REKAYASA GENETIKA(sin. rekayasa genetika) - arah penelitian dalam biologi molekuler dan genetika, yang tujuan utamanya adalah untuk memperoleh, menggunakan teknik laboratorium, organisme dengan kombinasi sifat-sifat turun-temurun baru, termasuk yang tidak ditemukan di alam. Di jantung G. dan. kemungkinan manipulasi yang disengaja dengan fragmen asam nukleat karena pencapaian terbaru dari biologi molekuler dan genetika terletak. Pencapaian ini termasuk penetapan universalitas kode genetik (lihat), yaitu, fakta bahwa di semua organisme hidup penyertaan asam amino yang sama dalam molekul protein dikodekan oleh urutan nukleotida yang sama dalam rantai DNA; kemajuan dalam enzymology genetik, yang telah tersedia bagi peneliti satu set enzim yang memungkinkan untuk memperoleh gen atau fragmen terpisah dari asam nukleat dalam bentuk terisolasi, untuk melakukan sintesis in vitro fragmen asam nukleat untuk - t, untuk menggabungkan potongan-potongan yang diperoleh menjadi satu kesatuan. Jadi, perubahan sifat turun-temurun suatu organisme melalui G. dan. direduksi menjadi konstruksi materi genetik baru dari berbagai fragmen, pengenalan materi ini ke dalam organisme penerima, penciptaan kondisi untuk fungsinya dan pewarisan yang stabil.

Salah satu cara untuk mendapatkan gen adalah kimia. perpaduan. Setelah Holly (A. Holli) di AS, A. A. Baev di Uni Soviet dan peneliti lain berhasil menguraikan struktur berbagai transportasi RBGK (tRNA), X. Koran et al., melakukan kimia. sintesis DNA pengkodean ragi roti alanin tRNA.

Tetapi metode sintesis gen buatan yang paling efektif dikaitkan dengan penggunaan enzim DNA yang bergantung pada RNA (reverse transcriptase) yang ditemukan oleh Baltimore (D. Baltimore) dan Temin (H. Temin) pada virus onkogenik (lihat). Enzim ini telah diisolasi dan dimurnikan dari sel yang terinfeksi virus onkogenik yang mengandung RNA tertentu, termasuk virus myeloblastosis burung, sarkoma Rous, dan leukemia tikus. Reverse transcriptase menyediakan sintesis DNA pada template messenger RNA (mRNA). Penggunaan molekul mRNA sebagai cetakan untuk sintesis DNA sangat memudahkan sintesis buatan gen struktural individu organisme yang lebih tinggi, karena urutan basa nitrogen dalam molekul mRNA adalah salinan yang tepat dari urutan basa nitrogen dari gen struktural yang sesuai, dan teknik untuk mengisolasi berbagai molekul mRNA cukup berkembang dengan baik. Kemajuan dalam mengisolasi mRNA protein globin, yang merupakan bagian dari hemoglobin manusia, hewan dan burung, mRNA protein lensa mata, mRNA imunoglobin, mRNA dari protein tumor ganas tertentu (mieloma), memungkinkan untuk mensintesis bagian struktural gen yang mengkode beberapa protein ini menggunakan reverse transcriptase.

Namun, gen struktural dalam tubuh berfungsi bersama dengan gen pengatur, urutan nukleotidanya tidak direproduksi oleh molekul mRNA. Oleh karena itu, tidak satu pun dari metode ini memungkinkan sintesis satu set gen struktural dan pengatur. Solusi untuk masalah ini menjadi mungkin setelah pengembangan metode untuk mengisolasi gen individu. Untuk mengisolasi gen bakteri, digunakan struktur sitoplasma kecil yang mengandung DNA yang dapat mereplikasi (lihat Replikasi) secara independen dari kromosom bakteri. Struktur ini membentuk satu kelompok elemen genetik ekstrakromosomal bakteri - plasmid (lihat Plasmid). Beberapa dari mereka dapat dimasukkan ke dalam kromosom bakteri, dan kemudian secara spontan atau di bawah pengaruh agen penginduksi, misalnya. Iradiasi UV, bergerak dari kromosom ke sitoplasma, membawa serta sel-sel gen kromosom yang berdekatan dari inang. Elemen genetik ekstrakromosomal bakteri dengan sifat seperti itu disebut episom [F. Yakub, Wollman (E. Wollman)]. Episom (lihat) termasuk fag sedang (lihat. Bakteriofag), faktor jenis kelamin bakteri, faktor resistensi obat dari mikroorganisme (lihat), faktor bakteriosinogenik (lihat). Di sitoplasma, gen yang ditangkap oleh episom bereplikasi dalam komposisinya dan sering kali membentuk banyak salinan. Pengembangan metode yang efektif untuk mengisolasi plasmid, khususnya fag beriklim sedang yang membawa materi genetik kromosom bakteri, dan mengisolasi fragmen kromosom sel bakteri yang termasuk dalam genom bakteriofag memungkinkan pada tahun 1969 untuk J. Beckwith et al. mengisolasi operon laktosa, sekelompok gen yang mengontrol enzim sintesis yang diperlukan untuk penyerapan laktosa oleh Escherichia coli. Teknik serupa digunakan untuk mengisolasi dan memurnikan gen yang mengontrol sintesis RNA transfer tirosin Escherichia coli (lihat Asam ribonukleat).

Penggunaan plasmid memungkinkan untuk memperoleh hampir semua gen bakteri dalam bentuk terisolasi, dan, akibatnya, kemungkinan membangun molekul DNA dari berbagai sumber. Struktur hibrida semacam itu dapat terakumulasi dalam sel dalam jumlah yang signifikan, karena banyak plasmid dalam kondisi tertentu bereplikasi secara intensif di sitoplasma bakteri, membentuk puluhan, ratusan, dan bahkan ribuan salinan.

keberhasilan G. dan. terkait dengan pengembangan teknik untuk menggabungkan struktur genetik dari sumber yang berbeda dalam satu molekul DNA. Faktor penentu dalam desain molekul hibrida in vitro adalah penggunaan endonuklease restriksi - enzim khusus yang mampu memotong molekul DNA di area yang ditentukan secara ketat. Enzim tersebut ditemukan dalam sel Escherichia coli yang membawa plasmid tipe R, yang menyebabkan resistensi bakteri terhadap obat tertentu, dalam sel Haemophilus influenzae, Serratia marcescens dan mikroorganisme lainnya. Salah satu enzim yang paling umum digunakan dari jenis ini adalah endonuklease restriksi EcoRI, yang disintesis oleh plasmid RI dalam sel E. coli. Enzim mengenali bagian DNA dengan urutan unik enam pasangan basa dan memotong struktur DNA untai ganda di bagian ini sehingga ujung untai tunggal dari empat nukleotida terbentuk di kedua sisi (disebut ujung lengket). Karena enzim memotong molekul DNA, terlepas dari asalnya, dengan cara yang ditentukan secara ketat, semua fragmen DNA yang dihasilkan dari aksi enzim akan memiliki ujung lengket yang sama. Ujung lengket komplementer dari setiap fragmen DNA digabungkan oleh ikatan hidrogen, membentuk DNA sirkular hibrid (Gbr.). Untuk menstabilkan molekul DNA hibrida, enzim lain digunakan - ligase polinukleotida, yang mengembalikan ikatan kovalen yang diputus oleh enzim restriksi. Urutan yang secara khusus dikenali oleh EcoRI terjadi pada DNA yang terpisah tidak lebih dari 4.000-16.000 pasangan basa. Oleh karena itu, fragmen DNA yang terbentuk di bawah aksi EcoRI dapat mencakup setidaknya satu gen yang tidak rusak oleh enzim (rata-rata, satu gen mengandung 1000-1500 pasangan basa).

Penggunaan endonuklease restriksi dan sejumlah enzim lain memungkinkan untuk memperoleh DNA rekombinan kompleks. Sekelompok peneliti di Amerika Serikat yang dipimpin oleh P. Berg berhasil menggabungkan informasi genetik dari tiga sumber sebagai bagian dari satu molekul DNA: genom lengkap (lihat) virus monyet onkogenik SV40, bagian dari genom bakteriofag beriklim sedang dan kelompok gen E. coli yang bertanggung jawab atas asimilasi galaktosa. Molekul rekombinan yang dirancang tidak diuji aktivitas fungsionalnya, karena penulis karya ini berhenti sebelum potensi bahaya penyebaran virus hewan onkogenik pada populasi bakteri yang hidup di usus manusia. Diketahui bahwa DNA virus yang dimurnikan dapat menembus berbagai sel mamalia dan diwariskan secara stabil.

Untuk pertama kalinya, molekul DNA hibrid yang aktif secara fungsional dibangun di AS oleh S. Cohen et al. Kelompok Cohen secara konsisten memecahkan masalah penggabungan dan kloning (akumulasi selektif) molekul DNA yang diisolasi dari spesies yang semakin jauh satu sama lain dalam istilah filogenetik. Prosedur kloning biasanya terdiri dari fakta bahwa DNA dari berbagai sumber difragmentasi menggunakan endonuklease restriksi, kemudian fragmen-fragmen ini digabungkan secara in vitro ke dalam struktur umum dan dimasukkan ke dalam organisme penerima, yang dalam eksperimen Cohen adalah Escherichia coli. Telah ditetapkan bahwa sel-sel dari beberapa spesies bakteri (termasuk Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) dapat diubah (lihat Transformasi) menggunakan molekul DNA rekombinan. Dalam hal ini, bagian plasmid dari molekul hibrida (atau salah satu plasmid, jika dua plasmid dari sumber yang berbeda digabungkan dalam molekul hibrida) berfungsi sebagai vektor, yaitu, memastikan transfer materi genetik asing filogenetik ke sel penerima dan reproduksinya di dalamnya. Plasmid pertama yang digunakan oleh Cohen dkk sebagai vektor adalah plasmid pSC101 yang diperolehnya secara in vitro, yang mengontrol resistensi bakteri terhadap tetrasiklin. Plasmid kecil ini panjangnya hanya 8000 bp. Ini diserang oleh enzim EcoRI hanya di satu tempat, dan enzim tidak merusak kemampuan plasmid untuk bereplikasi dalam sel E. coli dan mengendalikan resistensi tetrasiklin. Fitur-fitur ini memungkinkan untuk menggunakannya untuk konstruksi molekul DNA hibrid secara in vitro. Pada tahap pertama, DNA plasmid diisolasi dari berbagai spesies bakteri dan kemudian dari organisme tingkat tinggi dilekatkan pada pSC101. Dengan demikian, plasmid "chimeric" (yaitu, tidak mampu terjadi dalam kondisi alami) diciptakan, yang menggabungkan bahan genetik Escherichia coli dalam komposisinya, segmen DNA dari oosit katak cakar Xenopus laevis, yang mengontrol sintesis RNA ribosom, dan segmen DNA bulu babi yang mengontrol sintesis protein histon, atau DNA mitokondria tikus. Dalam sel-sel Escherichia coli, di mana hibrida, plasmid "chimeric" diperkenalkan, pekerjaan gen organisme yang lebih tinggi didaftarkan.

Tidak seperti pSC101, yang hadir dalam sel hanya dalam 4-6 salinan, beberapa plasmid lain yang digunakan sebagai vektor dapat bereplikasi berkali-kali dalam kondisi tertentu, membentuk beberapa ribu salinan dalam satu sel. Sifat-sifat tersebut dimiliki, misalnya, oleh plasmid ColEI, yang mengontrol sintesis colicin (lihat Bacteriocinogeny). Seperti pSC101, ColEI dibelah oleh enzim EcoRl hanya di satu situs, dan DNA asing, juga diperlakukan dengan EcoRI, mudah dilekatkan pada molekul linier yang dihasilkan dengan ujung lengket. Dengan demikian, gen operon triptofan Escherichia coli "dijahit" ke ColEI. Dalam sel yang membawa banyak salinan plasmid hibrida yang dibangun, produksi protein enzim yang dikendalikan oleh gen biosintesis triptofan meningkat secara dramatis. Dalam sistem in vitro, adalah mungkin untuk menempelkan plasmid ColEI ke faktor-R tertentu dan fag sedang. Pekerjaan semacam itu pertama kali dilakukan di Uni Soviet di bawah bimbingan Akademisi A. A. Baev dan Profesor S. I. Alikhanyan. Plasmid vektor gabungan yang dibentuk oleh ColEI dan faktor-R mampu berkembang biak secara intensif dalam sel bakteri, seperti ColEI, dan pada saat yang sama menentukan resistensi sel terhadap antibiotik, yang sangat menyederhanakan pemilihan bakteri - pembawa plasmid hibrida.

Fag beriklim sedang juga digunakan sebagai vektor. Dalam sistem in vitro, partikel bakteriofag hibrida dibangun yang mencakup gen bakteri, DNA fag lain atau organisme yang lebih tinggi (misalnya, DNA lalat buah Drosophila) dalam strukturnya.

