A síntese combinatória pode ser realizada não apenas em solução (síntese em fase líquida), mas também na superfície de uma fase sólida quimicamente inerte. Neste caso, o primeiro material de partida é quimicamente “ligado” aos grupos funcionais na superfície do carreador de polímero (na maioria das vezes, uma ligação éster ou amida é usada) e tratado com uma solução do segundo material de partida, que é retirado em excesso significativo para que a reação seja completada. Há uma certa conveniência nesta forma de reação, uma vez que a técnica de isolamento de produtos é facilitada: o polímero (geralmente na forma de grânulos) é simplesmente filtrado, lavado cuidadosamente dos restos do segundo reagente e o composto alvo é clivada quimicamente a partir dele.
Em química orgânica, não há uma única reação que, na prática, forneça rendimentos quantitativos de produtos alvo em qualquer caso. A única exceção é, aparentemente, a combustão completa de substâncias orgânicas em oxigênio em alta temperatura para CO 2 e H 2 O. Portanto, a purificação do produto alvo é sempre uma tarefa indispensável e muitas vezes a mais difícil e demorada. Uma tarefa particularmente difícil é o isolamento de produtos da síntese peptídica, por exemplo, a separação de uma mistura complexa de polipeptídeos. Portanto, é na síntese de peptídeos que o método de síntese em substrato de polímero sólido, desenvolvido no início da década de 1960 por R. B. Merifield, se tornou mais amplamente utilizado.
O carreador de polímero no método de Merrifield é um poliestireno granular reticulado contendo grupos clorometil em anéis de benzeno, que são ligantes que ligam o suporte ao primeiro resíduo de aminoácido do polipeptídeo. Esses grupos transformam o polímero em um análogo funcional do cloreto de benzila e conferem a ele a capacidade de formar facilmente ligações éster após a reação com ânions carboxilato. A condensação de tal resina com aminoácidos N-protegidos leva à formação dos correspondentes ésteres benzílicos. A remoção da proteção N de dá um derivado C-protegido do primeiro aminoácido covalentemente ligado ao polímero. A aminoacilação do grupo amino liberado com o derivado N-protegido do segundo aminoácido, seguido pela remoção da proteção N, resulta em um derivado dipeptídeo semelhante também ligado ao polímero:
Esse ciclo de dois estágios (desproteção - aminoacilação) pode, em princípio, ser repetido quantas vezes forem necessárias para construir uma cadeia polipeptídica de um determinado comprimento.
O desenvolvimento posterior das ideias de Merifield visava principalmente a busca e criação de novos materiais poliméricos para substratos, o desenvolvimento de métodos de separação de produtos e a criação de instalações automatizadas para todo o ciclo de síntese de polipeptídeos.
A eficácia do método Merifield foi demonstrada pela síntese bem sucedida de vários polipeptídeos naturais, em particular insulina. Especialmente claramente suas vantagens foram demonstradas no exemplo da síntese da enzima ribonuclease. Assim, por exemplo, ao custo de esforços consideráveis, ao longo de vários anos, Hirschman e 22 funcionários realizaram a síntese da enzima ribonuclease (124 resíduos de aminoácidos) usando métodos tradicionais de fase líquida. Quase simultaneamente, a mesma proteína foi obtida por síntese automatizada em fase sólida. No segundo caso, a síntese, que incluiu um total de 11.931 operações diferentes, incluindo 369 reações químicas, foi realizada por dois participantes (Gatte e Merrifield) em apenas alguns meses.
As ideias de Merrifield serviram de base para a criação de vários métodos para a síntese combinatória de bibliotecas de polipeptídeos de várias estruturas.
