Центрифугирование Это разделение механических смесей на составные части
действием центробежной силы. Приборы, применяемые для этой
цели, называют центрифугами.
Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в
нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с
большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по
величине центробежные силы, под действием которых
происходит разделение механических смесей, например
осаждение взвешенных в жидкости частиц.

Процессы, происходящие в центрифуге

В центрифугах разделяют следующие процессы:
1)Центробежное фильтрование.
2)Центробежное отстаивание.
3)Центробежное осветление.

Центробежное фильтрование

Центробежное фильтрование представляет собой
процесс разделения суспензий в центрифугах с
дырчатыми барабанами. Внутренняя поверхность
такого барабана покрыта фильтровальной тканью.
Суспензия центробежной силой отбрасывается к
стенкам барабана, при этом твёрдая фаза остаётся на
поверхности ткани, а жидкость под действием
центробежной силы проходит сквозь слой осадка и
ткань удаляется наружу через отверстия в барабане.
Центробежное фильтрование обычно складывается из
трёх последовательных физических процессов:
1)фильтрование с образованием осадка;
2)уплотнение осадка;
3)удаление из осадка жидкости, удерживаемой
молекулярными силами;

Центробежное отстаивание

Центробежное отстаивание
Центробежное отстаивание - процесс разделения
суспензий в центрифугах, имеющих барабаны со
сплошными стенками. Суспензия вводится в нижнюю
часть барабана и под действием центробежной силы
отбрасывается к стенкам. У стенок образуется слой
осадка, а жидкость образует внутренний слой и
вытесняется из барабана поступающей на разделение
суспензией. Жидкость при этом поднимается кверху,
переливается через закраину барабана и удаляется
наружу.
При этом происходит два физических процесса:
1)Осаждение твёрдой фазы.
2)Уплотнение осадка.

Центробежное осветление

Центробежное осветление - процесс разделения
тонких суспензий и коллоидных растворов. Так
же проводится в сплошных барабанах.
По физической сущности центробежное
осветление представляет собой процесс
свободного осаждения твёрдых частиц в поле
центробежных сил.
В барабанах со сплошными стенками
производится так же разделение эмульсий. Под
действием центробежной силы компоненты
эмульсии в соответствии с плотностью
располагаются в виде разграниченных слоев:
наружного слоя жидкости с большей плотностью
и внутреннего слоя более лёгкой жидкости.
Жидкости выводятся из барабана порознь.

В клинических и санитарногигиенических лабораториях
центрифугирование используют
для отделения эритроцитов от
плазмы крови, сгустков крови от
сыворотки, плотных частиц от
жидкой части мочи и т. д. Для
этой цели применяют или
ручные центрифуги, или
центрифуги с электроприводом,
скорость вращения которых
можно регулировать.
Ультрацентрифуги, скорость
вращения роторов которых
превышает 40 000 об/мин,
применяют обычно в
экспериментальной практике
для разделения органелл
клеток, отделения коллоидных
частиц, макромолекул,
полимеров.

Использование центрифугирования в паразитологии

Метод используется для дифференцировки сложной
кровяной смеси, мочи или кала, с последующим
выделением из нее гельминтов для дальнейшего
изучения под микроскопом и фиксации материала. В
процессе центрифугирования имеющиеся в пробе
паразиты проходят через фильтр и скапливаются в
нижнем коническом отсеке пробирки. Сетка фильтра
со специально подобранными по размеру ячейками
в пробирке расположена вертикально, в результате
чего происходит горизонтальная (латеральная)
фильтрация пробы. В результате чего, грубые
частицы непереваренной пищи, клетчатка оседают в
смесительной камере, а паразиты и их яйца
беспрепятственно проходят через фильтр. Таким
образом, паразиты концентрируются в
поверхностном слое мелкодисперсного осадка, и
врачу-лаборанту остается только аккуратно отобрать
образец для микроскопирования с помощью
автоматической пипетки и нанести его на
предметное стекло.

