NO Um pequeno vírus adeno-associado (AAV) está sendo considerado como um vetor potencial porque, ao contrário dos adenovírus, não causa doença. No entanto, ele não carrega o gene também. Para melhorá-lo como vetor, estão sendo realizados experimentos de irradiação e modificação química. Outros laboratórios estão experimentando Retrovírus CFTR, pois esses vírus inserem naturalmente seu genoma nas células hospedeiras.

No entanto, permanece a questão se a síntese normal da proteína CFTR eliminará as infecções bacterianas dos pulmões, que são responsáveis ​​por 90% da morbidade e mortalidade. Há todas as razões para esperar que a engenharia genética lide com essa tarefa com sucesso. Uma proteína nos pulmões, cuja função é destruir células estranhas, não é ativada em uma concentração de sal aumentada (isto é, é isso que caracteriza a fibrose cística); mas assim que o CFTR começa a produzir seu produto, a concentração de sal diminui e a proteína é ativada.

NO métodos de terapia genética estão sendo desenvolvidos atualmente para o tratamento de outras doenças hereditárias. Assim, em caso de violações da função das células sanguíneas, elas podem ser convertidas em um meio de cultura e introduzidas em

medula óssea do paciente, em seu ambiente natural. Sem dúvida, alguns dos desenvolvimentos serão coroados de sucesso e se tornarão prática médica comum nos próximos anos.

Todos esses fatos são exemplos do chamado terapia genética somática, ou seja, são aplicadas no corpo (soma) do paciente na esperança de que seja obtido um número suficiente de células capazes de desempenhar funções normais. O paciente pode se recuperar, mas o risco de passar genes indesejados para a prole ainda permanece, porque as células germinativas não são modificadas dessa maneira. terapia com células germinativas visa modificar todo o organismo, incluindo as glândulas que produzem as células sexuais. A maneira mais simples (teoricamente) é modificar o óvulo fertilizado introduzindo nele um transgene adequado. Esse tipo de procedimento já é possível e vem sendo realizado com sucesso em animais de experimentação, como camundongos. Mas pode ser aplicado a uma pessoa e, o mais importante, vale a pena? Esta é uma questão ética séria, e alguns moralistas argumentam que se a terapia genética somática é ética, então brincar com o genoma humano e mudar o conjunto genético de nossos descendentes é inaceitável, então tais procedimentos deveriam ser banidos.

Genômica - o estudo de todo o genoma

Avanços recentes no sequenciamento e no desenvolvimento de meios técnicos para processar um grande número de clones em uma biblioteca de genes permitiram aos cientistas estudar todo o genoma de um organismo de uma só vez. As sequências completas de muitas espécies já foram determinadas, incluindo a maioria dos chamados organismos genéticos modelo, como E. coli, a lombriga Caenorhabditis elegans;

e, claro, o objeto clássico da genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Na década de 1990, apesar de uma série de turbulências e controvérsias, foi lançado um projeto para estudar o genoma humano (“Genoma Humano”), financiado pelo National Institutes of Health. Em fevereiro

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Em 2001, um grande grupo de pesquisadores liderados por J. Craig Venter do laboratório privado Celera Genomics fez uma declaração sobre a decodificação preliminar do genoma humano. O resultado de seu trabalho foi publicado em 16 de fevereiro de 2001 na revista Science.

Outra versão, apresentada por um grupo do International Human Genome Sequencing Consortium, foi publicada em 13 de fevereiro de 2001 na revista Nature.

O nascimento da genômica pode ser considerado em meados do século 20, quando os geneticistas mapearam todos os cromossomos de organismos modelo com base na frequência de recombinações (ver Capítulo 8). No entanto, esses mapas mostraram apenas os genes para os quais os alelos mutantes eram conhecidos e, portanto, esses mapas não podem ser chamados de completos. O sequenciamento completo de DNA permite localizar todos os genes de um organismo, bem como estabelecer a sequência de bases entre eles.

A genômica é dividida em estrutural e funcional. A genômica estrutural visa descobrir exatamente onde certos genes estão localizados no DNA cromossômico. Os programas de computador reconhecem o início e o fim típicos dos genes, selecionando as sequências que provavelmente são genes. Essas sequências são chamadas quadro de leitura aberto(abrir

quadro de leitura, OFR). Os mesmos programas de computador também podem reconhecer íntrons típicos em sequências OFR. Depois que os íntrons são isolados do gene potencial, o computador usa o código restante para determinar a sequência de aminoácidos na proteína. Essas proteínas potenciais são então comparadas com aquelas proteínas cujas funções já são conhecidas e cujas sequências já estão inseridas no banco de dados. Graças a este tipo de programas, os chamados conservadorismo evolutivo: que para a maioria dos genes em organismos diferentes existem genes semelhantes. Do ponto de vista do desenvolvimento evolutivo, essa semelhança é compreensível: se uma proteína de uma espécie biológica está bem adaptada para suas funções, então seu gene é transmitido da mesma forma ou com pequenas alterações para a espécie descendente da inicial. O conservadorismo evolutivo permite a identificação de genes relacionados a um determinado gene em outros organismos. Comparando o gene resultante com os já conhecidos, muitas vezes é possível determinar sua função, necessariamente verificando-a em experimentos subsequentes.

Uma vez que todos os genes potenciais tenham sido identificados, o mapeamento genético começa. O mapa genético humano é um diagrama bastante confuso e heterogêneo, pois cada gene é marcado com uma determinada cor dependendo de sua função, que é estabelecida em comparação com outros genes conhecidos. A maioria dos genes humanos, como os genes de todos os eucariotos em geral, tem íntrons grandes. De acordo com estimativas aproximadas, entre as sequências publicadas, cerca de um terço ou um quarto são íntrons. Curiosamente, apenas cerca de 1,5% do genoma humano total (cerca de 2,9 x 109 pares

bases) contêm sequências (éxons) que codificam proteínas. Além disso, esse DNA parece conter apenas 35.000-45.000 genes, o que é menos do que o previsto. Ainda temos que entender como um número relativamente pequeno de genes codifica um organismo tão complexo.

