वैज्ञानिकों का मानना ​​​​है कि छोटे आरएनए की गलत अभिव्यक्ति कई बीमारियों के कारणों में से एक है जो दुनिया भर में कई लोगों के स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित करती है। ऐसी बीमारियों में कार्डियोवैस्कुलर 23 और ऑन्कोलॉजिकल 24 हैं। उत्तरार्द्ध के लिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है: कैंसर कोशिकाओं के विकास और उनके भाग्य में विसंगतियों को इंगित करता है, और छोटे आरएनए संबंधित प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां कैंसर में शरीर पर छोटे आरएनए के बड़े प्रभाव के सबसे स्पष्ट उदाहरणों में से एक है। हम एक घातक ट्यूमर के बारे में बात कर रहे हैं, जो उन जीनों की गलत अभिव्यक्ति की विशेषता है जो जीव के प्रारंभिक विकास के दौरान कार्य करते हैं, न कि प्रसवोत्तर अवधि में। यह एक प्रकार का बचपन का ब्रेन ट्यूमर है जो आमतौर पर दो साल की उम्र से पहले दिखाई देता है। काश, यह कैंसर का एक बहुत ही आक्रामक रूप है, और गहन उपचार के साथ भी यहाँ रोग का निदान प्रतिकूल है। मस्तिष्क कोशिकाओं में अनुवांशिक सामग्री के अनुचित पुनर्वितरण के परिणामस्वरूप ऑन्कोलॉजिकल प्रक्रिया विकसित होती है। एक प्रमोटर जो सामान्य रूप से प्रोटीन-कोडिंग जीन में से एक की मजबूत अभिव्यक्ति का कारण बनता है, छोटे आरएनए के एक विशिष्ट समूह के साथ पुनर्संयोजन से गुजरता है। फिर, इस पूरे पुनर्व्यवस्थित क्षेत्र को बढ़ाया जाता है: दूसरे शब्दों में, इसकी कई प्रतियां जीनोम में बनाई जाती हैं। नतीजतन, स्थानांतरित प्रमोटर की तुलना में "डाउनस्ट्रीम" स्थित छोटे आरएनए को जितना चाहिए उससे कहीं अधिक व्यक्त किया जाता है। सक्रिय छोटे आरएनए की सामग्री का स्तर मानक से लगभग 150-1000 गुना अधिक है।

चावल। 18.3.अल्कोहल-सक्रिय छोटे आरएनए मैसेंजर आरएनए से जुड़ सकते हैं जो शराब के लिए शरीर के प्रतिरोध को प्रभावित नहीं करते हैं। लेकिन ये छोटे आरएनए ऐसे प्रतिरोध को बढ़ावा देने वाले दूत आरएनए अणुओं से बंधे नहीं होते हैं। यह शराब प्रतिरोध से जुड़े प्रोटीन विविधताओं को कूटने वाले मैसेंजर आरएनए अणुओं के अनुपात की एक सापेक्ष प्रबलता की ओर जाता है।

यह क्लस्टर 40 से अधिक विभिन्न छोटे आरएनए को एनकोड करता है। दरअसल, यह आम तौर पर ऐसे समूहों में सबसे बड़ा है जो प्राइमेट के पास होते हैं। यह आमतौर पर भ्रूण के जीवन के पहले 8 हफ्तों में, मानव विकास के प्रारंभिक चरण में ही व्यक्त किया जाता है। शिशु के मस्तिष्क में इसकी प्रबल सक्रियता आनुवंशिक अभिव्यक्ति पर विनाशकारी प्रभाव डालती है। एक परिणाम एक एपिजेनेटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति है जो डीएनए में संशोधन जोड़ता है। यह पूरे डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न में व्यापक परिवर्तन की ओर जाता है, और इसलिए सभी प्रकार के जीनों की असामान्य अभिव्यक्ति के लिए, जिनमें से कई को केवल तभी व्यक्त किया जाना चाहिए जब अपरिपक्व मस्तिष्क कोशिकाएं किसी जीव के विकास के प्रारंभिक चरणों में विभाजित होती हैं। इस प्रकार बच्चे की कोशिकाओं में कैंसर कार्यक्रम शुरू किया जाता है 25 .

छोटे आरएनए और सेल के एपिजेनेटिक हार्डवेयर के बीच समान संचार अन्य स्थितियों पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है जब कोशिकाएं कैंसर के लिए एक पूर्वाभास विकसित करती हैं। यह तंत्र संभवतः इस तथ्य की ओर ले जाता है कि छोटे आरएनए अभिव्यक्ति के विघटन के प्रभाव को एपिजेनेटिक संशोधनों को बदलकर बढ़ाया जाता है जो मां से बेटी कोशिकाओं को प्रेषित होते हैं। इस तरह, जीन अभिव्यक्ति की प्रकृति में संभावित खतरनाक परिवर्तनों की एक योजना बनाई जा सकती है।

अब तक, वैज्ञानिकों ने एपिजेनेटिक प्रक्रियाओं के साथ छोटे आरएनए की बातचीत के सभी चरणों का पता नहीं लगाया है, लेकिन वे अभी भी जो हो रहा है उसकी विशेषताओं के बारे में कुछ संकेत प्राप्त करने का प्रबंधन करते हैं। उदाहरण के लिए, यह पता चला है कि स्तन कैंसर की आक्रामकता को बढ़ाने वाले छोटे आरएनए का एक निश्चित वर्ग मैसेंजर आरएनए में कुछ एंजाइमों को लक्षित करता है जो प्रमुख एपिजेनेटिक संशोधनों को हटाते हैं। यह कैंसर कोशिका में एपिजेनेटिक संशोधनों के पैटर्न को बदल देता है और आगे आनुवंशिक अभिव्यक्ति 26 को बाधित करता है।

एक मरीज में कैंसर के कई रूपों को ट्रैक करना मुश्किल होता है। ऑन्कोलॉजिकल प्रक्रियाएं दुर्गम स्थानों में हो सकती हैं, जो नमूनाकरण प्रक्रिया को जटिल बनाती हैं। ऐसे मामलों में, डॉक्टर के लिए कैंसर प्रक्रिया के विकास और उपचार की प्रतिक्रिया की निगरानी करना आसान नहीं होता है। अक्सर, चिकित्सकों को अप्रत्यक्ष माप पर भरोसा करने के लिए मजबूर किया जाता है - कहते हैं, एक ट्यूमर के टोमोग्राफिक स्कैन पर। कुछ शोधकर्ताओं का मानना ​​है कि छोटे आरएनए अणु ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए एक नई तकनीक बनाने में मदद कर सकते हैं, जिससे इसकी उत्पत्ति का अध्ययन करना भी संभव हो जाता है। जब कैंसर कोशिकाएं मर जाती हैं, तो छोटे आरएनए कोशिका को टूटने पर छोड़ देते हैं। ये छोटे जंक अणु अक्सर सेलुलर प्रोटीन के साथ कॉम्प्लेक्स बनाते हैं या सेल झिल्ली के टुकड़ों में खुद को लपेटते हैं। इस वजह से, वे शरीर के तरल पदार्थों में बहुत स्थिर होते हैं, जिसका अर्थ है कि ऐसे आरएनए को अलग किया जा सकता है और उनका विश्लेषण किया जा सकता है। चूंकि उनकी संख्या कम है, इसलिए शोधकर्ताओं को विश्लेषण के बहुत संवेदनशील तरीकों का उपयोग करना होगा। हालांकि, यहां कुछ भी असंभव नहीं है: न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण की संवेदनशीलता लगातार 27 बढ़ रही है। स्तन कैंसर 28, डिम्बग्रंथि के कैंसर 29 और कई अन्य ऑन्कोलॉजिकल रोगों के संबंध में इस दृष्टिकोण के वादे की पुष्टि करते हुए डेटा प्रकाशित किया गया है। फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में छोटे आरएनए को प्रसारित करने के विश्लेषण से पता चला है कि ये आरएनए एक अकेले फेफड़े के नोड्यूल (जिन्हें चिकित्सा की आवश्यकता नहीं है) और घातक ट्यूमर नोड्यूल विकसित करने वाले रोगियों (उपचार की आवश्यकता) वाले रोगियों के बीच अंतर करने में मदद करते हैं।

SiRNA की लंबाई 21-25 bp है; वे dsRNA से बनते हैं। ऐसे आरएनए के स्रोत वायरल संक्रमण, जीनोम में पेश किए गए आनुवंशिक निर्माण, टेप में लंबे हेयरपिन, और ट्रांसपोज़ेबल तत्वों के द्विदिश प्रतिलेखन हो सकते हैं।
dsRNAs को RNase डिसर द्वारा 21-25 बीपी अंशों में काटा जाता है। 3" सिरों के साथ 2 न्यूक्लियोटाइड द्वारा फैला हुआ है, जिसके बाद श्रृंखला में से एक RISC का हिस्सा है और समरूप RNAs को काटने का निर्देश देता है। RISC में dsRNA के प्लस- और माइनस-स्ट्रैंड दोनों के अनुरूप siRNAs होते हैं। siRNAs के अपने जीन नहीं होते हैं और प्रतिनिधित्व लंबे आरएनए के टुकड़े हैं। सीआरएनए लक्ष्य आरएनए के काटने को निर्देशित करते हैं, क्योंकि वे पूरी तरह से इसके पूरक हैं। पौधों, कवक और नेमाटोड में, आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ जीन अभिव्यक्ति के दमन में शामिल हैं, जिसके लिए सीआरएनए भी प्राइमर के रूप में काम करते हैं (नए आरएनए के संश्लेषण के लिए बीज परिणामी dsRNA को डिसर के साथ काट दिया जाता है, नए siRNAs बनते हैं, जो द्वितीयक होते हैं, इस प्रकार संकेत को बढ़ाते हैं।

आरएनए हस्तक्षेप

1998 में, क्रेग सी। मेलो और एंड्रयू फायर ने नेचर में प्रकाशित किया, जिसमें कहा गया था कि डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) जीन अभिव्यक्ति को दबाने में सक्षम थे। बाद में यह पता चला कि इस प्रक्रिया में सक्रिय सिद्धांत लघु एकल-फंसे आरएनए है। इन आरएनए द्वारा जीन अभिव्यक्ति के दमन के तंत्र को कहा जाता है
आरएनए हस्तक्षेप और आरएनए साइलेंसिंग। यूकेरियोट्स के सभी बड़े करों में ऐसा तंत्र पाया गया है: कशेरुक और अकशेरुकी, पौधे और कवक। इस खोज के लिए 2006 में नोबेल पुरस्कार प्रदान किया गया था।
अभिव्यक्ति का दमन ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर या पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से हो सकता है। यह पता चला कि सभी मामलों में प्रोटीन के समान सेट और छोटे (21-32 बीपी) आरएनए की आवश्यकता होती है।
siRNAs जीन गतिविधि को दो तरह से नियंत्रित करते हैं। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, वे लक्ष्य आरएनए को काटने का निर्देश देते हैं। इस घटना को "दमन" कहा जाता है ( शमन) मशरूम में, " पोस्ट-ट्रांसलेशनल जीन साइलेंसिंग"पौधों में और" आरएनए हस्तक्षेप "जानवरों में। इन प्रक्रियाओं में 21-23 बीपी लंबे सीआरएनए शामिल होते हैं। एक अन्य प्रकार का प्रभाव, सीआरएनए, समरूप सीआरएनए अनुक्रम वाले जीन के प्रतिलेखन को दबाने में सक्षम हैं। इस घटना को कहा जाता था ट्रांसक्रिप्शनल जीन साइलेंसिंग (टीजीएस) और खमीर, पौधों और जानवरों में पाया जाता है। siRNAs डीएनए मेथिलिकरण को भी निर्देशित करते हैं, जिससे हेटरोक्रोमैटिन और ट्रांसक्रिप्शनल दमन का निर्माण होता है। टीजीएस का सबसे अच्छा अध्ययन यीस्ट एस. पोम्बे में किया जाता है, जहां आरआईटीएस नामक आरआईएससी जैसे प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में सीआरएनए डाले जाते हैं। उनके मामले में, जैसा कि आरआईएससी के मामले में होता है, सीआरएनए एजीओ परिवार के एक प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करता है। संभवतः, siRNA इस परिसर को एक ऐसे जीन की ओर निर्देशित करने में सक्षम है जिसमें एक समजात siRNA टुकड़ा होता है। उसके बाद, RITS प्रोटीन मिथाइलट्रांसफेरेज़ की भर्ती करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप siRNA लक्ष्य जीन को कूटने वाले स्थान में हेटरोक्रोमैटिन बनता है, और सक्रिय जीन अभिव्यक्ति रुक ​​जाती है।

सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका

सेल में siRNA का क्या महत्व है?
siRNAs वायरस के खिलाफ कोशिका रक्षा, ट्रांसजीन दमन, कुछ जीनों के नियमन और सेंट्रोमेरिक हेटरोक्रोमैटिन के निर्माण में शामिल हैं। SiRNA का एक महत्वपूर्ण कार्य मोबाइल आनुवंशिक तत्वों की अभिव्यक्ति का दमन है। इस तरह का दमन ट्रांसक्रिप्शनल स्तर और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल दोनों तरह से हो सकता है।
कुछ विषाणुओं के जीनोम में डीएनए होता है, उनमें से कुछ में - आरएनए का, इसके अलावा, विषाणुओं में आरएनए या तो एकल या डबल-स्ट्रैंडेड हो सकता है। इस मामले में विदेशी (वायरल) एमआरएनए को काटने की प्रक्रिया उसी तरह होती है जैसे ऊपर वर्णित है, यानी आरआईएससी एंजाइम कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करके। हालांकि, अधिक प्रभावी होने के लिए, पौधों और कीड़ों ने siRNA के सुरक्षात्मक प्रभाव को बढ़ाने के लिए एक अनूठा तरीका तैयार किया है। एमआरएनए स्ट्रैंड से जुड़कर, सीआरएनए क्षेत्र, डीआईसीईआर एंजाइम कॉम्प्लेक्स की मदद से, पहले दूसरे एमआरएनए स्ट्रैंड को पूरा कर सकता है और फिर इसे विभिन्न स्थानों में काट सकता है, इस प्रकार विभिन्न प्रकार के "सेकेंडरी" सीआरएनए का निर्माण कर सकता है। वे, बदले में, आरआईएससी बनाते हैं और एमआरएनए को ऊपर चर्चा की गई सभी चरणों के माध्यम से, इसके पूर्ण विनाश तक ले जाते हैं। ऐसे "माध्यमिक" अणु विशेष रूप से न केवल वायरल एमआरएनए की साइट पर बाँधने में सक्षम होंगे, जिस पर "प्राथमिक" अणु को निर्देशित किया गया था, बल्कि अन्य साइटों के लिए भी, जो नाटकीय रूप से सेलुलर सुरक्षा की प्रभावशीलता को बढ़ाता है।