Aktivitas fungsional DNA hibrida ditentukan oleh kemungkinan transfernya ke dalam sel organisme penerima dan penggandaan (amplifikasi) berikutnya dalam sel-sel ini. Sebagai penerima, tidak hanya bakteri, seperti yang disebutkan di atas, tetapi juga sel-sel organisme yang lebih tinggi telah digunakan secara efektif, namun sejauh ini hanya dalam bentuk kultur jaringan yang dibudidayakan di luar tubuh. Ada indikasi bahwa DNA fag yang membawa gen bakteri dapat menembus ke dalam sel jaringan ikat manusia (fibroblas), ke dalam protoplas, atau ke dalam kultur sel tumbuhan yang tidak berdiferensiasi (kalus). Pada tahun 1971, Amer. peneliti Merrill (S. R. Merril) et al., melaporkan eksperimen untuk memperbaiki cacat herediter - galaktosemia (lihat) dengan memasukkan ke dalam sel-sel "sakit" gen galaktosa bakteri yang termasuk dalam DNA fag transduksi. Akibatnya, sel-sel pasien dengan galaktosemia, yang rusak dalam enzim beta-D-galaktosa-1-fosfat uridiltransferase, tidak dapat mengasimilasi galaktosa, mengembalikan kemampuan normalnya untuk tumbuh dengan adanya galaktosa, dan aktivitas enzimatik yang sebelumnya tidak ada adalah terdaftar dalam ekstrak mereka. Hasil yang sama diperoleh oleh Horst (J. Horst) et al, dengan pengenalan gen bakteri yang mengontrol sintesis beta-galaktosidase dalam fibroblas pasien dengan gangliosidosis umum, ditandai dengan defisiensi parah enzim ini. Manion (W. Munyon) dan kolaboratornya. menggunakan virus herpes, mereka mentransfer gen yang mengontrol sintesis timidin kinase dari sel manusia ke sel tikus, memulihkan kemampuan fibroblas tikus yang rusak untuk mensintesis enzim ini.

Salah satu cara untuk mentransfer informasi genetik dalam kultur sel manusia, hewan dan tumbuhan adalah hibridisasi sel somatik, yang dikembangkan oleh Ephrussi (V. Ephrussi) dan Barsky (G. Barski). Efektivitas metode ini telah meningkat secara signifikan sejak ditemukan bahwa partikel virus parainfluenza tipe Sendai yang tidak aktif meningkatkan frekuensi fusi sel dari berbagai sumber. Kemungkinan mentransfer gen individu dari kromosom hamster Cina yang terisolasi ke dalam sel jaringan ikat tikus telah dibuktikan. Hibrida sel manusia dan tikus dijelaskan, di mana bagian dari kromosom manusia dihapus, sementara bagian itu tetap aktif secara fungsional. Perkembangan metode bedah mikro sel memungkinkan transplantasi inti sel dari sel somatik ke dalam telur yang dibuahi dan, sebagai hasilnya, mendapatkan organisme yang benar-benar identik. Hibridisasi sel memungkinkan untuk menginduksi sintesis globin manusia dalam sel benih katak. Semua contoh ini menunjukkan potensi G. dan.

Nilai praktis G. dan. untuk pengobatan dikaitkan dengan prospek untuk memperbaiki cacat metabolisme herediter pada manusia (lihat Terapi gen), menciptakan mikroorganisme yang telah kehilangan patogenisitasnya, tetapi mempertahankan kemampuan untuk membentuk kekebalan, sintesis antibiotik, asam amino, hormon, vitamin, enzim, imunoglobulin, dll., berdasarkan penggunaan mikroorganisme yang telah memasukkan gen yang sesuai. Hasil yang luar biasa dapat diperoleh dalam waktu dekat G. dan. tanaman. Dengan bantuan metode G. dan. mereka mencoba membuat tanaman yang dapat menyerap nitrogen atmosfer dan meningkatkan komposisi protein makanan nabati. Solusi yang berhasil dari masalah ini akan secara dramatis meningkatkan produktivitas tanaman, mengurangi produksi dan konsumsi nitrogen mineral, dan dengan demikian secara signifikan meningkatkan lingkungan (lihat). Kemungkinan untuk menciptakan bentuk hewan dan tumbuhan yang benar-benar baru dengan mengatasi hambatan interspesifik dari perkawinan silang sedang dipelajari. Namun pada penilaian G. dan. sebagai bentuk baru penguasaan satwa liar, seseorang harus memperhitungkan tidak hanya kemungkinan peran revolusionernya dalam biologi, kedokteran dan pertanian, tetapi juga peluang yang timbul sehubungan dengan perkembangannya untuk munculnya bentuk-bentuk baru mikroorganisme patogen, bahaya penyebaran DNA hibrid dalam populasi bakteri yang hidup pada manusia, pembawa virus Onkogenik, dll. Tentu saja, penggunaan yang disengaja atas pencapaian ilmu pengetahuan, termasuk G. dan., untuk tujuan misantropik yang tidak manusiawi hanya dimungkinkan dalam masyarakat di mana kebaikan manusia dikorbankan untuk keuntungan dan agresi.

Dari bahan tambahan

Rekayasa genetika terus menjadi metode penelitian yang berkembang pesat dalam biologi molekuler dan genetika. Perlu dicatat bahwa konsep "rekayasa genetika" dan "rekayasa genetika" tidak sepenuhnya identik, karena penelitian yang berkaitan dengan rekayasa genetika tidak terbatas pada manipulasi dengan gen seperti itu. Saat ini, metode rekayasa genetika memungkinkan analisis asam nukleat alami yang paling mendalam dan terperinci - zat yang bertanggung jawab untuk penyimpanan, transmisi, dan implementasi informasi genetik (lihat Asam nukleat.), Serta membuat yang dimodifikasi atau benar-benar baru yang tidak ditemukan di alam gen (lihat Gen), kombinasi gen dan mengekspresikannya dengan efisiensi tinggi dalam sel hidup (lihat Ekspresivitas gen). Dari pencapaian praktis spesifik rekayasa genetika dalam dekade terakhir, yang paling penting adalah penciptaan produsen protein yang aktif secara biologis - insulin (lihat), interferon (lihat), hormon pertumbuhan (lihat hormon somatotropik), dll., serta sebagai pengembangan metode rekayasa genetika, aktivasi tautan-tautan metabolisme itu, gandum hitam dihubungkan dengan pembentukan zat aktif biologis molekul rendah. Dengan cara ini, produsen antibiotik, asam amino, dan vitamin tertentu diperoleh, berkali-kali lebih efektif daripada produsen zat-zat ini, yang diturunkan dengan metode genetika dan seleksi tradisional. Metode sedang dikembangkan untuk mendapatkan vaksin protein murni terhadap virus hepatitis, influenza, herpes, dan penyakit mulut dan kuku, gagasan menggunakan vaksinasi dengan virus vaccinia telah diterapkan, dalam genom yang gennya mengkode sintesis protein virus lain (misalnya, virus hepatitis atau influenza) tertanam: sebagai hasilnya Inokulasi dengan virus yang dibuat dengan cara ini, tubuh mengembangkan kekebalan tidak hanya terhadap cacar, tetapi juga terhadap hepatitis, influenza atau penyakit lain yang disebabkan oleh virus itu, protein to-rogo dikodekan oleh gen bawaan.

Koleksi dunia endonuklease restriksi - restriksi, "alat" utama manipulasi rekayasa genetika, telah berkembang secara signifikan. Lebih dari 400 batasan "mengenali" kira-kira. 100 situs spesifik (situs) dari struktur yang berbeda dalam molekul DNA (lihat Asam deoksiribonukleat) dan pemecahan rantai polinukleotida DNA di situs ini. Dengan bantuan salah satu enzim tersebut atau kombinasi beberapa enzim restriksi, hampir semua gen dapat diisolasi sebagai bagian dari satu atau lebih fragmen DNA (disebut fragmen restriksi). Ini telah memperluas kemungkinan rekayasa genetika tidak hanya dalam kaitannya dengan isolasi gen, tetapi juga dalam kaitannya dengan aktivasi pekerjaan mereka, analisis struktur gen dan lingkungan molekulernya. Metode untuk sintesis seluruh gen dengan urutan nukleotida tertentu telah dikembangkan, menjadi mungkin untuk memasok gen yang disintesis dan alami dengan berbagai urutan nukleotida pengatur, mengganti, memasukkan, menghapus nukleotida tunggal di bagian gen yang ditentukan secara ketat, mempersingkat atau melengkapi rantai nukleotidanya dengan akurasi satu nukleotida.

Pencapaian rekayasa genetika adalah penetrasinya ke dalam organisasi dan fungsi mekanisme hereditas dalam sel-sel organisme yang lebih tinggi, termasuk manusia. Pada eukariota yang lebih tinggi, data paling menarik telah diperoleh dengan menggunakan metode rekayasa genetika. Keberhasilan rekayasa genetika sebagian besar terkait dengan produksi vektor khusus baru yang memungkinkan kloning (perbanyakan) fragmen DNA individu (gen) yang efisien dan sintesis protein yang dikodekan oleh gen-gen ini.

Fragmen restriksi yang terhubung ke vektor DNA dikloning dalam sel hidup menggunakan kemampuan vektor tersebut untuk bereproduksi (mereplikasi) dalam sel dalam banyak salinan. Tergantung pada ukuran fragmen yang akan dikloning dan tujuan penelitian, vektor dari salah satu dari empat jenis digunakan - plasmid (lihat), fag (lihat. Bakteriofag), kosmid atau turunan fag dengan DNA beruntai tunggal.

Untuk mengkloning fragmen DNA yang relatif kecil (hingga 10 ribu pasangan basa), vektor plasmid (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19, dll.) digunakan. Pencapaian rekayasa genetika dalam beberapa tahun terakhir adalah produksi vektor berdasarkan fag X (Charon 4A, gtwes-B), di mana bagian dari genom digantikan oleh fragmen DNA asing. Genom hibrida secara artifisial "dikemas" ke dalam cangkang protein dan bakteri terinfeksi dengan fag yang direkonstruksi ini. Membentuk beberapa ribu salinan selama reproduksi di dalam sel, fag yang direkonstruksi melisiskannya dan dilepaskan ke media kultur. Dengan bantuan vektor tersebut, fragmen DNA dari 10-25 ribu pasangan basa dikloning.

Vektor kosmid (pIB8, MUA-3) adalah hibrida dari fag X dan plasmid. Mereka mengandung apa yang disebut Urutan COS dari DNA fag yang diperlukan untuk mengemas genom fag ke dalam cangkang protein, dan segmen DNA plasmid yang memungkinkan vektor kosmid bereplikasi pada bakteri dengan cara yang sama seperti yang dilakukan plasmid. Dengan demikian, genom rekombinan yang dihasilkan menginfeksi bakteri dengan efisiensi tinggi seperti bakteriofag, tetapi berkembang biak di dalamnya seperti plasmid tanpa menyebabkan kematian sel bakteri. Kosmid digunakan untuk mengkloning fragmen DNA hingga 35-45 ribu pasangan basa.

Vektor, yang merupakan turunan dari fag dengan DNA untai tunggal (M13 mp8, M13, mp73, dll.), dibangun berdasarkan molekul DNA sirkular dari bakteriofag M13. Untuk menanamkan DNA asing, molekul DNA fag untai ganda replika digunakan. Sebuah vektor yang membawa DIC asing dimasukkan ke dalam sel bakteri, di mana molekul rekombinan berkembang biak tanpa melisiskan sel ini dan "bertunas" ke dalam media kultur sebagai partikel virus dengan molekul DNA beruntai tunggal. Vektor ini digunakan untuk mengkloning fragmen DNA (hingga 300-400 pasangan basa).

Gen yang diperlukan untuk manipulasi rekayasa genetika diperoleh dengan mengkloning molekul DNA rekombinan yang sesuai dan memilih klon tersebut. Dalam kasus-kasus ketika gen organisme yang lebih tinggi dan manusia dikloning / ekspresi to-rykh dalam E. coli (paling sering digunakan untuk tujuan tersebut) tidak mungkin, prosedur kloning dan seleksi dilakukan dalam beberapa tahap. Pada tahap pertama, yang disebut perpustakaan gen dari fragmen DNA (kloning langsung dari genom sel) atau dari salinan DNA kloning (cDNA) dari messenger RNA yang sesuai. Membandingkan struktur fragmen DNA genom dan cDNA yang sesuai, mereka memperoleh informasi penting tentang organisasi materi genetik, dan dalam kasus penyakit keturunan, tentang sifat anomali materi genetik, konsekuensinya adalah ini. penyakit. Dari perpustakaan gen, dengan menggunakan teknik modern, dimungkinkan untuk mengekstrak gen yang diperlukan dengan wilayah genom yang mengelilinginya. Saat ini, perpustakaan lengkap gen dari banyak mikroorganisme, tumbuhan dan hewan (hingga mamalia dan manusia) telah dibuat. Beberapa ratus gen dan urutan nukleotida lain dalam DNA manusia telah dikloning dan sampai batas tertentu dipelajari.

Kemungkinan penelitian rekayasa genetika tidak terbatas pada kloning gen dan memperoleh salinan dalam jumlah besar. Seringkali diperlukan tidak hanya untuk mengkloning gen, tetapi juga untuk memastikan ekspresinya dalam sel, yaitu, untuk menerapkan informasi yang terkandung di dalamnya ke dalam urutan asam amino dari rantai polipeptida dari protein yang dikodekan oleh gen ini. Jika gen yang dimasukkan ke dalam sel bakteri diperoleh dari bakteri dari spesies yang sama (atau dekat), maka mungkin cukup untuk mengisolasi gen dengan elemen pengatur yang mengontrol ekspresinya. Namun, dengan beberapa pengecualian, urutan nukleotida pengatur dari organisme yang jauh secara evolusioner tidak dapat dipertukarkan. Oleh karena itu, untuk mencapai, misalnya, ekspresi gen eukariotik dalam sel E. coli, daerah pengatur dihilangkan darinya, dan bagian struktural gen tersebut dilampirkan (pada jarak tertentu) ke daerah pengatur dari gen bakteri. Kemajuan signifikan dalam pengembangan teknik ini dicapai setelah penemuan enzim nuklease Ba131, yang memiliki sifat unik untuk menghidrolisis kedua rantai molekul DNA linier beruntai ganda mulai dari ujung molekul, yaitu enzim ini menghilangkan “ekstra Urutan nukleotida berapa pun panjangnya dari ujung fragmen DNA. Saat ini, wilayah struktural dan regulasi diisolasi secara terpisah menggunakan restriksi tersebut, situs "pengenalan" yang terletak paling berhasil pada rantai polinukleotida, kemudian urutan nukleotida "ekstra" dihilangkan dan wilayah struktural gen eukariotik terhubung ke wilayah regulasi gen bakteri. Dengan cara ini, dimungkinkan untuk mencapai tidak hanya ekspresi gen eukariotik dalam sel bakteri, tetapi, sebaliknya, gen bakteri dalam sel eukariota yang lebih tinggi dan lebih rendah.

