ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦИКЛ КРЕБСА)

Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Г. Кребсом. Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов . В дальнейшем было показано, что цикл трикарбо-новых кислот является тем центром, в котором сходятся практически все метаболические пути. Таким образом, цикл Кребса – общий конечный путь окисления ацетильных групп (в виде ацетил-КоА), в которые превращается в процессе катаболизма большая часть органических молекул , играющих роль «клеточного топлива »: углеводов , жирных кислот и аминокислот .

Образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата в митохондриях ацетил-КоА вступает в цикл Кребса . Данный цикл происходит в матриксе митохондрий и состоит из восьми последовательных реакций (рис. 10.9). Начинается цикл с присоединения ацетил-КоА к оксалоацетату и образования лимонной кислоты (цитрата ). Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода ) и двух декарбоксилирований (отщепление СО 2) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса превращается в оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т.е. в результате полного оборота цикла одна молекула ацетил-КоА сгорает до СО 2 и Н 2 О, а молекула окса-лоацетата регенерируется. Рассмотрим все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса .

Рис. 10.9. Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса ).

Первая реакция катализируется ферментом цит-рат-синтазой, при этом ацетильная группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется лимонная кислота :

По-видимому, в данной реакции в качестве промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA.

В результате второй реакции образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты , которая, присоединяя молекулу воды , переходит в изолимонную кислоту (изоцитрат). Катализирует эти обратимые реакции гидратации–дегидратации фермент аконитатгидратаза (аконитаза). В результате происходит взаимоперемещение Н и ОН в молекуле цитрата :

Третья реакция , по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса . Изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы.

В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом , которому в качестве специфического активатора необходим АДФ . Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg 2+ или Мn 2+ .

Во время четвертой реакции происходит окислительное декарбокси-лирование α-кетоглутаровой кислоты с образованием высокоэнергетического соединения сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с таковым реакции окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в реакции принимают участие 5 коферментов : ТПФ, амид липоевой кислоты , HS-KoA, ФАД и НАД + .

Пятая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтета-зой. В ходе этой реакции сукцинил-КоА при участии ГТФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат ). Одновременно происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА:

В результате шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту . Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой , в молекуле которой с белком прочно (ковалентно) связан кофермент ФАД. В свою очередь сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней ми-тохондриальной мембраной :

Седьмая реакция осуществляется под влиянием фермента фума-ратгидратазы (фумаразы ). Образовавшаяся при этом фумаровая кислота гидратируется, продуктом реакции является яблочная кислота (малат). Следует отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью (см. главу 4) – в ходе реакции образуется L-яблочная кислота :

Наконец, в ходе восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы происходит окисление L-малата в оксалоацетат:

Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций , происходит полное окисление («сгорание») одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД + и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов в дыхательной цепи (в цепи дыхательных ферментов ), локализованной в мембране митохондрий . Образовавшийся ФАДН 2 прочно связан с СДГ, поэтому он передает атомы водорода через KoQ. Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ . Из 4 пар атомов водорода 3 пары переносят НАДН на систему транспорта электронов ; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуется 3 молекулы АТФ (в процессе сопряженного ), а всего, следовательно, 9 молекул АТФ (см. главу 9). Одна пара атомов от сукцинатдегидрогеназы-ФАДН 2 попадает в систему транспорта электронов через KoQ, в результате образуется только 2 молекулы АТФ . В ходе цикла Кребса синтезируется также одна молекула ГТФ (субстратное фосфорилирование ), что равносильно одной молекуле АТФ . Итак, при окислении одной молекулы ацетил-КоА в цикле Кребса и системе окислительного фосфорилирования может образоваться 12 молекул АТФ .

Если подсчитать полный энергетический эффект гликолитического расщепления глюкозы и последующего окисления двух образовавшихся молекул пирувата до СО 2 и Н 2 О, то он окажется значительно большим.

Как отмечалось, одна молекула НАДН (3 молекулы АТФ ) образуется при окислительном декарбоксилировании пирувата в ацетил-КоА. При расщеплении одной молекулы глюкозы образуется 2 молекулы пирувата, а при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих 2 оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется 30 молекул АТФ (следовательно, окисление молекулы пирувата до СО 2 и Н 2 О дает 15 молекул АТФ ). К этому количеству надо добавить 2 молекулы АТФ , образующиеся при аэробном гликолизе , и 6 молекул АТФ , синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН, которые образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в дегидрогеназной реакции гликолиза . Следовательно, при расщеплении в тканях одной молекулы глюкозы по уравнению С 6 Н 12 О 6 + 6О 2 -> 6СО 2 + 6Н 2 О синтезируется 38 молекул АТФ . Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным процессом, чем анаэробный гликолиз .

Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН в дальнейшем при окислении могут давать не 6 молекул АТФ , а только 4. Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН не способны проникать через мембрану внутрь митохондрий . Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого глицеролфосфатного челночного механизма (рис. 10.10). Ци-топлазматический НАДН сначала реагирует с цитоплазматическим ди-гидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализи-

Рис. 10.10. Глицеролфосфатный челночный механизм. Объяснение в тексте.

руется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидроге-назой:

Дигидроксиацетонфосфат + НАДН + Н + <=> Глицерол-3-фосфат + НАД + .

Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через митохонд-риальную мембрану . Внутри митохондрии другая (митохондриальная) глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент ) снова окисляет глицерол-3-фосфат до диоксиацетонфосфата:

Глицерол-3-фосфат + ФАД <=> Диоксиацетонфосфат + ФАДН 2 .

Восстановленный флавопротеин (фермент-ФАДН 2) вводит на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования , а диоксиаце-тонфосфат выходит из митохондрий в цитоплазму и может вновь взаимодействовать с цитоплазматическим НАДН + Н + . Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН + Н +), вводимая в дыхательную цепь с помощью глицеролфосфатного челночного механизма, дает не 3, а 2 АТФ .

Рис. 10.11. Малат-аспартатная челночная система для переноса восстанавливающих эквивалентов от цитозольного НАДН в митохондриальный матрикс. Объяснение в тексте.

В дальнейшем было показано, что с помощью данного челночного механизма лишь в скелетных мышцах и мозге осуществляется перенос восстановленных эквивалентов от цитозольного НАДН + Н + в митохондрии .

В клетках печени , почек и сердца действует более сложная малат-ас-партатная челночная система. Действие такого челночного механизма становится возможным благодаря присутствию малатдегидрогеназы и ас-партатаминотрансферазы как в цитозоле, так и в митохондриях .

Установлено, что от цитозольного НАДН + Н + восстановленные эквиваленты сначала при участии фермента малатдегидрогеназы (рис. 10.11) переносятся на цитозольный оксалоацетат. В результате образуется малат, который с помощью системы, транспортирующей дикарбоновые кислоты , проходит через внутреннюю мембрану митохондрии в матрикс. Здесь малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД + восстанавливается в НАДН + Н + , который может теперь передавать свои электроны в цепь дыхательных ферментов , локализованную на внутренней мембране митохондрии . В свою очередь образовавшийся оксалоацетат в присутствии глутамата и фермента АсАТ вступает в реакцию трансаминирования . Образующиеся аспарат и α-кетоглутарат с помощью специальных транспортных систем способны проходить через мембрану митохондрий .

Транспортирование в цитозоле регенерирует оксалоацетат, что вызывает к действию следующий цикл. В целом процесс включает легкообратимые реакции , происходит без потребления энергии, «движущей силой» его является постоянное восстановление НАД + в цитозоле гли-церальдегид-3-фосфатом, образующимся при катаболизме глюкозы .

Итак, если функционирует малат-аспартатный механизм, то в результате полного окисления одной молекулы глюкозы может образоваться не 36, а 38 молекул АТФ (табл. 10.1).

В табл. 10.1 приведены реакции , в которых происходит образование высокоэргических фосфатных связей в ходе катаболизма глюкозы , с указанием эффективности процесса в аэробных и анаэробных условиях

Министерство образования Российской федерации

Самарский Государственный технический университет

Кафедра «Органической химии»

Реферат на тему:

«ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦИКЛ КРЕБСА)»

Выполнил студент: III – НТФ – 11

Ерошкина Н.В.

Проверил.

Процессы анаэробного брожения служили главным источником энергии для всего живого в те времена, когда в атмосфере Земли еще не было кислорода. Его появление открыло принципиально новые возможности получения энергии. Кислород – хороший окислитель, а при окислении органических веществ выделяется в десятки раз больше энергии, чем в ходе брожения. Так, в ходе реакции окисления глюкозы C 6 H 12 O 6 + 6О 2 → 6Н 2 О + 6CО 2 выделяется энергии 686 ккал на моль, тогда как при реакции молочнокислого брожения только 47 ккал на моль.

Естественно, клетки стали использовать открывшиеся возможности. Синтез АТФ в аэробных условиях значительно эффективнее анаэробных синтезов: если при утилизации 1 молекулы глюкозы в процессах брожения образуется 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования – около 30 (по старым данным – 38). Подробнее мы поговорим об энергетическом балансе на уроке 12.

