Die kombinatorische Synthese kann nicht nur in Lösung (Flüssigphasensynthese), sondern auch an der Oberfläche einer festen chemisch inerten Phase durchgeführt werden. Dabei wird das erste Ausgangsmaterial chemisch mit den funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Polymerträgers „vernäht“ (meistens wird eine Ester- oder Amidbindung verwendet) und mit einer eingenommenen Lösung des zweiten Ausgangsmaterials behandelt einen signifikanten Überschuss, so dass die Reaktion vollständig abläuft. Diese Reaktionsform hat eine gewisse Bequemlichkeit, da die Technik zum Isolieren von Produkten erleichtert wird: Das Polymer (normalerweise in Form von Granulat) wird einfach abfiltriert, gründlich von den Resten des zweiten Reagens gewaschen und die Zielverbindung ist chemisch davon abgespalten.
In der organischen Chemie gibt es keine einzige Reaktion, die in der Praxis in jedem Fall quantitative Ausbeuten an Zielprodukten liefert. Die einzige Ausnahme ist offenbar die vollständige Verbrennung organischer Substanzen in Sauerstoff bei hoher Temperatur zu CO 2 und H 2 O. Daher ist die Reinigung des Zielprodukts immer eine unverzichtbare und oft die schwierigste und zeitaufwändigste Aufgabe. Eine besonders schwierige Aufgabe ist die Isolierung von Produkten der Peptidsynthese, beispielsweise die Trennung einer komplexen Mischung von Polypeptiden. Daher wurde in der Peptidsynthese das Syntheseverfahren auf einem festen Polymersubstrat, das in den frühen 1960er Jahren von R. B. Merifield entwickelt wurde, am weitesten verbreitet.
Der Polymerträger im Merrifield-Verfahren ist ein körniges vernetztes Polystyrol, das Chlormethylgruppen in Benzolringen enthält, die Linker sind, die den Träger an den ersten Aminosäurerest des Polypeptids binden. Diese Gruppen wandeln das Polymer in ein funktionelles Analogon von Benzylchlorid um und verleihen ihm die Fähigkeit, bei der Reaktion mit Carboxylatanionen leicht Esterbindungen zu bilden. Die Kondensation eines solchen Harzes mit N-geschützten Aminosäuren führt zur Bildung der entsprechenden Benzylester. Die Entfernung des N-Schutzes von ergibt ein C-geschütztes Derivat der ersten kovalent an das Polymer gebundenen Aminosäure. Die Aminoacylierung der freigesetzten Aminogruppe mit einem N-geschützten Derivat der zweiten Aminosäure, gefolgt von der Entfernung des N-Schutzes, führt zu einem ähnlichen Dipeptid-Derivat, das ebenfalls an das Polymer gebunden ist:
Ein solcher zweistufiger Zyklus (Entschützung – Aminoacylierung) kann im Prinzip so oft wie nötig wiederholt werden, um eine Polypeptidkette einer gegebenen Länge aufzubauen.
Die Weiterentwicklung von Merifields Ideen richtete sich zunächst auf die Suche nach und Schaffung neuer Polymermaterialien für Substrate, die Entwicklung von Verfahren zur Trennung von Produkten und die Schaffung automatisierter Anlagen für den gesamten Zyklus der Polypeptidsynthese.
Die Wirksamkeit der Merifield-Methode wurde durch die erfolgreiche Synthese einer Reihe natürlicher Polypeptide, insbesondere Insulin, demonstriert. Besonders deutlich wurden seine Vorteile am Beispiel der Synthese des Enzyms Ribonuklease demonstriert. So führten beispielsweise Hirschmann und 22 Mitarbeiter mit erheblichem Aufwand über mehrere Jahre die Synthese des Enzyms Ribonuklease (124 Aminosäurereste) mit traditionellen Flüssigphasenmethoden durch. Fast zeitgleich wurde das gleiche Protein durch automatisierte Festphasensynthese erhalten. Im zweiten Fall wurde die Synthese, die insgesamt 11.931 verschiedene Operationen umfasste, darunter 369 chemische Reaktionen, von zwei Teilnehmern (Gatte und Merrifield) in nur wenigen Monaten durchgeführt.
Merrifields Ideen dienten als Grundlage für die Schaffung verschiedener Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Bibliotheken von Polypeptiden verschiedener Strukturen.