Keberhasilan rekayasa genetika erat kaitannya dengan pengembangan dan penyempurnaan metode penentuan urutan nukleotida (sequencing) dalam molekul DNA. Sejumlah besar restriksi yang tersedia bagi para peneliti memungkinkan untuk mengisolasi fragmen DNA tertentu dengan spesifisitas absolut, dan pengembangan serta peningkatan metode kloning memungkinkan untuk memperoleh fragmen bahkan gen unik dalam jumlah yang diperlukan untuk analisis. Metode sekuensing DNA telah terbukti sangat efektif sehingga seringkali, dengan menentukan urutan nukleotida DNA, diperoleh data tentang urutan nukleotida dalam molekul RNA yang sesuai dan urutan residu asam amino dalam molekul protein yang disintesis. Saat memproses hasil sekuensing DNA, komputer banyak digunakan. Untuk interpretasi yang lebih lengkap dan lebih cepat dari data eksperimen yang diperoleh, "bank" komputer nasional dan internasional dari urutan nukleotida sedang dibuat. Saat ini, urutan nukleotida lengkap genom dari sejumlah plasmid bakteri dan virus telah ditentukan, dan masalah menentukan urutan nukleotida lengkap dari kromosom individu pertama, dan kemudian seluruh genom organisme yang lebih tinggi, termasuk manusia, sudah sedang dipecahkan.

Dengan bantuan metode rekayasa genetika, penyimpangan dalam struktur bagian tertentu dari gen manusia ditemukan, yang merupakan penyebab penyakit keturunan. Paling sering, metode ini disebut. b. analisis lot. DNA seluler yang diisolasi mengalami hidrolisis enzim restriksi, fragmen yang dihasilkan dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan elektroforesis gel agarosa atau poliakrilamida. Fragmen yang dipisahkan dipindahkan ("dicetak ulang") ke kertas kromatografi yang diperlakukan khusus, filter nitroselulosa atau nilon dan sekali lagi dikenakan pemisahan elektroforesis. Potong tempat elektroferogram yang sesuai dengan fraksi individu dan mengandung jenis fragmen DNA yang sama; potongan elektroforogram diinkubasi dengan gen atau bagian dari kloning sebelumnya, atau dengan gen yang diperoleh secara kimia. sintesis oleh urutan nukleotida yang mengandung label radioaktif. DNA yang ditandai hanya berhubungan dengan fragmen DNA seluler yang dianalisis, sehingga gandum hitam memiliki urutan nukleotida yang melengkapinya. Perubahan dalam distribusi dan jumlah label tetap dibandingkan dengan norma memungkinkan untuk menilai penataan ulang dalam gen yang dianalisis atau urutan nukleotida yang berdekatan dengannya.

Situs "pengenalan" restriksi tertentu dalam molekul DNA tidak merata, oleh karena itu, selama hidrolisis oleh enzim ini, molekul DNA dipecah menjadi beberapa fragmen dengan panjang yang berbeda. Penataan ulang struktur DNA, sebagai akibatnya situs "pengenalan" yang ada menghilang atau muncul, menyebabkan perubahan pada kumpulan fragmen ini (yang disebut fragmen restriksi), yaitu, munculnya panjang fragmen restriksi polimorfisme (GVDRF). Penataan ulang dalam molekul DNA mungkin atau mungkin tidak menyebabkan perubahan selama sintesis atau dalam struktur protein yang dikodekan; penataan ulang yang tidak menyebabkan perubahan adalah mayoritas, dan menyebabkan RFLP normal. Ternyata RFLP adalah sifat genetik yang jelas. Saat ini, analisis RFLP telah menjadi salah satu metode paling akurat yang digunakan dalam genetika manusia dan genetika medis. Untuk sejumlah penyakit keturunan, bentuk RFLP dijelaskan yang secara langsung menunjukkan adanya penyakit atau pembawa gen yang diubah secara patologis.

Rekayasa genetika menandai awal dari arah penelitian baru, yang disebut "genetika terbalik". Analisis genetik tradisional (lihat) dilakukan dalam urutan berikut: tanda dipilih, hubungan tanda dengan determinan genetik dan lokalisasi determinan ini dalam kaitannya dengan yang sudah diketahui ditetapkan. Dalam genetika terbalik, semuanya terjadi dalam urutan terbalik: sebuah fragmen DNA dengan fungsi yang tidak diketahui dipilih, keterkaitan fragmen DNA ini dengan daerah lain dari genom dan hubungannya dengan sifat-sifat tertentu ditetapkan. Pendekatan ini memungkinkan untuk mengembangkan metode untuk diagnosis dini dan deteksi pembawa penyakit seperti korea Huntington, penyakit Duchenne, cystic fibrosis, sifat biokimia cacat herediter yang belum diketahui. Menggunakan metode silsilah untuk menetapkan pola transmisi herediter dari Huntington's chorea, ditunjukkan bahwa fragmen DNA G8 yang diisolasi dari genom manusia terkait erat dengan gen yang menentukan penyakit, dan bentuk fragmen RFLP G8 dalam populasi ini. dapat mendiagnosis penyakit ini dan mengidentifikasi pembawa gen yang rusak.

Masih banyak kesulitan teknis dalam memperkenalkan metode yang digunakan dalam rekayasa genetika ke dalam praktik medis. Banyak laboratorium di seluruh dunia secara aktif mengembangkan metode diagnostik rekayasa genetika yang cocok secara praktis, dan diharapkan metode tersebut akan menemukan aplikasi dalam waktu dekat, jika bukan untuk skrining genetik massal (screening) selama pemeriksaan medis populasi, maka, pada setidaknya, untuk survei sampel kelompok berisiko tinggi untuk penyakit keturunan.

Rekayasa genetika memungkinkan tidak hanya untuk menyalin senyawa dan proses alami, tetapi juga untuk memodifikasinya dan membuatnya lebih efisien. Contohnya adalah penelitian baru yang disebut rekayasa protein. Perhitungan yang dibuat berdasarkan data pada urutan asam amino dan organisasi spasial molekul protein menunjukkan bahwa dengan penggantian tertentu residu asam amino tertentu dalam molekul sejumlah enzim, peningkatan signifikan dalam aktivitas enzimatiknya dimungkinkan. Dalam gen terisolasi yang mengkode sintesis enzim tertentu, penggantian nukleotida tertentu yang dikontrol secara ketat dilakukan dengan metode rekayasa genetika. Selama sintesis protein enzimatik di bawah kendali gen yang dimodifikasi seperti itu, penggantian residu asam amino yang ditentukan sebelumnya secara ketat dalam rantai polipeptida terjadi, yang menyebabkan peningkatan aktivitas enzim berkali-kali lipat dibandingkan dengan aktivitas alami. prototipe.

Di bidang pertanian, rekayasa genetika diharapkan dapat memberikan kontribusi besar dalam pemilihan varietas tanaman unggul baru yang tahan terhadap kekeringan, penyakit, dan hama, serta pengembangan varietas tanaman baru yang sangat produktif. hewan.

Seperti halnya pencapaian ilmu pengetahuan, keberhasilan rekayasa genetika dapat digunakan tidak hanya untuk kepentingan, tetapi juga untuk merugikan umat manusia. Penelitian yang dilakukan secara khusus telah menunjukkan bahwa bahaya penyebaran DNA rekombinan yang tidak terkendali tidak sebesar yang diperkirakan sebelumnya. DNA rekombinan dan bakteri yang membawa mereka ternyata sangat tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan, tidak layak pada manusia dan hewan. Diketahui bahwa di alam dan tanpa campur tangan manusia ada kondisi yang menyediakan pertukaran aktif informasi genetik, inilah yang disebut. aliran gen. Namun, alam telah menciptakan banyak penghalang efektif untuk penetrasi informasi genetik asing ke dalam tubuh. Saat ini, jelas bahwa ketika bekerja dengan sebagian besar molekul DNA rekombinan, tindakan pencegahan yang biasa cukup memadai, gandum hitam digunakan, misalnya, oleh ahli mikrobiologi ketika bekerja dengan bahan infeksius. Untuk kasus khusus, metode yang efektif telah dikembangkan untuk perlindungan biologis dan isolasi fisik objek eksperimental dari manusia dan lingkungan. Oleh karena itu, versi pertama yang sangat ketat dari aturan untuk bekerja dengan DNA rekombinan direvisi dan dilunakkan secara signifikan. Mengenai penggunaan yang disengaja dari pencapaian rekayasa genetika untuk merugikan manusia, baik ilmuwan maupun masyarakat harus secara aktif berjuang untuk memastikan bahwa bahaya ini tetap hanya mungkin secara teoritis.

Lihat juga Bioteknologi.

Bibliografi: Alikhanyan S. I. Keberhasilan dan prospek rekayasa genetika, Genetika, vol.12, Jvft 7, hlm. 150, 1976, daftar pustaka; AlikhanyanS. I. dkk. Memperoleh molekul DNA rekombinan (hibrida) yang berfungsi, in vitro, ibid., vol.I, No.11, hal. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Rekayasa genetika, Priroda, M1, hal. 8, 1976; Tikhomirova L.P. dan lainnya. Molekul DNA hibrida fag X dan plasmid ColEl, Dokl. Akademi Ilmu Pengetahuan Uni Soviet, vol.223, no.4, hlm. 995, 1975, daftar pustaka; Coklat D.D.a. S t e r n R. Metode isolasi gen, Ann. Putaran. Biokimia., v. 43, hal. 667, 1974, daftar pustaka; C h a n g A. C. Y. a. Hai. Studi DNA mitokondria tikus di Escherichia coli, Cell, v. 6, hal. 231.1975, daftar pustaka; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. Urutan nukleotida DNA B o y e r H. W. dibatasi oleh endonuklease R1, Proc. nat. akad. sci. (cuci.), v. 69, hal. 3448, 1972, daftar pustaka; Hershfield V.a. Hai. Plasmid ColEl sebagai kendaraan molekuler untuk kloning dan amplifikasi DNA, ibid., v. 71, hal. 3455, 1974; Morrow J. F. a. Hai. Replikasi dan transkripsi DNA eukariotik dalam Escherichia coli, ibid., hal. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-tani S. RNA-dependent DNA polimerase dalam virion virus sarkoma Rous, Nature (Lond.), v. 226, hal. 1211, 1970.

Bioteknologi, ed. A.A. Baeva, M., 1984; B tentang h hingga sekitar di N. P., Zakharov A. F. dan Ivanov V. I. Genetika medis, M., 1984; M a n i a-tis G., FrichE. dan Sambrook J. Metode rekayasa genetika. Kloning molekuler, trans. dari bahasa Inggris, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. Hai. Polimorfisme DNA dan patologi molekuler kluster gen globin manusia, Hum. Gen., v. 69, hal. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliografi manusia kloning dan DNA terpilih lainnya, Amer. J. hum. Gen., v. 37, hal. 386, 1985; Dalam ot s t e i n D. a. Hai. Konstruksi peta keterkaitan genetik pada manusia menggunakan polimorfisme panjang fragmen restriksi, ibid., v. 32, hal. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. Hai. Penanda DNA untuk penyakit sistem saraf, Science, v. 225, hal. 1320, 1984; Motulsky A. G. Dampak manipulasi genetik pada masyarakat dan kedokteran, ibid., v. 219, hal. 135, 1983; Putih R.a. Hai. Penanda genetik terkait erat untuk cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, hal. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s sampai y A. S. a. Guttler F. Diagnosis prenatal fenilketonuria klasik dengan pemetaan gen, J. Amer. obat pantat., v. 251, hal. 1998, 1984.

L.S. Chernin, V.H. Kalinin.

rekayasa genetika

Biologi modern pada dasarnya berbeda dari biologi tradisional tidak hanya dalam pengembangan ide-ide kognitif yang lebih mendalam, tetapi juga dalam hubungan yang lebih dekat dengan kehidupan masyarakat, dengan praktik. Kita dapat mengatakan bahwa di zaman kita, biologi telah menjadi sarana untuk mengubah dunia kehidupan untuk memenuhi kebutuhan material masyarakat. Kesimpulan ini diilustrasikan, pertama-tama, oleh hubungan erat antara biologi dan bioteknologi, yang telah menjadi bidang produksi material yang paling penting, mitra setara teknologi mekanik dan kimia buatan manusia, serta obat-obatan.

Sejak awal, biologi dan bioteknologi selalu berkembang bersama, dan sejak awal, biologi telah menjadi dasar ilmiah bioteknologi. Namun, untuk waktu yang lama, kurangnya data sendiri tidak memungkinkan biologi memiliki dampak yang sangat besar pada bioteknologi. Situasi berubah secara dramatis dengan penciptaan pada paruh kedua abad ke-20. metodologi rekayasa genetika, yang dipahami sebagai manipulasi genetik dengan tujuan mengkonstruksi genotipe baru dan merekonstruksi genotipe yang sudah ada. Menjadi pencapaian metodis menurut sifatnya, rekayasa genetika tidak mengarah pada pemecahan ide-ide yang berlaku tentang fenomena biologis, tidak mempengaruhi ketentuan dasar biologi, seperti astronomi radio tidak menggoyahkan ketentuan dasar astrofisika, pembentukan "ekivalen mekanik panas" tidak menyebabkan perubahan dalam hukum konduksi panas, dan buktinya Teori atomistik materi tidak mengubah hubungan termodinamika, hidrodinamika dan teori elastisitas (A.A. Baev).

