ENGENHARIA GENÉTICA(sin. Engenharia genética) - uma direção de pesquisa em biologia molecular e genética, cujo objetivo final é obter, por meio de técnicas laboratoriais, organismos com novas combinações de propriedades hereditárias, inclusive não encontradas na natureza. No coração de G. e. a possibilidade de manipulação proposital com fragmentos de ácidos nucleicos devido às últimas conquistas da biologia molecular e da genética está. Essas conquistas incluem o estabelecimento da universalidade do código genético (ver), ou seja, o fato de que em todos os organismos vivos a inclusão dos mesmos aminoácidos em uma molécula de proteína é codificada pelas mesmas sequências de nucleotídeos na cadeia de DNA; os sucessos da enzimologia genética, que forneceu ao pesquisador um conjunto de enzimas que permitem obter genes separados ou fragmentos de ácidos nucléicos de forma isolada, realizar a síntese in vitro de fragmentos de ácidos nucléicos to - t, combinar os fragmentos obtidos em um único todo. Assim, modificação de propriedades hereditárias de um organismo por meio de G. e. se reduz a construir novo material genético a partir de vários fragmentos, introduzindo esse material no organismo receptor, criando condições para seu funcionamento e herança estável.

Uma das maneiras de obter genes é química. síntese. Após Holly (A. Holli) nos EUA, A. A. Baev na URSS e outros pesquisadores conseguiram decifrar a estrutura de vários RBGK de transporte (tRNA), X. Koran et al., realizaram uma química. síntese de DNA que codifica o tRNA de alanina de levedura de padeiro.

Mas o método mais eficaz de síntese gênica artificial está associado ao uso da enzima DNA polimerase dependente de RNA (transcriptase reversa) descoberta por Baltimore (D. Baltimore) e Temin (H. Temin) em vírus oncogênicos (ver). Esta enzima foi isolada e purificada de células infectadas com certos vírus oncogênicos contendo RNA, incluindo vírus da mieloblastose aviária, sarcoma de Rous e leucemia de camundongo. A transcriptase reversa fornece a síntese de DNA no modelo de RNA mensageiro (mRNA). O uso de moléculas de mRNA como moldes para a síntese de DNA facilita muito a síntese artificial de genes estruturais individuais de organismos superiores, uma vez que a sequência de bases nitrogenadas em uma molécula de mRNA é uma cópia exata da sequência de bases nitrogenadas dos genes estruturais correspondentes, e a técnica para isolar várias moléculas de mRNA é bastante desenvolvida. Avanços no isolamento do mRNA da proteína globina, que faz parte da hemoglobina humana, animal e ave, mRNA da proteína do cristalino, mRNA da imunoglobina, mRNA de uma proteína específica de tumor maligno (mieloma), tornou possível sintetizar a parte estrutural dos genes que codificam alguns dessas proteínas usando transcriptase reversa.

No entanto, no corpo, os genes estruturais funcionam em conjunto com os genes reguladores, cuja sequência de nucleotídeos não é reproduzida pela molécula de mRNA. Portanto, nenhum desses métodos permite a síntese de um conjunto de genes estruturais e reguladores. A solução para este problema tornou-se possível após o desenvolvimento de métodos para isolar genes individuais. Para isolar genes bacterianos, são usadas pequenas estruturas citoplasmáticas contendo DNA que podem se replicar (ver Replicação) independentemente do cromossomo bacteriano. Essas estruturas formam um único grupo de elementos genéticos extracromossômicos de bactérias - plasmídeos (ver Plasmídeos). Alguns deles podem ser introduzidos no cromossomo bacteriano e, em seguida, espontaneamente ou sob a influência de agentes indutores, por exemplo. A irradiação UV, move-se do cromossomo para o citoplasma, levando consigo os genes-células cromossômicas adjacentes do hospedeiro. Elementos genéticos extracromossômicos de bactérias com tais propriedades são chamados de epissomas [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Epissomas (ver) incluem fagos temperados (ver. Bacteriófago), fator sexual de bactérias, fatores de resistência a drogas de microrganismos (ver), fatores bacteriocinogênicos (ver). No citoplasma, os genes capturados pelos epissomas se replicam em sua composição e muitas vezes formam muitas cópias. O desenvolvimento de um método eficaz para isolar plasmídeos, em particular fagos temperados que transportam o material genético do cromossomo bacteriano, e isolar um fragmento do cromossomo da célula bacteriana incluído no genoma do bacteriófago tornou possível em 1969 para J. Beckwith et al. isolar o operon da lactose, um grupo de genes que controlam as enzimas de síntese necessárias para a absorção da lactose pela Escherichia coli. Uma técnica semelhante foi usada para isolar e purificar o gene que controla a síntese do RNA de transferência de tirosina de Escherichia coli (ver Ácidos ribonucleicos).

O uso de plasmídeos possibilita a obtenção de praticamente qualquer gene bacteriano de forma isolada e, consequentemente, a possibilidade de construir moléculas de DNA de várias fontes. Tais estruturas híbridas podem ser acumuladas nas células em quantidades significativas, uma vez que muitos plasmídeos sob certas condições se replicam intensamente no citoplasma bacteriano, formando dezenas, centenas e até milhares de cópias.

os sucessos de G. e. associado ao desenvolvimento de técnicas para combinar estruturas genéticas de diferentes fontes em uma única molécula de DNA. O fator decisivo no desenho de moléculas híbridas in vitro foi o uso de endonucleases de restrição - enzimas especiais capazes de cortar moléculas de DNA em áreas estritamente definidas. Tais enzimas são encontradas em células de Escherichia coli portadoras de plasmídeos do tipo R, que causam resistência bacteriana a certas drogas, em células de Haemophilus influenzae, Serratia marcescens e outros microrganismos. Uma das enzimas desse tipo mais utilizadas é a endonuclease de restrição EcoRI, que é sintetizada pelo plasmídeo RI em células de E. coli. A enzima reconhece uma seção de DNA com uma sequência única de seis pares de bases e corta a estrutura de DNA de fita dupla nesta seção, de modo que as extremidades de fita simples de quatro nucleotídeos sejam formadas em ambos os lados (as chamadas extremidades adesivas). Como a enzima corta moléculas de DNA, independentemente de sua origem, de forma estritamente definida, todos os fragmentos de DNA resultantes da ação da enzima terão as mesmas extremidades adesivas. As extremidades adesivas complementares de qualquer fragmento de DNA são combinadas por ligações de hidrogênio, formando um DNA circular híbrido (Fig.). Para estabilizar a molécula de DNA híbrida, outra enzima é usada - a polinucleotídeo ligase, que restaura as ligações covalentes quebradas pela enzima de restrição. A sequência especificamente reconhecida por EcoRI ocorre no DNA a não mais de 4.000-16.000 pares de bases de distância. Portanto, um fragmento de DNA formado sob a ação de EcoRI pode incluir pelo menos um gene não danificado pela enzima (em média, um gene contém 1.000-1.500 pares de bases).

O uso de endonucleases de restrição e várias outras enzimas possibilitam a obtenção de DNA recombinante complexo. Um grupo de pesquisadores nos Estados Unidos liderados por P. Berg conseguiu combinar informações genéticas de três fontes como parte de uma única molécula de DNA: o genoma completo (ver) do vírus oncogênico do macaco SV40, parte do genoma do bacteriófago temperado λ e o grupo de genes de E. coli responsáveis ​​pela assimilação da galactose. A molécula recombinante projetada não foi testada quanto à atividade funcional, porque os autores deste trabalho pararam diante do perigo potencial da disseminação de vírus animais oncogênicos na população bacteriana que vive no intestino humano. Sabe-se que o DNA purificado de vírus pode penetrar em várias células de mamíferos e ser herdado de forma estável por elas.

Pela primeira vez, moléculas de DNA híbrido funcionalmente ativas foram construídas nos EUA por S. Cohen et al. O grupo de Cohen resolveu consistentemente o problema da combinação e clonagem (acumulação seletiva) de moléculas de DNA isoladas de espécies cada vez mais distantes filogeneticamente umas das outras. O procedimento de clonagem geralmente consiste no fato de que o DNA de várias fontes é fragmentado usando endonucleases de restrição, então esses fragmentos são combinados in vitro em uma estrutura comum e introduzidos no organismo receptor, que nos experimentos de Cohen é a Escherichia coli. Foi estabelecido que células de várias espécies bacterianas (incluindo Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) podem ser transformadas (ver Transformação) usando moléculas de DNA recombinante. Neste caso, a parte plasmídica da molécula híbrida (ou um dos plasmídeos, se dois plasmídeos de fontes diferentes forem combinados na molécula híbrida) serve como vetor, ou seja, garante a transferência de material genético filogeneticamente estranho para as células receptoras e sua reprodução neles. O primeiro plasmídeo utilizado por Cohen et al. como vetor foi o plasmídeo pSC101 obtido por ele in vitro, que controla a resistência bacteriana à tetraciclina. Este pequeno plasmídeo tem apenas 8.000 pares de bases. Ele é atacado pela enzima EcoRI em apenas um sítio, e a enzima não danifica a capacidade do plasmídeo de se replicar subsequentemente em células de E. coli e controlar a resistência à tetraciclina. Essas características possibilitaram sua utilização para a construção de moléculas de DNA híbridas in vitro. Nos primeiros estágios, DNA de plasmídeo isolado de várias espécies bacterianas e depois de organismos superiores foi anexado a pSC101. Assim, foram criados plasmídeos “quiméricos” (ou seja, incapazes de ocorrer em condições naturais), que combinavam em sua composição o material genético de Escherichia coli, um segmento de DNA de oócitos da rã com garra Xenopus laevis, que controla a síntese de RNA ribossômico e um segmento de DNA de um ouriço-do-mar que controla a síntese de proteínas histonas, ou DNA mitocondrial de camundongo. Nas células de Escherichia coli, nas quais esses plasmídeos híbridos "quiméricos" foram introduzidos, foi registrado o trabalho dos genes de organismos superiores.

Ao contrário do pSC101, que está presente na célula apenas em 4-6 cópias, alguns outros plasmídeos usados ​​como vetores podem se replicar muitas vezes sob certas condições, formando vários milhares de cópias em uma célula. Tais propriedades são possuídas, por exemplo, pelo plasmídeo ColEI, que controla a síntese de colicina (ver Bacteriocinogenia). Assim como o pSC101, o ColEI é clivado pela enzima EcoRI em apenas um sítio, e o DNA estranho, também tratado com EcoRI, é facilmente ligado à molécula linear resultante com extremidades pegajosas. Assim, os genes do operon triptofano de Escherichia coli foram "costurados" ao ColEI. Em células que carregam muitas cópias do plasmídeo híbrido construído, a produção de proteínas enzimáticas controladas por genes de biossíntese de triptofano aumentou dramaticamente. No sistema in vitro, foi possível ligar o plasmídeo ColEI a certos fatores R e a um fago temperado. Tal trabalho foi realizado pela primeira vez na URSS sob a orientação do acadêmico A. A. Baev e do professor S. I. Alikhanyan. Os plasmídeos vetoriais combinados formados por ColEI e fatores R são capazes de se multiplicar intensamente em células bacterianas, como ColEI, e ao mesmo tempo determinar a resistência das células aos antibióticos, o que simplifica muito a seleção de bactérias - portadoras de plasmídeos híbridos.

Os fagos temperados também são usados ​​como vetores. No sistema in vitro, foram construídas partículas de bacteriófagos híbridos que incluíam genes bacterianos, DNA de outros fagos ou organismos superiores (por exemplo, DNA da mosca da fruta Drosophila) em sua estrutura.