So wurde 1982 eine originelle Strategie zur mehrstufigen Parallelsynthese von Peptiden an der Festphase vorgeschlagen, die als „Split-Methode“ bekannt ist ( Teilt- Splitten, Trennen) oder das „Mix and Split“-Verfahren (Abb. 3). Sein Wesen ist wie folgt. Nehmen wir an, dass Sie aus drei Aminosäuren (A, B und C) alle möglichen Kombinationen von Tripeptiden erhalten müssen. Dazu wird das Granulat eines festen Polymerträgers (P) in drei gleiche Portionen geteilt und mit einer Lösung einer der Aminosäuren behandelt. Dabei sind alle Aminosäuren durch eine ihrer funktionellen Gruppen chemisch an die Oberfläche des Polymers gebunden. Die erhaltenen Polymere der drei Qualitäten werden gründlich gemischt, und die Mischung wird erneut in drei Teile geteilt. Dann wird jeder Teil, der alle drei Aminosäuren in gleichen Mengen enthält, erneut mit einer der gleichen drei Aminosäuren behandelt und es werden neun Dipeptide erhalten (drei Mischungen von jeweils drei Produkten). Ein weiteres Mischen, Teilen in drei gleiche Teile und Behandlung mit Aminosäuren ergibt die gewünschten 27 Tripeptide (drei Mischungen von neun Produkten) in nur neun Stufen, während ihre getrennte Gewinnung eine Synthese von 27 × 3 = 81 Stufen erfordern würde.
"Biologe. Zeitschrift Armenia, 1 (65), 2013 FESTPHASENSYNTHESE VON HERZAKTIVEM PEPTID, ISOLIERT AUS SCHWEINEATRIUM G.S. CHAILYAN Institut für Biochemie. Bunyatyan NAS RA..."
Experimentelle und theoretische Artikel
Experimentelle und theoretische Artikel
Biologe. Zeitschrift Armenien, 1 (65), 2013
FESTPHASE-SYNTHESE VON HERZPEPTID,
ISOLIERT VOM SCHWEINEATRIUM
GS CHAILYAN
Institut für Biochemie. Bunyatyan NAS RA
Um weiter zu forschen acad. Galoyan führten wir eine Reihe von Experimenten durch, um neu isolierte Peptidverbindungen aus den Vorhöfen und Ohrmuschelteilen des Schweineherzens zu isolieren, zu reinigen und die biologische Orientierung zu bestimmen. Zur Durchführung von Biotests war es notwendig, präparative Mengen der untersuchten Proben zu erhalten. Dazu haben wir die Methode der Festphasensynthese von Peptiden mit ihrer weiteren Modifikation verwendet. Die Reinheit und Identität der synthetisierten Präparate wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektralanalyse überprüft.
Festphasensynthese - fmoc-Aminosäuren - HPLC - Phenylisothiocyanat - Massenspektralanalyse:
fmoc- – – Für weitere von Galoyan etablierte Studien wurde eine Reihe von Experimenten zur Isolierung, Reinigung und Bestimmung der biologischen Richtung von aus Schweinevorhöfen isolierten Peptiden durchgeführt. Zur Erfüllung der Biotests wurde die präparative Probenmenge benötigt. Es wurde ein modifiziertes Verfahren der Festphasen-Peptidsynthese verwendet. Die Reinheit und Identität des synthetisierten Peptids wurden durch HPLC und Massenspektralanalyse definiert.
Festphasensynthese – Hochleistungsflüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie – fmoc-Aminosäuren – Cardiopeptide – Vorhöfe Galoyan et al untersuchten die Regulationswege und Wirkungsmechanismen von hypothalamischen Neurohormonen auf verschiedene Prozesse im Körper.
Die Bestätigung der Idee des miteinander verbundenen, voneinander abhängigen, integralen Funktionierens eines solchen Systems wie Hypothalamus - Hypophyse - Nebennieren war ein Wendepunkt in der Endokrinologie. Ergänzung dieses Konzepts FESTPHASENSYNTHESE EINES AUS DEM SCHWEINEATRIUM ISOLIERTEN HERZAKTIVEN PEPTIDS der von Galoyan vorgeschlagenen Triade bezüglich der Interaktion von Hypothalamus - Hypophyse
– Herz, ist eine enorme wissenschaftliche Leistung. Anschließend wurde ein neues Gewebe-Ziel-Herz entdeckt, die Fähigkeit dieses Organs, die Funktion spezifischer Peptide zu kontrollieren, sowie die Existenz eines Rückkopplungsmechanismus zwischen dem Hypothalamus und dem Herzen durch diese Peptide gezeigt.
Die Entdeckung kardioaktiver Verbindungen - die Neurohormone K, C, G und eine Reihe anderer - im Hypothalamus verschiedener Tiere diente als Beginn der Arbeit nicht nur zur Untersuchung der molekularen Wirkungsmechanismen dieser Neurohormone, sondern auch zur Suche für ähnliche Verbindungen im Herzen. Die Grundlage für eine umfassende Untersuchung der biochemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften kardioaktiver Prinzipien waren die Daten über das Vorhandensein von 2 kardioaktiven Verbindungen im Herzmuskel. Die Beteiligung des Neurohormons „C“ an der Regulation glykolytischer Prozesse und des Spiegels zyklischer Nukleotide wurde durch Hemmung von PDE cAMP, cAMP-abhängiger Proteinkinase usw. festgestellt. Diese Verbindung hat sich als niedermolekular erwiesen und gehört zu den Glykopeptiden.