इस प्रकार, पौधों और निचले जानवरों के जीवों में, सीआरएनए एक प्रकार की "इंट्रासेल्युलर प्रतिरक्षा" में एक महत्वपूर्ण कड़ी है जो उन्हें विदेशी आरएनए को पहचानने और जल्दी से नष्ट करने की अनुमति देता है। इस घटना में कि आरएनए युक्त वायरस कोशिका में प्रवेश करता है, ऐसी सुरक्षा प्रणाली इसे गुणा करने से रोकेगी। यदि वायरस में डीएनए होता है, तो सीआरएनए प्रणाली वायरल प्रोटीन के उत्पादन में हस्तक्षेप करेगी (चूंकि इसके लिए आवश्यक एमआरएनए को पहचाना और काटा जाएगा), और इस रणनीति का उपयोग पूरे शरीर में इसके प्रसार को धीमा कर देगा।

स्तनधारियों में, कीड़ों और पौधों के विपरीत, एक अन्य रक्षा प्रणाली भी काम करती है। जब विदेशी आरएनए, जिसकी लंबाई 30 बीपी से अधिक है, एक "परिपक्व" (विभेदित) स्तनधारी कोशिका में प्रवेश करती है, तो कोशिका इंटरफेरॉन को संश्लेषित करना शुरू कर देती है। इंटरफेरॉन, कोशिका की सतह पर विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी, कोशिका में जीन के एक पूरे समूह को उत्तेजित करने में सक्षम है। नतीजतन, कोशिका में कई प्रकार के एंजाइम संश्लेषित होते हैं, जो प्रोटीन के संश्लेषण को रोकते हैं और वायरल आरएनए को तोड़ते हैं। इसके अलावा, इंटरफेरॉन पड़ोसी पर कार्य कर सकता है, अभी तक संक्रमित कोशिकाओं पर नहीं, जिससे वायरस के संभावित प्रसार को रोका जा सके।

जैसा कि आप देख सकते हैं, दोनों प्रणालियाँ कई मायनों में समान हैं: उनके पास एक सामान्य लक्ष्य और काम के "तरीके" हैं। यहां तक ​​​​कि "इंटरफेरॉन" और "(आरएनए) हस्तक्षेप" नाम भी एक सामान्य जड़ से आते हैं। लेकिन उनके पास एक बहुत महत्वपूर्ण अंतर भी है: यदि इंटरफेरॉन, आक्रमण के पहले संकेतों पर, सेल के काम को "जमा देता है", सेल में "निर्दोष" प्रोटीन सहित कई के उत्पादन को रोकता है (बस मामले में), तो siRNA प्रणाली अत्यंत बोधगम्य है: प्रत्येक siRNA केवल अपने विशिष्ट mRNA को ही पहचानेगा और नष्ट करेगा। SiRNA के भीतर सिर्फ एक न्यूक्लियोटाइड के प्रतिस्थापन से हस्तक्षेप के प्रभाव में तेज कमी आती है . अब तक ज्ञात किसी भी जीन अवरोधक में अपने लक्ष्य जीन के संबंध में ऐसी असाधारण विशिष्टता नहीं है।

आरएनए हस्तक्षेप की खोज ने एड्स और कैंसर के खिलाफ लड़ाई में नई उम्मीद जगाई है। यह संभव है कि पारंपरिक एंटीवायरल थेरेपी के साथ-साथ siRNA थेरेपी का उपयोग करके, एक शक्तिशाली प्रभाव प्राप्त किया जा सकता है, जब दो प्रभाव अलग-अलग लागू किए गए प्रत्येक के साधारण योग की तुलना में अधिक स्पष्ट चिकित्सीय प्रभाव की ओर ले जाते हैं।
स्तनधारी कोशिकाओं में siRNA के हस्तक्षेप के तंत्र का उपयोग करने के लिए, तैयार डबल-स्ट्रैंडेड siRNA अणुओं को कोशिकाओं में पेश किया जाना चाहिए। ऐसे सिंथेटिक siRNAs का इष्टतम आकार समान 21-28 न्यूक्लियोटाइड हैं। यदि आप इसकी लंबाई बढ़ाते हैं, तो कोशिकाएं इंटरफेरॉन के उत्पादन और प्रोटीन संश्लेषण में कमी के साथ प्रतिक्रिया करेंगी। सिंथेटिक siRNAs संक्रमित और स्वस्थ दोनों कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं, और असंक्रमित कोशिकाओं में प्रोटीन उत्पादन को कम करना अत्यधिक अवांछनीय होगा। दूसरी ओर, यदि आप 21 न्यूक्लियोटाइड से छोटे siRNA का उपयोग करने का प्रयास करते हैं, तो वांछित mRNA के लिए इसके बंधन की विशिष्टता और RISC कॉम्प्लेक्स बनाने की क्षमता में तेजी से कमी आती है।

यदि एक तरह से या कोई अन्य, कोई siRNA वितरित कर सकता है जिसमें एचआईवी जीनोम के किसी भी भाग (जो, जैसा कि ज्ञात है, आरएनए से मिलकर बनता है) को बांधने की क्षमता है, कोई इसे मेजबान के डीएनए में एकीकृत होने से रोकने की कोशिश कर सकता है। कोशिका। इसके अलावा, वैज्ञानिक पहले से ही संक्रमित कोशिका में एचआईवी प्रजनन के विभिन्न चरणों को प्रभावित करने के तरीके विकसित कर रहे हैं। बाद वाला दृष्टिकोण एक इलाज प्रदान नहीं करेगा, लेकिन यह वायरस के प्रजनन की दर को काफी कम कर सकता है और कॉर्नर्ड प्रतिरक्षा प्रणाली को वायरल हमले से "आराम" करने का मौका दे सकता है और बीमारी के अवशेषों से निपटने का प्रयास कर सकता है। आकृति में, कोशिका में एचआईवी प्रजनन के वे दो चरण, जो वैज्ञानिकों की आशा के अनुसार, siRNA का उपयोग करके अवरुद्ध किए जा सकते हैं, लाल क्रॉस के साथ चिह्नित हैं (चरण 4-5 - गुणसूत्र में वायरस को एम्बेड करना, और चरण 5-6 - वायरस का संयोजन और कोशिका से बाहर निकलना)।


हालाँकि, आज तक, उपरोक्त सभी केवल सिद्धांत के क्षेत्र में लागू होते हैं। व्यवहार में, siRNA थेरेपी में ऐसी कठिनाइयाँ आती हैं जिनसे वैज्ञानिक अभी तक निजात नहीं पा सके हैं। उदाहरण के लिए, एंटीवायरल थेरेपी के मामले में, यह siRNA की उच्च विशिष्टता है जो एक क्रूर मजाक कर सकती है: जैसा कि ज्ञात है, वायरस में तेजी से उत्परिवर्तित करने की क्षमता होती है, अर्थात। उनके न्यूक्लियोटाइड की संरचना को बदलें। एचआईवी इसमें विशेष रूप से सफल रहा है, जिसके परिवर्तनों की आवृत्ति ऐसी है कि वायरस के एक उपप्रकार से संक्रमित व्यक्ति में, कुछ वर्षों में एक पूरी तरह से अलग उपप्रकार को अलग किया जा सकता है। इस मामले में, संशोधित एचआईवी तनाव स्वचालित रूप से चिकित्सा की शुरुआत में चयनित siRNA के प्रति असंवेदनशील हो जाएगा।

बुढ़ापा और कार्सिनोजेनेसिस

किसी भी एपिजेनेटिक कारक की तरह, siRNAs जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं जो उन्हें "मौन" बनाते हैं। अब ऐसे कार्य हैं जो ट्यूमर से जुड़े जीन को बंद करने के लिए प्रयोगों का वर्णन करते हैं। siRNA की सहायता से जीनों को स्विच ऑफ (नॉक-डाउन) किया जाता है। उदाहरण के लिए, चीनी वैज्ञानिकों ने प्रतिलेखन कारक 4 (TCF4) जीन को बंद करने के लिए siRNA का उपयोग किया, जिसकी गतिविधि पिट-हॉपकिंस सिंड्रोम (मानसिक मंदता और हाइपरवेंटिलेशन और एपनिया के एपिसोड द्वारा विशेषता एक बहुत ही दुर्लभ आनुवंशिक बीमारी) और अन्य मानसिक बीमारियों का कारण बनती है। इस काम में, हमने गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं में टीसीएफ4 की भूमिका का अध्ययन किया। एक्टोपिक TCF4 अभिव्यक्ति गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों में सेल की वृद्धि को कम करती है, और TCF4 जीन के siRNA नॉकआउट से सेल माइग्रेशन बढ़ता है। इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि टीसीएफ 4 जीन की एपिजेनेटिक साइलेंसिंग ट्यूमर के गठन और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

ऑन्कोलॉजी विभाग, अल्बर्ट आइंस्टीन कैंसर सेंटर, लियोनार्ड एच। ऑगेनलिच के नेतृत्व में शोध के अनुसार, siRNA HDAC4 जीन शटडाउन में शामिल है, जो कोलन कैंसर के विकास अवरोध, एपोप्टोसिस और बढ़े हुए p21 प्रतिलेखन का कारण बनता है। HDAC4 एक हिस्टोन डीएसेटाइलेज़ है जो ऊतक विशिष्ट है, सेल भेदभाव को दबाता है, और सेल भेदभाव प्रक्रिया के दौरान डाउनग्रेड किया जाता है। काम से पता चलता है कि HDAC4 कोलन सेल प्रसार (जो कैंसर प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है) का एक महत्वपूर्ण नियामक है, और यह बदले में, siRNA द्वारा नियंत्रित होता है।

जापान में नारा मेडिकल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के पैथोलॉजी विभाग ने प्रोस्टेट कैंसर पर शोध किया। रेप्लिकेटिव सेल एजिंग अनियंत्रित विभाजन और कार्सिनोजेनेसिस के खिलाफ एक बाधा है। अल्पकालिक विभाजन कोशिकाएं (टीएसी) प्रोस्टेट सेल की आबादी का हिस्सा हैं जहां से ट्यूमर विकसित होता है। जापानी वैज्ञानिकों ने उन कारणों का अध्ययन किया जिनकी वजह से ये कोशिकाएं उम्र बढ़ने पर काबू पाती हैं। संस्कृति में प्रोस्टेट कोशिकाओं को junB siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। इन कोशिकाओं में, p53, p21, p16 और pRb का बढ़ा हुआ अभिव्यक्ति स्तर देखा जाता है, जो उम्र बढ़ने के दौरान पता चलता है। अगले चरण के लिए संस्कृति में कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, जिसमें p16 का स्तर कम था। TAC में siRNA के बार-बार ट्रांसफ़ेक्शन ने कोशिकाओं को p16/pRb निष्क्रियता पर बुढ़ापा से बचने की अनुमति दी। इसके अलावा, junB siRNA द्वारा junB प्रोटो-ऑन्कोजीन को बंद करने से सेल आक्रमण होता है। इसके आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला गया कि junB, p16 के लिए एक तत्व है और टीएसी की दुर्दमता (घातकता) को रोकने के लिए, सेलुलर जीर्णता को बढ़ावा देता है। इस प्रकार, junB प्रोस्टेट कार्सिनोजेनेसिस का नियामक है और चिकित्सीय हस्तक्षेप का लक्ष्य हो सकता है। और इसकी गतिविधि को siRNA की मदद से नियंत्रित किया जा सकता है।

ऐसे कई अध्ययन किए जा रहे हैं। वर्तमान में, siRNA न केवल एक वस्तु है, बल्कि एक चिकित्सा शोधकर्ता, जीवविज्ञानी, ऑन्कोलॉजिस्ट और जेरोन्टोलॉजिस्ट के हाथों में एक उपकरण भी है। ऑन्कोलॉजिकल रोगों के साथ siRNA के जुड़ाव का अध्ययन, उम्र से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति के साथ, विज्ञान के लिए सबसे महत्वपूर्ण कार्य है। SiRNA की खोज के बाद से बहुत कम समय बीत चुका है, और उनसे संबंधित कितने दिलचस्प अध्ययन और प्रकाशन सामने आए हैं। इसमें कोई शक नहीं कि उनका अध्ययन कैंसर और बढ़ती उम्र पर जीत की दिशा में मानवता के कदमों में से एक बन जाएगा...

आरएनए हस्तक्षेप की घटना के नाम में अंतर्निहित रूपक पेटुनिया के साथ प्रयोग को संदर्भित करता है, जब पौधे में कृत्रिम रूप से पेश किए गए गुलाबी और बैंगनी रंगद्रव्य के सिंथेटेस के जीन ने रंग तीव्रता में वृद्धि नहीं की, लेकिन इसके विपरीत, इसे कम कर दिया। इसी तरह, "साधारण" हस्तक्षेप में, दो तरंगों के अध्यारोपण से पारस्परिक "शमन" हो सकता है।

एक जीवित कोशिका में, नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच सूचना का प्रवाह कभी नहीं सूखता है, लेकिन इसके सभी "ट्विस्ट्स" को समझना और इसमें एन्कोड की गई जानकारी को समझना वास्तव में टाइटैनिक कार्य है। पिछली शताब्दी के जीव विज्ञान में सबसे महत्वपूर्ण सफलताओं में से एक को सूचना (या टेम्पलेट) आरएनए अणुओं (एमआरएनए या एमआरएनए) की खोज माना जा सकता है, जो मध्यस्थों के रूप में कार्य करते हैं जो नाभिक (गुणसूत्रों से) तक सूचना "संदेश" लेते हैं। कोशिकाद्रव्य। प्रोटीन संश्लेषण में आरएनए की निर्णायक भूमिका की भविष्यवाणी 1939 की शुरुआत में टॉर्बजर्न कैस्पर्सन, जीन ब्रेचेट और जैक शुल्त्स के काम में की गई थी, और 1971 में जॉर्ज मार्बैक्स ने पहले पृथक खरगोश दूत आरएनए एन्कोडिंग को इंजेक्ट करके oocytes मेंढकों में हीमोग्लोबिन के संश्लेषण की शुरुआत की। प्रोटीन।

1956-57 में सोवियत संघ में, A. N. Belozersky और A. S. Spirin ने स्वतंत्र रूप से mRNA के अस्तित्व को साबित किया, और यह भी पाया कि एक कोशिका में RNA का थोक किसी भी तरह से मैट्रिक्स नहीं होता है, बल्कि राइबोसोमल RNA (rRNA) होता है। राइबोसोमल आरएनए - सेलुलर आरएनए का दूसरा "मुख्य" प्रकार - सभी जीवों में "कंकाल" और राइबोसोम का कार्यात्मक केंद्र बनाता है; यह rRNA (और प्रोटीन नहीं) है जो प्रोटीन संश्लेषण के मुख्य चरणों को नियंत्रित करता है। उसी समय, तीसरे "मुख्य" प्रकार के आरएनए, स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए) का वर्णन और अध्ययन किया गया था, जो अन्य दो, एमआरएनए और आरआरएनए के संयोजन में, एक एकल प्रोटीन-संश्लेषण परिसर बनाते हैं। "आरएनए दुनिया" की अपेक्षाकृत लोकप्रिय परिकल्पना के अनुसार, यह न्यूक्लिक एसिड था जो पृथ्वी पर जीवन की उत्पत्ति में निहित था।

