Im Rahmen einer zytologischen Untersuchung wird die Struktur von Zellen untersucht, um bösartige, gutartige Tumore und Läsionen mit Nicht-Tumorcharakter zu erkennen. Der Hauptzweck der Studie besteht darin, die Tatsache der Malignität der zur Analyse entnommenen Zellen zu bestätigen oder zu widerlegen.

Methoden der zytologischen Forschung basieren auf der mikroskopischen Untersuchung der Struktur von Zellen, der zellulären Zusammensetzung von Flüssigkeiten und Geweben.

Es gibt solche Methoden zytologischer Studien:

• Lichtmikroskop;
• Elektronenmikroskopie;
• Zentrifugationsmethode. Es wird verwendet, wenn es notwendig ist, Zellmembranen von der allgemeinen Struktur zu trennen;
• markierte Atommethode. Sie werden verwendet, um biochemische Prozesse in Zellen zu untersuchen: Dazu wird ihnen ein markiertes radioaktives Isotop zugeführt;
• lebenslanges Studium. Diese Forschungsmethode ermöglicht es, die in der Zelle ablaufenden dynamischen Prozesse zu untersuchen.

Der Abschluss einer zytologischen Studie basiert auf den Merkmalen von Veränderungen des Zytoplasmas, des Zellkerns, des Kern-Zytoplasma-Verhältnisses, der Bildung von Komplexen und Zellstrukturen.

Eine zytologische Analyse dient bei der Vorsorgeuntersuchung, zur Klärung der Diagnose, bei Operationen, zur rechtzeitigen Erkennung von Rückfällen und zur Kontrolle des Behandlungsverlaufs.

Zytologische Untersuchung von Abstrichen

Als Materialien für die Analyse verwenden:

• Flüssigkeiten: Urin, Prostatasekret, Sputum, Abstriche aus der Endoskopie verschiedener Organe, Ausfluss aus den Brustwarzen, Abdrücke und Abschabungen von ulzerierten und erodierten Oberflächen, Wunden und Fisteln, Flüssigkeit aus serösen und artikulären Höhlen;
• Punktate: biologisches Material, das bei diagnostischen Punktionen mit einer dünnen Nadel gewonnen wird;
• Abstriche aus der Höhle und dem Gebärmutterhals.

Die meisten dieser zytologischen Abstrichuntersuchungen werden bei Bedarf durchgeführt, um die Diagnose zu stellen und zu klären. Eine zytologische Untersuchung eines Abstrichs vom Gebärmutterhals (Pap-Abstrich) wird jedoch empfohlen: einmal jährlich - für Frauen über 19, die sexuell aktiv sind; zweimal im Jahr - Frauen, die hormonelle Verhütungsmittel einnehmen, hatten Herpes genitalis; mehr als zweimal im Jahr - Frauen, die an Unfruchtbarkeit, Gebärmutterblutungen, Fettleibigkeit leiden, die häufig den Sexualpartner wechseln, Östrogene einnehmen, Warzen an den Genitalien haben, Genitalherpes haben.

Zytologische Untersuchung des Gebärmutterhalses

Zur zytologischen Untersuchung des Gebärmutterhalses wird mit einem speziellen Holzspatel ein Abstrich von den äußeren und inneren Teilen des Gebärmutterhalses und von den Scheidengewölben entnommen. Dann wird es auf Glas übertragen und fixiert.

Eine zytologische Untersuchung des Gebärmutterhalses wird durchgeführt, um krebsartige Zellveränderungen zu erkennen, und abschließend gibt der Arzt eine der fünf Stadien des Zustands der Zellen an:

• Stufe 1. Zellen mit Abweichungen werden nicht gefunden;
• Stufe 2. Es gibt geringfügige Veränderungen in der Zellstruktur, die durch eine Entzündung der inneren Geschlechtsorgane verursacht werden. Dieser Zustand der Zellen verursacht keine Angst, aber der Frau wird empfohlen, sich einer zusätzlichen Untersuchung und Behandlung zu unterziehen;
• Stufe 3. Eine kleine Anzahl von Zellen mit strukturellen Abweichungen wurde gefunden. In diesem Fall empfiehlt es sich, erneut einen Abstrich zu machen oder eine histologische Untersuchung des veränderten Gewebes durchzuführen;
• Stadium 4. Einzelne Zellen mit bösartigen Veränderungen werden gefunden. Die endgültige Diagnose wird nicht gestellt, eine zusätzliche Untersuchung wird vorgeschrieben;
• Stufe 5. Im Abstrich wurde eine große Anzahl von Krebszellen gefunden.

Die Zuverlässigkeit einer solchen zytologischen Untersuchung ist hoch, sie kann jedoch nur Auskunft darüber geben, aus welchem ​​Bereich die Zellen zur Analyse entnommen wurden. Um den Zustand der Eileiter, Eierstöcke und der Gebärmutter zu beurteilen, sollten Sie sich einer umfassenden Untersuchung unterziehen.

Das Hauptmerkmal der morphofunktionellen Methode zur Untersuchung von Zellen ist der Wunsch, die strukturelle Grundlage der biochemischen Prozesse zu verstehen, die eine bestimmte Funktion bestimmen, dh diese Prozesse mit spezifischen Zellstrukturen in Verbindung zu bringen.

Das Endziel dieser Methode ist identisch mit dem, das von der Molekularbiologie und der zellulären Strukturbiochemie verfolgt wird. Die Methoden, mit denen diese Wissenschaften ein gemeinsames Problem lösen, unterscheiden sich jedoch grundlegend. Wenn in der Molekularbiologie und Strukturbiochemie die Zerstörung der Zelle und die Isolierung der untersuchten Struktur in Form einer mehr oder weniger reinen Fraktion eine unabdingbare Bedingung ist, dann ist in zytologischen Studien im Gegenteil die Erhaltung der Integrität von Die Zelle ist Voraussetzung. In diesem Fall ist es notwendig, externe Eingriffe auf ein Minimum zu reduzieren und zu versuchen, die strukturelle und biochemische Organisation bestimmter Komponenten genau innerhalb der Grenzen eines integralen zellulären Systems zu untersuchen.

Morphofunktionelle Studien haben sich in den letzten Jahrzehnten rasant entwickelt. Damals wurde eine Vielzahl grundlegend neuer Methoden zur qualitativen und quantitativen Analyse zellulärer Strukturen entwickelt. Dieser Ansatz ist eng mit neuen Zweigen der biologischen Wissenschaften und insbesondere der Molekularbiologie verbunden, die den sehr bedeutenden Beitrag solcher Studien zum Fortschritt unseres Wissens über die allgemeinen Muster der Zellorganisation bestimmt.

Elektronenmikroskopie

Eine der gebräuchlichsten, die zu einem klassischen Verfahren für strukturelle und biochemische Untersuchungen geworden ist, ist die Methode der Elektronenmikroskopie in ihren verschiedenen Modifikationen. Diese Modifikationen sind sowohl auf unterschiedliche Ansätze zur Analyse der untersuchten Strukturen als auch auf die Besonderheiten der Zellpräparation für ultrastrukturelle Studien zurückzuführen. Hohe Auflösungen herkömmlicher Transmissionsmikroskope (Transmissionsmikroskope) ermöglichen es, nicht nur alle Organellen des Kern- und Zytoplasmaapparates zu analysieren, sondern auch einige Strukturen, die sich auf der supramolekularen Organisationsebene befinden, z. B. stützende und kontraktile Mikrofibrillen, Mikrotubuli und einige Multienzyme Komplexe. Um Zellen auf der systemischen und subsystemischen Ebene ihrer Organisation zu untersuchen, wird derzeit zunehmend die Methode der Hochspannungs-Elektronenmikroskopie erfolgreich eingesetzt. Aufgrund der im Vergleich zum Transmissionselektronenmikroskop viel höheren Energie des eindringenden Elektronenstrahls ermöglicht diese Methode, „dicke“ Schnitte oder sogar ganze ausgebreitete Zellen unter dem Mikroskop zu untersuchen, wodurch beispielsweise der Komplex analysiert werden kann System von Submembranfibrillen des gesamten Zelloberflächenapparates.

Bei der Untersuchung der Funktion des Oberflächenapparats der Zelle, der Beziehung einzelner Subsysteme des Oberflächenapparats des Kerns und einer Reihe anderer Fragen der allgemeinen Zytologie, der Methode der Rasterelektronenmikroskopie, die es ermöglicht, die zu untersuchen Oberfläche eines Objekts im Volumen, wird wesentlich.

Freeze-Chipping-Verfahren

Einen besonderen und grundlegend wichtigen Platz in zytologischen Studien der morphobiochemischen Richtung nimmt die Gefrier-Spalt-Methode ein. Es ist die schonendste Methode zur Präparation biologischer Objekte für die Ultrastrukturanalyse, d. h. sie verursacht minimale Veränderungen der Zellstruktur im Vergleich zu ihrem ursprünglichen Zustand. Das Wesen der Methode ist wie folgt. Das Objekt wird in eine Atmosphäre aus flüssigem Stickstoff gebracht, wodurch alle Stoffwechselvorgänge sofort gestoppt werden. Dann werden Chips aus dem gefrorenen Objekt hergestellt. Von der Oberfläche der Chips werden Repliken erhalten, indem ein Metallfilm darauf aufgebracht wird. Diese Filme werden weiter unter einem Elektronenmikroskop untersucht. Der Vorteil der Gefrierspaltungsmethode besteht darin, dass die Spaltungsebene normalerweise durch die hydrophobe Phase der Membran verläuft, und dies ermöglicht, die Menge, Größe und Anordnung von integralen Membranproteinen an den Spaltungen, also direkt dem Inneren, zu untersuchen morphobiochemische Organisation von Membranen. Die Methode lieferte sehr wertvolle Ergebnisse bei der Untersuchung verschiedener Arten von Membranstrukturen und speziellen Formationen, beispielsweise bestimmter Arten von Zellkontakten.

Zytochemische Methode

Für die Hauptaufgabe des strukturbiochemischen Aspekts zytologischer Untersuchungen - die Aufklärung der funktionellen Bedeutung von Strukturen durch die Analyse ihrer biochemischen Organisation - spielen zytochemische Methoden eine herausragende Rolle. Derzeit werden sie sowohl hinsichtlich der genauen qualitativen Identifizierung chemischer Verbindungen in den untersuchten Strukturen als auch hinsichtlich ihrer quantitativen Bewertung kontinuierlich verbessert. Mit Hilfe spezieller Instrumente, die eine quantitative Zytospektrophotometrie ermöglichen, ist es möglich, den Gehalt einer bestimmten Substanz, beispielsweise RNA und DNA, nicht nur in der Zelle als Ganzes, sondern auch auf nukleärer Ebene zu bestimmen oder zytoplasmatische Strukturen. Dank der Interferenzmikroskopie ist es möglich, die Gesamtmenge an Protein in der Zelle und ihre Veränderungen während ihres Lebens zu beurteilen.

Es gibt ein Verfahren zur zytochemischen Identifizierung von Enzymen, das es erlaubt, nicht nur die Lokalisierung und Menge einer bestimmten Verbindung in Zellstrukturen zu beurteilen, sondern auch die Prozesse der Synthese und des intrazellulären Transports dieser Verbindungen.

Die Zytochemie von Enzymen basiert auf dem Prinzip der Substrat-Enzym-Wechselwirkung unter Verwendung von Markerverbindungen, die in diesem Fall ausfallen. Durch die Bestimmung der Lokalisation und in einigen Fällen der Aktivität enzymatischer Systeme können wir die Lokalisation bestimmter biochemischer Prozesse in zellulären Strukturen beurteilen.

Autoradiographie

Die Methode der Autoradiographie sowie die Zytochemie von Enzymen eröffnet die Möglichkeit, die intrazelluläre Synthese und den Transport zu untersuchen, hat aber gleichzeitig noch breitere Möglichkeiten. Die Methode der Autoren-Diographie basiert auf der Verwendung radioaktiver Vorläufer für die Synthese von Makromolekülen, die mit künstlichen Isotopen (3 H, 14 C, 35 S usw.) markiert sind. Es ermöglicht nicht nur die Lokalisierung der Syntheseorte bestimmter Makromoleküle, sondern auch die Verfolgung spezifischer Wege des intrazellulären Transports dieser Verbindungen, um eine relative quantitative Bewertung der Syntheseintensität und der Bewegungsgeschwindigkeit von Makromolekülen in Zellstrukturen zu erhalten. So wurde insbesondere erstmals die Bewegung der RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma von Zellen aufgezeigt, die Lokalisation der Synthese und der intrazelluläre Sekrettransport in sekretorischen Zellen detailliert verfolgt und viele weitere für die allgemeine Zytologie wichtige Fakten wurden aufgedeckt. Im Kern ist diese Methode eine der typischsten Methoden, die für das strukturbiochemische Forschungsgebiet charakteristisch sind, da sie es Ihnen ermöglicht, die Stoffwechselprozesse in intrazellulären Strukturen in einer integralen, unzerstörten (wie in biochemischen Studien) Zelle direkt zu untersuchen. Das Wesen dieser Methode basiert auf dem Nachweis von Molekülen, die mit einem künstlichen Isotop markiert sind, unter Verwendung einer fotografischen Emulsion, die Schnitte von Zellen und Geweben bedeckt, die zu unterschiedlichen Zeiten nach der Einführung eines markierten Vorläufers fixiert wurden.

Immunzytochemische Methode

Derzeit ist auch eine sehr genaue qualitative Analyse einzelner Proteine ​​zellulärer Strukturen innerhalb eines integralen zellulären Systems möglich. Eine solche Analyse wird mit immuncytochemischen Methoden durchgeführt. Das Wesen dieser Methoden liegt darin, dass ein bestimmtes Protein als Antigen dient, gegen das im Körper von Säugetieren spezifische Antikörper produziert werden. Letztere werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff oder einem anderen Marker kombiniert. Dann wird die untersuchte Zelle mit Serum mit markierten Antikörpern behandelt. Dabei binden spezifisch markierte Antikörper streng selektiv an die Strukturen, die die untersuchten Proteine ​​enthalten. Unter Verwendung dieser Methode wurde insbesondere die Lokalisierung der kontraktilen Haupt- und Hilfsproteine ​​des Aktin-Myosin-Systems im submembranösen fibrillären Apparat der Zellen aufgedeckt und die Veränderung ihrer Verteilung während der Bildung des mitotischen Apparats und während der Zytotomie gezeigt . Die gleiche Methode wurde erfolgreich verwendet, um die Gültigkeit des Fluid-Mosaik-Modells der Membranorganisation zu beweisen.

Komplexe Methoden der Zellforschung

In jüngster Zeit wurden besonders große Fortschritte bei der Untersuchung der strukturellen und biochemischen Organisation von Zellen durch den komplexen Einsatz von ultrastrukturellen Analysemethoden, zytochemischen und autoradiographischen Methoden erzielt. Diese Erfolge sind vor allem auf die Entwicklung spezieller Methoden der Zytochemie und Autoradiographie auf ultrastruktureller Ebene zurückzuführen, die es ermöglichen, Stoffwechselvorgänge auf der genannten Ebene der Zellorganisation direkt zu analysieren, biochemische Prozesse zu „strukturieren“ und deren spezifische Bedeutung herauszufinden bestimmte Zellstrukturen in abgesonderten Gliedern komplexer Prozesse des intrazellulären Metabolismus. In dieser Hinsicht wurde umfangreiches Material über die Rolle verschiedener Arten der Membranphase des Zytoplasmas bei synthetischen anabolischen Prozessen und Prozessen des intrazellulären Katabolismus angesammelt.