A atividade funcional do DNA híbrido é determinada pela possibilidade de sua transferência para as células dos organismos receptores e posterior multiplicação (amplificação) nessas células. Como recipientes, não apenas as bactérias, como mencionado acima, mas também as células de organismos superiores já estão sendo efetivamente utilizadas, até o momento, porém, apenas na forma de cultura de tecidos cultivados fora do corpo. Há indicações de que o DNA de fagos portadores de genes bacterianos pode penetrar em células de tecido conjuntivo humano (fibroblastos), em protoplastos ou em uma cultura indiferenciada (calos) de células vegetais. Em 1971, Amer. pesquisador Merrill (S. R. Merril) et al., relatou experimentos para corrigir um defeito hereditário - galactosemia (ver) pela introdução em células "doentes" de genes de galactose de bactérias incluídas no DNA do fago transdutor. Como resultado, as células de um paciente com galactosemia, deficientes na enzima beta-D-galactose-1-fosfato uridiltransferase, incapazes de assimilar galactose, restauraram sua capacidade normal de crescer na presença de galactose, e a atividade enzimática anteriormente ausente foi registrados em seus extratos. Resultado semelhante foi obtido por Horst (J. Horst) et al, com a introdução de um gene bacteriano que controla a síntese de beta-galactosidase nos fibroblastos de um paciente com gangliosidose generalizada, caracterizada por grave deficiência dessa enzima. Manion (W. Munyon) e seus colaboradores. usando o vírus do herpes, eles transferiram o gene que controla a síntese de timidina quinase de células humanas para células de camundongos, restaurando a capacidade de fibroblastos de camundongos defeituosos de sintetizar essa enzima.

Uma das formas de transferir informação genética no cultivo de células humanas, animais e vegetais é a hibridização de células somáticas, desenvolvida por Ephrussi (V. Ephrussi) e Barsky (G. Barski). A eficácia deste método melhorou significativamente desde que se descobriu que partículas de vírus parainfluenza do tipo Sendai inativados aumentam a frequência de fusão celular de uma ampla variedade de fontes. A possibilidade de transferir genes individuais de cromossomos isolados de hamster chinês para células de tecido conjuntivo de camundongos foi demonstrada. São descritos híbridos de células humanas e de camundongos, nos quais parte dos cromossomos humanos é removida, enquanto a outra parte permanece funcionalmente ativa. O desenvolvimento de métodos de microcirurgia celular tornou possível transplantar núcleos celulares de células somáticas em óvulos fertilizados e, como resultado, obter organismos absolutamente idênticos. A hibridização celular tornou possível induzir a síntese de globina humana em células germinativas de rã. Todos esses exemplos demonstram o potencial e o potencial de G.

Valor prático de G. e. para a medicina está associada às perspectivas de correção de defeitos metabólicos hereditários em humanos (ver Terapia gênica), criando microrganismos que perderam sua patogenicidade, mas mantiveram a capacidade de formar imunidade, a síntese de antibióticos, aminoácidos, hormônios, vitaminas, enzimas, imunoglobulinas, etc., com base na utilização de microrganismos que incluíram os genes correspondentes. Resultados excepcionais podem ser obtidos em um futuro próximo G. e. plantas. Com a ajuda dos métodos de G. e. eles estão tentando criar plantas que possam absorver nitrogênio atmosférico e melhorar a composição de proteínas dos alimentos vegetais. A solução bem-sucedida desses problemas aumentará drasticamente a produtividade das plantas, reduzirá a produção e o consumo de nitrogênio mineral e, assim, melhorará significativamente o meio ambiente (ver). A possibilidade de criar formas completamente novas de animais e plantas superando barreiras interespecíficas de cruzamento está sendo estudada. No entanto, na avaliação de G. e. como uma nova forma de exploração da vida selvagem, deve-se levar em conta não apenas seu possível papel revolucionário na biologia, medicina e agricultura, mas também as oportunidades que surgem em conexão com seu desenvolvimento para o surgimento de novas formas de microrganismos patogênicos, o perigo de a disseminação de DNA híbrido em populações de bactérias que vivem em humanos, portadoras de vírus oncogênicos, etc. É claro que o uso deliberado das conquistas da ciência, incluindo G. e., para propósitos desumanos e misantrópicos, só é possível em uma sociedade em que o bem do homem é sacrificado ao lucro e à agressão.

De materiais adicionais

A engenharia genética continua a ser um método de pesquisa em rápido avanço em biologia molecular e genética. Deve-se notar que os conceitos de "engenharia genética" e "engenharia genética" não são completamente sinônimos, uma vez que as pesquisas relacionadas à engenharia genética não se limitam a manipulações com genes propriamente ditos. Atualmente, os métodos de engenharia genética permitem a análise mais aprofundada e detalhada dos ácidos nucleicos naturais - substâncias responsáveis ​​pelo armazenamento, transmissão e implementação da informação genética (ver Ácidos nucleicos.), bem como criar modificados ou completamente novos que são não encontrado na natureza.genes (ver Gene), combinações de genes e expressá-los com alta eficiência em uma célula viva (ver Gene expressivity). Das realizações práticas específicas da engenharia genética na última década, a mais importante deve ser a criação de produtores de proteínas biologicamente ativas - insulina (ver), interferon (ver), hormônio do crescimento (ver Hormônio somatotrópico), etc., também como o desenvolvimento da ativação de métodos de engenharia genética daquelas conexões de um metabolismo, ao centeio unem-se com a formação de substâncias biologicamente ativas baixas e moleculares. Desta forma, obtêm-se produtores de determinados antibióticos, aminoácidos e vitaminas, muitas vezes mais eficazes do que os produtores destas substâncias, derivadas por métodos tradicionais de genética e seleção. Estão sendo desenvolvidos métodos para obtenção de vacinas de proteínas puras contra os vírus da hepatite, influenza, herpes e febre aftosa, implantou-se a ideia de utilizar a vacinação com o vírus vaccinia, cujo genoma possui genes que codificam a síntese de proteínas de outros vírus (por exemplo, vírus da hepatite ou da gripe) estão incorporados: como resultado, as inoculações com um vírus construído desta forma, o corpo desenvolve imunidade não só contra a varíola, mas também contra a hepatite, gripe ou outras doenças causadas por esse vírus, a proteína to-rogo é codificada pelo gene embutido.

A coleção mundial de endonucleases de restrição - restringeses, as principais "ferramentas" das manipulações de engenharia genética, tem crescido significativamente. Mais de 400 restrições "reconhecendo" apprx. 100 sítios específicos (sítios) de estrutura diferente em moléculas de DNA (ver Ácidos desoxirribonucleicos) e dividindo a cadeia polinucleotídica de DNA nesses sítios. Com a ajuda de uma dessas enzimas ou uma combinação de várias enzimas de restrição, quase qualquer gene pode ser isolado como parte de um ou mais fragmentos de DNA (os chamados fragmentos de restrição). Isso ampliou as possibilidades da engenharia genética não apenas em relação ao isolamento de genes, mas também em relação à ativação de seu trabalho, à análise da estrutura dos genes e seu ambiente molecular. Métodos para a síntese de genes inteiros com uma determinada sequência de nucleotídeos foram desenvolvidos, tornou-se possível fornecer genes sintetizados e naturais com várias sequências de nucleotídeos reguladoras, substituir, inserir, excluir nucleotídeos únicos em seções estritamente especificadas de um gene, encurtar ou completar sua cadeia de nucleotídeos com uma precisão de um nucleotídeo.

A conquista da engenharia genética foi sua penetração na organização e funcionamento dos mecanismos de hereditariedade nas células dos organismos superiores, incluindo os humanos. É em eucariotos superiores que os dados mais interessantes foram obtidos usando métodos de engenharia genética. O sucesso da engenharia genética está amplamente associado à produção de novos vetores especializados que permitem a clonagem (propagação) eficiente de fragmentos de DNA individuais (genes) e a síntese de proteínas codificadas por esses genes.

Fragmentos de restrição conectados a vetores de DNA são clonados em uma célula viva usando a capacidade de tais vetores de se reproduzir (replicar) em uma célula em múltiplas cópias. Dependendo do tamanho dos fragmentos a serem clonados e do objetivo do estudo, são usados ​​vetores de um dos quatro tipos - plasmídeos (ver), fagos (ver. Bacteriófago), cosmídeos ou derivados de fagos com DNA de fita simples.

Para clonagem de fragmentos de DNA relativamente pequenos (até 10 mil pares de bases), são usados ​​vetores plasmídicos (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19, etc.). A conquista da engenharia genética nos últimos anos foi a produção de vetores baseados no fago X (Charon 4A, gtwes-B), em que parte do genoma é substituída por um fragmento de DNA estranho. O genoma híbrido é artificialmente "empacotado" em um revestimento de proteína e as bactérias são infectadas com este fago reconstruído. Formando vários milhares de cópias na célula durante a reprodução, o fago reconstruído o lisa e é liberado no meio de cultura. Com a ajuda de tais vetores, fragmentos de DNA de 10-25 mil pares de bases são clonados.

Os vetores cosmídeos (pIB8, MUA-3) são um híbrido do fago X e um plasmídeo. Eles contêm os chamados Sequências COS de DNA de fago necessárias para empacotar genomas de fagos em um invólucro de proteína e um segmento de DNA de plasmídeo que permite que os vetores cosmídeos se repliquem em bactérias da mesma maneira que os plasmídeos. Assim, o genoma recombinante resultante infecta bactérias com alta eficiência como um bacteriófago, mas se multiplica nelas como um plasmídeo sem causar a morte de uma célula bacteriana. Os cosmídeos são usados ​​para clonar fragmentos de DNA de até 35-45 mil pares de bases.

Os vetores, que são derivados de fagos com DNA de fita simples (M13 mp8, M13, mp73, etc.), são construídos com base na molécula de DNA circular do bacteriófago M13. Para incorporar DNA estranho, uma molécula de DNA de fago de fita dupla replicativa é usada. Um vetor carregando um DIC estranho é introduzido em células bacterianas, onde as moléculas recombinantes se multiplicam sem lisar esta célula e “brotam” no meio de cultura como uma partícula viral com uma molécula de DNA de fita simples. Esses vetores são usados ​​para clonar fragmentos de DNA (até 300-400 pares de bases).

O gene necessário para as manipulações de engenharia genética é obtido clonando as moléculas de DNA recombinante apropriadas e selecionando tais clones. Nos casos em que os genes de organismos superiores e humanos são clonados / expressão to-rykh em E. coli (mais frequentemente usado para esses fins) é impossível, o procedimento de clonagem e seleção é realizado em várias etapas. Na primeira fase, o chamado uma biblioteca de genes de fragmentos de DNA (clonados diretamente do genoma da célula) ou de cópias de DNA clonadas (cDNA) do RNA mensageiro correspondente. Comparando a estrutura de fragmentos de DNA genômico e o cDNA correspondente, eles obtêm informações importantes sobre a organização do material genético e, no caso de doenças hereditárias, sobre a natureza das anomalias no material genético, cuja consequência é essa doença. A partir da biblioteca de genes, usando técnicas modernas, é possível extrair o gene necessário com as regiões do genoma circundantes. Atualmente, foram criadas bibliotecas completas de genes de muitos microrganismos, plantas e animais (até mamíferos e humanos). Várias centenas de genes e outras sequências de nucleotídeos no DNA humano já foram clonados e até certo ponto estudados.

