Комбинаторный синтез можно проводить не только в растворе (жидкофазный синтез), но и на поверхности твёрдой химически инертной фазы. В этом случае первое исходное вещество химически „пришивают“ к функциональным группам на поверхности полимерного носителя (чаще всего используют сложноэфирную или амидную связь) и обрабатывают раствором второго исходного вещества, которое берётся в значительном избытке, чтобы реакция прошла до конца. В такой форме реакции есть определённое удобство, поскольку облегчается техника выделения продуктов: полимер (обычно в виде гранул) просто отфильтровывают, тщательно промывают от остатков второго реагента и химически отщепляют от него целевое соединение.

В органической химии нет ни одной реакции, обеспечивающей на практике количественные выходы целевых продуктов в любом случае. Единственное исключение составляет, по-видимому, полное сжигание органических веществ в кислороде при высокой температуре до СО 2 и Н 2 О. Поэтому очистка целевого продукта всегда является непременной, а часто самой сложной и трудоемкой задачей. Особенно сложной задачей является выделение продуктов пептидного синтеза, например, разделение сложной смеси полипептидов. Поэтому именно в пептидном синтезе наибольшее распространение получил метод синтеза на твердой полимерной подложке, разработанный в начале 60-х годов ХХ века Р.Б.Мерифилдом.

Полимерный носитель в методе Меррифилда – это гранулированный сшитый полистирол, содержащий хлорметильные группы в бензольных ядрах, которые являются линкерами, связывающими подложку с первым аминокислотным остатком полипептида. Эти группы превращают полимер в функциональный аналог бензилхлорида и сообщают ему способность легко образовывать сложноэфирные связи при реакции с карбоксилат-анионами. Конденсация такой смолы с N-защищенными аминокислотами ведет к образованию соответствующих бензиловых эфиров. Удаление N-защиты из дает С-защищенное производное первой аминокислоты, ковалентно связанное с полимером. Аминоацилирование освобожденной аминогруппы N-защищенным производным второй аминокислоты с последующим удалением N-защиты приводит к аналогичному производному дипептида также привязанному к полимеру:

Такой двухстадийный цикл (удаление защиты - аминоацилирование) может быть, в принципе, повторен столько раз, сколько требуется для наращивания полипептидной цепи заданной длины.

Дальнейшее развитие идей Мерифильда было направлено, прежде всего, на поиск и создание новых полимерных материалов для подложек, разработку методов разделения продуктов и создания автоматизированных установок для всего цикла полипептидного синтеза

Эффективность метода Мерифилда была продемонстрирована успешным синтезом целого ряда природных полипептидов, в частности инсулина. Особенно наглядно его преимущества были продемонстрированы на примере синтеза фермента рибонуклеазы. Так, например, ценой значительных усилий, в течение нескольких лет, Хиршмен с 22 сотрудниками выполнили синтез фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка) с помощью традиционных жидкофазных методов. Почти одновременно тот же белок был получен путем автоматизированного твердофазного синтеза. Во втором случае синтез, включающий всего 11 931 различных операций, в том числе и 369 химических реакций, был выполнен двумя участниками (Гатте и Меррифильдом) всего за несколько месяцев.

Идеи Меррифильда послужили основой для создания различных методов комбинаторного синтеза библиотек полипептидов различного строения.

Так в 1982 году была предложена оригинальная стратегия многостадийного параллельного синтеза пептидов на твёрдой фазе известная как „сплит-метод“ (split - расщепление, разделение) или метод “смешай и раздели” (рис. 3). Суть ее состоит в следующем. Допустим, что из трёх аминокислот (А, В и С) нужно получить все возможные комбинации трипептидов. Для этого гранулы твёрдого полимерного носителя (Р) разделяют на три равные порции и обрабатывают их раствором одной из аминокислот. При этом все аминокислоты химически связываются с поверхностью полимера одной из своих функциональных групп. Полученные полимеры трёх сортов тщательно смешивают, и смесь опять разделяют на три части. Затем каждую часть, содержащую все три аминокислоты в одинаковых количествах, вновь обрабатывают одной из тех же трёх аминокислот и получают девять дипептидов (три смеси по три продукта). Ещё одно смешение, разделение на три равные части и обработка аминокислотами дают искомые 27 трипептидов (три смеси по девять продуктов) всего через девять стадий, тогда как получение их по отдельности потребовало бы синтеза из 27×3 = 81 стадий.

«Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013 ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ Г.С. ЧАИЛЯН Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА...»

Экспериментальные и теоретические статьи

Experimental and theoretical articles

Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА,

ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

Г.С. ЧАИЛЯН

Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА

[email protected].

В целях продолжения исследований акад. Галояна, нами был проведен ряд экспериментов по выделению, очистке и определению биологической направленности нововыделенных соединений пептидной природы из предсердий и ушковых частей сердца свиньи. Для проведения биотестов требовалось получить препаративные количества исследуемых образцов. Для этого мы воспользовались методикой твердофазного синтеза пептидов с ее дальнейшей модификацией. Чистота и идентичность синтезированных препаратов проверялись методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрального анализа.

Твердофазный синтез – fmoc-аминокислоты – ВЭЖХ – фенилизотиоцианат – масс-спектральный анализ:

fmoc- – – For further studies established by Galoyan, a series of experiments on the isolation, purification and determination of biological direction of peptides isolated from pigs atria were carried out. For fulfilling the biotests the preparative amount of samples was required. A modified method of solid phase peptide synthesis was used. The synthesized peptide purity and identity were defined by HPLC and mass-spectral analysis.

Solid phase synthesis – high performance liquid chromatography – mass spectrometry – fmoc-aminoacids – cardiopeptides – atria В течение многих лет в Институте биохимии НАН РА в отделе биохимии нейрогормонов акад. Галояном с сотрудниками изучались пути регуляции и механизмы действия гипоталамических нейрогормонов на различные процессы в организме .

Подтверждение идеи о взаимосвязанном, взаимообусловленном, цельном функционировании такой системы, как гипоталамус – гипофиз – надпочечники, явилось переломным моментом в эндокринологии. Пополнение же этой концепТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ туальной триады, выдвинутой Галояном относительно взаимодействия гипоталамус - гипофиз

– сердце, является огромным научным достижением. Впоследствии была обнаружена новая ткань-мишень-сердце, показана способность этого органа управлять функционированием специфических пептидов, а также существование механизма обратной связи между гипоталамусом и сердцем посредством этих пептидов.

Обнаружение кардиоактивных соединений – нейрогормона К, С, G и ряд других в гипоталамусе различных животных послужило началом работ не только по изучению молекулярных механизмов действия этих нейрогормонов, но и по поиску подобных соединений в сердце . Основанием для всестороннего исследования биохимических и физико-химических свойств кардиоактивных начал послужили данные о наличии 2-х кардиоактивных соединений в сердечной мышце . Было установлено участие нейрогормона “С” в регуляции гликолитических процессов и уровня циклических нуклеотидов посредством ингибирования ФДЭ цАМР, цАМФ- зависимой протеинкиназы и т.д. Было показано, что это соединение является низкомолекулярным и относится к гликопептидам .

Нами в лаборатории аналитической хроматографии и пептидного синтеза была проведена работа по выделению и очистке соединений пептидной природы из предсердий и ушковых зон сердца свиньи . При разделении пептидных фракций препаративной ВЭЖХ, нами были выделены и очищены до гомогенного состояния 20 соединений пептидной природы . Для определения биологической направленности все препараты были тестированы на изменения компонентов ЭКГ у крыс . Результаты экспериментов показали, что 7 соединений имеют разносторонние факторы влияния на определенные компоненты ЭКГ.

Пептид №7 показал наибольшую активность на изменение амплитуды компонента R, длительности комплекса QRS, амплитуды S и других параметров.

Для изучения биологических механизмов действия данного препарата стало необходимо наличие большого количества исследуемого образца. Ввиду того, что процесс выделения и очистки биопрепаратов является крайне неэффективным, трудоемким, времязатратным и не может обеспечивать хорошей воспроизводимости, стало крайне актуальным проведение химического синтеза данного препарата. Анализируя мировую литературу в области химического синтеза пептидов, мы пришли к выводу, что наиболее оптимальным для нас является методика твердофазного синтеза с использованием fmoc-защищенных аминокислот. Открытый в 1984 году твердофазный синтез пептидов (Solid phase peptide synthesis) имеет много преимуществ по сравнению с обычным синтезом с точки зрения эффективности, а также удобной обработки и очистки .