Große Erfolge wurden insbesondere bei der Erforschung der Organisation und Funktionsweise des lysosomalen Zellapparates erzielt. Bei der Untersuchung des Kernapparates von Zellen wurden wichtige neue Tatsachen gewonnen. Mit Hilfe zytochemischer Methoden ist es möglich, Ribonukleoproteine ​​(RNPs) und Desoxyribonukleoproteine ​​(DNPs) auf ultrastruktureller Ebene zu identifizieren und dadurch signifikante Fortschritte bei der Untersuchung der Organisation der Transkription, Reifung und des intranukleären Transports verschiedener Arten von RNPs in eukaryotischen Zellen zu erzielen , und die Verwendung der Elektronenautoradiographie ermöglichte es, die Rolle einzelner zellulärer Strukturen in diesen Prozessen detailliert darzustellen. So konnte beispielsweise die Funktion des Nucleolus detailliert untersucht und darin die Prozesse der Bildung von ribosomaler RNA gezielt strukturiert werden.

Eine solche Synthese molekularbiologischer und strukturbiochemischer Aspekte und Methoden ist auch sehr typisch für die Entwicklung vieler weiterer wichtiger Fragestellungen zur Feinorganisation einzelner Zellbestandteile. Dabei manifestiert sich die enge Verwandtschaft zwischen molekularbiologischer und morphobiochemischer zytologischer Analytik nicht nur in der Synthese der Endergebnisse, sondern auch in deren Zusammenspiel im Untersuchungsprozess selbst. Eine solche Interaktion wird entweder durch die Durchführung komplexer Arbeiten unter Verwendung sowohl biochemischer als auch zytologischer Methoden durch Spezialisten, Biochemiker und Zytologen oder durch die Verwendung spezieller komplexer Methoden durchgeführt, die an der Grenze der biochemischen und zytologischen Analyse von Zellstrukturen liegen.

Ein Beispiel erster Art ist die Kombination von Methoden zur biochemischen Isolierung von Zellbestandteilen mit deren feiner Ultrastrukturanalyse. Auf diese Weise wurden erstmals Fotografien von Arbeitsgenen mit der Identifizierung von DNA, RNA-Polymerasen und darauf transkribierten RNA-Molekülen erhalten. Die Verbesserung dieser Methode ermöglicht es nun in einigen Fällen, die Intensität der Transkription durch direktes Auszählen der Anzahl der RNA-Polymerase-Komplexe zu berücksichtigen. Mit einem Elektronenmikroskop können Sie Muster der DNA-Replikation an biochemisch isolierten, zirkulären oder linearen DNA-Molekülen direkt untersuchen. Methoden der Ultrastrukturanalyse werden auch weit verbreitet bei der immunzytochemischen Untersuchung der Lokalisierung einzelner Proteine, in Ribosomen-Subpartikeln, bei der Untersuchung verschiedener Ebenen der DNP-Organisation und in vielen anderen Fällen verwendet.

Ein typisches Beispiel für speziell entwickelte komplexe Verfahren ist die Hybridisierung von DNA und RNA auf Schnitten. Sein Wesen ist wie folgt. DNA, die Teil des DNP einer ganzen Zelle ist, wird denaturiert und dann von RNA-Fraktionen verarbeitet, die mit radioaktiven Isotopen markiert sind. Als Ergebnis zeigt die DNA autoradiographisch Regionen, die zu bestimmten RNA-Fraktionen komplementär sind, d. h. die Transkriptionsstellen der letzteren, mit anderen Worten, es wird möglich, die Lokalisierung bestimmter Gene genau zu bestimmen.

Im Rahmen der experimentellen Methode wird die funktionelle Organisation der Zelle als Ganzes oder ihrer einzelnen Bestandteile untersucht, indem ihr Zustand mit Hilfe äußerer Einflüsse verändert wird. Beobachtet man dann Veränderungen in der Vitalaktivität der Zelle oder ihrer Bestandteile, kann man Rückschlüsse auf bestimmte Eigenschaften der untersuchten Mechanismen ziehen. Diese Art von Verfahren ist heute in einigen Bereichen der Zytologie sehr weit verbreitet, und in einigen ihrer Bereiche nimmt der zytophysiologische Aspekt der Analyse zellulärer Strukturen immer noch eine dominierende Stellung ein.

Genau hier liegt das Problem der Transportfunktion des Oberflächenapparates der Zelle. Einerseits wurden bei der Erforschung dieses Themas erhebliche Fortschritte erzielt: Basierend auf den Ergebnissen der zytophysiologischen Analyse war es möglich, Varianten des transmembranösen Transports von Substanzen zu identifizieren und verschiedene Eigenschaften von Transportsystemen zu charakterisieren. Andererseits ist die endgültige Lösung der Frage nach den Mechanismen des Transmembrantransports nur möglich, wenn die spezifische Organisation des Lipid-Protein-Systems von Membranen geklärt ist und die genaue Kenntnis der Eigenschaften und Rolle der übrigen Komponenten von Membrantransportsysteme, d.h. auf der Ebene der strukturellen und biochemischen Analyse der Plasmamembran und des gesamten Oberflächenapparates der Zelle.

Die Grenzen der zytophysiologischen Untersuchung des Transmembrantransports werden deutlich am Beispiel des Standes der Fragestellung der Organisation von Ionenkanälen, die bei vielen wichtigen Prozessen, wie beispielsweise der Ausbreitung eines Nervenimpulses, eine große Rolle spielen . Mit Hilfe eines ganzen Arsenals verschiedener zytophysiologischer Methoden wurde gezeigt, dass es in der Plasmamembran spezielle Kanäle für Na-, K-, Cl-Ionen gibt, die sich in ihren Eigenschaften unterscheiden. Das spezifische Wissen über ihre strukturelle Organisation ist jedoch immer noch durch indirekte Daten über ihre Proteinnatur begrenzt. Damit scheint die Entscheidung über die Organisation von Ionenkanälen im Besonderen und Membrantransportsystemen im Allgemeinen in die Hände von Wissenschaftlern zu fallen, die sich mit strukturbiochemischen Methoden auskennen, da hier zahlreiche und sehr wertvolle Erkenntnisse aus zytophysiologischen Untersuchungen gewonnen werden nur die erste phänomenologische Stufe in der Analyse dieser allgemeinen zellulären Mechanismen. Dennoch kann der zytophysiologische Ansatz in bestimmten Aspekten der Untersuchung der Zelle viel geben.

Gegenwärtig wird die Vielfalt der Methoden zytophysiologischer Studien sowohl durch das ständig wachsende Arsenal an Mitteln bestimmt, die bei Zytologen auftauchen, als auch durch die Verwendung subtiler Methoden zur Analyse der Veränderungen, die als Folge der Einwirkung dieser Mittel auf die auftreten Zelle. Früher wurden zur Analyse von Zellveränderungen unter Einwirkung äußerer Mittel den Physiologen vertraute Methoden verwendet, z. B. Registrierung elektrischer Potentiale, Bewertung der Zellatmung durch Sauerstoffaufnahme, quantitative Bewertung der Farbstoffsorption, Registrierung qualitativer Änderungen der Zellfärbung usw. , jetzt werden für solche Zwecke zunehmend Methoden verwendet, die für die strukturelle und funktionelle Richtung charakteristisch sind: elektronenmikroskopische Untersuchung ultrastruktureller Veränderungen, autoradiographische Analyse synthetischer Prozesse usw.

Unter den in experimentellen Studien verwendeten Mitteln können zwei Hauptgruppen unterschieden werden. Die erste Gruppe besteht aus Substanzen, deren "Einsatzort" innerhalb der Zelle mehr oder weniger bekannt ist - das sind Substanzen, die einzelne Verknüpfungen des intrazellulären Stoffwechsels blockieren (zum Beispiel Actinomycin D, das die Transkription hemmt, oder Puromycin, das die Proteinsynthese blockiert, 2,4-Dinitrophenol, das Atmung und oxidative Phosphorylierung entkoppelt), Substanzen, die selektiv bestimmte Zellstrukturen zerstören (z. B. Colchicin, das Mikrotubuli zerstört, oder Cytochalasin B, das auf Mikrofibrillen wirkt). Die zweite Gruppe besteht aus Mitteln der sogenannten komplexen Wirkung, die den Zellstoffwechsel im Allgemeinen verändern – Temperatur, osmotischer Druck, pH-Wert usw. Die Verwendung von Mitteln wie beispielsweise 2,4-Dinitrophenol ermöglichte eine Klärung eine Reihe von Fragen zur Konjugation von Atmung und Phosphorylierung in der Atmungskette der Mitochondrien; die Verwendung von Inhibitoren der RNA- und Proteinsynthese ermöglichte es, einige der Verbindungen in der Proteinsynthese in Ribosomen und Transkriptionsprozessen zu untersuchen; Unter Verwendung von Colchicin und Cytochalasin wurde die Rolle von Mikrotubuli und Mikrofilamenten in den Prozessen des intrazellulären Transports aufgeklärt.

Wirkstoffe der zweiten Gruppe (komplexe Wirkung) haben den Vorteil, dass sie sozusagen natürlicher für Zellen sind, weil Zellen unter natürlichen Bedingungen ähnlichen Veränderungen in der äußeren Umgebung begegnen. Gleichzeitig beeinflussen sie fast alle Aspekte des Zellstoffwechsels, was es schwierig macht, die Veränderungen zu analysieren, die in diesem Fall auftreten. Dennoch ist die Untersuchung der Wirkung solcher Mittel auf die Zelle von unabhängiger Bedeutung und absolut notwendig, um die Mechanismen der Zellanpassung an sich ändernde Umweltfaktoren zu untersuchen und die Frage des Verhältnisses von spezifischen und unspezifischen Prozessen in der Reaktion von Zellen darauf zu lösen äußere Einflüsse und andere ähnliche Aufgaben, die eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Problems der zellulären Integration spielen.

Bei der Untersuchung der funktionellen Organisation von Zellen ist die Analyse der Interaktionsmechanismen einzelner Zellsysteme von großer Bedeutung. In vielen Fällen kann dieses Problem durch die Erstellung spezieller experimenteller Modelle gelöst werden. Die typischsten Beispiele dieser Art sind Kerntransplantationen in verschiedenen Objekten (Protozoen, Amphibieneier); Hybridisierung somatischer Zellen; Transplantation von Zellteilen in Protozoen; Forschung unter Verwendung einer Reihe anderer mikrochirurgischer Techniken, die an protozoologischen Objekten und in vitro kultivierten Säugetierzellen durchgeführt werden.

Mit Hilfe solcher Modelle wurden die wichtigsten allgemeinen zytologischen Fragestellungen untersucht. Beispielsweise waren die Ergebnisse von Experimenten zur Transplantation der Kerne differenzierter Amphibienzellen in eine kernlose Eizelle eines der überzeugendsten Argumente für die Theorie der differentiellen Genaktivität. Der Kern des letzteren besteht darin, die strukturelle Identität der Genome differenzierter Zellen eines vielzelligen Organismus anzugeben. Dies impliziert eine grundlegend wichtige Position, dass der Differenzierungsprozess nicht durch irreversible Veränderungen im Erbapparat der Zellen erfolgt, sondern durch die Regulierung der Aktivität einer Reihe von Genen, die für alle Zellen eines bestimmten Organismus gleich sind.

An einem experimentellen Modell zur Untersuchung des Prozesses der Dedifferenzierung einer Hybridzelle – eines Hühnererythrozyten und einer Säugetierkrebszelle – wurden sehr interessante Fakten gefunden. Die Besonderheit dieses Heterokaryons liegt darin, dass bei der Verschmelzung eines Hühnererythrozyten mit einer Krebszelle eine Hämolyse des Hämoglobins eintritt und im Zytoplasma der Krebszelle ein normaler, fast vollständig inaktivierter Erythrozytenkern gefunden wird. Daher wird hier eine Transplantation des differenzierten Kerns in ungewöhnliche Zustände des aktiven Zytoplasmas durchgeführt. Sorgfältige Beobachtungen von Veränderungen in der strukturellen Organisation dieser Kerne zeigten, dass ihr Volumen unter neuen Bedingungen signifikant zunimmt. Proteine, die aus dem Zytoplasma stammen, spielen eine bedeutende Rolle bei der Schwellung der Zellkerne. Diese äußeren Veränderungen im Kernapparat des Erythrozyten spiegeln die tiefgreifenden Prozesse der Umstrukturierung seiner inneren Organisation wider, die zur Wiederaufnahme der Transkription von "Hühner"-Boten-RNA führen. Die Umsetzung der darin enthaltenen Informationen in Form der Synthese von "Hühner"-Proteinen erfolgt jedoch erst, wenn der Nukleolus im Kernapparat von Hühnererythrozyten gebildet wird und die Synthese von ribosomaler RNA beginnt. So zeigte eine gründliche Analyse experimenteller Modelle das Vorhandensein einer komplexen zytoplasmatischen Kontrolle über die Aktivität des Kernapparats.

Mit Hilfe experimenteller Modelle konnten eine Reihe weiterer wichtiger allgemeiner zytologischer Fragestellungen gelöst werden. Beispielsweise wurde die Frage nach den Bewegungsmechanismen von Anaphase-Chromosomen erfolgreich am nativen mitotischen Apparat untersucht, der aus den zermalmenden Seeigel-Blastomeren isoliert wurde und außerhalb der Zelle arbeitet. Meist an experimentellen Modellen konnte ein weit verbreitetes allgemeines Muster der Zellorganisation festgestellt werden, nämlich das Fehlen eines starren Ursache-Wirkungs-Prinzips bei der Verschaltung komplexer intrazellulärer Prozesse. Es stellte sich heraus, dass solche Mehrkomponentenprozesse wie die Zellreproduktion, die Prozesse der Synthese und des intrazellulären Transports hochpolymerer Verbindungen usw. aus getrennten, relativ autonomen Stufen bestehen, die nicht durch einen starren kausalen Zusammenhang verbunden sind. Die Aufklärung dieses Musters schafft einerseits die Voraussetzungen, um die Mechanismen der erstaunlichen Plastizität zellulärer Organisation zu verstehen. Andererseits ist dieselbe Regelmäßigkeit die Grundlage für das Studium der Integrationsmechanismen solcher Prozesse in einem integralen zellulären System unter normalen Bedingungen.

Gegenwärtig nimmt die Anzahl und Vielfalt experimenteller Modelle zu, die zur Lösung bestimmter spezifischer allgemeiner zytologischer Probleme entwickelt wurden. Dies trägt wesentlich zum Fortschritt unseres Wissens in einem relativ schlecht untersuchten Bereich der Zytologie bei - den Mechanismen der Interaktion und Integration der Arbeit subzellulärer Systeme.

Es sollte betont werden, dass die Besonderheit der Forschung, die im Rahmen eines experimentellen Ansatzes zur Analyse der Muster der Zellorganisation durchgeführt wird, die immer größere Vertiefung der Kriterien und Zeichen ist, anhand derer die Analyse der Integrationsmechanismen und spezifischen Funktionen einzelner Zellen durchgeführt wird Strukturen durchgeführt wird und gleichzeitig deutlich wird, dass die erfolgreiche Lösung der anstehenden Forschungsaufgaben nur mit einer breiten Einführung der Methoden des strukturell-funktionalen Ansatzes in die Praxis möglich ist.