As possibilidades da pesquisa em engenharia genética não se limitam à clonagem de um gene e à obtenção de um grande número de suas cópias. Muitas vezes é necessário não apenas clonar um gene, mas também garantir sua expressão em uma célula, ou seja, implementar a informação contida nele na sequência de aminoácidos da cadeia polipeptídica da proteína codificada por este gene. Se um gene introduzido em uma célula bacteriana é obtido de bactérias da mesma espécie (ou próximas), pode ser suficiente isolar o gene com elementos reguladores que controlam sua expressão. No entanto, com algumas exceções, as sequências de nucleotídeos reguladores de organismos evolutivamente distantes não são intercambiáveis. Portanto, para alcançar, por exemplo, a expressão de um gene eucariótico em células de E. coli, a região reguladora é removida dela e a parte estrutural desse gene é anexada (a uma certa distância) à região reguladora do gene bacteriano. Progressos significativos no desenvolvimento desta técnica foram alcançados após a descoberta da enzima nuclease Ba131, que tem a propriedade única de hidrolisar ambas as cadeias de uma molécula de DNA linear de fita dupla a partir do final da molécula, ou seja, esta enzima remove “extra " seqüências de nucleotídeos de qualquer comprimento a partir do final do fragmento de DNA . Atualmente, as regiões estruturais e regulatórias são isoladas separadamente usando aquelas restritases, cujos sítios de “reconhecimento” estão localizados com mais sucesso na cadeia polinucleotídica, então as sequências nucleotídicas “extras” são removidas e a região estrutural do gene eucariótico é conectada a a região reguladora do gene bacteriano. Desta forma, é possível alcançar não apenas a expressão de genes eucarióticos em células bacterianas, mas, inversamente, genes bacterianos nas células de eucariotos superiores e inferiores.

Os avanços na engenharia genética estão intimamente relacionados ao desenvolvimento e aprimoramento de métodos para determinação da sequência de nucleotídeos (sequenciamento) em moléculas de DNA. Um número significativo de restritases à disposição dos pesquisadores permite isolar certos fragmentos de DNA com especificidade absoluta, e o desenvolvimento e aprimoramento de métodos de clonagem possibilitam a obtenção de fragmentos de genes mesmo únicos em quantidades necessárias para análise. Os métodos de sequenciamento de DNA provaram ser tão eficazes que muitas vezes, pela determinação da sequência de nucleotídeos do DNA, são obtidos dados sobre a sequência de nucleotídeos nas moléculas de RNA correspondentes e sobre a sequência de resíduos de aminoácidos na molécula de proteína sintetizada. Ao processar os resultados do sequenciamento de DNA, os computadores são amplamente utilizados. Para uma interpretação mais completa e rápida dos dados experimentais obtidos, estão sendo criados "bancos" computacionais nacionais e internacionais de sequências de nucleotídeos. Atualmente, as sequências nucleotídicas completas dos genomas de vários plasmídeos bacterianos e vírus foram determinadas, e o problema de determinar as sequências nucleotídicas completas dos primeiros cromossomos individuais e, em seguida, todo o genoma de organismos superiores, incluindo humanos, já é sendo resolvido.

Com a ajuda de métodos de engenharia genética, foram encontrados desvios na estrutura de certas seções de genes humanos, que causavam doenças hereditárias. Na maioria das vezes, esse método é o chamado. b análise do lote. O DNA celular isolado é submetido à hidrólise de enzimas de restrição, os fragmentos resultantes são separados por tamanho usando eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida. Os fragmentos separados são transferidos (“reimpressos”) em papel cromatográfico especialmente tratado, nitrocelulose ou filtro de nylon e novamente submetidos à separação eletroforética. Recorte locais de eletroferogramas correspondentes a frações individuais e contendo o mesmo tipo de fragmentos de DNA; seções cortadas de eletroforegramas são incubadas com um gene previamente clonado ou parte dele, ou com um obtido quimicamente. síntese por uma sequência de nucleotídeos contendo um marcador radioativo. O DNA marcado contata apenas aqueles fragmentos do DNA celular analisado, pois o centeio possui sequências de nucleotídeos complementares a ele. Uma mudança na distribuição e quantidade de um marcador fixo em relação à norma torna possível julgar rearranjos no gene analisado ou sequências de nucleotídeos adjacentes a ele.

Os locais de "reconhecimento" de certas restritases na molécula de DNA são distribuídos de forma desigual, portanto, durante a hidrólise por essas enzimas, a molécula de DNA é dividida em vários fragmentos de vários comprimentos. O rearranjo da estrutura do DNA, pelo qual os sítios de “reconhecimento” existentes desaparecem ou aparecem, leva a uma mudança no conjunto desses fragmentos (os chamados fragmentos de restrição), ou seja, ao aparecimento do comprimento do fragmento de restrição polimorfismo (GVDRF). Rearranjos na molécula de DNA podem ou não causar alterações durante a síntese ou na estrutura da proteína codificada; os rearranjos que não causam alterações são a maioria e causam um RFLP normal. Descobriu-se que RFLP é uma característica genética clara. Atualmente, a análise RFLP tornou-se um dos métodos mais precisos usados ​​em genética humana e genética médica. Para várias doenças hereditárias, são descritas formas de RFLP que indicam diretamente a presença de uma doença ou o transporte de um gene patologicamente alterado.

A engenharia genética marcou o início de uma nova direção de pesquisa, chamada de "genética ao contrário". A análise genética tradicional (ver) é realizada na seguinte sequência: o signo é escolhido, a ligação de um signo com um determinante genético e a localização deste determinante em relação ao já conhecido é estabelecida. Na genética reversa, tudo acontece na ordem inversa: um fragmento de DNA com função desconhecida é selecionado, a ligação desse fragmento de DNA com outras regiões do genoma e sua conexão com determinados traços é estabelecida. Essa abordagem possibilitou o desenvolvimento de métodos para diagnóstico precoce e detecção de portadores de doenças como a coreia de Huntington, doença de Duchenne, fibrose cística, cuja natureza bioquímica de defeitos hereditários ainda não é conhecida. Utilizando o método genealógico para estabelecer os padrões de transmissão hereditária da coreia de Huntington, foi demonstrado que o fragmento de DNA G8 isolado do genoma humano está intimamente ligado ao gene que determina a doença, e a forma do fragmento RFLP G8 nesta população pode diagnosticar esta doença e identificar portadores de genes defeituosos.

Ainda existem muitas dificuldades técnicas na forma de introduzir os métodos utilizados na engenharia genética na prática médica. Muitos laboratórios ao redor do mundo estão desenvolvendo ativamente métodos de diagnóstico de engenharia genética praticamente adequados, e espera-se que tais métodos encontrem aplicação em um futuro próximo, se não para triagem genética em massa (triagem) durante o exame médico da população, então, em pelo menos, para um levantamento amostral de grupos de alto risco para doenças hereditárias.

A engenharia genética permite não apenas copiar compostos e processos naturais, mas também modificá-los e torná-los mais eficientes. Um exemplo disso é uma nova linha de pesquisa chamada engenharia de proteínas. Cálculos feitos com base em dados sobre a sequência de aminoácidos e a organização espacial das moléculas de proteínas mostram que, com certas substituições de certos resíduos de aminoácidos nas moléculas de várias enzimas, é possível um aumento significativo de sua atividade enzimática. Em um gene isolado que codifica a síntese de uma determinada enzima, a substituição estritamente controlada de certos nucleotídeos é realizada por métodos de engenharia genética. Durante a síntese de uma proteína enzimática sob o controle de tal gene modificado, ocorre uma substituição pré-planejada de resíduos de aminoácidos estritamente definidos na cadeia polipeptídica, o que causa um aumento na atividade enzimática muitas vezes em comparação com a atividade de uma proteína natural. protótipo.

No campo da agricultura, espera-se que a engenharia genética dê uma grande contribuição para a seleção de novas variedades de plantas de alto rendimento resistentes à seca, doenças e pragas, bem como para o desenvolvimento de novas variedades de culturas altamente produtivas. animais.

Como qualquer conquista da ciência, os sucessos da engenharia genética podem ser usados ​​não apenas em benefício, mas também em detrimento da humanidade. Estudos especialmente conduzidos mostraram que o perigo de disseminação descontrolada de DNA recombinante não é tão grande quanto se pensava anteriormente. O DNA recombinante e as bactérias que os carregavam revelaram-se muito instáveis ​​às influências ambientais, inviáveis ​​em humanos e animais. Sabe-se que na natureza e sem intervenção humana existem condições que proporcionam uma troca ativa de informações genéticas, é o que se chama. fluxo gênico. No entanto, a natureza criou muitas barreiras eficazes para a penetração de informações genéticas alienígenas no corpo. Atualmente, é óbvio que, ao trabalhar com a maioria das moléculas de DNA recombinante, as precauções usuais são bastante suficientes, o centeio é usado, por exemplo, por microbiologistas ao trabalhar com material infeccioso. Para casos especiais, métodos eficazes foram desenvolvidos para proteção biológica e isolamento físico de objetos experimentais de humanos e do meio ambiente. Portanto, as primeiras versões muito rígidas das regras para trabalhar com DNA recombinante foram revisadas e significativamente suavizadas. Quanto ao uso deliberado das conquistas da engenharia genética em detrimento dos humanos, tanto os cientistas quanto o público devem lutar ativamente para garantir que esse perigo permaneça apenas teoricamente possível.

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L.S. Chernin, V.H. Kalinin.

Engenharia genética

A biologia moderna difere fundamentalmente da biologia tradicional não apenas na maior profundidade de desenvolvimento das idéias cognitivas, mas também em uma conexão mais próxima com a vida da sociedade, com a prática. Podemos dizer que em nosso tempo, a biologia tornou-se um meio de transformar o mundo vivo para atender às necessidades materiais da sociedade. Essa conclusão é ilustrada, em primeiro lugar, pela estreita relação entre biologia e biotecnologia, que se tornou a área mais importante da produção de materiais, parceira igualitária das tecnologias mecânicas e químicas feitas pelo homem, assim como da medicina.

Desde a sua criação, a biologia e a biotecnologia sempre se desenvolveram juntas e, desde o início, a biologia tem sido a base científica da biotecnologia. No entanto, por muito tempo, a falta de dados próprios não permitiu que a biologia tivesse um impacto muito grande na biotecnologia. A situação mudou drasticamente com a criação na segunda metade do século 20. metodologia de engenharia genética, que é entendido como manipulação genética com o objetivo de construir novos genótipos e reconstruir os existentes. Sendo uma conquista metódica por natureza, a engenharia genética não levou a um colapso das ideias predominantes sobre os fenômenos biológicos, não afetou as disposições básicas da biologia, assim como a radioastronomia não abalou as disposições básicas da astrofísica, o estabelecimento do "equivalente mecânico do calor" não levou a uma mudança nas leis de condução de calor, e a prova A teoria atomística da matéria não mudou as relações da termodinâmica, hidrodinâmica e teoria da elasticidade (A.A. Baev).

No entanto, a engenharia genética abriu uma nova era na biologia porque surgiram novas oportunidades para penetrar nas profundezas dos fenômenos biológicos, a fim de caracterizar ainda mais as formas de existência da matéria viva, estudar mais efetivamente a estrutura e a função dos genes em o nível molecular, e compreender os mecanismos sutis do aparelho genético de trabalho. Os avanços na engenharia genética significam uma revolução na

Ciência natural. Eles determinam os critérios para o valor das idéias modernas sobre as características estruturais e funcionais dos níveis moleculares e celulares da matéria viva. Os dados modernos sobre os seres vivos têm um significado cognitivo gigantesco, porque fornecem uma compreensão de um dos aspectos mais importantes do mundo orgânico e, portanto, dão uma contribuição inestimável para a criação de uma imagem científica do mundo. Assim, tendo expandido acentuadamente sua base cognitiva, a biologia por meio da engenharia genética também teve uma influência importante no surgimento da biotecnologia.

A engenharia genética cria bases no caminho para a compreensão dos métodos e formas de "projetar" novos organismos ou melhorar os existentes, dando-lhes grande valor econômico e a capacidade de aumentar drasticamente a produtividade dos processos biotecnológicos. No entanto, a engenharia genética criou novos horizontes para a medicina no campo do diagnóstico e tratamento de muitas doenças, não hereditárias e hereditárias. Ela abriu novos caminhos na busca de novos medicamentos e materiais usados ​​na medicina. A engenharia genética e a biotecnologia estimularam o desenvolvimento de métodos de bionanotecnologia.

