Halos lahat ng biochemical reactions ay enzymatic. Mga enzyme(biocatalysts) ay mga sangkap na may likas na protina na isinaaktibo ng mga metal na kasyon. Humigit-kumulang 2000 iba't ibang mga enzyme ang kilala, at humigit-kumulang 150 sa kanila ang nahiwalay, ang ilan ay ginagamit bilang mga gamot. Trypsin at chymotrypsin ay ginagamit upang gamutin ang brongkitis at pulmonya; pepsin - para sa paggamot ng gastritis; plasmin - para sa paggamot ng atake sa puso; pancreatin - para sa paggamot ng pancreas. Ang mga enzyme ay naiiba sa mga kumbensyonal na catalyst sa (a) mas mataas na aktibidad ng catalytic; (b) mataas na pagtitiyak, ibig sabihin. piling pagkilos.

Ang mekanismo ng isang solong substrate na reaksyon ng enzymatic ay maaaring kinakatawan ng scheme:

kung saan ang E ay isang enzyme,

S - substrate,

ES - enzyme-substrate complex,

Ang R ay ang produkto ng reaksyon.

Ang katangian ng unang yugto ng reaksyong enzymatic ay Michaelis constant (KM). Ang K M ay ang kapalit ng equilibrium constant:

ang Michaelis constant (KM) ay nagpapakilala sa katatagan ng enzyme-substrate complex (ES). Kung mas maliit ang Michaelis constant (KM), mas matatag ang complex.

Ang rate ng isang enzymatic reaction ay katumbas ng rate ng rate-limiting step nito:

kung saan ang k 2 ay ang rate constant, na tinatawag bilang ng mga rebolusyon o molekular na aktibidad ng enzyme.

molekular na aktibidad ng isang enzyme(k 2) ay katumbas ng bilang ng mga molekula ng substrate na sumasailalim sa mga pagbabagong-anyo sa ilalim ng impluwensya ng isang molekula ng enzyme sa 1 minuto sa 25 0 C. Ang pare-parehong ito ay tumatagal ng mga halaga sa saklaw: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Para sa urease, na nagpapabilis sa hydrolysis ng urea, k 2 = 1.85∙10 6 min‾ 1; para sa adenosine triphosphatase, na nagpapabilis sa hydrolysis ng ATP, k 2 = 6.24∙10 6 min‾ 1; para sa catalase, na nagpapabilis sa pagkabulok ng H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

Gayunpaman, ang kinetic equation ng enzymatic reaction sa anyo kung saan ito ay ibinigay sa itaas ay halos imposibleng gamitin dahil sa imposibilidad ng eksperimentong pagtukoy ng konsentrasyon ng enzyme-substrate complex (). Pagpapahayag sa mga tuntunin ng iba pang dami, madaling matukoy sa eksperimento, nakukuha natin ang kinetic equation ng mga reaksyong enzymatic, tinawag Michaelis-Menten equation (1913):

,

kung saan ang produkto k 2 [E]tot ay ang halaga ng pare-pareho, na tinutukoy ng (maximum na bilis).

Ayon sa pagkakabanggit:

Isaalang-alang ang mga espesyal na kaso ng Michaelis-Menten equation.

1) Sa mababang konsentrasyon ng substrate, K M >> [S], samakatuwid

na tumutugma sa kinetic equation ng first order reaction.

2) Sa isang mataas na konsentrasyon ng substrate K m<< [S], поэтому

na tumutugma sa kinetic equation ng zero order reaction.

Kaya, sa isang mababang konsentrasyon ng substrate, ang rate ng reaksyon ng enzymatic ay tumataas na may pagtaas sa nilalaman ng substrate sa system, at sa isang mataas na konsentrasyon ng substrate, ang kinetic curve ay umabot sa isang talampas (ang rate ng reaksyon ay hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng substrate) ( Larawan 30).

Figure 30. - Kinetic curve ng enzymatic reaction

Kung [S] = K M, kung gayon

na nagpapahintulot sa iyo na graphically na matukoy ang Michaelis constant K m (Fig. 31).

Figure 31. - Graphical na kahulugan ng Michaelis constant

Ang aktibidad ng enzyme ay naiimpluwensyahan ng: (a) temperatura, (b) acidity ng medium, (c) ang pagkakaroon ng mga inhibitor. Ang epekto ng temperatura sa rate ng isang reaksyong enzymatic ay tinalakay sa kabanata 9.3.

Ang impluwensya ng acidity ng medium sa rate ng enzymatic reaction ay ipinapakita sa Figure 32. Ang maximum na aktibidad ng enzyme ay tumutugma sa pinakamainam na halaga ng pH value (pH opt).

Figure 32. - Impluwensya ng kaasiman ng mga solusyon sa aktibidad ng mga enzyme

Para sa karamihan ng mga enzyme, ang pinakamainam na mga halaga ng pH ay nag-tutugma sa mga halaga ng physiological (7.3 - 7.4). Gayunpaman, may mga enzyme na nangangailangan ng isang malakas na acidic (pepsin - 1.5-2.5) o medyo alkalina na kapaligiran (arginase - 9.5 - 9.9) para sa kanilang normal na paggana.

Mga inhibitor ng enzyme- Ito ang mga sangkap na sumasakop sa bahagi ng mga aktibong sentro ng mga molekula ng enzyme, bilang isang resulta kung saan bumababa ang rate ng reaksyon ng enzymatic. Ang mga mabibigat na metal na kasyon, mga organikong acid at iba pang mga compound ay kumikilos bilang mga inhibitor.

Lektura 11

Ang istraktura ng atom

Mayroong dalawang kahulugan ng terminong "atom". Atom ay ang pinakamaliit na butil ng elementong kemikal na nagpapanatili ng mga katangiang kemikal nito.

Atom ay isang electrically neutral microsystem na binubuo ng isang positively charged nucleus at isang negatively charged electron shell.

Ang doktrina ng atom ay dumating sa isang mahabang paraan ng pag-unlad. Ang mga pangunahing yugto sa pagbuo ng atomistics ay kinabibilangan ng:

1) natural-pilosopiko yugto - ang panahon ng pagbuo ng konsepto ng atomic na istraktura ng bagay, hindi nakumpirma ng eksperimento (5th century BC - 16th century AD);

2) ang yugto ng pagbuo ng hypothesis tungkol sa atom bilang pinakamaliit na butil ng elemento ng kemikal (XVIII-XIX na siglo);

3) ang yugto ng paglikha ng mga pisikal na modelo na sumasalamin sa pagiging kumplikado ng istraktura ng atom at ginagawang posible na ilarawan ang mga katangian nito (simula ng ika-20 siglo)

4) ang modernong yugto ng atomistics ay tinatawag na quantum mechanical. Quantum mechanics ay isang sangay ng pisika na nag-aaral ng galaw ng elementarya na mga particle.

PLANO

11.1. Ang istraktura ng nucleus. Isotopes.

11.2. Quantum-mechanical na modelo ng electron shell ng atom.

11.3. Mga katangiang pisikal at kemikal ng mga atomo.

Ang istraktura ng nucleus. isotopes

nucleus ng atom- Ito ay isang particle na may positibong charge, na binubuo ng mga proton, neutron at ilang iba pang elementarya na particle.

Karaniwang tinatanggap na ang mga pangunahing elementong particle ng nucleus ay mga proton at neutron. Proton (p) - ito ay isang elementarya na particle na ang relatibong atomic mass ay 1 amu at ang relatibong singil ay + 1. Neutron (n) - ito ay isang elementarya na particle na walang electric charge, ang masa nito ay katumbas ng mass ng isang proton.

Ang nucleus ay naglalaman ng 99.95% ng masa ng isang atom. Ang mga espesyal na puwersang nuklear ng extension ay kumikilos sa pagitan ng mga elementarya na particle, na makabuluhang lumampas sa mga puwersa ng electrostatic repulsion.

Ang pangunahing katangian ng isang atom ay singilin kanyang nuclei, katumbas ng bilang ng mga proton at kasabay ng serial number ng elemento sa periodic system ng mga elemento ng kemikal. Ang isang koleksyon (uri) ng mga atom na may parehong nuclear charge ay tinatawag elemento ng kemikal. Ang mga elemento na may mga numero mula 1 hanggang 92 ay matatagpuan sa kalikasan.

isotopes- Ito ay mga atomo ng parehong elemento ng kemikal na naglalaman ng parehong bilang ng mga proton at ibang bilang ng mga neutron sa nucleus.

kung saan ang mass number (A) ay ang masa ng nucleus, z ang singil ng nucleus.

Ang bawat elemento ng kemikal ay pinaghalong isotopes. Bilang isang patakaran, ang pangalan ng isotopes ay tumutugma sa pangalan ng isang elemento ng kemikal. Gayunpaman, ang mga espesyal na pangalan ay ipinakilala para sa hydrogen isotopes. Ang kemikal na elemento ng hydrogen ay kinakatawan ng tatlong isotopes:

Bilang p Bilang n

Protium H 1 0

Deuterium D 1 1

Tritium T 1 2

Ang isotopes ng isang elemento ng kemikal ay maaaring maging matatag o radioactive. Ang radioactive isotopes ay naglalaman ng nuclei na kusang bumagsak sa paglabas ng mga particle at enerhiya. Ang katatagan ng isang nucleus ay tinutukoy ng neutron-proton ratio nito.

Ang pagpasok sa katawan, ang mga radionuclides ay nakakagambala sa kurso ng pinakamahalagang proseso ng biochemical, binabawasan ang kaligtasan sa sakit, ipahamak ang katawan sa mga sakit. Pinoprotektahan ng katawan ang sarili mula sa mga epekto ng radiation sa pamamagitan ng piling pagsipsip ng mga elemento mula sa kapaligiran. Ang mga matatag na isotopes ay nangunguna sa radioactive isotopes. Sa madaling salita, hinaharangan ng mga matatag na isotopes ang akumulasyon ng radioactive isotopes sa mga buhay na organismo (Talahanayan 8).

Ang aklat ni S. Shannon na "Nutrition in the Atomic Age" ay nagbibigay ng sumusunod na data. Kung ang isang blocking na dosis ng isang matatag na isotope ng yodo, katumbas ng ~100 mg, ay kinuha nang hindi lalampas sa 2 oras pagkatapos pumasok sa katawan ang I-131, kung gayon ang pagsipsip ng radioiodine sa thyroid gland ay bababa ng 90%.

Ginagamit ang mga radioisotop sa medisina

para sa diagnosis ng ilang mga sakit,

para sa paggamot ng lahat ng uri ng kanser,

para sa pag-aaral ng pathophysiological.

Talahanayan 8 - Epekto ng pagharang ng mga matatag na isotopes

Kinetics ng mga reaksyong enzymatic. Pinag-aaralan ng kinetics ang mga rate, mekanismo ng mga reaksyon at ang impluwensya ng mga kadahilanan tulad ng konsentrasyon ng mga enzyme at substrate, temperatura, pH ng medium, ang pagkakaroon ng mga inhibitor o activator.

Sa isang pare-parehong konsentrasyon ng substrate, ang rate ng reaksyon ay direktang proporsyonal sa konsentrasyon ng enzyme. Ang graph ng dependence ng rate ng enzymatic reaction sa konsentrasyon ng substrate ay may anyo ng isosceles hyperbola.

Ang pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng enzyme (a) at substrate (b)

Ang pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng substrate ay inilarawan Michaelis-Menten equation:

kung saan ang V ay ang nakatigil na rate ng biochemical reaction; Vmax - pinakamataas na bilis; Km - Michaelis pare-pareho; [S] - konsentrasyon ng substrate.

Kung mababa ang konsentrasyon ng substrate, ibig sabihin, [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Pagkatapos

Kaya, sa mababang konsentrasyon ng substrate, ang rate ng reaksyon ay direktang proporsyonal sa konsentrasyon ng substrate at inilalarawan ng isang first-order equation. Ito ay tumutugma sa unang tuwid na seksyon ng curve V = f[S] (figure b).

Sa mataas na konsentrasyon ng substrate [S] >> Km, kapag ang Km ay maaaring mapabayaan, ang Michaelis-Menten equation ay nasa anyo, i.e. V=Vmax.

Kaya, sa mataas na konsentrasyon ng substrate, ang rate ng reaksyon ay nagiging maximum at inilalarawan ng isang zero order equation. Ito ay tumutugma sa isang seksyon ng curve V =f [S], parallel sa x-axis.

Sa mga konsentrasyon ng substrate ayon sa numerong maihahambing sa Michaelis constant, unti-unting tumataas ang rate ng reaksyon. Ito ay medyo pare-pareho sa mga ideya tungkol sa mekanismo ng reaksyon ng enzymatic:

kung saan ang S ay ang substrate; E - enzyme; ES - enzyme-substrate complex; P - produkto; k1 ay ang rate na pare-pareho para sa pagbuo ng enzyme-substrate complex; Ang k2 ay ang rate ng pare-pareho ng agnas ng enzyme-substrate complex na may pagbuo ng mga paunang reagents; Ang k3 ay ang rate ng pare-pareho ng agnas ng enzyme-substrate complex sa pagbuo ng produkto.

Rate ng Conversion ng substrate na may pagbuo ng produkto (P) ay proporsyonal sa konsentrasyon ng enzyme-substrate complex. Sa mababang konsentrasyon ng substrate, ang solusyon ay naglalaman ng isang tiyak na bilang ng mga libreng molekula ng enzyme (E) na hindi nakagapos sa isang complex (ES). Samakatuwid, sa isang pagtaas sa konsentrasyon ng substrate, ang konsentrasyon ng mga complex ay tumataas, at, dahil dito, ang rate ng pagbuo ng produkto ay tumataas din. Sa mataas na konsentrasyon ng substrate, ang lahat ng mga molekula ng enzyme ay nakatali sa isang ES complex (enzyme saturation phenomenon), samakatuwid, ang karagdagang pagtaas sa konsentrasyon ng substrate ay halos hindi nagpapataas ng konsentrasyon ng mga complex, at ang rate ng pagbuo ng produkto ay nananatiling pare-pareho.

Kaya, ang pisikal na kahulugan ng pinakamataas na rate ng reaksyon ng enzymatic ay nagiging malinaw. Ang Vmax ay ang bilis ng reaksyon ng isang enzyme, na ganap na umiiral bilang enzyme-substrate complex..