Das Wesen der vergleichenden zytologischen Forschungsmethode in der allgemeinen Zytologie ist die Aufklärung der allgemeinen Muster der Zellorganisation unter Verwendung der gesamten Vielfalt ihrer Vielfalt, die dem Wissenschaftler von der lebenden Natur zur Verfügung gestellt wird. Die vergleichende Methode hat zwei Aspekte. Einerseits wird es traditionell verwendet, um verwandte Beziehungen zwischen einzelnen Zelltypen (insbesondere bei einzelligen Organismen) zu identifizieren. Auf der Grundlage der so entstandenen phylogenetischen Systematik prokaryontischer und niederer und höherer eukaryontischer Zellen, die nach feinzytologischen Kriterien durchgeführt wird, wird es möglich, die Entstehung sowohl einzelner partikularer Zellsysteme als auch die allgemeinen Regulations- und Integrationsmechanismen der Zellsysteme nachzuvollziehen Zelle als integrales System Als Beispiel kann eine solche Anwendung der vergleichenden zytologischen Analyse in der Zellforschung interessante Daten über die Feinorganisation des Kernapparates in prokaryotischen, niederen und höheren eukaryotischen Zellen liefern

Die Hauptmerkmale der Organisation des Kernapparates eukaryotischer Zellen sind das Vorhandensein eines komplexen Oberflächenapparates des Kerns, eine im Vergleich zu prokaryotischen Zellen deutlich größere DNA-Konzentration in den Chromosomen und schließlich eine Art DNA-Verpackung Die Analyse des Kernapparates niederer Eukaryoten unter Verwendung der Hauptproteine ​​- Histone - ermöglichte es, unter ihnen Zellen zu identifizieren, die in Bezug auf die Kernstruktur eine Zwischenstellung zwischen pro- und eukaryotischen Zellen einnehmen. Gepanzerte Flagellaten haben einen typischen Oberflächenapparat des Kerns, aber ihre Chromosomen werden wie im Fall von Prokaryoten von ringförmigen DNA-Molekülen gebildet, die ohne Beteiligung von Histonen, die für alle Eukaryoten charakteristisch sind, zu kompakten Strukturen organisiert sind

Kürzlich hat sich im Zusammenhang mit der Entdeckung grundlegender Merkmale in der Organisation des Genoms von pro- und eukaryotischen Zellen der Vergleich der Prozesse der Transkription und Reifung von RNA in diesen Organismen sowie in Mesokaryoten und Zellen niederer Eukaryoten ergeben Als Ergebnis solcher Vergleiche können unsere traditionellen Vorstellungen über Verwandtschaftsbeziehungen in den Hauptgruppen von Organismen und insbesondere die Beziehung zwischen pro- und eukaryotischen Zellen erheblich verändert worden sein.

Das zweite Beispiel für die traditionelle Anwendung des evolutionären Ansatzes bei zytologischen Problemen können Versuche sein, eine Hypothese über die Komplikation der Mechanismen der gleichmäßig erblichen Verteilung von Chromosomen zwischen Tochterzellen im Evolutionsprozess vorzuschlagen, die auf der Grundlage eines Vergleichs entwickelt wurde Analyse zahlreicher Varianten der Chromosomendivergenz bei Protozoen und niederen Pflanzen. In diesen Fällen nehmen Kernhüllenmembranen eine aktive Rolle in den Prozessen der Chromosomensegregation ein, was es ermöglicht, eine gewisse Homologie mit prokaryotischen Zellen durchzuführen, in denen die Zellmembran eine führende Rolle bei der gleichmäßigen Verteilung von Schwesterchromosomen zwischen Tochter spielt Zellen.

Schließlich kann die weithin akzeptierte symbiotische Hypothese des Ursprungs von Mitochondrien und Chloroplasten als drittes Beispiel für die traditionelle evolutionäre Herangehensweise an allgemeine zytologische Probleme dienen. Ihr Kern liegt in der Annahme, dass diese wichtigen Organellen des Energiestoffwechsels aus prokaryotischen Organismen hervorgegangen sind, die in einem relativ frühen Stadium der eukaryotischen Evolution in eukaryotische Zellen eingedrungen sind.

Trotz der Bedeutung dieser Art von allgemeinen biologischen Konstruktionen für die Entwicklung der allgemeinen Zytologie ist die traditionelle historische Herangehensweise an die Entwicklung allgemeiner zytologischer Probleme heute noch von ziemlich begrenztem Nutzen. Einer der Hauptgründe für diese Situation ist das Vorhandensein spezifischer und noch unzureichend untersuchter Merkmale des Evolutionsprozesses auf zellulärer und subzellulärer Organisationsebene, was es äußerst schwierig macht, die Beziehung zwischen einzelnen Gruppen einzelliger Organismen und folglich zu bestimmen , die Konstruktion vernünftiger evolutionärer Nyh-Hypothesen auf dem Gebiet der allgemeinen Zytologie.

Derzeit ist ein anderer Aspekt der Anwendung der vergleichenden zytologischen Methode weiter verbreitet, der nicht das Ziel verfolgt, die historische Bedingtheit einer bestimmten zellulären Struktur oder eines bestimmten Prozesses direkt zu klären. In der modernen allgemeinen Zytologie hat dieser Aspekt der Anwendung der vergleichenden Methode mehrere Modifikationen erfahren.

In der ersten Phase, bei der Einführung grundlegend neuer morphobiochemischer Methoden in die Praxis der zytologischen Analytik, wurde die Wahl des Untersuchungsgegenstandes durch folgende Überlegungen bestimmt. Zunächst kam es auf die Bequemlichkeit dieses oder jenes Objekts für die Anwendung der verwendeten Methode an. Zweitens spielte der Grad der Expression dieses Merkmals in der untersuchten Zelle eine wichtige Rolle. Um die allgemeinen Organisationsmuster eukaryotischer Zellen zu untersuchen, waren Leberzellen von Säugetieren mit ihrem harmonisch entwickelten System von Membranorganellen ein bevorzugtes Objekt.

Für komplexe zytologische und molekularbiologische Studien der Organisation prokaryotischer Zellen wurde Escherichia coli weithin verwendet; Die Modelle zur Untersuchung der Organisation niederer Eukaryoten waren Hefen und Schimmelpilze. Gleichzeitig stellte sich heraus, dass die an diesen Objekten festgestellten Gesetzmäßigkeiten von universeller Bedeutung sind, da sie in vielen Fällen in allen eukaryotischen oder allen prokaryotischen Zellen grundsätzlich ähnlich sind. Darüber hinaus erwiesen sich einige Muster der subzellulären Organisation, insbesondere auf molekularer und supramolekularer Ebene, als universell für Zellen sowohl pro- als auch eukaryotischer Typen (Organisation von Membranen, das Prinzip der Ribosomenstruktur usw.), obwohl dies der Fall war dass sich diese Zelltypen in mancher Hinsicht grundlegend voneinander unterscheiden. Aus diesem Umstand entstand die Idee, dass es möglich ist, die wichtigsten allgemeinen zytologischen Probleme an einer begrenzten Auswahl von Objekten zu entwickeln, die methodisch günstig sind, und die etablierten Muster dann aufgrund ihrer grundsätzlich ähnlichen Organisation auf andere Zellen auszudehnen.

In den letzten Jahren ist eine solche vereinfachte Anwendung des vergleichenden Ansatzes jedoch zunehmend kritisiert worden, da moderne zytologische Methoden in die speziellen biologischen Wissenschaften der Zelle - insbesondere Zytologie, Protozoologie, Botanik der niederen Pflanzen - eingeführt wurden. Die in diesen Bereichen der Wissenschaft angewandte morphobiochemische Analyse ermöglichte die Feststellung von Tatsachen, die die enorme Vielfalt der spezifischen Umsetzung der einen oder anderen Gemeinsamkeit der Zellorganisation bezeugen, die Vielfalt ist viel größer als aus den früher erhaltenen Ergebnissen am "Modell" hervorgeht „Objekte. Diese Vielfalt ist besonders groß auf den höchsten Subsystem- und systemischen Ebenen der Zellorganisation. Sie ist auch typisch für so komplexe und vielkomponentige Prozesse wie die Vorgänge des intrazellulären Stoffwechsels und Transports oder die erbliche Gleichverteilung von Erbgut bei der Zellteilung.

Die Verallgemeinerung eines großen vergleichenden zytologischen Materials, das auf der Ebene moderner methodischer Fähigkeiten erhalten wurde, zwang uns, die oben erwähnte vereinfachte Vorstellung von der Rolle der vergleichenden Methode aufzugeben. In dieser Hinsicht wird in der allgemeinen Zytologie (insbesondere in Bezug auf eukaryotische Zellen) die dominierende Stellung durch die Idee erlangt, dass eine vergleichende Methode zur Analyse einzelner Zellsysteme oder Prozesse verwendet werden muss, die in ihrer funktionellen Aktivität in allen ähnlich sind Vielfalt ihrer Manifestationen in spezifischen Zellen RES wird nicht von "typischen", "durchschnittlichen" Zellen verursacht, sondern im Gegenteil von Zellen, die stark vom durchschnittlichen Organisationstyp abweichen, Zellen, in denen bestimmte Zeichen hypertrophiert sind.

Die größte Zahl solcher "ausweichenden" Varianten findet sich unter den Zellen höherer vielzelliger Organismen, wo eine weitreichende Spezialisierung von Zellen als Teil einzelner Gewebesysteme entwickelt wird. Fälle von "Abweichungen" vom mittleren Typ sind auch unter den höheren Protozoen weit verbreitet, die eine Evolution durchlaufen haben, während sie die einzellige Organisationsebene beibehalten haben. Während der Untersuchung dieser Art von atypischen Zellen war es möglich, eine Vielzahl neuer interessanter Fakten aufzudecken, die unser Verständnis sowohl der allgemeinen Gesetze der zellulären Organisation als auch ihrer evolutionären Plastizität, die die beobachtete Vielfalt zellulärer Systeme bestimmt, erheblich vertiefen . Gleichzeitig ist, wie oben erwähnt, im Falle der Spezialwissenschaften die spezifische Manifestation gemeinsamer Merkmale, die für alle Zellen in verschiedenen Objekten charakteristisch sind, von größtem Interesse.

Im Gegensatz zu den Spezialwissenschaften stellt sich diese Frage bei einem allgemeinen zytologischen Ansatz auf einer etwas anderen Ebene, weil der Forscher herausfinden möchte, wie weit die spezifischen Ausprägungen dieses Merkmals in verschiedenen Zellen sind, welche Kombination allgemeiner Mechanismen und was genau daran liegt es. So gelang es Protozoologen beispielsweise, eine sehr interessante Dynamik der Makronukleusbildung nach der Konjugation in gastrociliären Ciliaten zu entdecken. Im entstehenden Makronukleus kommt es zu einer signifikanten Zunahme der DNA-Menge und dann zu einer starken Abnahme des Erbmaterials (bis zu 93%). Ein solcher Prozess der Erbgutreduktion findet auch in den somatischen Zellen einer Reihe von Gruppen vielzelliger Tiere (einige Insekten, Nematoden) statt. Die verbleibende DNA, die zwar in ihrer Gesamtmenge klein ist, aber alle Informationen enthält, die für das Funktionieren des Makronukleus notwendig sind, wird viele Male repliziert. Dadurch entsteht ein definitiver Makronukleus, der sich vom Mikronukleus nicht nur in der DNA-Menge, sondern auch in seiner qualitativen Zusammensetzung unterscheidet. Die überwiegende Mehrheit der nicht funktionierenden Gene fehlt hier, während funktionierende Loci durch eine beträchtliche Anzahl von Kopien repräsentiert werden.

Diese Tatsachen sind gerade deshalb von großem allgemeinen zytologischen Interesse, weil die hier beobachteten Phänomene in der Regel nicht nur paradoxe Zeichen sind, die nur für höhere Einzeller charakteristisch sind. Die Prozesse der Polytenisierung, der selektiven Replikation einzelner Abschnitte der chromosomalen DNA und schließlich der selektiven Reduktion wesentlicher Abschnitte des Genoms - all diese Phänomene finden auch in spezialisierten Zellen vielzelliger Organismen statt. Sie werden wahrscheinlich aufgrund gemeinsamer elementarer Mechanismen durchgeführt. Und die Spezifität des komplexen Prozesses der Veränderungen im Kernapparat während der Bildung des Makronukleus in gastrociliierten Ciliaten ist hauptsächlich auf eine besondere Kombination allgemeiner, universeller elementarer Mechanismen für eukaryotische Zellen zurückzuführen. Ideen dieser Art sind heute in der allgemeinen Zytologie weit verbreitet. Sie sind äußerst anregende gerichtete vergleichende zytologische Studien, die der Aufklärung wichtiger allgemeiner zytologischer Probleme gewidmet sind. Material von der Website

Ein Beispiel für eine gezielte vergleichende zytologische Untersuchung kann die Untersuchung des Mechanismus der gleichmäßig erblichen Verteilung von Chromosomen während der Mitose in Eukaryoten sein, indem die Mitose verschiedener Arten von Diatomeen analysiert wird: An diesen Objekten wird im Gegensatz zu typischen Mitosen von Vielzellerzellen, es Es ist möglich, komplexe Veränderungen in Mikrotubuli-Organisationszentren, die Bildung und gegenseitige Divergenz von mikrotubulären Halbspindeln, die Divergenz von Chromosomen zu den Zellpolen mit Hilfe der Bildung einer besonderen Struktur in der Metaphase - eines Kragens - morphologisch eindeutig zu verfolgen.

Angesichts neuerer Daten zur führenden Rolle des mechanochemischen Tubulin-Dynein-Systems bei der Anaphase-Bewegung von Chromosomen in Metazoenzellen ist es sehr wahrscheinlich, dass dieses System auch in Diatomeen vorhanden ist, d.h. auch hier gibt es nur eine Besonderheit Kombination elementarer Mechanismen, die allen Zellen gemeinsam sind und mechanochemische Prozesse während der Mitose verursachen.

Offensichtlich wäre es für die Analyse dieser Mechanismen, deren Aufklärung eines der dringendsten Probleme der allgemeinen Zytologie ist, vielversprechend, ein solches Objekt zu haben, an dem sie klar differenziert und morphologisch zum Ausdruck kommen.

Die Zahl solcher Beispiele wächst ständig. Dies liegt zum einen an der immer weiter fortschreitenden Einführung komplexer moderner Methoden in die Praxis insbesondere zytologischer, protozoologischer und botanischer Studien, zum anderen an der zunehmenden Häufung von Tatsachen in den vergleichenden zytologischen Studien selbst wichtig für die allgemeine Zytologie und stehen im Zentrum ihrer Aufmerksamkeit. Und all dies führt wiederum dazu, dass die vergleichende zytologische Analyse einen außerordentlich wichtigen Platz in der Zytologie einnimmt.

Eine kurze Beschreibung der Hauptrichtungen und Aspekte der modernen allgemeinen zytologischen Forschung zeigt, dass auf dieser Stufe der Entwicklung der Zytologie sowohl eine ziemlich klare Unterscheidung zwischen einzelnen Bereichen als auch deren Synthese besteht. Es gibt eine Unterscheidung sowohl in methodologischer Hinsicht als auch in Bezug auf die Logik der Lösung spezifischer Probleme, die in den einzelnen Richtungen und Ansätzen festgelegt sind. Im morphofunktionellen Aspekt zytologischer Studien dominiert ein diskreter Ansatz zur Analyse zellulärer Strukturen. Eines der wichtigsten Merkmale des experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Muster zellulärer Organisation ist sein Fokus auf die Analyse der allgemeinen integrierenden Mechanismen der Organisation zellulärer Systeme und der gesamten Zelle. Gleichzeitig ist, wie bereits oben betont, die Lösung der Probleme solcher Studien ohne den weit verbreiteten Einsatz von Methoden, die dem morphofunktionalen Ansatz innewohnen, unmöglich. Die experimentelle Analyse liefert eine phänomenologische Charakterisierung der Eigenschaften bestimmter zellulärer Mechanismen und intrazellulärer Prozesse und schafft damit die notwendige Grundlage für die Anwendung eines reichen Arsenals struktureller und biochemischer Methoden.

Somit sind im gegenwärtigen Entwicklungsstadium der allgemeinen Zytologie Voraussetzungen für eine sehr enge Verknüpfung dieser beiden Aspekte zytologischer Studien gegeben. Dies ist naheliegend, da beide Ansätze letztlich das gleiche Ziel verfolgen – die funktionelle Organisation zellulärer Strukturen und die Regulationsmechanismen von Prozessen in einem integralen zellulären System aufzuklären.

Der vergleichende zytologische Ansatz zur Analyse allgemeinzytologischer Probleme nimmt in der modernen allgemeinen Zytologie eine Sonderstellung ein. Die vergleichende zytologische Analyse wird auf der Grundlage von Daten durchgeführt, die auf der Grundlage morphofunktioneller und experimenteller Ansätze gewonnen wurden, d. H. Methodisch sind alle Hauptaspekte zytologischer Studien eng miteinander verbunden.