Окислительным превращениям подвергаются различные органические вещества – промежуточные метаболиты обмена аминокислот, сахаров, жирных кислот и др. Было бы нелогично создавать для каждого из них свой собственный метаболический путь. Гораздо удобнее сначала окислять все эти вещества одним, унифицированным окислителем, а затем уже окислять образовавшуюся восстановленную форму такого «универсального окислителя» кислородом. В качестве этого универсального окислительно-восстановительного промежуточного соединения в клетке используется никотинамидадениндинуклеотид – НАД; мы уже говорили об этом соединении на уроке 10. Как указывалось в 10-м уроке, это вещество может существовать в двух формах: окисленной НАД + и восстановленной НАД∙Н. Для превращения первой формы во вторую необходимо поступление двух электронов и одного иона Н + .

Система играет роль окислительно-восстановительного челнока, переносящего электроны от различных органических веществ к кислороду: на первой стадии НАД + отнимает электроны у органических веществ, окисляя их в конце концов до CО 2 и Н 2 О (разумеется, не в одну стадию, а через многочисленные промежуточные соединения); на второй стадии кислород окисляет НАД∙Н, образовавшийся в ходе первой стадии, и возвращает его вновь в окисленное состояние.

Итак, в самом общем виде совокупность реакций распада различных веществ в аэробных условиях (то есть в присутствии кислорода) можно представить так:

1)	органические соединения +
2)

Реакции первого этапа идут или в цитоплазме, или в митохондриях, тогда как реакции второго этапа – только в митохондриях. На этом уроке мы рассмотрим лишь реакции первой группы, реакции второй группы будут изучаться на 12-м уроке.

В клетке имеется еще один кофермент – ФАД (флавинадениндинуклеотид) – который тоже служит окислительно-восстановительным челноком, но используется в меньшем числе реакций, чем НАД; он синтезируется из витамина В 2 – рибофлавина.

Давайте рассмотрим конкретные метаболические пути – окислительные превращения глюкозы и жирных кислот. Аэробный гликолиз начинается с тех же реакций, что и уже рассмотренный нами анаэробный гликолиз (см. урок 10). Однако конечные стадии процесса будут протекать по-другому. При проведения анаэробного гликолиза перед клеткой стояла проблема: куда девать восстановленный НАД∙Н, образующийся в ходе глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназной реакции? Если его не окислять обратно в НАД + , то процесс быстро остановится, поэтому в анаэробном гликолизе последняя реакция – лактатдегидрогеназная – как раз и служила для возвращения этого кофермента в исходную форму. В аэробных условиях такой проблемы нет. Наоборот, в кислородном метаболизме НАД∙Н служит ценнейшим источником энергии – специальная система переносчиков доставляет его из цитозоля в митохондрии, где он окисляется, и за счет этой энергии синтезируется АТФ.

Когда гликолиз протекает в аэробных условиях, пировиноградная кислота не будет восстанавливаться, а будет транспортироваться в митохондрию и окисляться. Сначала она превратится в остаток уксусной кислоты, ацетил, ковалентно присоединенный к особому коферменту – так называемому коэнзиму А.

Эту необратимую реакцию проводит митохондриальный фермент пируватдегидрогеназа, который окисляет пировиноградную кислоту до ацетил-коэнзима А с освобождением углекислоты. Этот фермент содержит несколько коферментов, необходимых для его работы: тиаминпирофосфат (образуется из витамина В 1 – тиамина), липоевую кислоту (она иногда применяется в качестве укрепляющей здоровье пищевой добавки) и ФАД (про него мы уже писали выше). Это очень сложный белок, состоящий из многих субъединиц, его молекулярная масса составляет несколько миллионов дальтон.

Коэнзим А, к которому присоединяется ацетильный остаток, синтезируется из пантотеновой кислоты, также являющейся витамином (витамин В 5). Ацетил-коэнзим А является макроэргом, столь же богатым энергией, сколь и АТФ (см. урок 9).

Пируватдегидрогеназа играет важную роль в регуляции аэробного катаболизма глюкозы. Этот фермент ингибируется НАД∙Н и ацетил-КоА – своими конечными продуктами - по принципу отрицательной обратной связи. Регуляция осуществляется с помощью сложного механизма, включающего и аллостерию, и ковалентную модификацию этого белка. Данный фермент также ингибируется жирными кислотами. Жирные кислоты – более калорийный источник энергии, и кроме того, они менее ценны для проведения синтетических процессов в клетке, поэтому при наличии и глюкозы (ведь пируват образуется из нее), и жирных кислот целесообразно сперва окислять жирные кислоты.

Затем ацетил-коэнзим А будет окисляться до CО 2 и Н 2 О в ходе процесса, называемого циклом Кребса (в честь Г. Кребса, впервые описавшего его в 1937 г.).

Основная роль цикла Кребса в энергетическом обмене клетки состоит в получении восстановленных коферментов НАД∙Н и ФАД∙Н 2 , которые затем будут окисляться кислородом для синтеза АТФ из АДФ и фосфата (этот процесс мы рассмотрим на уроке 12). Восстановление коферментов достигается за счет полного окисления остатка уксусной кислоты до CО 2 и Н 2 О.