Ang pare-parehong Michaelis ay tumutugma ayon sa numero sa naturang konsentrasyon ng substrate kung saan ang nakatigil na bilis ay katumbas ng kalahati ng maximum. Ang pare-parehong ito ay nagpapakilala sa dissociation constant ng enzyme-substrate complex:

Ang pisikal na kahulugan ng Michaelis constant sa na ito ay nagpapakilala sa affinity ng enzyme para sa substrate. Ang Km ay may maliliit na halaga kapag k1 > (k2 + k3), i.e. nangingibabaw ang proseso ng pagbuo ng ES complex sa mga proseso ng dissociation ng ES. Samakatuwid, mas mababa ang halaga ng Km, mas malaki ang affinity ng enzyme para sa substrate. Sa kabaligtaran, kung ang Km ay malaki, kung gayon (k2 + k3) > k1 at mga proseso ng dissociation ng ES ang nangingibabaw. Sa kasong ito, mababa ang affinity ng enzyme para sa substrate.

Mga inhibitor at activator ng enzyme . Mga inhibitor ng enzyme tinatawag na mga sangkap na nagpapababa sa aktibidad ng mga enzyme. Anumang mga ahente ng denaturation (halimbawa, mga heavy metal salts, acids) ay mga non-specific na enzyme inhibitors.

Mga nababaligtad na inhibitor ay mga compound na nakikipag-ugnayan ng non-covalently sa isang enzyme. hindi maibabalik na mga inhibitor- ito ay mga compound na partikular na nagbubuklod sa mga functional na grupo ng aktibong sentro at bumubuo ng mga covalent bond sa enzyme.

Ang nababaligtad na pagsugpo ay nahahati sa mapagkumpitensya at hindi mapagkumpitensya. Competitive inhibition nagmumungkahi ng pagkakatulad sa istruktura sa pagitan ng inhibitor at substrate. Ang inhibitor ay sumasakop sa isang lugar sa aktibong site ng enzyme, at isang makabuluhang bilang ng mga molekula ng enzyme ay naharang. Maaaring alisin ang mapagkumpitensyang pagsugpo sa pamamagitan ng pagtaas ng konsentrasyon ng substrate. Sa kasong ito, inilipat ng substrate ang mapagkumpitensyang inhibitor mula sa aktibong site.

Reversible inhibition ay maaaring hindi mapagkumpitensya tungkol sa substrate. Sa kasong ito, ang inhibitor ay hindi nakikipagkumpitensya para sa site ng attachment sa enzyme. Ang substrate at ang inhibitor ay nagbubuklod sa iba't ibang mga site, kaya mayroong posibilidad ng pagbuo ng IE complex, pati na rin ang ternary IES complex, na maaaring mabulok sa paglabas ng produkto, ngunit sa mas mabagal na rate kaysa sa ES complex .

Sa pamamagitan ng ang kalikasan ng iyong pagkilos Ang mga inhibitor ay nahahati sa:

• tiyak,
• hindi tiyak.

Mga partikular na inhibitor magkaroon ng kanilang epekto sa enzyme, na sumasali sa isang covalent bond sa aktibong sentro ng enzyme at pinapatay ito mula sa globo ng pagkilos.

Di-tiyak na pagsugpo nagsasangkot ng epekto sa enzyme ng denaturing agent (mga asin ng mabibigat na metal, urea, atbp.). Sa kasong ito, bilang isang resulta ng pagkasira ng quaternary at tertiary na istraktura ng protina, ang biological na aktibidad ng enzyme ay nawala.

Mga Aktibidad ng Enzyme ay mga sangkap na nagpapataas ng bilis ng isang reaksyong enzymatic. Kadalasan, ang mga metal ions (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, atbp.) ay kumikilos bilang mga activator. Pagkilala sa pagitan ng mga metal na bahagi ng metalloenzymes, na cofactors at kumikilos bilang enzyme activators. Ang mga cofactor ay maaaring magbigkis nang malakas sa bahagi ng protina ng enzyme, ngunit para sa mga activator, madali silang mahihiwalay sa apoenzyme. Ang mga naturang metal ay obligadong kalahok sa catalytic act, na tumutukoy sa aktibidad ng enzyme. Mga activator mapahusay ang catalytic effect, ngunit ang kanilang kawalan ay hindi pumipigil sa reaksyon ng enzymatic na magpatuloy. Bilang isang patakaran, ang metal cofactor ay nakikipag-ugnayan sa mga negatibong sisingilin na grupo ng substrate. Ang isang metal na may variable na valence ay nakikibahagi sa pagpapalitan ng mga electron sa pagitan ng substrate at ng enzyme. Bilang karagdagan, sila ay kasangkot sa pagbuo ng isang matatag na transitional conformation ng enzyme, na nag-aambag sa isang mas mabilis na pagbuo ng ES complex.

Regulasyon ng aktibidad ng enzyme . Ang isa sa mga pangunahing mekanismo para sa pag-regulate ng metabolismo ay ang regulasyon ng aktibidad ng enzyme. Ang isang halimbawa ay allosteric regulation, regulasyon ng mga activator at inhibitor. Kadalasan ang kaso na ang huling produkto ng metabolic pathway ay isang inhibitor ng regulatory enzyme. Ang ganitong uri ng pagsugpo ay tinatawag retroinhibition, o negatibong feedback inhibition.

Maraming mga enzyme ang ginawa bilang hindi aktibong proenzyme precursors at pagkatapos ay isinaaktibo sa tamang oras sa pamamagitan ng bahagyang proteolysis. Bahagyang proteolysis- cleavage ng isang bahagi ng molekula, na humahantong sa isang pagbabago sa tertiary na istraktura ng protina at ang pagbuo ng aktibong sentro ng enzyme.

Ang ilang mga oligomeric enzymes ay maaaring magbago ng kanilang aktibidad dahil sa asosasyon - dissociations ng subunits kasama sa kanilang komposisyon.

Maraming mga enzyme ang matatagpuan sa dalawang anyo: bilang isang simpleng protina at bilang isang phosphoprotein. Ang paglipat mula sa isang anyo patungo sa isa pa ay sinamahan ng isang pagbabago sa aktibidad ng catalytic.

Ang rate ng isang enzymatic reaksyon ay depende sa dami ng enzyme, na sa cell ay tinutukoy ng ratio ng mga rate ng synthesis at pagkabulok nito. Ang ganitong paraan ng pag-regulate ng rate ng isang enzymatic na reaksyon ay isang mas mabagal na proseso kaysa sa regulasyon ng aktibidad ng enzyme.

Pinag-aaralan ng enzymatic kinetics ang rate ng mga reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme depende sa iba't ibang kondisyon (konsentrasyon, temperatura, pH, atbp.) ng kanilang pakikipag-ugnayan sa substrate.

Gayunpaman, ang mga enzyme ay mga protina na sensitibo sa impluwensya ng iba't ibang panlabas na impluwensya. Samakatuwid, kapag pinag-aaralan ang rate ng mga reaksyon ng enzymatic, higit sa lahat ang mga konsentrasyon ng mga reactant ay isinasaalang-alang, at ang impluwensya ng temperatura, pH ng daluyan, mga activator, inhibitor, at iba pang mga kadahilanan ay sinubukan na mabawasan at ang mga karaniwang kondisyon ay nilikha. Una, ito ang pinakamainam na halaga ng pH ng daluyan para sa enzyme na ito. Pangalawa, inirerekomenda na panatilihin ang temperatura sa 25°C, kung posible. Pangatlo, ang kumpletong saturation ng enzyme na may substrate ay nakakamit. Ang puntong ito ay lalong mahalaga, dahil sa isang mababang konsentrasyon ng substrate, hindi lahat ng mga molekula ng enzyme ay nakikilahok sa reaksyon (Larawan 6.5, a), na nangangahulugan na ang resulta ay malayo sa pinakamataas na posible. Ang pinakamataas na kapangyarihan ng catalyzed na reaksyon, ang iba pang mga bagay ay pantay, ay nakakamit kung ang bawat molekula ng enzyme ay kasangkot sa pagbabagong-anyo, i.e. sa isang mataas na konsentrasyon ng enzyme-substrate complex (Larawan 6.5, sa). Kung ang konsentrasyon ng substrate ay hindi matiyak ang kumpletong saturation ng enzyme (Larawan 6.5, b), kung gayon ang rate ng nagpapatuloy na reaksyon ay hindi umabot sa pinakamataas na halaga.

kanin. 65.

a- sa mababang konsentrasyon ng substrate; 6 - na may hindi sapat na konsentrasyon ng substrate; sa - kapag ang enzyme ay ganap na puspos ng substrate

Ang rate ng isang reaksyon ng enzymatic, na sinusukat sa ilalim ng mga kondisyon sa itaas, at ang kumpletong saturation ng enzyme na may substrate ay tinatawag maximum na rate ng reaksyon ng enzymatic (V).

Ang rate ng reaksyon ng enzymatic, na tinutukoy kapag ang enzyme ay hindi ganap na puspos ng substrate, ay tinutukoy v.

Ang enzymatic catalysis ay maaaring simpleng inilarawan ng scheme

kung saan ang F ay isang enzyme; S - substrate; FS - enzyme-substrate complex.

Ang bawat yugto ng prosesong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang tiyak na bilis. Ang yunit para sa pagsukat ng rate ng isang reaksyong enzymatic ay ang bilang ng mga moles ng substrate na na-convert sa isang yunit ng oras(tulad ng rate ng isang normal na reaksyon).

Ang pakikipag-ugnayan ng enzyme sa substrate ay humahantong sa pagbuo ng isang enzyme-substrate complex, ngunit ang prosesong ito ay nababaligtad. Ang mga rate ng pasulong at baligtad na mga reaksyon ay nakasalalay sa mga konsentrasyon ng mga reactant at inilarawan ng kaukulang mga equation:

Ang equation (6.3) ay may bisa sa equilibrium, dahil ang mga rate ng pasulong at pabalik na reaksyon ay pantay.

Ang pagpapalit ng mga rate ng direktang (6.1) at reverse (6.2) na mga reaksyon sa equation (6.3), makuha natin ang pagkakapantay-pantay:

Ang estado ng ekwilibriyo ay nailalarawan sa pamamagitan ng katumbas ekwilibriyong pare-pareho ang K p, katumbas ng ratio ng mga constant ng direkta at baligtad na reaksyon (6.5). Ang reciprocal ng equilibrium constant ay tinatawag substrate constant K s , o ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex:

Mula sa equation (6.6) ay malinaw na ang substrate constant ay bumababa sa isang mataas na konsentrasyon ng enzyme-substrate complex, i.e. na may mahusay na katatagan. Samakatuwid, ang substrate constant ay nagpapakilala sa affinity ng enzyme at ang substrate at ang ratio ng mga rate ng constant para sa pagbuo at dissociation ng enzyme-substrate complex.

Ang kababalaghan ng saturation ng isang enzyme na may substrate ay pinag-aralan nina Leonor Michaelis at Maud Mepten. Batay sa pagproseso ng matematika ng mga resulta, nakuha nila ang equation (6.7), na natanggap ang kanilang mga pangalan, kung saan malinaw na sa isang mataas na konsentrasyon ng substrate at isang mababang halaga ng pare-pareho ang substrate, ang rate ng reaksyon ng enzymatic ay may posibilidad. sa maximum. Gayunpaman, ang equation na ito ay limitado dahil hindi nito isinasaalang-alang ang lahat ng mga parameter:

Ang enzyme-substrate complex sa panahon ng reaksyon ay maaaring sumailalim sa mga pagbabago sa iba't ibang direksyon:

• ihiwalay sa orihinal na mga sangkap;
• ma-convert sa isang produkto kung saan ang enzyme ay pinaghihiwalay nang hindi nagbabago.

Samakatuwid, upang ilarawan ang pangkalahatang epekto ng proseso ng enzymatic, ang konsepto Michaelis constants K t, na nagpapahayag ng relasyon ng mga pare-pareho ng rate ng lahat ng tatlong reaksyon ng enzymatic catalysis (6.8). Kung ang parehong mga termino ay nahahati sa rate ng pare-pareho ng reaksyon ng pagbuo ng enzyme-substrate complex, kung gayon ang expression (6.9) ay makukuha:

Isang mahalagang corollary ang sumusunod mula sa equation (6.9): ang Michaelis constant ay palaging mas malaki kaysa sa substrate constant ng k 2 /kv

Sa bilang K t ay katumbas ng naturang konsentrasyon ng substrate kung saan ang rate ng reaksyon ay kalahati ng pinakamataas na posibleng rate at tumutugma sa naturang saturation ng enzyme na may substrate, tulad ng sa Fig. 6.5, b. Dahil sa pagsasagawa, hindi laging posible na makamit ang kumpletong saturation ng enzyme na may substrate, ito ay K t ginagamit upang ihambing ang mga kinetic na katangian ng mga enzyme.

Ang rate ng reaksyon ng enzymatic sa kaso ng hindi kumpletong saturation ng enzyme na may substrate (6.10) ay depende sa konsentrasyon ng enzyme-substrate complex. Ang koepisyent ng proporsyonalidad ay ang pare-parehong reaksyon para sa pagpapalabas ng enzyme at produkto, dahil binabago nito ang konsentrasyon ng enzyme-substrate complex:

Matapos ang mga pagbabagong-anyo, isinasaalang-alang ang mga dependency na ipinakita sa itaas, ang rate ng reaksyon ng enzymatic sa kaso ng hindi kumpletong saturation ng enzyme na may substrate ay inilarawan ng equation (6.11), i.e. depende sa mga konsentrasyon ng enzyme, substrate at ang kanilang pagkakaugnay Ks:

Ang graphical na pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng substrate ay hindi linear. Gaya ng nakikita mula sa Fig. 6.6, na may pagtaas sa konsentrasyon ng substrate, ang isang pagtaas sa aktibidad ng enzyme ay sinusunod. Gayunpaman, kapag ang maximum na saturation ng enzyme na may substrate ay naabot, ang rate ng enzymatic reaksyon ay nagiging maximum. Samakatuwid, ang kadahilanan na naglilimita sa rate ng reaksyon ay ang pagbuo ng isang enzyme-substrate complex.

Ipinakita ng pagsasanay na ang mga konsentrasyon ng mga substrate, bilang panuntunan, ay ipinahayag sa mga halaga na mas mababa kaysa sa pagkakaisa (10 6 -10 3 mol). Ito ay medyo mahirap na gumana sa mga naturang dami sa mga kalkulasyon. Samakatuwid, iminungkahi ni G. Lineweaver at D. Burke na ipahayag ang graphic na pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic hindi sa mga direktang coordinate, ngunit sa mga reverse. Nagpatuloy sila mula sa pag-aakalang para sa pantay na mga halaga, ang kanilang mga kapalit ay pantay din:

kanin. 6.6.

