okuler) bisa 1500-2500.

Jadi, dalam mikroskop cahaya, seseorang tidak hanya dapat melihat sel-sel individu dengan ukuran mulai dari 4 hingga 150 mikron, tetapi juga struktur intraselulernya - organel, inklusi. Untuk meningkatkan kontras objek mikro, pewarnaan mereka digunakan.

mikroskop ultraviolet. Ini adalah jenis mikroskop cahaya. Mikroskop ultraviolet menggunakan sinar ultraviolet yang lebih pendek dengan panjang gelombang sekitar 0,2 m. Jarak yang diselesaikan di sini adalah 2 kali lebih kecil daripada di mikroskop cahaya konvensional, dan kira-kira 0,1 m (d o = V 2 - 0,2 m = 0,1 m). Gambar yang diperoleh dalam sinar ultraviolet, tidak terlihat oleh mata, diubah menjadi gambar yang terlihat dengan mendaftar pada pelat fotografi atau dengan menggunakan perangkat khusus (layar luminescent, konverter elektron-optik).

Mikroskop fluoresen (berpendar). Fenomena fluoresensi terletak pada kenyataan bahwa atom dan molekul dari sejumlah zat, menyerap sinar panjang gelombang pendek, masuk ke keadaan tereksitasi. Transisi terbalik dari keadaan tereksitasi ke keadaan normal terjadi dengan emisi cahaya, tetapi dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Dalam mikroskop fluoresen, lampu xenon merkuri atau ultrahigh-pressure digunakan sebagai sumber cahaya untuk eksitasi fluoresensi, yang memiliki kecerahan tinggi di wilayah spektral 0,25-0,4 m (sinar ultraviolet dekat) dan 0,4-0,5 m (sinar biru-ungu) ). Panjang gelombang gelombang cahaya fluoresensi selalu lebih besar dari panjang gelombang cahaya yang menggairahkan, sehingga mereka dipisahkan menggunakan filter cahaya dan gambar objek dipelajari hanya dalam cahaya fluoresensi. Bedakan antara sendiri, atau primer, dan terinduksi, atau sekunder, fluoresensi. Setiap sel organisme hidup memiliki fluoresensinya sendiri, tetapi seringkali sangat lemah.

Serotonin, katekolamin (adrenalin, norepinefrin) yang terkandung dalam saraf, tiang dan sel lainnya memiliki fluoresensi primer setelah fiksasi jaringan dalam uap formaldehida pada 60-80 °C (metode Falk).

Fluoresensi sekunder terjadi ketika sediaan diperlakukan dengan pewarna khusus - fluorokrom.

Ada berbagai fluorokrom yang secara khusus mengikat makromolekul tertentu (acridine orange, rhodamin, fluorescein, dll.). Misalnya, saat memproses persiapan, fluorochrome acridine orange paling sering digunakan. Dalam hal ini, DNA dan senyawanya dalam sel berwarna hijau terang, dan RNA dan turunannya - cahaya merah terang. Dengan demikian, komposisi spektral radiasi membawa informasi tentang struktur internal objek dan komposisi kimianya. Sebuah varian dari metode mikroskop fluoresensi, di mana eksitasi dan emisi fluoresensi terjadi di wilayah spektrum ultraviolet, disebut metode mikroskop fluoresensi ultraviolet.

mikroskop fase kontras. Metode ini digunakan untuk mendapatkan gambar kontras tinggi dari benda hidup transparan dan tidak berwarna yang tidak terlihat dengan metode mikroskop konvensional. Seperti yang telah disebutkan, dalam mikroskop cahaya konvensional, kontras struktur yang diperlukan dicapai dengan pewarnaan. Metode kontras fase memberikan kontras dari struktur yang tidak diwarnai yang dipelajari karena diafragma annular khusus yang ditempatkan di kondensor dan pelat fase yang disebut terletak di objektif. Desain mikroskop optik ini memungkinkan untuk mengubah perubahan fase cahaya yang melewati sediaan yang tidak diwarnai, yang tidak terlihat oleh mata, menjadi perubahan amplitudonya, yaitu kecerahan gambar yang dihasilkan. Meningkatkan kontras memungkinkan Anda untuk melihat semua struktur yang berbeda dalam indeks bias. Variasi dari metode kontras fase adalah metode kontras fase-medan gelap, memberikan gambar kontras fase negatif versus positif.

Mikroskop medan gelap. Dalam mikroskop medan gelap, hanya cahaya yang mendifraksikan struktur dalam sediaan yang mencapai tujuan. Ini terjadi karena adanya kondensor khusus di mikroskop, yang menerangi sediaan dengan cahaya yang sangat miring; sinar dari iluminator diarahkan dari samping. Dengan demikian, bidang terlihat gelap, dan partikel kecil dalam preparasi memantulkan cahaya, yang kemudian memasuki lensa. Resolusi mikroskop ini tidak bisa lebih baik daripada mikroskop medan terang karena panjang gelombang yang sama digunakan. Tetapi ada lebih banyak kontras di sini. Ini digunakan untuk mempelajari objek hidup, objek autoradiografi seperti butiran perak yang tampak terang di bidang gelap. Di klinik, digunakan untuk mempelajari kristal dalam urin (asam urat, oksalat), untuk menunjukkan spirochetes, khususnya treponema pallidum, yang menyebabkan sifilis, dll.

mikroskop interferensi. Varietas mikroskop kontras fase adalah mikroskop interferensi, yang dirancang untuk mengukur massa jaringan, dan mikroskop interferensi diferensial (dengan optik Nomarsky), yang secara khusus digunakan untuk mempelajari relief permukaan sel dan objek biologis lainnya.

Dalam mikroskop interferensi, berkas cahaya dari iluminator dibagi menjadi dua aliran: satu melewati objek dan mengubah fase osilasi, yang kedua melewati objek. Pada prisma objektif, kedua balok dihubungkan dan saling berinterferensi. Akibatnya, sebuah gambar dibangun di mana bagian dari objek mikro dengan ketebalan dan kepadatan berbeda berbeda kontras. Setelah mengukur perubahan, tentukan konsentrasi dan massa bahan kering.

Mikroskop fase-kontras dan interferensi memungkinkan untuk mempelajari sel-sel hidup. Mereka menggunakan efek interferensi yang terjadi ketika dua set gelombang digabungkan untuk membuat gambar struktur mikro. Keuntungan dari mikroskop fase kontras, interferensi dan medan gelap adalah kemampuan untuk mengamati sel dalam proses pergerakan dan mitosis. Dalam hal ini, pergerakan sel dapat direkam menggunakan microfilming selang waktu (frame-by-frame).

mikroskop polarisasi. Mikroskop polarisasi adalah modifikasi dari mikroskop cahaya di mana dua filter polarisasi dipasang - yang pertama (polarizer) antara berkas cahaya dan objek, dan yang kedua (analyzer) antara lensa objektif dan mata. Cahaya melewati filter pertama hanya dalam satu arah, filter kedua memiliki sumbu utama yang tegak lurus dengan filter pertama, dan tidak mentransmisikan cahaya. Ini menciptakan efek medan gelap. Kedua filter dapat diputar untuk mengubah arah pancaran cahaya. Jika alat analisa diputar 90° terhadap polarisator, tidak ada cahaya yang akan melewatinya. Struktur yang mengandung molekul berorientasi longitudinal (kolagen, mikrotubulus, mikrofilamen) dan struktur kristal (dalam sel Leydig 1) tampak bercahaya ketika sumbu rotasi berubah. Kemampuan kristal atau formasi parakristalin untuk memecah gelombang cahaya menjadi gelombang biasa dan gelombang tegak lurus disebut birefringence. Kemampuan ini dimiliki oleh serabut-serabut otot lurik.