इस तथ्य के कारण कि डीएनए की तुलना में आरएनए बहुत अधिक हाइड्रोफिलिक है (राइबोज द्वारा डीऑक्सीराइबोज के प्रतिस्थापन के कारण), यह अधिक लचीला है और कोशिका में अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकता है, और इसलिए आनुवंशिक जानकारी (एमआरएनए) की अल्पकालिक प्रतिकृतियां प्रदान करता है। उस स्थान पर जहां प्रोटीन संश्लेषण होता है। हालांकि, इससे जुड़ी "असुविधा" पर ध्यान देने योग्य है - आरएनए बहुत अस्थिर है। यह डीएनए (कोशिका के अंदर भी) की तुलना में बहुत खराब संग्रहीत होता है और परिस्थितियों (तापमान, पीएच) में मामूली बदलाव पर खराब हो जाता है। उनकी "स्वयं" अस्थिरता के अलावा, एक बड़ा योगदान राइबोन्यूक्लिअस (या RNases) का है - आरएनए-क्लीविंग एंजाइमों का एक वर्ग, बहुत स्थिर और "सर्वव्यापी" - यहां तक ​​​​कि प्रयोगकर्ता के हाथों की त्वचा में भी इन एंजाइमों को पार करने के लिए पर्याप्त है संपूर्ण प्रयोग। इस वजह से, आरएनए के साथ काम करना प्रोटीन या डीएनए की तुलना में बहुत अधिक कठिन है - बाद वाले को आमतौर पर सैकड़ों हजारों वर्षों तक कम या बिना किसी नुकसान के संग्रहीत किया जा सकता है।

काम के दौरान शानदार सटीकता, ट्राइडिस्टिलेट, बाँझ दस्ताने, डिस्पोजेबल प्रयोगशाला कांच के बने पदार्थ - आरएनए क्षरण को रोकने के लिए यह सब आवश्यक है, लेकिन ऐसे मानकों का अनुपालन हमेशा संभव नहीं था। इसलिए, लंबे समय तक, आरएनए के छोटे "टुकड़े", जो अनिवार्य रूप से प्रदूषित समाधान थे, को केवल अनदेखा किया गया था। हालांकि, समय के साथ, यह स्पष्ट हो गया कि, कार्य क्षेत्र की बाँझपन को बनाए रखने के सभी प्रयासों के बावजूद, "मलबे" का स्वाभाविक रूप से पता लगाना जारी रहा, और फिर यह पता चला कि हजारों छोटे डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए हमेशा साइटोप्लाज्म में मौजूद होते हैं। , काफी विशिष्ट कार्य करना, और सामान्य विकास कोशिकाओं और जीवों के लिए बिल्कुल आवश्यक है।

आरएनए हस्तक्षेप का सिद्धांत

आज, छोटे नियामक आरएनए का अध्ययन आणविक जीव विज्ञान के सबसे तेजी से विकासशील क्षेत्रों में से एक है। यह पाया गया कि सभी छोटे आरएनए आरएनए हस्तक्षेप नामक एक घटना के आधार पर अपना कार्य करते हैं (इस घटना का सार छोटे आरएनए अणुओं की सक्रिय भागीदारी के साथ प्रतिलेखन या अनुवाद के चरण में जीन अभिव्यक्ति का दमन है)। बहुत योजनाबद्ध रूप से, आरएनए हस्तक्षेप का तंत्र चित्र 1 में दिखाया गया है:

चावल। 1. RNAi . के मूल तत्व
डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए अणु (डीएसआरएनए) सामान्य कोशिकाओं की विशेषता नहीं हैं, लेकिन वे कई वायरस के जीवन चक्र में एक आवश्यक कदम हैं। एक विशेष डिसर प्रोटीन, एक कोशिका में dsRNA पाए जाने पर, इसे छोटे टुकड़ों में "काट" देता है। इस तरह के एक टुकड़े की एंटीसेंस श्रृंखला, जिसे पहले से ही शॉर्ट इंटरफेरिंग आरएनए (siRNA, siRNA से - छोटे हस्तक्षेप RNA) कहा जा सकता है, RISC (RNA- प्रेरित साइलेंसिंग कॉम्प्लेक्स) नामक एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से बंधी होती है, जिसका केंद्रीय तत्व एक है Argonaute परिवार के एंडोन्यूक्लाइज। SiRNA से आबद्ध होना RISC को सक्रिय करता है और सेल में DNA और RNA अणुओं की खोज को ट्रिगर करता है जो "टेम्पलेट" siRNA के पूरक हैं। ऐसे अणुओं का भाग्य आरआईएससी परिसर द्वारा नष्ट या निष्क्रिय किया जाना है।

संक्षेप में, विदेशी (जानबूझकर पेश किए गए सहित) के छोटे "ट्रिमिंग" डबल-फंसे आरएनए बड़े पैमाने पर पूरक mRNAs की खोज और विनाश के लिए "टेम्पलेट" के रूप में कार्य करते हैं (और यह संबंधित जीन की अभिव्यक्ति के दमन के बराबर है) , न केवल एक सेल में, बल्कि पड़ोसी में भी। कई जीवों के लिए - प्रोटोजोआ, मोलस्क, कीड़े, कीड़े, पौधे - यह घटना संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा के मुख्य तरीकों में से एक है।

2006 में, एंड्रयू फायर और क्रेग मेलो को फिजियोलॉजी या मेडिसिन में नोबेल पुरस्कार मिला "आरएनए हस्तक्षेप की घटना की खोज के लिए - डीएसआरएनए की भागीदारी के साथ जीन साइलेंसिंग का तंत्र"। यद्यपि आरएनए हस्तक्षेप की घटना का वर्णन बहुत पहले (1980 के दशक की शुरुआत में) किया गया था, यह फायर एंड मेलो का काम था जिसने छोटे आरएनए के नियामक तंत्र को रेखांकित किया और आणविक अनुसंधान के अब तक के अज्ञात क्षेत्र को रेखांकित किया। यहाँ उनके काम के मुख्य परिणाम हैं:

• आरएनए हस्तक्षेप में, यह एमआरएनए (और कोई अन्य नहीं) है जो क्लीव किया जाता है;
• डबल-फंसे आरएनए एकल-फंसे की तुलना में बहुत अधिक कुशलता से कार्य करता है (दरार पैदा करता है)। इन दो टिप्पणियों ने dsRNA की क्रिया की मध्यस्थता करने वाली एक विशेष प्रणाली के अस्तित्व की भविष्यवाणी की;
• डीएसआरएनए, परिपक्व एमआरएनए के एक खंड के पूरक, बाद के दरार का कारण बनता है। इसने प्रक्रिया के साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण और एक विशिष्ट एंडोन्यूक्लाइज की उपस्थिति का संकेत दिया;
• dsRNA की एक छोटी मात्रा (प्रति कोशिका कई अणु) लक्ष्य जीन को पूरी तरह से "बंद" करने के लिए पर्याप्त है, जो उत्प्रेरण और/या प्रवर्धन के कैस्केड तंत्र के अस्तित्व को इंगित करता है।

इन परिणामों ने आधुनिक आणविक जीव विज्ञान के एक पूरे क्षेत्र की नींव रखी - आरएनए हस्तक्षेप - और एक दर्जन से अधिक वर्षों के लिए दुनिया भर के कई शोध समूहों के काम के वेक्टर को निर्धारित किया। आज तक, छोटे आरएनए के तीन बड़े समूहों की खोज की गई है जो "आरएनए हस्तक्षेप टीम" के लिए आणविक क्षेत्र में खेलते हैं। आइए इनके बारे में विस्तार से जानते हैं।

प्लेयर #1 - शॉर्ट इंटरफेरिंग RNAs

आरएनए हस्तक्षेप की विशिष्टता छोटे हस्तक्षेप आरएनए (siRNAs) द्वारा निर्धारित की जाती है - एक अच्छी तरह से परिभाषित संरचना के साथ छोटे डबल-असहाय आरएनए अणु (चित्र 2 देखें)।

siRNAs क्रमिक रूप से सबसे पहले हैं, और पौधों, एककोशिकीय जीवों और अकशेरुकी जीवों में सबसे व्यापक रूप से वितरित किए जाते हैं। सामान्य कशेरुकियों में, siRNAs व्यावहारिक रूप से नहीं पाए जाते हैं, क्योंकि उन्हें बाद में छोटे RNAs के "मॉडल" (नीचे देखें) द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।

siRNAs - साइटोप्लाज्म में खोज करने और mRNA अणुओं को नष्ट करने के लिए "टेम्पलेट्स" - की लंबाई 20-25 न्यूक्लियोटाइड और एक "विशेष संकेत" है: 3'-सिरों पर 2 अप्रकाशित न्यूक्लियोटाइड और फॉस्फोराइलेटेड 5'-सिरों। एंटी-सेंस सीआरएनए एमआरएनए को पहचानने और विशेष रूप से इसके क्षरण का कारण बनने में सक्षम है (निश्चित रूप से नहीं, बल्कि आरआईएससी कॉम्प्लेक्स की मदद से): लक्ष्य एमआरएनए का कट हमेशा 10 और 11 न्यूक्लियोटाइड के पूरक स्थान पर होता है। एंटी-सेंस siRNA स्ट्रैंड का।

चावल। 2. एमआरएनए और सीआरएनए के बीच "हस्तक्षेप" का तंत्र
"हस्तक्षेप" छोटे आरएनए अणु दोनों बाहर से कोशिका में प्रवेश कर सकते हैं, और पहले से ही लंबे समय तक डबल-फंसे आरएनए से "कट" कर सकते हैं। डीएसआरएनए को "काटने" के लिए आवश्यक मुख्य प्रोटीन डिसर एंडोन्यूक्लाइज है। हस्तक्षेप के तंत्र द्वारा जीन को "स्विचिंग ऑफ" आरआईएससी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ सीआरएनए द्वारा किया जाता है, जिसमें तीन प्रोटीन होते हैं - एगो 2 एंडोन्यूक्लाइज और दो सहायक प्रोटीन पीएसीटी और टीआरबीपी। बाद में, यह पाया गया कि डिसर और आरआईएससी कॉम्प्लेक्स न केवल एक बीज के रूप में डीएसआरएनए का उपयोग कर सकते हैं, बल्कि सिंगल-फंसे हुए आरएनए को डबल-फंसे हुए हेयरपिन के साथ-साथ तैयार किए गए सीआरएनए (बाद वाले "काटने" चरण को छोड़कर और तुरंत आरआईएससी को बांधता है)।

अकशेरुकी कोशिकाओं में siRNAs के कार्य काफी विविध हैं। पहला और मुख्य एक प्रतिरक्षा सुरक्षा है। "पारंपरिक" प्रतिरक्षा प्रणाली (लिम्फोसाइट्स + ल्यूकोसाइट्स + मैक्रोफेज) केवल जटिल बहुकोशिकीय जीवों में मौजूद है। एककोशिकीय जीवों, अकशेरुकी और पौधों (जिनमें या तो ऐसी प्रणाली नहीं है, या यह अपनी प्रारंभिक अवस्था में है) में, प्रतिरक्षा रक्षा आरएनए हस्तक्षेप के आधार पर बनाई जाती है। आरएनए हस्तक्षेप पर आधारित प्रतिरक्षा को प्रतिरक्षा कोशिकाओं (तिल्ली, थाइमस) के अग्रदूतों के "प्रशिक्षण" के जटिल अंगों की आवश्यकता नहीं होती है; इसी समय, सैद्धांतिक रूप से संभव लघु आरएनए अनुक्रमों की विविधता (421 प्रकार) उच्च जानवरों में संभावित प्रोटीन एंटीबॉडी की संख्या के साथ सहसंबद्ध है। इसके अलावा, siRNAs को "शत्रुतापूर्ण" RNA के आधार पर संश्लेषित किया जाता है जो कोशिका को संक्रमित करता है, जिसका अर्थ है कि एंटीबॉडी के विपरीत, वे एक विशिष्ट प्रकार के संक्रमण के लिए तुरंत "तेज" हो जाते हैं। और यद्यपि आरएनए हस्तक्षेप पर आधारित सुरक्षा कोशिका के बाहर काम नहीं करती है (कम से कम, अभी तक ऐसा कोई डेटा नहीं है), यह संतोषजनक से अधिक इंट्रासेल्युलर प्रतिरक्षा प्रदान करता है।

सबसे पहले, siRNA संक्रामक जीवों के mRNA या जीनोमिक RNA को नष्ट करके एंटीवायरल इम्युनिटी बनाता है (उदाहरण के लिए, पौधों में इस तरह से siRNA की खोज की गई)। वायरल आरएनए की शुरूआत एक बीज अणु के आधार पर विशिष्ट siRNAs के एक शक्तिशाली प्रवर्धन का कारण बनती है - स्वयं वायरल आरएनए। इसके अलावा, siRNAs विभिन्न मोबाइल आनुवंशिक तत्वों (MGE) की अभिव्यक्ति को दबा देते हैं, जिसका अर्थ है कि वे अंतर्जात "संक्रमण" से भी सुरक्षा प्रदान करते हैं। आरआईएससी परिसर के जीन में उत्परिवर्तन अक्सर उच्च एमजीई गतिविधि के कारण जीनोम अस्थिरता में वृद्धि करते हैं; सीआरएनए अपने स्वयं के जीन की अभिव्यक्ति का एक सीमक हो सकता है, जो उनके अतिअभिव्यक्ति के जवाब में ट्रिगर हो सकता है। जीन के काम का विनियमन न केवल अनुवाद के स्तर पर, बल्कि प्रतिलेखन के दौरान भी हो सकता है - H3 हिस्टोन पर जीन के मिथाइलेशन के माध्यम से।

आधुनिक प्रायोगिक जीव विज्ञान में, आरएनए हस्तक्षेप और लघु आरएनए के महत्व को कम करके आंका नहीं जा सकता है। इन विट्रो (कोशिका संस्कृतियों पर) और विवो (भ्रूण पर) में व्यक्तिगत जीन को "बंद करना" (या खटखटाना) की तकनीक विकसित की गई है, जो पहले से ही किसी भी जीन के अध्ययन में वास्तविक मानक बन गई है। कभी-कभी, किसी प्रक्रिया में व्यक्तिगत जीन की भूमिका स्थापित करने के लिए, वे सभी जीनों को बारी-बारी से "बंद" करते हैं।

