Veri ja punasolut. Jatkamme verta koskevien materiaalien julkaisemista.
Miltä punasolu näyttää? Normaalissa verenkierron fysiologisissa olosuhteissa punasoluilla on kaksoiskovera muoto, jossa on tasainen paksuus reunoja pitkin ja keskellä on kevyempi osa - pellor.
Valooptisessa tutkimuksessa normaali erytrosyytti, joka on rutiininomaisesti värjätty happamilla väreillä, on levyn muotoinen, jonka halkaisija on 6,9-7,7 ja jopa 9,0 mikronia. Punasolut jaetaan koosta riippuen mikro- ja makrosyytteihin, mutta suurinta osaa niistä edustavat normosyytit/diskosyytit.
Punasolun morfofunktionaaliset ominaisuudet
Punasolu on tumasta vapaa kaksoiskovera solu, jonka keskimääräinen tilavuus on 90,0 µm 3 ja pinta-ala 142 µm 2 . Sen suurin paksuus on 2,4 µm, pienin 1 µm.
Kuivatussa valmisteessa punasolun keskimääräinen koko on 7,55 um; 95% sen kuiva-aineesta laskeutuu rautaa sisältävään hemoglobiiniproteiiniin ja vain 5% - muiden aineiden (muiden proteiinien ja lipidien) osuuteen. Tällaiset solut muodostavat ehdottoman enemmistön – yli 85 % – terveistä ihmisen punasoluista.
Punasolujen alkion tumamuodot erotetaan helposti useimmista leukosyyttisarjan soluista, koska niiden sytoplasmassa ei ole rakeita (virheet ovat mahdollisia vain blastisolujen tunnistamisessa). Erytroblasteille on ominaista rakeisempi ja tiheämpi ydinkromatiini.
Punasolulevyn keskusontelo (pellor) muodostaa 35-55 % sen pinnasta ja poikkileikkaukseltaan erytrosyytti on donitsin muotoinen, mikä toisaalta varmistaa hemoglobiinin säilymisen ja toisaalta päästää punasolun kulkemaan ohuimpienkin kapillaarien läpi. Tällä hetkellä saatavilla olevat punasolurakenteen mallit vastaavat tämän solun erityisominaisuuksien käsitettä, erityisesti sen kalvoa, joka huolimatta herkkyydestään muodonmuutospaineelle tarjoaa vastustuskyvyn taipumiselle ja kokonaispinnan kasvulle.
Kirjallisuustiedot osoittavat, että punasolukalvon koko ja muotoutuvuus ovat niiden tärkeimmät ominaisuudet, jotka liittyvät näiden solujen normaaliin toimintaan, mukaan lukien korkea migraatiokyky, osallistuminen aineenvaihduntaprosesseihin (ensisijaisesti hapenvaihtoon).
Muutokset erytrosyyttien mikroelastometrisissa ominaisuuksissa ja diskosyyttien "transformaatio" muihin morfologisiin muotoihin voivat johtua useista eri tekijöistä. Siten pinnallisten uloskasvujen ilmaantuminen johtaa kalvon elastisuuden vähenemiseen, mikä voi johtua vastakkaisista voimista, jotka syntyvät punasolun muodonmuutosprosessissa; muodonmuutos lisääntyy ATP-pitoisuuden laskun myötä soluissa.
Jos solukalvon eheys rikotaan, erytrosyytti menettää tyypillisen muotonsa ja muuttuu sferoplastiksi, joka puolestaan hemolysoituu. Punasolukalvon (diskosyytti) rakenne on kauttaaltaan sama; ja huolimatta siitä, että sen eri osissa voi esiintyä painaumia ja pullistumia, solunsisäisen tai ekstrasellulaarisen paineen muutokset ± 15 %:n leviämisellä eivät aiheuta koko solun rypistymistä, koska sillä on merkittävä "muodonmuutosta estävyyden" marginaali. . Punasolukalvolla on riittävä elastisuus kestääkseen erilaisten tekijöiden vaikutuksen, joita esiintyy punasolun kiertäessä verenkierrossa.
Punasolukalvon koostumus sisältää: fosfolipidit (36,3 %), sfingomyeliinit (29,6 %), kolesteroli (22,2 %) ja glykolipidit (11,9 %). Kaksi ensimmäistä elementtiä ovat amfifiiliset molekyylit vesipitoisessa väliaineessa, jotka muodostavat tunnusomaisen lipidikaksoiskerroksen, joka on myös läpäisty integraalisilla proteiinimolekyylillä, jotka liittyvät punasolun sisälle sen sytoskeletiin.