Dois terços a três quartos do genoma estão na vasta

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O número de cópias de DNA repetitivo em pessoas diferentes não é o mesmo, então elas podem ser usadas para estabelecer a identidade, inclusive na medicina forense.

genômica funcional

genômica funcionalé o estudo da função do gene ao nível de todo o genoma. Embora os genes potenciais possam ser identificados por sua semelhança com genes que desempenham funções conhecidas em outros organismos, todas as suposições devem ser testadas contra o organismo em estudo. Em alguns organismos modelo, como a levedura nutricional, é possível desligar sistematicamente a função dos genes, por sua vez, o desligamento de um gene ocorre substituindo sua forma funcional por uma forma apagada em um vetor especial. Em seguida, obtenha uma cepa com um gene desativado e avalie seu fenótipo. Em um programa em andamento para analisar o genoma nutricional da levedura, vários milhares de genes foram desativados um por um.

Outro método de genômica funcional é que eles estudam o mecanismo de transcrição no nível de todo o genoma. Este método é baseado na suposição de que a maioria dos fenômenos biológicos são processos complexos envolvendo muitos genes. De particular interesse para os pesquisadores são os processos associados ao desenvolvimento do organismo, que mencionamos no Cap. 11. Se a transcrição de genes for estudada sob diferentes condições de crescimento, pode-se ter uma ideia das vias genéticas completas do desenvolvimento de um organismo.

Mas como a transcrição pode ser estudada no nível do genoma? Mais uma vez, as novas tecnologias ajudam os cientistas nisso. O DNA de cada gene do genoma ou de alguma parte do genoma é colocado na superfície de pequenas placas de vidro dispostas em ordem. Em seguida, eles são expostos a todos os tipos de mRNA encontrados na célula desse organismo. O DNA nas placas é obtido em duas

caminhos. Em um método, todos os mRNAs são transcritos reversamente para produzir moléculas curtas de DNA complementares correspondentes a um único gene. De outra forma, os genes (ou partes dos genes) são sintetizados uma base de cada vez em certas áreas das placas. A síntese é realizada por robôs que abrem e fecham

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superfície de vidro em uma determinada ordem. Registros com o genoma de muitos organismos podem ser adquiridos em empresas químicas.

Para estudar o mecanismo de transcrição, todos os mRNAs de um determinado estágio de desenvolvimento são marcados com um marcador fluorescente e distribuídos sobre a superfície das placas. Esses mRNAs se ligam ao seu respectivo DNA e podem ser reconhecidos por suas manchas brilhantes. Como a posição do DNA de cada gene individual nas placas é conhecida antecipadamente, o computador determina quais genes são transcritos em um determinado estágio de desenvolvimento.

Assim, com a ajuda dessas e de outras tecnologias, os geneticistas estão começando a descobrir os modelos gerais de organização dos vivos do lado funcional e estrutural. Para processar uma enorme quantidade de informações, surgiu um ramo especial da ciência - a bioinformática. As próximas décadas prometem ser uma época de grandes descobertas.

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Estudos da configuração espacial do DNA nos cromossomos revelaram causas inesperadas e até então desconhecidas de doenças humanas graves.

O surgimento da genômica 3D

Ao longo das décadas que se passaram desde a prova da função genética do DNA na década de 1940, permaneceu inalterada a ideia de que a medida da distância entre quaisquer partes do genoma é o comprimento da cadeia de DNA que as separa. Hoje sabemos que a capacidade do DNA de formar alças e outras estruturas complexas possibilita que genes e elementos genômicos que controlam seu trabalho (potenciadores) estejam próximos uns dos outros no espaço do núcleo celular, mesmo que estejam separados por um fragmento de DNA estendido (Fig. um).

Nos últimos anos, surgiram novas abordagens que permitem estudar o dobramento do DNA genômico no núcleo da célula. Isso marcou o início do desenvolvimento da direção científica, que chamamos de genômica 3D. Usando essas abordagens, foi demonstrado que os cromossomos são divididos em blocos estruturais e funcionais - domínios topologicamente associados (TADs). As regiões do genoma de um TAD contactam-se com muito mais frequência do que com regiões de TADs vizinhos. Isso torna possível representar TADs como bobinas relativamente densas de fitas de DNA. Os resultados de muitos experimentos mostram que um potenciador só pode ativar genes localizados dentro do TAD onde seu potenciador está localizado.

Assim, os TADs desempenham um papel importante no controle da atividade gênica. A remoção ou dano ao segmento de DNA que separa os TADs vizinhos permite que o potenciador ative genes que normalmente não funcionam neste tipo de célula, o que pode levar a doenças graves como câncer, violações da formação de características sexuais e disfunções no desenvolvimento embrionário (Fig. . 2).

Onde estão as fronteiras entre os TADs

Mas o que garante a divisão do genoma em TADs? O trabalho do nosso laboratório contribuiu significativamente para a solução deste problema. Descobrimos que a organização do DNA genômico em TADs é em grande parte espontânea e governada por leis físicas simples. Nosso trabalho foi publicado em uma prestigiosa revista internacional Pesquisa do genoma(Sergey V. Ulianov et al. A cromatina ativa e a transcrição desempenham um papel fundamental na partição cromossômica em domínios de associação topológica // Pesquisa do genoma, 2016, 26, pág. 70–84, doi: 10.1101/gr.196006.115), foi muito comentada na imprensa e na televisão.