Pagkatapos ng pagbabagong-anyo ng expression (6.13), isang expression ay nakuha, tinatawag Lineweaver-Burk equation (6.14):

Ang graphical dependence ng Lineweaver-Burk equation ay linear (Fig. 6.7). Ang mga kinetic na katangian ng enzyme ay tinutukoy bilang mga sumusunod:

• ang segment na pinutol sa y-axis ay katumbas ng 1/V;
• ang segment na pinutol sa x-axis ay -1 /K t.

kanin. 6.7.

Ito ay pinaniniwalaan na ang paraan ng Lineweaver - Burke ay nagbibigay-daan sa iyo upang mas tumpak na matukoy ang maximum na rate ng reaksyon kaysa sa mga direktang coordinate. Ang mahalagang impormasyon tungkol sa pagsugpo ng enzyme ay maaari ding makuha mula sa graph na ito.

Mayroong iba pang mga paraan upang ibahin ang anyo ng Michaelis-Menten equation. Ginagamit ang mga graphic na dependency sa pag-aaral ng impluwensya ng iba't ibang panlabas na impluwensya sa proseso ng enzymatic.

Pinag-aaralan ng seksyong ito ng enzymology ang impluwensya ng iba't ibang salik sa bilis ng isang reaksyong enzymatic. Isinasaalang-alang ang pangkalahatang equation ng enzymatic catalysis ng reversible reaction ng pagbabago ng isang substrate sa isang produkto (1),

dapat pangalanan ang mga pangunahing salik na nakakaimpluwensya sa bilis ng isang reaksyong enzymatic: konsentrasyon ng substrate [S], konsentrasyon ng enzyme [E], at konsentrasyon ng produkto ng reaksyon [P].

Ang pakikipag-ugnayan ng ilang mga enzyme sa kanilang substrate ay maaaring ilarawan sa pamamagitan ng hyperbolic curve ng pag-asa ng enzymatic reaction rate V sa konsentrasyon ng substrate [S] (Fig. 19):

Fig. 19. Pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng substrate.

Tatlong mga segment ang maaaring makilala sa curve na ito, na maaaring ipaliwanag sa pamamagitan ng mga posisyon ng mekanismo ng pakikipag-ugnayan ng enzyme sa substrate: Ang OA ay ang segment ng direktang proporsyonal na pag-asa ng V sa [S], ang mga aktibong site ng enzyme. ay unti-unting napuno ng mga molekula ng substrate na may pagbuo ng isang hindi matatag na kumplikadong ES; seksyon AB - curvilinear dependence ng V sa [S], ang kumpletong saturation ng mga aktibong sentro ng enzyme na may mga substrate molecule ay hindi pa nakakamit. Ang ES complex bago maabot ang transition state ay hindi matatag, ang posibilidad ng back dissociation sa E at S ay mataas pa rin; seksyon BC - dependence ay inilarawan sa pamamagitan ng isang zero-order equation, ang seksyon ay parallel sa [S] axis, kumpletong saturation ng mga aktibong enzymes na may substrate molecules ay nakakamit, V=V max.

Ang katangiang hugis ng kurba ay inilarawan sa matematika ng Briggs-Haldane equation:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

kung saan ang Km ay ang Michaelis-Menten constant, ayon sa bilang na katumbas ng substrate concentration kung saan ang rate ng enzymatic reaction ay katumbas ng kalahating V max.

Kung mas mababa ang K m ng enzyme, mas mataas ang affinity ng enzyme para sa substrate, mas mabilis na maabot ang estado ng paglipat para sa substrate, at ito ay nagiging isang produkto ng reaksyon. Ang paghahanap para sa mga halaga ng Km para sa bawat substrate ng enzyme na may partikular na grupo ay mahalaga sa pagtukoy ng biological na papel ng enzyme na ito sa cell.

Para sa karamihan ng mga enzyme, imposibleng bumuo ng hyperbolic curve (Larawan 19) Sa kasong ito, ang double reciprocal na paraan (Lineweaver-Burk) ay ginagamit, i.e. naka-plot ang isang graphical na dependence na 1/[V] sa 1/[S] (Larawan 20). Ang paraan ng pagbuo ng gayong mga kurba sa isang eksperimento ay napaka-maginhawa kapag pinag-aaralan ang epekto ng iba't ibang uri ng mga inhibitor sa aktibidad ng mga enzyme (tingnan ang teksto sa ibaba).

Fig.20. Plot ng 1/[V] laban sa 1/[S] (Lineweaver-Burk method),

kung saan ang y-cut-off area - , at x – cut-off area - , ang padaplis ng anggulo α - .

Ang pag-asa ng enzymatic reaction rate V sa konsentrasyon ng enzyme [E].

Ang graphical na pag-asa na ito (Larawan 21) ay isinasaalang-alang sa pinakamainam na temperatura at pH ng kapaligiran, sa mga konsentrasyon ng substrate na makabuluhang mas mataas kaysa sa konsentrasyon ng saturation ng mga aktibong site ng enzyme.

kanin. 21. Impluwensya ng konsentrasyon ng enzyme sa rate ng reaksyon ng enzymatic.

Ang pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa konsentrasyon ng cofactor o coenzyme. Para sa mga kumplikadong enzyme, dapat tandaan na ang kakulangan ng mga coenzyme form ng bitamina sa hypovitaminosis, isang paglabag sa paggamit ng mga metal ions sa katawan ay kinakailangang humantong sa isang pagbawas sa konsentrasyon ng kaukulang mga enzyme na kinakailangan para sa kurso ng metabolic. mga proseso. Samakatuwid, dapat itong tapusin na ang aktibidad ng enzyme ay direktang nakasalalay sa konsentrasyon ng cofactor o coenzyme.

Impluwensya ng konsentrasyon ng mga produkto sa rate ng reaksyon ng enzymatic. Para sa mga nababaligtad na reaksyon na nagaganap sa katawan ng tao, dapat itong isaalang-alang na ang mga produkto ng direktang reaksyon ay maaaring gamitin ng enzyme bilang mga substrate para sa reverse reaction. Samakatuwid, ang direksyon ng daloy at ang sandali ng pag-abot sa V max ay nakasalalay sa ratio ng mga konsentrasyon ng mga paunang substrate at mga produkto ng reaksyon. Halimbawa, ang aktibidad ng alanine aminotransferase, na nagpapagana sa pagbabagong-anyo:

Alanine + Alpha-ketoglutarate ↔ Pyruvate + Glutamate

depende sa cell sa ratio ng mga konsentrasyon:

[alanine + alpha-ketoglutarate] / [pyruvate + glutamate].

MECHANISM OF ENZYME ACTION. MGA TEORYA NG ENZYMATIVE CATALYSIS

Ang mga enzyme, tulad ng mga non-protein catalyst, ay nagpapataas ng rate ng isang kemikal na reaksyon dahil sa kanilang kakayahang babaan ang activation energy ng reaksyong iyon. Ang activation energy ng isang enzymatic reaction ay kinakalkula bilang ang pagkakaiba sa pagitan ng energy value sa system ng patuloy na reaksyon na umabot sa transition state at ang energy na tinutukoy sa simula ng reaction (tingnan ang graphical dependence sa Fig. 22).

kanin. 22. Graphical na pag-asa ng estado ng enerhiya ng isang kemikal na reaksyon na walang enzyme (1) at sa pagkakaroon ng isang enzyme (2) sa oras ng reaksyon.

Ang mga gawa ni V. Henry at, sa partikular, L. Michaelis, M. Menten sa pag-aaral ng mekanismo ng monosubstrate reversible enzymatic reactions ay naging posible na mag-postulate na ang enzyme E ay unang nababaligtad at medyo mabilis na pinagsama sa substrate nito na S upang mabuo. isang enzyme-substrate complex (ES):

E+S<=>ES (1)

Ang pagbuo ng ES ay nangyayari dahil sa mga bono ng hydrogen, electrostatic, hydrophobic na pakikipag-ugnayan, sa ilang mga kaso covalent, mga bono ng koordinasyon sa pagitan ng mga side radical ng mga residue ng amino acid ng aktibong sentro at ang mga functional na grupo ng substrate. Sa kumplikadong mga enzyme, ang hindi protina na bahagi ng istraktura ay maaari ring gumanap ng pag-andar ng pakikipag-ugnay sa substrate.

Ang enzyme-substrate complex pagkatapos ay nasira sa pangalawang mas mabagal na reversible reaction upang mabuo ang reaksyong produkto P at ang libreng enzyme E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

Sa kasalukuyan, salamat sa gawain ng mga nabanggit na siyentipiko, gayundin kay Kaylin D., Chance B., Koshland D. (ang teorya ng "induced conformity"), mayroong mga probisyon sa teoretikal sa apat na pangunahing punto sa mekanismo ng pagkilos ng enzyme sa substrate, na tumutukoy sa kakayahan ng mga enzyme na mapabilis ang mga reaksiyong kemikal.

1. Oryentasyon at kalapitan . Nagagawa ng enzyme na itali ang molekula ng substrate sa paraang ang bono na inaatake ng enzyme ay hindi lamang matatagpuan sa kalapit na pangkat ng catalytic, kundi pati na rin ang wastong nakatuon sa paggalang dito. Ang posibilidad na maabot ng ES complex ang estado ng paglipat dahil sa oryentasyon at diskarte ay lubhang nadagdagan.

2. Stress at strain : induced fit. Ang pag-attach ng substrate ay maaaring maging sanhi ng mga pagbabago sa conformational sa molekula ng enzyme, na humahantong sa pag-igting sa istraktura ng aktibong site, pati na rin ang medyo deform sa nakagapos na substrate, sa gayon pinapadali ang pagkamit ng estado ng paglipat ng ES complex. Mayroong tinatawag na sapilitan na pagsusulatan sa pagitan ng mga molekula ng E at S.

TRABAHO NG KURSO

Kinetics ng mga reaksyong enzymatic

Panimula

Ang batayan ng buhay ng anumang organismo ay mga proseso ng kemikal. Halos lahat ng mga reaksyon sa isang buhay na organismo ay nagpapatuloy sa pakikilahok ng mga natural na biocatalyst - mga enzyme.

Si Berzelius noong 1835 sa unang pagkakataon ay iminungkahi na ang mga reaksyon ng isang buhay na organismo ay isinasagawa dahil sa isang bagong puwersa, na tinawag niyang "catalytic". Pinatunayan niya ang ideyang ito pangunahin sa pamamagitan ng isang eksperimentong obserbasyon: ang diastase mula sa patatas ay nag-hydrolyse ng starch nang mas mabilis kaysa sa sulfuric acid. Noon pang 1878, tinawag ni Kuhne ang isang sangkap na may catalytic power sa isang buhay na organismo bilang isang enzyme.

Ang kinetics ng pagkilos ng enzyme ay isang sangay ng enzymology na nag-aaral ng dependence ng rate ng isang reaksyon na na-catalyze ng mga enzyme sa kemikal na kalikasan at mga kondisyon ng pakikipag-ugnayan ng substrate sa enzyme, pati na rin sa mga kadahilanan sa kapaligiran. Sa madaling salita, ginagawang posible ng kinetics ng mga enzyme na maunawaan ang likas na katangian ng mga mekanismo ng molekular ng pagkilos ng mga kadahilanan na nakakaapekto sa rate ng enzymatic catalysis. Ang seksyong ito ay nabuo sa intersection ng mga agham gaya ng biochemistry, physics at matematika. Ang pinakamaagang pagtatangka na mathematically ilarawan ang mga enzymatic na reaksyon ay ginawa ni Duclos noong 1898.

Sa katunayan, ang seksyong ito sa pag-aaral ng mga enzyme ay napakahalaga sa ating panahon, lalo na para sa praktikal na gamot. Nagbibigay ito sa mga pharmacologist ng isang tool upang baguhin ang metabolismo ng cell, isang malaking bilang ng mga parmasyutiko at iba't ibang mga lason - ito ay mga inhibitor ng enzyme.

Ang layunin ng gawaing ito ay isaalang-alang ang tanong ng pag-asa ng rate ng reaksyon sa iba't ibang mga kadahilanan, kung paano makokontrol ang rate ng reaksyon at kung paano ito matutukoy.

1. Michaelis-Menten kinetics

Ang mga paunang eksperimento sa pag-aaral ng kinetics ng mga reaksyon ng enzymatic ay nagpakita na ang rate ng reaksyon, salungat sa mga inaasahan ng teoretikal, ay hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng enzyme (E) at substrate (S) sa parehong paraan tulad ng sa kaso ng isang maginoo. pangalawang-order na reaksyon.

Brown at, nang nakapag-iisa sa kanya, si Henri ang unang naglagay ng hypothesis tungkol sa pagbuo ng isang enzyme-substrate complex sa panahon ng reaksyon. Pagkatapos ang pagpapalagay na ito ay nakumpirma ng tatlong pang-eksperimentong katotohanan:

a) ang papain ay bumuo ng isang hindi matutunaw na tambalan na may fibrin (Wurtz, 1880);

b) ang invertase substrate sucrose ay maaaring maprotektahan ang enzyme mula sa thermal denaturation (O'Sullivan at Thompson, 1890);

c) ang mga enzyme ay ipinakita na stereochemically specific catalysts (Fischer, 1898-1899).

Ipinakilala nila ang konsepto ng pinakamataas na bilis at ipinakita iyon saturation curve(ibig sabihin, ang pag-asa ng rate ng reaksyon sa konsentrasyon ng substrate) ay isang isosceles hyperbola. Pinatunayan nila na ang pinakamataas na naobserbahang bilis ay isa sa mga asymptotes sa curve, at ang segment ay pinutol sa x-axis (sa rehiyon ng mga negatibong halaga nito) ng pangalawang asymptote, i.e. pare-pareho sa rate equation, katumbas ng absolute value sa substrate na konsentrasyon na kinakailangan upang makamit ang kalahati ng maximum na rate.