Namun demikian, rekayasa genetika telah membuka era baru dalam biologi dengan alasan bahwa peluang baru telah muncul untuk menembus kedalaman fenomena biologis untuk lebih mengkarakterisasi bentuk-bentuk keberadaan makhluk hidup, lebih efektif mempelajari struktur dan fungsi gen di tingkat molekuler, dan memahami mekanisme kerja yang halus, aparatus genetik. Kemajuan dalam rekayasa genetika berarti sebuah revolusi dalam modern

ilmu pengetahuan Alam. Mereka menentukan kriteria nilai gagasan modern tentang fitur struktural dan fungsional tingkat molekuler dan seluler materi hidup. Data modern tentang makhluk hidup memiliki signifikansi kognitif yang sangat besar, karena memberikan pemahaman tentang salah satu aspek terpenting dari dunia organik dan dengan demikian memberikan kontribusi yang tak ternilai bagi penciptaan gambaran ilmiah tentang dunia. Dengan demikian, setelah memperluas basis kognitifnya secara tajam, biologi melalui rekayasa genetika juga memiliki pengaruh utama pada kebangkitan bioteknologi.

Rekayasa genetika menciptakan landasan di jalan untuk memahami cara dan sarana "merancang" organisme baru atau meningkatkan yang ada, memberi mereka nilai ekonomi yang besar dan kemampuan untuk secara dramatis meningkatkan produktivitas proses bioteknologi. Namun, rekayasa genetika telah menciptakan cakrawala baru bagi kedokteran di bidang diagnosis dan pengobatan banyak penyakit, baik non-herediter maupun herediter. Dia membuka jalan baru dalam mencari obat baru dan bahan yang digunakan dalam pengobatan. Rekayasa genetika dan bioteknologi telah mendorong perkembangan metode bionanoteknologi.

Dalam kerangka rekayasa genetika, ada genetik dan seluler rekayasa. Rekayasa genetika adalah manipulasi untuk membuat molekul DNA rekombinan. Metodologi ini sering disebut sebagai kloning molekuler, kloning gen, teknologi DNA rekombinan, atau sekadar manipulasi genetik. Penting untuk ditekankan bahwa objek rekayasa genetika adalah molekul DNA, gen individu. Sebaliknya, rekayasa sel dipahami sebagai manipulasi genetik dengan sel individu atau kelompok sel tumbuhan dan hewan yang terisolasi.

TEKNIK GENETIK DAN ALATNYA

Rekayasa genetika adalah seperangkat berbagai metode eksperimen (teknik) yang menyediakan konstruksi (rekonstruksi), kloning molekul DNA dan gen dengan tujuan tertentu.

Metode rekayasa genetika digunakan dalam urutan tertentu (Gbr. 127), dan beberapa tahapan dibedakan dalam pelaksanaannya

eksperimen rekayasa genetika khas yang bertujuan untuk mengkloning gen, yaitu:

1. Isolasi DNA plasmid dari sel organisme yang diinginkan (awal) dan isolasi DNA vektor.

2. Pemotongan (pembatasan) DNA organisme asli menjadi fragmen yang mengandung gen yang diinginkan menggunakan salah satu enzim restriksi dan isolasi gen tersebut dari campuran restriksi. Pada saat yang sama, DNA vektor dipotong (dibatasi), mengubahnya dari struktur melingkar menjadi linier.

3. Menghubungkan segmen DNA (gen) yang diinginkan dengan DNA vektor untuk mendapatkan molekul DNA hibrid.

4. Pengenalan molekul DNA rekombinan melalui transformasi menjadi beberapa organisme lain, misalnya menjadi E. coli atau sel somatik.

5. Inokulasi bakteri, di mana molekul DNA hibrid diperkenalkan, pada media nutrisi yang memungkinkan pertumbuhan hanya sel yang mengandung molekul DNA hibrid.

6. Identifikasi koloni yang terdiri dari bakteri yang mengandung molekul DNA hibrid.

7. Isolasi DNA kloning (kloning gen) dan karakterisasinya, termasuk sekuensing basa nitrogen dalam fragmen DNA kloning.

Beras. 127.Tahapan percobaan rekayasa genetika berturut-turut

Dalam perjalanan evolusi, bakteri mengembangkan kemampuan untuk mensintesis apa yang disebut enzim restriksi (endonuklease), yang menjadi bagian dari sistem modifikasi restriksi seluler (bakteri). Pada bakteri, sistem modifikasi restriksi adalah sistem pertahanan imun intraseluler terhadap DNA asing. Tidak seperti organisme tingkat tinggi, di mana pengenalan dan penghancuran virus, bakteri, dan patogen lainnya terjadi secara ekstraseluler, pada bakteri, perlindungan dari DNA asing (DNA tumbuhan dan hewan tempat mereka hidup) terjadi secara intraseluler, yaitu. ketika DNA asing memasuki sitoplasma bakteri. Untuk melindungi diri mereka sendiri, bakteri juga telah mengembangkan kemampuan untuk "menandai" DNA mereka sendiri dengan basa metilasi pada urutan tertentu. Untuk alasan yang sama, DNA asing, karena tidak adanya gugus metil di dalamnya pada urutan yang sama, dilebur (dipotong) menjadi fragmen oleh berbagai restriksi bakteri, dan kemudian didegradasi oleh eksonuklease bakteri menjadi nuleotida. Kita dapat mengatakan bahwa dengan cara ini bakteri melindungi diri dari DNA tumbuhan dan hewan, yang organismenya hidup sementara (sebagai patogen) atau permanen (sebagai saprofit).

Enzim restriksi pertama kali diisolasi dari E. coli pada tahun 1968. Ternyata mereka mampu memotong (melelehkan) molekul DNA di berbagai tempat (tempat) restriksi. Enzim ini disebut endonuklease kelas I. Kemudian, endonuklease kelas II ditemukan pada bakteri, yang secara khusus mengenali situs restriksi pada DNA asing dan juga melakukan restriksi pada situs tersebut. Enzim dari kelas inilah yang mulai digunakan dalam rekayasa genetika. Pada saat yang sama, enzim kelas III ditemukan yang melelehkan DNA di dekat tempat pengenalan, tetapi enzim ini tidak penting dalam rekayasa genetika.

Tindakan sistem modifikasi restriksi "dirasionalkan" oleh apa yang disebut sekuens palindromik (mengenali) basa nitrogen, yang merupakan situs restriksi DNA. Barisan palindromik adalah barisan basa yang bacaannya sama maju dan mundur, seperti barisan huruf radar. Karena untai DNA memiliki arah antiparalel, urutan dianggap palindromik jika identik ketika dibaca dalam arah dari ujung 5" ke 3" di atas dan di untai bawah dari 3" ke 5" akhir, yaitu:

Palindrom dapat berukuran berapa pun, tetapi sebagian besar palindrom yang digunakan sebagai tempat pengenalan enzim restriksi memiliki panjang 4, 5, 6, dan jarang 8 basa.

Enzim restriksi adalah alat yang sangat penting dalam rekayasa genetika untuk memotong fragmen (gen) yang diinginkan dari molekul DNA besar. Karena lebih dari 100 enzim restriksi diketahui, ini memungkinkan pemilihan enzim restriksi dan eksisi selektif fragmen dari DNA asli.

Fitur yang luar biasa dari restriksi adalah bahwa mereka menghasilkan potongan molekul menjadi beberapa fragmen (pembatasan) DNA di tepian, sebagai akibatnya satu untai lebih panjang dari yang lain di ujung yang dihasilkan, membentuk semacam ekor. Ujung (ekor) seperti itu disebut ujung "lengket", karena mereka mampu saling melengkapi.

Pertimbangkan hasil pembatasan pada contoh salah satu restriksi yang paling terkenal EcoRI dari sistem pembatasan-modifikasi E. coi. Alih-alih melelehkan DNA di tengah urutan pengenalan palindromik, enzim ini melelehkan DNA di luar pusat dan menghasilkan 4 ujung komplementer (“lengket”), yang terdiri dari sejumlah nukleotida yang berbeda, yaitu:

Ujung "lengket" ini berguna dalam rekayasa genetika karena dapat dihubungkan kembali secara komplementer pada suhu rendah, memungkinkan penutupan fragmen DNA yang efisien.

Situs pengakuan dan situs peleburan dalam hal pembatasan lainnya memiliki konten yang berbeda, yaitu:

Setelah restriksi DNA, fragmen DNA restriksi (DNA-restriksi) diisolasi dari campuran restriksi, yang kemudian diperlukan untuk berasosiasi dengan vektor. DNA terbatas diisolasi menggunakan elektroforesis, karena sangat mudah untuk memfraksinasi DNA terbatas menggunakan metode ini karena ukuran fragmen terbatas dan rasio massa muatan listrik yang konstan. Fragmen dalam medan listrik bermigrasi selama elektroforesis pada frekuensi yang bergantung pada ukurannya (massa). Semakin besar (panjang) fragmen, semakin lambat ia bermigrasi di medan listrik. Bahan di mana elektroforesis dilakukan adalah agarosa atau poliakrilamida yang tidak bermuatan. Etidium bromida digunakan untuk mengidentifikasi fragmen, yang menodai fragmen, yang mengarah pada deteksi yang lebih mudah.

Efisiensi elektroforesis sangat tinggi, karena dapat digunakan untuk memisahkan fragmen dengan ukuran mulai dari 2 hingga 50.000 basa.

Setelah elektroforesis, fragmen dari agarosa diisolasi menggunakan berbagai metode. Berdasarkan hasil perbandingan ukuran

Restriksi DNA yang sama, diperoleh dengan menggunakan enzim restriksi yang berbeda, membangun peta restriksi, yang menunjukkan situs restriksi dari masing-masing enzim restriksi yang digunakan. Dalam istilah praktis, peta restriksi memungkinkan untuk menentukan tidak hanya ukuran restriksi, tetapi juga untuk mengetahui lokasi lokus gen tertentu dalam molekul DNA.

Karena pada organisme yang lebih tinggi, selama transkripsi, DNA heterogen disintesis, dikoreksi dengan pemrosesan, dalam rekayasa genetika, DNA komplementer (cDNA) biasanya digunakan, yang diperoleh dengan menggunakan mRNA sebagai templat, di mana transkriptase balik mensintesis DNA beruntai tunggal ( cDNA), yang merupakan salinan mRNA. Selanjutnya, DNA untai tunggal ini diubah menjadi DNA untai ganda. Pertimbangkan bahwa cDNA mengandung urutan nukleotida kontinu (ditranskripsi dan diterjemahkan). Ini adalah cDNA yang digunakan untuk restriksi.

Fragmen DNA (pembatasan) yang diisolasi setelah elektroforesis dari gel agarosa dapat diurutkan terlebih dahulu; menentukan urutan nukleotidanya. Untuk ini, metode sekuensing kimia dan enzimatik digunakan. Metode kimia didasarkan pada perolehan fragmen yang diberi label dengan fosfor radioaktif (32 P) dan menghilangkan salah satu basa dari fragmen ini, diikuti dengan memperhitungkan hasil radioautografi gel yang mengandung fragmen ini. Metode enzimatik didasarkan pada fakta bahwa nukleotida dimasukkan pada akhir fragmen yang dianalisis, yang kemudian digunakan dalam sintesis fragmen yang berbeda. in vitro, dianalisis urutan nukleotidanya secara elektroforesis. Untuk mempelajari urutan nukleotida spesifik dalam molekul DNA, gunakan

juga hibridisasi DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern-

dan bercak Selatan.

Vektor genetik. Segmen DNA (gen) yang dimaksudkan untuk kloning molekuler harus dapat bereplikasi ketika ditransfer ke dalam sel bakteri, mis. menjadi replika. Namun, dia tidak memiliki kemampuan ini. Oleh karena itu, untuk memastikan transfer dan deteksi gen kloning dalam sel, mereka digabungkan dengan apa yang disebut vektor genetik. Yang terakhir harus memiliki setidaknya dua properti. Pertama, vektor harus dapat bereplikasi

dalam sel, dan di beberapa ujung. Kedua, mereka harus mengizinkan pemilihan sel yang mengandung vektor, mis. memiliki penanda yang memungkinkan untuk menyeleksi sel yang mengandung vektor bersama dengan gen kloning (molekul DNA rekombinan). Plasmid dan fag memenuhi persyaratan ini. Plasmid adalah vektor yang baik karena mereka adalah replika dan dapat mengandung gen untuk resistensi terhadap antibiotik apapun, yang memungkinkan seleksi bakteri untuk resistensi terhadap antibiotik ini dan, oleh karena itu, mudah mendeteksi molekul DNA rekombinan.

(Gbr. 128).

Beras. 128. Vektor pBRl

Karena tidak ada vektor plasmid alami, semua vektor plasmid yang diketahui sejauh ini telah dibuat secara artifisial. R-plasmid berfungsi sebagai bahan awal untuk pembuatan sejumlah vektor genetik, di mana sekuens DNA yang berlebihan, termasuk yang memiliki banyak situs restriksi, dihilangkan dengan bantuan restriksi. Penghapusan ini ditentukan oleh fakta bahwa vektor plasmid seharusnya hanya memiliki satu situs pengenalan untuk satu enzim restriksi, dan situs ini harus terletak di wilayah genom plasmid yang secara fungsional tidak penting. Misalnya, vektor plasmid pBR 322, yang memiliki gen resistensi ampisilin dan tetrasiklin, membuatnya sangat nyaman

untuk pemilihan bakteri yang mengandung segmen DNA kloning, ia memiliki situs restriksi tunggal untuk lebih dari 20 enzim restriksi, termasuk enzim restriksi terkenal seperti Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II dan Sal I.

Vektor fag juga memiliki sejumlah keunggulan. Mereka mungkin termasuk fragmen DNA kloning yang lebih besar (lebih lama) dibandingkan dengan vektor plasma. Selanjutnya, transfer fragmen kloning oleh fag ke dalam sel sebagai akibat dari infeksi yang terakhir lebih efisien daripada transformasi DNA. Akhirnya, vektor fag memungkinkan penyaringan (pengenalan) yang lebih efisien pada permukaan agar dari koloni yang mengandung sel yang membawa gen kloning. Banyak vektor fag didasarkan pada fag lambda.