Im Labor für Analytische Chromatographie und Peptidsynthese haben wir Arbeiten zur Isolierung und Aufreinigung von Peptidverbindungen aus den Vorhöfen und Ohrmuschelbereichen des Schweineherzens durchgeführt. Während der Trennung von Peptidfraktionen durch präparative HPLC haben wir 20 Verbindungen mit Peptidnatur isoliert und bis zu einem homogenen Zustand gereinigt. Zur Bestimmung des biologischen Fokus wurden alle Präparate auf Veränderungen von EKG-Komponenten bei Ratten getestet. Die Ergebnisse der Experimente zeigten, dass 7 Verbindungen vielseitige Einflussfaktoren auf bestimmte Komponenten des EKG haben.
Peptid Nr. 7 zeigte die größte Aktivität bei der Änderung der Amplitude der R-Komponente, der Dauer des QRS-Komplexes, der S-Amplitude und anderer Parameter.
Um die biologischen Wirkungsmechanismen dieses Medikaments zu untersuchen, wurde es notwendig, eine große Menge der Testprobe zu haben. Aufgrund der Tatsache, dass der Prozess der Isolierung und Reinigung biologischer Produkte äußerst ineffizient, mühsam und zeitaufwändig ist und keine gute Reproduzierbarkeit bieten kann, ist es äußerst wichtig geworden, die chemische Synthese dieses Arzneimittels durchzuführen. Bei der Analyse der Weltliteratur auf dem Gebiet der chemischen Synthese von Peptiden kamen wir zu dem Schluss, dass die Methode der Festphasensynthese unter Verwendung von fmoc-geschützten Aminosäuren für uns am optimalsten ist. Die 1984 entdeckte Festphasen-Peptidsynthese hat viele Vorteile gegenüber der konventionellen Synthese in Bezug auf Effizienz sowie bequeme Verarbeitung und Reinigung.
Unter Verwendung verschiedener Methoden: Hydrolyse dieses Medikaments, Modifikation von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat, erhielten wir die Aminosäurezusammensetzung von Peptid Nr. 7. Unter Verwendung der Daten von Massenspektral- und NMR-Analysen, Edmon-Abbau, konnten wir nicht nur die Aminosäurezusammensetzung, sondern auch die Aminosäuresequenz von Peptid Nr. 7 erhalten.
Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Ein effizientes Festphasen-Syntheseverfahren hängt weitgehend von der richtigen Wahl verschiedener Bedingungen für seine Durchführung ab, wie etwa der Wahl des Harzes, des Lösungsmittels und der Synthesekinetik. Diese Variablen beeinflussen den Quellungsgrad des Harzes und seine Assoziation mit Aminosäuren, die Anzahl der Bindungsstellen, was letztendlich die Synthese des Peptids als Ganzes beeinflusst. Wir haben den Prozess der Festphasensynthese in Bezug auf unsere untersuchten Peptide angepasst und dabei die Besonderheiten ihrer Aminosäuresequenz berücksichtigt.
GS CHAILYAN Material und Methoden. Alle verwendeten Reagenzien, Lösungsmittel und Harze stammen von Advanced Chem Techcompany. Wir verwendeten fmoc-Gruppen, um den N-Terminus von Aminosäuren während der Synthese zu schützen, und Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel während der gesamten Synthese. Als Substrat verwendeten wir säurelabiles 2-Chlortritylharz. Die Entfernung der fmoc-Schutzgruppen wurde unter Verwendung einer Lösung von Piperidin in DMF durchgeführt.
Sehr wichtig im Syntheseprozess ist die Landung der ersten Aminosäure auf dem Harz. Zwei Gramm 2Cl-Trt-Harz wurden in eine 10-ml-Spritze gegossen. DMF wurde in die Spritze aufgezogen, das Harz wurde 15 Minuten quellen gelassen. Danach wurde das DMF ausgewaschen. Dann wurde eine Lösung der ersten Aminosäure (fmoc-Pro) und eines Reaktionsaktivators (DIPEA) in einem Verhältnis von 1 RESIN/1,2 FMOC-PRO/4DIPEA in die Spritze aufgezogen. Die Reaktion des Einpflanzens der ersten Aminosäure dauerte 3 Stunden.Eine sehr wichtige Bedingung für die Synthese ist das Fehlen freier Linkernach dem Einpflanzen der ersten Aminosäure, daher wurde das Harz nach Bindungan die erste Aminosäure mit einer Mischung von behandelt Methylen, DIPEA (Diisopropylethylamin) und DMF im Verhältnis 80DMF/15MEOH/5DIPEA, um eventuell verbleibende freie Enden zu blockieren. Danach wurde das Harz fünfmal 5 Minuten lang mit DMF gewaschen. Dann wurden Aminosäuren mit einer 30%igen Lösung von Piperidin in DMF 8-mal für 5 Minuten deblockiert. Danach wurde das Harz fünfmal 5 Minuten lang mit DMF gewaschen. Dieser Zyklus wurde während der gesamten Synthese des Peptids wiederholt. Nach jedem Aminosäure-Additions- und Deblockierungsschritt wurde der Reaktionsfortschritt durch den Kaiser-Test überwacht, der die Reaktion von Ninhydrin mit einer freien Aminogruppe ist, um eine charakteristische dunkelblaue Farbe zu bilden. Dank dieses Tests wurde es möglich, die Reaktionen des Ladens und Deblockierens von Aminosäuren schrittweise zu kontrollieren.