Mikroskop elektron. Sebuah langkah maju yang besar dalam perkembangan teknologi mikroskop adalah penciptaan dan penggunaan mikroskop elektron (lihat Gambar 1, B). Mikroskop elektron menggunakan aliran elektron dengan panjang gelombang lebih pendek dari mikroskop cahaya. Pada tegangan 50.000 V, panjang gelombang osilasi elektromagnetik yang timbul dari pergerakan aliran elektron dalam ruang hampa adalah 0,0056 nm. Secara teoritis dihitung bahwa jarak yang dapat diselesaikan dalam kondisi ini bisa sekitar 0,002 nm, atau 0,000002 m, yaitu. 100.000 kali lebih sedikit; daripada di mikroskop cahaya. Dalam praktiknya, dalam mikroskop elektron modern, jarak yang dapat dipecahkan adalah sekitar 0,1-0,7 nm.

Saat ini, transmisi (transmisi) mikroskop elektron (TEM) dan pemindaian (scanning) mikroskop elektron (SEM) banyak digunakan. Dengan bantuan TEM, hanya gambar planar dari objek mikro yang diteliti yang dapat diperoleh. Untuk mendapatkan representasi spasial dari struktur, digunakan SEM yang dapat membuat gambar tiga dimensi. Mikroskop elektron pemindaian bekerja berdasarkan prinsip pemindaian objek yang sedang dipelajari dengan mikroprobe elektron, yaitu, secara berurutan "merasakan" titik-titik individual permukaan dengan berkas elektron yang terfokus tajam. Untuk mempelajari area yang dipilih, mikroprobe bergerak di sepanjang permukaannya di bawah aksi defleksi kumparan (prinsip pemindaian televisi). Pemeriksaan objek semacam itu disebut pemindaian (pembacaan), dan pola di mana mikroprobe bergerak disebut raster. Gambar yang dihasilkan ditampilkan di layar televisi, berkas elektron yang bergerak secara serempak dengan mikroprobe.

Keuntungan utama dari pemindaian mikroskop elektron adalah kedalaman bidang yang besar, berbagai perubahan perbesaran yang terus menerus (dari puluhan hingga puluhan ribu kali) dan resolusi tinggi.

Mikroskop elektron beku- chipping digunakan untuk mempelajari detail struktur membran dan hubungan antar sel. Sel dibekukan pada suhu rendah (-160°C) untuk membuat keripik. Saat memeriksa membran, bidang pembelahan melewati bagian tengah lapisan ganda lipid. Selanjutnya, logam (platinum, paladium, uranium) diendapkan pada permukaan bagian dalam dari bagian membran yang diperoleh, dipelajari menggunakan TEM dan mikrofotografi.

Metode mikroskop cryoelectron. Lapisan tipis yang membeku dengan cepat (sekitar 100 nm) dari sampel jaringan ditempatkan pada kisi mikroskopis dan diperiksa di bawah mikroskop vakum pada -160°C.

Metode mikroskop elektron "pembekuan"- etsa" digunakan untuk mempelajari permukaan luar membran sel. Setelah dengan cepat membekukan sel pada suhu yang sangat rendah, balok itu dibelah dengan pisau. Kristal es yang dihasilkan dihilangkan dengan sublimasi air dalam ruang hampa. Kemudian area sel diarsir dengan menyemprotkan film tipis logam berat (misalnya, platinum). Metode ini memungkinkan untuk mengungkapkan organisasi struktur tiga dimensi.

Dengan demikian, metode pembekuan-pembelahan dan pembekuan-etsa memungkinkan untuk mempelajari sel-sel non-tetap tanpa pembentukan artefak yang diinduksi fiksasi di dalamnya.

Metode kontras dengan garam logam berat memungkinkan untuk mempelajari makromolekul individu - DNA, protein besar (misalnya, miosin) dalam mikroskop elektron. Dengan kontras negatif, agregat makromolekul (ribosom, virus) atau filamen protein (filamen aktin) dipelajari.

Mikroskop elektron dari bagian ultra tipis yang diperoleh dengan cryoultra-microtomy. Dengan metode ini, potongan jaringan tanpa fiksasi dan penuangan ke media padat didinginkan dengan cepat dalam nitrogen cair pada suhu -196 °C. Ini memberikan penghambatan proses metabolisme sel dan transisi air dari fase cair ke padat. Selanjutnya, blok dipotong pada ultramikrotom pada suhu rendah. Metode pemotongan ini biasanya digunakan untuk menentukan aktivitas enzim, serta untuk melakukan reaksi imunokimia. Untuk mendeteksi antigen, antibodi yang terkait dengan partikel koloid emas digunakan, yang lokalisasinya mudah diidentifikasi pada sediaan.

Metode mikroskop tegangan ultra tinggi. Mikroskop elektron dengan tegangan percepatan hingga 3.000.000 V digunakan.Keuntungan dari mikroskop ini adalah memungkinkan Anda untuk mempelajari objek dengan ketebalan besar (1-10 mikron), karena pada energi elektron tinggi mereka kurang diserap oleh objek. Pencitraan stereoskopik memungkinkan memperoleh informasi tentang organisasi tiga dimensi struktur intraseluler dengan resolusi tinggi (sekitar 0,5 nm).

Analisis difraksi sinar-X. Untuk mempelajari struktur makromolekul pada tingkat atom, digunakan metode dengan menggunakan sinar-X yang memiliki panjang gelombang sekitar 0,1 nm (diameter atom hidrogen). Molekul yang membentuk kisi kristal dipelajari dengan menggunakan pola difraksi, yang direkam pada pelat fotografi dalam bentuk banyak titik dengan intensitas yang bervariasi. Intensitas bintik-bintik tergantung pada kemampuan berbagai objek dalam array untuk menyebarkan radiasi. Posisi bintik-bintik dalam pola difraksi tergantung pada posisi objek dalam sistem, dan intensitasnya menunjukkan struktur atom internalnya.