С использованием несколько различных методик: гидролиза данного препарата, модифицирования аминокислот фенилизотиоцианатом, нами был получен аминокислотный состав пептида №7. Используя данные масс-спектрального и ЯМР-анализов, эдмоновской деградации, нам удалось получить не только аминокислотный состав, но также аминокислотную последовательность пептида №7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Эффективный процесс твердофазного синтеза во многом зависит от правильного выбора различных условий его проведения, таких как выбор смолы, растворителя и кинетики проведения синтеза . Эти переменные влияют на степень набухания смолы и связи ее с аминокислотами, количеству связывающих сайтов, что в конечном итоге влияет на синтез пептида в целом. Мы приспособи-ли процесс твердофазного синтеза по отношению к нашим исследуемым пептидам с учетом особенностей их аминокислотной последовательности.

Г.С. ЧАИЛЯН Материал и методика. Все использованные реактивы, растворители, смолы фирмы “Advanced Chem Techcompany”. Мы использовали fmoc-группы для защиты N-концов аминокислот в процессе синтеза и диметилформамид (DMF) как растворитель в процессе всего синтеза. В качестве подложки мы использовали кислотолабильную 2-хлортритильную смолу. Снятие защитных fmoc-групп проводилось с помощью раствора пиперидина в DMF.

Очень важным в процессе синтеза является посадка первой аминокислоты на смолу. Два грамма 2Cl-Trt-й смолы насыпали в шприц объемом 10 мл. Набирали DMF в шприц, давали набухнуть смоле в течение 15 мин. После этого DMF вымывался. Затем в шприц набирался раствор первой аминокислоты (fmoc-Pro) и активатор реакции (DIPEA) в соотношении 1СМОЛА/1,2FMOC-PRO/4DIPEA. Реакция посадки первой аминокислоты шла 3 ч. Очень важным условием проведения синтеза является отсутствие свободных линкеров после посадки первой аминокислоты, поэтому смолу после связывания с первой аминокислотой обрабатывали смесью метилена, DIPEA (диизопроилэтиламин) и DMF в соотношении 80DMF/15MEOH/5DIPEA для блокирования возможно оставшихся свободных концов. После этого промывали смолу DMF 5 раз по 5 мин. Затем проводили деблокирование аминокислот 30%-ным раствором пипередина в DMF 8 раз по 5 мин. После этого смолу промывали DMF 5 раз по 5 мин. Этот цикл повторялся в течение всего синтеза пептида. После каждого шага присоединения и деблокирования аминокислот контроль хода реакции проверялся Кайзер тестом, что представляет собой реакцию нингидрина со свободной аминогруппой с образованием характерного темно-синего цвета. Благодаря этому тесту, стал возможным пошаговый контроль реакций посадки и деблокирования аминокислот.

Очистка и контроль синтезированного пептида № 7 были проведены на 2-х компонентной препаративной системе ВЭЖХ фирмы Waters (USA). Для ввода образца использовался инжектор Rheodyne с объемом петли 500 мкл. Детектирование проводилось в диапазоне 190-360 нм. Мы использовали колонку “Symmetry Si-100 C18” (4,6х250 mm) для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Скорость потока была 50 мл/мин. Использовалась градиентная система элюента H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1). Время анализа 15 мин. Рехроматографию проводили на аналитической системе Knauer HPLC. Использовалась колонка XbridgeC18 (2.6x150 mm). Детектирование проводили при 214 нм.

Для подтверждения полученных данных синтезированный препарат был подвергнут массспектральному анализу на CSU "Analitycal spectrometry”.

Результаты и обсуждение. Данные, полученные на хроматограмме, позволяют утверждать, что чистота синтезированного пептида №7 после очистки составляет более 99,6% (pис.1).

–  –  –

Нами был проведен сравнительный хроматографический анализ нативного пептида №7 на колонке X-bridgeC18 в тех же условиях, что и его синтезированный аналог. Результаты сравнения представлены (pис. 2).

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

–  –  –

Рис. 4. Спектрограммы синтезированного (А) и нативного (В) препаратов.

Г.С. ЧАИЛЯН Как видно из сравнения хроматограмм, синтезированный аналог и нативный пептид № 7 одинаковы по массе и времени выхода, что говорит об идентичности их структур и аминокислотной последовательности. Таким образом, используя метод твердофазного синтеза пептидов и учитывая особенности строения исследуемого пептида, нам удалось получить гомогенный и идентичный нативному пептид, состоящий из 9 аминокислот. В дальнейшем, имея достаточное количество препарата, мы планируем провести ряд биотестов по выявлению не только путей регуляции сердечной деятельности этим пептидом, но также механизмов действия на другие органы и системы.

ЛИТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапионян Р.М., Галоян А.А. Обнаружение и идентификация в сердце быка новых 1.

кардиоактивных белков. Вопр. мед. химии, 37, 2, с. 56-58, 1991.

Срапионян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Выделение и характеристика 2.

кардиоактивного триптического фрагмента белка-носителя нейрогормона “С”. Нейрохимия, 2, 3, с. 263-271, 1983.

Срапионян, Р.М. Мисирян, С.С. Разделение низкомолекулярных коронароактивных соединений 3.

сердечной мышцы сочетанием методов гелевой фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле. Биолог. журн. Армении, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапионян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Распределение кардиоактивных белковых комплексов в сердце различных животных. Биолог. журн. Армении, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biochemistry of Novel Cardioactive Hormones and Immunomodulators of the Functional System Neurosecretory Hypothalamus, Endocrine Heart. Nauka Publ. p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. The purification of coronarodilatory proteins isolated from the hypothalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J.,Smith M. March’s advanced organic chemistry. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133, 2007.

–  –  –

Похожие работы:

« СООБЩЕСТВ ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА» Москва 1979 УДК 581.55:56.017 Плот н и к о·в В. В. Эволюция структуры растительных сообществ. М.: Наука, с. 1979, 276 На современной мет...»

«Известия Музейного Фонда им. А.А.Браунера №2 Том I 2004 Известия Музейного Фонда им. А. А. Браунера Том I № 2 2004 Научный журнал Основан в декабре 2003 г. Выходит 4 раза в год Свидетельство о государственной регистрации ОД № 913 от 13.12.2003 г. Учредитель и изда...»

Министерство образования и науки Российской Федерации

ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого президента России Б. Н. Ельцина»

Кафедра технологии органического синтеза

Реферат на тему: « Принципы и методы твердофазного синтеза. Синтез пептидов »

Выполнила студент гр. Х-300803

Шайхутдинова А.И.

Проверила Берсенева В.С.

Екатеринбург 2013

1. Введение…………………………………………………………………………3

2. Что такое пептиды?..........................................................................................4

2.1. Строение пептидов……………………………………………………….5

2.2. Синтез пептидов………………………………………………………….7

3. Твердофазный синтез пептидов……………………………………………10

3.1. Метод Мерринфилда……………………………………………………10

3.2. Твердая подложка……………………………………………………….14

3.3. Выбор подложки………………………………………………………...14

3.4. Линкеры………………………………………………………………….16

4. Первый синтез природного гормона – окситоцина……………………….22

5. Синтез инсулина в клетке…………………………………………………..30

6. Заключение…………………………………………………………………..34

7. Литература…………………………………………………………………...35

Введение

В органической химии нет ни одной реакции, обеспечивающей на практике количественные выходы целевых продуктов в любом случае. Единственное исключение составляет, по-видимому, полное сжигание органических веществ в кислороде при высокой температуре до СО 2 и Н 2 О. Поэтому очистка целевого продукта является сложной и трудоемкой задачей. Например, 100%-ная очистка продуктов пептидного синтеза является трудноразрешимой проблемой. Действительно, первый полный синтез пептида, гормона окситоцина (1953 г), содержащего всего 8 аминокислотных остатков, рассматривался как выдающееся достижение, принесшее его автору, В. дю Виньо, Нобелевскую премию 1955 г. Однако уже в следующие двадцать лет синтезы полипептидов подобной сложности превратились в рутину, так что в настоящее время синтез полипептидов, состоящих из 100 и более аминокислотных остатков, уже не рассматривается как непреодолимо трудная задача.

Цель работы: разобрать и объяснить: «Что вызвало столь драматические изменения в области синтеза полипептидов?»

Что же такое пептиды?

Пептиды- природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков альфа-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O) NH. Могут содержать в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода ). По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более 10 аминокислотных остатков полипептидами Природные полипептиды с молекулярной массой более 6 тыс. называются белками .