Цикл начинается с переноса остатка уксусной кислоты из ацетил-КоА к щавелевоуксусной кислоте (в нейтральной среде это ион оксалоацетата), в результате чего образуется лимонная кислота (точнее, цитрат-ион), а коэнзим А освобождается. Эта реакция катализируется ферментом цитратсинтазой, она необратима.

Участвующие на этом этапе органические кислоты имеют три карбоксильные группы, иногда и весь цикл называют «циклом трикарбоновых кислот», но это название неудачное – уже на следующей стадии одна карбоксильная группа теряется. Поэтому часто цикл называют «циклом трикарбоновых и дикарбоновых кислот».

В обоих случаях выделяется углекислота, окислитель НАД + восстанавливается до НАД∙Н, а укороченный остаток кислоты в ходе реакции присоединяется к коэнзиму А. Только пировиноградная кислота давала двухуглеродный остаток (ацетил-КоА), а вот α-кетоглютаровая дает четырехуглеродный – сукцинил-коэнзим А. α-кетоглютаратдегидрогеназная реакция так же необратима, как и пируватдегидрогеназная, а катализирующий ее фермент содержит те же коферменты.

Продукт реакции сукцинил-коэнзим А, столь же богат энергией, как и ацетил-коэнзим А. Было бы глупо рассеивать эту энергию в тепло, и клетка не допускает такого расточительства. Сукцинил-КоА не просто гидролизуется до янтарной кислоты (точнее, сукцинат-иона) и коэнзима А, в ходе этой реакции происходит синтез ГТФ из ГДФ и фосфата, а ГТФ так же макроэргичен, как АТФ.

Янтарная кислота подвергается дальнейшему окислению. Однако ее окислителем служит не привычный нам НАД + , а другой кофермент – ФАД. Природа использовала именно этот кофермент вовсе не для того, чтобы отравить жизнь студентам и школьникам, изучающим цикл Кребса. Дело в том, что в янтарной кислоте окислению подвергается весьма инертная группа –СН 2 –СН 2 –. Вспомните курс органической химии – алканы в общем-то малореакционноспособны по сравнению со спиртами и альдегидами, окислить их гораздо труднее. Вот и здесь клетка вынуждена использовать более сильный флавиновый окислитель, а не обычный никотинамидный. Янтарная кислота при этом превращается в фумаровую, реакцию ускоряет фермент сукцинатдегидрогеназа.

Последней реакцией цикла является окисление яблочной кислоты до щавелевоуксусной, окислителем служит хорошо знакомый нам НАД + , катализирует реакцию фермент малатдегидрогеназа.

Образовавшиеся НАД∙Н и ФАД∙Н 2 затем окисляются в митохондриях, обеспечивая энергией синтез АТФ. В цикле Кребса образуется также 1 молекула ГТФ, богатого энергией соединения, способного передать фосфатный остаток на АДФ и образовать АТФ. Молекула щавелевоуксусной кислоты выходит из цикла без всяких изменений – она служит как бы катализатором окисления ацетил-коэнзима А, а сама возвращается в исходное состояние в конце каждого оборота цикла. Ферменты цикла Кребса расположены в матриксе митохондрий (кроме сукцинатдегидрогеназы, она находится на внутренней митохондриальной мембране).

В цикле Кребса подвергаются регуляции сразу несколько ферментов. Изоцитратдегидрогеназа ингибируется НАД∙Н – конечным продуктом цикла, и активируется АДФ – веществом, образующимся при энергетических затратах. Важную роль в регуляции цикла играет также обратимость малатдегидрогеназной реакции. При высоких концентрациях НАД∙Н эта реакция протекает справа налево, в сторону образования малата. В результате концентрация оксалоацетата падает, и скорость цитратсинтазной реакции снижается. Образовавшийся малат может использоваться в других метаболических процессах. Цитратсинтаза еще и аллостерически ингибируется АТФ. Регулируется и активность α-кетоглютаратдегидрогеназы.

Цикл Кребса участвует в окислительных превращениях не только глюкозы, но также жирных кислот и аминокислот. После проникновения через наружную мембрану жирные кислоты сперва активируются в цитоплазме путем присоединения коэнзима А, при этом затрачиваются две макроэргические связи АТФ:

R–COOH + HS–KoA + АТФ = R–CO–S–KoA + АМФ + Ф–Ф.

Пирофосфат тут же расщепляется ферментом пирофосфатазой, смещая равновесие реакции вправо.

Ацил-коэнзим А затем переносится в митохондрию.

В этих органеллах действует ферментативная система так называемого β-окисления жирных кислот. Процесс β-окисления протекает поэтапно. На каждом этапе от жирной кислоты отщепляется двухуглеродный фрагмент в виде ацетил-коэнзима А, а также происходит восстановление НАД + до НАД∙Н и ФАД до ФАД∙Н 2 .