Metode untuk mempelajari sel dan jaringan tetap

Mempelajari sel dan jaringan tetap. Objek utama penelitian adalah persiapan histologis, dibuat dari struktur tetap. Obat dapat berupa apusan (misalnya, apusan darah, sumsum tulang, air liur, cairan serebrospinal, dll.), jejak (misalnya, limpa, timus, hati), lapisan jaringan (misalnya, ikat atau peritoneal, pleura, pia mater) , dipotong tipis. Paling sering, bagian dari jaringan atau organ digunakan untuk studi. Persiapan histologis dapat dipelajari tanpa pemrosesan khusus. Misalnya, apusan darah, cetakan, film, atau bagian organ yang telah disiapkan dapat segera dilihat di bawah mikroskop. Tetapi karena fakta bahwa strukturnya memiliki "kontras yang lemah", mereka kurang terdeteksi dalam mikroskop cahaya konvensional dan penggunaan mikroskop khusus (kontras fase, dll.) Oleh karena itu, persiapan yang diproses secara khusus lebih sering digunakan.

Proses pembuatan preparat histologi untuk mikroskop cahaya dan elektron meliputi langkah-langkah utama berikut: 1) mengambil bahan dan memperbaikinya, 2) memadatkan bahan, 3) mempersiapkan bagian, 4) pewarnaan atau kontras bagian. Untuk mikroskop cahaya, satu langkah lagi diperlukan - kesimpulan bagian dalam balsem atau media transparan lainnya (5). Fiksasi memastikan pencegahan proses dekomposisi, yang membantu menjaga integritas struktur. Hal ini dicapai dengan fakta bahwa sampel kecil yang diambil dari suatu organ direndam dalam fiksatif (alkohol, formalin, larutan garam logam berat, asam osmik, campuran fiksatif khusus) atau dikenai perlakuan panas. Di bawah aksi fiksatif, perubahan fisiko-kimia yang kompleks terjadi pada jaringan dan organ. Yang paling signifikan dari mereka adalah proses koagulasi protein yang tidak dapat diubah, akibatnya aktivitas vital berhenti, dan struktur menjadi mati, diperbaiki. Fiksasi mengarah pada pemadatan dan pengurangan volume potongan, serta peningkatan pewarnaan sel dan jaringan selanjutnya.

potongan penyegelan, diperlukan untuk persiapan bagian, dibuat dengan menghamili bahan yang sebelumnya dikeringkan dengan parafin, seloidin, resin organik. Pemadatan yang lebih cepat dicapai dengan menggunakan metode pembekuan potongan, misalnya dalam asam karbonat cair.

Persiapan bagian diproduksi pada perangkat khusus - mikrotom(untuk mikroskop cahaya) dan ultramikrotom(untuk mikroskop elektron).

Pewarnaan bagian(dalam mikroskop cahaya) atau menyemprotnya dengan garam logam(dalam mikroskop elektron) digunakan untuk meningkatkan kontras gambar struktur individu bila dilihat di bawah mikroskop. Metode pewarnaan struktur histologis sangat beragam dan dipilih tergantung pada tujuan penelitian. Pewarnaan histologis dibagi menjadi asam, basa dan netral. Contohnya termasuk pewarna dasar yang paling terkenal, biru langit II, yang mewarnai inti ungu, dan pewarna asam, eosin, yang mewarnai sitoplasma merah muda-oranye. Afinitas selektif struktur untuk pewarna tertentu adalah karena komposisi kimia dan sifat fisiknya. Struktur yang dapat diwarnai dengan baik dengan pewarna asam disebut oksifilik(asidofilik, eosinofilik), dan pewarnaan basa - basofilik. Struktur yang menerima pewarna asam dan basa adalah neutrofilik(heterofilik). Preparat berwarna biasanya didehidrasi dalam alkohol dengan kekuatan yang meningkat dan dibersihkan dalam xilena, benzena, toluena, atau beberapa minyak. Untuk pengawetan jangka panjang, bagian histologis yang mengalami dehidrasi ditutup di antara kaca objek dan kaca penutup dalam balsam Kanada atau zat lain. Persiapan histologis yang telah selesai dapat digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis selama bertahun-tahun. Untuk mikroskop elektron, bagian yang diperoleh pada ultramikrotom ditempatkan pada kisi-kisi khusus, dikontraskan dengan garam mangan, kobalt, dll., Setelah itu dilihat di bawah mikroskop dan difoto. Mikrofotografi yang diperoleh berfungsi sebagai objek penelitian bersama dengan preparat histologis.

Metode untuk mempelajari sel dan jaringan hidup

Studi tentang sel dan jaringan hidup memungkinkan Anda untuk mendapatkan informasi paling lengkap tentang kehidupan mereka - untuk melacak pergerakan, proses pembelahan, penghancuran, pertumbuhan, diferensiasi dan interaksi sel, durasi siklus hidup mereka, perubahan reaktif sebagai respons terhadap tindakan berbagai faktor.

Studi in vivo sel-sel dalam tubuh (divivo). Salah satu metode penelitian penting adalah pengamatan struktur dalam organisme hidup. Dengan bantuan mikroskop-iluminator tembus khusus, misalnya, dimungkinkan untuk mempelajari dinamika sirkulasi darah dalam pembuluh mikro. Setelah anestesi pada hewan, objek penelitian (misalnya, mesenterium usus) dikeluarkan dan diperiksa di bawah mikroskop, sementara jaringan harus terus-menerus dibasahi dengan larutan natrium klorida isotonik. Namun, durasi pengamatan tersebut terbatas. Hasil terbaik diperoleh dengan menanamkan ruang transparan ke dalam tubuh hewan.

Organ yang paling nyaman untuk penanaman kamera semacam itu dan pengamatan selanjutnya adalah telinga binatang (misalnya, kelinci). Bagian telinga dengan ruang transparan ditempatkan di atas panggung mikroskop dan dalam kondisi ini dinamika perubahan sel dan jaringan dipelajari dalam jangka waktu yang lama. Dengan cara ini, proses pengusiran leukosit dari pembuluh darah, berbagai tahap pembentukan jaringan ikat, kapiler, saraf, dan proses lainnya dapat dipelajari. Mata hewan percobaan dapat digunakan sebagai kamera transparan alami. Sampel sel, jaringan, atau organ ditempatkan dalam cairan bilik mata depan pada sudut yang dibentuk oleh kornea dan iris dan dapat diamati melalui kornea transparan. Dengan cara ini, sel telur yang telah dibuahi ditransplantasikan dan tahap awal perkembangan embrio dapat dilacak. Monyet mentransplantasikan potongan-potongan kecil rahim dan mempelajari perubahan lapisan rahim dalam berbagai fase siklus menstruasi.

Metode transplantasi sel darah dan sumsum tulang dari hewan donor yang sehat ke hewan penerima yang terkena radiasi mematikan telah digunakan secara luas. Hewan penerima setelah transplantasi tetap hidup karena pencangkokan sel donor membentuk koloni sel hematopoietik di limpa. Studi tentang jumlah koloni dan komposisi selulernya memungkinkan untuk mengidentifikasi jumlah sel hematopoietik leluhur dan berbagai tahap diferensiasinya. Dengan menggunakan metode pembentukan koloni, sumber perkembangan untuk semua sel darah ditetapkan.

Pewarnaan vital dan supravital. Selama pewarnaan sel dan jaringan vital (seumur hidup), pewarna dimasukkan ke dalam tubuh hewan, sementara pewarna secara selektif menodai sel-sel tertentu, organel atau zat antar selnya. Misalnya, menggunakan trypan blue atau lithium carmine, fagosit dideteksi, dan menggunakan alizarin, matriks tulang yang baru terbentuk.