No âmbito da engenharia genética, existem genético e celular Engenharia. A engenharia genética é a manipulação para criar moléculas de DNA recombinante. Esta metodologia é muitas vezes referida como clonagem molecular, clonagem de genes, tecnologia de DNA recombinante ou simplesmente manipulação genética. É importante enfatizar que o objeto da engenharia genética são moléculas de DNA, genes individuais. Pelo contrário, a engenharia celular é entendida como manipulações genéticas com células individuais isoladas ou grupos de células vegetais e animais.

ENGENHARIA GENÉTICA E SUAS FERRAMENTAS

A engenharia genética é um conjunto de vários métodos experimentais (técnicas) que proporcionam construção (reconstrução), clonagem de moléculas de DNA e genes com objetivos específicos.

Os métodos de engenharia genética são usados ​​em uma determinada sequência (Fig. 127), e vários estágios são distinguidos na execução

uma experiência típica de engenharia genética destinada a clonar um gene, a saber:

1. Isolamento do DNA plasmidial das células do organismo de interesse (inicial) e isolamento do vetor DNA.

2. Corte (restrição) do DNA do organismo original em fragmentos contendo os genes de interesse usando uma das enzimas de restrição e isolamento desses genes da mistura de restrição. Ao mesmo tempo, o DNA vetorial é cortado (restrito), transformando-o de uma estrutura circular em linear.

3. Ligação do segmento de DNA (gene) de interesse ao DNA vetor para obtenção de moléculas de DNA híbridas.

4. Introdução de moléculas de DNA recombinante por transformação em algum outro organismo, por exemplo, em E. coli ou células somáticas.

5. Inoculação de bactérias, nas quais foram introduzidas moléculas de DNA híbridas, em meio nutriente que permita o crescimento apenas de células contendo moléculas de DNA híbridas.

6. Identificação de colônias constituídas por bactérias contendo moléculas de DNA híbridas.

7. Isolamento de DNA clonado (genes clonados) e sua caracterização, incluindo sequenciamento de bases nitrogenadas no fragmento de DNA clonado.

Arroz. 127.Estágios sucessivos de experimentos de engenharia genética

No curso da evolução, as bactérias desenvolveram a capacidade de sintetizar as chamadas enzimas de restrição (endonucleases), que se tornaram parte do sistema de modificação de restrição celular (bacteriano). Nas bactérias, os sistemas de modificação de restrição são o sistema de defesa imunológica intracelular contra o DNA estranho. Ao contrário dos organismos superiores, nos quais o reconhecimento e a destruição de vírus, bactérias e outros patógenos ocorrem extracelularmente, nas bactérias, a proteção contra DNA estranho (DNA de plantas e animais em que vivem) ocorre intracelularmente, ou seja, quando o DNA estranho entra no citoplasma das bactérias. Para se proteger, as bactérias também desenvolveram a capacidade de “marcar” seu próprio DNA com bases metilantes em sequências específicas. Pela mesma razão, o DNA estranho, devido à ausência de grupos metil nas mesmas sequências, é fundido (cortado) em fragmentos por várias restritases bacterianas e depois degradado por exonucleases bacterianas em nuleotídeos. Podemos dizer que desta forma as bactérias se protegem do DNA de plantas e animais, em cujo organismo vivem temporariamente (como patógenos) ou permanentemente (como saprófitas).

As enzimas de restrição foram inicialmente isoladas de E. coli em 1968. Descobriu-se que eles são capazes de cortar (derreter) moléculas de DNA em diferentes locais (locais) de restrição. Essas enzimas foram chamadas de endonucleases de classe I. Então, endonucleases de classe II foram encontradas em bactérias, que reconhecem especificamente sítios de restrição em DNA estranho e também realizam restrição nesses sítios. São as enzimas desta classe que começaram a ser usadas na engenharia genética. Ao mesmo tempo, foram descobertas enzimas de classe III que derretem o DNA perto dos locais de reconhecimento, mas essas enzimas não têm importância na engenharia genética.

A ação do sistema de restrição-modificação é "racionalizada" pelas chamadas sequências palindrômicas (de reconhecimento) de bases nitrogenadas, que são sítios de restrição do DNA. Sequências palindrômicas são sequências de bases que lêem o mesmo para frente e para trás, como a sequência de letras radar. Como as fitas de DNA têm direção antiparalela, uma sequência é considerada palindrômica se for idêntica quando lida na direção da extremidade de 5" para a de 3" na parte superior e na fita inferior de 3" para a de 5". final, a saber:

Os palíndromos podem ser de qualquer tamanho, mas a maioria dos palíndromos usados ​​como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição tem 4, 5, 6 e raramente 8 bases de comprimento.

As enzimas de restrição são uma ferramenta absolutamente essencial na engenharia genética para cortar fragmentos (genes) de interesse de grandes moléculas de DNA. Como são conhecidas mais de 100 enzimas de restrição, isso permite a seleção de enzimas de restrição e a excisão seletiva de fragmentos do DNA original.

Uma característica notável das restringeses é que elas produzem cortes de moléculas em vários fragmentos (restrições) de DNA em bordas, fazendo com que uma fita seja mais longa que a outra nas extremidades resultantes, formando uma espécie de cauda. Tais extremidades (caudas) são chamadas de extremidades "pegajosas", pois são capazes de autocomplementaridade.

Considere os resultados da restrição no exemplo de uma das restrições mais famosas EcoRI do sistema de modificação de restrição E. coi. Em vez de derreter o DNA no centro da sequência de reconhecimento palindrômico, essa enzima derrete o DNA fora do centro e produz 4 extremidades autocomplementares (“pegajosas”), consistindo em um número diferente de nucleotídeos, a saber:

Essas extremidades "pegajosas" são úteis na engenharia genética porque podem ser reconectadas de forma complementar a baixas temperaturas, permitindo o fechamento eficiente de fragmentos de DNA.

Os sítios de reconhecimento e os sítios de derretimento no caso de outras restritas têm um conteúdo diferente, a saber:

Após a restrição de DNA, fragmentos de DNA de restrição (restrições de DNA) são isolados da mistura de restrição, que são então necessários para associação com o vetor. O DNA restrito é isolado usando eletroforese, uma vez que é muito fácil fracionar o DNA restrito usando este método devido ao tamanho dos fragmentos restritos e à razão carga elétrica-massa constante. Fragmentos em um campo elétrico migram durante a eletroforese em uma frequência dependente de seu tamanho (massa). Quanto maior (mais longo) o fragmento, mais lentamente ele migra no campo elétrico. O material no qual a eletroforese é realizada é agarose não carregável ou poliacrilamida. O brometo de etídio é usado para identificar os fragmentos, o que os cora, o que facilita sua detecção.

A eficiência da eletroforese é muito alta, pois pode ser usada para separar fragmentos que variam em tamanho de 2 a 50.000 bases.

Após a eletroforese, fragmentos de agarose são isolados usando vários métodos. Com base nos resultados da comparação de tamanho

Restrições de um mesmo DNA, obtidas por meio de diferentes enzimas de restrição, constroem mapas de restrição, que mostram os sítios de restrição de cada uma das enzimas de restrição utilizadas. Em termos práticos, os mapas de restrição permitem determinar não apenas o tamanho das restrições, mas também a localização dos loci de determinados genes nas moléculas de DNA.

Como em organismos superiores, durante a transcrição, o DNA heterogêneo é sintetizado, corrigido por processamento, na engenharia genética, geralmente é utilizado o DNA complementar (cDNA), que é obtido usando o mRNA como molde, sobre o qual a transcriptase reversa sintetiza o DNA de fita simples. cDNA), que é uma cópia do mRNA. Subsequentemente, esses DNAs de fita simples são convertidos em DNAs de fita dupla. Considere que o cDNA contém sequências de nucleotídeos contínuas (transcritas e traduzidas). É o cDNA que é usado para restrição.

Fragmentos de DNA (restrições) isolados após eletroforese a partir de géis de agarose podem ser preliminarmente submetidos ao sequenciamento; determinar sua sequência de nucleotídeos. Para isso, são utilizados métodos de sequenciamento químico e enzimático. O método químico baseia-se na obtenção de fragmentos marcados com fósforo radioativo (32P) e na remoção de uma das bases desses fragmentos, seguindo-se os resultados da radioautografia dos géis contendo esses fragmentos. O método enzimático baseia-se no fato de que ao final do fragmento analisado é introduzido um nucleotídeo, que é então utilizado na síntese de diferentes fragmentos. em vitro, analisado eletroforeticamente para a sequência de nucleotídeos. Para estudar sequências de nucleotídeos específicas em uma molécula de DNA, use

também hibridação de DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern-

e Southern blots.

Vetores genéticos. O segmento de DNA (gene) que se destina à clonagem molecular deve ser capaz de se replicar quando é transferido para uma célula bacteriana, ou seja, ser uma réplica. No entanto, ele não tem essa habilidade. Portanto, para garantir a transferência e detecção de genes clonados nas células, eles são combinados com os chamados vetores genéticos. Este último deve ter pelo menos duas propriedades. Primeiro, os vetores devem ser capazes de replicar

nas células e em várias extremidades. Em segundo lugar, eles devem permitir a seleção de células contendo o vetor, ou seja, possuem um marcador para o qual é possível contra-selecionar células contendo o vetor juntamente com o gene clonado (moléculas de DNA recombinante). Plasmídeos e fagos atendem a esses requisitos. Os plasmídeos são bons vetores porque são replicons e podem conter genes para resistência a qualquer antibiótico, o que permite a seleção de bactérias para resistência a esse antibiótico e, portanto, a fácil detecção de moléculas de DNA recombinante.

(Fig. 128).

Arroz. 128. Vetor pBRl

Uma vez que não existem vectores plasmídicos naturais, todos os vectores plasmídicos conhecidos até agora foram construídos artificialmente. Os plasmídeos R serviram como material de partida para a criação de vários vetores genéticos, nos quais sequências excessivas de DNA, incluindo aquelas com múltiplos sítios de restrição, foram removidas com a ajuda de restringeses. Esta remoção foi determinada pelo facto de o vector plasmídico ter apenas um local de reconhecimento para uma enzima de restrição, e este local deveria situar-se numa região funcionalmente sem importância do genoma plasmídico. Por exemplo, o vetor plasmidial pBR 322, que possui genes de resistência à ampicilina e tetraciclina, tornando-o muito conveniente

para a seleção de bactérias contendo o segmento de DNA clonado, possui locais de restrição únicos para mais de 20 enzimas de restrição, incluindo enzimas de restrição conhecidas como Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II e Sal I.

Os vetores de fagos também têm várias vantagens. Eles podem incluir fragmentos de DNA clonados maiores (mais longos) em comparação com vetores de plasma. Além disso, a transferência do fragmento clonado por fagos em células como resultado da infecção deste último é mais eficiente do que a transformação de DNA. Finalmente, os vetores fagos permitem uma triagem (reconhecimento) mais eficiente na superfície do ágar de colônias contendo células portadoras do gene clonado. Muitos vetores de fago são baseados no fago lambda.

Além do fago, também são usados ​​outros vetores virais construídos com base no vírus do herpes, bem como vetores construídos com base em DNA de levedura.

Se a clonagem de genes for realizada usando células de mamíferos ou vegetais, os requisitos para vetores são os mesmos que no caso de clonagem em células bacterianas.

Construção de moléculas de DNA recombinante. A construção direta das moléculas de DNA recombinante segue após a obtenção da restrição do DNA estudado e do DNA vetorial. Consiste no fechamento dos segmentos de restrição do DNA estudado com o vetor de restrição de DNA, que, como resultado da restrição, passa de DNA circular para linear.