फार्मासिस्ट भी सीआरएनए का उपयोग करने की संभावना में रुचि रखते हैं, क्योंकि व्यक्तिगत जीन के काम के विनियमन को निर्देशित करने की क्षमता कई बीमारियों के इलाज में अनसुनी संभावनाओं का वादा करती है। कार्रवाई का छोटा आकार और उच्च विशिष्टता सीआरएएनए-आधारित दवाओं की उच्च प्रभावकारिता और कम विषाक्तता का वादा करती है; हालाँकि, इन अणुओं की नाजुकता और नाजुकता के कारण शरीर में रोगग्रस्त कोशिकाओं को siRNA वितरण की समस्या को हल करना अभी तक संभव नहीं हो पाया है। और यद्यपि अब दर्जनों टीमें इन "जादुई गोलियों" को लक्ष्य पर (रोगग्रस्त अंगों के अंदर) निर्देशित करने का एक तरीका खोजने की कोशिश कर रही हैं, उन्हें अभी तक दिखाई देने वाली सफलता नहीं मिली है। इसके अलावा और भी दिक्कतें हैं। उदाहरण के लिए, एंटीवायरल थेरेपी के मामले में, siRNA की कार्रवाई की उच्च चयनात्मकता एक असावधानी हो सकती है - चूंकि वायरस जल्दी से उत्परिवर्तित होते हैं, संशोधित तनाव बहुत जल्दी चिकित्सा की शुरुआत में चयनित siRNA के प्रति संवेदनशीलता खो देगा: यह ज्ञात है कि siRNA में सिर्फ एक न्यूक्लियोटाइड के प्रतिस्थापन से हस्तक्षेप प्रभाव में उल्लेखनीय कमी आती है।

इस बिंदु पर, यह एक बार फिर याद करने योग्य है कि siRNAs केवल पौधों, अकशेरूकीय और एककोशिकीय जीवों में पाए गए हैं; हालांकि आरएनए हस्तक्षेप (डिसर, आरआईएससी कॉम्प्लेक्स) के लिए प्रोटीन के समरूप उच्च जानवरों में भी मौजूद हैं, पारंपरिक तरीकों से सीआरएनए का पता नहीं लगाया गया है। यह कितना आश्चर्य की बात थी जब कृत्रिम रूप से पेश किए गए सिंथेटिक siRNA एनालॉग्स ने स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों में एक मजबूत विशिष्ट खुराक-निर्भर प्रभाव का कारण बना! इसका मतलब यह था कि कशेरुक कोशिकाओं में, आरएनए हस्तक्षेप को अधिक जटिल प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा प्रतिस्थापित नहीं किया गया था, लेकिन जीवों के साथ विकसित हुआ, कुछ और "उन्नत" में बदल गया। नतीजतन, स्तनधारियों में siRNAs के सटीक एनालॉग्स के लिए नहीं, बल्कि उनके विकासवादी उत्तराधिकारियों के लिए देखना आवश्यक था।

प्लेयर #2 - miRNA

दरअसल, आरएनए हस्तक्षेप के क्रमिक रूप से बल्कि प्राचीन तंत्र के आधार पर, अधिक विकसित जीवों ने जीन के काम को नियंत्रित करने के लिए दो विशेष प्रणालियां विकसित की हैं, प्रत्येक ने छोटे आरएनए के अपने समूह - माइक्रोआरएनए (माइक्रोआरएनए) और पीआईआरएनए (पीआईआरएनए, पिवी-) का उपयोग किया है। परस्पर क्रिया आरएनए)। दोनों प्रणालियाँ स्पंज और सहसंयोजकों में दिखाई दीं और उनके साथ विकसित हुईं, siRNA और "नग्न" RNA हस्तक्षेप के तंत्र को विस्थापित कर दिया। प्रतिरक्षा प्रदान करने में उनकी भूमिका घट रही है, क्योंकि इस कार्य को सेलुलर प्रतिरक्षा के अधिक उन्नत तंत्र, विशेष रूप से इंटरफेरॉन सिस्टम द्वारा ले लिया गया है। हालाँकि, यह प्रणाली इतनी संवेदनशील है कि यह स्वयं siRNA पर भी काम करती है: एक स्तनधारी कोशिका में छोटे दोहरे-असहाय आरएनए की उपस्थिति एक "अलार्म सिग्नल" को ट्रिगर करती है (इंटरफेरॉन के स्राव को सक्रिय करती है और इंटरफेरॉन-निर्भर जीन की अभिव्यक्ति का कारण बनती है, जो सभी अनुवाद प्रक्रियाओं को पूरी तरह से ब्लॉक कर देता है)। इस संबंध में, उच्च जानवरों में आरएनए हस्तक्षेप का तंत्र मुख्य रूप से माइक्रोआरएनए और पीआईआरएनए, एकल-फंसे अणुओं द्वारा एक विशिष्ट संरचना के साथ मध्यस्थ होता है जो इंटरफेरॉन सिस्टम द्वारा पता नहीं लगाया जाता है।

जैसे-जैसे जीनोम अधिक जटिल होता गया, miRNAs और piRNAs प्रतिलेखन और अनुवाद के नियमन में तेजी से शामिल होते गए। समय के साथ, वे जीनोम विनियमन की एक अतिरिक्त, सटीक और सूक्ष्म प्रणाली में विकसित हुए। SiRNAs के विपरीत, microRNAs और piRNAs (2001 में खोजे गए, चित्र 3, A-B देखें) विदेशी डबल-स्ट्रैंडेड RNA अणुओं से उत्पन्न नहीं होते हैं, लेकिन शुरू में मेजबान जीव के जीनोम में एन्कोडेड होते हैं।

miRNA अग्रदूत को RNA पोलीमरेज़ II द्वारा जीनोमिक डीएनए के दोनों स्ट्रैंड्स से ट्रांसक्राइब किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक मध्यवर्ती रूप, pri-miRNA होता है, जो पारंपरिक mRNA, m7G कैप और पॉलीए टेल की विशेषताओं को वहन करता है। यह अग्रदूत केंद्र में दो एकल-फंसे "पूंछ" और कई अयुग्मित न्यूक्लियोटाइड के साथ एक लूप बनाता है (चित्र 3 ए)। ऐसा लूप दो-चरणीय प्रसंस्करण (छवि बी) से गुजरता है: पहला, ड्रोसा एंडोन्यूक्लिज़ हेयरपिन से एकल-फंसे आरएनए "पूंछ" को काट देता है, जिसके बाद कटे हुए हेयरपिन (प्री-माइक्रोआरएनए) को साइटोप्लाज्म में निर्यात किया जाता है, जहां यह होता है डिसर द्वारा मान्यता प्राप्त है, जो दो और कटौती करता है (एक डबल-स्ट्रैंडेड क्षेत्र काट दिया जाता है)। , चित्र 3 ए में रंग द्वारा दर्शाया गया है)। इस रूप में, परिपक्व miRNA, siRNA के समान, RISC परिसर में शामिल है।

कई miRNAs की क्रिया का तंत्र siRNAs के समान है: RISC प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में एक छोटा (21-25 न्यूक्लियोटाइड्स) एकल-फंसे आरएनए लक्ष्य mRNA के 3'-अनट्रांसलेटेड क्षेत्र में एक पूरक साइट के लिए उच्च विशिष्टता के साथ बांधता है। . एगो प्रोटीन द्वारा एमआरएनए की दरार में बाध्यकारी परिणाम। हालांकि, माइक्रोआरएनए (सीआरएनए की तुलना में) की गतिविधि पहले से ही अधिक विभेदित है: यदि पूरकता पूर्ण नहीं है, तो लक्ष्य एमआरएनए नीचा नहीं हो सकता है, लेकिन केवल विपरीत रूप से अवरुद्ध (कोई अनुवाद नहीं होगा)। वही RISC कॉम्प्लेक्स कृत्रिम रूप से पेश किए गए siRNAs का भी उपयोग कर सकता है। यह बताता है कि प्रोटोजोआ के साथ सादृश्य द्वारा बनाए गए siRNAs भी स्तनधारियों में सक्रिय क्यों हैं।

इस प्रकार, हम उच्च (द्विपक्षीय रूप से सममित) जीवों में आरएनए हस्तक्षेप की क्रिया के तंत्र के चित्रण को एक आकृति में miRNAs की कार्रवाई की योजना और जैव-तकनीकी रूप से पेश किए गए siRNAs (छवि 3C) में जोड़कर पूरक कर सकते हैं।

चावल। 3ए: एक डबल-फंसे miRNA अग्रदूत अणु की संरचना
मुख्य विशेषताएं: संरक्षित अनुक्रमों की उपस्थिति जो एक हेयरपिन बनाते हैं; 3'-छोर पर दो "अतिरिक्त" न्यूक्लियोटाइड के साथ एक पूरक प्रतिलिपि (माइक्रोआरएनए *) की उपस्थिति; विशिष्ट अनुक्रम (2–8 बीपी) जो एंडोन्यूक्लाइजेस के लिए मान्यता स्थल बनाता है। MiRNA स्वयं लाल रंग में हाइलाइट किया गया है - यही वह है जिसे डिसर काटता है।

चावल। 3B: miRNA प्रसंस्करण और इसकी गतिविधि की प्राप्ति का सामान्य तंत्र

चावल। 3B: कृत्रिम miRNAs और siRNAs की क्रिया की सामान्यीकृत योजना
कृत्रिम सीआरएनए को विशेष प्लास्मिड (सिआरएनए वेक्टर को लक्षित) का उपयोग करके सेल में पेश किया जाता है।

miRNA के कार्य

MiRNAs के शारीरिक कार्य अत्यंत विविध हैं; वास्तव में, वे ओटोजेनी के मुख्य गैर-प्रोटीन नियामकों के रूप में कार्य करते हैं। miRNAs रद्द नहीं करते हैं, लेकिन जीन विनियमन (इंडक्टर्स, सप्रेसर्स, क्रोमैटिन संघनन, आदि) की "शास्त्रीय" योजना के पूरक हैं। इसके अलावा, माइक्रोआरएनए के संश्लेषण को स्वयं एक जटिल तरीके से नियंत्रित किया जाता है (माइक्रोआरएनए के कुछ पूल इंटरफेरॉन, इंटरल्यूकिन्स, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (TNF-α), और कई अन्य साइटोकिन्स द्वारा चालू किए जा सकते हैं)। नतीजतन, हजारों जीनों का एक "ऑर्केस्ट्रा" स्थापित करने का एक बहु-स्तरीय नेटवर्क, इसकी जटिलता और लचीलेपन में अद्भुत, उभरता है, लेकिन यह बात का अंत नहीं है।

miRNAs, siRNAs की तुलना में अधिक "सार्वभौमिक" हैं: "वार्ड" जीन को 100% पूरक होने की आवश्यकता नहीं है - आंशिक बातचीत के साथ विनियमन भी किया जाता है। आज, आणविक जीव विज्ञान में सबसे गर्म विषयों में से एक माइक्रोआरएनए की खोज है, जो ज्ञात शारीरिक प्रक्रियाओं के वैकल्पिक नियामकों के रूप में कार्य करता है। उदाहरण के लिए, पौधों में कोशिका चक्र और एपोप्टोसिस के नियमन में शामिल miRNAs, ड्रोसोफिला और सूत्रकृमि का वर्णन पहले ही किया जा चुका है; मनुष्यों में, miRNAs प्रतिरक्षा प्रणाली और हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल विकास को नियंत्रित करते हैं। बायोचिप्स (माइक्रो-एरे स्क्रीनिंग) पर आधारित प्रौद्योगिकियों के उपयोग से पता चला है कि छोटे आरएनए के पूरे पूल सेल जीवन के विभिन्न चरणों में चालू और बंद होते हैं। जैविक प्रक्रियाओं के लिए, दर्जनों विशिष्ट माइक्रोआरएनए की पहचान की गई है, जिनकी अभिव्यक्ति का स्तर कुछ शर्तों के तहत हजारों बार बदलता है, इन प्रक्रियाओं की असाधारण नियंत्रणीयता पर बल देता है।

कुछ समय पहले तक, यह माना जाता था कि miRNAs केवल - पूरे या आंशिक रूप से - जीन के काम को दबाते हैं। हालाँकि, हाल ही में यह पता चला है कि सेल की स्थिति के आधार पर miRNAs की क्रिया मौलिक रूप से भिन्न हो सकती है! सक्रिय रूप से विभाजित सेल में, माइक्रोआरएनए एमआरएनए की 3'-साइट में एक पूरक अनुक्रम से बांधता है और प्रोटीन संश्लेषण (अनुवाद) को रोकता है। हालांकि, आराम या तनाव की स्थिति में (उदाहरण के लिए, खराब माध्यम पर बढ़ने पर), वही घटना विपरीत प्रभाव की ओर ले जाती है - लक्ष्य प्रोटीन के संश्लेषण में वृद्धि!

miRNA का विकास

उच्च जीवों में माइक्रोआरएनए किस्मों की संख्या अभी तक पूरी तरह से स्थापित नहीं हुई है - कुछ आंकड़ों के अनुसार, यह प्रोटीन-कोडिंग जीन की संख्या के 1% से अधिक है (मनुष्यों में, उदाहरण के लिए, वे लगभग 700 माइक्रोआरएनए की बात करते हैं, और यह संख्या लगातार है बढ़ रही है)। माइक्रोआरएनए सभी जीनों के लगभग 30% की गतिविधि को नियंत्रित करते हैं (उनमें से कई के लिए लक्ष्य अभी तक ज्ञात नहीं हैं), और सर्वव्यापी और ऊतक-विशिष्ट दोनों अणु हैं - उदाहरण के लिए, माइक्रोआरएनए का एक ऐसा महत्वपूर्ण पूल रक्त स्टेम कोशिकाओं की परिपक्वता को नियंत्रित करता है। .