Pewarnaan supravital mengacu pada pewarnaan sel-sel hidup yang diisolasi dari tubuh. Dengan cara ini, bentuk eritrosit muda terdeteksi - retikulosit darah (pewarna biru cresyl brilian), mitokondria dalam sel (pewarna hijau Janus), lisosom (pewarna merah netral).

Studi sel dan jaringan hidup dalam kultur (divitro). Metode ini adalah salah satu yang paling umum. Sel yang diisolasi dari tubuh manusia atau hewan, sampel kecil jaringan atau organ ditempatkan dalam wadah kaca atau plastik yang berisi media nutrisi khusus - plasma darah, ekstrak embrionik, serta media buatan. Ada kultur suspensi (sel tersuspensi dalam medium), jaringan, organ dan kultur monolayer (sel yang dieksplan membentuk lapisan kontinu pada kaca). Sterilitas media dan suhu yang sesuai dengan suhu tubuh dipastikan. Dalam kondisi ini, sel untuk waktu yang lama mempertahankan indikator utama aktivitas vital - kemampuan untuk tumbuh, berkembang biak, berdiferensiasi, dan bergerak. Kultur semacam itu dapat bertahan selama berhari-hari, berbulan-bulan, dan bahkan bertahun-tahun jika media kultur diperbarui dan sel-sel yang layak ditransplantasikan ke pembuluh lain. Beberapa jenis sel, karena perubahan genomnya, dapat bertahan dan berkembang biak dalam kultur, membentuk garis sel yang berkesinambungan. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky, dan F. M. Lazarenko memberikan kontribusi besar untuk pengembangan metode budidaya sel dan jaringan. Saat ini, garis sel fibroblas, miosit, epitelosit, makrofag, dll. telah diperoleh, yang telah ada selama bertahun-tahun.

Penggunaan metode kultivasi memungkinkan untuk mengungkapkan sejumlah pola diferensiasi, transformasi sel ganas, interaksi seluler, interaksi sel dengan virus dan mikroba. Kemampuan sel tulang rawan untuk membentuk zat antar sel dalam kultur dan kemampuan sel adrenal untuk menghasilkan hormon ditunjukkan. Budidaya jaringan dan organ embrio memungkinkan untuk melacak perkembangan tulang, kulit, dan organ lainnya. Sebuah teknik untuk menumbuhkan sel-sel saraf telah dikembangkan.

Metode kultur jaringan sangat penting untuk melakukan pengamatan eksperimental pada sel dan jaringan manusia. Sel yang diambil dari tubuh manusia selama tusukan atau biopsi dapat digunakan dalam kultur jaringan untuk menentukan jenis kelamin, penyakit keturunan, degenerasi ganas, dan untuk mengidentifikasi efek dari sejumlah zat beracun.

Dalam beberapa tahun terakhir, kultur sel telah banyak digunakan untuk hibridisasi sel.

Metode telah dikembangkan untuk memisahkan jaringan menjadi sel, mengisolasi jenis sel individu dan mengkulturnya.

Pertama, jaringan diubah menjadi suspensi sel dengan menghancurkan kontak antar sel dan matriks antar sel dengan bantuan enzim proteolitik (tripsin, kolagenase) dan senyawa yang mengikat Ca 2+ (menggunakan EDTA - asam etilendiamintetraasetat). Selanjutnya, suspensi yang dihasilkan dipisahkan menjadi fraksi sel dari berbagai jenis dengan sentrifugasi, yang memungkinkan pemisahan sel yang lebih berat dari yang lebih ringan, besar dari yang kecil, atau dengan menempelkan sel ke kaca atau plastik, yang kemampuannya berbeda untuk berbagai jenis sel. Untuk memastikan adhesi spesifik sel ke permukaan kaca, antibodi digunakan yang secara khusus mengikat sel dari jenis yang sama. Sel-sel yang melekat kemudian dipisahkan dengan memecah matriks dengan enzim, sehingga diperoleh suspensi sel-sel yang homogen. Metode pemisahan sel yang lebih halus adalah pelabelan dengan antibodi yang terkait dengan pewarna fluoresen. Sel berlabel dipisahkan dari sel tidak berlabel menggunakan penyortir (electronic fluorescence-activated cell analyzer). Penganalisis sel mengurutkan dalam 1 dengan sekitar 5000 sel. Sel yang diisolasi dapat dipelajari dalam kondisi kultur.

Metode kultivasi sel memungkinkan untuk mempelajari aktivitas vitalnya, reproduksi, diferensiasi, interaksi dengan sel lain, pengaruh hormon, faktor pertumbuhan, dll.

Kultur biasanya dibuat dari suspensi sel yang dibuat dengan metode disosiasi jaringan yang dijelaskan di atas. Sebagian besar sel tidak dapat tumbuh dalam suspensi, mereka membutuhkan permukaan padat, yang merupakan permukaan cawan kultur plastik, kadang-kadang dengan komponen matriks ekstraseluler, seperti kolagen. Tanaman primer disebut kultur yang disiapkan segera setelah tahap pertama fraksinasi sel, sekunder- kultur sel ditransplantasikan dari kultur primer ke media baru. Sel dapat ditransplantasikan secara berurutan selama berminggu-minggu dan berbulan-bulan, sementara sel mempertahankan tanda khas diferensiasinya (misalnya, sel epitel membentuk lapisan). Bahan awal untuk kultur sel biasanya jaringan janin dan neonatus.

Campuran garam, asam amino, vitamin, serum kuda, ekstrak embrio ayam, serum embrio, dll digunakan sebagai media nutrisi.Media khusus telah dikembangkan untuk budidaya berbagai jenis sel. Mereka mengandung satu atau lebih faktor pertumbuhan protein yang diperlukan sel untuk hidup dan bereproduksi. Misalnya, faktor pertumbuhan saraf (NGF) diperlukan untuk pertumbuhan sel saraf.

Sebagian besar sel dalam kultur memiliki jumlah pembelahan tertentu (50-100), dan kemudian mereka mati. Kadang-kadang sel mutan muncul dalam kultur, yang berkembang biak tanpa henti dan membentuk garis sel (fibroblas, epitelosit, mioblas, dll.). Sel mutan berbeda dengan sel kanker, yang juga mampu membelah secara terus menerus tetapi dapat tumbuh tanpa menempel pada permukaan padat. Sel kanker dalam cawan kultur membentuk populasi yang lebih padat daripada populasi sel normal. Sifat serupa dapat diinduksi secara eksperimental dalam sel normal dengan mengubahnya dengan virus mirip tumor atau senyawa kimia, yang menghasilkan pembentukan garis sel yang diubah secara neoplastik. Garis sel dari sel yang tidak berubah dan sel yang diubah dapat disimpan untuk waktu yang lama pada suhu rendah (-70 °C). Homogenitas genetik sel ditingkatkan dengan kloning, ketika koloni besar sel homogen diperoleh dari satu sel selama pembelahan berturut-turut. Klon adalah populasi sel yang berasal dari satu sel progenitor.

hibrida sel. Ketika dua sel dari jenis yang berbeda bergabung, heterokaryon terbentuk - sel dengan dua inti. Untuk mendapatkan heterokaryon, suspensi sel diperlakukan dengan polietilen glikol atau virus yang tidak aktif untuk merusak plasmolemm sel, setelah itu sel dapat berfusi. Misalnya, inti eritrosit ayam yang tidak aktif menjadi aktif (sintesis RNA, replikasi DNA) ketika sel-sel bergabung dan dipindahkan ke sitoplasma sel lain yang tumbuh dalam kultur jaringan. Heterokaryon mampu mitosis, menghasilkan pembentukan sel hibrida. Cangkang inti heterokaryon dihancurkan, dan kromosomnya digabungkan dalam satu inti besar.