Метод центрифугирования в цитологии

Метод дифференциального
центрифугирования используется для
фракционирования клеток, т. е. расслоения их
содержимого на фракции в зависимости от удельного
веса различных органоидов и клеточных включений.
Для этого тонко измельченные клетки вращают в
специальном аппарате – ультрацентрифуге. В
результате центрифугирования компоненты клеток
выпадают в осадок из раствора, располагаясь в
соответствии со своей плотностью. Более плотные
структуры осаждаются при более низких скоростях
центрифугирования, а менее плотные – при высоких
скоростях. Полученные слои разделяют и изучают
отдельно.

10. Центрифугирование в ботанике и физиологии растений

Центрифугирование позволяет получить различные
фракции субклеточных частиц и исследовать
свойства и функции каждой фракции в
отдельности. Например, из листьев шпината можно
выделить хлоропласты, отмыть их с помощью
повторного центрифугирования в соответствующей
среде от клеточных фрагментов и исследовать их
поведение в различных экспериментальных
условиях или же определить их химический состав.
Далее можно, применяя различные модификации
методики, разрушить эти пластиды и выделить
посредством
дифференциального центрифугирования (повторно
го осаждения частиц при различных величинах
ускорения) составляющие их элементы. Таким
путем удалось показать, что пластиды содержат
структуры, отличающиеся очень упорядоченным
строением, - так называемые граны; все граны
находятся внутри ограничивающей хлоропласт
мембраны (оболочка хлоропласта). Достоинства
этого метода просто неоценимы, поскольку он
позволяет выявить существование
функциональных субъединиц, входящих в состав
более крупных субклеточных частиц; в частности,
используя метод

11. Метод центрифугирования в вирусологии

Метод центрифугирования в градиенте плотности Брак-ке можно
использовать как для выделения, так и для получения
количественных характеристик вирусов растений. Как оказалось,
этот метод таит в себе многие возможности и в настоящее время
широко используется в области вирусологии и молекулярной
биологии. При проведении исследований методом
центрифугирования в градиенте плотности центрифужную пробирку
частично наполняют раствором, плотность которого уменьшается в
направлении от дна к мениску. Для создания градиента при
фракционировании вирусов растений наиболее часто используют
сахарозу. Перед началом центрифугирования частицы вируса могут
быть либо распределены во всем объеме раствора, либо нанесены на
вершину градиента. Бракке предложил три различных приема
центрифугирования в градиенте плотности. При изопикпическом
(равновесном) центрифугировании процесс продолжается до тех пор,
пока все частицы в градиенте не достигнут уровня, где плотность
среды равна их собственной плотности. Таким образом,
фракционирование частиц происходит в этом случае в соответствии с
различиями в их плотности. Растворы сахарозы не обладают
достаточной плотностью для изопикнического разделения многих
вирусов. При скоростном зональном центрифугировании вирус
сначала наносят па предварительно созданный градиент. Частицы
каждого типа седиментируют при, этом через градиент в виде зоны,
или полосы, со скоростью, зависящей от их размера, формы и
плотности. Центрифугирование при этом заканчивают, когда частицы
еще продолжают седиментировать. Равновесное зональное
центрифугирование сходно со скоростным зональным
центрифугированием, по в этом случае центрифугирование

12. Трудности в использовании метода центрифугирования

Применение метода дифференциального центрифугирования
сопряжено со многими методическими трудностями. Во первых, при
выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому
потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток,
которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных
фракций. Во вторых, поскольку субклеточные частицы обладают
мембранами, в процессе их выделения могут возникать
разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того
чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена
еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав
среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение
частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц
(ресуспендирование их в среде и последующее повторное
центрифугирование) может приводить к потере некоторых
содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии
переходят в раствор.
В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул
действительно являются элементами исследуемых структур, а какие
просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения.
Такое положение затрудняет точное определение некоторых
функциональных свойств выделенных объектов.

Метод центрифугирования основан на различном поведении частиц в центробежном поле, создаваемом центрифугой. Образец, находящийся в сосуде для центрифугирования, помещают в ротор, который приводится в движение приводом центрифуги. Для разделения смеси частиц необходимо выбрать набор условий, таких как скорость вращения, время центрифугирования и радиус ротора. Для сферических частиц скорость осаждения (седиментации) зависит не только от ускорения, но и от радиуса и плотности частиц, а так же от вязкости среды, в которой производится осаждение образца.