Selain fag, vektor virus lain yang dibuat berdasarkan virus herpes, serta vektor yang dibuat berdasarkan DNA ragi, juga digunakan.

Jika kloning gen dilakukan dengan menggunakan sel mamalia atau tumbuhan, maka persyaratan vektor sama dengan kloning pada sel bakteri.

Konstruksi molekul DNA rekombinan. Konstruksi langsung molekul DNA rekombinan mengikuti setelah restriksi DNA yang dipelajari dan DNA vektor diperoleh. Ini terdiri dari penutupan segmen restriksi dari DNA yang dipelajari dengan restriksi DNA vektor, yang, sebagai akibat dari restriksi, berubah dari DNA sirkular menjadi DNA linier.

Untuk menutup fragmen DNA yang diteliti dengan DNA vektor, digunakan DNA ligase (Gbr. 129). Ligasi akan berhasil jika struktur yang akan disambung memiliki gugus 3'-hidroksil dan 5'-fosfat dan jika gugus-gugus ini terletak pada hubungan yang sesuai satu sama lain. Fragmen digabungkan melalui ujung "lengket" mereka sebagai hasil dari saling melengkapi. Pada konsentrasi fragmen yang tinggi, yang terakhir dari waktu ke waktu menjadi pada posisi yang benar (berlawanan satu sama lain). Banyak restriksi, seperti Eco RI, menghasilkan ujung "lengket" empat dasar. Proses ligasi ujung "lengket", yang terdiri dari empat basa, terjadi pada suhu rendah (sampai 12? C).

Beras. 129. ligasi DNA

Jika fragmen tanpa ujung "lengket" terbentuk selama restriksi, maka fragmen tersebut "secara paksa" diubah menjadi molekul dengan ujung "lengket" menggunakan enzim transferase. Enzim ini menambahkan nukleotida ke ujung 3" DNA. Ekor poli-A dapat ditambahkan pada satu fragmen, ekor poli-T di sisi lain. Reaksi berantai polimerase (PCR) juga digunakan untuk menghasilkan ujung DNA yang diinginkan. Prinsip PCR didasarkan pada denaturasi DNA yang diisolasi dari sel dan “annealing”-nya dengan penambahan oligonukleotida DNA yang masing-masing terdiri dari 15-20 nukleotida pada rantai yang mengalami renaturasi. 50-2000 nukleotida. Sintesis DNA in vitro, mereka memungkinkan DNA polimerase untuk menyalin daerah-daerah yang berada di antara "biji". Penyalinan ini memberikan sejumlah besar salinan dari fragmen DNA yang dipelajari.

Pengenalan molekul DNA rekombinan ke dalam sel. Setelah fragmen DNA (gen) yang diinginkan menyatu dengan vektor genetik menggunakan DNA ligase, molekul rekombinan yang dihasilkan dimasukkan ke dalam sel untuk mencapai replikasinya (karena vektor genetik) dan meningkatkan jumlah salinan. Cara paling populer untuk memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel, di mana vektornya adalah plasmid, adalah transformasi E.coli. Untuk tujuan ini, sel-sel bakteri diperlakukan sebelumnya dengan kalsium atau rubidium (ion), untuk:

sehingga mereka menjadi "kompeten" dalam persepsi DNA rekombinan. Untuk meningkatkan frekuensi penetrasi DNA ke dalam sel, metode elektroporasi digunakan, yang terdiri dari memaparkan sel secara singkat ke medan listrik yang kuat. Perawatan ini menciptakan rongga di membran sel, yang memudahkan sel untuk mengambil DNA. Setelah pengenalan molekul DNA rekombinan ke dalam bakteri, yang terakhir ditaburkan pada MPA (agar pepton daging) yang diperkaya dengan antibiotik untuk memilih sel yang diinginkan, mis. sel yang mengandung molekul DNA rekombinan. Frekuensi transformasi rendah. Biasanya, satu transforman terjadi per 105 sel yang diunggulkan. Jika vektornya adalah fag, maka sel (bakteri atau ragi) ditransfusikan dengan fag. Adapun sel somatik hewan, mereka ditransfeksi dengan DNA dengan adanya bahan kimia yang memfasilitasi perjalanan DNA melalui membran plasma. Injeksi mikro langsung DNA ke dalam oosit, sel somatik yang dikultur, dan embrio mamalia juga dimungkinkan.

Poin terpenting yang terkait dengan kloning molekuler adalah pencarian metode untuk menetapkan apakah fragmen kloning benar-benar termasuk dalam vektor dan, bersama dengan vektor, membentuk molekul DNA rekombinan, memasuki sel. Jika kita berbicara tentang sel bakteri, maka salah satu metode didasarkan pada inaktivasi penyisipan gen resistensi plasmid (vektor). Misalnya, dalam vektor plasmid pBR 322, yang menentukan resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin, satu-satunya situs untuk enzim restriksi Pst I terletak di lokus yang ditempati oleh gen resistensi ampisilin. Pst I yang meleleh di situs ini menghasilkan ujung lengket yang memungkinkan ligasi fragmen kloning ke DNA vektor. Namun, dalam kasus ini, gen resistensi ampisilin plasmid (vektor) tidak aktif, sedangkan gen resistensi tetrasiklin pada vektor tetap utuh. Ini adalah gen resistensi tetrasiklin yang digunakan untuk memilih sel yang diubah oleh molekul DNA rekombinan. Hal ini memungkinkan untuk memverifikasi bahwa sel-sel koloni yang tumbuh pada media dengan tetrasiklin memang mengandung molekul DNA rekombinan, mereka diperiksa menggunakan apa yang disebut "tes spot" pada sepasang cawan dengan media padat, salah satunya mengandung ampisilin, sedangkan yang lain tidak mengandung antibiotik ini. DNA yang akan dikloning adalah

hanya pada transforman yang resisten terhadap tetrasiklin. Sedangkan untuk transforman yang resisten terhadap ampisilin dan tetrasiklin (ArTc), mereka mengandung molekul plasmid (vektor) yang secara spontan memperoleh bentuk melingkar tanpa memasukkan DNA asing (kloning) di dalamnya.

Metode lain untuk mendeteksi penyisipan fragmen asing (kloning) ke dalam vektor plasmid didasarkan pada penggunaan vektor yang mengandung gen -galaktosidase. Penyisipan DNA asing ke dalam gen ini pasti menonaktifkan sintesis -galaktosidase, yang dapat dideteksi dengan menyemai sel-sel yang diubah pada media yang mengandung substrat -galaktosidase. Media ini memungkinkan pemilihan koloni sel yang diwarnai. Ada metode lain juga.

Seperti yang telah dicatat, fragmen restriksi linier dari DNA vektor mampu memulihkan struktur melingkar tanpa menyertakan segmen kloning di dalamnya. Untuk mengurangi frekuensi pembentukan spontan molekul DNA vektor sirkular tersebut, restriksi DNA vektor diperlakukan dengan fosfatase. Akibatnya, pembentukan molekul DNA sirkular menjadi tidak mungkin, karena ujung 5'-PO4 yang diperlukan untuk kerja ligase tidak ada.

Himpunan koloni transforman yang ditumbuhkan pada media selektif adalah sekumpulan sel yang mengandung klon dari fragmen (gen) yang berbeda dari genom atau cDNA yang dikloning. Koleksi klon ini membentuk apa yang disebut perpustakaan DNA, yang banyak digunakan dalam rekayasa genetika.

Tahap akhir dari kloning gen adalah isolasi dan studi DNA kloning, termasuk sequencing. Strain bakteri atau sel somatik yang menjanjikan yang mengandung molekul DNA rekombinan yang mengontrol sintesis protein yang diminati yang memiliki nilai komersial ditransfer ke industri.

TEKNIK SEL

Seperti disebutkan di awal bab, rekayasa sel mengacu pada manipulasi genetik sel hewan dan tumbuhan yang terisolasi. Manipulasi ini sering in vitro, dan tujuan utama mereka adalah untuk mendapatkan genotipe organisme ini dengan sifat yang diinginkan, terutama berguna secara ekonomi. Perihal-

Xia man, maka rekayasa sel diterapkan pada sel germinalnya.

Prasyarat untuk pengembangan rekayasa sel pada manusia dan hewan adalah pengembangan metode untuk menumbuhkan sel somatik mereka pada media nutrisi buatan, serta memperoleh hibrida sel somatik, termasuk hibrida interspesifik. Pada gilirannya, kemajuan dalam budidaya sel somatik telah mempengaruhi studi sel germinal dan pembuahan pada manusia dan hewan. Sejak tahun 60-an. abad ke-20 Banyak percobaan telah dilakukan di beberapa laboratorium di seluruh dunia pada transplantasi inti sel somatik ke dalam telur artifisial tanpa inti. Hasil percobaan ini sering bertentangan, tetapi secara umum mengarah pada penemuan kemampuan inti sel untuk memastikan perkembangan normal telur (lihat Bab IV).

Berdasarkan hasil penelitian perkembangan telur yang dibuahi pada tahun 60-an. abad ke-20 penelitian juga dimulai untuk memastikan kemungkinan pembuahan sel telur di luar tubuh ibu. Sangat cepat, penelitian ini mengarah pada penemuan kemungkinan pembuahan telur dengan spermatozoa in vitro dan perkembangan lebih lanjut dari embrio yang terbentuk dengan cara ini ketika ditanamkan di dalam rahim seorang wanita. Perbaikan lebih lanjut dari metode yang dikembangkan di bidang ini telah mengarah pada fakta bahwa kelahiran anak-anak "tabung" telah menjadi kenyataan. Sudah pada tahun 1981, 12 anak lahir di dunia, yang hidupnya diberikan di laboratorium, di tabung reaksi. Saat ini, bagian rekayasa sel ini telah tersebar luas, dan jumlah anak-anak "tabung percobaan" sudah mencapai puluhan ribu (Gbr. 130). Di Rusia, pekerjaan untuk mendapatkan anak-anak "tabung percobaan" baru dimulai pada tahun 1986.

Pada tahun 1993, sebuah teknik dikembangkan untuk mendapatkan kembar manusia monozigot in vitro dengan membagi embrio menjadi blastomer dan menumbuhkan yang terakhir hingga 32 sel, setelah itu mereka dapat ditanamkan di rahim seorang wanita.

Dipengaruhi oleh hasil yang terkait dengan bayi tabung, hewan juga mengembangkan teknologi yang disebut transplantasi embrio. Ini terkait dengan pengembangan metode untuk menginduksi poliovulasi, metode pembuahan buatan telur dan implantasi embrio dalam tubuh hewan - ibu asuh. Inti dari teknologi ini adalah sebagai berikut:

schuschy. Sapi yang sangat produktif disuntik dengan hormon, menghasilkan poliovulasi, yang terdiri dari pematangan 10-20 sel sekaligus. Telur-telur tersebut kemudian dibuahi secara artifisial dengan sel-sel reproduksi jantan di saluran telur. Pada hari ke 7-8, embrio dikeluarkan dari rahim dan ditransplantasikan ke rahim sapi lain (ibu asuh), yang kemudian melahirkan anak kembar. Anak sapi mewarisi status genetik dari orang tua aslinya.

Beras. 130.Anak-anak "tabung"

Bidang lain dari rekayasa sel pada hewan adalah penciptaan hewan transgenik. Cara paling sederhana untuk mendapatkan hewan tersebut adalah dengan memasukkan molekul DNA linier ke dalam telur hewan asli. Hewan yang berkembang dari telur yang dibuahi akan membawa salinan gen yang diperkenalkan di salah satu kromosom mereka dan, di samping itu, mereka akan mengirimkan gen ini melalui pewarisan. Sebuah metode yang lebih kompleks untuk mendapatkan hewan transgenik telah dikembangkan pada tikus yang berbeda dalam warna bulu dan adalah sebagai berikut. Pertama, embrio berumur empat hari dikeluarkan dari tubuh tikus abu-abu yang hamil dan dihancurkan menjadi sel-sel individual. Kemudian inti diekstraksi dari sel embrio, mereka dipindahkan ke telur tikus hitam, yang sebelumnya kehilangan inti. Telur tikus hitam yang mengandung inti asing ditempatkan dalam tabung reaksi

dengan larutan nutrisi untuk pengembangan lebih lanjut. Embrio yang dikembangkan dari telur tikus hitam ditanamkan ke dalam rahim tikus putih. Dengan demikian, dalam percobaan ini dimungkinkan untuk mendapatkan klon tikus dengan warna bulu abu-abu, yaitu. mengkloning sel embrio dengan sifat yang diinginkan. Dalam Bab IV, kami memeriksa hasil pembuahan buatan tanpa inti telur domba dengan bahan inti sel somatik hewan dari spesies yang sama. Secara khusus, inti dikeluarkan dari telur domba, dan kemudian inti sel somatik (embrio, buah atau sel hewan dewasa) dimasukkan ke dalam telur tersebut, setelah itu telur yang dibuahi dengan cara ini dimasukkan ke dalam rahim. domba dewasa. Anak domba yang lahir ternyata identik dengan domba donor. Contohnya adalah domba Dolly. Anak sapi klon, tikus, kelinci, kucing, bagal dan hewan lainnya juga telah diperoleh. Konstruksi hewan transgenik tersebut merupakan cara langsung untuk mengkloning hewan yang memiliki sifat ekonomis, termasuk individu jenis kelamin tertentu.