Kloning sel hibrid mengarah pada pembentukan garis sel hibrid yang digunakan untuk mempelajari genom. Misalnya, dalam garis sel hibrida tikus-manusia, peran kromosom 11 manusia dalam sintesis insulin telah ditetapkan.

Hibridoma. Garis sel hibridoma digunakan untuk mendapatkan antibodi monoklonal. Antibodi diproduksi oleh sel plasma, yang terbentuk dari limfosit B selama imunisasi. Jenis antibodi spesifik diperoleh dengan mengimunisasi tikus dengan antigen spesifik. Jika limfosit yang diimunisasi tersebut dikloning, sejumlah besar antibodi homogen dapat diperoleh. Namun, masa hidup limfosit B dalam kultur terbatas. Oleh karena itu, mereka bergabung dengan sel tumor "abadi" (limfoma B). Akibatnya, hibrida terbentuk. (sel hibrida, dengan genom dari dua sel yang berbeda; ohm - diakhiri dengan nama tumor). Hibridoma semacam itu dapat berkembang biak untuk waktu yang lama dalam kultur dan mensintesis antibodi dari jenis tertentu. Setiap klon hibridoma adalah sumber antibodi monoklonal. Semua molekul antibodi dari spesies tertentu memiliki spesifisitas pengikatan antigen yang sama. Dimungkinkan untuk menghasilkan antibodi monoklonal terhadap protein apa pun yang terkandung dalam sel dan menggunakannya untuk melokalisasi protein dalam sel, serta untuk mengisolasi protein dari campuran (pemurnian protein), yang memungkinkan seseorang untuk mempelajari struktur dan fungsi protein . Antibodi monoklonal juga digunakan dalam teknologi kloning gen.

Antibodi dapat digunakan untuk mempelajari fungsi berbagai molekul dengan memasukkannya melalui plasmalemma langsung ke dalam sitoplasma sel dengan pipet kaca tipis. Misalnya, pengenalan antibodi terhadap miosin ke dalam sitoplasma telur bulu babi yang telah dibuahi menghentikan pembelahan sitoplasma.

Teknologi DNA rekombinan. Metode genetik klasik memungkinkan untuk mempelajari fungsi gen dengan menganalisis fenotipe organisme mutan dan keturunannya. Teknologi DNA rekombinan melengkapi metode ini, memungkinkan analisis kimia terperinci dari materi genetik dan memperoleh protein seluler dalam jumlah besar.

Metode hibridisasi banyak digunakan dalam biologi modern untuk mempelajari struktur gen dan ekspresinya.

Metode untuk mempelajari komposisi kimia dan metabolisme sel dan jaringan

Untuk mempelajari komposisi kimia struktur biologis - lokalisasi zat, konsentrasi dan dinamikanya dalam proses metabolisme, metode penelitian khusus digunakan.

Cyto- dan metode histokimia. Metode ini memungkinkan untuk mendeteksi lokalisasi berbagai bahan kimia dalam struktur sel, jaringan dan organ - DNA, RNA, protein, karbohidrat, lipid, asam amino, mineral, vitamin, aktivitas enzim. Metode ini didasarkan pada spesifisitas reaksi antara reagen kimia dan substrat yang merupakan bagian dari struktur seluler dan jaringan, dan pada pewarnaan produk reaksi kimia. Kontrol enzimatik sering digunakan untuk meningkatkan spesifisitas reaksi. Misalnya, untuk mendeteksi asam ribonukleat (RNA) dalam sel, gallocyanin sering digunakan - pewarna dengan sifat dasar, dan keberadaan RNA dikonfirmasi oleh pengobatan kontrol dengan ribonuklease, yang memotong RNA. Noda Gallosianin RNA dalam warna biru-ungu. Jika bagian tersebut diperlakukan sebelumnya dengan ribonuklease dan kemudian diwarnai dengan gallocyanin, maka tidak adanya pewarnaan menegaskan adanya asam ribonukleat dalam struktur. Banyak metode sitokimiawi dan histokimia dijelaskan dalam manual khusus.

Dalam beberapa tahun terakhir, kombinasi metode histokimia dengan metode mikroskop elektron telah mengarah pada pengembangan bidang baru yang menjanjikan - histokimia elektron. Metode ini memungkinkan untuk mempelajari lokalisasi berbagai bahan kimia tidak hanya pada tingkat seluler, tetapi juga pada tingkat subselular dan molekuler.

Untuk mempelajari makromolekul sel, metode yang sangat sensitif digunakan menggunakan isotop radioaktif dan antibodi, yang memungkinkan untuk mendeteksi bahkan kandungan molekul yang kecil (kurang dari 1000).

isotop radioaktif selama peluruhan nukleus, mereka memancarkan partikel bermuatan (elektron) atau radiasi (misalnya, sinar gamma), yang dapat didaftarkan di perangkat khusus. Isotop radioaktif digunakan dalam radioautografi. Misalnya, dengan bantuan radioisotop 3 H-timidin, DNA inti diperiksa, dengan bantuan 3 H-uridin - RNA.

metode radioautografi. Metode ini memungkinkan untuk mempelajari metabolisme sepenuhnya dalam struktur yang berbeda. Metode ini didasarkan pada penggunaan elemen radioaktif (misalnya, fosfor - 32 P, karbon - 14 C, belerang - 35 S, hidrogen - 3 H) atau senyawa yang diberi label oleh mereka. Zat radioaktif di bagian histologis dideteksi menggunakan emulsi fotografi, yang diterapkan pada sediaan dan kemudian dikembangkan. Di area obat, di mana emulsi fotografi bersentuhan dengan zat radioaktif, terjadi fotoreaksi, akibatnya area yang diterangi (trek) terbentuk. Metode ini dapat digunakan untuk menentukan, misalnya, laju penggabungan asam amino berlabel ke dalam protein, pembentukan asam nukleat, metabolisme yodium dalam sel tiroid, dll.