Kalvolipidit ovat nestemäisiä, niillä on alhainen viskositeetti (vain 10-100 kertaa veden viskositeetti). Lipidit, siaalihappo, antigeeniset oligosakkaridit, adsorboituneet proteiinit sijaitsevat kalvon ulkopinnalla; kalvon sisäpintaa edustavat glykolyyttiset entsyymit, natrium ja kalsium, ATPaasi, glykoproteiinit ja hemoglobiini.
Kalvon kaksoislipidikerros suorittaa kolme tehtävää: ionien ja molekyylien esteen tehtävä, reseptorien ja entsyymien (proteiinit, glykoproteiinit, glykolipidit) toiminnan rakenteellinen perusta ja mekaaninen. Erikoistuneen hengitystoiminnon - hapen tai hiilidioksidin siirron - toteutuksessa pääroolissa on lipidikaksoiskerrokseen "upotetut" kalvoproteiinit. Kypsät punasolut eivät pysty syntetisoimaan nukleiinihappoja ja hemoglobiinia; niille on ominaista alhainen aineenvaihdunta, mikä varmistaa näiden solujen riittävän pitkän eliniän (120 päivää).
Punasolun ikääntyessä sen pinta-ala pienenee, kun taas hemoglobiinipitoisuus pysyy ennallaan. On todettu, että "kypsässä" iässä punasolut säilyttävät kemiallisen koostumuksensa vakiona pitkään, mutta solujen ikääntyessä kemikaalien pitoisuus niissä vähenee vähitellen. Punasolun sytoskeleton muodostavat ja hallitsevat monigeeniset ja kalvoon liittyvät proteiinien "perheet", jotka järjestävät erikoistuneita kalvodomeeneja, jotka ylläpitävät tämän erittäin erikoistuneen solun toimintaa ja muotoa.
Punasolujen sähköpotentiaali
Punasolukalvo sisältää 50 % proteiinia, 45 % lipidejä ja 10 % hiilihydraatteja. Intaktien solujen pinnalla varausten "verkko"jakauman määrää glykoproteiini, joka sisältää siaalihappoa (neutraamihappoa), joka määrittää jopa 62 % solun pintanegatiivisesta varauksesta.
Uskotaan, että jokainen sähkövaraus vastaa yhtä tämän hapon molekyyliä. Sialihapon menetys erytrosyyttien pinnalla johtaa sen elektroforeettisen liikkuvuuden (EPM) vähenemiseen ja kationien kuljetuksen vaimenemiseen. Tämän seurauksena solun pinnalla on kationisten ja anionisten ryhmien määräämä varausten "mosaiikki", jonka suhde määrää erytrosyyttien sähköisen kokonaisvarauksen.
Optimaalisen homeostaasin tilan ylläpitämiseksi verisoluilla on oltava vakaa varaus. EFP:n korkea stabiilisuus varmistetaan sen hienovaraisella säätelymekanismilla - erytrosyyttikalvojen lipidperoksidaatioprosessien (LPO) tasapainolla ja antioksidanttijärjestelmän suojaavalla vaikutuksella.
Empiirisesti on todettu, että vasta-aineiden reseptorit sijaitsevat erytrosyyttien kalvolla ja niiden pienikin määrä pinnalla voi häiritä kehon normaaleja fysiologisia toimintoja ja muuttaa punasolujen EFP:tä. Tämä voi vaikuttaa jälkimmäisen hemoglobiinitasoon, koska hemoglobiinin ja EFP:n pitoisuus on tiukasti koordinoitu.
On myös otettava huomioon, että negatiivisten tekijöiden äärimmäisissä vaikutuksissa kehoon lipidien peroksidaatiotuotteet vaikuttavat erytrosyyttien elektrokineettisiin ominaisuuksiin. Tämä puolestaan heijastuu niiden kalvojen peroksidiprosessien nopeuteen.
Samalla tavalla varautuneiden erytrosyyttisolujen sähköstaattisen hylkimisen ("levitty" Chizhevskyn mukaan) ansiosta viimeksi mainitut liikkuvat vapaasti verisuonten läpi suorittaen hapenkuljetustehtävänsä. Siksi varausvakauden rikkomista voidaan pitää olennaisena indikaattorina kehon patologisista muutoksista.
1.5 Käytännön oppituntien aiheet
OSA 1. MEMBRAANIBIOFYSIIKKA
1. 1. Biologiset kalvot. Rakenne, ominaisuudet.
Aksonikalvon ominaissähköinen kapasitanssi mitattuna solunsisäisellä mikroelektrodilla havaittiin olevan 0,5 mikrofaradia/cm2. Arvioi litteän kondensaattorin kaavan avulla kalvon hydrofobisen kerroksen paksuus, jonka dielektrisyysvakio on 2.
Mikä on etäisyys erytrosyyttikalvon pinnalla, jonka fosfolipidimolekyyli kulkee 1 sekunnissa lateraalisen diffuusion seurauksena? Sivudiffuusiokertoimeksi otetaan 10 -12 m 2 /s. Vertaa erytrosyytin ympärysmittaan, jonka halkaisija on 8 mikronia.