Центрифугирование можно разделить на два вида: препаративное и аналитическое. Препаративное центрифугирование используется в случае, когда необходимо выделить часть образца для дальнейших исследований. Этот метод применяется для выделения клеток из суспензии, биологических макромолекул и т.д.

Аналитическое центрифугирование применяется для изучения поведения биологических макромолекул в центробежном поле. Данный метод позволяет получать данные о массе, форме и размерах молекул, находящихся в относительно небольших объемах образца. В повседневной практике работы в лаборатории чаще всего встречается препаративное центрифугирование.

Препаративные лабораторные центрифуги , в свою очередь, подразделяются на группы по назначению: препаративные ультрацентрифуги, центрифуги общего назначения и скоростные центрифуги. Центрифуги общего назначения имеют самое большое практическое применение в медицинских лабораториях, имеют максимальную скорость до 6 тысяч об/мин. Основной особенностью данного вида приборов является их относительно большая емкость – до 6 литров, что позволяет использовать для центрифугирования не только центрифужные пробирки объемом до 100 мл, но и емкости до 1.25 литра. Во всех центрифугах общего назначения роторы жестко крепятся на валу привода, поэтому центрифугируемые емкость должны быть довольно точно уравновешены. Чтобы избежать поломки, не следует загружать в ротор нечетное количество пробирок, при неполной загрузке емкость следует размещать друг напротив друга.

Скоростные центрифуги имеют предельную скорость 25 тыс. об/мин и ускорение до 89 тыс g. Камеру, в которой находится ротор и центрифугирумеые образцы, оснащают системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего от трения при вращении ротора на больших скоростях. Обычно, такие центрифуги могут работать с объемом до 1.5 литра и оснащаются угловыми роторами или роторами со сменными стаканами.

Препаративные ультрацентрифуги разгоняются до 75000 об/мин и имеют максимальное центробежное ускорение 510 тыс g. Их оснащают холодильной и вакуумной установками, для предотвращения перегрева ротора от трения о воздух. Роторы для этих центрифуг изготавливают из высокопрочных титановых или алюминиевых сплавов. Вал ультрацентрифуг, в отличие от скоростных и препаративных, делается гибким для уменьшения вибрации при нарушении равновесия ротора. Емкости в роторе должны быть тщательно уравновешены с точностью до одной десятой грамма.

Помимо фильтрования, разделение смеси жидкого и твердого веществ возможно также путем центрифугирования, т. е. разделения веществ в приборах, называемых центрифугами.

Применение центрифуги основано на использовании центробежной силы . При быстром вращении (центрифугировании) взвешенные в жидкости твердые частицы (с большей" плотностью, чем плотность жидкости) под дейт ствием развивающейся при вращении центробежной силы отбрасываются от центра и таким путем отделяются от жидкости.

Рис. 407. Аппарат Тиссена для микроаналитических работ

Рис. 408. Ручная центрифуга

Центрифуги бывают: открытые и закрытые, с ручным и механическим приводом. Основной частью открытой ручной центрифуги (рис. 408) является вертикально поставленная вращающаяся ось, перпендикулярно которой на верхнем конце ее прикреплена планка с подвижно укрепленными двумя (или четырьмя) металлическими,гильзами. В эти гильзы вставляют специальные сужен-, ные книзу пробирки (рис. 409) с жидкостью, из которой нужно удалить взвешенные частицы,

На дно гильзы кладут кусочек ваты, «чтобы избежать прямого соприкосновения стекла с металлом. Когда пробирки вставлены в гильзы, центрифугу приводят в движение и через некоторое время (зависящее от вязкости жидкости, размеров взвешенных частиц и разности плотностей) происходит отделение взвешенных твердых частиц от жидкости, после чего центрифугу останавливают. На дне пробирки собирается плотный осадок твёрдого вещества, над которым находится чистая жидкость.

Закрытые центрифуги (рис. 410) в зависимости от величины содержат различное количество гильз, от 2 до 12 и больше, расположенных симметрично на одинаковом расстоянии друг от друга и от оси центрифуги.

Механические закрытые центрифуги (рис. 410, б) более удобны, чем ручные (рис. 410, а). Они дают обычно 2000- 3000 об/мин, позволяют достигнуть более совершенного разделения жидкости и твердого вещества.