Metode analisis imunofluoresen. Penggunaan antibodi. Antibodi adalah protein pelindung yang diproduksi oleh sel plasma (turunan limfosit B) sebagai respons terhadap aksi zat asing (antigen). Jumlah berbagai bentuk antibodi mencapai satu juta. Setiap antibodi memiliki situs untuk "pengenalan" molekul yang menyebabkan sintesis antibodi ini. Karena spesifisitas antibodi yang tinggi untuk antigen, mereka dapat digunakan untuk mendeteksi protein sel apa pun. Untuk mengidentifikasi lokalisasi protein, antibodi diwarnai dengan pewarna fluoresen, dan kemudian sel diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi. Antibodi juga dapat digunakan untuk mempelajari antigen pada tingkat ultrastruktural menggunakan mikroskop elektron. Untuk ini, antibodi diberi label dengan partikel padat elektron (mikrosfer emas koloid). Untuk meningkatkan spesifisitas reaksi, antibodi monoklonal digunakan, dibentuk oleh garis sel - klon yang diperoleh dengan metode hibridoma dari satu sel. Metode hibridoma memungkinkan untuk memperoleh antibodi monoklonal dengan spesifisitas yang sama dan dalam jumlah yang tidak terbatas.

Metode analisis imunofluoresen secara luas dan efektif digunakan dalam histologi modern. Metode ini digunakan untuk mempelajari proses diferensiasi sel, untuk mengidentifikasi senyawa kimia tertentu dan struktur di dalamnya. Mereka didasarkan pada reaksi antigen-antibodi. Setiap sel tubuh memiliki komposisi antigenik spesifik, yang terutama ditentukan oleh protein. Produk reaksi dapat diwarnai dan dideteksi dalam mikroskop fluoresen, misalnya, deteksi aktin dan tubulin dalam sel menggunakan metode analisis imunofluoresen (lihat bab IV).

Metode penelitian modern memungkinkan untuk menganalisis komposisi kimia berbagai komponen struktural sel, baik yang tetap maupun yang hidup. Studi struktur intraseluler individu menjadi mungkin setelah pengembangan teknologi fraksinasi isi sel.

Fraksinasi konten seluler

Struktur sel dan makromolekul dapat difraksinasi dengan berbagai metode - ultrasentrifugasi, kromatografi, elektroforesis. Metode ini dijelaskan secara lebih rinci dalam buku teks biokimia.

Ultrasentrifugasi. Dengan menggunakan metode ini, sel dapat dibagi menjadi organel dan makromolekul. Pertama, sel dihancurkan oleh kejutan osmotik, ultrasound, atau tindakan mekanis. Dalam hal ini, membran (plasmolemma, retikulum endoplasma) pecah menjadi fragmen, dari mana gelembung terkecil terbentuk, dan inti dan organel (mitokondria, aparatus Golgi, lisosom dan peroksisom) tetap utuh dan berada dalam suspensi pembentuk.

Sebuah centrifuge berkecepatan tinggi (80.000-150.000 rpm) digunakan untuk memisahkan komponen sel di atas. Pertama, bagian yang lebih besar (inti, sitoskeleton) mengendap (endapan) di bagian bawah tabung. Dengan peningkatan lebih lanjut dalam kecepatan sentrifugasi fraksi supernatan, partikel yang lebih kecil secara berurutan mengendap - pertama mitokondria, lisosom dan peroksisom, kemudian mikrosom dan vesikel terkecil, dan akhirnya ribosom dan makromolekul besar. Selama sentrifugasi, fraksi yang berbeda mengendap pada kecepatan yang berbeda, membentuk pita terpisah dalam tabung reaksi, yang dapat diisolasi dan diperiksa. Ekstrak sel yang difraksinasi (sistem bebas sel) banyak digunakan untuk mempelajari proses intraseluler, misalnya untuk mempelajari biosintesis protein, menguraikan kode genetik, dll.

Kromatografi banyak digunakan untuk fraksinasi protein.

Elektroforesis memungkinkan untuk memisahkan molekul protein dengan muatan berbeda dengan menempatkan larutan berairnya (atau dalam matriks berpori padat) dalam medan listrik.

Metode kromatografi dan elektroforesis digunakan untuk menganalisis peptida yang diperoleh dengan memecah molekul protein dan untuk mendapatkan apa yang disebut peta peptida protein. Metode ini dijelaskan secara rinci dalam buku teks biokimia.

Ilmu yang mempelajari komposisi kimia sel hidup. Untuk mempelajari distribusi zat dan metabolismenya dalam sel hidup, digunakan teknik resonansi magnetik nuklir dan mikroelektroda.

Resonansi magnetik nuklir (NMR) memungkinkan untuk mempelajari molekul kecil dari zat dengan berat molekul rendah. Sampel jaringan mengandung atom dalam molekul yang berbeda dan dalam lingkungan yang berbeda, sehingga akan menyerap energi pada frekuensi resonansi yang berbeda. Diagram penyerapan pada frekuensi resonansi untuk sampel yang diberikan akan menjadi spektrumnya NMR. Dalam biologi, sinyal NMR dari proton (inti hidrogen) banyak digunakan untuk mempelajari protein, asam nukleat, dll. Untuk mempelajari makromolekul di dalam sel hidup, isotop 3 H, 13 C, 35 K, 31 P sering digunakan untuk memperoleh Sinyal NMR dan pantau perubahannya selama kehidupan sel. Jadi, 3| P digunakan untuk mempelajari kontraksi otot - perubahan kandungan ATP dan fosfat anorganik dalam jaringan. Isotop 13 C memungkinkan untuk mempelajari banyak proses di mana glukosa terlibat menggunakan NMR. Penggunaan NMR dibatasi oleh sensitivitasnya yang rendah: 1 g jaringan hidup harus mengandung setidaknya 0,2 mm zat uji. Keuntungan dari metode ini adalah tidak berbahaya bagi sel hidup.

Teknologi mikroelektroda. Mikroelektroda adalah tabung gelas yang diisi dengan larutan konduktif listrik (biasanya larutan KC1 dalam air), yang diameter ujungnya diukur dalam fraksi mikron. Ujung tabung tersebut dapat dimasukkan ke dalam sitoplasma sel melalui plasmalemma dan menentukan konsentrasi ion H + , Na + , K + , C1", Ca 2+ , Mg 2+ , beda potensial pada plasma membran, dan juga menyuntikkan molekul ke dalam sel. Untuk penentuan konsentrasi ion tertentu, digunakan elektroda selektif ion, yang diisi dengan resin penukar ion yang permeabel hanya untuk ion ini. Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi mikroelektroda telah digunakan untuk mempelajari pengangkutan ion melalui saluran ion khusus (saluran protein khusus) dalam membran plasma.Dalam hal ini, mikroelektroda dengan ujung yang lebih tebal, yang ditekan erat pada bagian plasmalemma yang sesuai.Metode ini memungkinkan Anda untuk mempelajari fungsi molekul protein tunggal.Perubahan konsentrasi ion di dalam sel dapat ditentukan dengan menggunakan indikator luminescent.Misalnya, untuk mempelajari konsentrasi Ca 2+ intraseluler, protein luminescent aquarin (terisolasi dari ubur-ubur) digunakan , yang memancarkan cahaya t dengan adanya ion Ca 2+ dan bereaksi terhadap perubahan konsentrasi yang terakhir dalam kisaran 0,5-10 M. Indikator fluoresen juga telah disintesis yang mengikat kuat Ca 2+ . Penciptaan berbagai jenis baru indikator intraseluler dan metode analisis gambar modern memungkinkan untuk secara akurat dan cepat menentukan konsentrasi intraseluler dari banyak zat dengan berat molekul rendah.