Para fechar os fragmentos do DNA em estudo com o DNA do vetor, utiliza-se a DNA ligase (Fig. 129). A ligação será bem sucedida se as estruturas a serem unidas tiverem grupos 3'-hidroxila e 5'-fosfato e se esses grupos estiverem localizados em uma relação apropriada entre si. Os fragmentos são combinados através de suas extremidades "pegajosas" como resultado da autocomplementaridade. Em altas concentrações de fragmentos, os últimos de tempos em tempos ficam na posição correta (opostos um ao outro). Muitas restritoras, como Eco RI, produzem extremidades "pegajosas" de quatro bases. O processo de ligação das extremidades "pegajosas", constituídas por quatro bases, ocorre a baixa temperatura (até 12ºC).

Arroz. 129. Ligação de DNA

Se fragmentos sem extremidades "pegajosas" são formados durante a restrição, então eles são "forçadamente" convertidos em moléculas com extremidades "pegajosas" usando a enzima transferase. Esta enzima adiciona nucleotídeos à extremidade de 3" do DNA. Uma cauda poli-A pode ser adicionada em um fragmento, uma cauda poli-T no outro. A reação em cadeia da polimerase (PCR) também é usada para gerar quaisquer extremidades de DNA desejadas. O princípio da PCR baseia-se na desnaturação do DNA isolado das células e seu "anelamento" com a adição de oligonucleotídeos de DNA de 15 a 20 nucleotídeos cada um às cadeias renaturantes, que devem ser complementares às sequências nas cadeias separadas por distâncias de 50-2000 nucleotídeos. Síntese de DNA em vitro, eles permitem que a DNA polimerase copie as regiões que estão entre as "sementes". Esta cópia dá um grande número de cópias do fragmento de DNA estudado.

Introdução de moléculas de DNA recombinante nas células. Após a fusão do fragmento de DNA (gene) de interesse com um vetor genético utilizando DNA ligase, as moléculas recombinantes resultantes são introduzidas nas células para conseguir sua replicação (devido ao vetor genético) e aumentar o número de cópias. A maneira mais popular de introduzir moléculas de DNA recombinante em células, nas quais o vetor é um plasmídeo, é a transformação E. coli. Para isso, as células bacterianas são pré-tratadas com cálcio ou rubídio (íons), a fim de

para que se tornem "competentes" na percepção do DNA recombinante. Para aumentar a frequência de penetração do DNA nas células, é utilizado o método de eletroporação, que consiste em expor brevemente as células a um intenso campo elétrico. Este tratamento cria cavidades nas membranas celulares, o que torna mais fácil para as células absorverem o DNA. Após a introdução de moléculas de DNA recombinante nas bactérias, estas são semeadas em MPA (meat-peptona agar) enriquecido com antibióticos para selecionar as células desejadas, ou seja, células contendo moléculas de DNA recombinante. A frequência de transformação é baixa. Tipicamente, ocorre um transformante por 105 células semeadas. Se o vetor for um fago, então as células (bactérias ou leveduras) são transfectadas com o fago. Quanto às células somáticas de animais, elas são transfectadas com DNA na presença de substâncias químicas que facilitam a passagem do DNA pelas membranas plasmáticas. A microinjeção direta de DNA em oócitos, células somáticas cultivadas e embriões de mamíferos também é possível.

O ponto mais importante associado à clonagem molecular é a busca de um método para estabelecer se o fragmento clonado está realmente incluído no vetor e, junto com o vetor, formando uma molécula de DNA recombinante, entrou nas células. Se estamos falando de células bacterianas, um dos métodos é baseado em levar em consideração a inativação insercional do gene de resistência ao plasmídeo (vetor). Por exemplo, no vetor plasmídico pBR 322, que determina resistência à ampicilina e tetraciclina, o único sítio para a enzima de restrição Pst I está localizado no locus ocupado pelo gene de resistência à ampicilina. A fusão de Pst I neste local gera extremidades adesivas permitindo a ligação do fragmento clonado ao DNA do vetor. No entanto, neste caso, o gene de resistência à ampicilina do plasmídeo (vetor) é inativado, enquanto o gene de resistência à tetraciclina no vetor permanece intacto. É o gene de resistência à tetraciclina que é usado para selecionar células transformadas por moléculas de DNA recombinante. Isto permite verificar que as células das colónias crescidas no meio com tetraciclina contêm efectivamente moléculas de ADN recombinante, são verificadas através do chamado "spot test" num par de placas com meio sólido, uma das quais contém ampicilina, enquanto o outro é desprovido desse antibiótico. O DNA a ser clonado é

apenas em transformantes resistentes a tetraciclina. Quanto aos transformantes resistentes tanto à ampicilina quanto à tetraciclina (ArTc), eles contêm moléculas de plasmídeo (vetor) que adquiriram espontaneamente uma forma circular sem a inclusão de DNA estranho (clonado).

Outro método para detectar a inserção de fragmentos estranhos (clonados) em um vetor de plasmídeo é baseado no uso de um vetor contendo o gene de β-galactosidase. A inserção de DNA estranho neste gene inevitavelmente inativa a síntese de β-galactosidase, que pode ser detectada semeando as células transformadas em um meio contendo substratos de β-galactosidase. Este meio permite a seleção de colônias de células coradas. Existem outros métodos também.

Como já observado, fragmentos de restrição linear de DNA vetorial são capazes de restaurar a estrutura circular sem incluir neles segmentos clonados. Para reduzir a frequência de formação espontânea de tais moléculas de DNA de vetor circular, a restrição de DNA de vetor é tratada com fosfatase. Como resultado, a formação de moléculas circulares de DNA torna-se impossível, uma vez que as extremidades do 5'-PO 4 necessárias para a ação da ligase estarão ausentes.

O conjunto de colônias transformantes cultivadas em meio seletivo é um conjunto de células contendo clones de diferentes fragmentos (genes) do DNA genômico clonado. Coleções desses clones formam as chamadas bibliotecas de DNA, amplamente utilizadas na engenharia genética.

A etapa final da clonagem de genes é o isolamento e estudo do DNA clonado, incluindo o sequenciamento. Cepas promissoras de bactérias ou células somáticas contendo moléculas de DNA recombinante que controlam a síntese de proteínas de interesse que possuem valor comercial são transferidas para a indústria.

ENGENHARIA DE CÉLULAS

Conforme observado no início do capítulo, a engenharia celular refere-se à manipulação genética de células isoladas de animais e plantas. Essas manipulações são muitas vezes em vitro, e seu principal objetivo é obter genótipos desses organismos com propriedades desejadas, principalmente economicamente úteis. Quanto a-

Xia man, então a engenharia celular era aplicável às suas células germinativas.

Um pré-requisito para o desenvolvimento da engenharia celular em humanos e animais foi o desenvolvimento de métodos para o cultivo de suas células somáticas em meio nutriente artificial, bem como a obtenção de híbridos de células somáticas, incluindo híbridos interespecíficos. Por sua vez, os avanços no cultivo de células somáticas influenciaram o estudo das células germinativas e a fertilização em humanos e animais. Desde os anos 60. século 20 Numerosos experimentos foram realizados em vários laboratórios ao redor do mundo sobre o transplante de núcleos de células somáticas em óvulos artificialmente desprovidos de núcleos. Os resultados desses experimentos foram muitas vezes contraditórios, mas em geral levaram à descoberta da capacidade dos núcleos celulares de assegurar o desenvolvimento normal do óvulo (ver Capítulo IV).

Com base nos resultados do estudo do desenvolvimento de ovos fertilizados nos anos 60. século 20 também foram iniciados estudos para verificar a possibilidade de fertilização dos óvulos fora do corpo da mãe. Muito rapidamente, esses estudos levaram à descoberta da possibilidade de fertilização de óvulos com espermatozóides in vitro e ao desenvolvimento posterior dos embriões assim formados quando implantados no útero de uma mulher. A melhoria dos métodos desenvolvidos nesta área levou ao fato de que o nascimento de crianças "de proveta" se tornou uma realidade. Já em 1981, 12 crianças nasceram no mundo, cuja vida foi dada no laboratório, no tubo de ensaio. Atualmente, esta seção de engenharia celular tornou-se difundida, e o número de crianças "tubo de ensaio" já é de dezenas de milhares (Fig. 130). Na Rússia, o trabalho para obter crianças "de proveta" foi iniciado apenas em 1986.

Em 1993, foi desenvolvida uma técnica para a obtenção de gêmeos humanos monozigóticos em vitro dividindo os embriões em blastômeros e cultivando os últimos até 32 células, após o que poderiam ser implantados no útero de uma mulher.

Influenciados pelos resultados associados aos bebês de proveta, os animais também desenvolveram uma tecnologia chamada transplantes embriões. Está associado ao desenvolvimento de um método de indução da poliovulação, métodos de fertilização artificial de óvulos e implantação de embriões no corpo dos animais - mães adotivas. A essência desta tecnologia é a seguinte:

escroto. Uma vaca altamente produtiva é injetada com hormônios, resultando em poliovulação, que consiste na maturação de 10 a 20 células de uma só vez. Os ovos são então fertilizados artificialmente com células reprodutivas masculinas no oviduto. No 7-8º dia, os embriões são lavados do útero e transplantados para o útero de outras vacas (mães adotivas), que dão à luz bezerros gêmeos. Os bezerros herdam o status genético de seus pais originais.

Arroz. 130.Crianças "tubo"

Outra área da engenharia celular em animais é a criação de animais transgênicos. A maneira mais simples de obter tais animais é introduzir moléculas lineares de DNA nos óvulos dos animais originais. Animais que se desenvolvem a partir de óvulos assim fertilizados carregarão uma cópia do gene introduzido em um de seus cromossomos e, além disso, transmitirão esse gene por herança. Um método mais complexo para obter animais transgênicos foi desenvolvido em camundongos que diferem na cor da pelagem e é o seguinte. Primeiro, embriões de quatro dias de idade são removidos do corpo de uma camundongo cinza grávida e esmagados em células individuais. Em seguida, os núcleos são extraídos das células embrionárias, são transferidos para os ovos de camundongos pretos, previamente desprovidos dos núcleos. Ovos de camundongos pretos contendo núcleos estranhos são colocados em tubos de ensaio

com solução nutritiva para posterior desenvolvimento. Embriões desenvolvidos a partir de ovos de camundongos pretos são implantados no útero de camundongos brancos. Assim, nestes experimentos, foi possível obter um clone de camundongos com pelagem cinza, ou seja, clonar células embrionárias com propriedades desejadas. No Capítulo IV, examinamos os resultados da fertilização de ovos artificialmente desprovidos de núcleos de ovelhas com o material nuclear de células somáticas de animais da mesma espécie. Em particular, os núcleos foram removidos dos ovos de ovelhas e, em seguida, os núcleos de células somáticas (embrionárias, frutas ou células de animais adultos) foram introduzidos nesses ovos, após o que os ovos fertilizados dessa maneira foram introduzidos no útero de ovelhas adultas. Os cordeiros nascidos eram idênticos ao doador de ovelhas. Um exemplo é a ovelha Dolly. Também foram obtidos clones de bezerros, camundongos, coelhos, gatos, mulas e outros animais. Tal construção de animais transgênicos é uma forma direta de clonagem de animais com características economicamente úteis, incluindo indivíduos de um determinado sexo.

Animais transgênicos também foram obtidos usando material de origem pertencente a diferentes espécies. Em particular, é conhecido um método para transferir um gene que controla o hormônio do crescimento de ratos para óvulos de camundongo, bem como um método para combinar blastômeros de ovelha com blastômeros de cabra, o que levou ao surgimento de animais híbridos (vacas). Esses experimentos indicam a possibilidade de superar a incompatibilidade de espécies nos estágios iniciais de desenvolvimento. Perspectivas particularmente tentadoras se abrem (se a incompatibilidade de espécies for completamente superada) no caminho da fertilização dos ovos de uma espécie pelos núcleos de células somáticas de outra espécie. Estamos falando da perspectiva real de criar híbridos de animais economicamente valiosos que não podem ser obtidos por cruzamento.