विभिन्न जीवों के विभिन्न ऊतकों में व्यापक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और miRNAs की जैविक बहुतायत एक क्रमिक रूप से प्राचीन उत्पत्ति का संकेत देती है। पहली बार, miRNAs नेमाटोड में पाए गए थे, और लंबे समय से यह माना जाता था कि ये अणु केवल स्पंज और कोइलेंटरेट में दिखाई देते हैं; हालाँकि, बाद में उन्हें एककोशिकीय शैवाल में भी खोजा गया। दिलचस्प बात यह है कि जैसे-जैसे जीव अधिक जटिल होते जाते हैं, माइक्रोआरएनए पूल की संख्या और विविधता भी बढ़ती जाती है। यह परोक्ष रूप से इंगित करता है कि इन जीवों की जटिलता विशेष रूप से, miRNAs के कामकाज द्वारा प्रदान की जाती है। MiRNA का संभावित विकास चित्र 4 में दिखाया गया है।

चावल। 4. विभिन्न जीवों में miRNAs की विविधता
जीव का संगठन जितना ऊँचा होता है, उसमें उतने ही अधिक miRNAs (कोष्ठक में संख्या) पाए जाते हैं। एकल miRNAs वाली प्रजातियों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। इसके अनुसार ।

निम्नलिखित तथ्यों के आधार पर siRNA और माइक्रोआरएनए के बीच एक स्पष्ट विकासवादी संबंध खींचा जा सकता है:

• दोनों प्रजातियों की क्रिया विनिमेय है और सजातीय प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाती है;
• स्तनधारी कोशिकाओं में पेश किए गए siRNAs विशेष रूप से आवश्यक जीन को "बंद" करते हैं (इंटरफेरॉन सुरक्षा के कुछ सक्रियण के बावजूद);
• miRNAs अधिक से अधिक प्राचीन जीवों में पाए जाते हैं।

ये और अन्य डेटा एक सामान्य "पूर्वज" से दोनों प्रणालियों की उत्पत्ति का सुझाव देते हैं। यह भी ध्यान रखना दिलचस्प है कि प्रोटीन एंटीबॉडी के एक स्वतंत्र अग्रदूत के रूप में "आरएनए" प्रतिरक्षा आरएनए पर आधारित पहले जीवन रूपों की उत्पत्ति के सिद्धांत की पुष्टि करती है, न कि प्रोटीन (याद रखें कि यह शिक्षाविद ए.एस. स्पिरिन का पसंदीदा सिद्धांत है)।

जबकि आणविक जीव विज्ञान के क्षेत्र में केवल दो "खिलाड़ी" थे - सीआरएनए और माइक्रोआरएनए - आरएनए हस्तक्षेप का मुख्य "उद्देश्य" पूरी तरह से स्पष्ट था। दरअसल: विभिन्न जीवों में सजातीय लघु आरएनए और प्रोटीन का एक सेट समान कार्य करता है; जैसे-जैसे जीव अधिक जटिल होते जाते हैं, वैसे-वैसे उनकी कार्यक्षमता भी बढ़ती जाती है।

हालांकि, विकास की प्रक्रिया में, प्रकृति ने आरएनए हस्तक्षेप के समान सफल सिद्धांत के आधार पर एक और, क्रमिक रूप से नवीनतम और अत्यधिक विशिष्ट प्रणाली बनाई। हम बात कर रहे हैं piRNA (piRNA, Piwi-interaction RNA से)।

जीनोम जितना अधिक जटिल होता है, जीव उतना ही अधिक विकसित और अनुकूलित होता है (या इसके विपरीत? ;-)। हालांकि, जीनोम की जटिलता में वृद्धि का एक नकारात्मक पहलू है: जटिल आनुवंशिक प्रणाली अस्थिर हो जाती है। इससे जीनोम की अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार तंत्र की आवश्यकता होती है - अन्यथा डीएनए का सहज "मिश्रण" इसे अक्षम कर देगा। मोबाइल आनुवंशिक तत्व (एमजीई), जीनोम अस्थिरता के मुख्य कारकों में से एक, छोटे अस्थिर क्षेत्र हैं जो स्वायत्त रूप से पूरे जीनोम में स्थानांतरित और स्थानांतरित कर सकते हैं। ऐसे ट्रांसपोज़ेबल तत्वों के सक्रिय होने से गुणसूत्रों में कई डीएनए टूट जाते हैं, जो घातक परिणामों से भरे होते हैं।

जीनोम आकार के साथ एमजीई की संख्या गैर-रैखिक रूप से बढ़ती है, और उनकी गतिविधि को नियंत्रित किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, जानवर, जो पहले से ही coelenterates से शुरू होते हैं, आरएनए हस्तक्षेप की एक ही घटना का उपयोग करते हैं। यह कार्य लघु आरएनए द्वारा भी किया जाता है, हालांकि, वे नहीं जिनकी पहले ही चर्चा की जा चुकी है, लेकिन उनके तीसरे प्रकार, पीआईआरएनए।

PiRNA का "पोर्ट्रेट"

piRNAs छोटे अणु 24-30 न्यूक्लियोटाइड लंबे होते हैं, जो गुणसूत्र के सेंट्रोमेरिक और टेलोमेरिक क्षेत्रों में एन्कोडेड होते हैं। उनमें से कई के अनुक्रम ज्ञात मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के पूरक हैं, लेकिन कई अन्य piRNAs हैं जो काम करने वाले जीन के क्षेत्रों या जीनोम के टुकड़ों के साथ मेल खाते हैं जिनके कार्य अज्ञात हैं।

piRNAs (साथ ही माइक्रोआरएनए) जीनोमिक डीएनए के दोनों स्ट्रैंड में एन्कोडेड हैं; वे बहुत परिवर्तनशील और विविध हैं (एक जीव में 500,000 (!) प्रजातियों तक)। SiRNAs और microRNAs के विपरीत, वे एक विशेषता विशेषता के साथ एक एकल स्ट्रैंड द्वारा बनते हैं - 5' छोर पर यूरैसिल (U) और एक मिथाइलेटेड 3' छोर। अन्य अंतर भी हैं:

• SiRNAs और miRNAs के विपरीत, उन्हें डिसर प्रोसेसिंग की आवश्यकता नहीं होती है;
• piRNA जीन केवल जर्म कोशिकाओं (भ्रूणजनन के दौरान) और आसपास के एंडोथेलियल कोशिकाओं में सक्रिय होते हैं;
• PiRNA प्रणाली की प्रोटीन संरचना भिन्न होती है - ये Piwi वर्ग एंडोन्यूक्लाइजेस (Piwi और Aub) और Argonaute की एक अलग किस्म - Ago3 हैं।

पीआईआरएनए के प्रसंस्करण और गतिविधि को अभी भी कम समझा जाता है, लेकिन यह पहले से ही स्पष्ट है कि कार्रवाई का तंत्र अन्य छोटे आरएनए से पूरी तरह से अलग है - आज उनके काम का एक पिंग-पोंग मॉडल प्रस्तावित किया गया है (चित्र 5 ए, बी)।

PIRNA जैवजनन का पिंग-पोंग तंत्र

चावल। 5A: piRNA प्रसंस्करण का साइटोप्लाज्मिक हिस्सा
PiRNA जैवजनन और गतिविधि की मध्यस्थता Piwi endonuclease परिवार (Ago3, Aub, Piwi) द्वारा की जाती है। piRNA गतिविधि को एकल-फंसे हुए piRNA अणुओं, सेंस और एंटी-सेंस दोनों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक एक विशिष्ट Piwi endonuclease के साथ जुड़ता है। piRNA ट्रांसपोसॉन mRNA (नीला किनारा) के पूरक क्षेत्र को पहचानता है और उसे काट देता है। यह न केवल ट्रांसपोसॉन को निष्क्रिय करता है, बल्कि एक नया पीआईआरएनए भी बनाता है (3 'अंत के हेन 1 मिथाइलस मिथाइलेशन के माध्यम से एगो 3 से जुड़ा हुआ)। इस तरह के piRNA, बदले में, mRNA को piRNA अग्रदूत क्लस्टर (लाल स्ट्रैंड) के टेप के साथ पहचानता है - इस तरह से चक्र बंद हो जाता है और वांछित piRNA फिर से उत्पन्न होता है।

चावल। 5B: नाभिक में piRNA
ऑब एंडोन्यूक्लिज़ के अलावा, पिवी एंडोन्यूक्लिज़ एंटीसेंस पीआईआरएनए को भी बांध सकता है। बंधन के बाद, जटिल नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है, जहां यह पूरक टेप और क्रोमेटिन पुनर्व्यवस्था के क्षरण का कारण बनता है, जिससे ट्रांसपोसॉन गतिविधि का दमन होता है।

पीआईआरएनए कार्य

पीआईआरएनए का मुख्य कार्य ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद के स्तर पर एमजीई गतिविधि का दमन है। यह माना जाता है कि piRNAs केवल भ्रूणजनन के दौरान सक्रिय होते हैं, जब जीनोम का अप्रत्याशित फेरबदल विशेष रूप से खतरनाक होता है और इससे भ्रूण की मृत्यु हो सकती है। यह तर्कसंगत है - जब प्रतिरक्षा प्रणाली ने अभी तक काम नहीं किया है, तो भ्रूण की कोशिकाओं को कुछ सरल लेकिन प्रभावी सुरक्षा की आवश्यकता होती है। बाहरी रोगजनकों से, भ्रूण को प्लेसेंटा (या अंडे के खोल) द्वारा मज़बूती से संरक्षित किया जाता है। लेकिन इसके अलावा, अंतर्जात (आंतरिक) वायरस से भी बचाव की जरूरत है, मुख्य रूप से एमजीई।

PiRNA की इस भूमिका की पुष्टि अनुभव द्वारा की गई है - "नॉकआउट" या Ago3, Piwi, या Aub जीन के म्यूटेशन से गंभीर विकास संबंधी विकार होते हैं (और ऐसे जीव के जीनोम में म्यूटेशन की संख्या में तेज वृद्धि), और यह भी रोगाणु कोशिकाओं के बिगड़ा विकास के कारण बांझपन का कारण।

PiRNA का वितरण और विकास

पहले piRNAs पहले से ही समुद्री एनीमोन और स्पंज में पाए जाते हैं। पौधे, जाहिरा तौर पर, दूसरे रास्ते पर चले गए - उनमें पिवी प्रोटीन नहीं पाए गए, और ट्रांसपोज़न के लिए "थूथन" की भूमिका एगो 4 एंडोन्यूक्लिज़ और सीआरएनए द्वारा की जाती है।

मनुष्यों सहित उच्च जानवरों में, piRNA प्रणाली बहुत अच्छी तरह से विकसित होती है, लेकिन यह केवल भ्रूण कोशिकाओं और एमनियोटिक एंडोथेलियम में पाई जा सकती है। शरीर में piRNA का वितरण इतना सीमित क्यों है, यह देखा जाना बाकी है। यह माना जा सकता है कि, किसी भी शक्तिशाली हथियार की तरह, पीआईआरएनए केवल बहुत विशिष्ट परिस्थितियों (भ्रूण के विकास के दौरान) में उपयोगी है, और एक वयस्क जीव में, उनकी गतिविधि अच्छे से ज्यादा नुकसान करेगी। फिर भी, पीआईआरएनए की संख्या ज्ञात प्रोटीन की संख्या से अधिक परिमाण का एक क्रम है, और परिपक्व कोशिकाओं में पीआईआरएनए के गैर-विशिष्ट प्रभावों की भविष्यवाणी करना मुश्किल है।

पिवट तालिका। लघु आरएनए के सभी तीन वर्गों के गुण

	सिरना	मिरना	पीआईआरएनए
प्रसार	पौधे, ड्रोसोफिला, सी. एलिगेंस. कशेरुकियों में नहीं पाया जाता है	यूकैर्योसाइटों	जंतुओं की भ्रूणीय कोशिकाएँ (सहसंयोजकों से प्रारंभ होकर)। प्रोटोजोआ और पौधों में नहीं
लंबाई	21-22 न्यूक्लियोटाइड्स	19-25 न्यूक्लियोटाइड्स	24-30 न्यूक्लियोटाइड्स
संरचना	डबल-स्ट्रैंडेड, 19 पूरक न्यूक्लियोटाइड और 3' छोर पर दो अयुग्मित न्यूक्लियोटाइड	सिंगल स्ट्रैंड जटिल संरचना	एकल-फंसे जटिल संरचना। यू 5'-अंत में, 2'- हे-मेथिलेटेड 3' अंत
प्रसंस्करण	डिसर पर निर्भर	डिसर पर निर्भर	डिसर-स्वतंत्र
एंडोन्यूक्लिएज	एगो2	एगो1, एगो2	एगो 3, पिवी, औब
गतिविधि	पूरक mRNAs का अवक्रमण, जीनोमिक डीएनए का एसिटिलीकरण	लक्ष्य एमआरएनए अनुवाद का अवक्रमण या निषेध	एमआरएनए एन्कोडिंग का अवक्रमण एमजीई, एमजीई प्रतिलेखन का विनियमन
जैविक भूमिका	एंटीवायरल प्रतिरक्षा रक्षा, अपने स्वयं के जीन की गतिविधि का दमन	जीन गतिविधि का विनियमन	भ्रूणजनन के दौरान एमजीई गतिविधि का दमन

निष्कर्ष

अंत में, मैं आरएनए हस्तक्षेप (चित्र 6) में शामिल प्रोटीन तंत्र के विकास को दर्शाने वाली एक तालिका देना चाहूंगा। यह देखा जा सकता है कि प्रोटोजोआ में सबसे विकसित सीआरएनए प्रणाली (प्रोटीन परिवार एगो, डिसर) है, और जीवों की जटिलता के साथ, अधिक विशिष्ट प्रणालियों पर जोर दिया जाता है: माइक्रोआरएनए (ड्रोसा, पाशा) और पीआईआरएनए के लिए प्रोटीन आइसोफॉर्म की संख्या ( Piwi, Hen1) बढ़ता है। इसी समय, siRNA की क्रिया में मध्यस्थता करने वाले एंजाइमों की विविधता कम हो जाती है।

चावल। 6. आरएनए हस्तक्षेप में शामिल विभिन्न प्रकार के प्रोटीन और
संख्याएँ प्रत्येक समूह में प्रोटीन की संख्या को दर्शाती हैं। SiRNA और microRNA की विशेषता वाले तत्वों को नीले रंग में हाइलाइट किया गया है, और piRNA से जुड़े प्रोटीन को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। इसके अनुसार ।

आरएनए हस्तक्षेप की घटना का उपयोग सबसे सरल जीवों द्वारा किया जाने लगा। इस तंत्र के आधार पर, प्रकृति ने प्रतिरक्षा प्रणाली का एक प्रोटोटाइप बनाया, और जैसे-जैसे जीव अधिक जटिल होते जाते हैं, आरएनए हस्तक्षेप जीनोम गतिविधि का एक अनिवार्य नियामक बन जाता है। दो अलग-अलग तंत्र और तीन प्रकार के छोटे आरएनए (सारांश तालिका देखें) - परिणामस्वरूप, हम विभिन्न चयापचय और आनुवंशिक मार्गों के हजारों सूक्ष्म नियामक देखते हैं। यह आकर्षक तस्वीर आणविक जैविक प्रणालियों की बहुमुखी प्रतिभा और विकासवादी अनुकूलन को दर्शाती है। लघु आरएनए फिर से साबित करते हैं कि कोशिका के अंदर कोई "छोटी चीजें" नहीं होती हैं - केवल छोटे अणु होते हैं, जिनकी भूमिका का पूरा महत्व हम अभी समझने लगे हैं।

सच है, इस तरह की एक शानदार जटिलता इस तथ्य के बारे में बोलती है कि विकास "अंधा" है और पूर्व-अनुमोदित "मास्टर प्लान" के बिना संचालित होता है।

साहित्य

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), राइबोसोम पर mRNA के अनुवाद को उस प्रोटीन में बदलने से रोकता है जो इसे एन्कोड करता है। अंततः, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए का प्रभाव केवल जीन अभिव्यक्ति को कम करने के समान होता है।

1999 में यूके में डेविड बाउलकोम्ब के समूह द्वारा पौधों में पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन साइलेंसिंग सिस्टम के एक घटक के रूप में छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए की खोज की गई थी (इंग्लैंड। पीटीजीएस, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन साइलेंसिंग) समूह ने विज्ञान पत्रिका में अपने निष्कर्ष प्रकाशित किए।