В ходе первой реакции происходит окисление группы –СН 2 -СН 2 –, расположенной около карбонильного атома углерода. Как и при окислении сукцината в цикле Кребса, окислителем служит ФАД. Затем (вторая реакция) происходит гидратация двойной связи образовавшегося непредельного соединения, при этом третий атом углерода становится гидроксилированным – образуется β-оксикислота, присоединенная к коэнзиму А. В ходе третьей реакции происходит окисление этой спиртовой группы до кетогруппы, в качестве окислителя используется НАД + . Наконец, с образовавшимся β-кетоацил-коэнзимом А реагирует другая молекула коэнзима А. В результате отщепляется ацетил-коэнзим А, и ацил-КоА укорачивается на два углеродных атома. Теперь циклический процесс будет протекать по второму заходу, остаток жирной кислоты укоротится еще на один ацетил-КоА, и так до полного расщепления жирной кислоты. Из четырех реакций β-окисления только первая является необратимой, остальные – обратимы, их прохождение слева направо обеспечивается постоянным выводом конечных продуктов.

Суммарно β-окисление пальмитоил-коэнзима А протекает согласно уравнению:

Ацетил-КоА затем поступает в цикл Кребса. НАД∙Н и ФАД∙Н 2 окисляются в митохондриях, обеспечивая энергией синтез АТФ.

Катаболизм аминокислот протекает также через цикл Кребса. Различные аминокислоты поступает в цикл различными метаболическими путями, их рассмотрение слишком сложно для данного курса.

Цикл Кребса используется клеткой не только для энергетических нужд, но и для синтеза целого ряда необходимых ей веществ. Он является центральным метаболическим путем и в катаболических, и в анаболических процессах клетки.

Сам Ганс Кребс сперва теоретически предположил, что превращения ди- и трикарбоновых кислот протекают циклически, а затем проделал серию опытов, в которых показал взаимопревращения этих кислот и их способность стимулировать аэробный гликолиз. Однако решительные доказательства протекания этого метаболического пути именно так, а не иначе, были получены с помощью экспериментов с изотопной меткой.

Представьте себе, что вы в определенном промежуточном метаболите цикла Кребса заменили обычный природный изотоп на радиоактивный. Теперь это вещество как бы несет на себе радиоактивную метку, и это позволяет отследить его дальнейшую судьбу. Такое меченое соединение можно добавить к клеточному экстракту и через некоторое время посмотреть, во что оно превратится. Для этого можно отделить небольшие молекулы от макромолекул (например, осаждением последних) и разделить их смесь хроматографическим методом (см. урок 8). Затем останется только определить, в каких веществах содержится радиоактивность. Например, если вы добавите к экстракту радиоактивно меченую лимонную кислоту, то очень скоро метка обнаружится в цис-аконитовой и изолимонной кислоте, а еще через некоторое время – в α-кетоглютаровой. Если же добавить меченую α-кетоглютаровую кислоту, то метка раньше всего перейдет в сукцинил-коэнзим А и янтарную кислоту, потом – в фумаровую. Таким образом, добавляя различные радиоактивно меченые вещества и определяя, куда перешла радиоактивная метка, можно выяснить последовательность реакций на любом этапе метаболическом пути.

Определять радиоактивность можно различными путями. Самый простой способ – по засвечиванию фотографической эмульсии, ведь сама радиоактивность была открыта А. Беккерелем именно благодаря способности радиоактивного излучения засвечивать фотопластинку. Например, если мы разделили смесь веществ тонкослойной хроматографией и знаем, где расположено пятно того или иного вещества, то можно просто приложить к нашей хроматограмме фотопластинку. Тогда участок фотопластинки, соприкасавшийся с пятном, содержащим радиоактивность, окажется засвеченным. Остается только посмотреть, около пятен каких веществ фотоэмульсия засветилась, и сразу же можно сказать, что именно в эти вещества перешла радиоактивная метка.

Этот метод называется радиоавтографией . С его помощью можно изучать не только малые молекулы, но и крупные – например, добавив к живой клетке радиоактивно меченый уридин. Как мы уже говорили на 7-м уроке, уридиновые нуклеотиды входят в состав РНК, так что вскоре эта макромолекула будет радиоактивно помечена. Теперь можно отслеживать местонахождение и транспортировку РНК в клетке. Для этого нужно зафиксировать клетки, чтобы макромолекулы выпали в осадок и не уплыли при дальнейших процедурах, залить их фотоэмульсией и через некоторое время посмотреть в микроскоп, где появились засвеченные участки.