Das Spezifische des vergleichenden zytologischen Ansatzes, das Spezifische, das seine besondere Stellung bestimmt, ist die gezielte Verwendung verschiedener Objekte der Tierwelt, um die allgemeinen Organisationsmuster einzelner Zellstrukturen, intrazelluläre Prozesse und Integrationsmechanismen in der ganzen Vielfalt ihrer Erscheinungsformen zu untersuchen verschiedene Zelltypen.

Wie aus dem Obigen ersichtlich ist, bestimmen die Hauptrichtungen der zytologischen Forschung weitgehend die Besonderheiten des aktuellen Stadiums in der Entwicklung der allgemeinen Zytologie und bestimmen ihre enge Beziehung zu verwandten biologischen Wissenschaften. Eines der charakteristischsten Merkmale dieser Stufe ist die enge Verknüpfung aller wichtigsten Bereiche der zytologischen Forschung im methodischen Sinne. Zudem sprengt eine solche methodische Integration oft den Rahmen der allgemeinen Zytologie.

In der zytologischen Arbeit sind rein biochemische und molekularbiologische Methoden weit verbreitet, und umgekehrt sind in biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen zytologische morphologische Methoden weit verbreitet. Die methodische Integration verwandter Wissenschaften und die Einheit ihrer übergeordneten Ziele führten zur Herausbildung einer neuen synthetischen Wissenschaft der Zelle – der Zellbiologie. Es verbindet Zytologie, Strukturbiochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik und private biologische Wissenschaften über die zelluläre Organisationsebene. Eine solche Vereinigung verwandter Wissenschaften ist zweifellos ein fortschrittliches Phänomen. Trotz einer solchen Synthese behält jedoch jede der Wissenschaften sowohl ihre methodologischen Besonderheiten als auch ihre Besonderheiten in der Formulierung und den Methoden zur Entwicklung von Problemen der Zellorganisation bei. Derzeit gehört die dominierende Stellung in dieser synthetischen Wissenschaft der Forschung auf molekularbiologischem und molekulargenetischem Gebiet. Diese Situation ist auf den schnellen Fortschritt unseres Wissens über die unteren Ebenen der Zellorganisation zurückzuführen, aber es ist nur ein vorübergehendes Phänomen.

Tatsächlich sollte der führende Platz in der neuen synthetischen Wissenschaft der Zelle von der allgemeinen Zytologie eingenommen werden - der Wissenschaft von den allgemeinen Mustern der zellulären Ebene der Organisation lebender Materie. Von den modernen biologischen Wissenschaften, die sich mit dieser Ebene der Organisation lebender Materie befassen, ist die allgemeine Zytologie, die den gezielten vergleichenden zytologischen Ansatz auf der Grundlage strukturbiochemischer Methoden erweitert, am besten auf eine tiefe allgemeine biologische Verallgemeinerung einer großen Menge an Tatsachenmaterial bei diskreter Analyse vorbereitet individuelle -ny Zellstrukturen in zahlreichen Zellarten. Die allgemeine Zytologie sollte bei der Analyse allgemeiner zellulärer Integrationsmechanismen eine führende Position einnehmen. Eine wichtige Voraussetzung dafür ist die schnelle Entwicklung neuer experimenteller Modelle. Ihre gründliche Analyse mit modernen Methoden und die breite Einführung experimenteller Modelle in gezielte vergleichende zytologische Studien sollen Fortschritte bei der Lösung eines der Hauptprobleme der Zellorganisation - dem Problem der Zellintegration - sicherstellen.

Mit der Anhäufung von Faktenmaterial über die elementaren universellen Mechanismen der Zellintegration und die Tragweite ihrer Modifikationen steht die allgemeine Zytologie vor der Aufgabe, eine tiefgreifende Analyse der historischen Bedingtheit der Organisation bestimmter Zellsysteme und der Zellorganisation durchzuführen als Ganzes sowie die Besonderheiten des Evolutionsprozesses auf der zellulären und subzellulären Ebene der Organisation lebender Materie. Die Lösung dieses Problems wird erleichtert durch die sich jetzt in allgemeinen zytologischen Untersuchungen deutlich abzeichnende Tendenz, die diskrete Analyse einzelner Bestandteile einer Zelle mit der Untersuchung ihrer kg zu verbinden. zu einem kompletten System.

Auf dieser Seite Material zu den Themen:

Planen:

1. Was untersucht die Zytologie?

2. Die Idee, dass Organismen aus Zellen bestehen.

3. Forschungsmethoden in der Zytologie.

4. Fraktionierung von Zellen.

5. Radioautographie.

6. Bestimmung der Dauer einiger Stadien des Zellzyklus durch Autoradiographie.

Zytologie ist die Wissenschaft von der Zelle. Sie hob sich vor fast 100 Jahren vom Umfeld anderer biologischer Wissenschaften ab. Verallgemeinerte Informationen über den Aufbau von Zellen wurden erstmals in dem Buch von J.-B. Carnoys The Biology of the Cell, veröffentlicht 1884. Die moderne Zytologie untersucht die Struktur von Zellen, ihre Funktion als elementare lebende Systeme: Die Funktionen einzelner Zellbestandteile, die Prozesse der Zellreproduktion, ihre Reparatur, Anpassung an Umweltbedingungen und viele andere Prozesse werden untersucht, die es ermöglichen, die zu beurteilen Eigenschaften und Funktionen, die allen Zellen gemeinsam sind. Die Zytologie berücksichtigt auch die strukturellen Merkmale spezialisierter Zellen. Mit anderen Worten, moderne Zytologie ist Zellphysiologie. Die Zytologie ist eng verbunden mit den wissenschaftlichen und methodischen Errungenschaften der Biochemie, Biophysik, Molekularbiologie und Genetik. Dies diente als Grundlage für eine vertiefte Untersuchung der Zelle bereits aus der Sicht dieser Wissenschaften und der Entstehung einer bestimmten synthetischen Wissenschaft der Zelle – der Zellbiologie oder Zellbiologie. Gegenwärtig fallen die Begriffe Zytologie und Zellbiologie zusammen, da ihr Untersuchungsgegenstand die Zelle mit ihren eigenen Organisations- und Funktionsmustern ist. Die Disziplin „Zellbiologie“ bezieht sich auf die grundlegenden Bereiche der Biologie, denn sie erforscht und beschreibt die einzige Einheit allen Lebens auf der Erde – die Zelle.

Ein langes und eingehendes Studium der Zelle als solcher führte zur Formulierung einer wichtigen theoretischen Verallgemeinerung von allgemeiner biologischer Bedeutung, nämlich der Entstehung der Zelltheorie. Im 17. Jahrhundert Robert Hooke, ein Physiker und Biologe von großem Einfallsreichtum, erschuf das Mikroskop. Hooke untersuchte einen dünnen Korkabschnitt unter seinem Mikroskop und stellte fest, dass er aus winzigen leeren Zellen bestand, die durch dünne Wände getrennt waren, die, wie wir heute wissen, aus Zellulose bestehen. Er nannte diese kleinen Zellen Zellen. Später, als andere Biologen damit begannen, Pflanzengewebe unter dem Mikroskop zu untersuchen, stellte sich heraus, dass die kleinen Zellen, die Hooke in einem toten getrockneten Kork fand, auch in lebenden Pflanzengeweben zu finden sind, aber sie sind nicht leer, sondern enthalten jeweils einen kleinen gallertartigen Körper . Nach mikroskopischer Untersuchung der tierischen Gewebe stellte sich heraus, dass sie ebenfalls aus kleinen gallertartigen Körpern bestehen, diese Körper aber nur selten durch Wände voneinander getrennt sind. Als Ergebnis all dieser Studien formulierten Schleiden und Schwann 1939 unabhängig voneinander die Zelltheorie, die besagt, dass Zellen die elementaren Einheiten sind, aus denen alle Pflanzen und alle Tiere letztendlich aufgebaut sind. Lange Zeit sorgte die Doppelbedeutung des Wortes Zelle noch für einige Missverständnisse, doch dann war sie fest in diesen kleinen gallertartigen Körpern verankert.

Das moderne Verständnis der Zelle ist eng mit technischen Fortschritten und Verbesserungen der Forschungsmethoden verbunden. Neben der konventionellen Lichtmikroskopie, die ihre Rolle nicht verloren hat, haben in den letzten Jahrzehnten die Polarisations-, Ultraviolett-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie große Bedeutung erlangt. Unter ihnen nimmt die Elektronenmikroskopie einen besonderen Platz ein, deren Auflösung es ermöglichte, die submikroskopische und molekulare Struktur der Zelle zu durchdringen und zu untersuchen. Moderne Forschungsmethoden haben es ermöglicht, ein detailliertes Bild der zellulären Organisation aufzuzeigen.

Jede Zelle besteht aus einem Kern und einem Zytoplasma, die durch Membranen voneinander und von der äußeren Umgebung getrennt sind. Die Bestandteile des Zytoplasmas sind: Membran, Hyaloplasma, endoplasmatisches Retikulum und Ribosomen, Golgi-Apparat, Lysosomen, Mitochondrien, Einschlüsse, Zellzentrum, spezialisierte Organellen.

Ein Teil eines Organismus, der eine bestimmte Funktion erfüllt, wird als Organ bezeichnet. Jedes Organ - zum Beispiel Lunge, Leber, Niere - hat seine eigene spezielle Struktur, dank der es eine bestimmte Rolle im Körper spielt. Ebenso gibt es im Zytoplasma spezielle Strukturen, deren besondere Struktur es ihnen ermöglicht, bestimmte Funktionen auszuführen, die für den Zellstoffwechsel notwendig sind; diese Strukturen werden Organellen ("kleine Organe") genannt.

Die Aufklärung der Natur, Funktion und Verteilung zytoplasmatischer Organellen wurde erst nach der Entwicklung von Methoden der modernen Zellbiologie möglich. Die nützlichsten in dieser Hinsicht waren: 1) Elektronenmikroskopie; 2) Zellfraktionierung, mit deren Hilfe Biochemiker relativ reine Zellfraktionen mit bestimmten Organellen isolieren und so einzelne für sie interessante Stoffwechselreaktionen untersuchen können; 3) Autoradiographie, die die direkte Untersuchung einzelner Stoffwechselreaktionen in Organellen ermöglichte.

Die Methode, mit der Organellen aus Zellen isoliert werden, nennt man Fraktionierung. Diese Methode erwies sich als sehr fruchtbar und gab Biochemikern die Möglichkeit, verschiedene Zellorganellen in relativ reiner Form zu isolieren. Es ermöglicht auch, die chemische Zusammensetzung von Organellen und den darin enthaltenen Enzymen zu bestimmen und anhand der gewonnenen Daten Rückschlüsse auf ihre Funktionen in der Zelle zu ziehen. Als erster Schritt werden die Zellen durch Homogenisierung in einem geeigneten Medium zerstört, das die Organellen bewahrt und ihre Aggregation verhindert. Sehr oft wird dafür eine Saccharoselösung verwendet. Obwohl die Mitochondrien und viele andere Zellorganellen intakt bleiben, zerfallen Membranknäuel wie das endoplasmatische Retikulum und die Plasmamembran in Fragmente. Die resultierenden Membranfragmente schließen sich jedoch häufig selbst, was zu abgerundeten Blasen unterschiedlicher Größe führt.

Im nächsten Schritt wird das Zellhomogenat einer Reihe von Zentrifugationen unterzogen, deren Geschwindigkeit und Dauer jedes Mal zunimmt; Dieser Vorgang wird als differentielle Zentrifugation bezeichnet. Je nach Größe, Dichte und Form der Organellen werden bei unterschiedlichen Zentrifugationsgeschwindigkeiten unterschiedliche Zellorganellen am Boden von Zentrifugenröhrchen abgelagert. Der resultierende Niederschlag kann entnommen und untersucht werden. Größere, dichtere Strukturen wie Zellkerne präzipitieren am schnellsten, während kleinere, weniger dichte Strukturen wie Vesikel des endoplasmatischen Retikulums höhere Raten und längere Zeiten erfordern. Daher werden bei niedrigen Zentrifugationsgeschwindigkeiten Zellkerne ausgefällt, während andere Zellorganellen in Suspension bleiben. Bei höheren Geschwindigkeiten werden Mitochondrien und Lysosomen ausgefällt, und bei langer Zentrifugation und sehr hohen Geschwindigkeiten werden sogar kleine Partikel wie Ribosomen ausgefällt. Niederschläge können unter Verwendung eines Elektronenmikroskops untersucht werden, um die Reinheit der resultierenden Fraktionen zu bestimmen. Alle Fraktionen sind teilweise mit anderen Organellen kontaminiert. Gelingt es dennoch, eine ausreichende Reinheit der Fraktionen zu erreichen, werden diese anschließend einer biochemischen Analyse unterzogen, um die chemische Zusammensetzung und enzymatische Aktivität der isolierten Organellen zu bestimmen.

Für den Fortschritt der Histologie, Zytologie und Embryologie ist die Einführung der Errungenschaften der Physik und Chemie, neuer Methoden verwandter Wissenschaften - Biochemie, Molekularbiologie, Gentechnik - von großer Bedeutung.

Moderne Forschungsmethoden ermöglichen es, Gewebe nicht nur als Ganzes zu untersuchen, sondern auch einzelne Zelltypen daraus zu isolieren, ihre Vitalaktivität über lange Zeit zu studieren, einzelne Zellorganellen und ihre Makromoleküle (z. B. DNA) zu isolieren und ihre funktionellen Eigenschaften zu studieren.

Solche Möglichkeiten haben sich im Zusammenhang mit der Schaffung neuer Instrumente und Technologien eröffnet - verschiedene Arten von Mikroskopen, Computertechnologie, Röntgenbeugungsanalyse, die Verwendung von Kernspinresonanz (NMR), radioaktive Isotope und Autoradiographie, Elektrophorese und Chromatographie, Fraktionierung von Zellinhalten durch Ultrazentrifugation, Trennung und Kultivierung von Zellen, Gewinnung von Hybriden; die Verwendung biotechnologischer Methoden - Gewinnung von Hybridomen und monoklonalen Antikörpern, rekombinanter DNA usw.

Somit können biologische Objekte auf Gewebe-, Zell-, Subzellular- und Molekularebene untersucht werden. Trotz der Einführung verschiedener biochemischer, biophysikalischer, physikalischer und technologischer Methoden in die Naturwissenschaften, die zur Lösung vieler Fragen im Zusammenhang mit der lebenswichtigen Aktivität von Zellen und Geweben erforderlich sind, bleibt die Histologie im Wesentlichen eine morphologische Wissenschaft mit eigenen Methoden. Letztere ermöglichen es, die in Zellen und Geweben ablaufenden Prozesse, ihre strukturellen Merkmale zu charakterisieren.

Die Hauptschritte der zytologischen und histologischen Analyse sind die Auswahl des Untersuchungsobjekts, seine Vorbereitung für die Untersuchung unter dem Mikroskop, die Verwendung mikroskopischer Methoden sowie die qualitative und quantitative Analyse von Bildern.

Die Untersuchungsobjekte sind lebende und fixierte Zellen und Gewebe, deren Bilder in Licht- und Elektronenmikroskopen oder auf einem Fernsehbildschirm erhalten werden. Es gibt eine Reihe von Methoden, die die Analyse dieser Objekte ermöglichen.

Methoden der Mikroskopie histologischer Präparate

Die Hauptmethoden zur Untersuchung biologischer Mikroobjekte sind Licht- und Elektronenmikroskopie, die in der experimentellen und klinischen Praxis weit verbreitet sind.

Mikroskopie ist die Hauptmethode zur Untersuchung von Mikroobjekten, die seit über 300 Jahren in der Biologie verwendet wird. Seit der Entwicklung und Verwendung der ersten Mikroskope wurden sie ständig verbessert. Moderne Mikroskope sind eine Vielzahl komplexer optischer Systeme mit hoher Auflösung. Die Größe der kleinsten mikroskopisch erkennbaren Struktur wird durch den kleinsten auflösbaren Abstand (d o ) bestimmt, der hauptsächlich von der Wellenlänge des Lichts abhängt. (\) und Wellenlängen elektromagnetischer Schwingungen des Elektronenflusses usw. Diese Abhängigkeit wird näherungsweise durch die Formel d 0 = bestimmt 1 / 2 \. Je kleiner also die Wellenlänge, desto kleiner die auflösbare Distanz und desto kleiner die im Präparat sichtbaren Mikrostrukturen. Zur Untersuchung histologischer Präparate werden verschiedene Arten von Lichtmikroskopen und Elektronenmikroskopen verwendet.