Пробирки для центрифуг после наполнения жидкостью должны иметь одинаковую массу. Там, где центрифугой приходится пользоваться часто, рекомендуется иметь специальные весы, приспособленные для взвешивания (вернее, тарирования) пробирок. В указанных весах чашки подвешивают к коромыслу при помощи стержней, прикрепленных к центру чашек. На этих стержнях имеются кольца, в которые вставляют пробирки.

Укрепив пробирки, сперва наливают жидкость, подлежащую центрифугированию, в одну пробирку (при помощи, например, пипетки), а затем во вторую, добиваясь уравновешивания чашек.

Никогда не следует наливать в пробирки слишком много жидкости; пробирки наполняют так, чтобы расстояние от края до уровня жидкости было не меньше 10 мм.

Когда нужно уравновесить много пробирок, целесообразно применять следующий прием. Уравновесив первую пару пробирок, одну из них вынимают и помещают в гнездо центрифуги, а другую оставляют на весах; эта последняя пробирка будет служить эталоном для остальных в освободившееся на весах место вставляют другую пробирку, уравновешивают с эталоном и убирают. Целесообразно также предварительно наполнить пробирки (взяв количество жидкости несколько меньше, нужного) и уже при уравновешивании добавлять необходимое количество жидкости. Такой прием ускоряет работу.

Рис. 409. Пробирки для центрифуг.

Уравновешенные пробирки вставляют в гнезда центрифуги.

Центрифугу следует пускать не сразу на полный ход, а постепенно. Это относится как к ручным, так и к ме* ханическим центрифугам.

Рис. 410. Закрытые центрифуги: а - с ручным приводом; б - с электромотором.

Механические центрифуги для регулирования ско--рости имеют соответствующие приспособления. Так, электрические центрифуги снабжены реостатами для постепенного включения на полное число оборотов. У центрифуг, приводимых в движение от водяной турбины, постепенность нарастания скорости движения достигается регулированием струи воды. Чем осторожнее было проведено включение, тем надежнее работает центрифуга.

За центрифугой следует постоянно наблюдать; недопустимо загрязнение ее, в особенности движущихся частей. Металлические гильзы должны легко и свободно поворачиваться. Шестерни, приводящие во вращение центрифугу, должны иметь легкий ход; их нельзя смазывать такими смазками, которые могут загустеть. Ось центрифуги также должна быть в порядке и всегда чистой.

При неосторожном обращении с центрифугами, особенно ручными, можно согнуть ось и этим вывести.центрифугу из строя.

После выключения центрифуге дают остановиться самор и только после этого вынимают пробирки.

В последнее время начинают приобретать все большее распространение так называемые суперцентрифуги, дающие до 40 000 об/мин (рис. 411).

Рис. 411 суперцентрифуга

Такие центрифуги особенно удобны для центрифугирования всякого рода вязких растворов, например лаков, тонких дисперсий, а также эмульсий.

Жидкость, подлежащая суперцен-трифугированию, поступает в патрубок1, расположенный в Нижней части аппарата. Затем жидкость выливается в рабочий цилиндр 2, вращающийся со скоростью до 40 ООО об/мин, в котором происходит отделение бйлее тяжелых частиц, взвешенных в жидкости. Жидкость постепенно поднимается по цилиндру 2 вверх до разделителя 5, и если разрушают эмульсию, то более легкая жидкость вытекает по стоку 8, а более тяжелая - по стоку 4. При отделении твердых частиц с плотностью больше единицы жидкость вытекает по стоку 3. На внутренней стенке рабочего цилиндра откладыкается отделяемый твердый осадок. Суперцентрифуга. Время от времени суперцентрифугу останавливают, извлекают рабочий цилиндр 2, очищают его от осддка и, снова поставив на место, продолжают работу. Весь процесс очистки рабочего цилиндра, от момента остановки до момента нового пуска суперцентрифуги, занимает не более 15 мин. Если приходится очищать сравнительно большие количества жидкости, то пользуются тремя8 суперцентрифугами: одна - работает, Другую - очищают, третья - в резерве,

Центрифугирование - это разделение механических смесей на составные части действием центробежной силы. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.

Центрифуги: 1 - ручная: 2 - с электроприводом.