Радиоавтография позволяет непосредственно наблюдать за судьбой молекул в клетке. Однако у метода есть и недостаток – он дает лишь качественную характеристику наличия радиоактивной метки и не позволяет измерить ее количественно. Для точных количественных измерений используется другой способ. β-частицы, вылетающие из радиоактивных изотопов, вызывают свечение особых веществ – сцинтилляторов. Интенсивность этого свечения можно точно измерить с помощью специального прибора – сцинтилляционного счетчика. Точно измерив свечение, мы можем точно определить и количество радиоактивного изотопа. Однако использование сцинтилляционного счетчика позволяет измерить лишь общее количество радиоактивного изотопа в пробе. Если мы зальем раствором сцинтиллятора клеточную суспензию, то сможем определить суммарное количество радиоактивного соединения, но не его распределение по органеллам. Для этого нам придется выделять отдельные клеточные органеллы и измерять радиоактивность в них.

Обычно в биохимических исследованиях применяют такие изотопы как тритий 3 Н, углерод 14 С, фосфор 32 Р и серу 35 S.

Основная масса химической энергии углерода высвобождается в аэробных условиях при участии кислорода. Цикл Кребса называют еще циклом лимонной кислоты, или клеточным дыханием. В расшифровке отдельных реакций этого процесса приняли участие многие ученые: А. Сент-Дьердьи, А. Ленинджер, X. Кребс, именем которого назван цикл, С. Е. Северин и другие.

Между анаэробным и аэробным расщеплением углеводов существует тесная коррелятивная связь. Прежде всего, она выражается в наличии пировиноградной кислоты, которой завершается анаэробное расщепление углеводов и начинается клеточное дыхание (цикл Кребса). Обе фазы катализируются одними и теми же ферментами. Химическая энергия высвобождается при фосфорилировании, резервируется в виде макроэргов АТФ. В химических реакциях участвуют одни и те же коферменты (НАД, НАДФ) и катионы. Различия заключаются в следующем: если анаэробное расщепление углеводов преимущественно локализовано в гиалоплазме, то реакции клеточного дыхания проходят в основном в митохондриях.

При некоторых условиях наблюдается антагонизм между обеими фазами. Так, при наличии кислорода гликолиза резко уменьшается (эффект Пастера). Продукты гликолиза могут тормозить аэробный обмен углеводов (эффект Крэбтри).

Цикл Кребса имеет целый ряд химических реакций, в результате которых продукты расщепления углеводов окисляются до диоксида углерода и воды, а химическая энергия аккумулируется в макроэргических соединениях. Во время образуется «носитель» - щавелевоуксусная кислота (ЩОК). В дальнейшем происходит конденсация с «носителем» активированного остатка уксусной кислоты. Возникает трикарбоновая кислота - лимонная. В ходе химических реакций происходит «оборот» остатка уксусной кислоты в цикле. Из каждой молекулы пировиноградной кислоты образуется восемнадцать молекул аденозинтрифосфатной кислоты. В конце цикла высвобождается «носитель», который вступает в реакцию с новыми молекулами активированного остатка уксусной кислоты.

Цикл Кребса: реакции

Если конечным продуктом анаэробного расщепления углеводов является молочная кислота, то под влиянием лактатдегидрогеназы она окисляется до пировиноградной кислоты. Часть молекул пировиноградной кислоты идет на синтез «носителя» ЩОК под влиянием фермента пируваткарбоксилазы и при наличии ионов Mg2 +. Часть молекул пировиноградной кислоты является источником образования «активного ацетата» - ацетилкоэнзима А (ацетил-КоА). Реакция осуществляется под влиянием пируватдегидрогеназы. Ацетил-КоА содержит в которой аккумулируется около 5-7 % энергии. Основная масса химической энергии образуется в результате окисления «активного ацетата».

Под влиянием цитратсинтетазы начинает функционировать собственно Цикл Кребса, что приводит к образованию цитратной кислоты. Эта кислота под влиянием аконитат-гидратазы дегидрируется и превращается в цис-аконитовую кислоту, которая после присоединения молекулы воды переходит в изолимонную. Между тремя трикарбоновыми кислотами устанавливается динамическое равновесие.

Изолимонная кислота окисляется до щавелевоянтарной, которая декарбоксилируется и превращается в альфа-кетоглутаровую кислоту. Реакция катализируется энзимом изоцитратдегидрогеназой. Альфа-кетоглутаровая кислота под влиянием энзима 2-оксо-(альфа-кето)-глутаратдегидрогеназы декарбоксилируется, в результате чего образуется сукцинил-КоА, содержащий макроэргическую связь.

На следующей стадии сукцинил-КоА под действием фермента сукцинил-КоА-синтетазы передает макроэргическую связь ГДФ (гуанозиндифосфатной кислоте). ГТФ (гуанозинтрифосфатная кислота) под влиянием энзима ГТФ-аденилаткиназы отдает макроэргическую связь АМФ (аденозинмонофосфатной кислоте). Цикл Кребса: формулы - ГТФ+АМФ - ГДФ+АДФ.

