Бактериофаг Т4 относится к крупным фагам Т-четного ряда. ДНК фага Т4 линейная, двухцепочечная, имеет молекулярную массу 120*10 6 , длину 165 тыс. пар оснований., которой достаточно для кодирования примерно 200 генов . Было определено положение на генетической карте почти 100 генов фага (рис. 1) . Для молекул ДНК фага характерна концевая избыточность (длина этих участков составляет несколько процентов от всей длины ДНК, т.е. несколько тысяч пар оснований). Молекулы ДНК фага одинаковы по величине и генетическому составу, но гетерогенны по нуклеотидной последовательности (в результате циклических перестановок генов).
Т4- очень крупный фаг, который имеет достаточно полный и независимый репликативный аппарат. В течение одной минуты после адсорбции фага Т4 синтез молекул хозяина почти полностью прекращается, начинается транскрипция некоторых фаговых генов и через 4 минуты уже идет репликация фаговой ДНК. Инфекция фагом Т4- прекрасная модель для изучения контроля репликации и экспрессии генов .
Репликация ДНК фага Т4 начинается в точке, расположенной между генами 42 и 43 и идет в двух направлениях. Позже возникает много точек репликации, в результате чего образуется до 60 репликативных вилок.
Одно из преимуществ использования фага Т4 как модельной системы для изучения репликации ДНК заключается в том, что все белки, необходимые для элонгации цепи, кодируются фагом. Идентифицированно 11 белков, участвующих в формировании и передвижении репликативной вилки, но только 5 из них необходимы для создания коровой системы . Это продукты генов 43 (Т4 ДНК полимераза), 32 (белок, связывающий одноцепочечную ДНК), 44, 62, 45 (вспомогательные белки). Взаимодействие этих белков определяет точность репликации .
В состав ДНК фага Т4 (и других Т-четных фагов) вместо обычного цитозина. входит необычное основание- оксиметилцитозин (ОМЦ). Большинство остатков ОМЦ глюкозилировано . ДНК с такими модифицированными основаниями не разрезают почти все известные рестриктазы . Ферменты рестрикции E.coli узнают неглюкозилированные остатки ОМЦ в определенных последовательностях, и разрушают такую ДНК. Т-четные фаги не только защищаются от хозяйских рестриктаз, но и кодируют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, которые не действуюют на фаговую ДНК.
Гликозилирование остатков ОМЦ в ДНК фага Т4 генетически детерминировано, оно происходит путем переноса гликозильных остатков на ДНК в течение нескольких минут после полимеризации с помощью специфических ферментов - гликозилтрансфераз. Такой способ борьбы мог возникнуть только у такого крупного фага, как Т4 .
Бактериофаг Т4 - гораздо более сложный вирус, чем ВТМ. Его двухспиральная ДНК содержит примерно 165 генов по сравнению
Рис. 30.7. Участок РНК ВТМ, обеспечивающий инициирование сборки вирусной частицы ВТМ.
Рис. 30.8. Электронная микрофотография частично реконструированных частиц ВТМ. Видны два хвоста РНК, отходящие от каждого растущего вириона.
Рис. 30.9. Схема сборки ВТМ. А - область инициации в РНК образует петлю и проходит в центральное отверстие белкового диска. диск переходит в спиральную форму «запорной шайбы». В - к тому концу РНК, где расположена петля, присоединяются новые диски. одна из концов РНК все время протаскивается через центральное отверстие и взаимодействует с новыми дисками. схематическое изображение молекулы РНК в частично собранном вирусе. Направление движения РНК, обозначено стрелкой. (Butler P. J.G., Klug A., Sci.Amer., 1978.)
с 6 генами ВТМ. Однако структура, размножение и процесс сборки фага Т4 изучены довольно хорошо, так как он подвергался интенсивному генетическому и биохимическому анализу. Вирион Т4 состоит из головки. отростка и шести нитей (фибрилл) отростка (рис. 30.10). Его молекула ДНК плотно упакована внутри икосаэдрической белковой оболочки и образует головку вируса. Отросток состоит из двух соосных трубок, соединенных с головкой короткой шейкой. В отростке сократительный чехол окружает центральный стержень, через который ДНК вводится в бактерию-хозяина. Отросток несет на конце базальную пластинку с шестью короткими зубцами, от которой отходит шесть длинных тонких нитей.
Концы нитей отростка связываются с определенными участками на клетке E. coli. В результате АТР-зависимого сокращения чехол подтягивает головку фага к базальной пластинке и нитям отростка, и в результате центральный стержень проникает через клеточную стенку, но не через мембрану клетки. Затем обнаженная фаговая ДНК проникает через клеточную мембрану. По истечении несколько минут все реакции синтеза клеточных ДНК, РНК и белка останавливаются и начинается синтез вирусных макромолекул. Другими словами, заразивший клетку вирус овладевает синтетическими механизмами бактериальной клетки и замещает ее гены своими.
В ДНК фага Т4 имеется три группы генов, которые транскрибируются на различных стадиях заражения: предранние, ранние и
Рис. 30.10. Электронная микрофотография фага Т4. (Williams R. С., Fisher Н. W., An electron micrographic atlas of viruses, С. С. Thomas, Springfield,
1974. Печатается с любезного разрешения издателя.)
Таблица 30.2. (см. скан) Гены фага Т4
поздние. Предранние и ранние гены транскрибируются и транслируются до того, как синтезируется ДНК фага Т4. Некоторые белки, кодируемые этими генами, обеспечивают выключение синтеза клеточных макромолекул. Вскоре после заражения ДНК клетки-хозяина распадается под действием дезоксирибонуклеазы, кодируемой одним из ранних генов фага Т4. ДНК самого фага Т4 не гидролизуется под действием этого фермента, поскольку в ней нет кластеров (сгруппированных остатков) цитозина. В ДНК фага Т4 вместо цитозина находится гидроксиметилцитозин (ГМЦ). К тому же остатки ГМЦ в ДНК Т4 глюкозилированы.
Эти производные цитозина включаются в ДНК бактериофага Т4 благодаря действию нескольких фагоспепифических ферментов, синтезирующихся на ранней стадии заражения. Один из них гидролизует dCTP с образованием dCMP, чтобы воспрепятствовать включению dCTP в ДНК фага Т4. Затем второй фермент вводит в dCMP гидроксиметильную группу, и образуется
Гидроксиметилцитидилат. Третий фермент превращает -гидроксиметилцитидилат в трифосфат, который служит субстратом для ДНК-полимераз. Наконец, четвертый фермент гликозилирует некоторые из содержащихся в ДНК остатки гидрокси-метилцитозина.
Синтез поздних белков сопряжен с репликацией ДНК фага Т4. На этом этапе образуются белки капсида и лизоцим. Когда сборка вирионов потомства завершена, лизоцим гидролизует клеточную стенку бактерии и разрушает ее. Примерно через 20 мин после заражения возникает около двухсот новых вирусных частиц.