Reinigung und Kontrolle des synthetisierten Peptids Nr. 7 wurden auf einem präparativen 2-Komponenten-HPLC-System der Firma Waters (USA) durchgeführt. Ein Rheodyne-Injektor mit einem Schleifenvolumen von 500 &mgr;l wurde verwendet, um die Probe zu injizieren. Die Detektion erfolgte im Bereich von 190–360 nm. Wir verwendeten eine "Symmetry Si-100 C18" (4,6 x 250 mm) Säule für Umkehrphasen-HPLC. Die Fließgeschwindigkeit betrug 50 ml/min. Es wurde ein Gradienteneluentsystem H2O/ACN/TFA (98/2/0,1) / (0,100,0,1) verwendet. Analysezeit 15 min. Die erneute Chromatographie wurde auf einem analytischen Knauer-HPLC-System durchgeführt. Es wurde eine XbridgeC18-Säule (2,6 x 150 mm) verwendet. Die Detektion wurde bei 214 nm durchgeführt.
Um die erhaltenen Daten zu bestätigen, wurde das synthetisierte Präparat einer Massenspektralanalyse auf dem CSU "Analitycal Spectrometry" unterzogen.
Resultate und Diskussion. Die auf dem Chromatogramm erhaltenen Daten legen nahe, dass die Reinheit des synthetisierten Peptids Nr. 7 nach der Reinigung mehr als 99,6 % beträgt (Fig. 1).
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Wir führten eine vergleichende chromatographische Analyse des nativen Peptids Nr. 7 auf einer X-Bridge-C18-Säule unter den gleichen Bedingungen wie sein synthetisiertes Analogon durch. Die Vergleichsergebnisse werden dargestellt (Abb. 2).
Festphasensynthese eines aus Schweinevorhöfen isolierten kardioaktiven Peptids
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Reis. Abb. 4. Spektrogramme von synthetisierten (A) und nativen (B) Präparaten.
GS CHAILYAN Wie aus dem Vergleich der Chromatogramme ersichtlich ist, sind das synthetisierte Analogon und das native Peptid Nr. 7 in Masse und Freisetzungszeit identisch, was die Identität ihrer Strukturen und Aminosäuresequenz anzeigt. So gelang es uns, unter Verwendung der Methode der Festphasen-Peptidsynthese und unter Berücksichtigung der strukturellen Merkmale des untersuchten Peptids, ein homogenes und mit dem nativen Peptid identisches Peptid zu erhalten, das aus 9 Aminosäuren besteht. Wenn wir in Zukunft über eine ausreichende Menge des Medikaments verfügen, planen wir, eine Reihe von Biotests durchzuführen, um nicht nur die Wege zur Regulierung der Herzaktivität durch dieses Peptid, sondern auch die Wirkungsmechanismen auf andere Organe und Systeme zu identifizieren.
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Ähnliche Werke:
« COMMUNITIES VERLAG "NAUKA" Moskau 1979 UDC 581.55:56.017 Plot n i k v VV Entwicklung der Struktur von Pflanzengemeinschaften. M.: Nauka, p. 1979, 276 Auf modernem Metall...»
„Iswestija des Museumsfonds. AA Brauner №2 Band I 2004 Proceedings of the Museum Fund. A. A. Brauner Band I Nr. 2 2004 Wissenschaftliche Zeitschrift Gegründet im Dezember 2003 Erscheint 4 x jährlich Staatliche Registrierungsbescheinigung OD Nr. 913 vom 13.12.2003 Gründer und Herausgeber ... "
Ministerium für Bildung und Wissenschaft der Russischen Föderation
Föderale staatliche autonome Bildungseinrichtung für höhere Berufsbildung "Ural Federal University benannt nach dem ersten Präsidenten Russlands B. N. Jelzin"
Institut für Technologie der Organischen Synthese
Abstract zum Thema: „Prinzipien und Methoden der Festphasensynthese. Synthese von Peptiden »
Aufgeführt von Schüler Gr. Х-300803
Shaikhutdinova A.I.
Geprüft von Berseneva V.S.