Iminungkahi nina Michaelis at Menten na ang rate ng reaksyon ay tinutukoy ng pagkasira ng ES complex, i.e. pare-pareho k 2 . Ito ay posible lamang sa ilalim ng kondisyon na k 2 ay ang pinakamaliit sa rate constants. Sa kasong ito, ang equilibrium sa pagitan ng enzyme-substrate complex, ang libreng enzyme at ang substrate ay mabilis na naitatag kumpara sa rate ng reaksyon (mabilis na equilibrium).

Ang paunang rate ng reaksyon ay maaaring ipahayag sa pamamagitan ng sumusunod na pormula:

v = k2

Dahil ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex ay

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

kung gayon ang konsentrasyon ng libreng enzyme ay maaaring ipahayag bilang

[E]=K S / [S]

Ang kabuuang konsentrasyon ng enzyme sa pinaghalong reaksyon ay tinutukoy ng formula

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Ang reaksyon ay umabot sa pinakamataas na rate nito kapag ang konsentrasyon ng substrate ay sapat na mataas upang ang lahat ng mga molekula ng enzyme ay nasa anyo ng isang ES complex (isang walang katapusang malaking labis ng substrate). Ang ratio ng paunang bilis sa theoretically posibleng maximum na bilis ay katumbas ng ratio ng [ES] sa [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Ito ang klasikong equation Michaelis at Menten, na, mula nang mailathala ito noong 1913, ay naging pangunahing prinsipyo ng lahat ng enzyme kinetic na pag-aaral sa loob ng mga dekada, at, na may ilang mga limitasyon, ay nanatiling ganoon hanggang ngayon.

Sa kalaunan ay ipinakita na ang orihinal na Michaelis-Menten equation ay may ilang mga hadlang. Ito ay patas, i.e. wastong naglalarawan ng kinetics ng reaksyon na na-catalyze ng enzyme na ito kung ang lahat ng sumusunod na mga paghihigpit na kondisyon ay natutugunan:

) isang kinetically stable enzyme-substrate complex ay nabuo;

) pare-pareho ang K S ay ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex: ito ay totoo lamang kung ;

) ang konsentrasyon ng substrate ay hindi nagbabago sa panahon ng reaksyon, i.e. ang konsentrasyon ng libreng substrate ay katumbas ng paunang konsentrasyon nito;

) ang produkto ng reaksyon ay mabilis na natanggal mula sa enzyme, i.e. walang kinetically makabuluhang halaga ng ES complex ay nabuo;

) ang ikalawang yugto ng reaksyon ay hindi maibabalik; mas tiyak, isinasaalang-alang lamang namin ang paunang bilis, kapag ang reaksyon sa likod (dahil sa aktwal na kakulangan ng produkto) ay maaari pa ring mapabayaan;

) isang molekula ng substrate lamang ang nagbubuklod sa bawat aktibong site ng enzyme;

) para sa lahat ng mga reactant, ang kanilang mga konsentrasyon ay maaaring gamitin sa halip na mga aktibidad.

Ang Michaelis-Menten equation ay nagsisilbing panimulang punto para sa anumang quantitative na paglalarawan ng pagkilos ng mga enzyme. Dapat itong bigyang-diin na ang kinetic na pag-uugali ng karamihan sa mga enzyme ay mas kumplikado kaysa sa sumusunod mula sa idealized na pamamaraan na pinagbabatayan ng Michaelis-Menten equation. Sa pagkuha ng equation na ito, ipinapalagay na mayroon lamang isang enzyme-substrate complex. Samantala, sa katotohanan, sa karamihan ng mga reaksyon ng enzymatic, hindi bababa sa dalawa o tatlong tulad ng mga complex ang nabuo, na nagmumula sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod.

Dito, tinutukoy ng EZ ang kumplikadong naaayon sa totoong estado ng paglipat, at ang EP ay tumutukoy sa kumplikado sa pagitan ng enzyme at produkto ng reaksyon. Maaari din itong ituro na sa karamihan ng mga reaksyong enzymatic higit sa isang substrate ang kasangkot at dalawa o higit pang mga produkto ang nabuo, ayon sa pagkakabanggit. Sa isang reaksyon na may dalawang substrate, S 1 at S 2 , tatlong enzyme-substrate complex ang maaaring mabuo, katulad ng ES 1 , ES 2 at ES 1 S 2 . Kung ang reaksyon ay gumagawa ng dalawang produkto, P 1 at P 2 , maaaring mayroong hindi bababa sa tatlong karagdagang mga complex EP 1 , EP 2 at EP 1 P 2 . Sa ganitong mga reaksyon, mayroong maraming mga intermediate na hakbang, na ang bawat isa ay nailalarawan sa pamamagitan ng sarili nitong rate constant. Ang kinetic analysis ng mga reaksyong enzymatic na kinasasangkutan ng dalawa o higit pang mga reactant ay kadalasang lubhang kumplikado at nangangailangan ng paggamit ng mga elektronikong kompyuter. Gayunpaman, kapag sinusuri ang kinetics ng lahat ng mga reaksyong enzymatic, ang panimulang punto ay palaging ang Michaelis-Menten equation na tinalakay sa itaas.

1.1 Ang likas na katangian ng pare-parehoKsa equation

equation enzymatic reaction kinetics

Ang pangalawang postulate ay nagsasaad na ang pare-parehong K S sa equation ay ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex.

Pinatunayan nina Briggs at Haldane noong 1925 na ang orihinal na Michaelis-Menten equation ay balido lamang para sa , i.e. kapag ang ekwilibriyo ng elementarya na yugto E+S ES ay naitatag nang napakabilis kumpara sa rate ng susunod na yugto. Samakatuwid, ang gayong mga mekanismo ng kinetiko (pagsunod sa paunang kondisyon ng Michaelis-Menten at pagkakaroon ng isang mabagal na yugto ng elementarya, kung saan ang equilibria sa lahat ng iba pang mga elementarya ay mabilis na naitatag) ay tinatawag na nagbibigay-kasiyahan sa pagpapalagay ng "mabilis na ekwilibriyo". Kung, gayunpaman, ang k 2 ay maihahambing sa pagkakasunud-sunod ng magnitude sa k -1 , ang pagbabago sa konsentrasyon ng enzyme-substrate complex sa paglipas ng panahon ay maaaring ipahayag ng sumusunod na differential equation:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Dahil isinasaalang-alang namin ang paunang rate ng reaksyon, i.e. ang sandali kapag ang reverse reaction ay hindi pa nangyayari, at ang pre-stationary stage ay lumipas na, pagkatapos ay dahil sa labis na substrate, ang halaga ng nabuo na enzyme-substrate complex ay katumbas ng halaga ng nabulok. ( ang prinsipyo ng stationarity, o ang kinetics nina Briggs at Haldane, o ang prinsipyo ng Bodenstein sa chemical kinetics) at totoo na

d/dt=0

Ang pagpapalit nito sa differential equation, nakakakuha tayo ng expression para sa konsentrasyon ng libreng enzyme:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Equation ng steady state:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

kasi v = k 2 , pagkatapos makuha namin iyon

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Sa kasong ito

V max = k 2 [E] T

at katumbas ng pinakamataas na bilis na nakuha mula sa Michaelis-Menten equation. Gayunpaman, ang pare-pareho sa denominator ng Michaelis-Menten equation ay hindi K S , mga. hindi ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex, ngunit ang tinatawag na Michaelis constant:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

Ang K m ay katumbas ng K S lamang kung .

Sa kaso, ang pare-pareho sa denominator ng velocity equation ay ipinahayag ng formula

K k \u003d k 2 / k 1

at tinawag, ayon kay Van Slyke, kinetic constant.

Ang steady state equation ay maaari ding makuha mula sa differential equation nang walang assumption na d / dt = 0. Kung papalitan natin ang value [E] = [E] T - sa differential equation, pagkatapos ng mga transformation ay makukuha natin

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Upang makuha ang steady state equation mula sa equation na ito, hindi ito kailangang d / dt = 0. Sapat na ang hindi pagkakapantay-pantay d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Ang differentiated steady state equation ay ganito ang hitsura:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Ang expression na ito ay malinaw na hindi katumbas ng 0.

1.2 Pagbabago ng Michaelis-Menten equation

Ang orihinal na Michaelis-Menten equation ay isang hyperbolic equation, kung saan ang isa sa mga constants (V max) ay ang asymptote sa curve. Ang isa pang pare-pareho (K m), ang negatibong halaga nito ay tinutukoy ng pangalawang asymptote, ay katumbas ng konsentrasyon ng substrate na kinakailangan upang makamit ang V max / 2. Madali itong i-verify, dahil kung

v=Vmax / 2, pagkatapos

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], ibig sabihin. [S] = K m para sa v = V max /2.

Ang Michaelis-Menten equation ay maaaring algebraically transformed sa iba pang mga form na mas maginhawa para sa graphical na representasyon ng pang-eksperimentong data. Ang isa sa mga pinakakaraniwang pagbabago ay ang pagtumbas lamang ng mga kapalit ng kaliwa at kanang bahagi ng equation.

Bilang resulta ng pagbabago, nakuha natin ang expression

na nagtataglay ng pangalan Mga equation ng Lineweaver-Burk. Ayon sa equation na ito, ang isang graph na naka-plot sa mga coordinate 1/[S] at 1/v ay isang tuwid na linya, ang slope nito ay katumbas ng K m /V max , at ang segment na pinutol sa y-axis ay pantay. hanggang 1/V max. Ang ganitong double reciprocal graph ay may kalamangan na ginagawang posible upang matukoy ang V max nang mas tumpak; sa isang curve na naka-plot sa [S] at v coordinate, ang V max ay isang asymptotic na dami at natutukoy nang hindi gaanong tumpak. Ang segment na pinutol sa x-axis sa Lineweaver-Burk plot ay katumbas ng -1/K m . Ang mahalagang impormasyon tungkol sa pagsugpo ng enzyme ay maaari ding makuha mula sa graph na ito.

Ang isa pang pagbabago ng Michaelis-Menten equation ay ang magkabilang panig ng Lineweaver-Burk equation ay pinarami ng V max *v at pagkatapos ng ilang karagdagang pagbabagong nakukuha natin

Ang katumbas na plot sa v at v/[S] coordinate ay kumakatawan sa e 4, fig. isa]. Ang ganitong graph ( Edie-Hofsty na tsart) hindi lamang ginagawang napakadaling matukoy ang mga halaga ng V max at K m , ngunit nagbibigay-daan din sa iyo na tukuyin ang mga posibleng paglihis mula sa linearity na hindi nakita sa Lineweaver-Burk plot.

Ang equation ay maaari ding i-linearize sa ibang anyo

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

Sa kasong ito, ang pagtitiwala [S] / v sa [S] ay dapat itayo. Ang slope ng nagresultang tuwid na linya ay 1 / V max ; ang mga segment na pinutol sa ordinate at abscissa axes ay katumbas ng (K m / V max) at (- K m), ayon sa pagkakabanggit. Ang tsart na ito ay ipinangalan sa may-akda tsart ng Haynes.

Ipinakita ng pagsusuri sa istatistika na ang mga pamamaraan ng Edie-Hofstee at Haynes ay nagbibigay ng mas tumpak na mga resulta kaysa sa pamamaraang Lineweaver-Burk. Ang dahilan nito ay sa mga graph ng Edie - Hofstee at Haynes, ang parehong umaasa at independiyenteng mga variable ay kasama sa mga halaga na naka-plot sa parehong coordinate axes.

1.3 Epekto ng konsentrasyon ng substrate sa mga kinetika ng reaksyon

Sa maraming mga kaso, ang kondisyon ng patuloy na konsentrasyon ng substrate ay hindi nasiyahan. Sa isang banda, ang labis na substrate ay hindi ginagamit sa in vitro na reaksyon sa ilang mga enzyme dahil sa madalas na nagaganap na pagsugpo sa aktibidad ng enzymatic ng substrate. Sa kasong ito, ang pinakamainam na konsentrasyon lamang ang maaaring gamitin, at hindi ito palaging nagbibigay ng labis na substrate na kinakailangan upang matupad ang mga kinetic equation ng mga mekanismo na tinalakay sa itaas. Bukod dito, sa cell sa vivo, ang labis na substrate na kinakailangan upang matupad ang kundisyong ito ay karaniwang hindi nakakamit.

Sa mga reaksyong enzymatic kung saan ang substrate ay hindi labis at, samakatuwid, ang konsentrasyon nito ay nagbabago sa panahon ng reaksyon, ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex ay

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - konsentrasyon ng substrate sa t = 0). Sa kasong ito, ang paunang rate ng reaksyon (sa steady state) ay ibinibigay ng

v= V max / (K m + )

kung saan ang konsentrasyon ng substrate sa isang punto ng oras.

Gayunpaman, posibleng magsulat ng tinatayang solusyon para sa dalawang kaso kung saan [S] o = :

) kung ang hindi pagkakapantay-pantay na ito ay nasiyahan dahil sa malalaking halaga ng t, i.e. kapag higit sa 5% ng paunang konsentrasyon ng substrate ay natupok sa panahon ng reaksyon;

) kung ang konsentrasyon ng enzyme ay hindi maaaring pabayaan kumpara sa konsentrasyon ng substrate at sa gayon ang konsentrasyon ng enzyme-substrate complex ay dapat isaalang-alang.

Kung ang t ay malaki, at ang konsentrasyon ay bale-wala kumpara sa [S] 0 , kung gayon ang equation para sa dissociation constant ng enzyme-substrate complex ay magiging sumusunod:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Para sa halaga ng konsentrasyon, na nagbabago sa panahon ng reaksyon, ang halaga ([S] 0 + )/2 ay nagsisilbing isang kasiya-siyang pagtatantya. Dahil = [S] 0 - [P], ang average na bilis; maaaring ipahayag bilang

Pinapalitan ang expression na ito at ang tinatayang halaga sa

v= V max / (K m + ),

makuha namin:

Kapag inihambing ang mga halaga na kinakalkula batay sa pagtatantya na ito sa mga halaga na nakuha mula sa eksaktong, pinagsamang Michaelis-Menten equation, lumalabas na ang error sa pagtukoy ng K m ay 1 at 4% kapag gumagastos ng 30 at 50% ng substrate, ayon sa pagkakabanggit. Samakatuwid, ang error sa approximation na ito ay bale-wala kumpara sa error sa pagsukat.