A essência de nossos resultados é que os limites dos TADs são regiões genômicas contendo genes “housekeeping”, ou seja, genes que funcionam em todos os tipos de células e são necessários para manter os processos celulares básicos. Devido a uma série de características, tais regiões do genoma não podem se dobrar em glóbulos densos, criando assim uma “marcação” dos limites dos TADs no genoma.

É importante notar que, além de várias técnicas bioquímicas, usamos a modelagem da estrutura do genoma no supercomputador Lomonosov da Universidade Estadual de Moscou, e os resultados dessa modelagem indicam claramente que o dobramento do DNA em células individuais pode variar bastante (Fig. 3).

De populações celulares a células individuais

Na esmagadora maioria dos casos, centenas de milhares e até milhões de células em cada experimento precisam ser usadas em pesquisas de biologia molecular. Isso se deve ao fato de haver muito poucas moléculas estudadas em uma célula, o que torna extremamente difícil trabalhar com elas.

Por exemplo, a quantidade de DNA genômico em uma célula humana é cerca de cem bilhões de vezes menor que um grama. Trabalhar com um grande número de células leva ao fato de que os resultados obtidos no experimento, via de regra, permitem estabelecer os valores médios mais típicos de certos parâmetros da fisiologia celular. De certa forma, as informações obtidas podem ser comparadas à "temperatura média" dos pacientes de um hospital.

Trabalhar com um grande número de células, como regra, permite definir os valores médios mais típicos de certos parâmetros da fisiologia celular, como a “temperatura média” dos pacientes em um hospital

Sem dúvida, os resultados dos estudos de populações celulares permitiram estabelecer muitas regularidades importantes. No entanto, é sabido que células do mesmo tipo, que parecem exatamente iguais ao microscópio, podem diferir em muitos parâmetros bioquímicos diferentes. Os estudos sobre o funcionamento do genoma em uma única célula estão se tornando uma "tendência dos tempos" e já deram uma contribuição significativa para entender como é feito o ajuste fino do nosso genoma. Essa pesquisa também afeta o desenvolvimento da medicina, pois, por exemplo, eventos que ocorrem em uma proporção muito pequena de células podem desencadear o desenvolvimento de tumores. Ao estudar grandes populações de células, esses eventos geralmente passam despercebidos.

Em colaboração com colegas austríacos e americanos, desenvolvemos uma nova abordagem experimental que nos permite analisar o dobramento do genoma em células individuais. Usando essa abordagem, conseguimos construir mapas significativamente mais detalhados da organização espacial do genoma do camundongo do que no trabalho anterior de nossos colegas ingleses. Uma análise dos dados obtidos, recentemente publicados na revista Natureza(Ilya M. Flyamer et al. Único-núcleo Hi-C revela reorganização única da cromatina na transição ovócito-zigoto // Natureza, 544, pág. 110–114, doi: 10.1038/nature21711), forneceram fortes evidências de que o dobramento do genoma é significativamente diferente em células individuais (Fig. 4). Em nossa opinião, isso indica que há uma enumeração constante de várias configurações genômicas na célula, e isso oferece a possibilidade de rápida adaptação às mudanças nas condições ambientais.

Embora na maioria dos casos seja mais fácil estudar uma população de células do que células individuais, para alguns tipos de células, a abordagem da população não pode ser usada, porque essas células são, como se costuma dizer, produtos por peça. Usando nossa abordagem experimental, fomos capazes de estudar o dobramento dos genomas paterno e materno em ovos fertilizados de camundongos (zigotos).

Inesperadamente para nós mesmos, descobrimos que o dobramento do DNA genômico no núcleo materno no zigoto é fundamentalmente diferente do dobramento do genoma nos núcleos de qualquer outro tipo de célula. Nos núcleos de todos os outros tipos de células estudados, as regiões ativas e “silenciosas” do genoma são espacialmente isoladas umas das outras. No núcleo materno do zigoto, ao contrário, isso não é observado. Nossos resultados sugerem que a configuração do genoma no núcleo materno é a mais básica, correspondendo ao chamado estado de totipotência, que possibilita a obtenção de diversos tipos celulares de um organismo adulto de um zigoto durante o desenvolvimento embrionário.

A configuração espacial do genoma no núcleo materno é a mais básica e permite obter muitos tipos diferentes de células de um organismo adulto de um óvulo fertilizado.

Genômica e medicina 3D

Ao discutir as novidades da biologia molecular, via de regra, eles falam sobre o "genoma humano", ou "DNA genômico humano", ou simplesmente sobre o DNA. Mas é importante lembrar que os núcleos das células do nosso corpo normalmente contêm 23 moléculas de DNA diferentes, cada uma das quais forma um cromossomo separado, e juntas elas são chamadas de genoma.

Cada cromossomo é dobrado de uma maneira única e única para ele e está localizado no núcleo da célula de tal forma que o território ocupado por ele praticamente não se sobrepõe aos territórios dos cromossomos vizinhos. Nesse sentido, o núcleo da célula se assemelha ao globo, no qual existem muitos estados ocupando determinados territórios e separados por fronteiras.

A história conhece muitos exemplos de como os eventos em um estado influenciaram diretamente a vida nos países vizinhos e a política mundial em geral. No núcleo da célula, a situação é aproximadamente a mesma. Quaisquer alterações no trabalho do genoma, seja o início ou a supressão da expressão de genes individuais, ou o aparecimento de cópias extras de certos cromossomos, podem afetar o trabalho de genes que não são diretamente afetados por essas alterações e localizados em outros estados cromossômicos.