Assim, em 1982, foi proposta uma estratégia original para a síntese paralela em vários estágios de peptídeos na fase sólida, conhecida como “método split” ( dividir- divisão, separação) ou o método “mix and split” (Fig. 3). Sua essência é a seguinte. Digamos que de três aminoácidos (A, B e C) você precisa obter todas as combinações possíveis de tripeptídeos. Para isso, os grânulos de um carreador de polímero sólido (P) são divididos em três porções iguais e tratados com uma solução de um dos aminoácidos. Nesse caso, todos os aminoácidos estão quimicamente ligados à superfície do polímero por um de seus grupos funcionais. Os polímeros obtidos de três graus são completamente misturados e a mistura é novamente dividida em três partes. Em seguida, cada parte, contendo todos os três aminoácidos em quantidades iguais, é novamente tratada com um dos mesmos três aminoácidos e nove dipeptídeos são obtidos (três misturas de três produtos cada). Outra mistura, divisão em três partes iguais e tratamento com aminoácidos dá os 27 tripeptídeos desejados (três misturas de nove produtos) em apenas nove etapas, enquanto obtê-los separadamente exigiria uma síntese de 27 × 3 = 81 etapas.
"Biólogo. revista Armênia, 1 (65), 2013 SÍNTESE DE FASE SÓLIDA DE PEPTÍDEO CARDIOATIVO ISOLADO DE ÁTRIO DE PORCO G.S. Instituto CHAILYAN de Bioquímica. Bunyatyan NAS RA..."
Artigos experimentais e teóricos
Artigos experimentais e teóricos
Biólogo. revista Armênia, 1 (65), 2013
SÍNTESE DE FASE SÓLIDA DE PEPTÍDEO CARDÍACO,
ISOLADO DO ÁTRIO DE PORCO
G.S. CHAILYAN
Instituto de Bioquímica. Bunyatyan NAS RA
A fim de continuar a pesquisa acad. Galoyan, realizamos uma série de experimentos para isolar, purificar e determinar a orientação biológica de compostos peptídicos recém-isolados dos átrios e partes auriculares do coração do porco. Para a realização dos biotestes, foi necessário obter quantidades preparativas das amostras estudadas. Para fazer isso, usamos o método de síntese de peptídeos em fase sólida com sua modificação adicional. A pureza e identidade das preparações sintetizadas foram verificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e análise espectral de massa.
Síntese em fase sólida - fmoc-aminoácidos - HPLC - fenilisotiocianato - análise espectral de massa:
fmoc- – – Para maiores estudos estabelecidos por Galoyan, foi realizada uma série de experimentos sobre o isolamento, purificação e determinação da direção biológica de peptídeos isolados de átrios de porcos. Para o cumprimento dos biotestes foi necessária a quantidade preparativa de amostras. Foi utilizado um método modificado de síntese peptídica em fase sólida. A pureza e identidade do peptídeo sintetizado foram definidas por HPLC e análise de espectro de massa.
Síntese em fase sólida – cromatografia líquida de alta eficiência – espectrometria de massa – fmoc-aminoácidos – cardiopeptídeos – átrios Galoyan e colaboradores estudaram as formas de regulação e mecanismos de ação dos neurohormônios hipotalâmicos em vários processos no corpo.
A confirmação da ideia do funcionamento interconectado, interdependente e integral de um sistema como o hipotálamo - glândula pituitária - glândulas adrenais foi um ponto de virada na endocrinologia. Reabastecimento deste conceito SÍNTESE DE FASE SÓLIDA DE UM PEPTÍDEO CARDÍACO ATIVO ISOLADO DO ÁTRIO PORCO da tríade tual proposta por Galoyan sobre a interação do hipotálamo - glândula pituitária
– coração, é uma grande conquista científica. Posteriormente, descobriu-se um novo tecido-alvo-coração, demonstrou-se a capacidade deste órgão de controlar o funcionamento de peptídeos específicos, bem como a existência de um mecanismo de retroalimentação entre o hipotálamo e o coração por meio desses peptídeos.
A descoberta de compostos cardioativos - o neurohormônio K, C, G e vários outros no hipotálamo de vários animais serviu como o início dos trabalhos não apenas no estudo dos mecanismos moleculares de ação desses neurohormônios, mas também na busca para compostos semelhantes no coração. A base para um estudo abrangente das propriedades bioquímicas e físico-químicas dos princípios cardioativos foram os dados sobre a presença de 2 compostos cardioativos no músculo cardíaco. A participação do neurohormônio “C” na regulação dos processos glicolíticos e no nível de nucleotídeos cíclicos foi estabelecida através da inibição de PDE cAMP, proteína quinase dependente de cAMP, etc. Este composto demonstrou ser de baixo peso molecular e pertence aos glicopeptídeos.