Впервые пептиды были выделены из ферментативных гидролизатов белков. Термин "пептиды" предложен Э. Фишером. Первый синтетический пептид получил T. Курциус в 1881г. Э. Фишер к 1905 разработал первый общий метод синтеза пептидов и синтезировал ряд олигопептидов различного строения. Существующий вклад в развитие химии пептидов внесли ученики Э. Фишера Э. Абдергальден, Г. Лейке и M. Бергман. В 1932 г. M Бергман и Л. Зервас использовали в синтезе пептидов бензилоксикарбонильную группу (карбобензоксигруппу) для защиты альфа-аминогрупп аминокислот, что ознаменовало новый этап в развитии синтеза пептидов. Полученные N-защищенные аминокислоты (N-карбобензоксиаминокислоты) широко использовали для получения различных пептидов, которые успешно применяли для изучения ряда ключевых проблем химии и биохимии этих веществ, например, для исследования субстратной специфичности протеолитических ферментов. С применением N-карбобензоксиаминокислот были впервые синтезированы природные пептиды(глутатион, карнозин и др.). Важное достижение в этой области разработанный в начале 50-х гг. P. Воганом и др. синтез пептидов методом смешанных ангидридов.

В 1953 В. Дю Виньо синтезировал первый пептидный гормон -окситоцин. На основе разработанной P. Меррифилдом в 1963 концепции твердофазного пептидного синтеза были созданы автоматические синтезаторы пептидов. Получили интенсивное развитие методы контролируемого ферментативного синтеза пептидов. Использование новых методов позволило осуществить синтез гормона инсулина и др.

Успехи синтетической химии пептидов были подготовлены достижениями в области разработки таких методов разделения, очистки и анализа пептидов, как ионообменная хроматография, электрофорез на различных носителях, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуно-химический анализ и др. Получили большое развитие также методы анализа концевых групп и методы ступенчатого расщепления пептидов. Были, в частности, созданы автоматические аминокислотные анализаторы и автоматические приборы для определения первичной структуры пептидов-так называемых секвенаторы.

Пептидная связь имеет свойства частично двойной связи. Это проявляется в уменьшении длины этой связи (0,132 нм) по сравнению с длиной простой связи C N (0,147 нм). Частично двоесвязный характер пептидной связи делает невозможным свободное вращение заместителей вокруг нее, поэтому пептидная группировка является плоской и имеет обычно транс-конфигурацию (ф-ла I). Tаким образом, остов пептидной цепи представляет собой ряд жестких плоскостей с подвижным ("шарнирным") сочленением в месте, где расположены асимметричные атомы С (в ф-ле I обозначены звездочкой).

В растворах пептидов наблюдается предпочтительное образование определенных конформеров. С удлинением цепи более выраженную устойчивость приобретают (аналогично белкам) упорядоченные элементы вторичной структуры. Образование вторичной структуры особенно характерно для регулярных пептидов, в частности для полиаминокислот.

Свойства

Олигопептиды по свойствам близки к аминокислотам, полипептиды подобны белкам. Олигопептиды представляют собой, как правило, кристаллические вещества, разлагающиеся при нагревании до 200 300 0 C. Они хорошо растворимы в воде, разбавленных кислотах и щелочах, почти не растворимы в органических растворителях. Исключения составляют олигопептиды, построенные из остатков гидрофобных аминокислот.

Олигопептиды обладают амфотерными свойствами и, в зависимости от кислотности среды, могут существовать в форме катионов, анионов или цвиттер-ионов. Основные полосы поглощения в ИК спектре для группы NH 3300 и 3080 см -1 , для группы C=O 1660 см -1 . В УФ спектре полоса поглощения пептидной группы находится в области 180-230 нм. Изоэлектрическая точка (рI) пептидов колеблется в широких пределах и зависит от состава аминокислотных остатков в молекуле. Величины рК а пептидов составляют для а-СООН ок. 3, для -H 2 ок. 8.

Химические свойства олигопептидов определяются содержащимися в них функциональными группами, а также особенностями пептидной связи. Их химические превращения в значительной мере аналогичны соответствующим реакциям аминокислот. Они дают положительную биуретовую реакцию и нингидриновую реакцию. Дипептиды и их производные (особенно эфиры) легко циклизуются, превращаясь в дикетопиперазины. Под действием 5,7 нормальной соляной кислоты пептиды гидролизуются до аминокислот в течение 24ч при 105 0 C.