Como exemplo, podemos citar os resultados do trabalho que desenvolvemos com nossos colegas franceses do Instituto Gustave Roussy. Os resultados deste trabalho foram publicados na prestigiosa revista de hematologia Sangue(Jeanne Allinne et al. Relocalização perinucleolar e nucleolina como eventos cruciais na ativação transcricional de genes-chave no linfoma de células do manto // Sangue, V. 123, 13, p. 2044–2053 doi:10.1182/sangue-2013-06-510511). Demonstramos de forma convincente que o simples movimento de um determinado gene de uma região do núcleo para outra pode fazer com que ele seja ativado em células onde normalmente não funcionaria. Isso desencadeia toda uma cascata de processos que, em última análise, leva ao desenvolvimento de leucemia, cujas causas seriam difíceis de entender sem levar em conta a estrutura espacial do genoma.

Simplesmente mover um gene específico de uma região do núcleo para outra pode desencadear toda uma cascata de processos que eventualmente leva ao desenvolvimento de leucemia.

É importante notar que a descoberta de um mecanismo fundamentalmente novo para a ocorrência de leucemia cria a base para o desenvolvimento de formas de combate a essas doenças. Assim, os estudos de dobramento do DNA genômico no núcleo são de interesse não só para a ciência fundamental, mas também para a medicina, contribuindo para uma compreensão mais profunda dos mecanismos de diversas patologias.

Evolução da organização 3D do genoma

Como a organização tridimensional do genoma é uma das ferramentas de regulação da expressão gênica, ela deve ser objeto de evolução. Em um trabalho recente realizado em nosso laboratório, cujos resultados foram publicados em uma revista internacional altamente conceituada (Anastasia P. Kovina et al. Evolução da Organização 3D do Genoma: Comparação de Agrupamentos de Genes de Globina Fundidos e Segregados // Biologia Molecular e Evolução, v. 34, 6, p. 1492-1504, doi: 10.1093/molbev/msx100), mostramos que esse é realmente o caso.

Usando o exemplo da evolução dos agrupamentos de genes de globina de vertebrados, demonstramos que, à medida que sobem na escada evolutiva, segmentos lineares de cromossomos são perdidos, enquanto segmentos organizados em glóbulos (bobinas) são retidos (Fig. 5).

Muito provavelmente, isso se deve ao fato de que em mamíferos o papel de intensificadores remotos na regulação da atividade gênica aumenta significativamente. O estabelecimento de contatos entre esses intensificadores e os genes por eles controlados é assegurado pela formação de alças de DNA, que levam à formação de glóbulos.

Nos vertebrados, à medida que sobem na escada evolutiva, os segmentos lineares dos cromossomos são perdidos, enquanto os segmentos organizados em glóbulos (emaranhados) são preservados.

Notas Finais

Nos últimos anos, a ciência doméstica tem sido frequentemente e em muitos casos justificadamente criticada por sua baixa produtividade e falta de trabalho em nível internacional. Acima, mostramos como um laboratório doméstico relativamente pequeno trabalha com sucesso na vanguarda da ciência mundial, publicando sistematicamente os resultados de seu trabalho nas revistas internacionais de maior prestígio.

A implementação de todos os trabalhos acima foi possível graças a uma grande doação da Russian Science Foundation. O valor desse apoio não pode ser superestimado, não apenas porque oferece a oportunidade de realizar trabalhos caros, como o sequenciamento massivo de DNA. Mas, mais importante, essas bolsas oferecem uma oportunidade de atrair jovens pesquisadores para o trabalho, oferecendo uma alternativa razoável para ir para o exterior. Pelo menos na biologia experimental, o apoio direcionado a equipes que trabalham em nível mundial (o que pode ser julgado pela presença de publicações em revistas internacionais de primeira linha) é, em nossa opinião, o caminho mais direto para o renascimento da ciência em nosso país.

(em inglês - genomics) é uma ciência que estuda genomas. A quantidade de informação genômica aumentou dramaticamente nos últimos anos devido a melhorias na tecnologia de sequenciamento de DNA. GenBank, o banco de dados do NIH (Institutos Nacionais de Saúde dos EUA), em abril de 2011, contém 135.440.924 sequências de DNA.

O ano de 1956 tornou-se fundamental no processo de pesquisa em genética humana, pois neste ano foi criada a ciência da cromosologia e realizado um congresso de genética humana em Copenhague.

A evolução de qualquer ciência se deve ao refinamento de modelos e teorias, mas novas suposições não anulam velhas verdades, de modo que o que era verdade ontem não é necessariamente falso hoje. Somente as pseudociências são imutáveis ​​por séculos e se orgulham disso como se fosse uma espécie de garantia de qualidade.

Estamos sitiados por todos os lados por inúmeras disciplinas, antigas e novas, que ensinam práticas médicas com resultados excepcionais, dispositivos revolucionários para medir habilidades negativas e positivas.

Atualmente, não há setor da ciência que não tenha sido explorado em algum lugar e por alguém no mundo: todos os dias, gigantes centros de pesquisa em universidades, institutos privados e até pequenos laboratórios, divulgam uma enorme quantidade de novas informações sobre as últimas pesquisas e adições . para eles. Às vezes essa informação é bastante excêntrica, como em áreas como a invisibilidade, o comportamento sexual das moscas na China, ou o peso molecular dos cheiros, e em áreas que abrem espaço para cenários emocionantes, como aqueles relacionados à construção da vida em um laboratório ou a descoberta de novos planetas que poderiam levar essa nova vida.

Pioneiro na corrida para prolongar a vida humana está Craig Venter, geneticista, empresário e filantropo por trás do Projeto Genoma Humano, que disse em março deste ano que seu mais recente projeto genômico usaria US$ 70 milhões em capital para criar uma nova empresa chamada Human Longevity Inc. HLI). Venter não está sozinho em suas ambições. Por exemplo, a empresa Calico (California Life Company) tem como objetivos melhorar a saúde das pessoas, resolver o problema do envelhecimento e doenças associadas, e a Universidade da Califórnia, em San Diego - onde vão seccionar o genoma do câncer e os tumores HLI para todos os pacientes que sofrem de câncer e quem lhe dará o seu consentimento.