No Laboratório de Cromatografia Analítica e Síntese Peptídica, realizamos trabalhos de isolamento e purificação de compostos peptídicos dos átrios e áreas auriculares do coração do porco. Durante a separação das frações peptídicas por HPLC preparativa, isolamos e purificamos até um estado homogêneo 20 compostos de natureza peptídica. Para determinar o foco biológico, todas as preparações foram testadas quanto a alterações nos componentes do ECG em ratos. Os resultados dos experimentos mostraram que 7 compostos têm fatores versáteis de influência em certos componentes do ECG.
O peptídeo nº 7 apresentou a maior atividade na alteração da amplitude do componente R, a duração do complexo QRS, a amplitude S e outros parâmetros.
Para estudar os mecanismos biológicos de ação desta droga, tornou-se necessário ter uma grande quantidade da amostra de teste. Devido ao fato do processo de isolamento e purificação de produtos biológicos ser extremamente ineficiente, trabalhoso, demorado e não proporcionar boa reprodutibilidade, tornou-se de extrema importância a realização da síntese química deste fármaco. Analisando a literatura mundial no campo da síntese química de peptídeos, chegamos à conclusão de que o mais ideal para nós é o método de síntese em fase sólida usando aminoácidos protegidos por fmoc. Descoberta em 1984, a síntese de peptídeos em fase sólida tem muitas vantagens sobre a síntese convencional em termos de eficiência, bem como processamento e purificação convenientes.
Usando vários métodos diferentes: hidrólise desta droga, modificação de aminoácidos com fenilisotiocianato, obtivemos a composição de aminoácidos do peptídeo nº 7. Usando os dados das análises de espectro de massa e de RMN, degradação de Edmon, conseguimos obter não apenas a composição de aminoácidos, mas também a sequência de aminoácidos do peptídeo nº 7.
Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Um processo de síntese em fase sólida eficiente depende muito da escolha correta de várias condições para sua implementação, como a escolha da resina, solvente e cinética de síntese. Essas variáveis afetam o grau de inchamento da resina e sua associação com aminoácidos, o número de sítios de ligação, o que acaba afetando a síntese do peptídeo como um todo. Adaptamos o processo de síntese em fase sólida em relação aos nossos peptídeos estudados, levando em consideração as peculiaridades de sua sequência de aminoácidos.
G.S. CHAILYAN Material e métodos. Todos os reagentes, solventes e resinas utilizados são da Advanced Chem Techcompany. Usamos grupos fmoc para proteger o terminal N dos aminoácidos durante a síntese e dimetilformamida (DMF) como solvente durante toda a síntese. Usamos resina ácido-lábil 2-clorotritil como substrato. A remoção dos grupos fmoc protetores foi realizada utilizando uma solução de piperidina em DMF.
Muito importante no processo de síntese é o pouso do primeiro aminoácido na resina. Dois gramas de resina 2Cl-Trt foram vertidos em uma seringa de 10 ml. O DMF foi introduzido na seringa, a resina foi deixada inchar durante 15 minutos. Depois disso, o DMF foi lavado. Em seguida, uma solução do primeiro aminoácido (fmoc-Pro) e um ativador de reação (DIPEA) foram inseridos na seringa na proporção de 1 RESINA/1,2 FMOC-PRO/4DIPEA. A reação de plantio do primeiro aminoácido durou 3 horas. Uma condição muito importante para a síntese é a ausência de ligantes livres após o plantio do primeiro aminoácido, portanto, após a ligação ao primeiro aminoácido, a resina foi tratada com uma mistura de metileno, DIPEA (diisopropiletilamina) e DMF na proporção 80DMF/15MEOH/5DIPEA para bloquear possíveis extremidades livres remanescentes. Em seguida, a resina foi lavada com DMF 5 vezes por 5 minutos. Em seguida, os aminoácidos foram desbloqueados com uma solução de piperidina a 30% em DMF 8 vezes por 5 minutos. Em seguida, a resina foi lavada com DMF 5 vezes por 5 minutos. Este ciclo foi repetido ao longo da síntese do peptídeo. Após cada etapa de adição e desproteção de aminoácidos, o controle do progresso da reação foi verificado pelo teste de Kaiser, que é a reação da ninidrina com um grupo amino livre para formar uma cor azul escura característica. Graças a este teste, tornou-se possível o controle passo a passo de reações de carregamento e desbloqueio de aminoácidos.