Reis. 1. Mikroskope für die biologische Forschung.

A - Lichtbiologisches Mikroskop "Biolam-S": 1 - Basis; 2 - Rohrhalter; 3 - geneigtes Rohr; 4 - Okular, 5 - Revolver; 6 - Linsen; 7 - Tisch; 8 - Kondensator mit Irisblende; 9 - Kondensatorschraube; 10 - Spiegel; 11 - Mikrometerschraube; 12 - makrometrische Schraube. B - Elektronenmikroskop EMV-100AK mit einem automatisierten Bildverarbeitungssystem: 1 - Mikroskopsäule (mit einem elektronenoptischen System und einer Kamera für Proben); 2 - Bedienfeld; 3 - Kamera mit Leuchtschirm; 4 - Bildanalyseblock; 5 - Videosignalsensor.

Lichtmikroskop. Zur Untersuchung histologischer Mikroobjekte werden gewöhnliche Lichtmikroskope und deren Varianten verwendet, die Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen verwenden. Bei herkömmlichen Lichtmikroskopen ist die Beleuchtungsquelle natürliches oder künstliches Licht (Abb. 1, A). Die minimale Wellenlänge des sichtbaren Teils des Spektrums beträgt etwa 0,4 µm. Daher für ein herkömmliches Lichtmikroskop das kleinste der Auflösungsabstand beträgt ca. 0,2 µm ( tun = "/, - 0,4 μm = 0,2 μm), und die Gesamtvergrößerung (das Produkt aus Linsenvergrößerung und Okularvergrößerung) kann 1500–2500 betragen.

So kann man im Lichtmikroskop nicht nur einzelne Zellen mit einer Größe von 4 bis 150 Mikrometern sehen, sondern auch ihre intrazellulären Strukturen - Organellen, Einschlüsse. Um den Kontrast von Mikroobjekten zu erhöhen, wird ihre Färbung verwendet.

UV-Mikroskopie. Dies ist eine Art Lichtmikroskopie. Das UV-Mikroskop verwendet kürzere UV-Strahlen mit einer Wellenlänge von etwa 0,2 µm. Der aufgelöste Abstand ist hier 2-mal geringer als bei herkömmlichen Lichtmikroskopen und beträgt ungefähr 0,1 μm (d 0 = V 2 – 0,2 μm = 0,1 μm). Das in ultravioletten Strahlen erhaltene, für das Auge unsichtbare Bild wird durch Registrierung auf einer fotografischen Platte oder durch Verwendung spezieller Geräte (Leuchtschirm, elektronenoptischer Konverter) in ein sichtbares umgewandelt.

Fluoreszenz- (Lumineszenz-) Mikroskopie. Das Phänomen der Fluoreszenz besteht darin, dass die Atome und Moleküle einer Reihe von Substanzen, die kurzwellige Strahlen absorbieren, in einen angeregten Zustand übergehen. Der umgekehrte Übergang vom angeregten Zustand in den Normalzustand erfolgt unter Emission von Licht, jedoch mit größerer Wellenlänge. In einem Fluoreszenzmikroskop werden Quecksilber- oder Ultrahochdruck-Xenonlampen als Lichtquellen zur Anregung der Fluoreszenz verwendet, die eine hohe Helligkeit im Spektralbereich von 0,25–0,4 μm (nahe ultraviolette Strahlen) und 0,4–0,5 μm (blau-violette Strahlen) aufweisen ). Die Wellenlänge der Fluoreszenzlichtwelle ist immer größer als die Wellenlänge des anregenden Lichts, daher werden sie mit Lichtfiltern getrennt und das Bild des Objekts nur im Fluoreszenzlicht untersucht. Unterscheiden Sie zwischen eigener oder primärer und induzierter oder sekundärer Fluoreszenz. Jede Zelle eines lebenden Organismus hat ihre eigene Fluoreszenz, aber sie ist oft extrem schwach.

Serotonin, Catecholamine (Adrenalin, Norepinephrin), die in Nerven-, Mast- und anderen Zellen enthalten sind, fluoreszieren nach Gewebefixierung in Formaldehyddampf bei 60–80 °C (Falk-Methode).

Sekundärfluoreszenz tritt auf, wenn Präparate mit speziellen Farbstoffen - Fluorochrome - behandelt werden.

Es gibt verschiedene Fluorochrome, die spezifisch an bestimmte Makromoleküle binden (Acridinorange, Rhodamin, Fluorescein etc.). Beispielsweise wird bei der Verarbeitung von Präparaten am häufigsten Fluorochrom Acridinorange verwendet. In diesem Fall sind DNA und ihre Verbindungen in Zellen hellgrün und RNS und seine Derivate - ein hellrotes Leuchten. Somit enthält die spektrale Zusammensetzung der Strahlung Informationen über die innere Struktur des Objekts und seine chemische Zusammensetzung. Als Methode wird eine Variante der Methode der Fluoreszenzmikroskopie bezeichnet, bei der sowohl die Anregung als auch die Emission der Fluoreszenz im ultravioletten Bereich des Spektrums erfolgt UV-Fluoreszenzmikroskopie.

Phasenkontrastmikroskopie. Diese Methode wird verwendet, um kontrastreiche Bilder von transparenten und farblosen lebenden Objekten zu erhalten, die mit herkömmlichen Mikroskopiemethoden nicht sichtbar sind. Wie bereits erwähnt, wird bei einem herkömmlichen Lichtmikroskop der notwendige Kontrast von Strukturen durch Färbung erreicht. Das Phasenkontrastverfahren liefert den Kontrast der untersuchten ungefärbten Strukturen durch eine spezielle Ringblende im Kondensor und die sogenannte Phasenplatte im Objektiv. Diese Konstruktion der Mikroskopoptik ermöglicht es, die vom Auge nicht wahrnehmbaren Phasenänderungen des durch das ungefärbte Präparat tretenden Lichts in eine Amplitudenänderung umzuwandeln, d.h. Helligkeit des resultierenden Bildes. Wenn Sie den Kontrast erhöhen, können Sie alle Strukturen sehen, die sich im Brechungsindex unterscheiden. Eine Variation des Phasenkontrastverfahrens ist das Verfahren Phasen-Dunkelfeld-Kontrast, wodurch ein Negativ-gegen-Positiv-Phasenkontrastbild erhalten wird.

Dunkelfeldmikroskopie. Bei einem Dunkelfeldmikroskop gelangt nur das Licht, das die Strukturen im Präparat beugt, zum Objektiv. Dies geschieht durch das Vorhandensein eines speziellen Kondensors im Mikroskop, der das Präparat mit streng schrägem Licht beleuchtet; Strahlen von der Beleuchtung werden von der Seite gerichtet. Dadurch sieht das Feld dunkel aus und die kleinen Partikel im Präparat reflektieren das Licht, das dann in die Linse eintritt. Die Auflösung dieses Mikroskops kann nicht besser sein als die eines Hellfeldmikroskops, da die gleiche Wellenlänge verwendet wird. Aber hier gibt es mehr Kontrast. Es wird verwendet, um lebende Objekte zu untersuchen, autoradiographische Objekte wie Silberkörner, die in einem dunklen Feld hell erscheinen. In der Klinik wird es zur Untersuchung von Kristallen im Urin (Harnsäure, Oxalate), zum Nachweis von Spirochäten, insbesondere von Treponema pallidum, das Syphilis verursacht, usw. verwendet.

Interferenzmikroskopie. Varianten des Phasenkontrastmikroskops sind das Interferenzmikroskop, das zur Quantifizierung der Gewebemasse entwickelt wurde, und das Differentialinterferenzmikroskop (mit Nomarsky-Optik), das speziell zur Untersuchung der Oberflächentopographie von Zellen und anderen biologischen Objekten verwendet wird.

In einem Interferenzmikroskop wird der Lichtstrahl von der Beleuchtung in zwei Ströme aufgeteilt: Einer geht durch das Objekt und ändert die Phase der Schwingung, der zweite geht am Objekt vorbei. In den Prismen des Objektivs werden beide Strahlen verbunden und interferieren miteinander. Als Ergebnis wird ein Bild konstruiert, in dem sich Ausschnitte eines Mikroobjekts unterschiedlicher Dicke und Dichte im Kontrast unterscheiden. Bestimmen Sie nach Quantifizierung der Änderungen die Konzentration und Masse der Trockenmasse.

Phasenkontrast- und Interferenzmikroskope ermöglichen die Untersuchung lebender Zellen. Sie nutzen den Interferenzeffekt, der auftritt, wenn zwei Wellensätze kombiniert werden, um ein Bild von Mikrostrukturen zu erzeugen. Der Vorteil der Phasenkontrast-, Interferenz- und Dunkelfeldmikroskopie ist die Fähigkeit, Zellen bei der Bewegung und Mitose zu beobachten. In diesem Fall kann die Zellbewegung mithilfe von Zeitraffer-Mikrofilmen (Frame-by-Frame) aufgezeichnet werden.

polarisierende Mikroskopie. Ein Polarisationsmikroskop ist eine Modifikation eines Lichtmikroskops, bei dem zwei Polarisationsfilter installiert sind - der erste (Polarisator) zwischen dem Lichtstrahl und dem Objekt und der zweite (Analysator) zwischen der Objektivlinse und dem Auge. Licht passiert den ersten Filter nur in einer Richtung, der zweite Filter hat eine Hauptachse, die senkrecht zum ersten Filter ist, und lässt kein Licht durch. Dadurch entsteht ein Dunkelfeldeffekt. Beide Filter können gedreht werden, um die Richtung des Lichtstrahls zu ändern. Wenn der Analysator in Bezug auf den Polarisator um 90° gedreht wird, wird kein Licht durch sie hindurchtreten. Strukturen mit längsorientierten Molekülen (Kollagen, Mikrotubuli, Mikrofilamente) und kristalline Strukturen (in Leydig-Zellen 1) erscheinen als leuchtend, wenn sich die Rotationsachse ändert. Die Fähigkeit von Kristallen oder parakristallinen Formationen, eine Lichtwelle in eine gewöhnliche Welle und eine dazu senkrechte Welle aufzuspalten, wird als Doppelbrechung bezeichnet. Diese Fähigkeit besitzen die Fibrillen der quergestreiften Muskulatur.

Elektronenmikroskopie. Ein großer Fortschritt in der Entwicklung der Mikroskopietechnologie war die Schaffung und Verwendung eines Elektronenmikroskops (siehe Abb. 1, B). Das Elektronenmikroskop verwendet einen Elektronenstrom mit kürzeren Wellenlängen als das Lichtmikroskop. Bei einer Spannung von 50.000 V beträgt die Wellenlänge elektromagnetischer Schwingungen, die durch die Bewegung eines Elektronenstroms im Vakuum entstehen, 0,0056 nm. Es wird theoretisch berechnet, dass der auflösbare Abstand unter diesen Bedingungen etwa 0,002 nm oder 0,000002 um betragen kann, d. h. 100.000 Mal weniger; als in einem Lichtmikroskop. In der Praxis beträgt der auflösbare Abstand in modernen Elektronenmikroskopen etwa 0,1–0,7 nm.

Gegenwärtig werden T(Transmissionselektronenmikroskope) (TEM) und Rasterelektronenmikroskope (Raster)elektronenmikroskope (SEM) weit verbreitet verwendet. Mit Hilfe von TEM kann nur ein planares Bild des untersuchten Mikroobjekts erhalten werden. Um eine räumliche Darstellung der Strukturen zu erhalten, werden REMs verwendet, die ein dreidimensionales Bild erzeugen können. Ein Rasterelektronenmikroskop arbeitet nach dem Prinzip, ein Untersuchungsobjekt mit einer Elektronenmikrosonde abzutasten, d.h. es „tastet“ nacheinander einzelne Punkte der Oberfläche mit einem scharf fokussierten Elektronenstrahl ab. Um den ausgewählten Bereich zu untersuchen, bewegt sich die Mikrosonde unter der Wirkung von Ablenkspulen entlang ihrer Oberfläche (Prinzip der Fernsehabtastung). Eine solche Untersuchung eines Objekts wird als Scannen (Lesen) bezeichnet, und das Muster, entlang dem sich die Mikrosonde bewegt, wird als Raster bezeichnet. Das resultierende Bild wird auf einem Fernsehbildschirm angezeigt, dessen Elektronenstrahl sich synchron mit der Mikrosonde bewegt.

Die Hauptvorteile der Rasterelektronenmikroskopie sind eine große Schärfentiefe, ein großer Bereich kontinuierlicher Vergrößerungsänderungen (von zehn- bis zehntausendfach) und eine hohe Auflösung.

Gefrierelektronenmikroskopie- Abplatzen verwendet, um die Details der Struktur von Membranen und interzellulären Verbindungen zu untersuchen. Die Zellen werden bei einer niedrigen Temperatur (-160°C) eingefroren, um Chips herzustellen. Bei der Untersuchung der Membran verläuft die Spaltebene durch die Mitte der Lipiddoppelschicht. Außerdem werden Metalle (Platin, Palladium, Uran) auf den Innenflächen der erhaltenen Hälften der Membranen abgeschieden und mit TEM und Mikrofotografie untersucht.

Methode der Kryoelektronenmikroskopie. Eine schnell gefrorene dünne Schicht (ca. 100 nm) der Gewebeprobe wird auf ein mikroskopisches Gitter aufgebracht und unter einem Mikroskopvakuum bei -160°C untersucht.

Die Methode der Elektronenmikroskopie „Einfrieren- Radierung" verwendet, um die äußere Oberfläche von Zellmembranen zu untersuchen. Nach schnellem Einfrieren der Zellen bei sehr niedriger Temperatur wird der Block mit einer Messerklinge aufgespalten. Die entstehenden Eiskristalle werden durch Sublimation von Wasser im Vakuum entfernt. Dann werden Bereiche der Zellen durch Sputtern eines dünnen Films aus einem Schwermetall (z. B. Platin) schattiert. Die Methode ermöglicht es, die dreidimensionale Organisation von Strukturen sichtbar zu machen.

Somit ermöglichen es die Methoden des Gefrierspaltens und Gefrierätzens, nicht fixierte Zellen zu untersuchen, ohne dass sich in ihnen durch Fixierung induzierte Artefakte bilden.

Kontrastmethoden mit Schwermetallsalzen ermöglichen die Untersuchung einzelner Makromoleküle - DNA, großer Proteine ​​​​(z. B. Myosin) im Elektronenmikroskop. Bei negativer Kontrastierung werden Aggregate von Makromolekülen (Ribosomen, Viren) oder Proteinfilamente (Aktinfilamente) untersucht.

Elektronenmikroskopie von ultradünnen Schnitten, die durch Kryoultra-Mikrotomie erhalten wurden. Bei dieser Methode werden Gewebestücke ohne Fixierung und Eingießen in feste Medien in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -196 °C schnell abgekühlt. Dies sorgt für eine Hemmung der Stoffwechselprozesse von Zellen und des Übergangs von Wasser aus der flüssigen Phase in den Feststoff. Als nächstes werden die Blöcke auf einem Ultramikrotom bei niedriger Temperatur geschnitten. Diese Schnittmethode wird üblicherweise zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen sowie zur Durchführung immunchemischer Reaktionen verwendet. Zum Nachweis von Antigenen werden mit kolloidalen Goldpartikeln assoziierte Antikörper verwendet, deren Lokalisierung auf Präparaten leicht zu identifizieren ist.

Methoden der Ultrahochspannungsmikroskopie. Verwendet werden Elektronenmikroskope mit einer Beschleunigungsspannung von bis zu 3.000.000 V. Der Vorteil dieser Mikroskope besteht darin, dass sie die Untersuchung von Objekten mit großer Dicke (1–10 μm) ermöglichen, da sie bei hoher Elektronenenergie vom Objekt weniger absorbiert werden. Die stereoskopische Bildgebung ermöglicht es, Informationen über die dreidimensionale Organisation intrazellulärer Strukturen mit hoher Auflösung (ca. 0,5 nm) zu erhalten.