Jekaterinburg 2013
1 Einführung
2. Was sind Peptide? ......................................... ... ................................................4
2.1. Die Struktur von Peptiden …………………………………………………………….5
2.2. Synthese von Peptiden ……………………………………………………………….7
3. Festphasensynthese von Peptiden………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………
3.1. Merrinfield-Methode…………………………………………………………10
3.2. Fester Untergrund ………………………………………………………….14
3.3. Substratauswahl………………………………………………………...14
3.4. Linker…………………………………………………………………….16
4. Die erste Synthese eines natürlichen Hormons – Oxytocin……………………….22
5. Synthese von Insulin in der Zelle………………………………………………………..30
6. Fazit ……………………………………………………………………..34
7. Literatur……………………………………………………………………...35
Einführung
In der organischen Chemie gibt es keine einzige Reaktion, die in der Praxis in jedem Fall quantitative Ausbeuten an Zielprodukten liefert. Die einzige Ausnahme scheint die vollständige Verbrennung organischer Substanzen in Sauerstoff bei hoher Temperatur zu CO 2 und H 2 O zu sein. Daher ist die Reinigung des Zielprodukts eine komplexe und zeitaufwändige Aufgabe. Beispielsweise ist die 100%ige Reinigung von Peptidsyntheseprodukten ein unlösbares Problem. Tatsächlich galt die erste vollständige Synthese eines Peptids, des Hormons Oxytocin (1953), das nur 8 Aminosäurereste enthielt, als herausragende Leistung, die seinem Autor V. du Vignot 1955 den Nobelpreis einbrachte 20 Jahren ist die Synthese von Polypeptiden dieser Komplexität zur Routine geworden, so dass heute die Synthese von Polypeptiden, die aus 100 oder mehr Aminosäureresten bestehen, nicht mehr als unlösbare Aufgabe angesehen wird.
Der Zweck der Arbeit: zu zerlegen und zu erklären: "Was verursachte solch dramatische Veränderungen auf dem Gebiet der Polypeptidsynthese?"
Was sind Peptide?
Peptide sind natürliche oder synthetische VerbindungenMoleküledie aus den Überresten gebaut werdenAlpha-Aminosäuren, die durch Peptid-(Amid)-Bindungen C (O) NH miteinander verbunden sind. Kann in enthaltenMolekülauch eine Nicht-Aminosäure-Komponente (zum Beispiel ein RestKohlenhydrat). Je nach Anzahl der Aminosäurereste inMoleküle Peptide, unterscheiden zwischen Dipeptiden, Tripeptiden, Tetrapeptiden usw. Peptide mit bis zu 10 Aminosäureresten werden als Oligopeptide bezeichnet, solche mit mehr als 10 Aminosäureresten als Polypeptide. Polypeptidemit einem Molekulargewicht von mehr als 6 Tausend genannt werdenProteine.
Erstmals wurden Peptide aus enzymatischen Proteinhydrolysaten isoliert. Der Begriff "Peptide" wurde von E. Fisher vorgeschlagen. Das erste synthetische Peptid wurde 1881 von T. Curtius erhalten. E. Fisher entwickelte 1905 das erste allgemeine Verfahren zur Synthese von Peptiden und synthetisierte eine Reihe von Oligopeptiden verschiedener Strukturen. Der aktuelle Beitrag zur Entwicklung der Peptidchemie wurde von E. Fischers Studenten E. Abdergalden, G. Leike und M. Bergman geleistet. 1932 verwendeten Bergman und L. Zervas die Benzyloxycarbonylgruppe (Carbobenoxygruppe) bei der Synthese von Peptiden, um die alpha-Aminogruppen von Aminosäuren zu schützen, was eine neue Stufe in der Entwicklung der Peptidsynthese markierte. Die erhaltenen N-geschützten Aminosäuren (N-Carbobenoxyaminosäuren) wurden weithin verwendet, um verschiedene Peptide zu erhalten, die erfolgreich verwendet wurden, um eine Reihe von Schlüsselproblemen in der Chemie und Biochemie dieser Substanzen zu untersuchen, beispielsweise um die Substratspezifität von zu untersuchen proteolytische Enzyme. Unter Verwendung von N-Carbobenoxyaminosäuren wurden erstmals natürliche Peptide (Glutathion, Carnosin etc.) synthetisiert. Eine wichtige Errungenschaft auf diesem Gebiet wurde in den frühen 50er Jahren entwickelt. P. Vaughan et al.Synthesis of peptides by the mixed anhydride method.
1953 synthetisierte V. Du Vigno das erste Peptidhormon Oxytocin. Basierend auf dem 1963 von P. Merrifield entwickelten Konzept der Festphasen-Peptidsynthese wurden automatische Peptid-Synthesizer entwickelt. Verfahren zur kontrollierten enzymatischen Synthese von Peptiden wurden intensiv entwickelt. Die Verwendung neuer Methoden ermöglichte die Synthese des Hormons Insulin usw.
Fortschritte in der synthetischen Chemie von Peptiden wurden durch Fortschritte in der Entwicklung solcher Verfahren zur Trennung, Reinigung und Analyse von Peptiden wie Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese auf verschiedenen Medien, Gelfiltration, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), immunchemische Analyse vorbereitet usw. Methoden der Endgruppenanalyse und Methoden der schrittweisen Spaltung von Peptiden. Insbesondere wurden automatische Aminosäureanalysatoren und automatische Geräte zur Bestimmung der Primärstruktur von Peptiden, die sogenannten Sequenzer, geschaffen.