A purificação e o controle do peptídeo sintetizado nº 7 foram realizados em um sistema de HPLC preparativa de 2 componentes da Waters (EUA). Um injetor Rheodyne com um volume de loop de 500 µl foi usado para injetar a amostra. A detecção foi realizada na faixa de 190-360 nm. Usamos uma coluna “Symmetry Si-100 C18” (4,6x250 mm) para HPLC de fase reversa. A taxa de fluxo foi de 50 ml/min. Foi utilizado um sistema eluente gradiente H2O/ACN/TFA (98/2/0,1)/(0,100.0.1). Tempo de análise 15 min. A recromatografia foi realizada num sistema analítico Knauer HPLC. Foi utilizada uma coluna XbridgeC18 (2,6 x 150 mm). A detecção foi realizada a 214 nm.
Para confirmar os dados obtidos, a preparação sintetizada foi submetida à análise espectral de massa no CSU "Espectrometria Analítica".
Resultados e discussão. Os dados obtidos no cromatograma sugerem que a pureza do peptídeo sintetizado nº 7 após purificação é superior a 99,6% (Fig. 1).
– – –
Realizamos uma análise cromatográfica comparativa do peptídeo nativo No. 7 em uma coluna X-bridgeC18 nas mesmas condições que seu análogo sintetizado. Os resultados da comparação são apresentados (Fig. 2).
Síntese em fase sólida de um peptídeo cardioativo isolado de átrios de porco
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Arroz. Fig. 4. Espectrogramas de preparações sintetizadas (A) e nativas (B).
G.S. CHAILYAN Como pode ser visto pela comparação dos cromatogramas, o análogo sintetizado e o peptídeo nativo nº 7 são idênticos em massa e tempo de liberação, o que indica a identidade de suas estruturas e sequência de aminoácidos. Assim, utilizando o método de síntese peptídica em fase sólida e levando em consideração as características estruturais do peptídeo estudado, conseguimos obter um peptídeo homogêneo e idêntico ao nativo composto por 9 aminoácidos. Futuramente, com uma quantidade suficiente da droga, planejamos realizar uma série de biotestes para identificar não apenas as formas de regulação da atividade cardíaca por esse peptídeo, mas também os mecanismos de ação em outros órgãos e sistemas.
LITERATURA
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8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.
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Ministério da Educação e Ciência da Federação Russa
Instituição Educacional Autônoma do Estado Federal de Educação Profissional Superior "Universidade Federal de Ural em homenagem ao primeiro presidente da Rússia B.N. Yeltsin"
Departamento de Tecnologia de Síntese Orgânica
Resumo sobre o tema: “Princípios e métodos de síntese em fase sólida. Síntese de peptídeos »
Interpretada pelo aluno gr. Х-300803
Shaikhutdinova A.I.
Verificado por Berseneva V.S.