Kalvofosfolipidien faasisiirtymän aikana nestekiteisestä tilasta geeliksi kaksoiskerroksen paksuus muuttuu. Miten kalvon sähköinen kapasitanssi muuttuu tässä tapauksessa? Miten sähkökentän voimakkuus kalvossa muuttuu?
Spin-leimattujen fosfolipidimolekyylien avulla määritettiin viskositeettigradientti kalvon paksuuden poikki. Kuvaile entistä kokeilua. Missä viskositeetti on korkeampi: kalvon pinnalla vai sen keskellä?
1.1.1. Biologisen kalvon paksuus:
10 A, 3. OD µm
10 nm 4. 10 µm
1.1.2. Biologisen kalvon nestemosaiikkimalli sisältää:
proteiinikerros, polysakkaridit ja pintalipidit
yksikerroksinen lipidi ja kolesteroli
lipidikaksoiskerros, proteiinit, mikrofilamentit
lipidikaksoiskerros
1.1.3. Biologisen kalvon lipidiosa on seuraavassa fysikaalisessa tilassa:
nestemäinen amorfinen
kiinteä kiteinen
kiinteä amorfinen
nestekide
1.1.4. Aksonikalvon ominaissähkökapasitanssi:
1.1.5. Fosfolipidimolekyylin tyypillinen siirtymäaika tasapainoasennosta toiseen diffuusion aikana:
1.1.6. Kalvojen lipidikaksoiskerroksen faasisiirtymiseen nestekiteisestä tilasta geeliin liittyy:
kalvon oheneminen
kalvon paksuus ei muutu
kalvon paksuuntuminen
1.2. Aineiden kulkeutuminen biologisten kalvojen läpi.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
1. Mistä parametreista kalvon lipidihuokosen kriittinen säde riippuu?
2. Laske kriittinen huokossäde ilman kalvopotentiaalia. Otetaan huokosten reunajännitys 10 -11 N, lipidikaksoiskerroksen pintajännitys 0,3 mN/m.
3. Miten kaoium-ionien helpotettu diffuusio valinomysiinimolekyylin mukana muuttuu kalvolipidien faasisiirtymän jälkeen nestekiteisistä tiloista geeliksi?
4. Aksonikalvon ominaissähköinen kapasitanssi intrasellulaarisella mikroelektrodilla mitattuna osoittautui 0,5 mikrofaradia/cm2. Arvioi litteän kondensaattorin kaavan avulla kalvon hydrofobisen kerroksen paksuus, jonka dielektrisyysvakio on 2.
Mallin valvontatestit
1.2.1. Ionikuljetus tapahtuu suuntaan:
1.2.2. Ei-elektrolyyttien diffuusioyhtälö (Fika) on kirjoitettu:
2.3. Valinomysiinimolekyyli kulkee kalvon läpi:
1.2.4. Aineen siirtoa helpotetun diffuusion aikana verrataan yksinkertaiseen diffuusioon:
hitaammin
1.3. Biosähköiset potentiaalit.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
Mikä ionien kuljetus saa aikaan kalvopotentiaalieron: passiivinen vai aktiivinen?
Mikä on suurempi: sähköisen signaalin etenemisnopeus merilennättimen johtoja pitkin vai hermoimpulssin etenemisnopeus aksonikalvoa pitkin? Miksi?
Selitä myrkyn Tetro-Dotoxin ja paikallispuudutteen tetraetyyliammoniumin biofyysinen vaikutusmekanismi.
Miten kalmarin aksonikalvon läpäisevyys eri ioneille levossa ja virityksen aikana korreloi?
Miten toimintapotentiaalikäyrän muoto muuttuu, jos muutamme kemiallista koostumusta aksonin sisällä ja ulkopuolella: aksoplasma korvataan solunulkoisella nesteellä ja solunulkoinen neste - aksoplasmalla?
Mikä on sähkökentän voimakkuus kalvolla levossa, jos kalium-ionien pitoisuus solun sisällä on 125 mmol / l, ulkopuolella - 2,5 mmol / l ja kalvon paksuus on 8 nm?
(Vastaus: 1,3 * 10 7 V / m.)
7. Laske toimintapotentiaalin amplitudi, jos
kaliumin ja natriumin pitoisuus kiihtyvän kudoksen solussa
ei vastaavasti: 125 mmol / l, 1,5 mmol / l ja ulkopuolella
2,5 mmol/l ja 125 mmol/l.(Vastaus: 160 mV.)
