Medii speciale.

În bacteriologie, mediile nutritive uscate de producție industrială sunt utilizate pe scară largă, care sunt pulberi higroscopice care conțin toate componentele mediului, cu excepția apei. Pentru prepararea lor se folosesc digerări triptice de produse nealimentare ieftine (deșeuri de pește, făină de carne și oase, cazeină tehnică). Sunt convenabile pentru transport, pot fi depozitate pentru o lungă perioadă de timp, scutesc laboratoarele de procesul enorm de pregătire a mediilor și aduc problema standardizării mediilor mai aproape de rezolvare. Industria medicală produce medii uscate de Endo, Levin, Ploskirev, agar sulfit de bismut, agar nutritiv, carbohidrați cu indicator BP și altele.

termostate

Termostatele sunt folosite pentru cultivarea microorganismelor.

Un termostat este un dispozitiv care menține o temperatură constantă. Aparatul este format dintr-un incalzitor, o camera, pereti dubli intre care circula aer sau apa. Temperatura este controlată de un termostat. Temperatura optimă pentru reproducerea majorității microorganismelor este de 37°C.

ACTIVITATEA 7

TEMA: METODE DE IZOLARE A CULTURII AEROBICE PURE. ETAPE DE IZOLARE A CULTURII PURE A BACTERIILOR AEROBE PRIN METODA DECUPLĂRII MECANICE

Planul lecției

1. Conceptul de „cultură pură” a bacteriilor

2. Metode de izolare a culturilor pure prin separare mecanică

3. Metode biologice de izolare a culturilor pure

4. Metode de identificare a bacteriilor

Scopul lecției: Pentru a familiariza elevii cu diferite metode de izolare a culturilor pure, pentru a învăța cum să facă culturi cu o buclă, lovituri, înțepătură

Instrucțiuni pentru demonstrație

În habitatul lor natural, bacteriile se găsesc în asociații. Pentru a determina proprietățile microbilor, rolul lor în desfășurarea procesului patologic, este necesar să existe bacterii sub formă de populații omogene (culturi pure). O cultură pură este o colecție de indivizi bacterieni din aceeași specie cultivați pe un mediu nutritiv.

Metode de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe

Metoda Pasteur Metoda Koch Biologic Fizic

(are istoric (cablare de placă)

Sens)

Metoda chimică

Şciukevici

Modern

Semănat cu buclă Semănat cu spatulă

(metoda Drigalski)

Metode de izolare a culturilor pure:

1. Metodele de separare mecanică se bazează pe separarea microbilor prin frecarea succesivă a materialului de testat pe suprafața agarului.

a) Metoda Pasteur - este de importanță istorică, prevede diluarea secvențială a materialului de testat într-un mediu nutritiv lichid prin metoda laminare

b) Metoda Koch - metoda de aranjare a plăcilor - se bazează pe diluarea secvenţială a materialului de testat cu agar peptonă-carne, urmată de turnarea eprubetelor cu material diluat în vase Petri.

c) Metoda lui Drygalski - la semănat material abundent însămânțat cu microfloră, se folosesc 2-3 căni pentru semănatul succesiv cu o spatulă.

d) Semănat cu buclă în mișcări paralele.

2. Metodele biologice se bazează pe proprietățile biologice ale agenților patogeni.

a) Biologic - infecție a animalelor foarte sensibile, unde microbii se înmulțesc și se acumulează rapid. În unele cazuri, această metodă este singura care vă permite să izolați cultura agentului patogen de la o persoană bolnavă (de exemplu, cu tularemie), în alte cazuri este mai sensibilă (de exemplu, izolarea pneumococului la șoarecii albi). sau agentul cauzal al tuberculozei la cobai).

b) Chimic - bazat pe rezistența la acid a micobacteriilor. Pentru a elibera materialul de flora însoțitoare, acesta
tratat cu o soluție acidă. Doar bacilii tuberculi vor crește, deoarece microbii toleranți la acid sunt uciși de acid.

c) Metoda fizică se bazează pe rezistența sporilor la căldură. Pentru a izola culturile de bacterii formatoare de spori din
amestecuri, materialul se încălzește la 80°C și se inoculează pe un mediu nutritiv. Doar bacteriile cu spori vor crește, deoarece sporii lor au rămas în viață și au dat creștere.

d) Metoda lui Shukevich - bazată pe mobilitatea ridicată a proteusului vulgar, capabil să crească târâtor.