Ecaterimburgo 2013
1. Introdução…………………………………………………………………………… 3
2. O que são peptídeos? ........................................ ...................................................quatro
2.1. A estrutura dos peptídeos………………………………………………………….5
2.2. Síntese de peptídeos…………………………………………………………….7
3. Síntese em fase sólida de peptídeos …………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………
3.1. Método Merrinfield ……………………………………………………… 10
3.2. Substrato sólido……………………………………………………….14
3.3. Seleção de substrato…………………………………………………………14
3.4. Ligantes………………………………………………………………….16
4. A primeira síntese de um hormônio natural - ocitocina……………………….22
5. Síntese de insulina na célula ………………………………………………………..30
6. Conclusão……………………………………………………………………..34
7. Literatura……………………………………………………………………35
Introdução
Em química orgânica, não há uma única reação que, na prática, forneça rendimentos quantitativos de produtos alvo em qualquer caso. A única exceção é, aparentemente, a combustão completa de substâncias orgânicas em oxigênio em alta temperatura para CO 2 e H 2 O. Portanto, a purificação do produto alvo é uma tarefa complexa e demorada. Por exemplo, 100% de purificação de produtos de síntese de peptídeos é um problema intratável. De fato, a primeira síntese completa de um peptídeo, o hormônio oxitocina (1953), contendo apenas 8 resíduos de aminoácidos, foi considerada uma conquista notável que rendeu ao seu autor, V. du Vignot, o Prêmio Nobel em 1955. vinte anos, a síntese de polipeptídeos dessa complexidade tornou-se rotina, de modo que atualmente a síntese de polipeptídeos constituídos por 100 ou mais resíduos de aminoácidos não é mais considerada uma tarefa intransponível.
O objetivo do trabalho: desmontar e explicar: "O que causou mudanças tão dramáticas no campo da síntese de polipeptídeos?"
O que são peptídeos?
Peptídeos são compostos naturais ou sintéticosmoléculasque são construídos a partir dos restosalfa-aminoácidos interligados por ligações peptídicas (amida) C (O) NH. Pode conter emmoléculatambém um componente não aminoácido (por exemplo, um resíduocarboidrato). De acordo com o número de resíduos de aminoácidos emmoléculas peptídeos, distinguir entre dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos, etc. Peptídeos contendo até 10 resíduos de aminoácidos são chamados de oligopeptídeos, aqueles contendo mais de 10 resíduos de aminoácidos são chamados de polipeptídeos. polipeptídeoscom um peso molecular superior a 6 mil são chamadosproteínas.
Pela primeira vez, peptídeos foram isolados de hidrolisados de proteínas enzimáticas. O termo "peptídeos" foi proposto por E. Fisher. O primeiro peptídeo sintético foi obtido por T. Curtius em 1881. E. Fisher em 1905 desenvolveu o primeiro método geral para a síntese de peptídeos e sintetizou vários oligopeptídeos de várias estruturas. A contribuição atual para o desenvolvimento da química de peptídeos foi feita pelos alunos de E. Fischer, E. Abdergalden, G. Leike e M. Bergman. Em 1932, Bergman e L. Zervas utilizaram o grupo benziloxicarbonil (grupo carbobenoxi) na síntese de peptídeos para proteger os grupos alfa-amino dos aminoácidos, o que marcou uma nova etapa no desenvolvimento da síntese peptídica. Os aminoácidos N-protegidos obtidos (N-carbobenzoxiaminoácidos) foram amplamente utilizados para obter vários peptídeos, que foram usados com sucesso para estudar vários problemas-chave na química e bioquímica dessas substâncias, por exemplo, para estudar a especificidade do substrato de enzimas proteolíticas. Com o uso de N-carbobenoxiaminoácidos, peptídeos naturais (glutationa, carnosina, etc.) foram sintetizados pela primeira vez. Uma conquista importante nesta área foi desenvolvida no início dos anos 50. P. Vaughan et ai.. Síntese de péptidos pelo método de anidrido misto.
Em 1953, V. Du Vigno sintetizou o primeiro hormônio peptídico, a oxitocina. Com base no conceito de síntese de peptídeos em fase sólida desenvolvido por P. Merrifield em 1963, foram criados sintetizadores automáticos de peptídeos. Métodos para síntese enzimática controlada de peptídeos foram desenvolvidos intensivamente. O uso de novos métodos tornou possível sintetizar o hormônio insulina, etc.
Avanços na química sintética de peptídeos foram preparados por avanços no desenvolvimento de métodos para a separação, purificação e análise de peptídeos como cromatografia de troca iônica, eletroforese em vários meios, filtração em gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), imunoquímica análise, etc. métodos de análise de grupo final e métodos de clivagem passo a passo de peptídeos. Em particular, foram criados analisadores automáticos de aminoácidos e dispositivos automáticos para determinar a estrutura primária de peptídeos, os chamados sequenciadores.