डबल-फंसे आरएनए आरएनए-निर्भर जीन सक्रियण नामक तंत्र के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं। आरएनएए, छोटे आरएनए-प्रेरित जीन सक्रियण) यह दिखाया गया है कि लक्ष्य जीन के प्रमोटरों के पूरक डबल-फंसे आरएनए संबंधित जीनों के सक्रियण का कारण बनते हैं। मानव कोशिकाओं में सिंथेटिक डबल-फंसे आरएनए के प्रशासन पर आरएनए-निर्भर सक्रियण दिखाया गया है। यह ज्ञात नहीं है कि अन्य जीवों की कोशिकाओं में एक समान प्रणाली मौजूद है या नहीं।

अनिवार्य रूप से किसी भी जीन को इच्छानुसार बंद करने की क्षमता के साथ, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए पर आधारित आरएनए हस्तक्षेप ने बुनियादी और अनुप्रयुक्त जीव विज्ञान में जबरदस्त रुचि पैदा की है। जैव रासायनिक मार्गों में महत्वपूर्ण जीनों की पहचान करने के लिए व्यापक आरएनएआई-आधारित परखों की संख्या लगातार बढ़ रही है। चूंकि रोगों का विकास भी जीन की गतिविधि से निर्धारित होता है, यह उम्मीद की जाती है कि कुछ मामलों में, छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए का उपयोग करके जीन को बंद करने से चिकित्सीय प्रभाव हो सकता है।

हालांकि, जानवरों और विशेष रूप से मनुष्यों के लिए छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए के आधार पर आरएनए हस्तक्षेप के आवेदन में कई कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। प्रयोगों से पता चला है कि छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए की प्रभावशीलता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए भिन्न होती है: कुछ कोशिकाएं आसानी से छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए की कार्रवाई का जवाब देती हैं और जीन अभिव्यक्ति में कमी दिखाती हैं, जबकि अन्य में यह प्रभावी अभिकर्मक के बावजूद नहीं देखा जाता है। इस घटना के कारणों को अभी भी कम समझा जाता है।

2005 के अंत में प्रकाशित पहले दो आरएनएआई चिकित्सीय दवाओं (मैक्यूलर डिजनरेशन के उपचार के लिए लक्षित) के पहले चरण के परीक्षणों के परिणाम बताते हैं कि छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए पर आधारित दवाएं रोगियों द्वारा आसानी से सहन की जाती हैं और इनमें स्वीकार्य फार्माकोकाइनेटिक गुण होते हैं।

इबोला वायरस को लक्षित करने वाले छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए के प्रारंभिक नैदानिक ​​​​परीक्षणों से संकेत मिलता है कि वे रोग के पोस्ट-एक्सपोज़र प्रोफिलैक्सिस के लिए प्रभावी हो सकते हैं। इस दवा ने प्रायोगिक प्राइमेट के पूरे समूह के जीवित रहने की अनुमति दी, जिन्होंने ज़ैरेन इबोलावायरस की घातक खुराक प्राप्त की।

प्रतियोगिता के लिए लेख "जैव/मोल/पाठ": हाल के वर्षों में, आरएनए - और विशेष रूप से इसकी "गैर-शास्त्रीय" किस्मों - ने दुनिया भर के जीवविज्ञानियों का ध्यान आकर्षित किया है। यह पता चला कि गैर-कोडिंग आरएनए की मदद से विनियमन व्यापक है - वायरस और बैक्टीरिया से मनुष्यों तक। छोटे जीवाणु आरएनए नियामकों की विविधता के अध्ययन ने स्पष्ट रूप से मध्यवर्ती चयापचय और अनुकूली प्रतिक्रियाओं दोनों में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका दिखाई है। यह लेख बैक्टीरिया के छोटे आरएनए की किस्मों और उनकी मदद से किए गए विनियमन के तंत्र का वर्णन करता है। विशेष रूप से खतरनाक संक्रमण पैदा करने वाले जीवाणु एजेंटों की महत्वपूर्ण गतिविधि में इन अणुओं की भूमिका पर विशेष जोर दिया जाता है।

आरएनए: डीएनए की सिर्फ एक प्रति से अधिक

इस साइट के अधिकांश पाठक स्कूल से ही जीवित कोशिका के बुनियादी तंत्र को जानते हैं। मेंडल के नियमों से लेकर अत्याधुनिक जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं तक, जीव के विकास के लिए एक मास्टर आनुवंशिक कार्यक्रम का विचार, जिसे पेशेवर जीवविज्ञानियों के रूप में जाना जाता है आणविक जीव विज्ञान की केंद्रीय हठधर्मिता. इसमें कहा गया है कि डीएनए अणु आनुवंशिक जानकारी के वाहक और संरक्षक के रूप में कार्य करता है, जो एक मध्यस्थ - मैट्रिक्स आरएनए (एमआरएनए) के माध्यम से, और राइबोसोमल (आरआरएनए) और स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए) की भागीदारी के साथ - प्रोटीन के रूप में महसूस किया जाता है। . उत्तरार्द्ध प्रजातियों और व्यक्तिगत फेनोटाइप का निर्धारण करते हैं।

मामलों की यह स्थिति और आणविक तमाशा में एक माध्यमिक भागीदार की भूमिका के लिए आरएनए का असाइनमेंट वैज्ञानिक समुदाय में 1980 के दशक तक बना रहा। आरएनए पर करीब से नज़र डालने के लिए टी. चेक के काम ने मजबूर किया, जिन्होंने दिखाया कि आरएनए रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए उत्प्रेरक के रूप में कार्य कर सकता है। पहले, यह माना जाता था कि कोशिका में रासायनिक प्रक्रियाओं का त्वरण एंजाइमों का विशेषाधिकार है, जो विशेष रूप से प्रोटीन प्रकृति के होते हैं। आरएनए में उत्प्रेरक गतिविधि की खोज के दूरगामी परिणाम थे - के। वोसे के पहले के सैद्धांतिक काम के साथ, और इसने हमारे ग्रह पर प्रीबायोटिक विकास की एक संभावित तस्वीर खींचना संभव बना दिया। तथ्य यह है कि डीएनए में आनुवंशिक जानकारी के वाहक के कार्य की खोज के बाद से, विकास के दौरान पहले जो दिखाई दिया, उसके बारे में दुविधा - डीएनए या डीएनए के प्रजनन के लिए आवश्यक प्रोटीन - लगभग दार्शनिक लग रहा था (अर्थात, व्यर्थ) मुर्गी या अंडे की उपस्थिति की प्रधानता के बारे में प्रश्न के रूप में। टी। चेक की खोज के बाद, समाधान ने काफी वास्तविक रूपरेखा तैयार की - एक अणु पाया गया जिसमें एक सूचना वाहक और एक जैव उत्प्रेरक (यद्यपि अपनी प्रारंभिक अवस्था में) दोनों के गुण हैं। समय के साथ, ये अध्ययन जीव विज्ञान में एक पूरी दिशा में विकसित हुए हैं, तथाकथित "आरएनए दुनिया" के चश्मे के माध्यम से जीवन के उद्भव का अध्ययन करते हैं।

तो यह स्पष्ट हो गया कि आरएनए की प्राचीन दुनिया प्राथमिक जीवन की उत्पत्ति और फूल से संबंधित हो सकती है। फिर भी, यह स्वचालित रूप से इसका पालन नहीं करता है कि आधुनिक जीवों में आरएनए इंट्रासेल्युलर आणविक प्रणालियों की जरूरतों के अनुकूल एक पुरातनवाद नहीं है, बल्कि कोशिका के आणविक पहनावा का एक महत्वपूर्ण सदस्य है। केवल आणविक विधियों के विकास - विशेष रूप से, न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण - ने दिखाया कि आरएनए वास्तव में कोशिका में अपरिहार्य हैं, न कि केवल विहित ट्रिनिटी "एमआरएनए, आरआरएनए, टीआरएनए" के रूप में। पहले से ही डीएनए अनुक्रमण पर पहला व्यापक डेटा एक ऐसे तथ्य की ओर इशारा करता है जिसे पहले समझाना मुश्किल लग रहा था - इसमें से अधिकांश निकला गैर-कोडिंग- यानी प्रोटीन अणुओं या "मानक" आरएनए के बारे में जानकारी नहीं ले जाना। बेशक, इसे आंशिक रूप से "आनुवांशिक कचरा" - "बंद" या जीनोम के टुकड़े के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो अपना कार्य खो चुके हैं। लेकिन आर्थिक रूप से ऊर्जा का उपयोग करने की कोशिश कर रही जैविक प्रणालियों के लिए इतनी मात्रा में "दहेज" रखना अतार्किक लगता है।

वास्तव में, अधिक विस्तृत और सूक्ष्म शोध विधियों ने जीन अभिव्यक्ति के आरएनए नियामकों के एक पूरे वर्ग की खोज करना संभव बना दिया है जो आंशिक रूप से इंटरजेनिक स्पेस को भरते हैं। राउंडवॉर्म में संपूर्ण यूकेरियोटिक जीनोम अनुक्रम पढ़ने से पहले भी सी. एलिगेंस miRNAs को अलग कर दिया गया है - छोटी लंबाई के अणु (लगभग 20 न्यूक्लियोटाइड) जो विशेष रूप से पूरकता के सिद्धांत के अनुसार mRNA क्षेत्रों से जुड़ सकते हैं। यह अनुमान लगाना आसान है कि एमआरएनए के साथ ऐसे मामलों में एन्कोडेड प्रोटीन के बारे में जानकारी पढ़ना संभव नहीं है: राइबोसोम बस ऐसी साइट से "रन" नहीं हो सकता है जो अचानक डबल-स्ट्रैंड हो गया हो। जीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए इस तंत्र को कहा जाता है आरएनए हस्तक्षेप"बायोमोलेक्यूल" पर पर्याप्त विस्तार से पहले ही विश्लेषण किया जा चुका है। आज तक, हजारों माइक्रोआरएनए और अन्य गैर-कोडिंग आरएनए अणु (पीआईआरएनए, स्नोआरएनए, नैनोआरएनए, आदि) की खोज की गई है। यूकेरियोट्स (मनुष्यों सहित) में, वे इंटरजेनिक क्षेत्रों में स्थित हैं। कोशिका विभेदन, कार्सिनोजेनेसिस, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अन्य प्रक्रियाओं और विकृति में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका स्थापित की गई है।

छोटे आरएनए जीवाणु प्रोटीन के लिए "ट्रोजन हॉर्स" हैं

इस तथ्य के बावजूद कि बैक्टीरिया में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए यूकेरियोट्स में पहले समान नियामकों की तुलना में बहुत पहले खोजे गए थे, बैक्टीरिया सेल चयापचय में उनकी भूमिका लंबे समय तक वैज्ञानिक समुदाय के लिए छिपी हुई थी। यह समझ में आता है - परंपरागत रूप से, जीवाणु कोशिका को शोधकर्ता के लिए एक अधिक आदिम और कम रहस्यमय संरचना माना जाता था, जिसकी जटिलता की तुलना यूकेरियोटिक कोशिका में संरचनाओं के ढेर से नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, जीवाणु जीनोम में, गैर-कोडिंग जानकारी की सामग्री कुल डीएनए लंबाई का केवल कुछ प्रतिशत है, कुछ माइकोबैक्टीरिया में अधिकतम 40% तक पहुंचती है। लेकिन, यह देखते हुए कि माइक्रोआरएनए वायरस में भी पाए जाते हैं, उन्हें बैक्टीरिया में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभानी चाहिए, और इससे भी ज्यादा।

यह पता चला कि प्रोकैरियोट्स में काफी छोटे आरएनए नियामक हैं। परंपरागत रूप से, उन सभी को दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है:

1. आरएनए अणु जो अपना कार्य करने के लिए प्रोटीन से बंधे होते हैं।
2. आरएनए जो अन्य आरएनए (ज्ञात नियामक आरएनए अणुओं के बहुमत) को पूरक रूप से बांधते हैं।

पहले समूह में, छोटे आरएनए को अलग किया जाता है, जिसके लिए प्रोटीन बंधन संभव है, लेकिन आवश्यक नहीं है। एक प्रसिद्ध उदाहरण RNase P (RNAse P) है, जो "परिपक्व" tRNA पर राइबोजाइम के रूप में कार्य करता है। हालांकि, यदि RNase P प्रोटीन घटक के बिना कार्य कर सकता है, तो इस समूह के अन्य छोटे RNA के लिए, प्रोटीन बंधन अनिवार्य है (और वे स्वयं, वास्तव में, सहकारक हैं)। उदाहरण के लिए, tmRNA एक जटिल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करता है, जो "अटक" राइबोसोम के लिए "मास्टर कुंजी" के रूप में कार्य करता है - यदि मैसेंजर RNA जिसमें से रीडिंग की जा रही है, समाप्त हो गया है, लेकिन स्टॉप कोडन का सामना नहीं किया गया है।

प्रोटीन के साथ छोटे आरएनए के सीधे संपर्क के लिए एक और अधिक पेचीदा तंत्र भी जाना जाता है। प्रोटीन जो "पारंपरिक" न्यूक्लिक एसिड से बंधते हैं, किसी भी कोशिका में व्यापक होते हैं। प्रोकैरियोटिक कोशिका कोई अपवाद नहीं है। उदाहरण के लिए, इसके हिस्टोन जैसे प्रोटीन डीएनए स्ट्रैंड को सही ढंग से पैकेज करने में मदद करते हैं, और विशिष्ट रेप्रेसर प्रोटीन में जीवाणु जीन के ऑपरेटर क्षेत्र के लिए एक समानता होती है। यह दिखाया गया है कि इन दमनकारियों को छोटे आरएनए द्वारा बाधित किया जा सकता है जो इन प्रोटीनों के मूल निवासी डीएनए बाध्यकारी साइटों की नकल करते हैं। इस प्रकार, छोटे CsrB RNA (चित्र 1) पर 18 "डमी" साइटें हैं जो CsrA रेप्रेसर प्रोटीन को उसके वास्तविक लक्ष्य, ग्लाइकोजन ऑपेरॉन तक पहुंचने से रोकती हैं। वैसे, ऐसे छोटे आरएनए के कारण "खो गए" दमनकारी प्रोटीनों में, वैश्विक चयापचय पथ के नियामक हैं, जो छोटे आरएनए के निरोधात्मक संकेत को गुणा करना संभव बनाता है। उदाहरण के लिए, यह वही है जो छोटा RNA 6S करता है, जो प्रोटीन कारक σ 70 की "नकल" करता है। सिग्मा कारक के साथ आरएनए पोलीमरेज़ के बाध्यकारी केंद्रों पर कब्जा करके विन्यास "धोखे" द्वारा, यह "हाउसकीपिंग" जीन की अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करता है।

चित्रा 1. जैव सूचनात्मक रूप से CsrB छोटे आरएनए की माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी की विब्रियो कोलराएम 66-2।छोटे आरएनए एकल-फंसे अणु होते हैं, लेकिन, अन्य आरएनए के साथ, एक स्थिर स्थानिक संरचना में तह करने के साथ-साथ उन साइटों का निर्माण होता है जहां अणु स्वयं पर संकरण करता है। खुले वलय के रूप में संरचना पर असंख्य मोड़ कहलाते हैं हेयरपिन. कुछ मामलों में, हेयरपिन का संयोजन आरएनए को कुछ प्रोटीनों को गैर-सहसंयोजक बंधन द्वारा "स्पंज" के रूप में कार्य करने की अनुमति देता है। लेकिन अधिक बार, इस प्रकार के अणु डीएनए या आरएनए में हस्तक्षेप करते हैं; इस मामले में, छोटे आरएनए की स्थानिक संरचना गड़बड़ा जाती है, और संकरण के नए स्थल लक्ष्य अणु के साथ पहले से ही बनते हैं। हीट मैप इस संभावना को दर्शाता है कि संबंधित न्यूक्लियोटाइड जोड़ी वास्तव में एक इंट्रामोल्युलर हाइड्रोजन बॉन्ड से जुड़ी होगी; अयुग्मित साइटों के लिए - अणु के भीतर किसी भी साइट के साथ हाइड्रोजन बांड बनाने की संभावना। कार्यक्रम का उपयोग करके प्राप्त छवि आरएनएफोल्ड.