Desde o primeiro sequenciamento em 2011, a genômica progrediu rapidamente e agora os cientistas do câncer estarão se movendo para a próxima “próxima fronteira da ciência”, diz Lipman, diretor do Instituto da Califórnia. “Agora estamos em um período que será equiparado historicamente para a genômica do seccionamento de células cancerosas ao período dos anos 90 para o desenvolvimento da Internet. Estamos estudando o genoma e as tecnologias de seccionamento na esperança de que resultados rápidos possam ser alcançados em nesta escala. 15-20 anos agora podem ser alcançados de forma realista em 1-2 anos. A luta contra o câncer está evoluindo rapidamente e isso é apenas a ponta do iceberg."

Fatos do campo da genômica:

. Em abril de 2003, o Projeto Genoma Humano foi concluído após 13 anos de pesquisa. 2,7 bilhões de dólares foram investidos neste projeto.
. Em dezembro de 2005, o Cancer Genome Atlas, um projeto piloto de 3 anos e US$ 100 milhões, foi lançado para estudar a composição genética das células cancerosas.
. Em maio de 2007, o genoma de James Watson, um dos descobridores do DNA, foi "sequenciado" em sua totalidade, a um custo de até um milhão de dólares.
. Desde o final do ano passado, a 23andMe fornece sequenciamento de genoma por apenas US$ 1.000.
. Atualmente, o Projeto Genoma Humano está em andamento. Após o sequenciamento, foram encontrados cerca de três bilhões de pares de bases que compõem o DNA. O projeto ENCODE (Enciclopédia de Elementos de DNA), nascido de uma colaboração internacional de mais de 80 países e 35 grupos de pesquisa, promete a primeira interpretação da informação para descrever o comportamento do genoma.

Os pesquisadores conseguiram entender como e onde surgem certas funções biológicas, desafiando vários dogmas e reavaliações do que até ontem era considerado DNA "indesejado" ou DNA não codificado (inativo). "Os novos dados mostram que o genoma contém muito poucas seções que não estão sendo usadas", de acordo com um comunicado do Consórcio e do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL-EBI), que liderou o estudo junto com o Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano. (NHGRI). ), os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) nos Estados Unidos. A refutação do mito do determinismo genético pelo Projeto Genoma Humano marca o início de uma nova era pós-genômica.

Nova situação cultural

Até recentemente, o “design” do homem, ou seja, a criação de todas as suas características, era confiado à natureza, ninguém podia intervir para melhorar o ser humano.
Todo novo organismo nasce de uma pequena célula. Ele herda o programa ancestral na forma de DNA, mas não herda os corpos físicos de seus ancestrais. Ele herda o coração de seus pais, mas tem um novo coração. Tudo começa do zero, de uma célula, mas a cada nova vida, o programa de DNA pode melhorar e piorar.
Antes de avaliar o efeito da genômica, deve-se notar que seria impossível, e até irresponsável, abandonar os métodos de manipulação genética apenas porque esses métodos podem ser usados ​​por pessoas inescrupulosas e egoístas para seus próprios fins.

Nenhuma agência governamental tem a varinha mágica que pode fazer com que todas as tecnologias genômicas desapareçam. A questão principal no desenvolvimento da genômica não é pensar em como bloquear esse progresso, mas sim como obter o máximo benefício e minimizar os riscos.

A avaliação das possibilidades da genômica para possibilidades terapêuticas e no campo do aprimoramento do fundo genético depende de princípios éticos, que serão tomados como guia.

Para aqueles que são defensores da reprodução humana "sob supervisão" e que estão dispostos a aceitar como fato, a possibilidade de usar métodos artificiais será muito fácil de aceitar e manipulação genética, mas para alguém, isso será inaceitável.

Indo além dos princípios dos quais a ciência é repelida, a humanidade deve ter em mente que todas as tecnologias genômicas utilizadas em humanos têm um ser humano em primeiro plano. Esse fator levanta muitos pontos de interrogação, incluindo a questão de qual efeito a engenharia genética pode ter no equilíbrio do ecossistema e na moralidade da própria pessoa, que é, em última análise, beneficiária de uma ciência como a genômica.

Antes de falar diretamente sobre as consequências que as manipulações genéticas podem ter, esclarecemos que o desejo de melhorar a concepção de um ser humano, antes do nascimento, é principalmente uma influência direta na seleção, ou seja, "a retirada do que é diferente, do que é não é perfeito, falhou". É como jogar um embrião fracassado no lixo durante um procedimento de fertilização in vitro.

No ambiente de uma ciência como a genômica, podemos falar sobre a possibilidade de fundar um novo tipo de serviço, um "serviço genético", que terá que satisfazer o desejo humano de melhorar seu pool genético. Este serviço, muito provavelmente, será pago com apoio estatal ou estritamente comercial, onde cada pessoa, desde que seja solvente, poderá corrigir a sua informação genética.

Mas a existência deste "serviço" será impossível sem progresso técnico e alguma mudança na mentalidade humana.

Como qualquer droga, novas tecnologias genômicas podem ser usadas para "soro para gene" onde há riscos de curto ou longo prazo. Há sempre o risco de que sejam eliminados genes que têm aspectos positivos ainda desconhecidos e que podem aparecer em diferentes ambientes. Por exemplo, o mesmo gene que causa a anemia falciforme torna o corpo mais resistente à malária.

Com relação à terapia gênica, devemos assumir alterações nas células germinativas como consequência da terapia gênica somática. Em determinadas circunstâncias, pode ser legal (deve-se avaliar se essas pessoas podem ou não se reproduzir após o tratamento), pois a modificação de células germinativas para tratamento pode levar a alterações no patrimônio genético das gerações futuras. A terapia genética de embriões também está se desenvolvendo e há necessidade de realizar experimentos em embriões. Naturalmente, antes que o sucesso seja alcançado nesses estudos, haverá muitos fracassos, o que implica que o objeto de estudo morrerá. Sim, em nome da ciência e em benefício das gerações futuras, esses sacrifícios podem ser justificados, mas isso não pode ser justificado do ponto de vista ético.