Mallin valvontatestit
1.3.1. Kalvopotentiaalia f m kutsutaan:
1.3.2. Käytetyn intrasellulaarisen elektrodin kärjen halkaisija varten kalvopotentiaalin mittaukset:
solukoon verrannollinen
paljon pienempi kuin solu
paljon suurempia soluja
1.4 Toimintapotentiaalin tuottomekanismi.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
1. Onko mahdollista virittyvän solun kalvolla prosessi, jossa eri ionien virrat, joilla on sama varausmerkki, virtaavat samanaikaisesti kohti?
2. Mikä on ilmaisun merkitys
sydänlihassolujen toimintapotentiaalin II vaiheelle?
3. Mistä johtuu, että virta kanavan läpi on diskreetti ja kalvon läpi jatkuva, tasaisesti muuttuva?
Mallin valvontatestit
1.4.1. Depolarisaatiovaiheessa aksonin virityksen aikana Na + -ionien virtaukset suunnataan:
1. helvetti 2. bd 3. helvetti 4. 5. ag
1. 4.2. Aksonien repolarisaatiovaiheessa ionivirrat suunnataan:
1.ad 2.bd 3.be 4.d
4.3. Kardiomyosyyttien toimintapotentiaalin kesto verrattuna aksonin toimintapotentiaaliin
1. suurempi kuin 2. pienempi kuin 3. yhtä suuri
4.4 Sydänlihassolun tasannevaihe määräytyy ionivirtojen avulla:
1. Antonov V.F. Kalvojen biofysiikka // Sorovsky koulutuslehti. - 1997. - T. - 6. S. 1-15.
2. Antonov V.F., Smirnova E.Yu., Shevchenko E.V. Lipidikalvot faasimuutosten aikana. - M.: Nauka, 1992. - S. 125.
3. Klenchin V.A. biologiset kalvot. - 1993. - T. 10. -S. 5-19.
4. Chizmajaev Yu.A., Arakelyan V.B., Pastushenko V.F. Kalvojen biofysiikka. - M.: Nauka, 1981. - S. 207-229.
5. Kotek A., Janacek K. kalvon kuljetus. M.: Mir, 1980.
6. Lightfoot E. Kuljetusilmiöt elävissä järjestelmissä. M.: 1977.
7. Rubin A.B. Biofysiikka. M.: Korkeampi. Shk., 1987.
8. Biologiset kalvot: Collection / Under. Ed. D.S. Parsons. Moskova: Atomizdat, 1978.
9. Kalvo: Ionikanavat: Sat. Taide. M.: Mir, 1981.
10. Hills B.V. la Kalvo: ionikanavat. M.: Mir, 1981.
11. Sydämen fysiologia ja patofysiologia. Alla. toim. N. Sperelakis: M.: Lääketiede, 1998.
12. Ihmisen fysiologia. Alla. toim. Schmidt R. ja Tevs G. T. 1. M.: Mir, 1996.
OSA 2. SOLUJEN JA ELIMIEN BIOFYSIIKKA
2. 1. Elinten sähköinen toiminta.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
1. Mikä on ekvivalentin generaattorin periaate? Anna esimerkkejä tämän periaatteen käytöstä.
2. Miksi elektrokardiografian käänteinen ongelma on diagnostinen tehtävä, ei suora?
3. Mikä on mekanismi sähköpotentiaalien kartan muodostumiselle ihmiskehon pinnalle?
4. Miksi on tarpeen tallentaa vähintään 3 EKG-kytkentää, ei esimerkiksi yhtä?
Mallin valvontatestit
2.1.1. EKG:tä mallinnettaessa oletetaan, että dipoleja ympäröivä ympäristö
a. homogeeninen a, heterogeeninen
b. isotrooppinen b", anisotrooppinen
sisään. rajoitettu", ääretön
1. abc 2. a"b"c" 3.ab"c 4.abc"
2.1.2. Mikä on syy sydämen integraalisen sähkövektorin suuruuden ja suunnan muutoksiin sen työkierron aikana?
sydämen kammioiden supistuminen
sydämen eri rakenteiden viritysaallon peräkkäinen peitto
sydänlihassolujen metabolinen aktiivisuus
hidastaa aallon nopeutta eteiskammiossa
2.1.3. Miksi samojen EKG-hampaiden amplitudit samaan aikaan eri johtimissa eivät ole samat?
eri johtimille integraalisähkövektorin E_ arvo
eri johdoissa vektorin E rotaatio on erilainen
vektorin E projektiot eri johdoilla eivät ole samat
jokaisella johdolla on oma vektori E
2.1.4. Sydämen integraalinen sähkövektori E kuvaa silmukat P, QRS, T:
1. vaakasuuntainen
2.rintakehän pinnan tasossa
Z.tilavuustilassa XYZ
4. tasossa, joka yhdistää oikean, vasemman käden ja vasemman jalan pisteet
2.1.5 Kirjatut potentiaalierot
1. ag 2. olla 3. vg 4. dv
2.2. Autowave-prosessit aktiivisessa mediassa.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
Mikä on perustavanlaatuinen ero aktiivisen median autoaaltojen ja elastisten väliaineiden mekaanisten aaltojen välillä?