В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения от плазмы крови, от , плотных частиц от жидкой части мочи и т. д. Для этой цели применяют или ручные центрифуги (рис., 1), или центрифуги с электроприводом, скорость вращения которых можно регулировать (рис., 2).

Ультрацентрифуги, скорость вращения роторов которых превышает 40 000 об/мин, применяют обычно в экспериментальной практике для разделения органелл клеток, отделения коллоидных частиц, макромолекул и т. д.

Центрифугирование - это разделение грубодисперсных систем, состоящих из жидких и твердых компонентов с разными плотностями, при помощи специальных аппаратов, называемых центрифугами. Принцип действия центрифуги основан на создании большой центробежной силы, под влиянием которой скорость разделения компонентов смеси, помещенной в центрифугу, увеличивается во много раз по сравнению со скоростью разделения их под действием силы тяжести.

Метод центрифугирования широко применяется в биологии, медицине и технике, нередко заменяя процессы фильтрования, отстаивания и отжимания.

Центрифуга имеет корпус, механизм привода, ротор, рабочую (ограждающую) камеру и панель управления. Некоторые центрифуги снабжены электрочасами, обеспечивающими автоматическое выключение и торможение в диапазоне от 5 до 60 мин. Специальные центрифуги имеют холодильные и вакуумные установки с приборами слежения и автоматического управления. Основная часть любой центрифуги - ротор (в лабораторных центрифугах он обычно располагается на вертикально установленном валу электродвигателя или вращается посредством различных передач от вала двигателя, иногда даже вручную). Ротор центрифуги представляет собой диск (крестовину) с шарнирно закрепленными гнездами для металлических гильз, в которых помещаются пробирки, принимающие при вращении горизонтальное положение.

Иногда ротор делают в виде сплошного металлического усеченного конуса с ячейками для пробирок (угловой ротор); пробирки в нем располагаются под постоянным углом к оси вращения (обычно в 40°). При наклонном положении пробирок происходит расслоение компонентов смеси более быстро. Разделение смеси ведется в пробирках самой разнообразной формы и объема (рис. 1). При работе на больших скоростях используют пробирки из полиэтилена, так как стеклянные лопаются. Расположенные в роторе одна против другой пробирки с обрабатываемым материалом должны быть уравновешены. Этим осуществляется равномерная нагрузка на вал ротора и обеспечивается равномерное вращение вала центрифуги. Для уравновешивания пробирок применяют особые весы (рис. 2).

Рис. 1. Пробирки для центрифугирования.

Рис. 2. Центрифужные весы.

Центрифуги, применяемые в промышленности, отличаются от лабораторных более сложным устройством ротора, позволяющим центрифугировать большое количество материала одновременно или же вести процессы разделения непрерывно.

Центрифуги с небольшой скоростью вращения ротора употребляются в медицине для отделения осадков мочи, сыворотки крови от сгустков, осаждения эритроцитов, при серологических исследованиях и т. д.

Микроцентрифуга (рис. 4) приводится в действие вручную; оборудована двумя сменными насадками, одна из которых имеет гнезда для микропробирок и применяется при определении совместимости крови; другая - с гнездом для вкладывания градуированной микропипетки (гематокрит) - предназначается для определения процентного содержания форменных элементов крови.

Рис. 3. Ручная центрифуга.

Рис. 4. Микроцентрифуга.

Ручная центрифуга (рис. 3) имеет четыре металлические или пластмассовые гильзы для пробирок по 15 мл.

Лабораторная клиническая центрифуга ЦЛК-1 (рис. 5, 7)имеет три скорости вращения (1000, 1500, 3000 об/мин). Ротор-крестовина приспособлен для 12 обычных центрифужных пробирок. Наибольший объем центрифугируемой жидкости - 150 мл.

Центрифуги с большой скоростью вращения ротора в большинстве случаев снабжены сменными роторами, рассчитанными на различные объемы жидкости, и применяются для разделения тонкодисперсных взвесей.

Лабораторная настольная центрифуга ЦЛН-2 (рис. 5, 2) имеет угловой ротор на шесть коротких пробирок общей емкостью 72 мл. Максимальная скорость вращения -9000 об/мин.

Рис. 5. Различные лабораторные центрифуги: 1 - клиническая; 2 - настольная; 3 - угловая малогабаритная; 4 - стационарная; 5 - рефрижераторная.