Синтез пептидов

В пептидном синтезе используются известные из органической химии реакции получения амидов и специально разработанные методы для синтеза пептидов. Для успешного осуществления этих синтезов необходимо активировать карбоксильную группу, т.е. увеличить электрофильность карбонильного углерода. Это достигается путем химической модификации карбоксильной группы аминокислот. Тип такой модификации обычно определяет название метода пептидного синтеза.

1. Хлорангидридный метод.

В основе метода лежит реакция получения амидов взаимодействием хлорангидридов кислот с соответствующими аминами. Именно этим способом были получены первые пептиды. В настоящее время этот метод применяется крайне редко, поскольку он сопровождается образованием побочных продуктов и рацемизацией пептидов.

2. Азидный метод

Исходным веществом в данном способе чаще всего является этиловый эфир N-защищенной аминокислоты, из которой получают гидразид, последний превращают с помощью нитрита натрия в присутствии соляной кислоты в азид кислоты. В реакции обычно применяют гидразин, у которого один из азотов заблокирован защитной группой (Z-карбобензокси- или карботретбутилоксигруппа), что позволяет избежать образования побочных дигидразидов. Азиды при взаимодействии с С-защищенными аминокислотами в мягких условиях образуют пептиды.

Рацемизация в этом методе сведена к минимуму, однако могут протекать побочные реакции, а именно: азиды могут перегруппировываться в изоцианаты, которые в свою очередь при взаимодействии со спиртом, используемым в качестве растворителя, образуют уретаны.

3. Смешанные ангидриды

Широкое применение в пептидном синтезе нашли смешанные ангидриды аминокислот с производными угольной кислоты, получаемые, например, с помощью изобутилхлоркарбоната:

Реакцию в этом синтезе проводят при низкой температуре (-10..-20 С), достаточно быстро, что значительно снижает возможность образования побочных продуктов и рацемизации. Быстрый ступенчатый синтез пептидов с использованием смешанных ангидридов носит название REMA-синтез. Методы образования с использованием смешанных ангидридов широко применяются в твердофазном синтезе пептидов.

Таким образом, проведение пептидного синтеза требует учета и жесткого соблюдения некоторых факторов. Так, с целью снижения образования побочных продуктов и рацемизации, рекомендуются следующие типовые условия проведения реакции образования пептидной связи:

1)процесс необходимо проводить при низких температурах, время реакции должно быть минимальным;

2)реакционная масса должна иметь рН, близкую к нейтральной;

3) в качестве кислотосвязывающих реагентов используют органические основания, как пиперидин, морфолин и т.д;

4) проведение реакции желательно в безводных средах.

Твердофазный синтез

Твердофазный синтез - методический подход к синтезу олигомеров (полимеров) с использованием твердого нерастворимого носителя , представляющего собой органический или неорганический полимер.

В начале 60-х годов был предложен новый подход к решению проблем выделения и очистки, возникающих в пептидном синтезе. Позже автор открытия этого подхода, Р.Б. Меррифилд, в своей Нобелевской лекции рассказал, как это произошло: “Однажды у меня возникла мысль о том, как может быть достигнута цель более эффективного синтеза пептидов. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю”. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе. Такая механическая операция может быть выполнена количественно, легко стандартизируется и может быть даже автоматизирована. Рассмотрим эту процедуру более подробно.

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ,

методич. подход к синтезу олиго(поли)меров с использованием твердого нерастворимого носителя (Н.), представляющего собой орг. или неорг. полимер. Т. е. основан на том, что первое звено будущего олигомера ковалентно закрепляется на "якорной" группе Н., наращивание цепи проводится стандартно защищенными мономерами по обычным схемам, используемым для синтеза в р-рах. На заключит. этапе синтезир. олигомер отщепляется от Н. и очищается соответствующими методами. Т. с. применяют в осн. для получения полипептидов, олиго-нуклеотидов и олигосахаридов.

При синтезе полипептидов в качестве Н. наиб. широко используют сополимер стирола и 1-2% дивинилбензола, модифицированный введением диметоксибензилхлоридной якорной группы для присоединения первой (с защищенной группой NH 2) по С-концу, напр.:

После удаления N-защитной группы наращивание полипептидной цепи проводят стандартными методами пептидного синтеза в р-ре (см. Пептиды). В качестве конденсирующих агентов наиб. часто используют или предварительно превращают аминокислоты в активир. эфиры.