Под воздействием энзима сукцинатдегидрогеназы (СДГ) окисляется до фумаровой. Коферментом СДГ является флавинадениндинуклеотид. Фумарат под влиянием фермента фумаратгидратазы превращается в яблочную кислоту, которая в свою очередь окисляется, образуя ЩОК. При наличии в реагирующей системе ацетил-КоА ЩОК снова включается в цикл трикарбоновых кислот.

Итак, из одной молекулы глюкозы образуется до 38 молекул АТФ (две - за счет анаэробного гликолиза, шесть - в результате окисления двух молекул НАД·Н+Н+, которые образовались во время гликолитической оксиредукции, и 30 - за счет ЦТК). Коэффициент полезного действия ЦТК равен 0,5. Остальная энергия рассеивается в виде теплоты. В ЦТК окисляется 16-33 % лактатной кислоты, остальная ее масса идет на ресинтез гликогена.

Цикл трикарбоновых кислот - он же цикл Кребса, поскольку существование такого цикла было предположено Гансом Кребсом в 1937 году.
За это спустя 16 лет он был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине. Значит, открытие весьма значительное. В чём же смысл этого цикла и почему он так важен?

Как ни крути, все равно придётся начать довольно-таки издалека. Если вы взялись читать эту статью, то хотя бы понаслышке знаете, что основной источник энергии для клеток - это глюкоза. Она постоянно присутствует в крови в практически неизменной концентрации - для этого существуют специальные механизмы, запасающие или высвобождающие глюкозу.

Внутри каждой клетки находятся митохондрии - отдельные органеллы ("органы" клетки), перерабатывающие глюкозу для получения внутриклеточного источника энергии - АТФ. АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) универсальна и очень удобна в использовании, как источник энергии: она напрямую встраивается в белки, обеспечивая их энергией. Самый простой пример - это белок миозин, благодаря которому мышцы способны сокращаться.

Глюкозу невозможно превратить в АТФ, несмотря на то, что в ней содержится большое количество энергии. Как извлечь эту энергию и направить в нужное русло, не прибегая к варварским (по клеточным меркам) средствам типа сжигания? Надо использовать обходные пути, благо ферменты (белковые катализаторы) позволяют некоторым реакциям протекать гораздо быстрее и эффективнее.

Первый этап - это превращение молекулы глюкозы в две молекулы пирувата (пировиноградной кислоты) или лактата (молочной кислоты). При этом выделяется небольшая часть (примерно 5%) той энергии, что запасена в молекуле глюкозы. Лактат получается при анаэробном окислении - то есть в отсутствие кислорода. Также есть способ превращения глюкозы в анаэробных условиях в две молекулы этанола и углекислый газ. Это называется брожением, и этот способ мы рассматривать не будем.


...Так же как не будем мы рассматривать подробно сам механизм гликолиза, то есть расщепления глюкозы в пируват. Поскольку, цитируя Леинджера, "Превращение глюкозы в пируват катализируется десятью ферментами, действующими последовательно". Желающие могут открыть учебник по биохимии и подробно ознакомиться со всеми стадиями процесса - он изучен очень хорошо.

Казалось бы, путь от пирувата до углекислого газа должен быть довольно простым. Но оказалось, что он осуществляется посредством девятистадийного процесса, который и называется циклом трикарбоновых кислот. Это кажущееся противоречие с принципом экономии (неужели нельзя было проще?) отчасти объясняется тем, что цикл связывает между собой несколько метаболических путей: вещества, образующиеся в цикле, являются прекурсорами других молекул, уже не имеющих отношения к дыханию (например, аминокислот), а любые другие соединения, подлежащие утилизации, в итоге попадают в цикл и либо "сгорают" для получения энергии, либо перерабатываются в те, которые находятся в недостатке.

Первая стадия, которая традиционно рассматривается в отношении к циклу Кребса - это окислительное декарбоксилирование пирувата в ацетильный остаток (Acetyl-CoA). CoA, если кто не знает - это кофермент А, имеющий в своём составе тиольную группу, на которой он может переносить ацетильный остаток.


Расщепление жиров тоже приводит к ацетилам, которые также вступают в цикл Кребса. (Синтезируются они аналогично - из Acetyl-CoA, что объясняет тот факт, что в жирах почти всегда присутствуют только кислоты с чётным числом атомов углерода).

Ацетил-КоА конденсируется с молекулой оксалоацетата, давая цитрат. При этом высвобождается кофермент А и молекула воды. Эта стадия необратима.

Цитрат дегидрируется в цис-аконитат - вторую трикарбоновую кислоту в цикле.