बैक्टीरिया के छोटे आरएनए हस्तक्षेप करते हैं... और बहुत सफलतापूर्वक!

वह तंत्र जिसके द्वारा दूसरे समूह के नियामक सामान्य रूप से यूकेरियोटिक नियामक आरएनए के समान होते हैं - यह एमआरएनए के साथ संकरण द्वारा एक ही आरएनए हस्तक्षेप है, केवल छोटे आरएनए की श्रृंखलाएं अक्सर अधिक प्रामाणिक होती हैं - कई तक सौ न्यूक्लियोटाइड्स ( से। मी।चावल। एक)। नतीजतन, छोटे आरएनए के कारण, राइबोसोम एमआरएनए से जानकारी नहीं पढ़ सकते हैं। हालांकि अक्सर, ऐसा लगता है, यह इस तक भी नहीं आता है: परिणामी "छोटे आरएनए-एमआरएनए" कॉम्प्लेक्स आरएनएस (आरनेस पी प्रकार) का लक्ष्य बन जाते हैं।

प्रोकैरियोटिक जीनोम की कॉम्पैक्टनेस और पैकिंग घनत्व खुद को महसूस करता है: यदि यूकेरियोट्स में अधिकांश नियामक आरएनए अलग (अक्सर गैर-कोडिंग प्रोटीन) लोकी में दर्ज किए जाते हैं, तो कई छोटे जीवाणु आरएनए को उसी डीएनए क्षेत्र में एन्कोड किया जा सकता है जैसे कि दमित जीन, लेकिन विपरीत दिशा में। जंजीरों! ऐसे RNAs कहलाते हैं सीआईएस-कोडित(एंटीसेंस), और छोटे आरएनए दमित डीएनए क्षेत्र से कुछ दूरी पर पड़े हैं - ट्रांस-कोडेड. जाहिर है, सीआईएस-आरएनए की व्यवस्था को एर्गोनॉमिक्स की जीत माना जा सकता है: उन्हें विपरीत डीएनए स्ट्रैंड से पढ़ा जा सकता है, साथ ही साथ लक्ष्य ट्रांसक्रिप्ट के साथ-साथ इसके अनइंडिंग के समय, जो संश्लेषित प्रोटीन की मात्रा को बारीकी से नियंत्रित करना संभव बनाता है।

छोटे ट्रांस आरएनए लक्ष्य एमआरएनए से स्वतंत्र रूप से विकसित होते हैं, और उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप नियामक का अनुक्रम अधिक दृढ़ता से बदलता है। यह संभव है कि ऐसी व्यवस्था जीवाणु कोशिका के लिए केवल "हाथ पर" हो, क्योंकि छोटे आरएनए पहले से अप्रचलित लक्ष्यों के खिलाफ गतिविधि प्राप्त करते हैं, जिससे अन्य नियामकों के निर्माण के लिए समय और ऊर्जा लागत कम हो जाती है। दूसरी ओर, चयन दबाव ट्रांस-छोटे आरएनए को बहुत अधिक उत्परिवर्तित होने से रोकता है, क्योंकि यह गतिविधि खो देगा। हालांकि, अधिकांश ट्रांस-छोटे आरएनए को मैसेंजर आरएनए के साथ संकरण करने के लिए एक सहायक, एचएफक्यू प्रोटीन की आवश्यकता होती है। जाहिर है, अन्यथा छोटे आरएनए की अपूर्ण संपूरकता लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए समस्याएं पैदा कर सकती है।

जाहिर है, "एक छोटा आरएनए - कई लक्ष्य" के सिद्धांत पर आधारित विनियमन का संभावित तंत्र जीवाणु चयापचय नेटवर्क को एकीकृत करने में मदद करता है, जो कि एक छोटे एककोशिकीय जीवन की स्थितियों के तहत अत्यंत आवश्यक है। कोई इस विषय पर अटकलें जारी रख सकता है और मान सकता है कि ट्रांस-एन्कोडेड छोटे आरएनए का उपयोग कार्यात्मक रूप से संबंधित लेकिन शारीरिक रूप से दूर के लोकी से अभिव्यक्ति "निर्देश" भेजने के लिए किया जाता है। इस तरह के आनुवंशिक "रोल कॉल" की आवश्यकता तार्किक रूप से रोगजनक बैक्टीरिया में पाए जाने वाले छोटे आरएनए की बड़ी संख्या की व्याख्या करती है। उदाहरण के लिए, इस सूचक के लिए रिकॉर्ड धारक में कई सौ छोटे आरएनए पाए गए - हैजा विब्रियो ( विब्रियो कोलरा) यह एक सूक्ष्मजीव है जो आसपास के जलीय वातावरण (ताजा और नमकीन दोनों), और जलीय मोलस्क पर, और मछली में, और मानव आंत में जीवित रह सकता है - यहां आप नियामक अणुओं की मदद से जटिल अनुकूलन के बिना नहीं कर सकते!

जीवाणु स्वास्थ्य के लिए CRISPR

छोटे आरएनए ने बैक्टीरिया के लिए एक और महत्वपूर्ण समस्या को हल करने में भी आवेदन पाया है। यहां तक ​​​​कि सबसे दुर्भावनापूर्ण रोगजनक कोक्सी और बेसिली विशेष वायरस द्वारा उत्पन्न खतरे के सामने शक्तिहीन हो सकते हैं - बैक्टीरियोफेज जो बिजली की गति से बैक्टीरिया की आबादी को नष्ट कर सकते हैं। बहुकोशिकीय जीवों में विषाणुओं से सुरक्षा के लिए एक विशेष प्रणाली होती है - प्रतिरक्षा, कोशिकाओं और उन पदार्थों के माध्यम से जो वे स्रावित करते हैं, घुसपैठियों से शरीर की रक्षा करते हैं (एक वायरल प्रकृति सहित)। जीवाणु कोशिका एक अकेली है, लेकिन यह उतनी कमजोर नहीं है जितनी पहली नज़र में लग सकती है। जीवाणुओं की एंटीवायरल प्रतिरक्षा को बनाए रखने के लिए व्यंजनों के संरक्षक स्थान हैं crispr- क्लस्टर नियमित-असंतत लघु पैलिंड्रोमिक दोहराव ( नियमित रूप से गुच्छित छोटे पैलिंड्रोमिक दोहराव) (रेखा चित्र नम्बर 2; )। प्रोकैरियोटिक जीनोम में, प्रत्येक CRISPR कैसेट को कई सौ न्यूक्लियोटाइड्स लंबे एक लीडर सीक्वेंस द्वारा दर्शाया जाता है, इसके बाद 2-24 (कभी-कभी 400 तक) की एक श्रृंखला होती है, जो स्पेसर क्षेत्रों द्वारा लंबाई में समान होती है लेकिन न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में अद्वितीय होती है। प्रत्येक स्पेसर और रिपीट की लंबाई एक सौ बेस पेयर से अधिक नहीं होती है।

चित्रा 2. CRISPR ठिकाना और एक कार्यात्मक प्रतिलेख के लिए इसके संबंधित छोटे आरएनए का प्रसंस्करण।जीनोम में crispr- कैसेट को इंटरलीव्ड स्पेसर्स द्वारा दर्शाया जाता है (आंकड़े में उन्हें इस प्रकार दर्शाया गया है एसपी), फेज डीएनए के आंशिक रूप से समरूप क्षेत्र, और दोहराता है ( द्वारा) 24-48 बीपी लंबा, डाइडिक समरूपता दिखा रहा है। दोहराव के विपरीत, एक ही स्थान के भीतर स्पेसर लंबाई में समान होते हैं (विभिन्न बैक्टीरिया में यह 20-70 न्यूक्लियोटाइड हो सकते हैं), लेकिन न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में भिन्न होते हैं। "-स्पेसर-रिपीट-" खंड काफी लंबे हो सकते हैं और इसमें कई सौ लिंक शामिल हो सकते हैं। पूरी संरचना एक तरफ नेता अनुक्रम से घिरी हुई है ( एल.पी., कई सौ आधार जोड़े)। आस-पास कैस-जीन हैं ( सीरिस्परो-जैसासोशिएटेड) एक ऑपेरॉन में व्यवस्थित। उनसे पढ़े जाने वाले प्रोटीन कई सहायक कार्य करते हैं, जिससे पढ़े गए ट्रांसक्रिप्ट की प्रोसेसिंग होती है crispr-लोकस, फेज डीएनए लक्ष्य के साथ इसका सफल संकरण, लोकस में नए तत्वों का समावेश, आदि। बहु-चरण प्रसंस्करण के परिणामस्वरूप गठित सीआरआरएनए एक डीएनए क्षेत्र (आकृति का निचला हिस्सा) के साथ संकरण करता है जिसे फेज द्वारा जीवाणु में इंजेक्ट किया जाता है। यह वायरस की ट्रांसक्रिप्शन मशीन को खामोश कर देता है और इसे प्रोकैरियोटिक सेल में गुणा करने से रोकता है।

हर चीज की उत्पत्ति का विस्तृत तंत्र crispr-लोकस का अध्ययन किया जाना बाकी है। लेकिन आज तक, इसकी संरचना में सबसे महत्वपूर्ण संरचनाओं, स्पेसर्स के उद्भव का एक योजनाबद्ध आरेख प्रस्तावित किया गया है। यह पता चला है कि "बैक्टीरिया शिकारी" अपने ही हथियारों से पीटा जाता है - न्यूक्लिक एसिड, या बल्कि, पिछली लड़ाइयों में चरणों से बैक्टीरिया द्वारा प्राप्त "ट्रॉफी" आनुवंशिक जानकारी! तथ्य यह है कि जीवाणु कोशिका में प्रवेश करने वाले सभी चरण घातक नहीं होते हैं। ऐसे फेज (संभवतः समशीतोष्ण से संबंधित) के डीएनए को विशेष कैस प्रोटीन (उनके जीन फ्लैंक) द्वारा काटा जाता है crispr) छोटे टुकड़ों में। इनमें से कुछ अंशों को एम्बेड किया जाएगा crispr"होस्ट" जीनोम का लोकी। और जब फेज डीएनए जीवाणु कोशिका में फिर से प्रवेश करता है, तो यह छोटे आरएनए से मिलता है crispr-लोकस, उस समय कैस प्रोटीन द्वारा व्यक्त और संसाधित किया जाता है। इसके बाद ऊपर वर्णित आरएनए हस्तक्षेप के तंत्र के अनुसार वायरल आनुवंशिक जानकारी की निष्क्रियता होती है।

स्पेसर्स के गठन की परिकल्पना से, यह स्पष्ट नहीं है कि उनके बीच दोहराव की आवश्यकता क्यों है, एक ही स्थान के भीतर लंबाई में थोड़ा भिन्न, लेकिन क्रम में लगभग समान? यहां कल्पना की व्यापक गुंजाइश है। शायद, दोहराव के बिना, आनुवंशिक डेटा को कंप्यूटर हार्ड ड्राइव पर सेक्टरों के समान सिमेंटिक टुकड़ों में विभाजित करना समस्याग्रस्त होगा, और फिर ट्रांसक्रिप्शन मशीन को सख्ती से परिभाषित क्षेत्रों तक पहुंच प्राप्त होगी। crispr-लोकस मुश्किल हो जाएगा? या हो सकता है कि जब फेज डीएनए के नए तत्व डाले जाते हैं तो पुनर्संयोजन प्रक्रियाओं को सरल बनाते हैं? या वे "विराम चिह्न" हैं जो सीआरआईएसपीआर प्रसंस्करण के लिए अनिवार्य हैं? गोगोल के प्लायस्किन के तरीके से जीवाणु कोशिका के व्यवहार की व्याख्या करने वाले जैविक कारण का समय पर पता चल जाएगा।

crispr, एक जीवाणु और एक फेज के बीच संबंधों का "क्रोनिकल" होने के कारण, फ़ाइलोजेनेटिक अध्ययन में उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, हाल ही में की गई टाइपिंग के अनुसार crisprप्लेग माइक्रोब के अलग-अलग उपभेदों के विकास को देखना संभव बना दिया ( येर्सिनिया पेस्टिस) उन्हें तलाशना crispr- "वंशावली" आधा हजार साल पहले की घटनाओं पर प्रकाश डालती है, जब उपभेद अब चीन से संबंधित क्षेत्र से मंगोलिया में प्रवेश करते थे। लेकिन सभी बैक्टीरिया और विशेष रूप से रोगजनकों के लिए नहीं, यह विधि लागू होती है। टुलारेमिया में अनुमानित सीआरआईएसपीआर-प्रसंस्करण प्रोटीन के हालिया साक्ष्य के बावजूद ( फ़्रांसिसेला तुलारेन्सिस) और हैजा, CRISPR स्वयं, यदि उनके जीनोम में मौजूद है, तो असंख्य नहीं हैं। शायद चरण, जीवाणु साम्राज्य के रोगजनक प्रतिनिधियों द्वारा विषाणु के अधिग्रहण में उनके सकारात्मक योगदान को देखते हुए, इतने हानिकारक और खतरनाक नहीं हैं कि सीआरआईएसपीआर का उपयोग करके उनसे संरक्षित किया जा सके? या इन जीवाणुओं पर हमला करने वाले वायरस बहुत विविध हैं, और उनके खिलाफ आरएनए प्रतिरक्षा को "हस्तक्षेप" करने की रणनीति बेकार है?