Die Peptidbindung hat die Eigenschaften einer partiellen Doppelbindung. Dies äußert sich in einer Abnahme der Länge dieser Bindung (0,132 nm) im Vergleich zur Länge einer einfachen CN-Bindung (0,147 nm). Die teilweise doppelverknüpfte Natur der Peptidbindung macht es Substituenten unmöglich, sich frei um sie herum zu drehen, so dass die Peptidgruppe planar ist und normalerweise eine trans-Konfiguration (Form I) hat. Das Rückgrat der Peptidkette ist also eine Reihe von starren Ebenen mit einem beweglichen ("Scharnier") Gelenk an der Stelle, an der sich die asymmetrischen C-Atome befinden (angezeigt durch einen Stern im Abschnitt I).
In Peptidlösungen wird eine bevorzugte Bildung bestimmter Konformere beobachtet. Bei der Kettenverlängerung erhalten geordnete Elemente der Sekundärstruktur eine ausgeprägtere Stabilität (ähnlich wie Proteine). Die Ausbildung einer Sekundärstruktur ist besonders typisch für reguläre Peptide, insbesondere für Polyaminosäuren.
Eigenschaften
Oligopeptide ähneln in ihren Eigenschaften Aminosäuren, Polypeptide ähneln Proteinen. Oligopeptide sind in der Regel kristalline Substanzen, die sich beim Erhitzen auf 200-300 0 C zersetzen. Sie sind gut löslich in Wasser, verdünnten Säuren und Laugen, fast unlöslich in organischen Lösungsmitteln. Ausnahmen sind Oligopeptide, die aus hydrophoben Aminosäureresten aufgebaut sind.
Oligopeptide haben amphotere Eigenschaften und können je nach Acidität des Mediums in Form von Kationen, Anionen oder Zwitterionen vorliegen. Die Hauptabsorptionsbanden im IR-Spektrum für die NH-Gruppe sind 3300 und 3080 cm -1 , für die C=O-Gruppe 1660 cm -1 . Im UV-Spektrum liegt die Absorptionsbande der Peptidgruppe im Bereich von 180-230 nm. Der isoelektrische Punkt (pI) von Peptiden variiert stark und hängt von der Zusammensetzung der Aminosäurereste im Molekül ab. Die pKa-Werte der Peptide liegen für a-COOH bei ca. 3, für -H 2 ca. 8.
Die chemischen Eigenschaften von Oligopeptiden werden durch die darin enthaltenen funktionellen Gruppen sowie durch die Beschaffenheit der Peptidbindung bestimmt. Ihre chemischen Umwandlungen ähneln weitgehend den entsprechenden Reaktionen von Aminosäuren. Sie ergeben eine positive Biuret-Reaktion und eine Ninhydrin-Reaktion. Dipeptide und ihre Derivate (insbesondere Ester) lassen sich leicht cyclisieren und werden zu Diketopiperazinen. Unter Einwirkung von 5,7 normaler Salzsäure werden die Peptide innerhalb von 24 Stunden bei 105 0 C zu Aminosäuren hydrolysiert.
Synthese von Peptiden
Bei der Peptidsynthese werden aus der organischen Chemie bekannte Reaktionen zur Herstellung von Amiden und speziell entwickelte Methoden zur Synthese von Peptiden eingesetzt. Für die erfolgreiche Durchführung dieser Synthesen ist es notwendig, die Carboxylgruppe zu aktivieren, d.h. erhöhen die Elektrophilie des Carbonylkohlenstoffs. Dies wird durch chemische Modifikation der Carboxylgruppe von Aminosäuren erreicht. Die Art einer solchen Modifikation bestimmt normalerweise den Namen des Peptidsyntheseverfahrens.
1. Chlorid-Methode.
Das Verfahren basiert auf der Reaktion zur Gewinnung von Amiden durch die Wechselwirkung von Säurechloriden mit den entsprechenden Aminen. Auf diese Weise wurden die ersten Peptide erhalten. Derzeit wird dieses Verfahren äußerst selten angewendet, da es mit der Bildung von Nebenprodukten und Racemisierung von Peptiden einhergeht.
2. Azid-Methode
Ausgangsmaterial bei diesem Verfahren ist meist der Ethylester einer N-geschützten Aminosäure, aus dem Hydrazid gewonnen wird, das mit Natriumnitrit in Gegenwart von Salzsäure in Säureazid überführt wird. Bei der Reaktion wird üblicherweise Hydrazin verwendet, bei dem einer der Stickstoffe durch eine Schutzgruppe (Z-Carbobenoxy- oder Carbotretbutyloxygruppe) blockiert ist, was die Bildung von Seitendihydraziden vermeidet. Azide interagieren mit C-geschützten Aminosäuren unter milden Bedingungen, um Peptide zu bilden.