Röntgenbeugungsanalyse. Um die Struktur von Makromolekülen auf atomarer Ebene zu untersuchen, werden Methoden verwendet, bei denen Röntgenstrahlen mit einer Wellenlänge von etwa 0,1 nm (Wasserstoffatomdurchmesser) verwendet werden. Die Moleküle, die ein Kristallgitter bilden, werden anhand von Beugungsmustern untersucht, die in Form vieler Flecken unterschiedlicher Intensität auf einer Fotoplatte aufgezeichnet werden. Die Intensität der Flecken hängt von der Fähigkeit verschiedener Objekte in der Anordnung ab, Strahlung zu streuen. Die Position der Flecken im Beugungsmuster hängt von der Position des Objekts im System ab, und ihre Intensität zeigt seine innere atomare Struktur an.

Methoden zur Untersuchung fixierter Zellen und Gewebe

Untersuchung fixierter Zellen und Gewebe. Hauptgegenstand der Forschung sind histologische Präparate, aus festen Strukturen hergestellt. Das Medikament kann ein Abstrich (z. B. ein Abstrich von Blut, Knochenmark, Speichel, Liquor usw.), ein Abdruck (z. B. von Milz, Thymusdrüse, Leber), ein Gewebefilm (z. B. Binde- oder Bauchfell, Pleura, Pia mater), dünner Schnitt. Meistens wird ein Abschnitt eines Gewebes oder Organs für die Untersuchung verwendet. Histologische Präparate können ohne spezielle Aufbereitung untersucht werden. So kann beispielsweise ein angefertigter Blutausstrich, Abdruck, Film oder Schnitt eines Organs sofort unter dem Mikroskop betrachtet werden. Da die Strukturen aber einen „schwachen Kontrast“ haben, sind sie in einem herkömmlichen Lichtmikroskop schlecht zu erkennen und der Einsatz spezieller Mikroskope (Phasenkontrast etc.) ist erforderlich, weshalb häufiger auf speziell aufbereitete Präparate zurückgegriffen wird.

Der Prozess der Herstellung eines histologischen Präparats für die Licht- und Elektronenmikroskopie umfasst die folgenden Hauptschritte: 1) Entnahme und Fixierung des Materials, 2) Verdichten des Materials, 3) Anfertigen von Schnitten, 4) Färben oder Kontrastieren von Schnitten. Für die Lichtmikroskopie ist ein weiterer Schritt erforderlich - der Abschluss von Schnitten in einem Balsam oder anderen transparenten Medien (5). Fixierung sorgt für die Verhinderung von Zersetzungsprozessen, was hilft, die Integrität der Strukturen zu erhalten. Dies wird dadurch erreicht, dass eine kleine Organprobe entweder in ein Fixiermittel (Alkohol, Formalin, Lösungen von Schwermetallsalzen, Osminsäure, spezielle Fixiermittelmischungen) getaucht oder einer Wärmebehandlung unterzogen wird. Unter der Wirkung des Fixativs treten komplexe physikalisch-chemische Veränderungen in Geweben und Organen auf. Der bedeutendste von ihnen ist der Prozess der irreversiblen Koagulation von Proteinen, wodurch die Vitalaktivität aufhört und die Strukturen tot und fixiert werden. Die Fixierung führt zu einer Verdichtung und Volumenreduzierung der Stücke sowie zu einer Verbesserung der anschließenden Färbung von Zellen und Geweben.

Dichtungsstücke, notwendig für die Schnittpräparation, erfolgt durch Imprägnieren des zuvor dehydrierten Materials mit Paraffin, Celloidin, organischen Harzen. Eine schnellere Verdichtung wird durch die Methode des Einfrierens der Stücke erreicht, beispielsweise in flüssiger Kohlensäure.

Sektionsvorbereitung hergestellt auf speziellen Geräten - Mikrotome(für Lichtmikroskopie) und Ultramikrotome(für Elektronenmikroskopie).

Schnittfärbung(in der Lichtmikroskopie) bzw Besprühen mit Metallsalzen(in der Elektronenmikroskopie) wird verwendet, um den Bildkontrast einzelner Strukturen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop zu erhöhen. Methoden zur Färbung histologischer Strukturen sind sehr vielfältig und werden je nach Studienziel ausgewählt. Histologische Färbungen werden in sauer, basisch und neutral eingeteilt. Beispiele sind der bekannteste basische Farbstoff Azur II, der die Kerne lila färbt, und der Säurefarbstoff Eosin, der das Zytoplasma rosa-orange färbt. Die selektive Affinität von Strukturen zu bestimmten Farbstoffen beruht auf ihrer chemischen Zusammensetzung und ihren physikalischen Eigenschaften. Strukturen, die sich gut mit Säurefarbstoffen anfärben lassen, werden genannt oxyphil(acidophil, eosinophil) und basische Färbung - basophil. Strukturen, die sowohl saure als auch basische Farbstoffe annehmen, sind neutrophil(heterophil). Gefärbte Präparate werden üblicherweise in Alkoholen zunehmender Stärke dehydriert und in Xylol, Benzol, Toluol oder einigen Ölen geklärt. Zur Langzeitkonservierung wird ein dehydrierter histologischer Schnitt zwischen Objektträger und Deckglas in kanadischem Balsam oder anderen Substanzen eingeschlossen. Das fertige histologische Präparat kann viele Jahre für mikroskopische Untersuchungen verwendet werden. Für die Elektronenmikroskopie werden auf einem Ultramikrotom erhaltene Schnitte auf spezielle Gitter gelegt, mit Salzen von Mangan, Kobalt usw. kontrastiert, wonach sie unter einem Mikroskop betrachtet und fotografiert werden. Die erhaltenen Mikrofotografien dienen zusammen mit histologischen Präparaten als Untersuchungsobjekt.

Methoden zur Untersuchung lebender Zellen und Gewebe

Das Studium lebender Zellen und Gewebe ermöglicht es Ihnen, die umfassendsten Informationen über ihre Lebensaktivität zu erhalten - um die Bewegung, Teilungs-, Zerstörungs-, Wachstums-, Differenzierungs- und Interaktionsprozesse von Zellen, die Dauer ihres Lebenszyklus und reaktive Veränderungen als Reaktion zu verfolgen auf die Wirkung verschiedener Faktoren.

In-vivo-Untersuchungen von Körperzellen (inlebendig). Eine der wichtigsten Forschungsmethoden ist die Beobachtung von Strukturen in einem lebenden Organismus. Mit Hilfe spezieller durchscheinender Mikroskop-Illuminatoren ist es beispielsweise möglich, die Dynamik der Blutzirkulation in Mikrogefäßen zu untersuchen. Nach der Anästhesie bei einem Tier wird das Untersuchungsobjekt (z. B. das Darmgekröse) herausgenommen und unter dem Mikroskop untersucht, während das Gewebe ständig mit isotonischer Kochsalzlösung befeuchtet werden muss. Die Dauer einer solchen Beobachtung ist jedoch begrenzt. Die besten Ergebnisse werden erzielt, indem transparente Kammern in den Körper eines Tieres implantiert werden.

Das am besten geeignete Organ für die Implantation solcher Kameras und die anschließende Beobachtung ist das Ohr eines Tieres (z. B. eines Kaninchens). Ein Ausschnitt des Ohrs mit einer transparenten Kammer wird auf den Mikroskoptisch gelegt und unter diesen Bedingungen die Dynamik von Veränderungen in Zellen und Geweben über einen langen Zeitraum untersucht. So können die Prozesse der Leukozytenaustreibung aus Blutgefäßen, verschiedene Stadien der Bildung von Bindegewebe, Kapillaren, Nerven und andere Prozesse untersucht werden. Das Auge von Versuchstieren kann als natürliche transparente Kamera verwendet werden. Zellen, Gewebe oder Organproben werden im Winkel zwischen Hornhaut und Iris in die Flüssigkeit der vorderen Augenkammer eingebracht und können durch die transparente Hornhaut beobachtet werden. Auf diese Weise wurde eine befruchtete Eizelle transplantiert und die frühen Stadien der Embryonalentwicklung verfolgt. Affen wurden kleine Stücke der Gebärmutter transplantiert und Veränderungen in der Gebärmutterschleimhaut in verschiedenen Phasen des Menstruationszyklus untersucht.

Das Verfahren der Transplantation von Blut- und Knochenmarkszellen von gesunden Spendertieren auf Empfängertiere, die tödlicher Strahlung ausgesetzt wurden, hat breite Anwendung gefunden. Die Empfängertiere blieben nach der Transplantation am Leben aufgrund der Transplantation von Spenderzellen, die Kolonien von hämatopoetischen Zellen in der Milz bildeten. Die Untersuchung der Anzahl der Kolonien und ihrer zellulären Zusammensetzung ermöglicht es, die Anzahl der hämatopoetischen Elternzellen und die verschiedenen Stadien ihrer Differenzierung zu identifizieren. Unter Verwendung der Methode der Koloniebildung wurden die Entwicklungsquellen für alle Blutzellen ermittelt.

Vital- und supravitale Färbung. Während der lebenslangen Färbung von Zellen und Geweben wird der Farbstoff in den Körper des Tieres eingebracht, während er bestimmte Zellen, ihre Organellen oder interzelluläre Substanz selektiv färbt. Beispielsweise werden mit Trypanblau oder Lithiumkarmin Fresszellen nachgewiesen und mit Alizarin eine neu gebildete Knochenmatrix.

Die supravitale Färbung bezieht sich auf die Färbung lebender Zellen, die aus dem Körper isoliert wurden. Auf diese Weise werden junge Formen von Erythrozyten nachgewiesen - Blutretikulozyten (Brillantkresylblau-Farbstoff), Mitochondrien in Zellen (Janusgrün-Farbstoff), Lysosomen (Neutralrot-Farbstoff).

Untersuchungen an lebenden Zellen und Geweben in Kultur (invitro). Diese Methode ist eine der häufigsten. Aus dem menschlichen oder tierischen Körper isolierte Zellen, kleine Gewebe- oder Organproben werden in Glas- oder Kunststoffgefäße gegeben, die ein spezielles Nährmedium enthalten - Blutplasma, Embryonalextrakt sowie künstliche Medien. Es gibt Suspensionskulturen (im Medium suspendierte Zellen), Gewebe-, Organ- und Monolayerkulturen (explantierte Zellen bilden eine durchgehende Schicht auf dem Glas). Die Sterilität des Mediums und die der Körpertemperatur entsprechende Temperatur sind gewährleistet. Unter diesen Bedingungen behalten die Zellen lange Zeit die Hauptindikatoren für die Vitalaktivität bei - die Fähigkeit zu wachsen, sich zu vermehren, zu differenzieren und sich zu bewegen. Solche Kulturen können viele Tage, Monate und sogar Jahre bestehen, wenn das Kulturmedium erneuert und lebensfähige Zellen in andere Gefäße transplantiert werden. Einige Zelltypen können aufgrund von Veränderungen in ihrem Genom in Kultur bestehen bleiben und sich vermehren, wodurch kontinuierliche Zelllinien gebildet werden. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky und F. M. Lazarenko leisteten einen großen Beitrag zur Entwicklung von Methoden zur Kultivierung von Zellen und Geweben. Gegenwärtig sind Zelllinien von Fibroblasten, Myozyten, Epitheliozyten, Makrophagen usw. erhalten worden, die seit vielen Jahren existieren.

Die Verwendung der Kultivierungsmethode ermöglichte es, eine Reihe von Differenzierungsmustern, bösartigen Transformationen von Zellen, zellulären Wechselwirkungen, Wechselwirkungen von Zellen mit Viren und Mikroben aufzudecken. Es wurde die Fähigkeit von Knorpelzellen gezeigt, in Kultur eine interzelluläre Substanz zu bilden, und die Fähigkeit von Nebennierenzellen, Hormone zu produzieren. Die Kultivierung embryonaler Gewebe und Organe ermöglichte es, die Entwicklung von Knochen, Haut und anderen Organen zu verfolgen. Eine Technik zur Kultivierung von Nervenzellen wurde entwickelt.

Die Gewebekulturmethode ist von besonderer Bedeutung für die Durchführung experimenteller Beobachtungen an menschlichen Zellen und Geweben. Zellen, die dem menschlichen Körper bei Punktion oder Biopsie entnommen werden, können in Gewebekulturen zur Bestimmung des Geschlechts, von Erbkrankheiten, bösartigen Entartungen und zur Bestimmung der Wirkung einer Reihe von toxischen Substanzen verwendet werden.

In den letzten Jahren wurden Zellkulturen in großem Umfang für die Zellhybridisierung verwendet.

Es wurden Methoden entwickelt, um Gewebe in Zellen zu trennen, einzelne Zelltypen zu isolieren und zu kultivieren.

Zunächst wird das Gewebe in eine Zellsuspension umgewandelt, indem mit Hilfe von proteolytischen Enzymen (Trypsin, Collagenase) und Ca 2+ -bindenden Verbindungen (mittels EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure) interzelluläre Kontakte und die interzelluläre Matrix zerstört werden. Darüber hinaus wird die resultierende Suspension durch Zentrifugation in Fraktionen von Zellen verschiedener Typen getrennt, wodurch schwerere Zellen von leichteren, große von kleinen Zellen getrennt werden können, oder indem Zellen an Glas oder Kunststoff geklebt werden, deren Fähigkeit für verschiedene Typen unterschiedlich ist Zellen. Um eine spezifische Adhäsion von Zellen auf der Glasoberfläche zu gewährleisten, werden Antikörper verwendet, die spezifisch an Zellen des gleichen Typs binden. Anhaftende Zellen werden dann durch Aufbrechen der Matrix mit Enzymen getrennt, wodurch eine Suspension homogener Zellen erhalten wird. Eine subtilere Methode der Zelltrennung ist die Markierung mit Antikörpern, die mit fluoreszierenden Farbstoffen assoziiert sind. Markierte Zellen werden mit einem Sorter (elektronischer fluoreszenzaktivierter Zellanalysator) von unmarkierten Zellen getrennt. Der Zellanalysator sortiert in 1 mit ca. 5000 Zellen. Isolierte Zellen können unter Kulturbedingungen untersucht werden.

Die Methode der Zellkultivierung ermöglicht es, ihre Vitalaktivität, Reproduktion, Differenzierung, Interaktion mit anderen Zellen, den Einfluss von Hormonen, Wachstumsfaktoren usw. zu untersuchen.

Kulturen werden gewöhnlich aus einer Zellsuspension hergestellt, die durch das oben beschriebene Gewebedissoziationsverfahren hergestellt wurde. Die meisten Zellen können nicht in Suspension wachsen, sie brauchen eine feste Oberfläche, die die Oberfläche einer Plastikkulturschale ist, manchmal mit extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen. Primärkulturen werden Kulturen genannt, die unmittelbar nach der ersten Stufe der Zellfraktionierung hergestellt werden, zweitrangig- Zellkulturen, die aus Primärkulturen in ein neues Medium transplantiert wurden. Zellen können sequentiell über Wochen und Monate transplantiert werden, wobei die Zellen ihre charakteristischen Differenzierungsmerkmale behalten (z. B. Epithelzellen bilden Schichten). Ausgangsmaterial für Zellkulturen sind in der Regel fötale und neonatale Gewebe.

Als Nährmedien dienen Mischungen aus Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, Pferdeserum, Hühnerembryoextrakt, Embryonalserum etc. Für die Kultivierung verschiedener Zelltypen wurden spezielle Medien entwickelt. Sie enthalten einen oder mehrere Proteinwachstumsfaktoren, die für das Leben und die Reproduktion der Zellen notwendig sind. Beispielsweise wird der Nervenwachstumsfaktor (NGF) für das Wachstum von Nervenzellen benötigt.