चित्रा 3. राइबोसविच के संचालन के कुछ तंत्र।राइबोस्विच (राइबोस्विच) मैसेंजर आरएनए में निर्मित होते हैं, लेकिन वे विशिष्ट लिगैंड्स के आधार पर गठनात्मक व्यवहार की एक बड़ी स्वतंत्रता से प्रतिष्ठित होते हैं, जो राइबोस्विच को छोटे आरएनए की स्वतंत्र इकाइयों के रूप में मानने का कारण देता है। अभिव्यक्ति मंच की संरचना में परिवर्तन mRNA पर राइबोसोम प्रवेश स्थल को प्रभावित करता है ( आरबीएस), और, परिणामस्वरूप, पढ़ने के लिए सभी mRNA की उपलब्धता निर्धारित करता है। राइबोस्विच कुछ हद तक शास्त्रीय मॉडल में ऑपरेटर डोमेन के समान हैं एलएसी-ऑपरॉन - लेकिन केवल aptameric क्षेत्रों को आमतौर पर कम आणविक भार वाले पदार्थों द्वारा नियंत्रित किया जाता है और डीएनए के बजाय mRNA के स्तर पर जीन के काम को स्विच करते हैं। ए - लिगैंड्स की अनुपस्थिति में, राइबोस्विच btuB (कोबालिन ट्रांसपोर्टर)और थिएम (थियामिन पाइरोफॉस्फेट-आश्रित), जो mRNA के गैर-न्यूक्लियोलाइटिक दमन को अंजाम देते हैं, "स्विच ऑन" होते हैं ( पर) और राइबोसोम को अपना काम करने दें। लिगैंड को राइबोस्विच से बांधना ( बंद-स्थिति) एक हेयरपिन के निर्माण की ओर ले जाती है, जो इस साइट को राइबोसोम के लिए दुर्गम बनाती है। बी - लाइसिन राइबोस्विच एलआईएससीलिगैंड की अनुपस्थिति में भी शामिल है ( पर) राइबोस्विच को बंद करना राइबोसोम को mRNA तक पहुँचने से रोकता है। लेकिन ऊपर वर्णित राइबोस्विच के विपरीत, लाइसिन स्विच में, जब स्विच बंद हो जाता है, तो क्षेत्र एक विशेष RNase कॉम्प्लेक्स द्वारा काटा जाता है ( अपमानजनक), और सभी mRNA का उपयोग किया जाता है, छोटे टुकड़ों में तोड़ दिया जाता है। इस मामले में राइबोस्विच दमन को न्यूक्लियोलाइटिक कहा जाता है ( न्यूक्लियोलाइटिक) और अपरिवर्तनीय है क्योंकि, उदाहरण के विपरीत ( ए ), रिवर्स स्विचिंग (वापस करने के लिए पर) अब संभव नहीं है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि "अनावश्यक" mRNAs के एक समूह का उपयोग इस तरह से प्राप्त किया जा सकता है: एक राइबोसविच बच्चों के निर्माण किट के एक भाग के समान है, और कार्यात्मक रूप से संबंधित टेम्पलेट अणुओं के एक पूरे समूह में समान स्विच हो सकते हैं संरचना।

राइबोस्विच - बैक्टीरिया के लिए सेंसर

तो, प्रोटीन से जुड़े छोटे आरएनए होते हैं, छोटे आरएनए होते हैं जो बैक्टीरिया के अपने एमआरएनए में हस्तक्षेप करते हैं, साथ ही आरएनए वायरस से बैक्टीरिया द्वारा कब्जा कर लिया जाता है और फेज डीएनए को दबा देता है। क्या छोटे आरएनए की मदद से विनियमन के किसी अन्य तंत्र की कल्पना करना संभव है? यह हाँ निकला। यदि हम उपरोक्त का विश्लेषण करते हैं, तो यह पाया जाएगा कि एंटीसेंस विनियमन के सभी मामलों में, छोटे आरएनए और लक्ष्य का हस्तक्षेप दो के संकरण के परिणामस्वरूप मनाया जाता है। व्यक्तिअणु। छोटे आरएनए की व्यवस्था क्यों नहीं प्रतिलेख के भीतर ही? फिर यह संभव है, एमआरएनए के अंदर इस तरह के "गलत तरीके से संचालित कोसैक" की संरचना को बदलने के लिए, अनुवाद के दौरान पढ़ने के लिए पूरे टेम्पलेट की उपलब्धता को बदलने के लिए या, जो कि अधिक समीचीन ऊर्जावान रूप से, एमआरएनए बायोसिंथेसिस को विनियमित करने के लिए, यानी। प्रतिलेखन!

ऐसी संरचनाएं जीवाणु कोशिकाओं में व्यापक रूप से मौजूद होती हैं और इन्हें राइबोस्विच के रूप में जाना जाता है ( राइबोस्विच) वे जीन के कोडिंग भाग की शुरुआत से पहले, mRNA के 5' छोर पर स्थित होते हैं। सशर्त रूप से, दो संरचनात्मक रूपांकनों को राइबोसविच की संरचना में प्रतिष्ठित किया जा सकता है: aptamer क्षेत्र, लिगैंड (प्रभावक) के लिए बाध्य करने के लिए जिम्मेदार, और अभिव्यक्ति मंचवैकल्पिक स्थानिक संरचनाओं के लिए mRNA के संक्रमण के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का विनियमन प्रदान करना। उदाहरण के लिए, इस तरह के एक स्विच ("ऑफ" प्रकार) का उपयोग संचालित करने के लिए किया जाता है लाइसिन ऑपेरॉन: लाइसिन की अधिकता के साथ, यह एक "पेचीदा" स्थानिक संरचना के रूप में मौजूद होता है जो ऑपेरॉन से पढ़ने को अवरुद्ध करता है, और लाइसिन की कमी के साथ, राइबोस्विच "अनइंड्स" और लाइसिन बायोसिंथेसिस के लिए आवश्यक प्रोटीन संश्लेषित होते हैं (चित्र 3।) )

राइबोसविच डिवाइस का वर्णित योजनाबद्ध आरेख एक कैनन नहीं है, विकल्प हैं। विब्रियो हैजा में एक जिज्ञासु "स्विचिंग" अग्रानुक्रम राइबोस्विच पाया गया: अभिव्यक्ति मंच से पहले है एक साथ दोउपयुक्त साइट। जाहिर है, यह सेल में एक और अमीनो एसिड - ग्लाइसिन की उपस्थिति के लिए अधिक संवेदनशीलता और एक आसान प्रतिक्रिया प्रदान करता है। संभवतः, एंथ्रेक्स जीनोम में "डबल" राइबोस्विच अप्रत्यक्ष रूप से जीवाणु की उच्च जीवित रहने की दर में शामिल है ( कीटाणु ऐंथरैसिस) यह उस यौगिक के प्रति प्रतिक्रिया करता है जो इस सूक्ष्म जीव के लिए महत्वपूर्ण है - थायमिन पायरोफॉस्फेट, जो न्यूनतम वातावरण का हिस्सा है।

जीवाणु कोशिका के लिए उपलब्ध "मेनू" के आधार पर चयापचय पथों को बदलने के अलावा, राइबोस्विच जीवाणु होमियोस्टेसिस के सेंसर हो सकते हैं। इस प्रकार, उन्हें पढ़ने के लिए जीन उपलब्धता के नियमन में देखा गया था जब कोशिका के अंदर ट्रांसलेशनल सिस्टम की कार्यप्रणाली बाधित होती है (उदाहरण के लिए, "अनचार्ज्ड" टीआरएनए और "दोषपूर्ण" (रुके हुए) राइबोसोम की उपस्थिति जैसे संकेत), या जब पर्यावरणीय कारक बदलते हैं (उदाहरण के लिए, तापमान वृद्धि)।

प्रोटीन की जरूरत नहीं है, हमें आरएनए दें!

तो एक जीवाणु के भीतर इस तरह के विभिन्न प्रकार के छोटे आरएनए नियामकों की उपस्थिति का क्या मतलब है? क्या यह अवधारणा को अस्वीकार करने का संकेत देता है, जब मुख्य "प्रबंधक" प्रोटीन होते हैं, या क्या हम एक और फैशन प्रवृत्ति देख रहे हैं? जाहिर है, न तो एक और न ही दूसरा। बेशक, कुछ छोटे आरएनए चयापचय पथों के वैश्विक नियामक हैं, जैसे कि उल्लिखित सीएसआरबी, जो सीएसआरसी के साथ मिलकर कार्बनिक कार्बन भंडारण के नियमन में शामिल है। लेकिन, जैविक प्रणालियों में कार्यों के दोहराव के सिद्धांत को ध्यान में रखते हुए, बैक्टीरिया के छोटे आरएनए की तुलना एक सामान्य निदेशक की तुलना में "संकट-विरोधी प्रबंधक" से अधिक की जा सकती है। तो, ऐसी परिस्थितियों में जब किसी सूक्ष्मजीव के जीवित रहने के लिए यह आवश्यक है तेजइंट्रासेल्युलर चयापचय को पुन: कॉन्फ़िगर करें, उनकी नियामक भूमिका समान कार्यों वाले प्रोटीन की तुलना में निर्णायक और अधिक प्रभावी हो सकती है। इस प्रकार, आरएनए नियामक तेजी से प्रतिक्रिया के लिए अधिक जिम्मेदार हैं, जो प्रोटीन के मामले में कम स्थिर और विश्वसनीय है: हमें यह नहीं भूलना चाहिए कि छोटा आरएनए अपनी 3 डी संरचना को बनाए रखता है और कमजोर हाइड्रोजन बांड द्वारा बाधित मैट्रिक्स पर बनाए रखा जाता है।

इन थीसिस की अप्रत्यक्ष पुष्टि हैजा विब्रियो के पहले से बताए गए छोटे आरएनए हो सकते हैं। इस जीवाणु के लिए, मानव शरीर में प्रवेश करना एक वांछनीय लक्ष्य नहीं है, बल्कि, जाहिरा तौर पर, एक आपात स्थिति है। इस मामले में विषाक्त पदार्थों का उत्पादन और विषाणु से जुड़े अन्य मार्गों की सक्रियता पर्यावरण और शरीर की कोशिकाओं के "बाहरी लोगों" के आक्रामक विरोध के लिए सिर्फ एक रक्षात्मक प्रतिक्रिया है। यहां "बचावकर्ता" छोटे आरएनए हैं - उदाहरण के लिए, क्यूआरआर, जो विब्रियो को तनावपूर्ण परिस्थितियों में जीवित रहने की रणनीति को संशोधित करने में मदद करते हैं, सामूहिक व्यवहार को बदलते हैं। इस परिकल्पना की परोक्ष रूप से छोटे RNA VrrA की खोज से भी पुष्टि की जा सकती है, जो तब सक्रिय रूप से संश्लेषित होता है जब शरीर में कंपन मौजूद होते हैं और Omp झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन को दबा देते हैं। संक्रमण के प्रारंभिक चरण में "हिडन" झिल्ली प्रोटीन मानव शरीर से एक शक्तिशाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने में मदद कर सकता है (चित्र 4)।

चित्रा 4. विब्रियो हैजा के रोगजनक गुणों के कार्यान्वयन में छोटे आरएनए। ए - विब्रियो हैजा अच्छा लगता है और जलीय वातावरण में अच्छी तरह से प्रजनन करता है। मानव शरीर शायद इस सूक्ष्म जीव के लिए मुख्य पारिस्थितिक स्थान नहीं है। बी - एक आक्रामक वातावरण में संक्रमण के संचरण के पानी या भोजन मार्ग के माध्यम से प्राप्त करना - मानव छोटी आंत - व्यवहार के संगठन के संदर्भ में कंपन एक छद्म जीव जैसा दिखने लगते हैं, जिसका मुख्य कार्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को रोकना और बनाना है उपनिवेश के लिए अनुकूल वातावरण। जीवाणु आबादी के भीतर क्रियाओं के समन्वय और शरीर के साथ उनकी बातचीत में झिल्ली पुटिकाओं का बहुत महत्व है। अंत तक, आंत में अस्पष्टीकृत पर्यावरणीय कारक vibrios (उदाहरण के लिए, VrrA) में छोटे RNAs की अभिव्यक्ति के लिए संकेत हैं। नतीजतन, पुटिकाओं के गठन का तंत्र शुरू हो जाता है, जो आंत में कम संख्या में विब्रियो कोशिकाओं के साथ गैर-इम्यूनोजेनिक होते हैं। वर्णित प्रभाव के अलावा, छोटे आरएनए ओएमपी झिल्ली प्रोटीन को "छिपाने" में मदद करते हैं जो मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए संभावित रूप से उत्तेजक होते हैं। छोटे RNAs Qrr1-4 की अप्रत्यक्ष भागीदारी के साथ, हैजा विष का गहन उत्पादन शुरू हो जाता है (चित्र में नहीं दिखाया गया है), जो हैजा विब्रियो की अनुकूली प्रतिक्रियाओं के स्पेक्ट्रम को पूरक करता है। में - पहले से ही कुछ घंटों के बाद, जीवाणु कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, और छोटे VrrA RNA का पूल कम हो जाता है, जो संभवतः झिल्ली प्रोटीन के संपर्क में आता है। "खाली" पुटिकाओं की संख्या भी धीरे-धीरे कम हो जाती है, और इस स्तर पर उन्हें एंटरोसाइट्स तक पहुंचाने वाले इम्युनोजेनिक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। जाहिरा तौर पर, यह एक जटिल संकेत के कार्यान्वयन के लिए "योजना" का हिस्सा है, जिसका अर्थ मानव शरीर से कंपन की निकासी को भड़काना है। एनबी: जीवाणु कोशिकाओं और एंटरोसाइट्स के आकार का अनुपात नहीं देखा गया है।

यह देखना दिलचस्प है कि छोटे आरएनए नियामकों के बारे में हमारी समझ कैसे बदल जाएगी जब आरएनएसेक प्लेटफार्मों पर नया डेटा प्राप्त होगा, जिसमें मुक्त-जीवित और गैर-कृषि योग्य रूपों पर भी शामिल है। "डीप सीक्वेंसिंग" का उपयोग करते हुए हाल के काम में पहले से ही अप्रत्याशित परिणाम मिले हैं, जो उत्परिवर्ती स्ट्रेप्टोकोकी में miRNA जैसे अणुओं की उपस्थिति का संकेत देते हैं। बेशक, इस तरह के डेटा की सावधानीपूर्वक जांच करने की आवश्यकता है, लेकिन, जैसा कि हो सकता है, यह विश्वास के साथ कहा जा सकता है कि बैक्टीरिया में छोटे आरएनए का अध्ययन कई आश्चर्य लाएगा।

धन्यवाद

शीर्षक आकृति, साथ ही चित्र 4 बनाते समय मूल विचार और संरचनागत डिज़ाइन, ईए से संबंधित हैं। लेख में अंक 2 की उपस्थिति विभाग के एसोसिएट प्रोफेसर की योग्यता है। जूलॉजी एसएफडीयू जी.बी. बख्ताद्ज़े। उन्होंने शीर्षक आकृति और आकृति 4 का वैज्ञानिक प्रूफरीडिंग और संशोधन भी किया। लेखक इस मामले में उनके धैर्य और रचनात्मक दृष्टिकोण के लिए उनका गहरा आभार व्यक्त करता है। मेरे सहयोगी, वरिष्ठ शोधकर्ता को विशेष धन्यवाद प्रयोगशाला रोस्तोव एंटी-प्लेग इंस्टीट्यूट सोरोकिन वी.एम. के रोगाणुओं की जैव रसायन। लेख के पाठ की चर्चा के लिए और बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए।

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