Hewan transgenik juga diperoleh dengan menggunakan bahan sumber milik spesies yang berbeda. Secara khusus, metode yang dikenal untuk mentransfer gen yang mengontrol hormon pertumbuhan dari tikus ke telur tikus, serta metode untuk menggabungkan blastomer domba dengan blastomer kambing, yang menyebabkan munculnya hewan hibrida (sapi). Eksperimen ini menunjukkan kemungkinan mengatasi ketidakcocokan spesies pada tahap awal perkembangan. Prospek yang sangat menggoda terbuka (jika ketidakcocokan spesies benar-benar diatasi) dalam cara pembuahan telur satu spesies oleh inti sel somatik spesies lain. Kita berbicara tentang prospek nyata untuk menciptakan hibrida hewan yang bernilai ekonomi yang tidak dapat diperoleh dengan persilangan.

Perlu dicatat bahwa pekerjaan transplantasi nuklir belum terlalu efektif. Eksperimen yang dilakukan pada amfibi dan mamalia umumnya menunjukkan bahwa efektivitasnya rendah, dan itu tergantung pada ketidakcocokan antara inti donor dan oosit penerima. Selain itu, penyimpangan kromosom yang dihasilkan dalam inti yang ditransplantasikan dalam perkembangan lebih lanjut, yang disertai dengan kematian hewan transgenik, juga merupakan penghambat keberhasilan.

Di persimpangan pekerjaan pada studi hibridisasi sel dan studi imunologi, muncul masalah terkait dengan produksi dan studi apa yang disebut antibodi monoklonal. Seperti disebutkan di atas, antibodi yang diproduksi oleh tubuh sebagai respons terhadap pengenalan antigen (bakteri, virus, sel darah merah, dll.) adalah protein yang disebut imunoglobulin dan membentuk bagian mendasar dari sistem pertahanan tubuh melawan patogen. Tetapi setiap benda asing yang dimasukkan ke dalam tubuh adalah campuran dari antigen yang berbeda yang akan merangsang produksi antibodi yang berbeda. Misalnya, eritrosit manusia memiliki antigen tidak hanya untuk golongan darah A (II) dan B (III), tetapi juga banyak antigen lainnya, termasuk faktor Rh. Selanjutnya, protein dinding sel bakteri atau kapsid virus juga dapat bertindak sebagai antigen yang berbeda, menyebabkan pembentukan antibodi yang berbeda. Pada saat yang sama, sel-sel limfoid dari sistem kekebalan tubuh biasanya diwakili oleh klon. Ini berarti bahwa bahkan untuk alasan ini saja, dalam serum darah hewan yang diimunisasi, antibodi selalu merupakan campuran yang terdiri dari antibodi yang diproduksi oleh sel-sel dari klon yang berbeda. Sedangkan untuk keperluan praktis, hanya dibutuhkan satu jenis antibodi saja; yang disebut serum monospesifik, mengandung antibodi hanya satu jenis atau, sebagaimana disebut, antibodi monoklonal.

Dalam mencari metode untuk memperoleh antibodi monoklonal, peneliti Swiss pada tahun 1975 menemukan metode hibridisasi antara limfosit tikus yang diimunisasi dengan satu atau lain antigen dan sel tumor sumsum tulang yang dikultur. Hibrida semacam itu disebut "hibridoma". Dari bagian "limfositik", yang diwakili oleh limfosit dari satu klon, hibridoma tunggal mewarisi kemampuan untuk menyebabkan pembentukan antibodi yang diperlukan, dan dari jenis yang sama, dan berkat bagian "tumor (myeloma)", itu menjadi mampu, seperti semua sel tumor, untuk berkembang biak tanpa batas pada media nutrisi buatan, memberikan populasi hibrida yang besar. pada gambar. 131 menunjukkan skema untuk isolasi garis sel yang mensintesis antibodi monoklonal. Garis sel tikus penghasil antibodi monoklonal diisolasi dengan menggabungkan sel myeloma dengan limfosit dari limpa tikus yang diimunisasi lima hari sebelumnya.

antigen yang diinginkan. Fusi sel dicapai dengan mencampurnya dengan polietilen glikol, yang menginduksi fusi membran sel, dan kemudian menginokulasikannya pada media nutrisi yang memungkinkan pertumbuhan dan reproduksi hanya sel hibrida (hibridoma). Reproduksi hibridoma dilakukan dalam media cair, di mana mereka tumbuh lebih lanjut dan mengeluarkan antibodi ke dalam cairan kultur, dan hanya satu jenis, apalagi, dalam jumlah yang tidak terbatas. Antibodi ini disebut monoklonal. Untuk meningkatkan frekuensi pembentukan antibodi, kloning hibridoma terpaksa dilakukan, mis. untuk pemilihan koloni individu hibridoma yang mampu menghasilkan jumlah antibodi terbesar dari jenis yang diinginkan. Antibodi monoklonal telah menemukan aplikasi luas dalam pengobatan untuk diagnosis dan pengobatan sejumlah penyakit. Pada saat yang sama, keuntungan terpenting dari teknologi monoklonal adalah dapat digunakan untuk menghasilkan antibodi terhadap bahan yang tidak dapat dimurnikan. Sebaliknya, adalah mungkin untuk memperoleh antibodi monoklonal terhadap membran sel (plasma) neuron hewan. Untuk melakukan ini, tikus diimunisasi dengan membran saraf terisolasi, setelah limfosit limpa mereka digabungkan dengan sel myeloma, dan kemudian melanjutkan seperti dijelaskan di atas.

Beras. 131. Memperoleh antibodi monoklonal

TEKNIK GENETIK DAN PENGOBATAN

Rekayasa genetika ternyata sangat menjanjikan untuk pengobatan, terutama dalam penciptaan teknologi baru untuk memperoleh protein aktif fisiologis yang digunakan sebagai obat (insulin, somatostatin, interferon, somatotropin, dll.).

Insulin digunakan untuk mengobati penderita diabetes, yang merupakan penyebab kematian paling umum ketiga setelah penyakit jantung dan kanker. Permintaan dunia akan insulin adalah beberapa puluh kilogram. Secara tradisional, itu diperoleh dari kelenjar pankreas babi dan sapi, tetapi hormon hewan ini sedikit berbeda dari insulin manusia. Insulin babi berbeda dalam satu asam amino, sedangkan insulin sapi berbeda dalam tiga asam amino. Diyakini bahwa insulin hewani sering menyebabkan efek samping. Walaupun sintesis kimiawi insulin telah dilakukan sejak lama, namun sampai saat ini produksi hormon secara industri tetap sangat mahal. Sekarang insulin murah diperoleh dengan menggunakan metode rekayasa genetika dengan sintesis kimia-enzimatik dari gen insulin, diikuti dengan pengenalan gen ini ke E. coli, yang kemudian mensintesis hormon. Insulin semacam itu lebih "biologis", karena secara kimiawi identik dengan insulin yang diproduksi oleh sel pankreas manusia.

Interferon adalah protein yang disintesis oleh sel terutama sebagai respons terhadap infeksi tubuh oleh virus. Interferon adalah spesies spesifik. Misalnya, pada manusia, ada tiga kelompok interferon yang diproduksi oleh berbagai sel di bawah kendali gen yang sesuai. Ketertarikan pada interferon ditentukan oleh fakta bahwa mereka banyak digunakan dalam praktik klinis untuk pengobatan banyak penyakit manusia, terutama penyakit virus.

Memiliki ukuran besar, molekul interferon hampir tidak tersedia untuk sintesis. Oleh karena itu, sebagian besar interferon sekarang diperoleh dari darah manusia, tetapi hasil dengan metode perolehan ini kecil. Sementara itu, kebutuhan akan interferon sangat tinggi. Ini menimbulkan tantangan untuk menemukan metode yang efisien untuk produksi interferon dalam jumlah industri. Rekayasa genetika mendasari produksi modern interferon "bakteri".

Pengaruh rekayasa genetika terhadap teknologi bahan obat yang telah lama dibuat dengan menggunakan teknologi biologi semakin meningkat. Kembali di tahun 40-an dan 50-an. abad ke-20 telah dibuat

industri biologis untuk produksi antibiotik, yang merupakan bagian paling efektif dari gudang obat obat modern. Namun, dalam beberapa tahun terakhir telah terjadi peningkatan resistensi obat yang signifikan dari bakteri, terutama terhadap antibiotik. Alasannya terletak pada distribusi luas di dunia mikroba plasmid yang menentukan resistensi obat bakteri. Itulah sebabnya banyak antibiotik yang sebelumnya terkenal telah kehilangan keefektifannya sebelumnya. Selama ini satu-satunya cara untuk mengatasi resistensi bakteri terhadap antibiotik adalah dengan mencari antibiotik baru. Menurut para ahli, sekitar 300 antibiotik baru diciptakan setiap tahun di dunia. Namun, kebanyakan dari mereka tidak efektif atau beracun. Hanya sedikit antibiotik yang diperkenalkan ke praktik setiap tahun, yang membuatnya perlu tidak hanya untuk mempertahankan, tetapi juga untuk meningkatkan kapasitas industri antibiotik berdasarkan perkembangan rekayasa genetika.

Tugas utama rekayasa genetika dalam teknologi bahan obat di mana mikroorganisme adalah produsen obat ditentukan oleh kebutuhan untuk rekonstruksi rekayasa genetika yang terakhir untuk meningkatkan aktivitas mereka. Pada saat yang sama

Pada saat yang sama, gagasan untuk membuat obat dalam bentuk molekul kecil mulai direalisasikan, yang berkontribusi pada efektivitasnya yang lebih besar.

Bioteknologi kekebalan terutama terkait dengan produksi vaksin generasi baru untuk pencegahan penyakit menular pada manusia dan hewan. Produk komersial pertama yang dibuat dengan bantuan rekayasa genetika adalah vaksin terhadap hepatitis manusia, penyakit mulut dan kuku pada hewan, dan beberapa lainnya. Arah yang sangat penting di bidang ini terkait dengan produksi antibodi monoklonal, reagen yang diperlukan untuk diagnosis patogen, serta untuk pemurnian hormon, vitamin, dan protein dari berbagai alam (enzim, racun, dll.).

Kepentingan praktis yang cukup besar adalah metode memperoleh hemoglobin buatan dengan memasukkan gen hemoglobin ke dalam tanaman tembakau, di mana rantai - dan -globin diproduksi di bawah kendali gen-gen ini, yang digabungkan menjadi hemoglobin. Hemoglobin yang disintesis dalam sel tanaman tembakau berfungsi penuh (mengikat oksigen). Rekayasa sel sebagaimana diterapkan pada manusia dikaitkan tidak hanya dengan pemecahan masalah mendasar biologi manusia, tetapi juga dengan mengatasi, di atas segalanya, ketidaksuburan wanita. Sejak frekuensi kasus positif implantasi di rahim wanita embrio diperoleh in vitro, kecil, kemudian memperoleh embrio kembar monozigot in vitro juga penting, karena kemungkinan implantasi ulang meningkat karena embrio "cadangan". Yang menarik adalah prospek penggunaan sel punca sebagai sumber pengganti sel dan jaringan dalam pengobatan penyakit seperti diabetes, cedera tulang belakang, nyeri jantung, osteoartritis, dan penyakit Parkinson. Namun untuk mewujudkan prospek tersebut, diperlukan studi mendalam tentang biologi sel punca.

Dalam penggunaan rekayasa genetika dalam kaitannya dengan masalah kedokteran, tugas mengembangkan metode rekayasa genetika untuk pengobatan radikal penyakit keturunan, yang sayangnya, belum dapat diobati dengan metode yang ada, menjadi sangat penting. Isi tugas ini adalah mengembangkan cara untuk mengoreksi (menormalkan) mutasi yang mengakibatkan penyakit keturunan, dan untuk memastikan transmisi "koreksi" melalui pewarisan. Diyakini bahwa keberhasilan pengembangan metode rekayasa genetika untuk pengobatan penyakit keturunan akan

berkontribusi pada data genom manusia yang diperoleh sebagai hasil dari implementasi program ilmiah internasional "Human Genome".

MASALAH LINGKUNGAN TEKNIK GENETIK

Meningkatkan bioteknologi ke tingkat yang baru, rekayasa genetika juga telah menemukan aplikasi dalam pengembangan metode untuk menentukan dan menghilangkan pencemaran lingkungan. Secara khusus, strain bakteri telah dibangun yang merupakan semacam indikator aktivitas mutagenik kontaminan kimia. Di sisi lain, strain bakteri yang mengandung plasmid telah direkayasa secara genetik untuk mengontrol sintesis enzim yang mampu menghancurkan banyak senyawa kimia yang mencemari lingkungan. Secara khusus, beberapa bakteri yang mengandung plasmid mampu menguraikan minyak dan produk minyak yang masuk ke lingkungan sebagai akibat dari berbagai kecelakaan atau penyebab tidak menguntungkan lainnya menjadi senyawa yang tidak berbahaya.

Namun, rekayasa genetika adalah transformasi materi genetik, yang tidak ada di alam. Akibatnya, produk rekayasa genetika benar-benar produk baru yang tidak ada di alam. Oleh karena itu, karena sifat produknya yang tidak diketahui, itu sendiri menimbulkan bahaya baik bagi alam dan lingkungan, serta bagi personel yang bekerja di laboratorium yang menggunakan metode rekayasa genetika atau bekerja dengan struktur yang dibuat selama pekerjaan rekayasa genetika.