Metoda de preparare a plăcii de agar

MPA este topit într-o baie de apă, apoi răcit la 50-55°C. Gâtul flaconului este ars în flacăra unei lămpi cu alcool, vasele Petri se deschid astfel încât gâtul flacoanelor să intre, fără a atinge marginile vasului, se toarnă 10-15 ml MPA, se închide capacul, scuturați vasul astfel încât mediul să fie distribuit uniform, lăsați-l pe o suprafață orizontală până se solidifică. După uscare, plăcile cu agar pe placă se păstrează la rece.

Semănat în buclă

Se ia o picătură de material cu o buclă răcită steril, o margine a cupei este ușor deschisă cu mâna stângă, se introduce o buclă în interior și se fac câteva mișcări la marginea opusă într-un singur loc, apoi bucla este ruptă. iar materialul se inoculează cu mişcări paralele de la o margine la alta a cupei cu un interval de 5-6 mm. La începutul semănării, când vor fi mulți microbi pe buclă, vor da o creștere confluentă, dar cu fiecare lovitură a microbilor pe buclă, vor fi din ce în ce mai puțini microbi și vor rămâne solitari și vor da colonii izolate.

Semănat după metoda Drygalski

Această metodă este utilizată la însămânțarea materialului abundent însămânțat cu microfloră (puroi, fecale, spută). Pentru semănat conform metodei Drygalsky, se iau o spatulă și mai multe căni (3-4). O spatulă este o unealtă realizată din sârmă de metal sau din sticlă, îndoită sub formă de triunghi sau în formă de L. Materialul este introdus în prima cană cu o buclă sau pipetă și distribuit uniform cu o spatulă pe suprafața mediului, cu aceeași spatulă, fără a-l arde, materialul este frecat în mediul nutritiv din a doua ceașcă și apoi în a treia. Cu această inoculare, prima placă va avea o creștere confluentă, iar coloniile izolate vor crește în plăcile ulterioare.

Dacă, pe baza anumitor simptome ale plantelor și a rezultatelor examinării microscopice, se suspectează că agentul cauzal al bolii este o bacterie, următorul pas ar trebui să fie izolarea acesteia.

În acest caz, se presupune că agentul patogen este contaminat cu organisme asociate, adică există o populație mixtă. Pentru a obține agentul patogen ca o colonie de creștere separată, maceratul de țesut trebuie să fie striat pe mediu.

Semănatul cu accident vascular cerebral. O cantitate mică de macerat de țesut vegetal care conține bacterii se ia cu o ansă de inoculare calcinată și cu mișcări ușoare, fără a deteriora suprafața agarului, se aplică pe mediul nutritiv preparat cu 4-6 mișcări. După reaprinderea buclei, cupa cu mediu este întoarsă cu 90 ° la dreapta și apoi se aplică încă 4-6 mișcări de la a doua lovitură, acul este reaprins și se efectuează a treia inoculare. Se realizează astfel o astfel de diluare a materiei prime, în care bacteriile, după incubarea într-un termostat timp de 48-72 de ore la 28 ° C, formează colonii separate de diferite forme și culori. Coloniile sunt apoi transferate pentru studii suplimentare în tuburi de agar înclinat. O colonie este luată cu o buclă calcinată și, cu o mișcare atentă sub formă de șarpe sau în zig-zag, se aplică pe agar nutritiv.

Metoda de turnare Koch. Metoda de turnare Koch asigură că fiecare colonie este formată dintr-o singură celulă bacteriană. Cel mai bine este să suspendați materia primă în apă sterilă și să aplicați metoda Koch numai cu această diluție. O cantitate mică din suspensie este transferată în prima eprubetă cu un mediu nutritiv răcit la 60 °C. Apoi, conținutul tubului este amestecat cu inoculul prin rotirea acestuia între palme. Apoi, luați a doua eprubetă, deschideți-o cu atenție peste flacăra arzătorului și transferați trei părți din substrat în ea din prima eprubetă cu bucle mari. Conținutul eprubetei, după arderea gâtului și a dopului, se toarnă în primul vas Petri, deschizând ușor capacul cupei doar cât să se introducă gâtul eprubetei sub ea. Imediat după turnare, cana este închisă și mediul nutritiv este distribuit uniform cu mișcări atente.