Цис-аконитат присоединяет обратно молекулу воды, превращаясь уже в изолимонную кислоту. Эта и предыдущая стадии обратимы. (Ферменты катализируют как прямую, так и обратную реакции - вы же знаете, да?)

Изолимонная кислота декарбоксилируется (необратимо) и одновременно окисляется, давая кетоглутаровую кислоту. При этом NAD+, восстанавливаясь, превращается в NADH.

Следующая стадия - окислительное декарбоксилирование. Но при этом образуется не сукцинат, а сукцинил-КоА, который на следующей стадии гидролизуется, направляя высвобождающуюся энергию на синтез АТФ.

При этом образуется ещё одна молекула NADH и молекула FADH2 (кофермент, отличный от NAD, который однако так же может окисляться и восстанавливаться, запасая и отдавая энергию).

Выходит, что оксалоацетат работает как катализатор - он не накапливается и не расходуется в процессе. Так и есть - концентрация оксалоацетата в митохондриях поддерживается довольно низкой. А как избежать накопления других продуктов, как согласовать между собой все восемь стадий цикла?

Для этого, как оказалось, существуют специальные механизмы - своего рода отрицительная обратная связь. Как только концентрация какого-то продукта растёт выше нормы, это блокирует работу фермента, ответственного за его синтез. А для обратимых реакций всё ещё проще: при превышении концентрации продукта реакция просто начинает идти в обратную сторону.

И ещё пара мелких замечаний

Каждому известно, что для нормальной работы организм нуждается в регулярном поступлении целого ряда питательных веществ, которые нужны для здорового метаболизма и, соответственно, баланса процессов выработки и расходования энергии. Процесс выработки энергии, как известно, протекает в митохондриях, которые благодаря этой особенности и получили название энергетических центров клеток. А последовательность химических реакций, которая позволяет получить энергию для работы каждой клеточки тела, называется циклом Кребса.

Цикл Кребса - чудеса, которые происходят в митохондриях

Энергия, получаемая посредством цикла Кребса (также ЦТК - цикл трикарбоновых кислот), идет на нужды отдельных клеток, которые в свою очередь составляют различные ткани и, соответственно, органы и системы нашего организма. Поскольку без энергии организм попросту не может существовать, митохондрии постоянно работают над тем, чтобы бесперебойно поставлять в клетки необходимую им энергию.

Аденозин трифосфат (АТФ) - именно это соединение является универсальным источником энергии, необходимым для протекания всех биохимических процессов в нашем организме.

ЦТК - это центральный метаболический путь, в результате которого завершается окисление метаболитов:

• жирных кислот;
• аминокислот;
• моносахаридов.

В процессе аэробного распада эти биомолекулы расщепляются на меньшие молекулы, которые используются для получения энергии или синтеза новых молекул.

Цикл трикарбоновых кислот состоит из 8 этапов, т.е. реакций:

1. Образование лимонной кислоты:

2. Образование изолимонной кислоты:

3. Дегидрирование и прямое декарбоксилирование изолимонной кислоты.

4. Окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты

5. Субстратное фосфорилирование

6. Дегидрирование янтарной кислоты сукцинат-дегидрогеназой

7. Образование яблочной кислоты ферментом фумаразой

8. Образование оксалацетата

Таким образом, после завершения реакций, которые составляют цикл Кребса:

• одна молекула ацетил-КоА (образованная в результате распада глюкозы) окисляется до двух молекул углекислого газа;
• три молекулы NAD восстанавливаются до NADH;
• одна молекула ФАД восстанавливается до ФАДН 2 ;
• образуется одна молекула ГТФ (эквивалент АТФ).

Молекулы НАДН и ФАДН 2 действуют как переносчики электронов и используются для образования АТФ на следующей стадии метаболизма глюкозы - окислительном фосфорилировании.

Функции цикла Кребса:

• катаболическая (окисление ацетильных остатков топливных молекул до конечных продуктов обмена);
• анаболическая (субстраты цикла Кребса - основа для синтеза молекул, в т.ч. аминокислот и глюкозы);
• интегративная (ЦТК - связующее звено между анаболическими и катаболическими реакциями);
• водорододонорная (поставка 3 НАДН.Н + и 1 ФАДН 2 на дыхательную цепь митохондрий);
• энергетическая.

Недостаток элементов, необходимых для нормального протекания цикла Кребса, может привести к серьезным проблемам в организме, связанным с нехваткой энергии.

Благодаря метаболической гибкости организм способен использовать в качестве источника энергии не только глюкозу, но и жиры, расщепление которых также дает молекулы, образующие пировиноградную кислоту (задействуется в цикле Кребса). Таким образом, протекающий надлежащим образом ЦТК обеспечивает получение энергии и строительных блоков для образования новых молекул.