Kapag ang pagkonsumo ng substrate ay hindi lalampas sa 5% ng paunang konsentrasyon, ngunit ang konsentrasyon ng enzyme ay napakataas na hindi ito maaaring balewalain kumpara sa [S] 0, ang dissociation constant ng enzyme-substrate complex ay katumbas ng:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Ang kanyang solusyon tungkol sa mga nagbibigay

Sa dalawang posibleng solusyon, ang negatibo lamang ang maaaring piliin, dahil ito lamang ang nakakatugon sa mga paunang kondisyon: = 0 sa [S] 0 = 0 o [E] T = 0. Sa pamamagitan ng pagkakatulad sa equation para sa ratio na v/V max, nakuha namin ang paunang velocity equation. Ang quadratic equation na nakuha mula sa equation ng dissociation constant ng enzyme-substrate complex, natagpuan ng kaunti mas mataas, gamit ang mga formula v \u003d k 2 at V max \u003d k 2 [E] T, ay maaaring bawasan sa sumusunod na anyo :

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Dapat isaalang-alang ang dalawang limitadong kaso. Sa unang kaso [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

Kaya, nakuha namin ang maliwanag na unang pagkakasunud-sunod na reaksyon at k=V max /K m - ang maliwanag na unang pagkakasunud-sunod na kinetic constant. Ang aktwal na dimensyon nito ay oras -1 , ngunit ito ay kumbinasyon ng una at pangalawang order rate constants ng ilang elementary stages, i.e. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Sa ilalim ng mga kondisyon ng maliwanag na unang order k ay isang sukatan ng pag-unlad ng reaksyon.

Isa pang naglilimitang kaso: [S] >> K m . Dito ang pare-parehong K m ay bale-wala kumpara sa [S], at sa gayon ay nakukuha natin ang v = V max .

1.4 Pagbuo ng isang kinetically stable na enzyme-product complex

Kung ang isang kinetically stable na enzyme-product complex ay nabuo sa panahon ng reaksyon, ang mekanismo ng reaksyon ay ang mga sumusunod:

Sa paglalapat ng steady state assumption, maaari nating isulat ang mga differential equation:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Mula sa mga equation na ito ay sinusundan iyon

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Dahil v = k 3

at [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

nakukuha natin

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

I.e

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

Sa kasong ito, napakahirap na kalkulahin ang mga tiyak na halaga ng mga indibidwal na mga constant ng rate, dahil ang kanilang ratio lamang ang maaaring masukat nang direkta. Ang sitwasyon ay nagiging mas kumplikado kapag ang mekanismo ng enzymatic reaksyon ay nagiging mas kumplikado, kapag higit sa dalawang complexes ang kasangkot sa reaksyon, dahil ang bilang ng mga rate constants sa equation, siyempre, ay mas malaki, at ang kanilang mga ratio ay din. mas kumplikado.

Gayunpaman, ang sitwasyon ay pinasimple kung, pagkatapos ng mababalik na reaksyon ng pagbuo ng unang kumplikado, ang kasunod na mga hakbang sa elementarya ay hindi maibabalik. Ang mga mahahalagang kinatawan ng mga enzyme na sumusunod sa mekanismong ito ay mga proteolytic enzymes at esterases. Ang mekanismo ng kanilang reaksyon ay maaaring isulat tulad ng sumusunod:

kung saan ang ES` ay isang acyl-enzyme intermediate na nabubulok sa pagkakalantad sa tubig. Pwede tayong magsulat

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k cat [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 pusa / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

Ang Michaelis constant ng acylation step ay K m "K s. Kung mas malaki ang ratio k cat / K m , mas mataas ang specificity ng substrate.

Ang pagpapasiya ng mga constant ay lubos na pinasimple kung ang eksperimento ay isinasagawa sa pagkakaroon ng isang nucleophilic agent (N) na may kakayahang makipagkumpitensya sa tubig. Pagkatapos

Ang k 3 \u003d k 3 ’ at P i (i \u003d 1, 2, 3) ay mga produkto.

v i = k pusa, i [S] / (K m + [S]) pusa, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) pusa, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) pusa, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Dahil alam na K s / k 2 = K m / k pusa, at kung wala ang nucleophile, kung gayon

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

at upang matukoy ang mga constant, maaari mong gamitin ang punto ng intersection ng mga linya sa mga coordinate 1/v N (at 1/v) - 1/[S]. Dalawang tuwid na linya sa dobleng kabaligtaran na mga coordinate ay nagsalubong sa pangalawang kuwadrante. Sa kawalan ng nucleophile, ang punto ng intersection ng linya na may vertical axis ay tinukoy bilang 1/V max at 1/k cat , at may pahalang na axis bilang -1/K m . Ang mga coordinate ng punto ng intersection ng dalawang linya: -1/K s at 1/k 3 . Ang distansya sa pagitan ng 1/V max at 1/k 3 ay 1/k 2 .

1.5 Pagsusuri ng kumpletong kinetic curve ng reaksyon

Ang Michaelis - Menten equation sa orihinal nitong anyo ay tumutukoy lamang sa mga hindi maibabalik na reaksyon, i.e. sa mga reaksyon kung saan ang paunang rate lamang ang isinasaalang-alang, at ang kabaligtaran na reaksyon ay hindi lilitaw dahil sa hindi sapat na dami ng produkto at hindi nakakaapekto sa rate ng reaksyon. Sa kaso ng isang hindi maibabalik na reaksyon, ang kumpletong kinetic curve ay madaling masuri (para sa isang arbitrary na agwat ng oras t ), pagsasama ng orihinal na Michaelis-Menten equation. Sa kasong ito, samakatuwid, ang pagpapalagay ay nananatiling isang intermediate enzyme-substrate complex lamang ang nabuo sa kurso ng reaksyon. Dahil para sa pagitan ng oras t walang mga paghihigpit, ang konsentrasyon ng substrate sa oras ng pagsusuri ay hindi maaaring katumbas ng unang ipinakilala na konsentrasyon. Kaya, kinakailangan ding isaalang-alang ang pagbabago sa [S] sa panahon ng reaksyon. Hayaan ang S 0 ang paunang konsentrasyon ng substrate, (S 0 - y ) - konsentrasyon sa oras t . Pagkatapos, batay sa orihinal na Michaelis-Menten equation (kung y ay ang halaga ng substrate na na-convert), maaari naming isulat

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Ang pagkuha ng mga reciprocal at paghahati ng mga variable, isinasama namin ang y sa pagitan ng 0 at y (Ang V max ay ipinahiwatig bilang V):

(2.303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Kaya, ang pag-plot ng dependence ng kaliwang bahagi ng equation sa y / t (Foster-Niemann coordinates) , kumuha ng tuwid na linya na may slope (-1/K m) , cutoff na segment sa y-axis (V/K m) , at sa abscissa axis - ang segment V. Ang integral equation ay maaari ding linearized sa ibang paraan:

t / 2.3031 lg = y / 2.303 V lg + K m / V

o t/y = 2.3031 K m lg / V y +1/V

Kung pinag-aaralan natin ang isang reversible reaction, kailangang bigyang-pansin kung anong agwat ng oras ang ating kinakaharap. Sa sandali ng paghahalo ng enzyme sa substrate, ang tinatawag na pre-stationary phase ay nagsisimula, na tumatagal ng ilang micro- o milliseconds, kung saan nabuo ang mga enzyme-substrate complex na naaayon sa nakatigil na estado. Sa pag-aaral ng mga nababaligtad na reaksyon sa sapat na mahabang agwat ng panahon, ang bahaging ito ay hindi gumaganap ng isang mahalagang papel, dahil sa yugtong ito ang reaksyon ay hindi nagpapatuloy sa buong bilis sa alinman sa mga direksyon.

Para sa isang reaksyon na nagpapatuloy mula kaliwa hanggang kanan, ang enzyme-substrate complexes na kasangkot sa reaksyon ay umaabot sa rate-limiting concentration lamang sa dulo ng prestationary phase. Quasi-stationary na estado, kung saan ang mga konsentrasyon ng mga kumplikadong enzyme-substrate na tumutukoy sa rate ay lumalapit sa pinakamataas na halaga ng mga konsentrasyon sa matatag na estado, ay tumatagal ng ilang ikasampu ng isang segundo o isang segundo. Sa yugtong ito, ang rate ng pagbuo ng produkto (o pagkonsumo ng substrate) ay halos linear sa oras. Sa teorya, ang pagbuo ng produkto ay hindi pa naganap dito, ngunit sa pagsasagawa ng konsentrasyon nito ay napakababa na ang rate ng reverse reaction ay hindi nakakaapekto sa rate ng direktang isa. Ang linear phase na ito ay tinatawag na initial reaction rate, at sa ngayon ay isinasaalang-alang pa lang natin ito.

Ang reaksyon mula kanan pakaliwa sa susunod na yugto ay pinabilis din dahil sa unti-unting pagtaas ng konsentrasyon ng produkto. (katayuan ng paglipat; ang linearity na naobserbahan sa ngayon ay nawawala). Ang yugtong ito ay nagpapatuloy hanggang ang bilis ng reaksyon mula kaliwa hanggang kanan ay maging katumbas ng bilis ng reaksyon mula kanan pakaliwa. Ito ang estado dynamic na balanse, dahil ang reaksyon ay nagpapatuloy sa magkabilang direksyon sa parehong bilis.

2. Mga salik kung saan nakasalalay ang bilis ng reaksyong enzymatic

.1 Pag-asa ng enzymatic reaction rate sa temperatura

Sa isang pagtaas sa temperatura ng daluyan, ang rate ng reaksyon ng enzymatic ay tumataas, na umaabot sa isang maximum sa ilang pinakamainam na temperatura, at pagkatapos ay bumaba sa zero. Para sa mga reaksiyong kemikal, mayroong isang panuntunan na sa pagtaas ng temperatura ng 10 ° C, ang rate ng reaksyon ay tumataas ng dalawa hanggang tatlong beses. Para sa mga reaksyong enzymatic, ang koepisyent ng temperatura na ito ay mas mababa: para sa bawat 10°C, ang rate ng reaksyon ay tumataas ng isang salik na 2 o mas mababa pa. Ang kasunod na pagbaba sa rate ng reaksyon sa zero ay nagpapahiwatig ng denaturation ng enzyme block. Ang pinakamainam na halaga ng temperatura para sa karamihan ng mga enzyme ay nasa hanay na 20 - 40 0 ​​​​C. Ang thermolability ng mga enzyme ay nauugnay sa kanilang istraktura ng protina. Ang ilang mga enzyme ay na-denatured na sa temperatura na humigit-kumulang 40 0 ​​​​C, ngunit karamihan sa kanila ay hindi aktibo sa mga temperatura sa itaas 40 - 50 0 C. Ang ilang mga enzyme ay hindi aktibo sa pamamagitan ng malamig, i.e. sa mga temperatura na malapit sa 0°C, nangyayari ang denaturation.

Ang pagtaas ng temperatura ng katawan (lagnat) ay nagpapabilis ng mga biochemical reaction na na-catalyze ng mga enzyme. Madaling kalkulahin na ang pagtaas ng temperatura ng katawan para sa bawat antas ay nagpapataas ng rate ng reaksyon ng halos 20%. Sa mataas na temperatura na humigit-kumulang 39-40°C, ang maaksayang paggamit ng mga endogenous substrates sa mga selula ng isang may sakit na organismo ay kinakailangan upang mapunan ang kanilang paggamit ng pagkain. Bilang karagdagan, sa isang temperatura na humigit-kumulang 40°C, ang ilan sa mga pinaka-thermolabile na enzyme ay maaaring ma-denatured, na nakakagambala sa natural na kurso ng mga prosesong biochemical.

Ang mababang temperatura ay nagdudulot ng nababaligtad na hindi aktibo ng mga enzyme dahil sa isang bahagyang pagbabago sa spatial na istraktura nito, ngunit sapat na upang maputol ang kaukulang pagsasaayos ng aktibong sentro at mga molekula ng substrate.

2.2 Pagdepende ng rate ng reaksyon sa pH ng medium

Para sa karamihan ng mga enzyme, mayroong isang tiyak na halaga ng pH kung saan ang kanilang aktibidad ay pinakamataas; sa itaas at sa ibaba ng halagang ito ng pH, bumababa ang aktibidad ng mga enzyme na ito. Gayunpaman, hindi sa lahat ng kaso ang mga kurba na naglalarawan sa pagtitiwala ng aktibidad ng enzyme sa pH ay hugis kampana; minsan ang pag-asa na ito ay maaari ding direktang ipahayag. Ang pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa pH ay pangunahing nagpapahiwatig ng estado ng mga functional na grupo ng aktibong sentro ng enzyme. Ang pagbabago ng pH ng daluyan ay nakakaapekto sa ionization ng acidic at pangunahing mga grupo ng mga residue ng amino acid ng aktibong sentro, na kasangkot sa alinman sa pagbubuklod ng substrate (sa lugar ng contact) o sa pagbabagong-anyo nito (sa catalytic area). Samakatuwid, ang tiyak na epekto ng pH ay maaaring sanhi ng alinman sa isang pagbabago sa affinity ng substrate para sa enzyme, o sa pamamagitan ng isang pagbabago sa catalytic na aktibidad ng enzyme, o pareho.

Karamihan sa mga substrate ay may acidic o pangunahing mga grupo, kaya ang pH ay nakakaapekto sa antas ng ionization ng substrate. Ang enzyme ay mas mainam na nagbubuklod sa alinman sa ionized o non-ionized na anyo ng substrate. Malinaw, sa pinakamainam na pH, ang parehong mga functional na grupo ng aktibong sentro ay nasa pinaka-reaktibong estado, at ang substrate ay nasa isang anyo na mas mainam para sa pagbubuklod ng mga pangkat na ito ng enzyme.

Kapag nagtatayo ng mga curve na naglalarawan sa pag-asa ng aktibidad ng enzyme sa pH, ang mga pagsukat sa lahat ng mga halaga ng pH ay karaniwang isinasagawa sa ilalim ng mga kondisyon ng saturation ng enzyme na may substrate, dahil ang halaga ng K m para sa maraming mga enzyme ay nagbabago sa pH.

Ang curve na nagpapakilala sa pag-asa ng aktibidad ng enzyme sa pH ay maaaring magkaroon ng isang partikular na simpleng anyo sa mga kasong iyon kapag ang enzyme ay kumikilos sa electrostatically neutral na mga substrate o substrate kung saan ang mga naka-charge na grupo ay hindi gumaganap ng isang makabuluhang papel sa catalytic act. Ang isang halimbawa ng naturang mga enzyme ay ang papain, pati na rin ang invertase, na nag-catalyze sa hydrolysis ng mga neutral na molekula ng sucrose at nagpapanatili ng isang pare-parehong aktibidad sa hanay ng pH na 3.0-7.5.