Miksi autoaalto etenee aktiivisessa väliaineessa ilman vaimennusta?
Onko autoaaltojen häiriöitä havaittu aktiivisessa väliaineessa?
Mistä aktiivisen median autowave-parametrit riippuvat?
Sydänlihaksen alueen solujen kynnyspotentiaali on -30 mV. Tämän alueen solujen transmembraanipotentiaali saavutti jossain vaiheessa arvon 40 mV. Voiko viritysaalto siirtyä tämän sydänlihaksen alueen läpi?
Mallin valvontatestit
2.2.1. Herätysaalto (autoaalto), joka etenee aktiivisen väliaineen läpi (esimerkiksi sydänlihaksen rakenteen läpi), ei heikkene:
siirtämällä energiaa solusta toiseen
havaitsee kunkin solun varastoiman energian vapautumisen
sydänlihaksen supistumisen mekaanisen energian siirron seurauksena
sähkökentän energian käytön seurauksena
2.2.2 Herätyksen aallonpituus aktiivisessa väliaineessa riippuu:
a. sydänlihassolun toimintapotentiaalin amplitudit
b. aallon etenemisnopeudesta sydänlihaksen läpi
sisään. tahdistimen pulssitaajuudesta
esim. virittyneen tulenkestävän jakson kestosta
soluja1. ab 2. bg 3. cg 4. ag
2.2.3. Kesto X kestävän autoaallon (palaamisen) kierto renkaassa, jonka kehä on / voi tapahtua seuraavissa olosuhteissa:
2.2.4. Jos epähomogeenisessa aktiivisessa väliaineessa on vyöhykkeitä, joiden refraktorisuus on R 1 ja R 2 (R 2 > R:) ja tahdistimesta tulevat impulssit seuraavat jaksolla T, niin rytmimuutos voi tapahtua olosuhteissa:
1. T
R13.T = R2-R1 2.3. Lihasten supistumisen biofysiikka.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
Miksi isometrisellä supistuksella on erilainen riippuvuusmuoto F(t) eri alkulihasten pituuksilla?
Onko mahdollista määrittää V(P) Hill -käyrästä lihasten kestämän maksimikuormitus?
Lisääntyykö lihasten supistumisen tehokkuus, kun lihaksen lämmöntuotanto lisääntyy?
Mitä eroja on kardiomyosyyttien ja luustolihasten sähkömekaanisen kytkennän välillä?
Mallin valvontatestit
2.3.1. Lihaksen supistumisen aikana:
a. aktiinifilamentit liukuvat sarkomeeriin myosiinia pitkin
b. myosiini puristuu kuin jousi
sisään. sillat kiinnittyvät aktiiniaktiivisiin kohtiin
d. sillat auki
1. av 2. bg 3. bv 4. ag
2.3.2. Lihaksen synnyttämän supistumisvoiman määrää:
1. aktiivinen langan pituus
2 yhden sillan tuottama voimanmuutos
samanaikaisesti suljettujen siltojen lukumäärä
myosiinifilamentin elastisuus
2.3.3. Yhden lihaksen supistumisen nopeuden v riippuvuus kuormasta P on muotoa:
2.3.4 Sähkömekaaninen kytkentä määräytyy seuraavan tapahtumaketjun perusteella:
a. Ca 2+ -ionien vapautuminen myofibrilleihin
b. solukalvon viritys
sisään. Ca 2+ -ionien aktiivinen kuljetus sarkoplasmiseen retikulumiin
d. siltojen sulkeminen aktiiniaktiivisiin keskuksiin
e. aktiinin liukuminen sarkomeeriin
1. Ihmisen fysiologia. T. 2. M.: Mir, 1996.
2. Vasiliev V.A., Romanovsky Yu.N., Yakhno V.G. Autowave-prosessit. Moskova: Nauka, 1987.
3.Ivanitsky G.R., Krinsky V.I., Selkov E.E. Solun matemaattinen biofysiikka. Moskova: Nauka, 1978.
4. Chernysh A.M. Sydänlihaksen epähomogeenisuuksien biomekaniikka. Moskova: Nauka, 1993.
5. Bendol J. Lihakset, molekyylit ja liike. M.: Mir, 1989.
OSA 3. MONIMUTTAISTEN JÄRJESTELMIEN BIOFYSIIKKA
3.1. Biofysikaalisten prosessien mallintaminen.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
Kuinka kauan injektion jälkeen 10 % lääkkeen alkuperäisestä massasta jää vereen, jos erittymisvakio k = 0,3 (1/tunti)?