При синтезе олигонуклеотидов в качестве Н. используют макропористые стекла или . Якорной группой служит карбоксильная группа, отделенная от пов-сти Н. спец. "ножкой", напр.:

В-пуриновое или пиримидиковое основание

На первой стадии нуклеозид присоединяют к носителю по 3"-гидроксильной группе дезоксирибозы, у к-рой гидрок-сильная группа в положении 5" защищена диметокситри-тильной группой (СН 3 ОС 6 Н 4) 2 (С 6 Н 5)С (DMTr); кол-во последней после ее отщепления легко измеряется спектро-фотометрически, что служит количеств. характеристикой загрузки носителя и позволяет оценить выходы на последующих стадиях наращивания олигонуклеотидной цепи. После удаления группы DMTr сборку цепи осуществляют с помощью фосфитамидов (ф-ла I; M. Kapoзерс, 1980) или фосфонатов (гидрофосфонатов) (II; Р. Стремберг, 1986):

Для осуществления Т. с. необходимы высокие выходы (на уровне 96-99%) на каждой стадии р-ции, а также эффективные методы очистки и выделения синтезир. соединений.

Использование твердой фазы позволяет существенно упростить и ускорить проведение каждой стадии наращивания цепи олигомера, поскольку отделение избытка компонентов, конденсирующих агентов и побочных продуктов, находящихся в р-ре, достигается фильтрованием реакц. смеси и отмывкой Н. подходящим набором р-рите-лей. Т. обр., процесс сборки цепи олигомера распадается на ряд стандартных операций: деблокирование растущего конца цепи, дозирование очередного защищенного мономера и конденсирующего агента, подача этой смеси на колонку с Н. в течение рассчитанного времени и отмывка Н. подходящим р-рителем. Цикл наращивания мономерного звена м. б. автоматизирован.

В основе автоматич. пром. синтезаторов лежит общая принципиальная схема (см. рис.). Многочисл. модели синтезаторов различаются конструкцией колонок и их кол-вом, способом подачи реагентов и р-рителей и др. Управление и программирование осуществляют с помощью встроенного или вынесенного компьютера.

Принципиальная схема устройства автоматич. пром. синтезаторов (электрич. линия управления обозначена пунктиром): 1 -линия подачи мономеров (М 1 , М n ) и конденсирующего агента (КА); 2-линия подачи реагентов (напр., окислителей, ацилирующих агентов, к-т и др.) и р-рителей (P 1 , Р n ); 3 - переключающие клапаны; 4-колонка с носителем, снабженная распределит. клапаном; 5-фотометрич. ячейка; 6-измеритель; 7-блок управления и программирования; 8-дисплей.

Потенциальные возможности Т. е. были продемонстрированы синтезом А (Р. Меррифилд, 1969) и гормона роста человека (Д. Ямаширо, 1970) длиной 124 и 183 аминокислоты соответственно. Однако в связи с небольшой, но постоянной рацемизацией, происходящей при образовании пептидной связи, синтезир. обладают низкой биол. активностью, поэтому автоматич. синтезаторы используются гл. обр. для получения коротких полипептидов (10-30 звеньев), в т. ч. для препаративного синтеза белка (1г).

Т. е. предложен и введен в практику Меррифилдом (1962) для синтеза полипептидов, а затем распространен на синтез олигонуклеотидов (Р. Летзингер, 1964) и олигосахаридов (А. Патчорник, 1973).

Существует др. важный аспект использования Н. для проведения мн. орг. р-ций ( , галогенирование, и т. д.). В этом случае модифицир. Н. выступает в роли полимерного реагента или катализатора, а все превращения субстрата происходят в р-ре. Напр., р-цию фосфатов ROP(O)(OH) 2 со спиртами проводят с использованием в качестве конденсирующего агента сшитого полистирола, модифицированного сульфохлоридной группой.

Лит.: Химия полипептидов, пер. с англ., М., 1977; Polyner-supported reactions in organic synthesis, ed. by P. Hodge, D.C. Sherrington, Chichester, 1980; Oligonucleotide synthesis, A practical approach. Wash., 1984. B.K. Потапов.

Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . Под ред. И. Л. Кнунянца . 1988 .

Смотреть что такое "ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ" в других словарях:

твердофазный синтез - Комбинаторная химическая техника синтеза разнообразных составов, которая использует твердые поддержки, чтобы отделить составы в течение синтеза, тем самым, упрощая идентификацию получающихся составов }