Ang halaga ng pH na naaayon sa pinakamataas na aktibidad ng enzyme ay hindi kinakailangang tumutugma sa katangian ng pH value ng normal na intracellular na kapaligiran ng enzyme na ito; ang huli ay maaaring nasa itaas at mas mababa sa pinakamainam na pH. Iminumungkahi nito na ang epekto ng pH sa aktibidad ng enzyme ay maaaring isa sa mga kadahilanan na responsable para sa regulasyon ng aktibidad ng enzymatic sa loob ng cell. Dahil ang cell ay naglalaman ng daan-daang mga enzyme, at ang bawat isa sa kanila ay tumutugon nang iba sa mga pagbabago sa pH, ang halaga ng pH sa loob ng cell ay marahil ang isa sa mga mahahalagang elemento sa kumplikadong sistema ng regulasyon ng cellular metabolism.

2.3 Pagtukoy sa dami ng enzyme sa pamamagitan ng aktibidad nito

) ang kabuuang stoichiometry ng catalyzed na reaksyon;

) ang posibleng pangangailangan para sa mga cofactor - sa mga metal ions o coenzymes;

) ang pag-asa ng aktibidad ng enzyme sa mga konsentrasyon ng substrate at cofactor, i.e. Mga halaga ng K m para sa parehong substrate at cofactor;

) ang halaga ng pH na naaayon sa pinakamataas na aktibidad ng enzyme;

) ang hanay ng temperatura kung saan ang enzyme ay matatag at nagpapanatili ng mataas na aktibidad.

Bilang karagdagan, ito ay kinakailangan upang magkaroon sa iyong pagtatapon ng ilang medyo simpleng analytical na pamamaraan na nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang rate ng pagkawala ng substrate o ang rate ng hitsura ng mga produkto ng reaksyon.

Hangga't maaari, ang pagsusuri ng enzyme ay isinasagawa sa ilalim ng mga karaniwang kondisyon na nagpapanatili ng pinakamainam na pH at nagpapanatili ng konsentrasyon ng substrate sa itaas ng konsentrasyon ng saturation; sa kasong ito, ang paunang rate ay tumutugma sa zero order ng reaksyon na may paggalang sa substrate at proporsyonal lamang sa konsentrasyon ng enzyme. Para sa mga enzyme na nangangailangan ng mga cofactor, metal ions o coenzymes, ang konsentrasyon ng mga cofactor na ito ay dapat ding lumampas sa saturation concentration upang ang enzyme concentration ay ang rate-limiting factor. Sa pangkalahatan, ang pagsukat ng rate ng pagbuo ng produkto ng reaksyon ay maaaring isagawa nang may higit na katumpakan kaysa sa pagsukat ng rate ng pagkawala ng substrate, dahil ang substrate sa pangkalahatan ay dapat na naroroon sa medyo mataas na konsentrasyon upang mapanatili ang zero order kinetics. Ang rate ng pagbuo ng produkto ng reaksyon (o mga produkto) ay maaaring masukat sa pamamagitan ng kemikal o spectrum-photometric na pamamaraan. Ang pangalawang paraan ay mas maginhawa, dahil pinapayagan ka nitong patuloy na i-record ang kurso ng reaksyon sa mite ng recorder.

Sa pamamagitan ng internasyonal na kasunduan, ang isang yunit ng aktibidad ng enzymatic ay ang dami ng enzyme na may kakayahang magdulot ng conversion ng isang micromole ng substrate kada minuto sa 25°C sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon. Partikular na aktibidad Ang enzyme ay ang bilang ng mga yunit ng aktibidad ng enzymatic bawat 1 mg ng protina. Ang halagang ito ay ginagamit bilang isang criterion para sa kadalisayan ng paghahanda ng enzyme; ito ay tumataas habang ang enzyme ay dinadalisay at umabot sa pinakamataas na halaga nito para sa perpektong dalisay na paghahanda. Sa ilalim bilang ng mga rebolusyon maunawaan ang bilang ng mga molekula ng substrate na sumasailalim sa pagbabagong-anyo bawat yunit ng oras bawat isang molekula ng enzyme (o bawat isang aktibong site) sa ilalim ng mga kondisyon kung saan ang bilis ng reaksyon ay nililimitahan ng konsentrasyon ng enzyme.

2.4 Pag-activate ng enzyme

Ang regulasyon ng mga enzyme ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa kanila ng iba't ibang biological na bahagi o mga dayuhang compound (halimbawa, mga gamot at lason), na karaniwang tinatawag mga modifier o mga regulator mga enzyme. Sa ilalim ng impluwensya ng mga modifier sa enzyme, ang reaksyon ay maaaring mapabilis (mga activator) o mabagal. ( mga inhibitor).

Ang pag-activate ng mga enzyme ay natutukoy sa pamamagitan ng pagpabilis ng mga biochemical reaksyon na nangyayari pagkatapos ng pagkilos ng modifier. Ang isang pangkat ng mga activator ay binubuo ng mga sangkap na nakakaapekto sa rehiyon ng aktibong site ng enzyme. Kabilang dito ang mga enzyme cofactor at substrate. Ang mga cofactor (metal ions at coenzymes) ay hindi lamang mga obligadong elemento ng istruktura ng mga kumplikadong enzyme, kundi pati na rin ang kanilang mga activator.

Ang mga metal ions ay medyo tiyak na mga activator. Kadalasan, ang ilang mga enzyme ay nangangailangan ng mga ion ng hindi isa, ngunit ilang mga metal. Halimbawa, para sa Na + , K + -ATPase, na nagdadala ng mga monovalent na cation sa pamamagitan ng cell membrane, ang magnesium, sodium at potassium ions ay kinakailangan bilang mga activator.

Ang pag-activate sa tulong ng mga metal ions ay isinasagawa ng iba't ibang mga mekanismo. Sa ilang mga enzyme, sila ay bahagi ng catalytic site. Sa ilang mga kaso, pinadali ng mga ion ng metal ang pagbubuklod ng substrate sa aktibong sentro ng enzyme, na bumubuo ng isang uri ng tulay. Kadalasan, ang metal ay hindi pinagsama sa enzyme, ngunit sa substrate, na bumubuo ng isang metal-substrate complex, na kung saan ay lalong kanais-nais para sa pagkilos ng enzyme.

Ang pagtitiyak ng pakikilahok ng mga coenzymes sa pagbubuklod at catalysis ng substrate ay nagpapaliwanag sa pag-activate ng mga reaksyon ng enzymatic ng mga ito. Ang epekto ng pag-activate ng mga cofactor ay lalong kapansin-pansin kapag kumikilos sa isang enzyme na hindi puspos ng mga cofactor.

Ang substrate ay isa ring activator sa loob ng mga kilalang limitasyon ng konsentrasyon. Matapos maabot ang saturating na konsentrasyon ng substrate, ang aktibidad ng enzyme ay hindi tumataas. Pinapataas ng substrate ang katatagan ng enzyme at pinapadali ang pagbuo ng nais na conformation ng aktibong site ng enzyme.

Mga metal ions, coenzymes at ang kanilang mga precursor at aktibong analogues,

ang mga substrate ay maaaring gamitin sa pagsasanay bilang mga paghahanda na nagpapagana ng mga enzyme.

Ang pag-activate ng ilang mga enzyme ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng pagbabago na hindi nakakaapekto sa aktibong sentro ng kanilang mga molekula. Maraming mga pagbabago ang posible:

1) pag-activate ng isang hindi aktibong hinalinhan - proenzyme, o zymogen. Halimbawa, ang conversion ng pepsinogen sa pepsin ;

2) pag-activate sa pamamagitan ng paglakip ng anumang partikular na pangkat ng pagbabago sa molekula ng enzyme;

3) activation sa pamamagitan ng dissociation ng isang hindi aktibong kumplikadong protina - aktibong enzyme.

2.5 Enzyme inhibition

May mga reagents na maaaring makipag-ugnayan nang higit pa o mas kaunti partikular sa isa o ibang side chain ng mga protina, na humahantong sa pagsugpo sa aktibidad ng enzyme. Ginagawang posible ng hindi pangkaraniwang bagay na ito na pag-aralan ang likas na katangian ng mga residue ng panig ng amino acid na kasangkot sa reaksyong enzymatic na ito. Gayunpaman, sa pagsasagawa, dapat isaalang-alang ng isa ang maraming mga subtleties na gumagawa ng isang hindi malabo na interpretasyon ng mga resulta na nakuha sa mga tiyak na inhibitor sa halip mahirap at madalas na nagdududa. Una sa lahat, para ang reaksyon sa isang inhibitor ay angkop para sa pag-aaral ng likas na katangian ng mga side chain na kasangkot sa reaksyon, dapat itong matugunan ang mga sumusunod na pamantayan:

) maging tiyak, i.e. ang inhibitor ay dapat harangan lamang ang nais na mga grupo;

) pagbawalan ang aktibidad ng enzyme, at ang pagsugpo na ito ay dapat maging kumpleto sa pagtaas ng bilang ng mga binagong grupo;

) ang reagent ay hindi dapat maging sanhi ng di-tiyak na denaturation ng protina.

Mayroong 2 grupo ng mga inhibitor: nababaligtad at hindi maibabalik na pagkilos. Ang paghahati ay batay sa pamantayan para sa pagpapanumbalik ng aktibidad ng enzyme pagkatapos ng dialysis o isang malakas na pagbabanto ng isang solusyon ng enzyme na may isang inhibitor.

Ayon sa mekanismo ng pagkilos, ang mapagkumpitensya, hindi mapagkumpitensya, hindi mapagkumpitensya, substrate at allosteric inhibition ay nakikilala.

Competitive inhibition

Ang mapagkumpitensyang pagsugpo ay natuklasan sa pag-aaral ng pagsugpo na dulot ng mga analogue ng substrate. Ito ang pagsugpo sa reaksyon ng enzymatic na sanhi ng pagbubuklod sa aktibong sentro ng enzyme ng isang inhibitor na katulad ng istraktura sa substrate at pinipigilan ang pagbuo ng isang enzyme-substrate complex. Sa mapagkumpitensyang pagsugpo, ang inhibitor at substrate, na magkatulad sa istraktura, ay nakikipagkumpitensya para sa aktibong site ng enzyme. Ang tambalan ng mga molekula, na mas malaki, ay nagbubuklod sa aktibong sentro.

Ang ganitong mga ideya tungkol sa mekanismo ng pagsugpo ay nakumpirma ng mga eksperimento sa mga kinetika ng mapagkumpitensyang mga reaksyon sa pagsugpo. Kaya, ipinakita na, sa kaso ng mapagkumpitensyang pagsugpo, ang substrate analog ay hindi nakakaapekto sa rate ng agnas ng nabuo nang enzyme-substrate complex; kapag gumagamit ng isang "walang hanggan na malaki" na labis ng substrate, ang parehong maximum na rate ay nakuha kapwa sa presensya at sa kawalan ng isang inhibitor. Sa kabaligtaran, ang inhibitor ay nakakaapekto sa halaga ng dissociation constant at ang Michaelis constant. Mula dito maaari nating tapusin na ang inhibitor ay tumutugon sa mga grupo ng protina na kasangkot sa isang paraan o iba pa sa pagbubuklod sa substrate, samakatuwid, dahil sa pakikipag-ugnayan nito sa mga pangkat na ito, bumababa ang lakas ng pagbubuklod ng substrate (ibig sabihin, ang bilang ng mga molekula ng enzyme na may kakayahang nababawasan ang pagbubuklod sa substrate) .

Nang maglaon ay ipinakita na ang kinetically competitive inhibition ay maaaring sanhi hindi lamang ng substrate analogues, kundi pati na rin ng iba pang mga reagents, ang kemikal na istraktura na kung saan ay ganap na naiiba mula sa substrate. Sa mga kasong ito, ipinapalagay din na ang reagent na ito ay nakikipag-ugnayan sa pangkat na responsable para sa pagbubuklod sa substrate.

Mayroong dalawang teoretikal na posibilidad para sa mapagkumpitensyang pagsugpo:

1) nagbubuklod at catalytic site ng enzyme overlap; ang inhibitor ay nagbubuklod sa kanila, ngunit nakakaapekto lamang sa mga nagbubuklod na grupo ng sentro;

2) ang binding center at ang catalytic center sa enzyme molecule ay spatially isolated; nakikipag-ugnayan ang inhibitor sa binding site.

kung saan ang I ay isang inhibitor, at ang K I ay ang dissociation constant ng enzyme-inhibitor complex.

Relative rate (ratio ng enzymatic reaction rate na sinusukat sa pagkakaroon ng isang inhibitor (v i) , sa pinakamataas na bilis) ay katumbas ng

v i / V = ​​/ [E] T

dahil para sa kabuuang konsentrasyon ng enzyme ito ay totoo

[E]T = [E] + +

pagkatapos ay 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Malinaw, kung [I] = K I , pagkatapos ay ang slope ng tuwid na linya ay nagiging dalawang beses na mas malaki kaysa sa pag-asa ng 1/v 0 sa [S] (v 0 ay ang rate ng enzymatic reaction sa kawalan ng isang inhibitor).

Ang uri ng pagsugpo ay karaniwang tinutukoy ng graphical. Ang mapagkumpitensyang pagsugpo ay pinakamadaling makilala sa pamamagitan ng paglalagay ng mga plot ng Lineweaver-Burk (ibig sabihin, mga plot sa 1/v i at 1/[S]) sa iba't ibang konsentrasyon ng inhibitor. Sa tunay na mapagkumpitensyang pagsugpo, isang hanay ng mga tuwid na linya ay nakuha na naiiba sa tangent ng slope angle at bumalandra sa y-axis (axis 1/v i) sa isang punto. Sa anumang konsentrasyon ng inhibitor, posible na gumamit ng napakataas na konsentrasyon ng substrate na ang aktibidad ng enzyme ay magiging maximum.

Ang isang halimbawa ng mapagkumpitensyang pagsugpo ay ang epekto ng iba't ibang mga sangkap sa aktibidad ng succinate dehydrogenase. Ang enzyme na ito ay bahagi ng enzymatic cyclic system - ang Krebs cycle. Ang natural na substrate nito ay succinate, at ang mapagkumpitensyang inhibitor nito ay oxaloacetate, isang intermediate na produkto ng parehong Krebs cycle:

Ang isang katulad na mapagkumpitensyang inhibitor ng succinate dehydrogenase ay malonic acid, na kadalasang ginagamit sa biochemical research.