Metode kuantitatif

Saat ini, bersama dengan metode kualitatif, metode histokimia kuantitatif telah dikembangkan dan digunakan untuk menentukan kandungan berbagai zat dalam sel dan jaringan. Fitur metode penelitian kuantitatif-histokimia (sebagai lawan dari biokimia) adalah kemungkinan mempelajari konsentrasi dan kandungan komponen kimia dalam struktur sel dan jaringan tertentu.

Sitospektrofotometri- metode studi kuantitatif zat intraseluler dengan spektrum penyerapannya.

Sitospektrofluorometri- metode untuk studi kuantitatif zat intraseluler dengan spektrum fluoresensinya atau dengan intensitas fluoresensi pada satu panjang gelombang yang telah dipilih sebelumnya (sitofluorometri).

Mikroskop modern - sitofluorometer memungkinkan untuk mendeteksi sejumlah kecil zat dalam berbagai struktur (hingga 10-14 -10-16 g) dan untuk memperkirakan lokalisasi zat yang dipelajari dalam struktur mikro.

Metode untuk analisis citra struktur seluler dan jaringan

Gambar objek mikro yang diperoleh dalam mikroskop, di layar televisi, pada mikrofotograf elektron dapat dikenai analisis khusus - identifikasi parameter morfometrik, densitometrik, dan pemrosesan statistiknya.

Metode morfometrik memungkinkan untuk menentukan menggunakan kisi-kisi khusus (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) jumlah struktur apa pun, areanya, diameternya, dll. Secara khusus, dalam sel, area nukleus, sitoplasma, diameternya, inti- rasio sitoplasma, dll. Ada morfometri manual dan morfometri otomatis, di mana semua parameter diukur dan dicatat dalam perangkat secara otomatis.

Dalam beberapa tahun terakhir, semakin meluas otomatisasisistem pemrosesan gambar terintegrasi (ASOIS), memungkinkan penerapan metode kuantitatif di atas yang paling efektif untuk mempelajari sel dan jaringan. Pada saat yang sama, kemampuan analisis mikroskop kuantitatif dilengkapi dengan metode analisis dan pengenalan sampel berdasarkan pemrosesan melalui komputer elektronik (komputer) informasi yang diambil dari gambar sel dan jaringan. Intinya, kita dapat berbicara tentang perangkat yang tidak hanya meningkatkan kemampuan optik penganalisa visual manusia, tetapi juga sangat memperluas kemampuan analitisnya. Sebuah pendapat diungkapkan bahwa ASOIz membuat revolusi yang sama dalam morfologi, yang terjadi sekitar 300 tahun yang lalu karena penemuan mikroskop cahaya, dan sekitar 50 tahun yang lalu - mikroskop elektron, karena mereka tidak hanya secara tak terukur meningkatkan produktivitas peneliti dan tidak hanya mengobjektifikasi pengamatan, tetapi juga memungkinkan seseorang memperoleh informasi baru tentang proses yang sebelumnya tidak terdeteksi, memodelkan secara numerik dan memprediksi perkembangannya dalam sel dan jaringan.

Pada saat yang sama, partisipasi dalam eksperimen komputer mengharuskan peneliti untuk memiliki pendekatan baru untuk melakukannya, memiliki keterampilan untuk menyusun algoritma untuk proses penelitian, akurasi penalaran, dan, pada akhirnya, untuk meningkatkan tingkat ilmiah dan metodologis. penelitian.

Salah satu metode yang secara signifikan memperluas jumlah masalah morfologi yang harus dipecahkan adalah analisis mesin optik-struktural (OSMA), diusulkan pada tahun 1965 oleh K.M. Bogdanov. Pada tahun 1978, penulis metode ini dianugerahi Hadiah Negara Uni Soviet. Dengan munculnya OSMA, langkah kualitatif baru telah diambil dalam pengembangan metodologi terpadu untuk analisis kuantitatif struktur mikro berdasarkan karakteristik statistik. Baru-baru ini, OSMA telah menemukan aplikasi yang efektif dalam praktik penelitian dan ekonomi nasional.

pada gambar. 2 menunjukkan sistem pemrosesan gambar otomatis Protva-MP yang dibuat di negara kita oleh LOMO. Sistem ini dirancang untuk studi kompleks sel dan jaringan menggunakan absorpsi, mikroskop fluoresen, dan autoradiografi.

Mikroskop optik atau elektron pemindaian khusus, yang merupakan bagian dari sistem, secara berurutan memindai gambar sediaan dalam dua koordinat, mengubahnya menjadi bentuk digital, dan memasukkannya ke dalam komputer, yang, pada gilirannya, memproses gambar secara digital dan memberikan informasi tentang geometri dan karakteristik lain dari objek yang dianalisis.

Dengan bantuan tampilan warna, peneliti dapat "membedah" gambar, hanya menyoroti komponen struktural yang menarik baginya. Perangkat penyimpanan informasi yang luas yang disertakan dalam komputer pada disk atau pita magnetik memungkinkan untuk menyimpan gambar itu sendiri dan hasil pemrosesannya untuk penyimpanan dan dokumentasi selanjutnya.

Kami akan mempertimbangkan penggunaan metode untuk analisis otomatis objek mikro menggunakan contoh pemrosesan gambar leukosit darah (Gbr. 3) Mikroskop-fotometer pemindaian memungkinkan Anda untuk "melihat" nilai kerapatan optik baris demi baris dengan langkah yang ditentukan oleh peneliti Akibatnya, sinyal optik yang sesuai dengan kerapatan optik objek diubah menjadi bentuk digital. Matriks digital yang dihasilkan tunduk pada persiapan menggunakan peralatan matematika khusus

Pertama, latar belakang dihilangkan dan objek "bersih" diisolasi - gambar sel (1a), kemudian setiap detail yang menarik bagi peneliti dipilih dari gambar sel, misalnya, sitoplasma (16) dan nukleus (I memesan nilai rata-rata dan integral kepadatan optik, dispersi, asimetri, kurtosis, dll. Berdasarkan gambar objek, parameter morfometrik diperoleh: luas, keliling, diameter, rasio nuklir-sitoplasma, faktor bentuk, dll.

Tahap selanjutnya dari pemrosesan gambar adalah pembuatan diagram dua dimensi dari ketergantungan densitas optik untuk seluruh sel (lihat Gambar 3), sitoplasma (Wb) dan nukleusnya (Nm), dan kernel. Diagram ini memungkinkan Anda untuk menghitung parameter histogram orde kedua - homogenitas, kontras lokal, entropi, dll.

Beras. 3. Pemrosesan gambar sel otomatis (diagram).

Gambar leukosit (a), sitoplasma (b) dan nukleus (c). I - gambar digital; II - histogram kepadatan optik; III - histogram dua dimensi dari ketergantungan nilai kerapatan optik.