Угловая малогабаритная центрифуга ЦУМ-1 (рис. 5, 3) имеет три сменных угловых ротора с различным количеством пробирок и гематокрит: ротор для 6 пробирок общей емкостью 150 мл, ротор для 10 пробирок общей емкостью 120 мл, ротор для 24 пробирок общей емкостью 120 мл, гематокрит для двух капилляров. Максимальная скорость вращения- 10 000 об/мин.

Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом.

Лабораторная стационарная центрифуга ЦЛС-2 (рис. 5, 4) имеет два сменных ротора. Ротор-крестовина снабжен четырьмя стальными гильзами емкостью по 500 мл и четырьмя стеклянными пробирками к ним емкостью по 250 мл. Угловой ротор снабжен 8 полиэтиленовыми и стальными пробирками емкостью 50-75 мл. Максимальное вращение роторов до 6000 об/мин. Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом.

К числу специальных центрифуг относится лабораторная рефрижераторная центрифуга ЦЛР-1 (рис. 5,5), предназначаемая для центрифугирования при пониженных температурах (-5° и выше) различных изменяющихся даже при комнатной температуре веществ - большей частью белковых суспензий. Центрифуга имеет три сменных ротора, обеспечивающих различные режимы центрифугирования. Два ротора идентичны но техническим характеристикам роторам центрифуги типа ЦЛС-2, третий ротор, надевающийся на добавочную ось, развивает 18 000-18 500 об/мин. Максимальный объем исследуемого препарата -48 мл. Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом. Охлаждение рабочей камеры осуществляется при помощи холодильной машины.

См. также Ультрацентрифугирование.

2.5.1 Природа градиентов

Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D 2 0. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.

Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»

2.5.2 Методика создания ступенчатого градиента плотности

Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.

2.5.3 Методика создания плавного градиента плотности

В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробирки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.

Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.

2.5.4 Извлечение градиентов из центрифужных пробирок

После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60-70%-ный раствор сахарозы. Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.

2.5.5 Препаративные центрифуги и их применение

Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги. Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об мин -1 и ОЦУ до 6000 g . Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость - от 4 до 6 дм 3 , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см 3 , но и сосудами емкостью до 1,25 дм 3 . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25 000 об-мин -1 и ОЦУ до 89000g. Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание, которое возникает вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм 3 и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и с подвесными стаканами.

Препаративные ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об-мин -1 и максимальное центробежное ускорение 510 000 g . Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых или титановых сплавов. В основном применяют роторы из алюминиевых сплавов, однако в тех случаях, когда необходимы особенно высокие скорости, пользуются роторами из титана. Для уменьшения вибрации, возникающей в результате нарушения равновесия ротора из-за неравномерного наполнения центрифужных пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1 г. Аналогичные требования следует соблюдать и при загрузке роторов центрифуг общего назначения.

2.6 Конструкция роторов

2.6.1 Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами

Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов - угловые и с подвесными стаканами. Угловыми они называются потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы переходят в горизонтальное положение; угол наклона к оси вращения составляет 90°.

В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц с близкими седиментационными свойствами. Тем не менее роторы подобной конструкции с успехом применяются для разделения частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.

В роторах с подвесными стаканами также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.

Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы в роторах с подвесными стаканами и регулируя скорость вращения ротора; перечисленных выше, недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.

2.6.2 Роторы непрерывного действия

Роторы непрерывного действия предназначены для скоростного фракционирования относительно небольших количеств твердого материала из суспензий больших объемов, например для выделения клеток из питательных сред. В ходе центрифугирования суспензия частиц добавляется в ротор непрерывно; пропускная способность ротора зависит от природы осаждаемого препарата и варьируете пределах от 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 мин. Особенность ротора состоит в том, что он представляет собой изолированную камеру специальной конструкции; содержимое ее не сообщается с внешней средой, а поэтому не загрязняется и не распыляется.

2.6.3 Зональные роторы, или роторы Андерсона

Зональные роторы делают из алюминиевых или титановых сплавов, которые способны выдерживать весьма значительные центробежные ускорения. Обычно в них имеется цилиндрическая полость, закрывающаяся съемной крышкой. Внутри полости, на оси вращения расположена осевая трубка, на которую надевается насадка с лопастями, разделяющими полость ротора на четыре сектора. Лопасти или перегородки имеют радиальные каналы, по которым из осевой трубки к периферии ротора нагнетается градиент. Благодаря такой конструкции лопастей конвекция сведена до минимума.