Deve-se notar que o trabalho de transplante nuclear ainda não é muito eficaz. Experimentos realizados em anfíbios e mamíferos geralmente mostraram que sua eficácia é baixa e depende da incompatibilidade entre núcleos doadores e oócitos receptores. Além disso, as aberrações cromossômicas resultantes nos núcleos transplantados no curso de desenvolvimento posterior, que são acompanhadas pela morte de animais transgênicos, também são um obstáculo ao sucesso.

Na intersecção do trabalho sobre o estudo da hibridização celular e os estudos imunológicos, surgiu um problema associado à produção e estudo dos chamados anticorpos monoclonais. Como observado acima, os anticorpos produzidos pelo organismo em resposta à introdução de um antígeno (bactérias, vírus, hemácias, etc.) são proteínas chamadas imunoglobulinas e formam parte fundamental do sistema de defesa do organismo contra patógenos. Mas qualquer corpo estranho introduzido no corpo é uma mistura de diferentes antígenos que estimularão a produção de diferentes anticorpos. Por exemplo, os eritrócitos humanos possuem antígenos não apenas para os grupos sanguíneos A (II) e B (III), mas também muitos outros antígenos, incluindo o fator Rh. Além disso, as proteínas da parede celular bacteriana ou o capsídeo dos vírus também podem atuar como antígenos diferentes, causando a formação de anticorpos diferentes. Ao mesmo tempo, as células linfóides do sistema imunológico do corpo são geralmente representadas por clones. Isso significa que, mesmo só por isso, no soro sanguíneo de animais imunizados, os anticorpos são sempre uma mistura composta por anticorpos produzidos por células de diferentes clones. Enquanto isso, para fins práticos, são necessários anticorpos de apenas um tipo; os chamados soros monoespecíficos, contendo anticorpos de apenas um tipo ou, como são chamados, anticorpos monoclonais.

Em busca de métodos para obtenção de anticorpos monoclonais, pesquisadores suíços descobriram em 1975 um método de hibridização entre linfócitos de camundongos imunizados com um ou outro antígeno e células tumorais de medula óssea cultivadas. Esses híbridos são chamados de "hibridoma". Da parte “linfocítica”, representada por um linfócito de um clone, um único hibridoma herda a capacidade de causar a formação dos anticorpos necessários, e do mesmo tipo, e graças à parte “tumor (mieloma)” torna-se capaz, como todas as células tumorais, de se multiplicar indefinidamente em meio nutriente artificial, dando uma grande população de híbridos. Na fig. 131 mostra um esquema para o isolamento de linhas celulares que sintetizam anticorpos monoclonais. Linhas celulares de camundongos produtoras de anticorpos monoclonais são isoladas por fusão de células de mieloma com linfócitos do baço de camundongos imunizados cinco dias antes.

antígeno desejado. A fusão celular é conseguida misturando-as na presença de polietilenoglicol, que induz a fusão das membranas celulares, e depois inoculando-as num meio nutriente que permite o crescimento e reprodução apenas de células híbridas (hibridoma). A reprodução dos hibridomas é realizada em meio líquido, onde crescem ainda mais e secretam anticorpos no líquido de cultura, e apenas um tipo, além disso, em quantidades ilimitadas. Esses anticorpos são chamados de monoclonais. Para aumentar a frequência de formação de anticorpos, recorre-se à clonagem de hibridoma, i.e. à seleção de colônias individuais de hibridomas capazes de produzir a maior quantidade de anticorpos do tipo desejado. Os anticorpos monoclonais encontraram ampla aplicação na medicina para o diagnóstico e tratamento de várias doenças. Ao mesmo tempo, a vantagem mais importante da tecnologia monoclonal é que ela pode ser usada para gerar anticorpos contra materiais que não podem ser purificados. Pelo contrário, é possível obter anticorpos monoclonais contra membranas celulares (plasmáticas) de neurônios animais. Para fazer isso, os camundongos são imunizados com membranas neuronais isoladas, após o que seus linfócitos esplênicos são combinados com células de mieloma e, em seguida, procedem como descrito acima.

Arroz. 131. Obtenção de anticorpos monoclonais

ENGENHARIA GENÉTICA E MEDICINA

A engenharia genética revelou-se muito promissora para a medicina, principalmente na criação de novas tecnologias para obtenção de proteínas fisiologicamente ativas utilizadas como fármacos (insulina, somatostatina, interferons, somatotropina, etc.).

A insulina é usada para tratar pessoas com diabetes, que é a terceira causa mais comum de morte depois de doenças cardíacas e câncer. A demanda mundial de insulina é de várias dezenas de quilogramas. Tradicionalmente, é obtido das glândulas pancreáticas de porcos e vacas, mas os hormônios desses animais são ligeiramente diferentes da insulina humana. A insulina suína difere em um aminoácido, enquanto a insulina bovina difere em três. Acredita-se que a insulina animal muitas vezes causa efeitos colaterais. Embora a síntese química da insulina seja realizada há muito tempo, mas até agora a produção industrial de hormônios permaneceu muito cara. Já a insulina barata é obtida por meio de um método de engenharia genética por síntese químico-enzimática do gene da insulina, seguida da introdução desse gene na E. coli, que então sintetiza o hormônio. Essa insulina é mais "biológica", pois é quimicamente idêntica à insulina produzida pelas células do pâncreas humano.

Os interferons são proteínas sintetizadas pelas células principalmente em resposta à infecção do organismo por vírus. Os interferons são específicos da espécie. Por exemplo, em humanos, existem três grupos de interferons produzidos por várias células sob o controle dos genes correspondentes. O interesse pelos interferons é determinado pelo fato de serem amplamente utilizados na prática clínica para o tratamento de muitas doenças humanas, especialmente as virais.

Tendo tamanhos grandes, as moléculas de interferon dificilmente estão disponíveis para síntese. Portanto, a maioria dos interferons agora são obtidos de sangue humano, mas o rendimento com este método de obtenção é pequeno. Enquanto isso, a necessidade de interferon é extremamente alta. Isso colocou o desafio de encontrar um método eficiente para a produção de interferon em quantidades industriais. A engenharia genética é a base da produção moderna de interferon "bacteriano".

A influência da engenharia genética na tecnologia dessas substâncias medicinais que foram criadas há muito tempo usando tecnologia biológica aumentou. De volta aos anos 40 e 50. século 20 foi criado

indústria biológica para a produção de antibióticos, que são a parte mais eficaz do arsenal de medicamentos da medicina moderna. No entanto, nos últimos anos houve um aumento significativo na resistência das bactérias aos medicamentos, principalmente aos antibióticos. A razão está na ampla distribuição no mundo microbiano de plasmídeos que determinam a resistência das bactérias aos medicamentos. É por isso que muitos antibióticos anteriormente famosos perderam sua eficácia anterior. Até agora, a única maneira de superar a resistência bacteriana aos antibióticos é procurar novos antibióticos. Segundo especialistas, cerca de 300 novos antibióticos são criados anualmente no mundo. No entanto, a maioria deles são ineficazes ou tóxicos. Apenas alguns antibióticos são introduzidos na prática todos os anos, o que torna necessário não apenas manter, mas também aumentar a capacidade da indústria de antibióticos com base nos desenvolvimentos da engenharia genética.

As principais tarefas da engenharia genética naquelas tecnologias de substâncias medicinais em que os microrganismos são produtores de medicamentos são determinadas pela necessidade de reconstrução por engenharia genética destes últimos para aumentar sua atividade. No mesmo

Ao mesmo tempo, começou a se concretizar a ideia de criar medicamentos na forma de pequenas moléculas, o que contribui para sua maior eficácia.

A biotecnologia imunológica está principalmente associada à produção de vacinas de nova geração para a prevenção de doenças infecciosas em humanos e animais. Os primeiros produtos comerciais criados com a ajuda da engenharia genética foram vacinas contra hepatite humana, febre aftosa animal e algumas outras. Uma direção extremamente importante nesta área está associada à produção de anticorpos monoclonais, reagentes necessários para o diagnóstico de patógenos, bem como para a purificação de hormônios, vitaminas, proteínas de diversas naturezas (enzimas, toxinas, etc.).

De considerável interesse prático é o método de obtenção de hemoglobina artificial pela introdução de genes de hemoglobina em plantas de tabaco, onde as cadeias α e β-globina são produzidas sob o controle desses genes, que são combinados em hemoglobina. A hemoglobina sintetizada nas células das plantas de tabaco é totalmente funcional (liga o oxigênio). A engenharia celular aplicada ao homem está associada não só à solução de problemas fundamentais da biologia humana, mas também à superação, sobretudo, da infertilidade feminina. Uma vez que a frequência de casos positivos de implantação no útero de mulheres de embriões obtidos em vitro,é pequeno, obtendo então embriões gêmeos monozigóticos em vitro também é importante, pois a possibilidade de reimplantação aumenta devido a embriões de "reserva". De particular interesse são as perspectivas de uso de células-tronco como fonte de substituição de células e tecidos no tratamento de doenças como diabetes, lesão da medula espinhal, dor no coração, osteoartrite e doença de Parkinson. Mas para concretizar essas perspectivas, é necessário um estudo aprofundado da biologia das células-tronco.

No uso da engenharia genética em relação aos problemas da medicina, a tarefa de desenvolver métodos de engenharia genética para o tratamento radical de doenças hereditárias, que, infelizmente, ainda não são tratáveis ​​pelos métodos existentes, adquiriu particular importância. O conteúdo desta tarefa é desenvolver maneiras de corrigir (normalizar) mutações que resultam em doenças hereditárias e garantir a transmissão de "correções" por herança. Acredita-se que o desenvolvimento bem sucedido de métodos geneticamente modificados para o tratamento de doenças hereditárias será

contribuir para os dados sobre o genoma humano obtidos como resultado da implementação do programa científico internacional "Genoma Humano".

PROBLEMAS AMBIENTAIS DE ENGENHARIA GENÉTICA

Elevando a biotecnologia a um novo nível, a engenharia genética também encontrou aplicação no desenvolvimento de métodos para determinar e eliminar a poluição ambiental. Em particular, foram construídas cepas bacterianas que são uma espécie de indicadores da atividade mutagênica de contaminantes químicos. Por outro lado, cepas bacterianas contendo plasmídeos foram geneticamente modificadas para controlar a síntese de enzimas capazes de destruir muitos compostos químicos que poluem o meio ambiente. Em particular, algumas bactérias contendo plasmídeos são capazes de decompor petróleo e derivados de petróleo que entraram no meio ambiente como resultado de vários acidentes ou outras causas desfavoráveis ​​a compostos inofensivos.

No entanto, a engenharia genética é a transformação do material genético, que não existe na natureza. Consequentemente, os produtos de engenharia genética são produtos absolutamente novos que não existem na natureza. Portanto, devido à natureza desconhecida de seus produtos, ele próprio representa um perigo tanto para a natureza quanto para o meio ambiente, bem como para o pessoal que trabalha em laboratórios que usam métodos de engenharia genética ou trabalham com estruturas criadas no decorrer de trabalhos de engenharia genética.

Como as possibilidades de clonagem de genes são infinitas, mesmo no início desses estudos, surgiram dúvidas entre os cientistas sobre a natureza dos organismos criados. Ao mesmo tempo, houve sugestões sobre uma série de consequências indesejáveis ​​dessa metodologia, e essas sugestões também encontraram apoio entre o público em geral. Em particular, surgiram divergências sobre as propriedades das bactérias que receberam genes animais em experimentos de engenharia genética. Por exemplo, as bactérias retêm E. coli sua afiliação à espécie devido ao conteúdo de genes animais neles introduzidos (por exemplo, o gene da insulina) ou devem ser considerados uma nova espécie? Além disso, quão duráveis ​​são essas bactérias, em quais nichos ecológicos elas podem

existir? Mas o mais importante foi o surgimento de temores de que, durante a produção e manipulação de moléculas de DNA recombinante, possam ser criadas estruturas genéticas com propriedades imprevistas e perigosas para a saúde humana, para o equilíbrio ecológico historicamente estabelecido. Ao mesmo tempo, começaram os pedidos de uma moratória na engenharia genética. Esses apelos causaram comoção internacional e levaram a uma conferência internacional realizada em 1975 nos EUA, na qual foram amplamente discutidas as possíveis consequências da pesquisa nessa área. Então, em países onde a engenharia genética começou a se desenvolver, foram desenvolvidas regras para trabalhar com moléculas de DNA recombinante. Essas regras visam impedir que os produtos das atividades dos laboratórios de engenharia genética entrem no habitat.