După ce amestecați bine conținutul celei de-a doua eprubete, luați a treia eprubetă și transferați șase părți ale substratului în ea cu o buclă din a doua. Conținutul eprubetei se toarnă într-o cană, iar conținutul eprubetei, după amestecare, se toarnă într-o cană. Cupele cu mediu sunt incubate într-un termostat la 28°C, după câteva zile bacteriile conținute în materia primă formează colonii.

Creștere în serie. Dacă, de exemplu, este necesară izolarea bacteriilor din sol, atunci se utilizează diluția în serie. Mediul nutritiv steril (15 ml per farfurie) se toarnă în vase, 0,1 ml din ultimele trei diluții ale suspensiei se aplică pe agarul întărit și se întinde pe suprafață cu o spatulă de sticlă.

Pentru a izola bacteriile, 1 g de sol se suspendă în 9 ml de apă, se agită bine, se lasă să stea câteva secunde, iar din suspensie se prepară diluții în serie. Cu această metodă, se poate determina numărul de microorganisme din fiecare probă.

Dacă găsiți o eroare, evidențiați o bucată de text și faceți clic Ctrl+Enter.

Metoda Pasteur Metoda Koch Biologic Fizic

(are istoric (lamelar

valoare) cablare) Metoda chimică Shchukevich

Modern

Semănat cu buclă Semănat cu spatulă

(metoda Drigalski)

Metode de izolare a culturilor pure (Schema 11):

1. Metode de eliberare mecanică bazată pe separarea microbilor prin măcinarea succesivă a materialului de testat pe suprafața agarului.

A) Metoda Pasteur– are o importanță istorică, prevede diluarea secvențială a materialului de testat într-un mediu nutritiv lichid prin metoda laminare

b) metoda Koch- metoda de aranjare a plăcilor - bazată pe diluarea secvenţială a materialului de testat cu agar peptonă-carne, urmată de turnarea eprubetelor cu material diluat în vase Petri

în) Metoda Drygalski- la semănat material abundent însămânțat cu microfloră se folosesc 2-3 căni pentru semănatul succesiv cu spatula.

G) Semănat în buclă cu mișcări paralele.

2. metode biologice pe baza proprietăților biologice ale agenților patogeni.

A) Biologic- infectarea animalelor foarte sensibile, unde microbii se înmulțesc rapid și se acumulează. În unele cazuri, această metodă este singura care vă permite să izolați cultura agentului patogen de la o persoană bolnavă (de exemplu, cu tularemie), în alte cazuri este mai sensibilă (de exemplu, izolarea pneumococului la șoarecii albi). sau agentul cauzal al tuberculozei la cobai).

b) Chimic– bazat pe rezistența la acid a micobacteriilor. Pentru a elibera materialul de flora însoțitoare, acesta
tratat cu o soluție acidă. Doar bacilii tuberculi vor crește, deoarece microbii toleranți la acid sunt uciși de acid.

în) metoda fizica bazată pe rezistența sporilor la căldură. Pentru a izola culturile de bacterii formatoare de spori din
amestecuri, materialul se încălzește la 80°C și se inoculează pe un mediu nutritiv. Doar bacteriile cu spori vor crește, deoarece sporii lor au rămas în viață și au dat creștere.

G) metoda lui Șciukevici- bazat pe mobilitatea ridicată a proteusului vulgar, capabil să crească târâtor.