Kahden eri lääkkeen erittymisvakiot eroavat kertoimella kaksi. Piirrä kvalitatiiviset kaaviot lääkkeen massan muutoksista veressä injektioiden aikana näissä kahdessa tapauksessa. Kuinka monta kertaa erittymisnopeudet eroavat, kun t = O?
Jonkin aikaa sen jälkeen, kun potilas laitettiin tippulle (kun lääkkeen pitoisuus saavutti paikallaan olevan tason), hänelle annettiin injektio. Piirrä kvalitatiivinen kaavio lääkkeen massan muutoksesta ajan kuluessa.
Mallin valvontatestit
3.1.1. Petoeläin-saalismalli osoittaa, että saalistaja- ja saalispopulaatiot suorittavat harmonisia värähtelyjä. Ovatko näiden värähtelyjen taajuudet ja vaiheet samat?
a. taajuudet ovat samat. vaiheet ovat samat
b. taajuudet ovat erilaisia d. vaiheet ovat erilaisia
1. av 2. bv 3. ag 4. bg
3.1.2. Mikä malli sopii solujen elektrogeneesin tutkimuksiin?
1. liposomi 2. kaksikerroksinen lipidikalvo
3. kalmari aksoni 4. Frank malli
3.2. Verenkiertojärjestelmän biofysiikka.
Valvontakysymykset, tehtävät, seminaaritehtävät
Koulutus- ja metodologinen kompleksi tieteenalasta "talouden valtiollinen sääntely"
Koulutus- ja metodologiakompleksi... koulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainenpäälläkurinalaisuutta"TALOUSVALTION SÄÄNTELY" UFA -2007 Valtiontalouden sääntely: koulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainen... taloustieteet koulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainenpäälläkurinalaisuutta"Osavaltio...
Koulutus- ja metodologinen kompleksi yleisen ammatillisen koulutuksen alalla "biologian opetuksen teoria ja menetelmät" erikoisuus "050102 65 - biologia"
Koulutus- ja metodologiakompleksikoulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainenpäälläKoulutus- ja metodologiakompleksi
... __________________________________________________________ (Koko nimi.) koulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainenpäälläkurinalaisuutta Tietokoneiden ja ... Samme G.V. koulutuksellinen-menetelmällinenmonimutkainenpäälläkurinalaisuutta Tietokoneiden ja järjestelmien organisaatio (nimi tieteenaloilla) koottu...
Aluksen säde on puolittunut. Kuinka monta kertaa tilavuusvirtausnopeus muuttuu jatkuvalla paineen laskulla?
Laske verenpaine 5 cm:n etäisyydellä suonen alusta, jos suonen alussa paine on 10 4 Pa, sen säde on 1 mm, veren viskositeetti on 0,005 Pa s, suonen lineaarinen nopeus veri on 20 cm/s.
Kuinka monta kertaa paineen laskun nopeus diastolin alussa muuttuu, jos pienten suonten hydraulinen vastus kasvaa 20 %?
Kuinka monta kertaa aorttaosan (aortan säde 1,25 cm) hydraulinen vastus on pienempi kuin samanpituisen valtimoosan (valtimon säde 2,5 mm) hydraulinen vastus? Veren viskositeetti valtimoon on 0,9 aortan veren viskositeetista.
Kuinka monta kertaa verenpaineen tulee nousta suuren suonen alussa, jotta sen luumenin kapeneessa 30 %, paine suonen ulostulossa ja tilavuusveren virtausnopeus säilyvät ennallaan? Supistumisen puuttuessa painehäviö astiassa on 0,2 astian alun paineesta.
biologiassa, pediatrian kandidaatti, apulaisprofessori Osipova I.V. menetelmällinen ohjeita opiskelijalle päällä opiskelu tieteenaloillaKuri"Oppituntien ulkopuolisen...
1. Pfeferin, Hardy-Fischerin, Overtonin kokeet. Solukalvon luonne ja vaihtoehto solukalvolle.
2. Fluoresoivien koettimien menetelmä solukalvojen tutkimuksessa.
3. Aksonikalvon ominaissähköinen kapasitanssi solunsisäisellä elektrodilla mitattuna oli 0,5 μF/cm 2 . määritä kalvon hydrofobisen kerroksen paksuus litteän kondensaattorin kaavalla. Lipidien Ε katsotaan 2:ksi.
4. Sydänmykeettien toimintapotentiaalin muodostumismekanismi.
5. Spin-koettimien menetelmä solukalvojen tutkimuksessa.
6. Mikä on etäisyys erytrosyyttikalvon pinnalla, jonka fosfolipidimolekyyli kulkee 1 sekunnissa lateraalisen diffuusion seurauksena? Sivudiffuusiokertoimeksi otetaan 10 -12 m 2 /s. verrataan erytrosyytin ympärysmittaan, jonka halkaisija on 8 µm.