A ligação peptídica tem as propriedades de uma ligação parcialmente dupla. Isso se manifesta em uma diminuição no comprimento dessa ligação (0,132 nm) em comparação com o comprimento de uma ligação C N simples (0,147 nm). A natureza parcialmente duplamente ligada da ligação peptídica impossibilita que os substituintes girem livremente em torno dela, de modo que o grupo peptídico é planar e geralmente tem uma configuração trans (forma I). Assim, a espinha dorsal da cadeia peptídica é uma série de planos rígidos com uma articulação móvel ("articulada") no local onde os átomos de C assimétricos estão localizados (indicados por um asterisco na seção I).
A formação preferencial de certos confórmeros é observada em soluções peptídicas. Com o alongamento da cadeia, os elementos ordenados da estrutura secundária adquirem estabilidade mais pronunciada (semelhante às proteínas). A formação de uma estrutura secundária é especialmente típica para peptídeos regulares, em particular para poliaminoácidos.
Propriedades
Os oligopeptídeos são semelhantes em propriedades aos aminoácidos, os polipeptídeos são semelhantes às proteínas. Os oligopeptídeos são, via de regra, substâncias cristalinas que se decompõem quando aquecidos a 200-300 0 C. São facilmente solúveis em água, ácidos e álcalis diluídos e quase insolúveis em solventes orgânicos. As exceções são os oligopeptídeos construídos a partir de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos.
Os oligopeptídeos têm propriedades anfotéricas e, dependendo da acidez do meio, podem existir na forma de cátions, ânions ou zwitterions. As principais bandas de absorção no espectro IR para o grupo NH são 3300 e 3080 cm -1 , para o grupo C=O 1660 cm -1 . No espectro UV, a banda de absorção do grupo peptídico está na região de 180-230 nm. O ponto isoelétrico (pI) dos peptídeos varia amplamente e depende da composição dos resíduos de aminoácidos na molécula. Os valores de pKa dos peptídeos são para a-COOH aprox. 3, para -H 2 aprox. oito.
As propriedades químicas dos oligopeptídeos são determinadas pelos grupos funcionais contidos neles, bem como pelas características da ligação peptídica. Suas transformações químicas são muito semelhantes às reações correspondentes dos aminoácidos. Eles dão uma reação positiva de biureto e uma reação de ninidrina. Dipeptídeos e seus derivados (especialmente ésteres) são facilmente ciclizados, transformando-se em dicetopiperazinas. Sob a ação do ácido clorídrico normal 5,7, os peptídeos são hidrolisados a aminoácidos em 24 horas a 105 0 C.
Síntese de Peptídeos
Na síntese de peptídeos, são utilizadas reações conhecidas da química orgânica para a preparação de amidas e métodos especialmente desenvolvidos para a síntese de peptídeos. Para a implementação bem-sucedida dessas sínteses, é necessário ativar o grupo carboxila, ou seja, aumentar a eletrofilicidade do carbono carbonílico. Isto é conseguido por modificação química do grupo carboxila de aminoácidos. O tipo de tal modificação geralmente determina o nome do método de síntese peptídica.
1. Método de cloreto.
O método baseia-se na reação de obtenção de amidas pela interação de cloretos ácidos com as aminas correspondentes. Foi assim que os primeiros peptídeos foram obtidos. Atualmente, esse método é usado extremamente raramente, pois é acompanhado pela formação de subprodutos e racemização de peptídeos.
2. Método de azida
O material de partida neste método é mais frequentemente o éster etílico de um aminoácido N-protegido, a partir do qual a hidrazida é obtida, esta última é convertida com nitrito de sódio na presença de ácido clorídrico em azida ácida. A hidrazina é geralmente usada na reação, na qual um dos nitrogênios é bloqueado por um grupo protetor (grupo Z-carbobenoxi ou carbotretbutiloxi), o que permite evitar a formação de di-hidrazidas laterais. As azidas interagem com aminoácidos protegidos por C sob condições suaves para formar peptídeos.