Metoda de transfer de la colonii la agar oblic și BCH:

A) Transferarea de la colonii la agar slant

Se deschide ușor capacul cupei, se îndepărtează o parte a unei colonii individuale cu o buclă răcită calcinată, se deschide o eprubetă cu agar înclinat steril, ținând-o în mâna stângă într-o poziție înclinată, astfel încât suprafața mediu poate fi observat. Bucla cu cultura este transferată în eprubetă fără a atinge pereții, frecată peste mediul nutritiv, alunecând pe suprafață de la un capăt la celălalt al eprubetei, ridicând loviturile până la vârful mediului - semănat cu un accident vascular cerebral. Tubul se inchide si, fara a da drumul, se semneaza numele microbului insamantat si data semanatului.

b) Se transferă din colonie în bulion de peptonă de carne

Tehnica de reînsămânțare pe MPB este practic aceeași ca la semănat pe un mediu dens. La semănat pe BCH, bucla cu materialul pe ea este scufundată în mediu. Dacă materialul este vâscos și nu este îndepărtat din buclă, este frecat pe peretele vasului și apoi spălat cu un mediu lichid. Materialul lichid colectat cu o pipetă Pasteur sterilă sau gradată este turnat într-un mediu nutritiv.

Ca rezultat al muncii independente, studentul ar trebui să știe:

1. Metode de izolare a unei culturi pure de microorganisme

2. Metode de cultivare a microorganismelor

A fi capabil să:

1. Abilități de a respecta regulile regimului antiepidemic și măsurile de siguranță

2. Dezinfectați materialul, tratați mâinile

3. Pregătiți preparate din colonii bacteriene

4. Microscopați coloniile

5. Microorganisme cu colorație Gram

ACTIVITATEA 8

SUBIECT. Metode de izolare a culturilor pure (continuare). Activitatea enzimatică a bacteriilor și metode pentru studiul acesteia.

Sunt cunoscute relativ puține metode pentru izolarea bacteriilor ca culturi pure. Acest lucru se realizează cel mai frecvent prin izolarea celulelor individuale pe medii de creștere solide, folosind metoda de inoculare cu striuri sau prin turnarea unei cantități mici de cultură lichidă în plăci ( metoda de diluare). Cu toate acestea, obținerea unei colonii separate nu garantează întotdeauna puritatea culturii, deoarece coloniile pot crește nu numai din celule individuale, ci și din grupurile lor. Dacă microorganismele formează mucus, atunci forme străine se atașează adesea de el. Pentru curățare, este de preferat să folosiți un mediu neselectiv (MPA) deoarece contaminanții cresc mai bine pe acesta și sunt mai ușor de detectat.

Obținerea coloniilor izolate pe un mediu nutritiv solid se realizează fie prin cernerea unei suspensii de microorganisme cu o spatulă ( metoda Koch), sau cu ajutorul unei bucle bacteriologice ( metoda accidentului vascular cerebral debilitant). Ca urmare a separării mecanice a celulelor microbiene, fiecare dintre ele poate da naștere la o colonie izolată dintr-o specie microbiană.

Cernerea cu spatula (metoda Koch) produs în următoarea secvență:

1) o picătură din cultura de îmbogățire se aplică pe suprafața mediului nutritiv din cana nr. 1 cu o pipetă sterilă și se distribuie cu o spatulă sterilă;

2) se scoate spatula, se inchide rapid cupa si se transfera spatula in cana nr. 2 fara a o steriliza. Simulați distribuția culturii pe întreaga suprafață a mediului atingând suprafața acestuia cu aceeași parte a spatulei care a fost folosită anterior pentru distribuirea probei;

3) exact aceleași acțiuni se efectuează în cana nr. 3, după care spatula este sterilizată;

4) cupele însămânțate sunt plasate într-un termostat și incubate la temperatura optimă.

După un anumit timp, cupele sunt scoase din termostat și se studiază creșterea microorganismelor. De obicei, în vasul nr. 1 se observă o creștere continuă a bacteriilor, coloniile sunt notate în vasele ulterioare.

Cernerea în buclă (metoda cursei de epuizare) implică inocularea unei anse bacteriologice dintr-o cultură de îmbogățire pe suprafața unui mediu de agar în cutii Petri. În prima etapă, se aplică o buclă cu cultura cu o serie de mișcări paralele pe mediul de agar (Figura 4.2, DAR). Ansa se sterilizează, se răcește pe partea neinoculată a mediului de agar și se trasează o serie de lovituri în direcția perpendiculară pe prima (Figura 4.2, B). Apoi bucla este sterilizată din nou, răcită și se aplică lovituri în direcție LA(Figura 4.2), iar după următoarea sterilizare - în direcția G(Figura 4.2). Cupele se pun intr-un termostat si dupa un anumit timp se iau in calcul rezultatele. De obicei pe lovituri DARși B un număr mare de colonii cresc (uneori creștere continuă), în timp ce pe stroke LAși G se formează colonii izolate.