Заполнение ротора производится при его вращении со скоростью около 3000 об/мин -1 . В ротор нагнетают заранее созданный градиент, начиная со слоя наименьшей плотности, который равномерно распределяется по периферии ротора и удерживается у внешней его стенки перпендикулярно оси вращения благодаря центробежной силе. При последующем добавлении слоев градиента большей плотности происходит непрерывное смещение к центру менее плотных слоев. После того как в ротор будет нагнетен весь градиент, его заполняют до полного объема раствором, называемым «подушкой», плотность которого совпадает или несколько превышает наибольшую плотность преформированного градиента.

Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец, который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшей плотности, при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зонально-изопикническое фракционирование. Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об - мин -1 . Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои. Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по поглощению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.

Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см 3 , что позволяет получать довольно большое количество материала. Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.

2.6.4 Анализ субклеточных фракций

Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.

Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы - маркерами лизосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р -глюкуронидаза, НАДФ" Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органеллами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.

Фракция	Объем, см"	Общее разведение	Экснюк-ция, 660 нм	Единицы активности фермента	Выход активности во фракции, %

2.7 Фракционирование методом дифференциального центрифугирования

2.7.1 Оформление результатов

Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.

Ферментативную активности содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.

Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода, на основании чего составляют гистограмму. По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат - относительную удельную активность каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции.

2.7.2 Аналитическое ультрацентрифугирование

В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.

Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин -1 , создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g . Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния в аналитической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см 3 , имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации. На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления - с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить о скорости седиментации материала. Интерферометрические системы отличаются большей чувствительностью, чем шлирен-системы. Аналитические ячейки бывают односекторные, которые применяются наиболее часто, и двухсекторные, которые используются для сравнительного изучения растворителя и растворенного вещества.

В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных весов макромолекул, проверки чистоты получаемых образцов, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.

2.8 Применение аналитического ультрацентрифугирования

2.8.1 Определение молекулярных весов

Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.

Определение молекулярного веса по скорости седиментации - это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.

Скорость седиментации определяется следующим соотношением:

где х - расстояние от оси вращения в см,

t - время в с,

w - угловая скорость в рад-с -1 ,

s - коэффициент седиментации "молекулы.

Коэффициент седиментации - это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга ; 1 единица Сведберга равна 10 _13 с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий - от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов - от 40 до 60S.

где М - молекулярный вес молекулы, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, s - коэффициент седиментации молекулы, D - коэффициент диффузии молекулы, v - парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р - плотность растворителя.

Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000-8 000 об-мин -1 , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных - с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества "согласно формуле

где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, ю - угловая скорость, р - плотность растворителя, v - парциальный удельный объем, с х и с 2 - концентрация растворенного вещества на расстояниях г г и г 2 от оси вращения.

Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время - от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.

Метод приближения к седиментационному равновесию былразработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для "установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:

где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, v - парциальный удельный объем, р - плотность растворителя, dcldr - градиент концентрации макромолекулы, г м и г д - расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, с м и с д - концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, М м и M R -величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.

2.8.2 Оценка чистоты препаратов

Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.

2.8.3 Исследование конформационных изменений в макромолекулах

Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования - исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.

У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и малыми лигандами. Диссоциацию белка на субъединицы можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.

Формования трубчатых изделий методом центрифугирования . Под центрифугированием в промышленность строительных материалов... которых осуществляется такое воздействие, называются центрифугированием . В промышленности РБ используются горизонтальные центрифуги...

Осаждение частиц

Лабораторная работа >> Химия

Клеток, уже освобожденного низкоскоростным центрифугированием от ядра, митохондрий и... ультрацентрифугирование Особенности этого типа центрифугирования отражены в самом его... для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, ...

Использование центрифуги

Курсовая работа >> Промышленность, производство

В центрифугах периодического действия различные операции центрифугирования – загрузка, разделение, выгрузка – происходят... различают препаративное и аналитическое центрифугирование . При препаративном центрифугировании исходный биологический материал берут...