Outro aspecto das consequências indesejáveis ​​do trabalho de engenharia genética está relacionado ao risco à saúde do pessoal que trabalha em laboratórios onde são utilizados métodos de engenharia genética, uma vez que tais laboratórios utilizam fenol, brometo de etídio, radiação UV, que são fatores prejudiciais à saúde. Além disso, nesses laboratórios existe a possibilidade de contaminação com bactérias contendo moléculas de DNA recombinante que controlam propriedades indesejáveis, como resistência de bactérias a medicamentos. Esses e outros pontos determinam a necessidade de melhorar o nível de segurança no trabalho de engenharia genética.

Finalmente, o problema do perigo dos produtos geneticamente modificados (tomate, batata, milho, soja geneticamente modificados), bem como de produtos como pão, massas, doces, sorvetes, queijos, óleos vegetais, produtos cárneos, que em vários países, especialmente nos Estados Unidos, tornaram-se difundidos. Por 12.000 anos de agricultura, os seres humanos têm usado produtos naturais. Portanto, supõe-se que, com alimentos geneticamente modificados, novas toxinas, alérgenos, bactérias e agentes cancerígenos entrarão no corpo humano, o que levará a doenças completamente novas das gerações futuras. Isso levanta a questão de uma avaliação verdadeiramente científica dos alimentos geneticamente modificados.

QUESTÕES PARA DISCUSSÃO

1. O que se entende por engenharia genética, celular e genética? Existe alguma diferença entre esses conceitos e a clonagem molecular?

2. Qual é a natureza progressiva da engenharia genética em comparação com outros métodos usados ​​em biologia?

3. Liste as principais "ferramentas" da engenharia genética.

4. O que são enzimas de restrição, quais são suas propriedades e seu papel na engenharia genética?

5. Todas as restringeses formam extremidades "pegajosas" do DNA estudado e a estrutura das extremidades "pegajosas" depende do tipo de restritase?

6. Defina vetores genéticos. Existem vetores naturais?

7. Como os vetores genéticos são obtidos em laboratório? Quais objetos biológicos são o material de origem para a obtenção de vetores?

8. Qual é o comprimento máximo das sequências de bases nitrogenadas do DNA que ainda podem ser incluídas em um vetor genético? Os vetores diferem em "potência"?

9. Descrever as propriedades da DNA ligase e determinar o seu papel na engenharia genética.

10. Como um segmento de DNA clonado (gene) é ligado a um vetor genético?

11. Qual é a frequência de introdução de moléculas de DNA recombinante em células bacterianas?

12. Em que princípio se baseia a seleção de células bacterianas contendo moléculas de DNA recombinante? Dê um exemplo dessa seleção.

14. Muitas cepas de bactérias têm as mesmas enzimas que fornecem quase o mesmo metabolismo. Enquanto isso, a especificidade de nucleotídeos dos sistemas de modificação de restrição bacteriana é diferente. Você pode explicar esse fenômeno?

15. Por que as sequências de DNA que representam sítios de reconhecimento de enzimas de restrição não podem conter mais de oito pares de bases?

16. Quantas vezes a sequência de HHCC reconhecida pela enzima de restrição Hae III ocorrerá em um segmento de DNA de 50.000 pb com 30, 50 e 70 por cento de conteúdo de HC?

17. As enzimas de restrição Bam HI e Bgl I fundem as sequências G GATCC e T GATCA, respectivamente. Fragmentos de DNA produzidos por restrição Bgl I podem ser incluídos no sítio BamHI? Se sim, por quê? Se o plasmídeo (vetor) usado contém um sítio de restrição Bgl I, então em que meio nutriente as bactérias podem ser selecionadas, este plasmídeo?

18. Calcule a frequência de transformação bacteriana por molécula de DNA se 5-10 5 transformantes são formados por 5.000 pares de bases plasmídicas?

19. É possível clonar o ponto 0 de replicação do DNA E. coli e se sim, como?

20. É possível determinar quantas moléculas de DNA são necessárias para transformar uma célula E. coli?

21. É possível determinar o sítio de splicing no mRNA usando a reação em cadeia da polimerase?

22. Como a reação em cadeia da polimerase pode ser usada para introduzir o sítio de restrição desejado no sítio de interesse do fragmento de DNA a ser clonado?

23. Cite os métodos de engenharia celular aplicados a animais. Qual é o valor econômico dos animais produzidos por esses métodos?

24. Defina os termos "plantas transgênicas" e "animais transgênicos". Os organismos transgênicos mantêm suas espécies ou podem ser considerados organismos de novas espécies?

25. O que são hibridomas e anticorpos monoclonais? Como são recebidos?

26. A engenharia celular é aplicável a humanos?

27. Suponha que a injeção de DNA estranho em um óvulo de camundongo e a implantação do óvulo fertilizado dessa maneira no corpo de um camundongo terminassem em sua gravidez e no nascimento de camundongos contendo cópias do DNA injetado no genoma. No entanto, os camundongos acabaram sendo mosaicos; algumas de suas células contêm cópias do DNA injetado, enquanto outras não possuem esse DNA. Você pode explicar a natureza desse fenômeno?

28. Você considera os alimentos preparados a partir de alimentos geneticamente modificados geneticamente perigosos?

29. A revisão científica dos alimentos geneticamente modificados é necessária?

A cognição é determinada pelo que afirmamos como Verdade.

P.A. Florensky, 1923

Quando aplicada a humanos, a engenharia genética pode ser usada para tratar doenças hereditárias. No entanto, tecnicamente, há uma diferença significativa entre tratar o próprio paciente e alterar o genoma de seus descendentes.

A tarefa de alterar o genoma de um adulto é um pouco mais difícil do que criar novas raças de animais geneticamente modificadas, pois neste caso é necessário alterar o genoma de inúmeras células de um organismo já formado, e não apenas um ovo embrionário. Para isso, propõe-se a utilização de partículas virais como vetor. As partículas de vírus são capazes de penetrar em uma porcentagem significativa de células adultas, incorporando suas informações hereditárias nelas; possível reprodução controlada de partículas virais no corpo. Ao mesmo tempo, para reduzir os efeitos colaterais, os cientistas estão tentando evitar a introdução de DNA geneticamente modificado nas células dos órgãos genitais, evitando assim a exposição aos futuros descendentes do paciente. Também vale a pena notar as críticas significativas a essa tecnologia na mídia: o desenvolvimento de vírus geneticamente modificados é percebido por muitos como uma ameaça a toda a humanidade.

Com a ajuda da terapia genética no futuro, é possível alterar o genoma humano. Atualmente, métodos eficazes para modificar o genoma humano estão em desenvolvimento e testes em primatas. Por muito tempo, a engenharia genética de macacos enfrentou sérias dificuldades, mas em 2009 os experimentos foram coroados de sucesso: uma publicação apareceu na revista Nature sobre o uso bem-sucedido de vetores virais geneticamente modificados para curar um macaco adulto do daltonismo. No mesmo ano, o primeiro primata geneticamente modificado (cultivado a partir de um ovo modificado) deu descendência - o sagui comum.

Ainda que em pequena escala, a engenharia genética já está sendo usada para dar a mulheres com alguns tipos de infertilidade a chance de engravidar. Para fazer isso, use os ovos de uma mulher saudável. A criança como resultado herda o genótipo de um pai e duas mães.

No entanto, a possibilidade de introduzir alterações mais significativas no genoma humano enfrenta uma série de sérios problemas éticos.

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Engenharia genética (engenharia genética)

Trata-se de um conjunto de técnicas, métodos e tecnologias para obtenção de RNA e DNA recombinante, isolando genes de um organismo (células), manipulando genes e introduzindo-os em outros organismos.

A engenharia genética não é uma ciência no sentido mais amplo, mas é uma ferramenta biotecnologia usando os métodos de ciências biológicas como biologia molecular e celular, citologia, genética, microbiologia, virologia.

Um componente importante da biotecnologia é a engenharia genética. Nascida no início dos anos 70, ela alcançou grande sucesso hoje. Técnicas de engenharia genética transformam células de bactérias, leveduras e mamíferos em "fábricas" para a produção em larga escala de qualquer proteína. Isso possibilita analisar detalhadamente a estrutura e as funções das proteínas e utilizá-las como medicamentos.

Atualmente, a Escherichia coli (E. coli) tornou-se fornecedora de hormônios tão importantes como insulina e somatotropina. Anteriormente, a insulina era obtida de células pancreáticas de animais, então o custo era muito alto. Para obter 100 g de insulina cristalina, são necessários 800-1000 kg de pâncreas, e uma glândula de uma vaca pesa 200-250 gramas. Isso tornou a insulina cara e de difícil acesso para uma ampla gama de diabéticos. Em 1978, pesquisadores da Genentech produziram a primeira insulina em uma cepa de Escherichia coli especialmente projetada. A insulina consiste em duas cadeias polipeptídicas A e B, com 20 e 30 aminoácidos de comprimento. Quando eles estão conectados por pontes dissulfeto, a insulina de cadeia dupla nativa é formada. Demonstrou-se que não contém proteínas de E. coli, endotoxinas e outras impurezas, não apresenta efeitos colaterais como a insulina animal e não difere dela em atividade biológica. Subsequentemente, a pró-insulina foi sintetizada em células de E. coli, para as quais uma cópia de DNA foi sintetizada no molde de RNA usando transcriptase reversa. Após purificação da pró-insulina obtida, esta foi dividida e obteve-se a insulina nativa, minimizando-se as etapas de extração e isolamento do hormônio. A partir de 1.000 litros de fluido de cultura, podem ser obtidos até 200 gramas do hormônio, o que equivale à quantidade de insulina secretada por 1.600 kg do pâncreas de um porco ou vaca.

A somatotropina é um hormônio de crescimento humano secretado pela glândula pituitária. A falta desse hormônio leva ao nanismo hipofisário. Se a somatotropina for administrada em doses de 10 mg por kg de peso corporal três vezes por semana, em um ano uma criança que sofre de sua deficiência pode crescer 6 cm. Assim, as quantidades de hormônio disponíveis eram limitadas, além disso, o hormônio produzido por esse método era heterogêneo e podia conter vírus de desenvolvimento lento. A empresa "Genentec" em 1980 desenvolveu uma tecnologia para a produção de somatotropina usando bactérias, que era desprovida dessas deficiências. Em 1982, o hormônio de crescimento humano foi obtido na cultura de E. coli e células animais no Instituto Pasteur, na França, e desde 1984, a produção industrial de insulina começou na URSS. Na produção de interferon, tanto E. coli, S. cerevisae (levedura) quanto uma cultura de fibroblastos ou leucócitos transformados são usados. Vacinas seguras e baratas também são obtidas por métodos semelhantes.

A produção de sondas de DNA altamente específicas baseia-se na tecnologia do DNA recombinante, com a qual estudam a expressão gênica nos tecidos, a localização de genes nos cromossomos e identificam genes que possuem funções relacionadas (por exemplo, em humanos e galinhas ). As sondas de DNA também são usadas no diagnóstico de várias doenças.
A tecnologia de DNA recombinante tornou possível uma abordagem não convencional de proteína-gene chamada genética reversa. Com essa abordagem, uma proteína é isolada da célula, o gene dessa proteína é clonado e modificado, criando um gene mutante que codifica uma forma alterada da proteína. O gene resultante é introduzido na célula. Se for expresso, a célula que o carrega e seus descendentes sintetizarão a proteína alterada. Desta forma, genes defeituosos podem ser corrigidos e doenças hereditárias tratadas.