Figura 4.2 - Schema de cernere a bacteriilor cu lovituri pentru a obține colonii izolate

Diluții în serie în medii solide- cea mai simplă metodă de inoculare în plăci, care constă în faptul că după inocularea probei într-o eprubetă cu agar steril topit și răcit, mediul se amestecă, se toarnă într-o cutie Petri și se lasă să se solidifice. Pentru a obține colonii bine izolate, se prepară o serie de diluții succesive de zece ori și se adaugă imediat 1 ml de probe în vas, se adaugă 15-20 ml de mediu de agar topit și se amestecă prin agitarea vasului. Uneori, coloniile individuale sunt scufundate în agar și pot fi îndepărtate numai mecanic. De asemenea, este rău că bacteriile sunt în mediu la temperatura agarului topit de ceva timp.

O cultură pură este o colecție de microorganisme aparținând aceleiași specii. Obținerea acestui material este un moment necesar de cercetare în implementarea tehnicilor de diagnostic de laborator. Pentru a izola culturile pure de bacterii, se folosesc frotiuri din sânge, spută, fecale, purulente, precum și alt material biologic este examinat. În condiții naturale (în aer, apă, sol), produse alimentare, în cadavre (umane, animale) sunt conținute asociații de diferite tipuri de microorganisme.

Separarea culturii pure este importantă pentru un studiu detaliat al proprietăților microbilor: morfologice, culturale, biochimice și, de asemenea, antigenice. Pe baza rezultatelor acestor metode de cercetare, se poate stabili că agentul patogen aparține unui anumit tip și tip, cu alte cuvinte, să se efectueze identificarea acestuia.

Principiile separării biologice a bacteriilor presupun luarea în considerare a caracteristicilor activității vitale a microbilor pentru a alege cele mai optime metode de cercetare. Metodele selectate trebuie să se potrivească cu agentul patogen în anumiți parametri.

1. Tipul de respirație. Dintre bacterii, se disting grupuri de reprezentanți aerobi și anaerobi. Pentru a obține microbi anaerobi, materialul de cercetare este încălzit. Următoarea etapă este cultivarea microbilor în condiții anaerobe. Metodele de obținere a bacteriilor aerobe și anaerobe sunt diferite.
2. Sporularea. Capacitatea unor bacterii de a sporula asigura protectia si siguranta microorganismelor.
3. Rezistența bacteriilor la efectele agresive ale alcalinelor și acizilor. Rezistența unor tipuri de bacterii la aceste substanțe asigură purificarea maximă a materialului de testat din amestecul altor bacterii folosind soluții alcaline sau acide.
4. Mobilitatea organismelor bacteriene. Pentru a separa o cultură pură de microorganisme mobile, se folosesc metodele de separare a culturilor de microbi într-o picătură de condensat.
5. Susceptibilitatea microorganismelor la antibiotice, anumite substanțe chimice și alți agenți antimicrobieni. Pentru unii agenți patogeni, metodele de izolare a culturii care utilizează medii nutritive selective (specifice) sunt cele mai preferate.
6. Antibiotice. Purifică materialul de microorganisme suplimentare.
7. Capacitatea bacteriilor de a pătrunde în pielea intactă. Această proprietate este inerentă unor soiuri care au factori de agresiune.
8. Susceptibilitatea animalelor la anumite boli de origine infecțioasă.

Metode de evaluare a agenților patogeni

O serie de metode sunt utilizate pentru a obține culturi pure de celule bacteriene. Fiecare dintre ele este utilizat într-o anumită situație și are pași succesivi clari pentru a obține colonii de agent patogen. Luați în considerare cel mai popular.

Tehnica Pasteur

Aceasta este diluarea culturilor pure în mediu de creștere bacteriană (consistență lichidă) la o concentrație de 1 celulă per volum de lichid. Această metodă de selecție are o mare importanță istorică.

tehnica lui Koch

Cunoscută și sub denumirea de tehnică de „întindere în farfurie”. Este o diluție a materialului pentru cercetare în agar (în stare topită cu o temperatură de 48-50 ° C). Apoi, compoziția rezultată este turnată în vase Petri, unde ar trebui să se solidifice.