A racemização neste método é minimizada, mas podem ocorrer reações colaterais, a saber: as azidas podem se rearranjar em isocianatos, que por sua vez, ao interagir com um álcool utilizado como solvente, formam uretanos.
3. Anidridos mistos
Anidridos de aminoácidos mistos com derivados de ácido carbônico, obtidos, por exemplo, usando clorocarbonato de isobutil, encontraram ampla aplicação na síntese de peptídeos: 
A reação nesta síntese é realizada a baixa temperatura (-10..-20 C), bastante rapidamente, o que reduz significativamente a possibilidade de formação de subprodutos e racemização. A rápida síntese passo a passo de peptídeos usando anidridos mistos é chamada de síntese REMA. Métodos de formação usando anidridos mistos são amplamente utilizados na síntese de peptídeos em fase sólida.
Assim, a realização da síntese peptídica requer consideração e observância estrita de certos fatores. Assim, para reduzir a formação de subprodutos e racemização, são recomendadas as seguintes condições típicas para a reação de formação de ligações peptídicas:
1) o processo deve ser realizado a baixas temperaturas, o tempo de reação deve ser mínimo;
2) a massa da reação deve ter pH próximo ao neutro;
3) bases orgânicas como piperidina, morfolina, etc. são usadas como reagentes de ligação de ácido;
4) a realização da reação é desejável em meio anidro.
Síntese em fase sólida
Síntese em fase sólida - uma abordagem metódica para a síntese de oligômeros (polímeros) usando sólidos insolúveis operadora, que é um polímero orgânico ou inorgânico.
No início da década de 1960, uma nova abordagem foi proposta para resolver os problemas de isolamento e purificação que surgem na síntese de peptídeos. Mais tarde, o autor da descoberta desta abordagem, R.B. Merrifield, em sua Palestra Nobel, descreveu como isso aconteceu: “Um dia tive a ideia de como poderia ser alcançado o objetivo de uma síntese peptídica mais eficiente. O plano era montar a cadeia peptídica em etapas, com a cadeia tendo uma extremidade ligada a um suporte sólido durante a síntese.” Como resultado, o isolamento e purificação de derivados de peptídeos intermediários e alvo foi reduzido a uma simples filtração e lavagem completa do polímero sólido para remover todo o excesso de reagentes e subprodutos remanescentes em solução. Tal operação mecânica pode ser realizada quantitativamente, facilmente padronizada e pode até ser automatizada. Vamos considerar este procedimento com mais detalhes.
SÍNTESE DE FASE SÓLIDA,
metódico abordagem para a síntese de oligo(polímero)meros usando um transportador sólido insolúvel (N.), que é um org. ou inorg. polímero. Ou seja, baseia-se no fato de que a primeira ligação do futuro oligômero está covalentemente ligada ao grupo "âncora" H., a extensão da cadeia é realizada com monômeros protegidos padrão de acordo com os esquemas usuais usados para síntese em soluções. Concluir. etapa de síntese. o oligômero é clivado de N. e purificado por métodos apropriados. T. s. usado no principal para obter polipeptídeos, oligonucleotídeos e oligossacarídeos.
Durante a síntese de polipeptídeos como N. naib. um copolímero de estireno e 1-2% de divinilbenzeno é amplamente utilizado, modificado pela introdução de um grupo âncora de cloreto de dimetoxibenzil para anexar o primeiro (com um grupo NH 2 protegido) no terminal C, por exemplo:
Após a remoção do grupo N-protetor, a extensão da cadeia polipeptídica é realizada por métodos padrão de síntese de peptídeos em solução (ver. peptídeos). Como agentes de condensação, Naib. muitas vezes usam ou pré-converter aminoácidos para ativador. éteres.