Esta é a parte 1 da história da genômica, chamada de "Projetos Genômicos". Nesta parte, tentarei falar popularmente sobre como surgiram os primeiros métodos de leitura de sequências genéticas, em que consistiam e como a genômica passou da leitura de genes individuais para a leitura de genomas completos, incluindo genomas completos de pessoas específicas.

Logo após a descoberta de Watson e Crick (Fig. 1), nasceu a ciência da genômica. A genômica é a ciência que estuda os genomas dos organismos, que envolve a leitura intensiva de sequências completas de DNA (sequenciamento) e seu mapeamento em mapas genéticos. Esta ciência também considera as interações entre genes e alelos de genes e sua diversidade, padrões de evolução e a estrutura dos genomas. O desenvolvimento desta área foi tão rápido que até bem recentemente editores de texto como o Microsoft Word não conheciam a palavra "genoma" e tentaram corrigi-la para a palavra "gnome".

Arroz. 1James Watson (esquerda) e Francis Crick (direita) - cientistas que descobriram a dupla hélice do DNA

O primeiro gene lido foi o gene shell do bacteriófago MS2, estudado no laboratório de Walter Fyers em 1972. Em 1976, outros genes de bacteriófagos também eram conhecidos - sua replicase, o gene responsável pela reprodução das partículas virais. Moléculas curtas de RNA já eram lidas com relativa facilidade, mas moléculas grandes de DNA ainda não eram capazes de ler corretamente. Por exemplo, a sequência de 24 letras da sequência do gene do operon da lactose obtida em 1973 por Walter Gilbert e Allen Max foi considerada um avanço significativo na ciência. Aqui está a sequência:

5"—TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT 3"
3"—ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAA 5"

As primeiras técnicas de leitura de DNA eram muito ineficientes e usavam marcadores de DNA radioativos e métodos químicos para distinguir nucleotídeos. Por exemplo, pode-se tomar enzimas que cortam a sequência de nucleotídeos com diferentes probabilidades após letras diferentes. A molécula de DNA é composta por 4 letras (nucleotídeos) A, T, G e C, que fazem parte de uma dupla hélice antiparalela (duas cadeias são direcionadas em direções opostas). Dentro dessa hélice, os nucleotídeos se opõem de acordo com a regra da complementaridade: o oposto de A na outra cadeia é T, o oposto de G é C e vice-versa.

Gilbert e Maxam usaram 4 tipos de enzimas. Um corte após A ou G, mas melhor após A (A>G), o segundo corte melhor após G (G>A), o terceiro após C e o quarto após C ou T (C+T). A reação foi realizada em 4 tubos de ensaio com cada tipo de enzima e, em seguida, os produtos foram colocados em gel. O DNA é uma molécula carregada e quando a corrente é ligada, ela vai de menos a mais. Moléculas menores correm mais rápido, então as moléculas de DNA cortadas se alinham em comprimento. Olhando para as 4 pistas do gel, pode-se dizer em qual sequência os nucleotídeos estão localizados.

Um avanço no campo do sequenciamento de DNA veio quando o bioquímico inglês Frederick Sanger, em 1975, propôs o chamado “método de terminação de fita” para a leitura de sequências de DNA. Mas antes de falar sobre esse método, é necessário apresentar os processos que ocorrem durante a síntese de novas moléculas de DNA. Para a síntese de DNA, é necessária uma enzima - DNA polimerase dependente de DNA, que é capaz de completar a construção de uma molécula de DNA de fita simples para uma de fita dupla. Para fazer isso, a enzima precisa de uma "semente" - um primer, uma sequência curta de DNA que pode se ligar a uma molécula longa de fita simples, que queremos construir em uma fita dupla. Os próprios nucleotídeos também são necessários na forma de trifosfatos de nucleotídeos e certas condições, como um certo teor de íons de magnésio no meio e uma certa temperatura. A síntese sempre vai em uma direção da extremidade chamada 5' até a extremidade chamada 3'. Claro, para ler o DNA, você precisa de uma grande quantidade de matriz - isto é, cópias do DNA que serão lidas.

Em 1975, Sanger surgiu com o seguinte. Ele pegou nucleotídeos especiais (terminadores), que, tendo se juntado à cadeia crescente da molécula de DNA, interferiram na ligação de nucleotídeos subsequentes, ou seja, eles “quebraram” a cadeia. Em seguida, ele pegou 4 tubos de ensaio, a cada um dos quais adicionou todos os 4 tipos de nucleotídeos e um tipo de nucleotídeos terminais em pequena quantidade. Assim, no tubo de ensaio onde estava localizado o nucleotídeo de terminação “A”, a síntese de cada nova molécula de DNA poderia se romper em qualquer lugar onde “A” deveria estar, no tubo de ensaio com o “G” de terminação - em qualquer lugar onde G deve ficar, e assim por diante. 4 pistas de 4 tubos foram aplicadas ao gel (Fig. 2) e novamente as moléculas mais curtas “correram” para a frente, e as mais longas permaneceram no início, e pelas diferenças nas bandas foi possível dizer qual nucleotídeo segue qual. Para ver as bandas, um dos quatro nucleotídeos (A, T, G ou C) foi marcado, sem alterar as propriedades químicas, usando isótopos radioativos.

Arroz. 2Método Sanger. Três séries de 4 faixas são mostradas.

Usando este método, o primeiro genoma baseado em DNA foi lido, o genoma do bacteriófago ϕX174, com 5,386 nucleotídeos de comprimento (o genoma do fago MS2 lido anteriormente era baseado em RNA e tinha um genoma de 3,569 nucleotídeos).