Die Racemisierung wird bei diesem Verfahren minimiert, es können jedoch Nebenreaktionen auftreten, nämlich: Azide können sich zu Isocyanaten umlagern, die wiederum bei Wechselwirkung mit einem als Lösungsmittel verwendeten Alkohol Urethane bilden.
3. Gemischte Anhydride
Gemischte Aminosäureanhydride mit Kohlensäurederivaten, die beispielsweise unter Verwendung von Isobutylchlorcarbonat erhalten werden, haben eine breite Anwendung in der Peptidsynthese gefunden: 
Die Reaktion in dieser Synthese wird ziemlich schnell bei einer niedrigen Temperatur (–10 bis –20°C) durchgeführt, was die Möglichkeit der Bildung von Nebenprodukten und Racemisierung deutlich reduziert. Die schnelle schrittweise Synthese von Peptiden unter Verwendung gemischter Anhydride wird als REMA-Synthese bezeichnet. Bildungsverfahren unter Verwendung von gemischten Anhydriden werden weitverbreitet in der Festphasensynthese von Peptiden verwendet.
Daher erfordert die Durchführung der Peptidsynthese die Berücksichtigung und strikte Einhaltung bestimmter Faktoren. Um die Bildung von Nebenprodukten und Racemisierung zu reduzieren, werden daher die folgenden typischen Bedingungen für die Reaktion der Peptidbindungsbildung empfohlen:
1) das Verfahren muss bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, die Reaktionszeit muss minimal sein;
2) die Reaktionsmasse sollte einen nahezu neutralen pH-Wert haben;
3) als säurebindende Reagenzien werden organische Basen wie Piperidin, Morpholin etc. verwendet;
4) Die Durchführung der Reaktion ist wünschenswerterweise in wasserfreien Medien.
Festphasensynthese
Festphasensynthese - ein methodischer Ansatz zur Synthese von Oligomeren (Polymeren) unter Verwendung von festem Unlöslichem Träger, das ein organisches oder anorganisches Polymer ist.
In den frühen 1960er Jahren wurde ein neuer Ansatz vorgeschlagen, um die bei der Peptidsynthese auftretenden Isolierungs- und Reinigungsprobleme zu lösen. Später hat der Autor der Entdeckung dieses Ansatzes, R.B. Merrifield beschrieb in seinem Nobelvortrag, wie es dazu kam: „Eines Tages hatte ich die Idee, wie das Ziel einer effizienteren Peptidsynthese erreicht werden könnte. Der Plan war, die Peptidkette schrittweise zusammenzubauen, wobei die Kette während der Synthese mit einem Ende an einem festen Träger befestigt wird.“ Als Ergebnis wurde die Isolierung und Reinigung von Zwischen- und Zielpeptidderivaten auf eine einfache Filtration und gründliches Waschen des festen Polymers reduziert, um alle überschüssigen Reagenzien und Nebenprodukte, die in Lösung verbleiben, zu entfernen. Eine solche mechanische Operation kann quantitativ durchgeführt, leicht standardisiert und sogar automatisiert werden. Betrachten wir dieses Verfahren genauer.
FESTPHASENSYNTHESE,
methodisch Ansatz zur Synthese von Oligo(polymer)meren unter Verwendung eines festen unlöslichen Trägers (N.), der ein org. oder anorg. Polymer. Das heißt, es basiert auf der Tatsache, dass die erste Verknüpfung des zukünftigen Oligomers kovalent an die "Anker"-Gruppe H gebunden ist. Die Kettenverlängerung wird mit standardmäßig geschützten Monomeren gemäß den üblichen Schemata durchgeführt, die für die Synthese in Lösungen verwendet werden. Schlussfolgern. Synthesestufe. das Oligomer wird von N. abgespalten und durch geeignete Methoden gereinigt. T. s. in der Hauptsache verwendet um Polypeptide, Oligonukleotide und Oligosaccharide zu erhalten.
Während der Synthese von Polypeptiden wie N. naib. Weit verbreitet ist ein Copolymer aus Styrol und 1–2 % Divinylbenzol, modifiziert durch die Einführung einer Dimethoxybenzylchlorid-Ankergruppe, um die erste (mit einer geschützten NH 2 -Gruppe) am C-Terminus zu befestigen, zum Beispiel:
Nach Entfernung der N-Schutzgruppe erfolgt die Verlängerung der Polypeptidkette nach Standardmethoden der Peptidsynthese in Lösung (vgl. Peptide). Als Kondensationsmittel Naib. verwenden häufig Aminosäuren oder wandeln sie vorab in Aktivatoren um. Äther.