Karena kemungkinan kloning gen tidak terbatas, bahkan pada awal studi ini, muncul pertanyaan di antara para ilmuwan tentang sifat organisme yang diciptakan. Pada saat yang sama, ada saran tentang sejumlah konsekuensi yang tidak diinginkan dari metodologi ini, dan saran ini juga mendapat dukungan dari masyarakat umum. Secara khusus, muncul ketidaksepakatan tentang sifat-sifat bakteri yang menerima gen hewan dalam eksperimen rekayasa genetika. Misalnya, apakah bakteri mempertahankan E. coli afiliasi spesies mereka karena kandungan gen hewan yang dimasukkan ke dalamnya (misalnya, gen insulin) atau haruskah mereka dianggap sebagai spesies baru? Selanjutnya, seberapa tahan bakteri tersebut, dalam relung ekologi apa mereka dapat

ada? Tetapi yang paling penting adalah munculnya ketakutan bahwa selama produksi dan manipulasi molekul DNA rekombinan, struktur genetik dengan sifat yang tidak terduga dan berbahaya bagi kesehatan manusia, untuk keseimbangan ekologis yang telah ditetapkan secara historis dapat diciptakan. Pada saat yang sama, seruan dimulai untuk moratorium rekayasa genetika. Seruan ini menyebabkan kecaman internasional dan menyebabkan konferensi internasional yang diadakan pada tahun 1975 di AS, di mana kemungkinan konsekuensi dari penelitian di bidang ini dibahas secara luas. Kemudian, di negara-negara di mana rekayasa genetika mulai berkembang, aturan dikembangkan untuk bekerja dengan molekul DNA rekombinan. Aturan tersebut bertujuan untuk mencegah masuknya produk-produk kegiatan laboratorium rekayasa genetika ke dalam habitat.

Aspek lain dari konsekuensi yang tidak diinginkan dari pekerjaan rekayasa genetika terkait dengan bahaya kesehatan personel yang bekerja di laboratorium di mana metode rekayasa genetika digunakan, karena laboratorium tersebut menggunakan fenol, etidium bromida, radiasi UV, yang berbahaya bagi faktor kesehatan. Selain itu, di laboratorium ini ada kemungkinan kontaminasi dengan bakteri yang mengandung molekul DNA rekombinan yang mengontrol sifat yang tidak diinginkan, seperti resistensi obat bakteri. Poin-poin ini dan poin-poin lainnya menentukan kebutuhan untuk meningkatkan tingkat keamanan dalam pekerjaan rekayasa genetika.

Terakhir, masalah bahaya produk rekayasa genetika (tomat, kentang, jagung, kedelai yang dimodifikasi secara genetik), serta produk-produk seperti roti, pasta, permen, es krim, keju, minyak sayur, produk daging, yang dalam jumlah banyak. negara, terutama di Amerika Serikat, telah menyebar luas. Selama 12.000 tahun pertanian, manusia telah menggunakan produk alami. Oleh karena itu, diasumsikan bahwa dengan makanan yang dimodifikasi secara genetik, racun baru, alergen, bakteri, karsinogen akan memasuki tubuh manusia, yang akan menyebabkan penyakit yang sama sekali baru pada generasi mendatang. Hal ini menimbulkan pertanyaan tentang penilaian yang benar-benar ilmiah terhadap makanan yang dimodifikasi secara genetik.

PERMASALAHAN UNTUK DISKUSI

1. Apa yang dimaksud dengan rekayasa genetika, seluler, dan genetika? Apakah ada perbedaan antara konsep ini dan kloning molekuler?

2. Apa sifat progresif dari rekayasa genetika dibandingkan dengan metode lain yang digunakan dalam biologi?

3. Sebutkan "alat" utama rekayasa genetika.

4. Apa itu enzim restriksi, apa sifat dan perannya dalam rekayasa genetika?

5. Apakah semua restriksi membentuk ujung "lengket" dari DNA yang dipelajari dan apakah struktur ujung "lengket" bergantung pada jenis restratase?

6. Mendefinisikan vektor genetik. Apakah ada vektor alami?

7. Bagaimana cara mendapatkan vektor genetik di laboratorium? Objek biologis apa yang menjadi bahan sumber untuk mendapatkan vektor?

8. Berapa panjang maksimum sekuens basa nitrogen DNA yang masih dapat dimasukkan dalam vektor genetik? Apakah vektor berbeda dalam "kekuatan"?

9. Mendeskripsikan sifat-sifat DNA ligase dan menentukan perannya dalam rekayasa genetika.

10. Bagaimana segmen DNA kloning (gen) terkait dengan vektor genetik?

11. Berapa frekuensi memasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel bakteri?

12. Berdasarkan prinsip apa pemilihan sel bakteri yang mengandung molekul DNA rekombinan? Berikan salah satu contoh pemilihan tersebut.

14. Banyak strain bakteri memiliki enzim yang sama yang menyediakan metabolisme yang hampir sama. Sementara itu, spesifisitas nukleotida sistem modifikasi restriksi bakteri berbeda. Bisakah Anda menjelaskan fenomena ini?

15. Mengapa urutan DNA yang mewakili situs pengenalan enzim restriksi tidak dapat mengandung lebih dari delapan pasangan basa?

16. Berapa kali urutan HHCC yang dikenali oleh enzim restriksi Hae III terjadi pada segmen DNA 50.000 bp dengan kandungan HC 30, 50, dan 70 persen?

17. Enzim restriksi Bam HI dan Bgl I masing-masing melelehkan urutan G GATCC dan T GATCA. Dapatkah fragmen DNA yang dihasilkan oleh restriksi Bgl I dimasukkan ke dalam situs Bam HI? Jika ya, mengapa? Jika plasmid (vektor) yang digunakan mengandung satu situs restriksi Bgl I, maka pada media nutrisi apa bakteri dapat dipilih, plasmid ini?

18. Hitung frekuensi transformasi bakteri per molekul DNA jika 5-10 5 transforman terbentuk per 5000 pasangan basa plasmid?

19. Apakah mungkin untuk mengkloning replikasi DNA titik 0 E. coli dan jika demikian, bagaimana?

20. Apakah mungkin untuk menentukan berapa banyak molekul DNA yang dibutuhkan untuk mengubah satu sel? E.coli?

21. Apakah mungkin untuk menentukan tempat penyambungan pada mRNA menggunakan reaksi berantai polimerase?

22. Bagaimana reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkenalkan situs restriksi yang diinginkan pada situs yang diinginkan pada fragmen DNA yang akan diklon?

23. Sebutkan metode rekayasa sel yang diterapkan pada hewan. Berapa nilai ekonomi hewan yang dihasilkan dengan metode ini?

24. Definisikan istilah "tanaman transgenik" dan "hewan transgenik". Apakah organisme transgenik mempertahankan spesiesnya atau dapat dianggap organisme spesies baru?

25. Apa yang dimaksud dengan hibridoma dan antibodi monoklonal? Bagaimana mereka diterima?

26. Apakah rekayasa sel dapat diterapkan pada manusia?

27. Misalkan injeksi DNA asing ke dalam telur tikus dan implantasi telur yang dibuahi dengan cara ini ke dalam tubuh tikus berakhir pada kehamilannya dan kelahiran tikus yang mengandung salinan DNA yang disuntikkan dalam genom. Namun, tikus itu ternyata adalah mosaik; beberapa sel mereka mengandung salinan DNA yang disuntikkan, sementara yang lain kekurangan DNA ini. Bisakah Anda menjelaskan sifat dari fenomena ini?

28. Apakah Anda menganggap makanan yang dibuat dari makanan yang dimodifikasi secara genetik berbahaya secara genetik?

29. Apakah tinjauan ilmiah tentang makanan yang dimodifikasi secara genetik diperlukan?

Kognisi ditentukan oleh apa yang kita tegaskan sebagai Kebenaran.

P.A. Florensky, 1923

Ketika diterapkan pada manusia, rekayasa genetika dapat digunakan untuk mengobati penyakit keturunan. Namun, secara teknis, ada perbedaan yang signifikan antara merawat pasien itu sendiri dan mengubah genom keturunannya.

Tugas mengubah genom orang dewasa agak lebih sulit daripada membiakkan keturunan hewan rekayasa genetika baru, karena dalam hal ini perlu untuk mengubah genom banyak sel dari organisme yang sudah terbentuk, dan bukan hanya satu telur embrionik. Untuk ini, diusulkan untuk menggunakan partikel virus sebagai vektor. Partikel virus mampu menembus ke dalam persentase yang signifikan dari sel dewasa, menanamkan informasi turun-temurun mereka ke dalamnya; kemungkinan reproduksi terkontrol partikel virus dalam tubuh. Pada saat yang sama, untuk mengurangi efek samping, para ilmuwan berusaha menghindari pengenalan DNA rekayasa genetika ke dalam sel-sel organ genital, sehingga menghindari paparan keturunan pasien di masa depan. Perlu juga dicatat kritik yang signifikan terhadap teknologi ini di media: pengembangan virus rekayasa genetika dianggap oleh banyak orang sebagai ancaman bagi seluruh umat manusia.

Dengan bantuan terapi gen di masa depan, adalah mungkin untuk mengubah genom manusia. Saat ini, metode yang efektif untuk memodifikasi genom manusia sedang dikembangkan dan diuji pada primata. Untuk waktu yang lama, rekayasa genetika monyet menghadapi kesulitan serius, tetapi pada tahun 2009 percobaan itu berhasil: sebuah publikasi muncul di jurnal Nature tentang keberhasilan penggunaan vektor virus rekayasa genetika untuk menyembuhkan monyet jantan dewasa dari buta warna. Pada tahun yang sama, primata rekayasa genetika pertama (tumbuh dari telur yang dimodifikasi) memberikan keturunan - marmoset biasa.

Meskipun dalam skala kecil, rekayasa genetika telah digunakan untuk memberikan kesempatan pada wanita dengan beberapa jenis ketidaksuburan untuk hamil. Untuk melakukan ini, gunakan telur wanita yang sehat. Akibatnya, anak mewarisi genotipe dari satu ayah dan dua ibu.

Namun, kemungkinan memperkenalkan perubahan yang lebih signifikan dalam genom manusia menghadapi sejumlah masalah etika yang serius.

_____________________________________________________________________________________________

Rekayasa genetika (rekayasa genetika)

Ini adalah seperangkat teknik, metode dan teknologi untuk memperoleh RNA dan DNA rekombinan, mengisolasi gen dari suatu organisme (sel), memanipulasi gen dan memasukkannya ke dalam organisme lain.

Rekayasa genetika bukanlah ilmu dalam arti luas, tetapi merupakan alat bioteknologi menggunakan metode ilmu biologi seperti biologi molekuler dan seluler, sitologi, genetika, mikrobiologi, virologi.

Komponen penting dari bioteknologi adalah rekayasa genetika. Lahir di awal tahun 70-an, dia telah mencapai kesuksesan besar hari ini. Teknik rekayasa genetika mengubah sel bakteri, ragi, dan mamalia menjadi "pabrik" untuk produksi skala besar protein apa pun. Hal ini memungkinkan untuk menganalisis secara rinci struktur dan fungsi protein dan menggunakannya sebagai obat.

Saat ini, Escherichia coli (E. coli) telah menjadi pemasok hormon penting seperti insulin dan somatotropin. Sebelumnya, insulin didapat dari sel pankreas hewan, sehingga biayanya sangat mahal. Untuk mendapatkan 100 g insulin kristal, diperlukan 800-1000 kg pankreas, dan satu kelenjar sapi memiliki berat 200-250 gram. Hal ini membuat insulin menjadi mahal dan sulit untuk diakses oleh banyak penderita diabetes. Pada tahun 1978, para peneliti di Genentech membuat insulin pertama dalam strain Escherichia coli yang direkayasa secara khusus. Insulin terdiri dari dua rantai polipeptida A dan B, dengan panjang 20 dan 30 asam amino. Ketika mereka dihubungkan oleh ikatan disulfida, insulin rantai ganda asli terbentuk. Telah terbukti bahwa itu tidak mengandung protein E. coli, endotoksin dan kotoran lainnya, tidak memiliki efek samping seperti insulin hewan, dan tidak berbeda dari itu dalam aktivitas biologis. Selanjutnya, proinsulin disintesis dalam sel E. coli, yang salinan DNA disintesis pada template RNA menggunakan reverse transcriptase. Setelah pemurnian proinsulin yang diperoleh, itu dipecah dan insulin asli diperoleh, sedangkan tahapan ekstraksi dan isolasi hormon diminimalkan. Dari 1000 liter cairan biakan, hingga 200 gram hormon dapat diperoleh, yang setara dengan jumlah insulin yang dikeluarkan dari 1600 kg pankreas babi atau sapi.

Somatotropin adalah hormon pertumbuhan manusia yang disekresikan oleh kelenjar pituitari. Kurangnya hormon ini menyebabkan dwarfisme hipofisis. Jika somatotropin diberikan dalam dosis 10 mg per kg berat badan tiga kali seminggu, maka dalam setahun seorang anak yang menderita kekurangannya dapat tumbuh 6 cm produk farmasi akhir. Dengan demikian, jumlah hormon yang tersedia terbatas, apalagi hormon yang dihasilkan dengan metode ini bersifat heterogen dan dapat mengandung virus yang berkembang lambat. Perusahaan "Genentec" pada tahun 1980 mengembangkan teknologi untuk produksi somatotropin menggunakan bakteri, yang tidak memiliki kekurangan ini. Pada tahun 1982, hormon pertumbuhan manusia diperoleh dalam kultur E. coli dan sel hewan di Institut Pasteur di Prancis, dan sejak 1984 produksi industri insulin telah dimulai di Uni Soviet. Dalam produksi interferon, baik E. coli, S. cerevisae (ragi), dan kultur fibroblas atau leukosit yang ditransformasi digunakan. Vaksin yang aman dan murah juga diperoleh dengan cara yang serupa.

Produksi probe DNA yang sangat spesifik didasarkan pada teknologi DNA rekombinan, yang dengannya mereka mempelajari ekspresi gen dalam jaringan, lokalisasi gen dalam kromosom, dan mengidentifikasi gen yang memiliki fungsi terkait (misalnya, pada manusia dan ayam). ). Probe DNA juga digunakan dalam diagnosis berbagai penyakit.
Teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan pendekatan gen protein yang tidak konvensional yang disebut genetika terbalik. Dengan pendekatan ini, protein diisolasi dari sel, gen protein ini dikloning, dan dimodifikasi, menciptakan gen mutan yang mengkode bentuk protein yang diubah. Gen yang dihasilkan dimasukkan ke dalam sel. Jika diekspresikan, sel yang membawanya dan turunannya akan mensintesis protein yang diubah. Dengan cara ini, gen yang rusak dapat diperbaiki dan penyakit keturunan diobati.