O método de Sanger foi significativamente melhorado no laboratório de Leroy Hood, onde em 1985 o rótulo radioativo foi substituído por um rótulo luminoso e fluorescente. Isso possibilitou a criação do primeiro sequenciador automático: cada molécula de DNA agora era pintada com uma cor diferente, dependendo de qual fosse a última letra (nucleotídeo marcado com cores terminando a cadeia). Os fragmentos foram separados por tamanho no gel e a máquina leu automaticamente o espectro de luminescência das bandas de entrada, enviando os resultados para um computador. Como resultado deste procedimento, obtém-se um cromatograma (Fig. 2), segundo o qual é fácil estabelecer uma sequência de DNA de até 1000 letras, com um número muito pequeno de erros.

Arroz. 3 Um exemplo de cromatograma, em um sequenciador moderno, usando o método de terminação da cadeia Sanger e um rótulo brilhante.

Por muitos anos, o método aprimorado de Sanger se tornaria o principal método de sequenciamento de genoma em massa e seria usado para muitos projetos de genoma completo, e Sanger receberia um segundo Prêmio Nobel de Química em 1980 (ele recebeu seu primeiro em 1958 pela leitura do aminoácido sequência da proteína insulina, a primeira proteína lida). O primeiro genoma completo de um organismo celular foi o genoma de uma bactéria que causa algumas formas de pneumonia e meningite - haemophilus influenzae em 1995. O genoma desta bactéria tinha 1.830.137 nucleotídeos de comprimento. Em 1998, o primeiro genoma de um animal multicelular, uma lombriga, aparece Caenorhabditis elegans(Fig. 4 à direita), com 98 milhões de nucleotídeos, e então no ano 2000 aparece o primeiro genoma da planta - Arabidopsis thaliana(Fig. 4 à esquerda), parentes de rábano e mostarda. O genoma desta planta tem 157 milhões de nucleotídeos. A velocidade e a escala do sequenciamento cresceram a uma taxa surpreendente, e os bancos de dados emergentes de sequências de nucleotídeos foram reabastecidos cada vez mais rápido.

Arroz. quatro Arabidopsis thaliana(esquerda) e Caenorhabditis elegans(na direita).

Finalmente, foi a vez do genoma dos mamíferos: os genomas do camundongo e do humano. Quando, em 1990, James Watson liderou o projeto completo de leitura do genoma humano nos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) nos EUA, muitos cientistas estavam céticos em relação à ideia. Tal projeto exigia um enorme investimento de dinheiro e tempo e, dadas as capacidades limitadas das máquinas existentes para ler genomas, parecia simplesmente inviável para muitos. Por outro lado, o projeto prometia mudanças revolucionárias na medicina e na compreensão da estrutura do corpo humano, mas mesmo aqui havia problemas. O fato é que naquele momento não havia uma estimativa exata do número de genes em uma pessoa. Muitos acreditavam que a complexidade da estrutura do corpo humano indica a presença de centenas de milhares de genes, e talvez vários milhões, e, portanto, separar tal número de genes, mesmo que sua sequência pudesse ser lida, seria uma tarefa difícil. tarefa impossível. Foi na presença de um grande número de genes que muitos assumiram a diferença fundamental entre o homem e os outros animais - uma visão posteriormente refutada pelo projeto genoma humano.

A própria ideia de ler o genoma humano nasceu em 1986 por iniciativa do Departamento de Energia dos EUA, que posteriormente financiou o projeto em conjunto com o NIH. O custo do projeto foi estimado em 3 bilhões de dólares, e o projeto em si foi concebido por 15 anos com a participação de vários países no projeto: China, Alemanha, França, Grã-Bretanha e Japão. Para a leitura do genoma humano, foram utilizados os chamados “cromossomos bacterianos artificiais” (BAC - bacteria artificial cromossoma). Nessa abordagem, o genoma é cortado em vários pedaços, com cerca de 150.000 mil nucleotídeos de comprimento. Esses fragmentos são inseridos em cromossomos artificiais em anel que são inseridos em bactérias. Com a ajuda de bactérias, esses cromossomos se multiplicam e os cientistas obtêm muitas cópias do mesmo fragmento da molécula de DNA. Cada um desses fragmentos é então lido separadamente, e os pedaços lidos de 150.000 nucleotídeos são plotados em um mapa cromossômico. Este método permite um sequenciamento bastante preciso do genoma, mas é muito demorado.

Mas o projeto do genoma humano avançou em um ritmo extremamente lento. O cientista Craig Venter e sua empresa Celera Genomics, fundada em 1998, tiveram na história da genômica o mesmo papel que a União Soviética influenciou os americanos até a lua. Venter disse que sua empresa concluiria o projeto do genoma humano antes que o projeto do governo fosse concluído. O projeto exigirá apenas US$ 300 milhões - uma fração do custo de um projeto do governo usando a nova tecnologia de sequenciamento "whole genoma shotgun" - lendo fragmentos curtos aleatórios do genoma. Quando Francis Collins, que substituiu James Watson como chefe do Projeto de Leitura do Genoma Humano em 1993, soube das intenções de Venter, ficou chocado. “ Faremos o genoma humano, e você pode fazer um camundongo sugeriu Venter. A comunidade científica ficou alarmada, e por uma série de razões. Primeiro, Venter prometeu terminar seu projeto em 2001, 4 anos antes do previsto para o projeto do governo. Em segundo lugar, a Celera Genomics iria capitalizar o projeto criando um banco de dados absoluto que seria pago por empresas farmacêuticas comerciais.