Culturile sunt de obicei efectuate din ultimele 3-4 diluții, deoarece există deja puține bacterii acolo. Astfel, în timpul creșterii microbilor pe un mediu nutritiv, apar colonii izolate de microorganisme, care se nasc dintr-o singură celulă mamă. Apoi, o colonie izolată poate fi selectată din adâncimea agarului și transferată într-un mediu nutritiv proaspăt. Următorul pas este identificarea și izolarea agentului patogen.

tehnica lui Shukevich

Se utilizează atunci când este necesară izolarea unei culturi pure de Proteus aerobes sau a oricăror alți microbi caracterizați prin creștere „târâtoare”. Plantați culturile în apă condensată la baza oblicului de agar.

Cu această metodă de separare a unei culturi pure, organismele celulare mobile (Proteus) se ridică în partea superioară a oblicului de agar, iar formele imobile nu își schimbă locația pe mediul de semințe. Prin subcultivarea marginilor superioare ale culturii germinate se poate obtine o cultura bacteriana pura.

Tehnica lui Drygalsky

Metoda Drygalsky este folosită pe scară largă în studiul materialului biologic prin diluarea culturilor într-o eprubetă cu bulion sau ser fiziologic.

Următorul pas: folosind o spatulă sterilă de sticlă, o picătură din soluția rezultată este distribuită uniform pe suprafața mediului nutritiv din prima cană. Apoi, fără să ardă spatula pe foc, fac același semănat pe al 2-lea și al 3-lea vas. Esența metodei Drygalsky este că, cu fiecare însămânțare ulterioară a culturilor, concentrația de bacterii (aerobi) este din ce în ce mai mică. Pe placa a 3-a, sunt distribuite destul de separat, fiecare celulă bacteriană dă naștere la celule clonale (sub formă de colonie izolată). Sunt subcultivate pe agar oblic pentru acumularea agenților patogeni.

Tehnica Weinberg

Anumite dificultăți sunt cauzate de izolarea culturilor pure de agenți patogeni anaerobi dacă microorganismele nu mor la contactul cu moleculele de oxigen. Esența tehnicii este eliminarea microbilor anaerobi (din compoziția materialului) într-un mediu nutritiv topit ușor răcit (45-50 ° C) (agarosat). Petreceți 6-10 diluții. Apoi urmează următoarea etapă: este necesară răcirea rapidă a compoziției în eprubetă și umplerea suprafeței acesteia cu un amestec de vaselină și ulei de parafină, care împiedică pătrunderea aerului și favorizează dezvoltarea condițiilor anaerobe.

Cu semănat favorabil, în a doua zi germinează colonii izolate, care pot fi îndepărtate din tub prin încălzirea acestuia cu un arzător. Culturile sunt bucle din coloana de agar tăiat pentru examinare ulterioară. Coloniile rezultate sunt plasate într-un mediu nutritiv lichid, la care se pot parcurge etapele de izolare a coloniei de agenți patogeni anaerobi.

Tehnica Hungate

Este adesea folosit pentru a izola microbii aerobi cu sensibilitate ridicată la oxigen. În efectuarea unei astfel de izolări a culturii de aerobi, se utilizează tehnica eprubetelor rotative.

Metodele de inoculare a bacteriilor aerobe implică reproducerea lor pe un mediu de agar topit. Prezența unui gaz inert într-o eprubetă face posibilă creșterea coloanelor izolate de bacterii aerobe în așa fel încât culturile izolate de aerobi să poată fi văzute clar chiar și cu ochiul liber timp de 2-3 zile.

Micromanipulator

Aceasta este o tehnică pentru izolarea celulelor bacteriene individuale folosind un micromanipulator. Micromanipulatorul este un dispozitiv special care poate prinde o celulă dintr-o suspensie, precum și poate oferi posibilitatea de însămânțare a unei culturi într-o eprubetă.

Identificarea ulterioară a agentului patogen se realizează ținând cont de toate proprietățile enumerate ale agentului patogen (aerobi și anaerobi), precum și de caracteristicile interacțiunii lor cu diferite substanțe.