Jika DNA hibrida dimasukkan ke dalam telur yang dibuahi, organisme transgenik dapat diperoleh yang mengekspresikan gen mutan dan meneruskannya ke keturunannya. Transformasi genetik hewan memungkinkan untuk menetapkan peran gen individu dan produk proteinnya baik dalam pengaturan aktivitas gen lain maupun dalam berbagai proses patologis. Dengan bantuan rekayasa genetika, garis hewan yang tahan terhadap penyakit virus, serta keturunan hewan dengan sifat yang berguna bagi manusia, telah dibuat. Misalnya, mikroinjeksi DNA rekombinan yang mengandung gen somatotropin sapi ke dalam zigot kelinci memungkinkan untuk memperoleh hewan transgenik dengan hiperproduksi hormon ini. Hewan yang dihasilkan telah diucapkan akromegali.
Sekarang bahkan sulit untuk memprediksi semua peluang yang akan terwujud dalam beberapa dekade mendatang.

Rekayasa genetika adalah bidang bioteknologi yang mencakup tindakan penataan ulang genotipe. Bahkan saat ini, rekayasa genetika memungkinkan untuk menghidupkan dan mematikan gen individu, sehingga mengendalikan aktivitas organisme, dan juga untuk mentransfer instruksi genetik dari satu organisme ke organisme lain, termasuk organisme dari spesies lain. Ketika ahli genetika belajar lebih banyak tentang kerja gen dan protein, menjadi semakin nyata untuk dapat secara sewenang-wenang memprogram genotipe (terutama manusia), dengan mudah mencapai hasil apa pun: seperti ketahanan terhadap radiasi, kemampuan untuk hidup di bawah air , kemampuan untuk regenerasi organ yang rusak bahkan keabadian.

YouTube ensiklopedis

• 1 / 5

  Rekayasa genetika berfungsi untuk mendapatkan kualitas yang diinginkan dari organisme yang dimodifikasi atau dimodifikasi secara genetik. Tidak seperti pemuliaan tradisional, di mana genotipe hanya diubah secara tidak langsung, rekayasa genetika memungkinkan Anda untuk secara langsung mengganggu peralatan genetik, menggunakan teknik kloning molekuler. Contoh penerapan rekayasa genetika adalah produksi varietas tanaman rekayasa genetika baru, produksi insulin manusia menggunakan bakteri rekayasa genetika, produksi eritropoietin dalam kultur sel, atau keturunan baru tikus percobaan untuk penelitian ilmiah.

  Dasar dari industri mikrobiologis biosintetik adalah sel bakteri. Sel-sel yang diperlukan untuk produksi industri dipilih sesuai dengan kriteria tertentu, yang paling penting adalah kemampuan untuk memproduksi, mensintesis, dalam jumlah maksimum yang mungkin, senyawa tertentu - asam amino atau antibiotik, hormon steroid atau asam organik . Kadang-kadang diperlukan mikroorganisme yang dapat, misalnya, menggunakan minyak atau air limbah sebagai “makanan” dan mengolahnya menjadi biomassa atau bahkan protein yang cukup cocok untuk bahan tambahan pakan. Kadang-kadang diperlukan organisme yang dapat tumbuh pada suhu tinggi atau dengan adanya zat yang tidak diragukan lagi mematikan bagi jenis mikroorganisme lainnya.

  Tugas mendapatkan galur industri semacam itu sangat penting; untuk modifikasi dan seleksinya, banyak metode pengaruh aktif pada sel telah dikembangkan - mulai dari pengobatan dengan racun kuat hingga iradiasi radioaktif. Tujuan dari teknik ini adalah sama - untuk mencapai perubahan pada alat genetik sel yang diturunkan. Hasilnya adalah produksi banyak mikroba mutan, dari ratusan dan ribuan di antaranya para ilmuwan kemudian mencoba memilih yang paling cocok untuk tujuan tertentu. Penciptaan teknik untuk mutagenesis kimia atau radiasi merupakan pencapaian luar biasa dalam biologi dan banyak digunakan dalam bioteknologi modern.

  Tetapi kemampuannya dibatasi oleh sifat mikroorganisme itu sendiri. Mereka tidak mampu mensintesis sejumlah zat berharga yang terakumulasi dalam tanaman, terutama obat dan minyak esensial. Mereka tidak dapat mensintesis zat yang sangat penting bagi kehidupan hewan dan manusia, sejumlah enzim, hormon peptida, protein kekebalan, interferon, dan banyak lagi senyawa yang tersusun sederhana yang disintesis pada hewan dan manusia. Tentu saja, kemungkinan mikroorganisme masih jauh dari habis. Dari kelimpahan mikroorganisme, hanya sebagian kecil yang telah digunakan oleh ilmu pengetahuan, dan terutama oleh industri. Untuk tujuan seleksi mikroorganisme, yang sangat menarik adalah, misalnya, bakteri anaerob yang dapat hidup tanpa oksigen, fototrof yang menggunakan energi cahaya seperti tanaman, kemoautotrof, bakteri termofilik yang dapat hidup pada suhu, seperti yang baru-baru ini ditemukan. , sekitar 110 ° C, dll.

  Namun keterbatasan "bahan alami" sudah jelas. Mereka mencoba dan mencoba untuk menghindari pembatasan dengan bantuan kultur sel dan jaringan tumbuhan dan hewan. Ini adalah cara yang sangat penting dan menjanjikan, yang juga diterapkan dalam bioteknologi. Selama beberapa dekade terakhir, para ilmuwan telah mengembangkan metode di mana sel-sel tunggal dari jaringan tumbuhan atau hewan dapat dibuat untuk tumbuh dan berkembang biak secara terpisah dari tubuh, seperti sel bakteri. Ini merupakan pencapaian penting - kultur sel yang dihasilkan digunakan untuk eksperimen dan untuk produksi industri zat tertentu yang tidak dapat diperoleh dengan menggunakan kultur bakteri.

  Arah lain penelitian adalah penghapusan dari DNA gen yang tidak perlu untuk mengkodekan protein dan fungsi organisme dan penciptaan organisme buatan berdasarkan DNA tersebut dengan "set terpotong" gen. Ini memungkinkan untuk secara tajam meningkatkan resistensi organisme yang dimodifikasi terhadap virus.

  Sejarah perkembangan dan tingkat teknologi yang dicapai

  Pada paruh kedua abad ke-20, beberapa penemuan dan penemuan penting dibuat yang mendasarinya rekayasa genetika. Bertahun-tahun upaya untuk "membaca" informasi biologis yang "tercatat" dalam gen telah berhasil diselesaikan. Pekerjaan ini dimulai oleh ilmuwan Inggris Frederick Senger dan ilmuwan Amerika Walter Gilbert (Hadiah Nobel dalam Kimia pada tahun 1980). Seperti yang Anda ketahui, gen mengandung informasi-instruksi untuk sintesis molekul RNA dan protein dalam tubuh, termasuk enzim. Untuk memaksa sel mensintesis zat baru yang tidak biasa untuknya, set enzim yang sesuai harus disintesis di dalamnya. Dan untuk ini perlu dengan sengaja mengubah gen di dalamnya, atau memasukkan gen baru yang sebelumnya tidak ada ke dalamnya. Perubahan gen pada sel hidup adalah mutasi. Mereka terjadi di bawah pengaruh, misalnya, mutagen - racun kimia atau radiasi. Tetapi perubahan seperti itu tidak dapat dikendalikan atau diarahkan. Oleh karena itu, para ilmuwan telah memusatkan upaya mereka untuk mencoba mengembangkan metode untuk memasukkan gen baru yang sangat spesifik ke dalam sel yang dibutuhkan seseorang.

  Tahapan utama pemecahan masalah rekayasa genetika adalah sebagai berikut:

  1. Mendapatkan gen yang diisolasi.
  2. Pengenalan gen ke vektor untuk transfer ke organisme.
  3. Transfer vektor dengan gen ke organisme yang dimodifikasi.
  4. Transformasi sel tubuh.
  5. Seleksi organisme hasil rekayasa genetika ( transgenik) dan menghilangkan yang tidak berhasil dimodifikasi.

  Proses sintesis gen saat ini berkembang sangat baik dan bahkan sebagian besar otomatis. Ada perangkat khusus yang dilengkapi dengan komputer, dalam memori yang menyimpan program untuk sintesis berbagai urutan nukleotida. Peralatan tersebut mensintesis segmen DNA hingga 100-120 basa nitrogen (oligonukleotida). Sebuah teknik telah tersebar luas yang memungkinkan penggunaan reaksi berantai polimerase untuk sintesis DNA, termasuk DNA mutan. Enzim termostabil, DNA polimerase, digunakan di dalamnya untuk sintesis templat DNA, yang digunakan sebagai benih untuk potongan asam nukleat yang disintesis secara artifisial - oligonukleotida. Enzim reverse transcriptase memungkinkan untuk mensintesis DNA menggunakan primer tersebut (primer) pada matriks RNA yang diisolasi dari sel. DNA yang disintesis dengan cara ini disebut komplementer (RNA) atau cDNA. Gen terisolasi, "murni secara kimiawi" juga dapat diperoleh dari perpustakaan fag. Ini adalah nama persiapan bakteriofag, di mana fragmen acak genom dari genom atau cDNA dimasukkan, direproduksi oleh fag bersama dengan semua DNA-nya.

  Teknik memasukkan gen ke dalam bakteri dikembangkan setelah Frederick Griffith menemukan fenomena transformasi bakteri. Fenomena ini didasarkan pada proses seksual primitif, yang pada bakteri disertai dengan pertukaran fragmen kecil DNA non-kromosom, plasmid. Teknologi plasmid membentuk dasar untuk pengenalan gen buatan ke dalam sel bakteri.

  Kesulitan yang signifikan dikaitkan dengan pengenalan gen yang sudah jadi ke dalam peralatan herediter sel tumbuhan dan hewan. Namun, di alam, ada kasus-kasus ketika DNA asing (virus atau bakteriofag) termasuk dalam peralatan genetik sel dan, dengan bantuan mekanisme metabolismenya, mulai mensintesis protein "sendiri". Para ilmuwan mempelajari fitur pengenalan DNA asing dan menggunakannya sebagai prinsip untuk memasukkan materi genetik ke dalam sel. Proses ini disebut transfeksi.

  Jika organisme uniseluler atau kultur sel multiseluler dimodifikasi, maka kloning dimulai pada tahap ini, yaitu pemilihan organisme dan keturunannya (klon) yang telah mengalami modifikasi. Ketika tugasnya adalah untuk mendapatkan organisme multiseluler, maka sel-sel dengan genotipe yang berubah digunakan untuk perbanyakan vegetatif tanaman atau disuntikkan ke dalam blastokista dari ibu pengganti ketika datang ke hewan. Akibatnya, anak-anak dengan genotipe yang berubah atau tidak berubah lahir, di antaranya hanya yang menunjukkan perubahan yang diharapkan yang dipilih dan disilangkan satu sama lain.

  Aplikasi dalam penelitian ilmiah

  Meskipun dalam skala kecil, rekayasa genetika telah digunakan untuk memberikan kesempatan pada wanita dengan beberapa jenis ketidaksuburan untuk hamil. Untuk melakukan ini, gunakan telur wanita yang sehat. Akibatnya, anak mewarisi genotipe dari satu ayah dan dua ibu.

  Namun, kemungkinan membuat perubahan yang lebih signifikan pada genom manusia menghadapi sejumlah masalah etika yang serius. Pada tahun 2016, sekelompok ilmuwan di Amerika Serikat menerima persetujuan untuk uji klinis metode pengobatan kanker menggunakan sel kekebalan pasien sendiri, yang dimodifikasi gennya menggunakan teknologi CRISPR / Cas9.

  Rekayasa sel

  Rekayasa seluler didasarkan pada budidaya sel dan jaringan tumbuhan dan hewan yang mampu menghasilkan zat yang diperlukan manusia di luar tubuh. Metode ini digunakan untuk perbanyakan klonal (aseksual) dari bentuk tanaman yang berharga; untuk mendapatkan sel hibrida yang menggabungkan sifat-sifat, misalnya, limfosit darah dan sel tumor, yang memungkinkan Anda memperoleh antibodi dengan cepat.

  Rekayasa genetika di Rusia

  Perlu dicatat bahwa setelah pengenalan pendaftaran negara transgenik, aktivitas beberapa organisasi publik dan deputi individu Duma Negara, yang berusaha mencegah pengenalan bioteknologi inovatif ke dalam pertanian Rusia, telah meningkat secara nyata. Lebih dari 350 ilmuwan Rusia menandatangani surat terbuka dari Perhimpunan Ilmuwan untuk Mendukung Pengembangan Rekayasa Genetika di Federasi Rusia. Surat terbuka tersebut mencatat bahwa larangan transgenik di Rusia tidak hanya akan merugikan persaingan yang sehat di pasar pertanian, tetapi akan menyebabkan kelambatan yang signifikan dalam teknologi produksi pangan, meningkatkan ketergantungan pada impor pangan, dan merusak prestise Rusia sebagai negara di yang kursus untuk pengembangan inovatif telah diumumkan secara resmi [ pentingnya fakta? ] .

  Lihat juga

  Catatan

  1. Alexander Panchin Mengalahkan Tuhan // Mekanika Populer . - 2017. - No. 3. - S. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo genom pengeditan menggunakan sistem efisiensi tinggi TALEN(Bahasa inggris) . alam. Diakses pada 10 Januari 2017.
  3. Elemen - berita sains: monyet sembuh dari buta warna dengan terapi gen (tak terbatas) (18 September 2009). Diakses pada 10 Januari 2017.