Em 2000, a Celera comprovou a eficácia de seu método de sequenciamento ao publicar o genoma da mosca-das-frutas Drosophila, em conjunto com o laboratório do geneticista Gerald Rubin (antes, a espingarda de genoma inteiro era usada para ler o primeiro genoma de uma bactéria, mas poucos acreditavam que este método era adequado para genomas grandes). Foi esse chute de uma empresa comercial que estimulou o desenvolvimento de métodos aprimorados e mais modernos de leitura de genomas no Projeto Genoma Humano. Em 2001, uma versão preliminar do genoma foi publicada pelo State Genomic Project e pela Celera. Em seguida, foi feita uma estimativa preliminar do número de genes no genoma humano, 30-40 mil. Em 2004, saiu a versão final do genoma, quase dois anos antes do previsto. No último artigo, foi dito que o número de genes em uma pessoa é supostamente de apenas 20 a 25 mil. Este número é comparável com outros animais, em particular com um verme C.elegans.

Quase ninguém adivinhou que o número de genes que garantem o trabalho do nosso corpo pode ser tão pequeno. Mais tarde, outros detalhes ficaram conhecidos: o genoma humano tem um comprimento de cerca de três bilhões de nucleotídeos, a maior parte do genoma é composta de sequências não codificantes, incluindo todos os tipos de repetições. Apenas uma pequena parte do genoma realmente contém genes - seções de DNA das quais as moléculas de RNA funcionais são lidas. Um fato interessante é que, à medida que o conhecimento do genoma humano aumentava, o número de genes putativos só diminuía: muitos genes potenciais acabaram sendo pseudogenes (genes não funcionais), em outros casos, vários genes passaram a fazer parte do mesmo gene.

As taxas de sequenciamento adicionais aumentaram exponencialmente. Em 2005, foi publicado o genoma do chimpanzé, que confirmou a incrível semelhança entre macacos e humanos, que foi vista por zoólogos do passado. Em 2008, os genomas de 32 vertebrados foram totalmente lidos, incluindo gato, cachorro, cavalo, macaco, orangotango e elefante, 3 genomas de deuterostômios de invertebrados, 15 genomas de insetos, 7 genomas de vermes e centenas de genomas bacterianos.

Finalmente, em 2007, a humanidade se aproximou da possibilidade de sequenciar os genomas de pessoas individuais. A primeira pessoa a ter um genoma individual completo lido foi Craig Venter (Fig. 4). Ao mesmo tempo, o genoma foi lido de tal forma que foi possível comparar os cromossomos de Venter, herdados de ambos os pais. Assim, descobriu-se que entre um e outro conjunto de cromossomos dentro de uma pessoa existem cerca de três milhões de diferenças de nucleotídeos de uma letra, sem contar o grande número de grandes regiões variadas. Um ano depois, o genoma diplóide completo de James Watson foi publicado (Fig. 5). O genoma de Watson continha 3,3 milhões de substituições de uma única letra em comparação com o genoma humano anotado, das quais mais de 10.000 resultaram em mudanças nas proteínas que codificam seus genes. O genoma de Watson custou US$ 1 milhão, ou seja, o preço da leitura de genomas caiu mais de 3.000 vezes em 10 anos, mas esse não é o limite. Hoje, os cientistas se deparam com a tarefa de '1 genoma - $ 1000 - 1 dia', e não parece mais impossível com o advento de novas tecnologias de sequenciamento. A próxima parte da "história" contará sobre eles.

Arroz. 5 James Watson e Craig Venter são os primeiros humanos a ler genomas individualmente.

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Parte 2 - aqui

A genômica é geralmente chamada de um dos ramos da biologia molecular. Sua principal tarefa está no chamado sequenciamento do genoma - o estudo das sequências de nucleotídeos de DNA e RNA. Não confunda as palavras genética e genômica. A genética lida com o estudo dos mecanismos de hereditariedade e variabilidade, e a genômica é projetada para colocar em prática o conhecimento adquirido.

Da história da ciência

Como área especial, a genômica se formou em 1980-1990, juntamente com o surgimento dos primeiros projetos de sequenciamento (análise molecular) dos genomas de certas espécies de organismos vivos.

Estrutura da genômica

Na genômica moderna, existem muitas subseções:

• genômica comparativa ou evolutiva, é baseada na comparação da organização e conteúdo dos genomas de vários organismos vivos;
• genômica funcional - estuda detalhadamente as funções dos genes, seu impacto na atividade gênica;
• a genômica estrutural lida com o sequenciamento, a análise molecular do DNA, com base na qual os mapas genômicos são criados e podem ser comparados.

Por que precisamos de genômica

Um grande número de genomas de vários microrganismos (principalmente patogênicos) foi decifrado. Isso possibilita a busca de genes alvo de drogas aqui e a produção de novas drogas.

A genômica é percebida como uma parte integral e necessária da biologia geral. É capaz de contribuir significativamente para o desenvolvimento da biotecnologia, agricultura e saúde.

Em um hospital em Wisconsin, uma criança de três anos deixou os médicos perplexos por muito tempo. Nesta criança, os intestinos estavam edematosos e quase completamente cheios de abscessos. Esta criança tinha sobrevivido a mais de cem cirurgias aos três anos de idade. O bebê recebeu uma sequência completa das regiões codificadoras de seu DNA e o culpado da doença foi identificado - a proteína XIAP, envolvida nas cadeias de sinal da morte celular programada, desempenha um papel muito importante no sistema imunológico. Devido ao diagnóstico, os fisiologistas recomendaram um transplante de medula óssea. O bebê foi salvo.

Outro caso envolveu um câncer atípico em uma mulher de 39 anos que sofria de uma forma aguda de leucemia promielocítica. Ao usar métodos de diagnóstico padrão, a doença não pôde ser detectada. Mas ao decifrar e analisar o genoma das células cancerígenas, foi possível descobrir que uma grande parte do décimo quinto cromossomo mudou para o décimo sétimo, o que provocou certa interação gênica. O paciente foi prescrito tratamento adequado.