Die meisten Zellen in Kultur haben eine bestimmte Anzahl von Teilungen (50-100) und sterben dann ab. Manchmal erscheinen mutierte Zellen in Kultur, die sich endlos vermehren und eine Zelllinie bilden (Fibroblasten, Epitheliozyten, Myoblasten usw.). Mutierte Zellen unterscheiden sich von Krebszellen, die sich ebenfalls kontinuierlich teilen können, aber wachsen können, ohne an eine feste Oberfläche gebunden zu sein. Krebszellen in Kulturschalen bilden eine dichtere Population als normale Zellpopulationen. Eine ähnliche Eigenschaft kann experimentell in normalen Zellen induziert werden, indem sie mit tumorähnlichen Viren oder chemischen Verbindungen transformiert werden, was zur Bildung von neoplastisch transformierten Zelllinien führt. Zelllinien von nicht-transformierten und transformierten Zellen können lange bei niedrigen Temperaturen (-70 °C) gelagert werden. Die genetische Homogenität von Zellen wird durch das Klonen verbessert, wenn eine große Kolonie homogener Zellen während ihrer sukzessiven Teilung aus einer Zelle gewonnen wird. Ein Klon ist eine Population von Zellen, die von einer einzigen Vorläuferzelle abstammen.

Zellhybride. Wenn zwei Zellen unterschiedlichen Typs verschmelzen, entsteht ein Heterokaryon - eine Zelle mit zwei Kernen. Um ein Heterokaryon zu erhalten, wird eine Zellsuspension mit Polyethylenglycol oder inaktivierten Viren behandelt, um die Zellplasmolemme zu schädigen, wonach die Zellen zur Fusion befähigt sind. Beispielsweise wird der inaktive Kern eines Hühnererythrozyten aktiv (RNA-Synthese, DNA-Replikation), wenn Zellen verschmelzen und in das Zytoplasma einer anderen Zelle übertragen werden, die in Gewebekultur wächst. Das Heterokaryon ist zur Mitose fähig, was zur Bildung von führt hybride Zelle. Die Schalen der Kerne des Heterokaryons werden zerstört und ihre Chromosomen werden zu einem großen Kern kombiniert.

Das Klonen von Hybridzellen führt zur Bildung von Hybridzelllinien, die zur Untersuchung des Genoms verwendet werden. Beispielsweise wurde in einer Maus-Mensch-Hybridzelllinie die Rolle des menschlichen Chromosoms 11 bei der Insulinsynthese festgestellt.

Hybridome. Hybridomzelllinien werden verwendet, um monoklonale Antikörper zu erhalten. Antikörper werden von Plasmazellen produziert, die bei der Immunisierung aus B-Lymphozyten gebildet werden. Ein spezifischer Antikörpertyp wird durch Immunisierung von Mäusen mit spezifischen Antigenen erhalten. Wenn solche immunisierten Lymphozyten kloniert werden, kann eine große Menge an homogenen Antikörpern erhalten werden. Die Lebensdauer von B-Lymphozyten in Kultur ist jedoch begrenzt. Daher verschmelzen sie mit „unsterblichen“ Tumorzellen (B-Lymphomen). Als Ergebnis werden Hybriden gebildet. (Hybridzelle, mit einem Genom aus zwei verschiedenen Zellen; Ohm - auf Tumornamen enden). Solche Hybridome können sich in Kultur lange vermehren und Antikörper eines bestimmten Typs synthetisieren. Jeder Hybridomklon ist eine Quelle für monoklonale Antikörper. Alle Antikörpermoleküle einer bestimmten Spezies haben die gleiche Antigenbindungsspezifität. Es ist möglich, monoklonale Antikörper gegen jedes in einer Zelle enthaltene Protein zu erzeugen und sie zur Lokalisierung von Proteinen in einer Zelle sowie zur Isolierung eines Proteins aus einem Gemisch (Proteinreinigung) zu verwenden, wodurch man die Struktur und Funktion von Proteinen untersuchen kann . Monoklonale Antikörper werden auch in der Genklonierungstechnologie verwendet.

Antikörper können verwendet werden, um die Funktion verschiedener Moleküle zu untersuchen, indem sie mit einer dünnen Glaspipette durch das Plasmalemma direkt in das Zytoplasma von Zellen eingeführt werden. Beispielsweise stoppt die Einführung von Antikörpern gegen Myosin in das Zytoplasma eines befruchteten Seeigleiers die Teilung des Zytoplasmas.

Rekombinante DNA-Technologie. Klassische genetische Methoden ermöglichen es, die Funktion von Genen zu untersuchen, indem sie die Phänotypen mutierter Organismen und ihrer Nachkommen analysieren. Die rekombinante DNA-Technologie ergänzt diese Methoden und ermöglicht eine detaillierte chemische Analyse des genetischen Materials und die Gewinnung großer Mengen zellulärer Proteine.

Hybridisierungsmethoden werden in der modernen Biologie häufig verwendet, um die Struktur von Genen und ihre Expression zu untersuchen.

Methoden zur Untersuchung der chemischen Zusammensetzung und des Stoffwechsels von Zellen und Geweben

Zur Untersuchung der chemischen Zusammensetzung biologischer Strukturen - der Lokalisierung von Substanzen, ihrer Konzentration und Dynamik in Stoffwechselprozessen - werden spezielle Forschungsmethoden eingesetzt.

Zyto- und histochemische Methoden. Diese Methoden ermöglichen es, die Lokalisierung verschiedener Chemikalien in den Strukturen von Zellen, Geweben und Organen nachzuweisen - DNA, RNA, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Aminosäuren, Mineralien, Vitamine, Enzymaktivität. Diese Verfahren basieren auf der Spezifität der Reaktion zwischen einem chemischen Reagenz und einem Substrat, das Teil von Zell- und Gewebestrukturen ist, und auf der Färbung chemischer Reaktionsprodukte. Enzymatische Kontrolle wird häufig verwendet, um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen. Um beispielsweise Ribonukleinsäure (RNA) in Zellen nachzuweisen, wird häufig Gallocyanin verwendet - ein Farbstoff mit basischen Eigenschaften und dessen Anwesenheit RNS bestätigt durch Kontrollbehandlung mit Ribonuklease, die RNA spaltet. Gallocyanin-Flecken RNS in blau-violett. Wenn der Schnitt mit Ribonuclease vorbehandelt und dann mit Gallocyanin gefärbt wird, dann bestätigt das Fehlen einer Färbung das Vorhandensein von Ribonucleinsäure in der Struktur. Zahlreiche zyto- und histochemische Methoden sind in speziellen Handbüchern beschrieben.

Die Kombination von histochemischen Methoden mit der Methode der Elektronenmikroskopie hat in den letzten Jahren zur Entwicklung eines neuen vielversprechenden Gebiets geführt - der Elektronenhistochemie. Diese Methode ermöglicht es, die Lokalisierung verschiedener Chemikalien nicht nur auf zellulärer, sondern auch auf subzellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen.

Zur Untersuchung von Zellmakromolekülen werden sehr empfindliche Methoden mit radioaktiven Isotopen und Antikörpern verwendet, die es ermöglichen, auch einen geringen Gehalt an Molekülen (weniger als 1000) nachzuweisen.

radioaktive Isotope Beim Zerfall des Kerns senden sie geladene Teilchen (Elektronen) oder Strahlung (z. B. Gammastrahlen) aus, die in speziellen Geräten registriert werden können. Radioaktive Isotope werden in der Radioautographie verwendet. Beispielsweise wird mit Hilfe von Radioisotopen von 3 H-Thymidin Kern-DNA untersucht, mit Hilfe von 3 H-Uridin - RNA.

radioautographische Methode. Diese Methode ermöglicht es, den Stoffwechsel in verschiedenen Strukturen möglichst vollständig zu untersuchen. Das Verfahren basiert auf der Verwendung von radioaktiven Elementen (z. B. Phosphor - 32 P, Kohlenstoff - 14 C, Schwefel - 35 S, Wasserstoff - 3 H) oder von ihnen markierten Verbindungen. Radioaktive Substanzen in histologischen Schnitten werden mit einer fotografischen Emulsion nachgewiesen, die auf das Präparat aufgetragen und anschließend entwickelt wird. In Bereichen des Medikaments, wo die fotografische Emulsion mit einer radioaktiven Substanz in Kontakt kommt, findet eine Fotoreaktion statt, wodurch beleuchtete Bereiche (Spuren) gebildet werden. Mit dieser Methode kann beispielsweise die Einbaurate markierter Aminosäuren in Proteine, die Bildung von Nukleinsäuren, der Jodstoffwechsel in Schilddrüsenzellen usw. bestimmt werden.

Methoden der Immunfluoreszenzanalyse. Die Verwendung von Antikörpern. Antikörper sind Schutzproteine, die von Plasmazellen (Abkömmlinge von B-Lymphozyten) als Reaktion auf die Einwirkung von Fremdstoffen (Antigenen) produziert werden. Die Zahl der verschiedenen Formen von Antikörpern erreicht eine Million. Jeder Antikörper hat Stellen zur "Erkennung" der Moleküle, die die Synthese dieses Antikörpers verursacht haben. Aufgrund der hohen Spezifität von Antikörpern für Antigene können mit ihnen beliebige Zellproteine ​​nachgewiesen werden. Um die Lokalisation von Proteinen zu identifizieren, werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen angefärbt und die Zellen anschließend fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Antikörper können auch verwendet werden, um Antigene auf ultrastruktureller Ebene unter Verwendung eines Elektronenmikroskops zu untersuchen. Dazu werden Antikörper mit elektronendichten Partikeln (kolloidale Goldmikrosphären) markiert. Um die Spezifität der Reaktion zu verbessern, werden monoklonale Antikörper verwendet, die von einer Zelllinie gebildet werden - Klone, die durch das Hybridomverfahren aus einer Zelle erhalten wurden. Das Hybridoma-Verfahren ermöglicht es, monoklonale Antikörper mit gleicher Spezifität und in unbegrenzten Mengen zu erhalten.

Methoden der Immunfluoreszenzanalyse werden in der modernen Histologie weit verbreitet und effektiv eingesetzt. Diese Methoden werden verwendet, um die Prozesse der Zelldifferenzierung zu untersuchen, um spezifische chemische Verbindungen und Strukturen in ihnen zu identifizieren. Sie beruhen auf Antigen-Antikörper-Reaktionen. Jede Körperzelle hat eine spezifische antigene Zusammensetzung, die hauptsächlich durch Proteine ​​bestimmt wird. Die Reaktionsprodukte können angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden, beispielsweise der Nachweis von Aktin und Tubulin in einer Zelle mit der Immunfluoreszenz-Analysemethode (siehe Kapitel IV).

Moderne Forschungsmethoden ermöglichen es, die chemische Zusammensetzung verschiedener struktureller Bestandteile von sowohl festen als auch lebenden Zellen zu analysieren. Die Untersuchung individueller intrazellulärer Strukturen wurde nach der Entwicklung von Technologien zur Fraktionierung von Zellinhalten möglich.

Fraktionierung von Zellinhalten

Zellstrukturen und Makromoleküle können durch verschiedene Methoden fraktioniert werden - Ultrazentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese. Diese Methoden sind in Lehrbüchern der Biochemie ausführlicher beschrieben.

Ultrazentrifugation. Mit dieser Methode lassen sich Zellen in Organellen und Makromoleküle aufteilen. Zunächst werden Zellen durch osmotischen Schock, Ultraschall oder mechanische Einwirkung zerstört. Dabei zerfallen die Membranen (Plasmolemma, endoplasmatisches Retikulum) in Bruchstücke, aus denen sich kleinste Vesikel bilden, und die Kerne und Organellen (Mitochondrien, Golgi-Apparat, Lysosomen und Peroxisomen) bleiben intakt und befinden sich in der sich bildenden Suspension.

Eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge (80.000–150.000 U/min) wird verwendet, um die obigen Zellkomponenten zu trennen. Zuerst setzen sich größere Teile (Kerne, Zytoskelett) am Boden des Röhrchens ab (Sediment). Bei einer weiteren Erhöhung der Zentrifugationsgeschwindigkeit der Überstandsfraktionen setzen sich nacheinander kleinere Partikel ab – zuerst Mitochondrien, Lysosomen und Peroxisomen, dann Mikrosomen und kleinste Vesikel und schließlich Ribosomen und große Makromoleküle. Während der Zentrifugation setzen sich verschiedene Fraktionen unterschiedlich schnell ab und bilden im Reagenzglas separate Banden, die isoliert und untersucht werden können. Fraktionierte Zellextrakte (zellfreie Systeme) werden häufig verwendet, um intrazelluläre Prozesse zu untersuchen, beispielsweise um die Proteinbiosynthese zu untersuchen, den genetischen Code zu entschlüsseln usw.

Die Chromatographie wird häufig zur Proteinfraktionierung verwendet.

Die Elektrophorese ermöglicht es, Proteinmoleküle mit unterschiedlichen Ladungen zu trennen, indem ihre wässrigen Lösungen (oder in einer festen porösen Matrix) in ein elektrisches Feld gebracht werden.

Chromatographie- und Elektrophoreseverfahren werden verwendet, um Peptide zu analysieren, die durch Spaltung eines Proteinmoleküls erhalten werden, und um die sogenannten Peptidkarten von Proteinen zu erhalten. Diese Verfahren sind in Lehrbüchern der Biochemie ausführlich beschrieben.

Das Studium der chemischen Zusammensetzung lebender Zellen. Zur Untersuchung der Stoffverteilung und ihres Stoffwechsels in lebenden Zellen werden Kernspinresonanz- und Mikroelektrodentechniken eingesetzt.

Kernspinresonanz (NMR) ermöglicht die Untersuchung kleiner Moleküle niedermolekularer Substanzen. Eine Gewebeprobe enthält Atome in unterschiedlichen Molekülen und in unterschiedlichen Umgebungen, sodass sie Energie bei unterschiedlichen Resonanzfrequenzen absorbiert. Das Absorptionsdiagramm bei Resonanzfrequenzen für eine gegebene Probe ist ihr Spektrum NMR. In der Biologie wird das NMR-Signal von Protonen (Wasserstoffkernen) häufig verwendet, um Proteine, Nukleinsäuren usw. zu untersuchen. Um Makromoleküle innerhalb einer lebenden Zelle zu untersuchen, werden häufig 3 H-, 13 C-, 35 K-, 31 P-Isotope verwendet, um ein zu erhalten NMR-Signal und Überwachung seiner Änderung während der Lebensdauer der Zelle. Also, 3| P wird verwendet, um die Muskelkontraktion zu untersuchen - Änderungen des Gehalts an ATP und anorganischem Phosphat in Geweben. Das 13 C-Isotop ermöglicht es, viele Prozesse, an denen Glucose beteiligt ist, mittels NMR zu untersuchen. Die Verwendung von NMR ist durch ihre geringe Empfindlichkeit begrenzt: 1 g lebendes Gewebe muss mindestens 0,2 mm der Testsubstanz enthalten. Der Vorteil der Methode liegt in ihrer Unschädlichkeit für lebende Zellen.

Mikroelektroden-Technologie. Mikroelektroden sind Glasröhrchen, die mit einer elektrisch leitfähigen Lösung (normalerweise eine KCl-Lösung in Wasser) gefüllt sind, deren Enddurchmesser in Bruchteilen eines Mikrometers gemessen wird. Die Spitze eines solchen Röhrchens kann durch das Plasmalemma in das Zytoplasma der Zelle eingeführt werden und die Konzentration von H + , Na + , K + , C1", Ca 2+ , Mg 2+ -Ionen, die Potentialdifferenz auf der Plasmamembran, und auch Moleküle in die Zelle injizieren.Zur Bestimmung der Konzentration eines bestimmten Ions werden ionenselektive Elektrodenverwendet, die mit einem Ionenaustauscherharz gefüllt sind, das nur für diesesIon durchlässig ist.In den letzten Jahren wurde die Mikroelektrodentechnologie verwendet um den Transport von Ionen durch spezielle Ionenkanäle (spezialisierte Proteinkanäle) in der Plasmamembran zu untersuchen. In diesem Fall eine Mikroelektrode mit einer dickeren Spitze, die fest gegen den entsprechenden Teil des Plasmalemmas gedrückt wird. Mit dieser Methode können Sie untersuchen die Funktion eines einzelnen Proteinmoleküls. Die Veränderung der Konzentration von Ionen innerhalb der Zelle kann mit Leuchtindikatoren bestimmt werden. Um beispielsweise die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration zu untersuchen, wird das Leuchtprotein Aquarin (isoliert aus Quallen) verwendet, das strahlt hell t in Gegenwart von Ca 2+ -Ionen und reagiert auf Konzentrationsänderungen der letzteren im Bereich von 0,5–10 μM. Es wurden auch fluoreszierende Indikatoren synthetisiert, die stark an Ca 2+ binden. Die Schaffung verschiedener neuartiger intrazellulärer Indikatoren und moderner Methoden der Bildanalyse ermöglicht es, die intrazelluläre Konzentration vieler niedermolekularer Substanzen genau und schnell zu bestimmen.