7. Ionikanavan rakenne.
8. Differentiaalimikrokalorimetrian menetelmä.
9. Kalvofosfolipidien faasisiirtymän aikana nestekidetilasta geeliksi kaksoiskerroksen paksuus muuttuu. Miten kalvon kapasitanssi muuttuu tässä tapauksessa?
10. Solukalvojen ionikanavat.
11. Röntgenrakenneanalyysi solukalvojen tutkimuksessa. Periaatteet ja esimerkit.
12. Kalvofosfolipidien faasisiirtymän aikana nestekidetilasta geeliksi kaksoiskerroksen paksuus muuttuu. Miten sähkökentän voimakkuus kalvossa muuttuu tässä tapauksessa?
13. Ionivirrat aksonissa. Hodgkin-Huxley malli.
14. Menetelmät kalvon läpäisevyyden tutkimiseksi.
15. Spin-leimattujen fosfolipidimolekyylien avulla määritettiin kalvon viskositeetin paksuusgradientti. Kuvaile kokeilua.
16. Toimintapotentiaalin muodostumismekanismi.
17. Konduktometrian soveltaminen kalvojen tutkimuksessa. Fricken kokeet.
18. Jos hydrofobisen kerroksen viskositeetti on suurempi: kalvon pinnalla tai sen paksuudessa. Miten se asennetaan?
19. Hermoimpulssin jakautuminen virittyvää säiettä pitkin.
20. Elektrokineettiset ilmiöt soluissa ja suspensioissa.
21. Miten kaliumionien helpotettu diffuusio valinomysiinimolekyylin mukana muuttuu kalvolipidien faasisiirtymän jälkeen nestekiteisestä tilasta geeliksi?
22. Toimintapotentiaali. fyysinen mekanismi.
23. Elektrosmoosi elävissä soluissa ja kudoksissa.
24. Tuleeko antiport-kaavion mukaisen natrium-ionien kertymisen aikana osmoottista vaikutusta (turvotusta hypotonisissa ja ryppyjä hypertonisissa liuoksissa)?
25. Lepopotentiaali. Hänen luonteensa.
26. Osmoosin luonne elävissä soluissa.
27. Tuleeko osmoottinen vaikutus (turvotus hypotonisissa ja ryppyjä hypertonisissa liuoksissa) natrium-ionien kertymisen aikana symport-kaavion mukaisesti?
28. Biosähköisten potentiaalien luonne.
29. Solu on kuin osmometri. Esimerkki liuoksen isotonisuuden määrittämisestä elävien solujen avulla.
30. Osoita, että Nernst-Planck-yhtälö on pelkistetty Fick-yhtälöön varautumattomien hiukkasten diffuusion tapauksessa.
31. Erot proteiinikanavien ja lipidihuokosten välillä.
32. Kuolleiden solujen laskeutumisen luonne. ESR-menetelmän fysikaalinen kemiallinen perusta.
33. Entsyymi Na + -K + - ATPaasi punasolun plasmakalvossa on suorittanut kuusi sykliä. Kuinka monta natrium- ja kalium-ionia kuljetettiin aktiivisesti? Kuinka paljon energiaa kului tässä tapauksessa, jos yhden ATP-moolin hydrolyysin mukana vapautuu 33,6 kJ?. Kytkentätehokkuuden oletetaan olevan 100 %.
34. kalvon läpäisevyyden mekanismi vesimolekyyleille. Kiero hypoteesi.
35. NMR-spektroskopia kalvojen tutkimuksessa. Esimerkkejä ja periaatteita.
36. Solukalvoissa tunnetaan kolme ionipumppua: natrium-kalium, protoni ja kalsium. Kuinka sokerin ja aminohappojen aktiivinen kuljetus tapahtuu?
37. Malli huokosten muodostumisesta faasimuutoksen aikana.
38. Membraanin mikroviskositeetin mittausmenetelmät.
39. Onko kalium- ja natriumionien samanaikainen kalvon läpi tapahtuva siirto mahdollinen symport-kaavion mukaan?
40. kalvon lipidien sähköinen hajoaminen.
42.spektrikoettimien menetelmät.
43. Onko kalium- ja natriumionien samanaikainen kalvon läpi tapahtuva siirto mahdollista antiport-kaavion mukaan?
44. kriittisen lipidihuokosen malli.
45. ioniselektiivisten elektrodien käyttö kalvon läpäisevyyden tutkimuksessa.
46. Onko kalium- ja natriumionien samanaikainen kalvon läpi tapahtuva siirto mahdollista uniport-kaavion mukaan?
47. lipidihuokoset kalvon stabiilisuuden valossa.
48. erytrogrammien menetelmät. niiden informaatioarvo.