Ang pagkilos ng maraming paghahanda sa parmasyutiko, mga pestisidyo na ginagamit upang sirain ang mga peste sa agrikultura, at mga ahente sa pakikipagdigma ng kemikal ay batay sa prinsipyo ng mapagkumpitensyang pagsugpo.

Halimbawa, ang isang pangkat ng mga anticholinesterase na gamot, na kinabibilangan ng mga derivatives ng quaternary ammonium base at organophosphorus compound, ay mga mapagkumpitensyang inhibitor ng cholinesterase enzyme na may kinalaman sa substrate na acetylcholine nito. Ang Cholinesterase ay nag-catalyze ng hydrolysis ng acetylcholine, isang tagapamagitan ng mga cholinergic system (neuromuscular synapses, parasympathetic system, atbp.). Ang mga sangkap na anticholinesterase ay nakikipagkumpitensya sa acetylcholine para sa aktibong site ng enzyme, nagbubuklod dito, at pinapatay ang catalytic na aktibidad ng enzyme. Ang mga gamot tulad ng prozerin, physostigmine, sevin ay pumipigil sa enzyme na baligtarin, habang ang mga organophosphorus na gamot tulad ng armin, nibufin, chlorophos, soman ay kumikilos nang hindi maibabalik, phosphorylating ang catalytic group ng enzyme. Bilang resulta ng kanilang pagkilos, ang acetylcholine ay naipon sa mga synapses na iyon kung saan ito ay isang tagapamagitan ng nervous excitation, i.e. ang organismo ay nalason ng naipon na acetylcholine. Ang pagkilos ng nababaligtad na mga inhibitor ay unti-unting nawawala, dahil ang mas maraming acetylcholine ay naipon, mas mabilis nitong inilipat ang inhibitor mula sa aktibong sentro ng cholinesterase. Ang toxicity ng hindi maibabalik na mga inhibitor ay hindi maihahambing na mas mataas; samakatuwid, ginagamit ang mga ito upang labanan ang mga peste sa agrikultura, mga insekto sa sambahayan at mga daga (halimbawa, chlorophos) at bilang mga ahente sa pakikipagdigma ng kemikal (halimbawa, sarin, soman, atbp.).

Noncompetitive na pagsugpo

Sa non-competitive inhibition, ang isang partikular na inhibitor ay hindi nakakaapekto sa dissociation constant ng enzyme-substrate complex. Sa kabilang banda, ang maximum na matamo na rate ng reaksyon ay mas mababa sa pagkakaroon ng isang inhibitor kaysa sa kawalan nito, kahit na sa isang walang katapusang malaking labis ng substrate. Ang pagkakaroon ng pagsugpo ay nagpapatunay na ang inhibitor ay nagbubuklod sa protina. Ang invariance ng dissociation constant pareho sa presensya at kawalan ng inhibitor, sa turn, ay nagpapahiwatig na, hindi katulad ng substrate, ang inhibitor ay nagbubuklod sa ibang grupo. Mula sa isang teoretikal na pananaw, ang mekanismo ng naturang pagsugpo ay maaaring bigyang-kahulugan sa iba't ibang paraan.

a) Magkaiba ang binding site at ang catalytic site ng enzyme. Sa kasong ito, binabawasan ng inhibitor na nauugnay sa catalytic center ang aktibidad ng enzyme at ang maximum na makakamit
bilis nang hindi naaapektuhan ang pagbuo ng enzyme-substrate complex.

b) Ang binding site at ang catalytic site ay magkakapatong sa
ibabaw ng enzyme, at ang inhibitor ay nagbubuklod sa ibang mga grupo ng protina. Dahil sa pagbubuklod ng inhibitor sa ibabaw ng enzyme, ang impormasyon ng protina ay nagbabago at nagiging hindi kanais-nais para sa pagpapatupad ng catalysis.

c) Ang inhibitor ay hindi nagbubuklod sa alinman sa catalytic site o sa binding site, at sa gayon ay hindi nakakaapekto sa conformation ng protina. Gayunpaman, maaari nitong lokal na baguhin ang pamamahagi ng singil sa isang rehiyon ng ibabaw ng protina. Ang pagsugpo sa aktibidad ay maaari ding mangyari sa kasong ito, kung, halimbawa, ang ionization ng mga pangkat na mahalaga para sa pagpapakita ng aktibidad ay ginawang imposible, o kung, sa kabaligtaran, ang ionization ng mga grupo na aktibo lamang sa non-ionized na anyo ay nangyayari. Ang hindi pangkaraniwang bagay na ito ay naobserbahan pangunahin kapag gumagamit ng malakas na acidic o malakas na alkaline reagents.

Ang inhibitor at ang substrate ay hindi nakakaapekto sa pagbubuklod ng isa't isa sa enzyme, ngunit ang mga enzyme complex na naglalaman ng inhibitor ay ganap na hindi aktibo. Sa kasong ito, ang mga sumusunod na elementarya ay maaaring ipalagay:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Kung [I] = K I, ang mga slope ng mga tuwid na linya at ang mga ordinate ng punto ng intersection na may vertical axis ay dinoble kumpara sa 1/v 0 .

Ang mga non-competitive inhibitors ay, halimbawa, cyanides, na malakas na nauugnay sa ferric iron, na bahagi ng catalytic site ng hemic enzyme - cytochrome oxidase. Ang blockade ng enzyme na ito ay pinapatay ang respiratory chain, at ang cell ay namatay. Kabilang sa mga non-competitive enzyme inhibitors ang mga heavy metal ions at ang kanilang mga organic compound. Samakatuwid, ang mga mabibigat na metal na ion ng mercury, lead, cadmium, arsenic at iba pa ay lubhang nakakalason. Hinaharang nila, halimbawa, ang mga SH-group na kasama sa catalytic site ng enzyme.

Ang mga non-competitive inhibitors ay mga cyanides, na malakas na nauugnay sa ferric iron, na bahagi ng catalytic site ng hemic enzyme - cytochrome oxidase. Ang blockade ng enzyme na ito ay pinapatay ang respiratory chain, at ang cell ay namatay. Imposibleng alisin ang pagkilos ng isang hindi mapagkumpitensya na inhibitor na may labis na substrate (bilang ang pagkilos ng isang mapagkumpitensya), ngunit sa mga sangkap lamang na nagbubuklod sa inhibitor - mga reactivator.

Ang mga non-competitive inhibitors ay ginagamit bilang mga pharmacological agent, mga nakakalason na sangkap para sa pagkontrol ng peste sa agrikultura at para sa mga layuning militar. Sa gamot, ang mga paghahanda na naglalaman ng mercury, arsenic, bismuth ay ginagamit, na hindi mapagkumpitensya na pumipigil sa mga enzyme sa mga selula ng katawan o pathogenic bacteria, na tumutukoy sa isa o isa pa sa kanilang mga epekto. Sa kaso ng pagkalasing, ang pagbubuklod ng lason o ang pag-aalis nito mula sa enzyme-inhibitor complex ay posible sa tulong ng mga reactivator. Kabilang dito ang lahat ng complexone na naglalaman ng SH (cysteine, dimercaptopropanol), citric acid, ethylenediaminetetraacetic acid, atbp.

Hindi mapagkumpitensyang pagsugpo

Ang ganitong uri ng pagsugpo ay tinatawag ding anticompetitive inhibition sa panitikan. o nauugnay na pagsugpo , gayunpaman, ang terminong "hindi mapagkumpitensyang pagsugpo" ang pinakamalawak na ginagamit. Ang katangian ng ganitong uri ng pagsugpo ay ang inhibitor ay hindi nakakabit sa enzyme, ngunit ito ay nakakabit sa enzyme-substrate complex.

Sa kaso ng hindi mapagkumpitensyang pagsugpo, ang complex na naglalaman ng inhibitor ay hindi aktibo:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

pagsugpo sa substrate

Ang pagsugpo sa substrate ay ang pagsugpo ng isang reaksyong enzymatic na sanhi ng labis na substrate. Ang ganitong pagsugpo ay nangyayari dahil sa pagbuo ng isang enzyme-substrate complex na hindi kayang sumailalim sa mga catalytic transformation. Ang ES 2 complex ay hindi produktibo at ginagawang hindi aktibo ang molekula ng enzyme. Ang pagsugpo sa substrate ay sanhi ng labis na substrate, samakatuwid, ito ay tinanggal kapag bumababa ang konsentrasyon nito.

Allosteric inhibition

Ang allosteric regulation ay katangian lamang para sa isang espesyal na grupo ng mga enzyme na may quaternary na istraktura, na may mga sentro ng regulasyon para sa mga nagbubuklod na allosteric effector. Ang mga negatibong effector na pumipigil sa conversion ng substrate sa aktibong site ng enzyme ay kumikilos bilang allosteric inhibitors. Ang mga positibong allosteric effector, sa kabaligtaran, ay nagpapabilis sa reaksyon ng enzymatic, at samakatuwid ay tinutukoy sila bilang mga allosteric activator. Ang mga allosteric effector ng mga enzyme ay kadalasang iba't ibang metabolite, pati na rin ang mga hormone, metal ions, at coenzymes. Sa mga bihirang kaso, ang mga molekula ng substrate ay gumaganap ng papel ng isang allosteric effector ng mga enzyme.

Ang mekanismo ng pagkilos ng allosteric inhibitors sa enzyme ay upang baguhin ang conformation ng aktibong site. Ang pagbaba sa rate ng reaksyon ng enzymatic ay alinman sa isang kinahinatnan ng isang pagtaas sa K m o isang pagbaba sa maximum na rate ng V max sa parehong mga saturating na konsentrasyon ng substrate, i.e. ang enzyme ay bahagyang idle.

Ang mga allosteric enzyme ay naiiba sa iba pang mga enzyme sa kanilang partikular na hugis-S na curve ng rate ng reaksyon kumpara sa konsentrasyon ng substrate. Ang curve na ito ay katulad ng oxygen saturation curve ng hemoglobin; ito ay nagpapahiwatig na ang mga aktibong sentro ng mga subunit ay hindi gumagana nang awtonomiya, ngunit kooperatiba, i.e. ang pagkakaugnay ng bawat susunod na aktibong sentro para sa substrate ay tinutukoy ng antas ng saturation ng mga nakaraang sentro. Ang pinag-ugnay na gawain ng mga sentro ay tinutukoy ng mga allosteric effector.

Ang allosteric regulation ay nagpapakita ng sarili sa anyo ng pagsugpo ng end product ng unang enzyme sa chain. Ang istraktura ng pangwakas na produkto pagkatapos ng isang serye ng mga pagbabagong-anyo ng panimulang sangkap (substrate) ay hindi katulad ng substrate, kaya ang pangwakas na produkto ay maaaring kumilos sa paunang enzyme ng chain lamang bilang isang allosteric inhibitor (effector). Sa panlabas, ang naturang regulasyon ay katulad ng regulasyon ng mekanismo ng feedback at nagbibigay-daan sa iyo upang kontrolin ang output ng pangwakas na produkto, kung sakaling magkaroon ng akumulasyon kung saan huminto ang gawain ng unang enzyme sa chain. Halimbawa, ang aspartate carbamoyltransferase (ACTase) ay nag-catalyze sa una sa anim na reaksyon sa synthesis ng cytidine triphosphate (CTP). Ang CTP ay isang allosteric AKTase inhibitor. Samakatuwid, kapag ang CTP ay nag-iipon, ang AKTase inhibition ay nangyayari at ang karagdagang CTP synthesis ay hihinto. Natuklasan ang allosteric regulation ng mga enzyme sa tulong ng mga hormone. Halimbawa, ang mga estrogen ay isang allosteric inhibitor ng enzyme glutamate dehydrogenase, na nag-catalyze sa deamination ng glutamic acid.

Kaya, kahit na ang pinakasimpleng equation ng kinetic para sa isang reaksyong enzymatic ay naglalaman ng ilang mga parameter ng kinetic, na ang bawat isa ay nakasalalay sa temperatura at kapaligiran kung saan nagaganap ang reaksyon.

Ang mga inhibitor ay ginagawang posible hindi lamang upang maunawaan ang kakanyahan ng enzymatic catalysis, ngunit ito rin ay isang uri ng tool para sa pag-aaral ng papel ng mga indibidwal na reaksyon ng kemikal, na maaaring partikular na isara sa tulong ng isang inhibitor ng isang ibinigay na enzyme.

3. Ang ilang mga aparato ay kapaki-pakinabang para sa pagtukoy ng mga paunang rate ng reaksyon

Maraming mga problema ng enzymatic kinetics ang humahantong sa pagpapasiya ng mga paunang rate ng reaksyon (v 0). Ang pangunahing bentahe ng pamamaraang ito ay ang mga halaga ng v0 na tinutukoy sa paunang sandali ng oras ay magbibigay ng pinakatumpak na representasyon ng aktibidad ng mga enzyme sa ilalim ng pag-aaral, dahil ang mga nag-iipon na mga produkto ng reaksyon ay wala pang oras upang magsagawa ng pagbabawal. epekto sa enzyme at, bilang karagdagan, ang reacting system ay nasa isang estado ng nakatigil na ekwilibriyo. .

Sa laboratory practice, gayunpaman, kapag gumagamit ng conventional spectrophotometric, titrimetric, o iba pang mga diskarte para sa pagtatala ng pag-usad ng naturang mga reaksyon, sa pinakamainam, hanggang sa 15-20 segundo mula sa unang oras para sa pagpapasok ng enzyme sa substrate, paghahalo ng reacting system, ang pag-set up ng cell, atbp. ay nawala. At ito ay hindi katanggap-tanggap, dahil sa kasong ito ang padaplis ay dinadala sa punto kung saan tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без Ang patuloy na paghahalo ay mas kumplikado sa pamamagitan ng pagbabagu-bago sa mga konsentrasyon ng mga reagents sa dami.

Ang mga simpleng device na iminungkahi sa ibaba para sa isang spectrophotometer, isang pH meter, at mga katulad nito ay ginagawang posible na makabuluhang bawasan ang mga pinagmumulan ng mga ipinahiwatig na mga error sa pagtukoy ng v 0.

3.1 Device sa spectrophotometer

Ang device para sa spectrophotometer ay binubuo ng isang dispenser 1, isang umiikot na Teflon thread 2 (isang stirrer) at isang fixing cap 3.