Parameter yang diperoleh dengan cara ini mewakili "potret" multidimensi sel dan memiliki ekspresi numerik tertentu. Mereka dapat dikenakan berbagai metode pemrosesan statistik, memungkinkan klasifikasi objek mikro yang sangat akurat, mengungkapkan fitur strukturnya yang tidak dapat dideteksi secara visual.

Dengan demikian, penerapan metode penelitian baru dalam histologi, sitologi, dan embriologi memungkinkan untuk menjelaskan pola umum organisasi jaringan dan sel, fondasi struktural proses biokimia yang menentukan fungsi komponen struktural spesifik sel.

Struktur, ultrastruktur, dan fungsi organel seluler saat ini sedang dipelajari dengan menggunakan metode utama berikut: cahaya dan elektron, medan gelap, kontras fase, polarisasi, mikroskop pendaran, digunakan untuk mempelajari struktur, ultrastruktur sel tetap, dan sentrifugasi diferensial , yang memungkinkan untuk mengisolasi organel individu dan menganalisisnya dengan metode sitokimia, biokimia, biofisika, dan metode lainnya.

mikroskop cahaya.

Prinsip metode ini adalah bahwa seberkas cahaya, melewati suatu objek, memasuki sistem lensa objektif, dan membangun bayangan primer, yang diperbesar dengan bantuan lensa okuler. Bagian optik utama mikroskop, yang menentukan kemampuan utamanya, adalah lensa.

Dalam mikroskop modern, lensa dapat dipertukarkan, yang memungkinkan Anda mempelajari sel pada perbesaran yang berbeda. Ciri utama mikroskop sebagai sistem optik adalah resolusinya, yaitu kemampuan untuk memberikan gambar terpisah dari dua objek yang berdekatan.

Gambar yang diberikan oleh lensa dapat diperbesar berkali-kali dengan menggunakan lensa okuler yang kuat atau, misalnya, proyeksi ke layar (hingga 10 5 kali). Resolusi mikroskop cahaya dibatasi oleh panjang gelombang cahaya: semakin pendek panjang gelombang, semakin tinggi resolusinya. Biasanya, mikroskop cahaya menggunakan sumber cahaya di wilayah spektrum yang terlihat (400-700 nm), sehingga resolusi maksimum mikroskop dalam hal ini tidak boleh lebih tinggi dari 200-350 nm (0,2-0,35 mikron). Jika Anda menggunakan cahaya ungu (260-280 nm), maka Anda dapat meningkatkan resolusi menjadi 130 - 140 nm (0,13-0,14 mikron). Ini akan menjadi batas resolusi teoritis mikroskop cahaya, ditentukan oleh sifat gelombang cahaya.

Jadi, semua yang dapat diberikan mikroskop cahaya sebagai perangkat tambahan untuk mata kita adalah meningkatkan resolusinya sekitar 1000 kali (mata telanjang manusia memiliki resolusi sekitar 0,1 mm, yang sama dengan 100 mikron). Ini adalah perbesaran mikroskop yang "berguna", di mana di atasnya kami hanya akan meningkatkan kontur gambar tanpa mengungkapkan detail baru di dalamnya. Oleh karena itu, ketika menggunakan daerah cahaya tampak, 0,2-0,3 m adalah batas resolusi akhir mikroskop cahaya.

Mikroskop elektron.

Untuk mikroskop elektron pemindaian, bahan sering dibekukan untuk menghasilkan permukaan yang tertutup es. Dalam hal ini, hilangnya air dari zat yang larut dalam air tidak termasuk, dan perubahan kimia dalam struktur juga lebih kecil. Ketika menganalisis data yang diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron, harus diingat bahwa metode ini memeriksa keadaan statis sel pada saat penghentian cepat dalam pergerakan sitoplasma yang disebabkan oleh aksi pengikatan bahan kimia.

Mikroskop medan gelap.

Esensinya adalah, seperti partikel debu dalam seberkas cahaya (efek Tyndall), partikel kecil (kurang dari 0,2 mikron) bersinar dalam sel di bawah penerangan samping, cahaya yang dipantulkan memasuki lensa mikroskop. Metode ini telah berhasil digunakan dalam studi sel hidup.

Untuk menentukan lokalisasi situs untuk sintesis biopolimer, untuk menentukan transfer zat dalam sel, untuk memantau migrasi atau sifat sel individu, mereka banyak digunakan metode autoradiografi- pendaftaran zat berlabel isotop. Misalnya, dengan menggunakan metode ini, menggunakan prekursor RNA berlabel, ditunjukkan bahwa semua RNA disintesis hanya di inti interfase, dan keberadaan RNA sitoplasma adalah hasil dari migrasi molekul yang disintesis dari nukleus.

Dalam sitologi, berbagai metode analitis dan persiapan biokimia. Dalam kasus terakhir, berbagai komponen seluler dapat diperoleh dalam bentuk fraksi terpisah dan kimia, ultrastruktur, dan propertinya dapat dipelajari. Saat ini, hampir semua organel dan struktur sel diperoleh dalam bentuk fraksi murni.

Salah satu cara utama untuk mengisolasi struktur seluler adalah sentrifugasi diferensial (pemisahan). Prinsip penerapannya adalah waktu partikel untuk mengendap dalam homogenat tergantung pada ukuran dan densitasnya: semakin besar partikel atau semakin berat partikel, semakin cepat partikel tersebut mengendap di dasar tabung reaksi. Untuk mempercepat proses pengendapan ini, digunakan percepatan yang diciptakan oleh centrifuge.

Dengan sentrifugasi fraksional berulang dari subfraksi campuran, fraksi murni dapat diperoleh. Dalam kasus pemisahan fraksi yang lebih halus, sentrifugasi dalam gradien kerapatan sukrosa digunakan, yang memungkinkan untuk memisahkan komponen dengan baik, bahkan sedikit berbeda satu sama lain dalam berat jenis. Fraksi yang diperoleh, sebelum dianalisis dengan metode biokimia, harus diperiksa kemurniannya menggunakan mikroskop elektron.

pertanyaan tes:

1. Tingkat organisasi makhluk hidup

2. Teori seluler tentang organisasi organisme

3. Metode penelitian dalam sitologi

4. Tugas dan pokok bahasan sitologi

5. Perangkat mikroskop cahaya

6. Perangkat mikroskop elektron

7. Tindakan pencegahan keamanan untuk pekerjaan sitologis

8. Persyaratan penyiapan bahan biologis untuk pemeriksaan sitologi

9. Memperbaiki agen, mekanisme aksi

10. Sitokimia, persyaratan dan kemampuan material

11. Analisis kuantitatif (morfometri), persyaratan dan kemungkinan

12. Artefak dalam sitologi, cara untuk mengobjektifikasi hasil

1. Zavarzin A.A., Kharazova A.D. Dasar-dasar Sitologi Umum. -L., 1982.

2. Chentsov Yu.S. Dasar Sitologi. -M., 1984.

3. Shubnikova E.A. Morfologi fungsional jaringan. - M., Rumah Penerbitan Universitas Negeri Moskow, 1981.