Bei der Synthese von Oligonukleotiden werden makroporöse Gläser oder als N.. Die Ankergruppe ist eine Carboxylgruppe, getrennt von N. spec. "Bein", zum Beispiel:
B-Purin oder Pyrimidinbase
In der ersten Stufe wird das Nukleosid an der 3"-Hydroxylgruppe der Desoxyribose an den Träger gebunden, wobei die Hydroxylgruppe in Position 5" durch die Dimethoxytritylgruppe (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H) geschützt ist 5) C (DMTr); die Menge des letzteren nach seiner Abspaltung wird leicht spektrophotometrisch gemessen, was als Quantität dient. charakteristisch für die Beladung des Trägers und ermöglicht die Auswertung der Ausbeuten in den nachfolgenden Phasen des Aufbaus der Oligonukleotidkette. Nach Abspaltung der DMTr-Gruppe erfolgt der Kettenaufbau mit Phosphitamiden (Fl. I; M. Kaposers, 1980) oder Phosphonaten (Hydrophosphonaten) (II; R. Stremberg, 1986):
Für T.'s Umsetzung mit. Hohe Ausbeuten (auf dem Niveau von 96-99 %) sind auf jeder Stufe des Distrikts erforderlich, ebenso wie effektive Methoden zur Reinigung und Isolierung von Synthesizern. Verbindungen.
Die Verwendung einer Festphase ermöglicht es, jede Stufe des Oligomerkettenwachstums erheblich zu vereinfachen und zu beschleunigen, da die Abtrennung von überschüssigen Komponenten, Kondensationsmitteln und Nebenprodukten in der Lösung durch Filtrieren der Reaktionen erreicht wird. Mischungen und Waschen N. mit einem geeigneten Lösungssatz. Der Prozess des Aufbaus der Oligomerkette gliedert sich also in eine Reihe von Standardoperationen: Deblockieren des wachsenden Kettenendes, Dosierung des nächsten geschützten Monomers und Kondensationsmittels, Zuführen dieser Mischung zur N.-Säule für die berechnete Zeit und Waschen aus dem N. mit einem geeigneten Lösungsmittel. Der Zyklus des Aufbaus einer monomeren Verknüpfung m. b. automatisiert.
Das Herzstück der Automatik Abschlussball. Synthesizer ist ein allgemeiner Schaltplan (vgl. Abb.). Zahlreiche Synthesizer-Modelle unterscheiden sich in der Konstruktion der Säulen und ihrer Anzahl, der Methode der Zufuhr von Reagenzien und Lösungsmitteln usw. Die Steuerung und Programmierung erfolgt über einen eingebauten oder entfernten Computer.
Schematische Darstellung des Automaten. Abschlussball. Synthesizer (elektrische Steuerleitung ist durch eine gepunktete Linie gekennzeichnet): 1 - Monomerversorgungsleitung (M 1, M N) und einem Kondensationsmittel (CA); 2-Strang für die Zufuhr von Reagenzien (z. B. Oxidationsmittel, Acylierungsmittel, to-t usw.) und p-Lösungsmitteln (P 1, P N); 3 - Schaltventile; 4-Säulen mit Medien, bestückt mit verteilen. Ventil; 5-photometrisch Zelle; 6 Meter; 7-Steuer- und Programmiereinheit; 8-Anzeige.
Die potenziellen Möglichkeiten von T. E. wurden durch die Synthese von A (R. Merrifield, 1969) und menschlichem Wachstumshormon (D. Yamashiro, 1970) mit einer Länge von 124 bzw. 183 Aminosäuren demonstriert. Aufgrund der kleinen, aber konstanten Racemisierung, die während der Bildung einer Peptidbindung auftritt, sind Synthesizer. besitzen niedrige Biol. Aktivität, also automatisch. Synthesizer werden von Ch verwendet. Arr. um kurze Polypeptide (10-30 Verknüpfungen) zu erhalten, unter anderem für die präparative Proteinsynthese (1g).
Das heißt, von Merrifield (1962) für die Synthese von Polypeptiden vorgeschlagen und in die Praxis umgesetzt und dann auf die Synthese von Oligonukleotiden (R. Letzinger, 1964) und Oligosacchariden (A. Patchornik, 1973) ausgedehnt.
Es gibt noch einen weiteren wichtigen Aspekt der Verwendung von N. zur Durchführung von pl. org. p-tionen (, Halogenierung usw.). In diesem Fall die modifizierte N. wirkt als polymeres Reagens oder Katalysator, und alle Umwandlungen des Substrats finden in Lösung statt. Beispielsweise wird die P-tion von ROP(O)(OH) 2 -Phosphaten mit Alkoholen unter Verwendung von vernetztem Polystyrol, das mit einer Sulfochloridgruppe modifiziert ist, als Kondensationsmittel durchgeführt.
Zündete.: Chemie der Polypeptide, trans. aus Englisch, M., 1977; Polyner-unterstützte Reaktionen in der organischen Synthese, hrsg. von P. Hodge, DC Sherington, Chichester, 1980; Oligonukleotidsynthese, ein praktischer Ansatz. Washington, 1984. B.K. Potapov.
Chemische Enzyklopädie. - M.: Sowjetische Enzyklopädie. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .
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Festphasensynthese- Kombinatorische chemische Technik zur Synthese verschiedener Verbindungen, die feste Träger zur Trennung der Verbindungen während der Synthese verwendet und dadurch die Identifizierung der resultierenden Verbindungen vereinfacht)