Ang dispenser ay isang micropipette, ang isang dulo nito ay nabuo gamit ang isang karayom ​​4, ang isa pa - na may isang widening 5 (upang maiwasan ang enzyme mula sa pagpasok ng goma tip 6).

Ang Teflon cover 3 na sumasaklaw sa spectral cuvette 7 ay may dalawang butas: isa (8) sa gitna ng takip, ang pangalawa (9) sa itaas ng gitna ng puwang sa pagitan ng opaque na pader ng cuvette 7 at ng light beam 10. Teflon tube 11 (inner diameter 1 -1.5 mm) ay naayos sa isang dulo sa butas 9, ang isa - sa isang nakapirming ledge 12 sa harap ng motor rotor 13. Ang Teflon thread 2 ay ipinasok sa loob ng tube (thread kapal 0.5-0.6 mm ). Ang isang dulo ng thread ay naayos sa umiikot na rotor ng motor 13, ang pangalawa - naipasa sa cuvette 7 - ay hugis sa anyo ng isang spiral (upang mapahusay ang paghahalo). Ang posisyon ng thread ay tinutukoy ng pag-aayos ng cap 3, anuman ang distansya ng motor, na maginhawa kapag nagtatrabaho na nangangailangan ng madalas na pagbabago ng mga cuvettes.

Prinsipyo ng operasyon. Ang quartz cuvette ng spectrophotometer 7 ay puno ng substrate 14 (mga 1.5-2.0 ml), na ipinasok sa thermostatic cuvette holder ng spectrophotometer, sarado na may takip 3 na may umiikot na Teflon thread 2, na nahuhulog sa substrate 14, at lahat ng karagdagang operasyon ay ginagawa na sa sinag ng liwanag ng spectrophotometer at naitala sa recorder.

Sa simula ng trabaho, ang substrate ay halo-halong, at ang panulat ng recorder ay nagsusulat ng isang patag na pahalang (o "zero") na linya. Ang dispenser (na may enzyme) ay ipinasok sa butas 8 (ang karayom ​​ay nahuhulog sa substrate solution 14), sa pamamagitan ng mabilis na pagpiga sa tip 6, ang enzyme (karaniwan ay mga 0.03-0.05 ml) ay ipinakilala sa substrate, at ang dispenser ay tinanggal. Ang paghahalo ng mga bahagi ay nagtatapos sa 2.5-3 s, at inaayos ng panulat ng recorder ang simula ng reaksyon sa pamamagitan ng paglihis ng curve ng optical density (ΔA) kumpara sa oras.

Ginagawang posible rin ng naturang device na kumuha ng mga sample mula sa reacting system para sa pagsusuri; magdagdag ng mga inhibitor at activator sa system; baguhin ang mga kondisyon ng reaksyon (baguhin ang pH, lakas ng ionic, atbp.) nang hindi nakakagambala sa pagpaparehistro ng kurso ng reaksyon, na napaka-maginhawa, halimbawa, kapag pinag-aaralan ang paghahati n-NFF "acidic" phosphatases, kung saan cleavage n-NFF ay isinasagawa sa pH 5.0 (o pH 6-7), at ang aktibidad ng mga enzyme ay tinutukoy ng akumulasyon n-nitrophenolate ions sa pH 9.5-10.0.

Ang ganitong aparato ay maginhawa din para sa pagsasagawa ng spectrophotometric titration ng mga enzyme, atbp.

3.2 Device para sa pH meter

Ang device para sa pH meter ay binubuo ng isang binagong dulo ng flow electrode 1, isang semi-microcell 2, isang dispenser 3, at isang electronic circuit para sa pagkonekta ng pH meter sa recorder. Bilang karagdagan, ang device ay may kasamang karaniwang pH meter electrode (4), isang cell holder cap (5), isang thermostatic flow chamber (6), isang substrate solution (7), isang passive magnet (8), at isang aktibong magnet ( 9).

Ang karaniwang dulo ng flow electrode ng pH meter (LPU-01) ay pinalitan ng isang Teflon tube 1 (inner diameter 1.3-1.5 mm), na puno ng asbestos thread, pre-treated na may saturated KCl solution. Ang density ng pagpuno ng thread ay kinokontrol upang ang daloy ng rate ng KCl solusyon sa pamamagitan ng tubo ay malapit sa daloy rate ng orihinal na hindi binagong elektrod. Ang pagpapalit ng tip na ito ay ginagawang posible na bawasan ang laki ng orihinal na gumaganang cell mula 20-25 hanggang 2 ml, na ginagawang posible na pamahalaan na may kaunting mga volume (1.5 ml) ng mga solusyon ng mga mamahaling paghahanda ng biochemical.

Ang electronic circuit para sa pagkonekta ng pH meter (LPU-01) sa recorder ay binubuo ng power source (DC battery 12 V), isang variable wire resistance R 1 (10 - 100 Ohm), na nagtatakda ng boltahe na 9 V sa D809 zener diode ayon sa pagbabasa ng voltmeter, isang variable wire resistance R 2 (15-150 Ohm), na kinokontrol ang setting ng "zero" (reference point) ng pH meter readings sa sukat ng recorder, at variable wire paglaban R 3 (35-500 Ohm), na kinokontrol ang sukat ng pagpapalawak (amplification) ng mga pagbabasa ng pH scale - mga metro sa recorder. Ang circuit ay gumagana nang mapagkakatiwalaan hanggang ang pinagmulan ng boltahe ay bumaba sa ibaba 9 V.

Prinsipyo ng operasyon. Ang 1.5 ml ng substrate ay ipinakilala sa cell (isang glass cylinder na 1.7x2.4 cm), at ang cell ay naayos sa fixing cap 5. Ang pagpapakilos 9 ay naka-on, at ang panulat ng recorder ay nagsusulat ng isang pantay (pangunahing) linya ng sanggunian. Sa tulong ng isang dispenser, 0.03 ml ng enzyme solution ang ipinapasok sa substrate, at inaayos ng pen ng recorder ang simula ng reaksyon sa pamamagitan ng paglihis ng curve ng pH laban sa oras (t).

Ang nasabing aparato ay hindi pinapalitan ang isang pH stat, ngunit isinasaalang-alang ang posibilidad ng pagpapalawak ng sukat ng pH meter, pinapayagan ka nitong mapagkakatiwalaan na magtala ng mga menor de edad na pagbabago sa pH 0.004-0.005.

3.3 Nomogram rulers, maginhawa para sa pagtukoy ng paunang bilis

Ang malaking kumplikado ng pagtukoy ng paunang bilis sa paraan ng mga tangent ay ang pagkalkula ng mga ratio ng mga pagbabago sa mga konsentrasyon ng mga reagents (Δ[S]) bawat yunit ng oras (Δt), i.e. expression v 0 sa M/min mula sa mga kondisyon na

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

Sa pagsasagawa, ang gayong pamamaraan ay karaniwang binubuo ng tatlo o apat na magkakahiwalay na operasyon: ang isang tangent ay iginuhit sa paunang seksyon ng curve ng reaksyon, pagkatapos ay ang bilang ng mga yunit ng nakarehistrong halaga (optical density, anggulo ng pag-ikot, atbp.) bawat isang tiyak ang agwat ng oras ay binibilang, at ito ay humahantong sa yunit ng oras at, sa wakas, muling kalkulahin ang mga pagbasa ng recorder para sa pagbabago sa konsentrasyon ng reagent para sa 1 min (M/min). Ginagawang posible ng iminungkahing dalawang uri ng nomogram ruler na gawing simple ang pamamaraang ito.

Parihabang ruler. Ang v 0 ay ang ratio Δ[S]/Δt, ibig sabihin. tg ά, kung saan ang ά ay ang anggulo ng pagkahilig ng padaplis sa time axis t. Ang parehong tangent ay din ang hypotenuse ng kaukulang kanang tatsulok na may mga binti [S] at t. Ang mas malaking v 0 , mas matarik ang slope ng padaplis. Samakatuwid, kung nililimitahan natin ang ating sarili sa isang tiyak na agwat ng oras, halimbawa 1 min, makakakuha tayo ng isang serye ng mga right-angled na tatsulok na may iba't ibang mga halaga ng binti [S] (sa totoo lang, magkakaibang mga halaga ng v 0) . Kung, gayunpaman, ang parehong mga binti ay nagtapos: pahalang - sa mga yunit ng sanggunian ng oras (1 min), at patayo - sa mga yunit ng pagbabago sa mga konsentrasyon ng reagent, halimbawa, sa millimoles (mM), at ilapat ang mga resultang mga segment sa isang angkop na format mula sa isang transparent na materyal (plexiglass na halos 2 mm ang kapal) , pagkatapos ay makakakuha ka ng isang maginhawang ruler para sa pagtukoy ng mga paunang rate ng reaksyon. Ang lahat ng mga numero at linya ay naka-print sa reverse side ng ruler upang maalis ang parallax error kapag tinutukoy ang v 0.

Ang pamamaraan para sa pagtukoy ng v 0 ay binabawasan sa kasong ito sa dalawang simpleng operasyon: ang isang tangent ay iguguhit sa paunang seksyon ng kinetic curve t 2 at pagsamahin ang zero point ng horizontal leg t ng ruler sa simula ng tangent, ang pagpapatuloy ng tangent ay tatawid na ngayon sa concentration scale [S] sa puntong tumutukoy sa halaga ng v 0 sa M/min (kapag ang leg t ay pahalang, walang karagdagang operasyon ang kinakailangan.

Linya ng arko. Ang pamamaraan para sa pagtukoy ng v 0 ay maaaring gawing simple sa isang operasyon kung ang sukat ng konsentrasyon ay naka-plot sa isang arko ng isang tiyak na radius.

Ang isang tuwid ("basic") na linya 2 ay inilalapat sa isang plato ng transparent na materyal (lahat ng mga numero at linya ay inilalapat din sa reverse side ng ruler) at mula sa zero point (t=0, min) ng linyang ito na may isang radius na katumbas ng haba ng binti t=1 min [ , gumuhit ng isang arko [S], mula sa itaas hanggang sa ibaba kung saan inilalagay ang sukat ng mga pagbabago sa mga konsentrasyon ng reagent (halimbawa, substrate sa mM).

Ang inilarawan na mga uri ng mga ruler, isang aparato para sa isang spectrophotometer at isang pH meter ay ginamit sa loob ng ilang taon upang matukoy ang mga unang rate ng reaksyon (v 0), sa pag-aaral ng pagtitiyak ng substrate ng mga enzyme, para sa spectrophotometric titration, atbp.

Konklusyon

Sa papel na ito, ang isang seksyon ng enzymology ay isinasaalang-alang na pinag-aaralan ang pag-asa ng rate ng mga reaksiyong kemikal na na-catalyze ng mga enzyme sa isang bilang ng mga kadahilanan sa kapaligiran. Ang mga tagapagtatag ng agham na ito ay itinuturing na sina Michaelis at Menten, na naglathala ng kanilang teorya ng pangkalahatang mekanismo mga reaksyong enzymatic, nagmula sa isang equation na naging pangunahing prinsipyo ng lahat ng kinetic na pag-aaral ng mga enzyme, ito ay nagsisilbing panimulang punto para sa anumang quantitative na paglalarawan ng pagkilos ng mga enzyme. Ang orihinal na Michaelis-Menten equation ay isang hyperbolic equation; Ginawa ng Lineweaver at Burke ang kanilang kontribusyon sa kinetics, na binago ang Michaelis-Menten equation at nakakuha ng graph ng isang tuwid na linya, kung saan ang halaga ng V max ay maaaring pinakatumpak na matutukoy.

Sa paglipas ng panahon, ang pagbabago sa rate ng reaksyon ng enzymatic sa reaksyon ng enzymatic sa ilalim ng mga eksperimentong kondisyon ay bumababa. Ang pagbaba sa rate ay maaaring mangyari dahil sa isang bilang ng mga kadahilanan: isang pagbawas sa konsentrasyon ng substrate, isang pagtaas sa konsentrasyon ng isang produkto na maaaring magkaroon ng isang pagbawalan na epekto, mga pagbabago sa pH ng solusyon, at mga pagbabago sa temperatura ng daluyan ay maaaring mangyari. Kaya, sa bawat 10°C na pagtaas ng temperatura, ang rate ng reaksyon ay dumoble o mas mababa pa. Ang mababang temperatura ay binabaligtad na hindi aktibo ang mga enzyme. Ang pag-asa ng rate ng reaksyon ng enzymatic sa pH ay nagpapahiwatig ng estado ng mga functional na grupo ng aktibong sentro ng enzyme. Magkaiba ang reaksyon ng bawat enzyme sa mga pagbabago sa pH. Ang mga reaksiyong kemikal ay maaaring ihinto sa pamamagitan ng pagkilos sa kanila na may iba't ibang uri ng pagsugpo. Ang paunang rate ng reaksyon ay maaaring mabilis at tumpak na matukoy sa tulong ng mga kagamitang tulad ng mga nomogram ruler, isang spectrophotometer device at isang pH meter. Pinapayagan nito ang pinakatumpak na representasyon ng aktibidad ng pinag-aralan na mga enzyme.

Ang lahat ng ito ay aktibong ginagamit ngayon sa medikal na kasanayan.

Listahan ng mga mapagkukunang ginamit

1. Belyasova N.A. Biochemistry at molecular biology. - Minsk: book house, 2004. - 416 p., may sakit.

Keleti T. Mga Batayan ng enzymatic kinetics: Per. mula sa Ingles. - M.: Mir, 1990. -350 p., may sakit.

3. Knorre D.G. Biyolohikal na kimika: Proc. para sa kemikal, biol. at pulot. espesyalista. mga unibersidad. - 3rd ed., Rev. - M.: Mas mataas. paaralan 2002. - 479 p.: may sakit.

4. Krupyanenko V.I. Pamamaraan ng vector para sa kumakatawan sa mga reaksyong enzymatic. - M.: Nauka, 1990. - 144 p.

5. Lehninger A. Biochemistry. Molecular base ng istraktura at pag-andar ng cell: Per. mula sa Ingles. - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Biological Chemistry: Isang Textbook para sa Parmasya. in-tov at parmasyutiko. peke. honey. kasama. - M.: Mas mataas na paaralan, 1986. - 479 p., may sakit.

Severin E.S. Biochemistry. a. - 5th ed. - M.: GEOTAR - Media, 2009. - 786 p., may sakit.