Quantitative Methoden

Gegenwärtig sind neben qualitativen Verfahren auch quantitative histochemische Verfahren entwickelt und zur Bestimmung des Gehalts verschiedener Substanzen in Zellen und Geweben eingesetzt worden. Ein Merkmal quantitativ-histochemischer (im Gegensatz zu biochemischen) Forschungsmethoden ist die Möglichkeit, die Konzentration und den Gehalt chemischer Komponenten in bestimmten Zell- und Gewebestrukturen zu untersuchen.

Zytospektrophotometrie- Methode zur quantitativen Untersuchung intrazellulärer Substanzen anhand ihrer Absorptionsspektren.

Zytospektrofluorometrie- ein Verfahren zur quantitativen Untersuchung intrazellulärer Substanzen anhand ihrer Fluoreszenzspektren oder anhand der Fluoreszenzintensität bei einer vorgewählten Wellenlänge (Zytofluorometrie).

Moderne Mikroskope - Zytofluorometer ermöglichen den Nachweis kleiner Mengen einer Substanz in verschiedenen Strukturen (bis zu 10-14 -10-16 g) und die Abschätzung der Lokalisierung der untersuchten Substanzen in Mikrostrukturen.

Methoden zur Bildanalyse von Zell- und Gewebestrukturen

Die erhaltenen Bilder von Mikroobjekten in einem Mikroskop, auf einem Fernsehbildschirm, auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen können einer speziellen Analyse unterzogen werden - der Identifizierung morphometrischer, densitometrischer Parameter und ihrer statistischen Verarbeitung.

Morphometrische Methoden ermöglichen es, mit Hilfe spezieller Gitter (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) die Anzahl beliebiger Strukturen, ihre Bereiche, Durchmesser usw. zu bestimmen. Insbesondere in Zellen die Bereiche von Kernen, Zytoplasma, ihre Durchmesser , Kern-Zytoplasma-Verhältnisse usw. Es gibt manuelle Morphometrie und automatisierte Morphometrie, bei der alle Parameter automatisch gemessen und im Gerät aufgezeichnet werden.

In den letzten Jahren immer mehr verbreitet Automatisierungintegrierte Bildverarbeitungssysteme (ASOIS), was die effektivste Implementierung der obigen quantitativen Verfahren zum Untersuchen von Zellen und Geweben ermöglicht. Gleichzeitig werden die analytischen Möglichkeiten der quantitativen Mikroskopie durch Methoden der Analyse und Erkennung von Proben ergänzt, die auf der Verarbeitung von Informationen aus Bildern von Zellen und Geweben mit Hilfe elektronischer Computer (Computer) basieren. Im Wesentlichen können wir über Geräte sprechen, die nicht nur die optischen Fähigkeiten des menschlichen visuellen Analysators verbessern, sondern auch seine analytischen Fähigkeiten erheblich erweitern. Es wird die Meinung geäußert, dass ASOIz die gleiche Revolution in der Morphologie macht, die vor etwa 300 Jahren aufgrund der Erfindung des Lichtmikroskops und vor etwa 50 Jahren - des Elektronenmikroskops - stattfand, da sie nicht nur die Produktivität des Forschers unermesslich steigern und Beobachtungen nicht nur objektivieren, sondern auch neue Informationen über zuvor nicht nachweisbare Prozesse gewinnen, deren Entwicklung in Zellen und Geweben numerisch modellieren und vorhersagen können.

Gleichzeitig erfordert die Teilnahme an einem Computerexperiment eine neue Herangehensweise des Forschers an seine Implementierung, Fähigkeiten bei der Zusammenstellung von Algorithmen für den Forschungsprozess, Genauigkeit der Argumentation und letztendlich die Anhebung des wissenschaftlichen und methodologischen Niveaus der Forschung.

Eine der Methoden, die die Zahl der zu lösenden morphologischen Probleme erheblich erweitert hat, ist optisch-strukturelle Maschinenanalyse (OSMA), 1965 von K. M. Bogdanov vorgeschlagen. 1978 wurde der Autor der Methode mit dem Staatspreis der UdSSR ausgezeichnet. Mit dem Aufkommen von OSMA wurde ein qualitativ neuer Schritt in der Entwicklung einer einheitlichen Methodik zur quantitativen Analyse von Mikrostrukturen auf Basis statistischer Merkmale gemacht. In jüngster Zeit hat OSMA eine effektive Anwendung in der Forschungspraxis und der Volkswirtschaft gefunden.

Auf Abb. 2 zeigt das automatisierte Bildverarbeitungssystem Protva-MP, das in unserem Land von LOMO entwickelt wurde. Das System ist für komplexe Untersuchungen von Zellen und Geweben mittels Absorption, Fluoreszenzmikroskopie und Autoradiographie ausgelegt.

Ein spezielles optisches Raster- oder Elektronenmikroskop, das Teil des Systems ist, scannt das Bild des Präparats sequentiell in zwei Koordinaten, wandelt es in eine digitale Form um und gibt es in einen Computer ein, der das Bild wiederum digital verarbeitet und verarbeitet liefert Informationen über die geometrischen und anderen Eigenschaften des analysierten Objekts.

Anhand eines Farbdisplays kann der Forscher das Bild „zerlegen“ und nur die Strukturkomponenten hervorheben, die ihn interessieren. Die im Computer enthaltenen umfangreichen Informationsspeichergeräte auf Magnetplatten oder Bändern ermöglichen es, sowohl die Bilder selbst als auch die Ergebnisse ihrer Verarbeitung für eine spätere Speicherung und Dokumentation zu speichern.

Wir werden die Verwendung von Methoden zur automatisierten Analyse von Mikroobjekten am Beispiel der Verarbeitung eines Bildes eines Blutleukozyten betrachten (Abb. 3). Mit einem Rastermikroskop-Photometer können Sie die Werte der optischen Dichte Zeile für Zeile „ansehen“. mit einem vom Forscher festgelegten Schritt Als Ergebnis wird das optische Signal, das der optischen Dichte des Objekts entspricht, in digitale Form umgewandelt. Die resultierende digitale Matrix unterliegt der Vorbereitung unter Verwendung eines speziellen mathematischen Apparats

Zuerst wird der Hintergrund entfernt und ein "sauberes" Objekt isoliert - das Bild der Zelle (1a), dann wird jedes für den Forscher interessante Detail aus dem Bild der Zelle ausgewählt, beispielsweise das Zytoplasma (16) und der Kern (ich bestelle Durchschnitts- und Integralwert der optischen Dichte, Dispersion, Asymmetrie, Kurtosis usw. Basierend auf dem Bild des Objekts werden morphometrische Parameter erhalten: Fläche, Umfang, Durchmesser, Kern-Zytoplasma-Verhältnis, Formfaktor usw.

Die nächste Stufe der Bildverarbeitung ist die Erstellung von zweidimensionalen Diagrammen der gegenseitigen Abhängigkeit der optischen Dichte für die gesamte Zelle (siehe Abb. 3), ihr Zytoplasma (Wb) und Zellkern (Nm) und Kerne.Diese Diagramme ermöglichen Ihnen die Berechnung der Histogrammparameter zweiter Ordnung - Homogenität, lokaler Kontrast, Entropie usw.

Reis. 3. Automatisierte Zellbildverarbeitung (Diagramm).

Bild eines Leukozyten (a), seines Zytoplasmas (b) und seines Zellkerns (c). I - digitales Bild; II - Histogramme der optischen Dichte; III - zweidimensionale Histogramme der Abhängigkeit optischer Dichtewerte.

Die so gewonnenen Parameter stellen ein mehrdimensionales „Portrait“ der Zelle dar und haben einen spezifischen numerischen Ausdruck. Sie können verschiedenen Methoden der statistischen Verarbeitung unterzogen werden, ermöglichen eine äußerst genaue Klassifizierung von Mikroobjekten und offenbaren Merkmale ihrer Struktur, die visuell nicht erkennbar sind.

So ermöglicht die Anwendung neuer Forschungsmethoden in Histologie, Zytologie und Embryologie, die allgemeinen Organisationsmuster von Geweben und Zellen aufzuklären, die strukturellen Grundlagen biochemischer Prozesse, die die Funktion bestimmter struktureller Komponenten einer Zelle bestimmen.

Die Struktur, Ultrastruktur und Funktionsweise von Zellorganellen wird derzeit mit den folgenden Hauptmethoden untersucht: Licht und Elektron, Dunkelfeld, Phasenkontrast, Polarisation, Lumineszenzmikroskopie, die zur Untersuchung der Struktur, Ultrastruktur fixierter Zellen und differentieller Zentrifugation verwendet wird , die es ermöglicht, einzelne Organellen zu isolieren und sie mit zytochemischen, biochemischen, biophysikalischen und anderen Methoden zu analysieren.

Lichtmikroskop.

Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, dass ein Lichtstrahl, der ein Objekt durchdringt, in das Linsensystem des Objektivs eintritt und ein Primärbild aufbaut, das mit Hilfe der Okularlinsen vergrößert wird. Der optische Hauptteil des Mikroskops, der seine Hauptfähigkeiten bestimmt, ist das Objektiv.

In modernen Mikroskopen sind die Objektive austauschbar, wodurch Sie Zellen mit unterschiedlichen Vergrößerungen untersuchen können. Die Haupteigenschaft eines Mikroskops als optisches System ist seine Auflösung, d.h. die Fähigkeit, ein separates Bild von zwei nahe beieinander liegenden Objekten zu geben.

Durch die Verwendung eines starken Okulars oder z. B. Projektionen auf eine Leinwand (bis zu 10 5 -fach) können die vom Objektiv gelieferten Bilder um ein Vielfaches vergrößert werden. Die Auflösung eines Lichtmikroskops ist durch die Wellenlänge des Lichts begrenzt: Je kürzer die Wellenlänge, desto höher die Auflösung. Typischerweise verwenden Lichtmikroskope Lichtquellen im sichtbaren Bereich des Spektrums (400–700 nm), sodass die maximale Auflösung des Mikroskops in diesem Fall nicht höher als 200–350 nm (0,2–0,35 Mikron) sein darf. Wenn Sie violettes Licht (260–280 nm) verwenden, können Sie die Auflösung auf 130–140 nm (0,13–0,14 Mikrometer) erhöhen. Dies ist die Grenze der theoretischen Auflösung des Lichtmikroskops, die durch die Wellennatur des Lichts bestimmt wird.

Alles, was ein Lichtmikroskop als Hilfsmittel für unser Auge leisten kann, ist also, seine Auflösung um etwa das 1000-fache zu erhöhen (das menschliche bloße Auge hat eine Auflösung von etwa 0,1 mm, was 100 Mikron entspricht). Dies ist die "nützliche" Vergrößerung des Mikroskops, oberhalb der wir nur die Konturen des Bildes vergrößern, ohne neue Details darin zu enthüllen. Daher ist bei Verwendung des sichtbaren Bereichs des Lichts 0,2-0,3 µm die ultimative Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops.

Elektronenmikroskopie.

Für ein Rasterelektronenmikroskop wird das Material oft gefroren, um eine eisbedeckte Oberfläche zu erzeugen. Dabei ist der Wasserverlust von wasserlöslichen Stoffen ausgeschlossen und auch chemische Strukturveränderungen sind geringer. Bei der Analyse von Daten, die mit einem Elektronenmikroskop erhalten wurden, muss daran erinnert werden, dass diese Methode die statischen Zustände der Zelle im Moment eines schnellen Stopps der Bewegung des Zytoplasmas untersucht, der durch die Einwirkung von Fixierchemikalien verursacht wird.

Dunkelfeldmikroskopie.

Seine Essenz besteht darin, dass wie Staubpartikel in einem Lichtstrahl (Tyndall-Effekt) winzige Partikel (weniger als 0,2 Mikrometer) in einer Zelle unter seitlicher Beleuchtung leuchten, deren reflektiertes Licht in die Mikroskoplinse eintritt. Diese Methode wurde erfolgreich bei der Untersuchung lebender Zellen eingesetzt.

Um die Lokalisation von Stellen für die Synthese von Biopolymeren zu bestimmen, den Transfer von Substanzen in einer Zelle zu bestimmen, die Migration oder Eigenschaften einzelner Zellen zu überwachen, werden sie weithin verwendet Methode der Autoradiographie- Registrierung von mit Isotopen gekennzeichneten Stoffen. Beispielsweise wurde unter Verwendung dieses Verfahrens unter Verwendung von markierten RNA-Vorläufern gezeigt, dass die gesamte RNA nur im Interphase-Kern synthetisiert wird und das Vorhandensein von zytoplasmatischer RNA das Ergebnis der Migration synthetisierter Moleküle aus dem Kern ist.

In der Zytologie, verschiedene analytische und präparative Methoden Biochemie. Im letzteren Fall können verschiedene Zellbestandteile in Form separater Fraktionen erhalten und ihre Chemie, Ultrastruktur und Eigenschaften untersucht werden. Derzeit werden nahezu beliebige Zellorganellen und -strukturen in Form reiner Fraktionen gewonnen.

Eine der wichtigsten Möglichkeiten, zelluläre Strukturen zu isolieren, ist differentielle (trennende) Zentrifugation. Das Prinzip seiner Anwendung besteht darin, dass die Absetzzeit der Partikel im Homogenat von ihrer Größe und Dichte abhängt: Je größer die Partikel oder je schwerer sie sind, desto schneller setzen sie sich am Boden des Reagenzglases ab. Um diesen Absetzvorgang zu beschleunigen, werden die durch die Zentrifuge erzeugten Beschleunigungen genutzt.

Durch wiederholtes fraktioniertes Zentrifugieren von gemischten Teilfraktionen können reine Fraktionen erhalten werden. Bei einer feineren Trennung von Fraktionen wird die Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation verwendet, die es ermöglicht, Komponenten gut zu trennen, selbst wenn sie sich im spezifischen Gewicht geringfügig voneinander unterscheiden. Die erhaltenen Fraktionen müssen, bevor sie mit biochemischen Methoden analysiert werden, mit einem Elektronenmikroskop auf Reinheit überprüft werden.

Testfragen:

1. Organisationsebenen lebender Materie

2. Zelluläre Theorie der Organisation von Organismen

3. Forschungsmethoden in der Zytologie

4. Aufgaben und Gegenstand der Zytologie

5. Das Gerät eines Lichtmikroskops

6. Elektronenmikroskopisches Gerät

7. Sicherheitsvorkehrungen für zytologische Arbeiten

8. Anforderungen an die Vorbereitung von biologischem Material für die zytologische Untersuchung

9. Fixiermittel, Wirkmechanismus

10. Zytochemie, Materialanforderungen und Fähigkeiten

11. Quantitative Analyse (Morphometrie), Anforderungen und Möglichkeiten

12. Artefakte in der Zytologie, Möglichkeiten zur Objektivierung der Ergebnisse

1. Zavarzin A.A., Kharazova A.D. Grundlagen der Allgemeinen Zytologie. -L., 1982.

2. Chentsov Yu.S. Grundlagen der Zytologie. -M., 1984.

3. Shubnikova E.A. Funktionelle Morphologie von Geweben. - M., Verlag der Staatlichen Universität Moskau, 1981.