Se o DNA híbrido for introduzido em um óvulo fertilizado, podem ser obtidos organismos transgênicos que expressam o gene mutante e o transmitem à prole. A transformação genética de animais permite estabelecer o papel de genes individuais e seus produtos proteicos tanto na regulação da atividade de outros genes quanto em vários processos patológicos. Com a ajuda da engenharia genética, foram criadas linhas de animais resistentes a doenças virais, bem como raças de animais com características úteis para humanos. Por exemplo, a microinjeção de DNA recombinante contendo o gene da somatotropina bovina em um zigoto de coelho possibilitou a obtenção de um animal transgênico com hiperprodução desse hormônio. Os animais resultantes tinham acromegalia pronunciada.
Agora é até difícil prever todas as oportunidades que serão realizadas nas próximas décadas.

A engenharia genética é um campo da biotecnologia que inclui as ações de rearranjo de genótipos. Ainda hoje, a engenharia genética permite ligar e desligar genes individuais, controlando assim a atividade dos organismos, e também transferir instruções genéticas de um organismo para outro, incluindo organismos de outra espécie. À medida que os geneticistas aprendem cada vez mais sobre o trabalho de genes e proteínas, torna-se cada vez mais real poder programar arbitrariamente o genótipo (principalmente humano), alcançando facilmente quaisquer resultados: como resistência à radiação, capacidade de viver debaixo d'água , a capacidade de regeneração de órgãos danificados e até a imortalidade.

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  A engenharia genética serve para obter as qualidades desejadas de um organismo modificado ou geneticamente modificado. Ao contrário do melhoramento tradicional, durante o qual o genótipo é alterado apenas indiretamente, a engenharia genética permite interferir diretamente no aparato genético, usando a técnica de clonagem molecular. Exemplos de aplicações da engenharia genética são a produção de novas variedades de culturas geneticamente modificadas, a produção de insulina humana usando bactérias geneticamente modificadas, a produção de eritropoietina em cultura de células ou novas raças de camundongos experimentais para pesquisa científica.

  A base da indústria microbiológica e biossintética é a célula bacteriana. As células necessárias para a produção industrial são selecionadas de acordo com certos critérios, dos quais o mais importante é a capacidade de produzir, sintetizar, nas quantidades máximas possíveis, um determinado composto - um aminoácido ou um antibiótico, um hormônio esteróide ou um ácido orgânico . Às vezes é necessário ter um microrganismo que possa, por exemplo, usar óleo ou água residual como “alimento” e transformá-los em biomassa ou mesmo proteína bastante adequada para aditivos alimentares. Às vezes são necessários organismos que possam crescer em temperaturas elevadas ou na presença de substâncias que são inquestionavelmente letais para outros tipos de microrganismos.

  A tarefa de obter tais cepas industriais é muito importante; para sua modificação e seleção, vários métodos de influência ativa na célula foram desenvolvidos - desde o tratamento com venenos potentes até a irradiação radioativa. O objetivo dessas técnicas é o mesmo - conseguir uma mudança no aparato genético hereditário da célula. Seu resultado é a produção de numerosos micróbios mutantes, de centenas e milhares dos quais os cientistas tentam selecionar os mais adequados para um determinado propósito. A criação de técnicas para mutagênese química ou por radiação foi uma conquista notável na biologia e é amplamente utilizada na biotecnologia moderna.

  Mas suas capacidades são limitadas pela natureza dos próprios microrganismos. Eles não são capazes de sintetizar uma série de substâncias valiosas que se acumulam nas plantas, principalmente óleos medicinais e essenciais. Eles não podem sintetizar substâncias que são muito importantes para a vida de animais e humanos, uma série de enzimas, hormônios peptídicos, proteínas imunes, interferons e muitos outros compostos de arranjo simples que são sintetizados em animais e humanos. É claro que as possibilidades de microorganismos estão longe de se esgotarem. Da abundância de microrganismos, apenas uma pequena fração tem sido utilizada pela ciência e, especialmente, pela indústria. Para efeitos de seleção de microrganismos, são de grande interesse, por exemplo, bactérias anaeróbias que podem viver na ausência de oxigênio, fototróficos que utilizam a energia da luz como plantas, quimioautotróficos, bactérias termofílicas que podem viver a uma temperatura, como foi descoberto recentemente , de cerca de 110 ° C, etc.

  E, no entanto, as limitações do "material natural" são óbvias. Eles tentaram e estão tentando contornar as restrições com a ajuda de culturas de células e tecidos de plantas e animais. Este é um caminho muito importante e promissor, que também é implementado na biotecnologia. Nas últimas décadas, os cientistas desenvolveram métodos pelos quais células únicas de uma planta ou tecido animal podem crescer e se multiplicar separadamente do corpo, como células bacterianas. Esta foi uma conquista importante - as culturas de células resultantes são usadas para experimentos e para a produção industrial de certas substâncias que não podem ser obtidas por meio de culturas bacterianas.

  Outra direção de pesquisa é a remoção do DNA de genes desnecessários para codificar proteínas e o funcionamento de organismos e a criação de organismos artificiais baseados nesse DNA com um "conjunto truncado" de genes. Isso torna possível aumentar drasticamente a resistência dos organismos modificados aos vírus.

  Histórico de desenvolvimento e nível de tecnologia alcançado

  Na segunda metade do século 20, foram feitas várias descobertas e invenções importantes que fundamentam Engenharia genética. Muitos anos de tentativas de "ler" as informações biológicas que estão "registradas" nos genes foram concluídas com sucesso. Este trabalho foi iniciado pelo cientista inglês Frederick Senger e pelo cientista americano Walter Gilbert (Prêmio Nobel de Química em 1980). Como você sabe, os genes contêm instruções de informação para a síntese de moléculas de RNA e proteínas no corpo, incluindo enzimas. Para forçar uma célula a sintetizar substâncias novas e incomuns para ela, é necessário que os conjuntos correspondentes de enzimas sejam sintetizados nela. E para isso é necessário alterar propositalmente os genes nele ou introduzir nele novos genes anteriormente ausentes. Mudanças nos genes em células vivas são mutações. Eles ocorrem sob a influência de, por exemplo, mutagênicos - venenos químicos ou radiação. Mas tais mudanças não podem ser controladas ou dirigidas. Portanto, os cientistas concentraram seus esforços na tentativa de desenvolver métodos para introduzir na célula genes novos e muito específicos de que uma pessoa precisa.

  As principais etapas para resolver o problema de engenharia genética são as seguintes:

  1. Obtenção de um gene isolado.
  2. Introdução de um gene em um vetor para transferência em um organismo.
  3. Transferência de um vetor com um gene para um organismo modificado.
  4. Transformação das células do corpo.
  5. Seleção de organismos geneticamente modificados ( OGM) e eliminando aqueles que não foram modificados com sucesso.

  O processo de síntese gênica está atualmente muito bem desenvolvido e até amplamente automatizado. Existem dispositivos especiais equipados com computadores, na memória dos quais são armazenados programas para a síntese de várias sequências de nucleotídeos. Tal aparelho sintetiza segmentos de DNA de até 100-120 bases nitrogenadas de comprimento (oligonucleotídeos). Uma técnica tornou-se difundida que permite o uso da reação em cadeia da polimerase para a síntese de DNA, incluindo DNA mutante. Uma enzima termoestável, a DNA polimerase, é usada para a síntese de molde de DNA, que é usada como semente para pedaços de ácido nucleico sintetizados artificialmente - oligonucleotídeos. A enzima transcriptase reversa possibilita a síntese de DNA utilizando tais primers (primers) em uma matriz de RNA isolada de células. O DNA sintetizado dessa maneira é chamado complementar (RNA) ou cDNA. Um gene isolado, "quimicamente puro" também pode ser obtido a partir de uma biblioteca de fagos. Este é o nome de uma preparação de bacteriófagos, em cujo genoma são inseridos fragmentos aleatórios do genoma ou cDNA, reproduzidos pelo fago juntamente com todo o seu DNA.

  A técnica de introdução de genes em bactérias foi desenvolvida depois que Frederick Griffith descobriu o fenômeno da transformação bacteriana. Este fenômeno é baseado em um processo sexual primitivo, que em bactérias é acompanhado pela troca de pequenos fragmentos de DNA não cromossômico, plasmídeos. As tecnologias de plasmídeos formaram a base para a introdução de genes artificiais em células bacterianas.

  Dificuldades significativas foram associadas à introdução do gene preparado no aparelho hereditário de células vegetais e animais. No entanto, na natureza, há casos em que o DNA estranho (de um vírus ou bacteriófago) é incluído no aparato genético de uma célula e, com a ajuda de seus mecanismos metabólicos, começa a sintetizar “sua própria” proteína. Os cientistas estudaram as características da introdução de DNA estranho e o usaram como princípio para a introdução de material genético em uma célula. Este processo é chamado de transfecção.

  Se organismos unicelulares ou culturas de células multicelulares são modificados, a clonagem começa neste estágio, ou seja, a seleção desses organismos e seus descendentes (clones) que sofreram modificação. Quando a tarefa é obter organismos multicelulares, as células com um genótipo alterado são usadas para propagação vegetativa de plantas ou injetadas nos blastocistos de uma mãe de aluguel quando se trata de animais. Como resultado, nascem filhotes com genótipo alterado ou inalterado, entre os quais apenas aqueles que apresentam as alterações esperadas são selecionados e cruzados entre si.

  Aplicação em pesquisas científicas

  Ainda que em pequena escala, a engenharia genética já está sendo usada para dar a mulheres com alguns tipos de infertilidade a chance de engravidar. Para fazer isso, use os ovos de uma mulher saudável. A criança como resultado herda o genótipo de um pai e duas mães.

  No entanto, a possibilidade de fazer mudanças mais significativas no genoma humano enfrenta uma série de sérios problemas éticos. Em 2016, um grupo de cientistas nos Estados Unidos recebeu a aprovação para ensaios clínicos de um método de tratamento de câncer usando células imunes do próprio paciente, submetidas à modificação genética usando a tecnologia CRISPR/Cas9.

  Engenharia celular

  A engenharia celular baseia-se no cultivo de células e tecidos vegetais e animais capazes de produzir substâncias necessárias para os seres humanos fora do corpo. Este método é usado para propagação clonal (assexuada) de formas vegetais valiosas; para obter células híbridas que combinam as propriedades de, por exemplo, linfócitos do sangue e células tumorais, o que permite obter anticorpos rapidamente.

  Engenharia genética na Rússia

  Note-se que após a introdução do registro estatal de OGMs, a atividade de algumas organizações públicas e deputados individuais da Duma do Estado, que estão tentando impedir a introdução de biotecnologias inovadoras na agricultura russa, aumentou visivelmente. Mais de 350 cientistas russos assinaram uma carta aberta da Sociedade de Cientistas de Apoio ao Desenvolvimento da Engenharia Genética na Federação Russa. A carta aberta observa que a proibição de OGMs na Rússia não apenas prejudicará a concorrência saudável no mercado agrícola, mas levará a um atraso significativo nas tecnologias de produção de alimentos, aumentará a dependência das importações de alimentos e minará o prestígio da Rússia como um estado em que o curso para o desenvolvimento inovador foi oficialmente anunciado [ o significado do fato? ] .

  Veja também

  Notas

  1. Alexandre Panchin Vencer Deus // Mecânica Popular . - 2017. - Nº 3. - S. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo genoma edição usando um um sistema TALEN de alta eficiência(Inglês) . natureza. Recuperado em 10 de janeiro de 2017.
  3. Elementos - notícias científicas: macacos curados do daltonismo com terapia genética (indeterminado) (18 de setembro de 2009). Recuperado em 10 de janeiro de 2017.