Na síntese de oligonucleotídeos, vidros macroporosos ou são usados como N.. O grupo âncora é um grupo carboxila, separado de N. spec. "perna", por exemplo:
B-purina ou base pirimídica
Na primeira etapa, o nucleosídeo é ligado ao carreador no grupo 3 "-hidroxila da desoxirribose, no qual o grupo hidroxila na posição 5" é protegido pelo grupo dimetoxitritil (CH 3 OS 6 H 4) 2 (C 6 H 5) C (DMTr); a quantidade deste último após a sua separação é facilmente medida espectrofotometricamente, que serve como uma quantidade. característica do carregamento do transportador e permite avaliar os rendimentos em etapas subsequentes da construção da cadeia de oligonucleotídeos. Após a remoção do grupo DMTr, a cadeia é montada usando fosfitamidas (fl. I; M. Kaposers, 1980) ou fosfonatos (hidrofosfonatos) (II; R. Stremberg, 1986):
Para a implementação de T. com. altos rendimentos (no nível de 96-99%) são necessários em cada etapa do distrito, bem como métodos eficazes para purificação e isolamento de sintetizadores. conexões.
A utilização de uma fase sólida permite simplificar e acelerar significativamente cada etapa do crescimento da cadeia do oligômero, uma vez que a separação de componentes em excesso, agentes de condensação e subprodutos na solução é realizada filtrando as reações. misturas e lavagem N. com um conjunto adequado de soluções. Assim, o processo de montagem da cadeia de oligômero se divide em várias operações padrão: desbloqueio da extremidade crescente da cadeia, dosagem do próximo monômero protegido e agente de condensação, alimentação dessa mistura na coluna N. pelo tempo calculado e lavagem remover o N. com um solvente adequado. O ciclo de construção de um link monomérico m. b. automatizado.
No coração do automático baile de formatura. sintetizadores é um diagrama de circuito geral (ver. Fig.). Numerosos os modelos de sintetizadores diferem no design das colunas e seu número, no método de fornecimento de reagentes e solventes, etc. O controle e a programação são realizados usando um computador embutido ou remoto.
Diagrama esquemático do dispositivo automático. baile de formatura. sintetizadores (a linha de controle elétrico é indicada por uma linha pontilhada): 1 - linha de alimentação de monômero (M 1, M n) e um agente de condensação (CA); 2 linhas para fornecimento de reagentes (por exemplo, agentes oxidantes, agentes acilantes, to-t, etc.) e p-solventes (P 1, P n); 3 - válvulas de comutação; 4 colunas com mídia, equipada com distribuição. válvula; 5-fotométrico célula; 6 metros; 7-unidade de controle e programação; 8-exibição.
As possibilidades potenciais de T. e. foram demonstradas pela síntese de A (R. Merrifield, 1969) e hormônio de crescimento humano (D. Yamashiro, 1970) com um comprimento de 124 e 183 aminoácidos, respectivamente. No entanto, devido à pequena mas constante racemização que ocorre durante a formação de uma ligação peptídica, sintetizador. possuem baixo biol. atividade, tão automática. sintetizadores são usados por Ch. arr. para obter polipeptídeos curtos (10-30 ligações), inclusive para síntese proteica preparativa (1g).
Ou seja, proposto e posto em prática por Merrifield (1962) para a síntese de polipeptídeos, e depois estendido para a síntese de oligonucleotídeos (R. Letzinger, 1964) e oligossacarídeos (A. Patchornik, 1973).
Há outro aspecto importante do uso de N. para realizar pl. org. p-ções (, halogenação, etc.). Neste caso, o modificado N. atua como um reagente ou catalisador polimérico, e todas as transformações do substrato ocorrem em solução. Por exemplo, a p-ção de ROP (O) (OH) 2 fosfatos com álcoois é realizada usando poliestireno reticulado modificado com um grupo sulfocloreto como agente de condensação.
Aceso.: Química de polipeptídeos, trans. de English, M., 1977; Reações suportadas por polímeros em síntese orgânica, ed. por P. Hodge, D.C. Sherrington, Chichester, 1980; Síntese de oligonucleotídeos, uma abordagem prática. Lava, 1984. B.K. Potapov.
Enciclopédia Química. - M.: Enciclopédia Soviética. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .
Veja o que é "SOLID-PHASE SYNTHESIS" em outros dicionários:
síntese em fase sólida- Técnica química combinatória para a síntese de diversos compostos, que utiliza suportes sólidos para separar os compostos durante a síntese, simplificando assim a identificação dos compostos resultantes)