49. Mikä ionien kuljetus aiheuttaa kalvopotentiaalieron: passiivinen vai aktiivinen?
50. Ionien sekundaarisen aktiivisen kuljetuksen mekanismi ja kuviot.
51. Helpotetun diffuusion kokeelliset kriteerit.
52. Mikä on enemmän sähköisen signaalin etenemisnopeus merilennättimen johtoja pitkin tai hermoimpulssin etenemisnopeus aksonikalvoa pitkin? Miksi?
53. Sähkö-ionipumput.
54. Solujen fraktiointimenetelmät.
55. Mikä on paikallispuudutteen tetrayyliammoniumin biofyysinen vaikutusmekanismi?
56. Ussingin kokemus ja suunnitelma.
57. Lipidi-lipidi-vuorovaikutusvoimien luonne kalvossa. Tutkimusmenetelmät.
Kalenterin teemasuunnitelma tieteenalalle
"Biologisten kalvojen molekyyliorganisaatio"
Lukuvuosi 2011/2012 vuosi (4. vuosi, 7. lukukausi All-Russian Biophysics Facilityssä)
päivämäärä Nro p / s Koulutusmoduulin tyyppi ja nimi Koulutusmoduulin koulutus- ja metodologinen tuki LUENTOT: Biologiset kalvot yleismaailmallisina elävien järjestelmien rakenteellisina ja toiminnallisina muodostelmina. Luennon yhteenveto. Biokalvojen rakenteellinen organisaatio. Luennon yhteenveto. Kalvoproteiinit ja lipidit. Luennon yhteenveto. Proteiini-lipidivuorovaikutukset. Luennon yhteenveto. Kalvojen dynaamiset ominaisuudet. Luennon yhteenveto. Kalvojen rakenteen mallintaminen. Luennon yhteenveto. Kalvorakenteen laskelmat Luennon yhteenveto. YHTEENSÄ - 14 tuntia Työpajat* Kalvojen sähkökapasitanssin ja impedanssin laskelmat. Laitoksen tietokoneluokka. Punasolukalvon paksuuden määritys sähkönjohtavuudella. Laitoksen tietokoneluokka. Punasolukalvojen mekaanisen lujuuden tutkimus. Laitoksen tietokoneluokka. Tutkimus kolesterolin vaikutuksesta punasolujen kalvojen muodonmuutokseen. Laitoksen tietokoneluokka. Laskelmat punasolujen kalvojen lujuudesta. Laitoksen tietokoneluokka. Magneettikentän vaikutuksen tutkimus punasolujen kalvojen mekaanisiin ominaisuuksiin Laitoksen tietokoneluokka. Yhteensä - 22 tuntia * - jokainen käytännön oppitunti on suunniteltu 4 tunniksi.
Hyväksytty osaston kokouksessa __________________________________________________
1. Tästä pääteltiin, että erytrosyyttien kalvo koostuu lipidimolekyyleistä, jotka on järjestetty kahteen kerrokseen.
Ilmeisesti tämä Gorterin ja Grendelin johtopäätös osoittautui oikeaksi vain virheiden keskinäisen kompensoinnin vuoksi, mutta historiallisesti tällä työllä oli suuri merkitys, koska siitä lähtien käsitys lipidikaksoiskerroksesta biologisen rakenteellisena perustana. kalvoista on tullut hallitseva ja itse asiassa osoittautunut oikeaksi.
Bimolekulaarisen lipidikalvon käsitettä kehitettiin edelleen vuoden 1935 Devson-Danielli-mallissa tai "sandwich"-mallissa, jossa proteiinien oletettiin peittävän lipidikaksoiskerroksen pintaa. Tämä oli poikkeuksellisen onnistunut malli, ja seuraavien 30 vuoden aikana lukuisat kokeelliset tiedot, erityisesti ne, jotka saatiin röntgendiffraktiolla ja elektronimikroskopialla, vahvistivat täysin sen riittävyyden. Samaan aikaan kuitenkin havaittiin, että kalvot suorittavat valtavasti erilaisia toimintoja, ja tämän ilmiön selittämiseksi alkuperäistä Devson-Danielli-mallia muokattiin toistuvasti.
Membranologian nopea kehitys, joka on johtanut nykyaikaisten käsitteiden muodostumiseen, on saavutettu suurelta osin kalvoproteiinien ominaisuuksien tutkimuksen edistymisen ansiosta. Jäädytysleikkausmenetelmällä tehdyt elektronimikroskooppiset tutkimukset osoittivat, että kalvoihin on upotettu pallomaisia hiukkasia. Sillä välin pesuaineita käyttävät biokemistit onnistuivat erottamaan kalvot toiminnallisesti aktiivisten "hiukkasten" tilaan. Spektritiedot osoittivat, että kalvoproteiineille on tunnusomaista korkea a-heliksien pitoisuus ja että ne luultavasti muodostavat palloja sen sijaan, että ne jakautuisivat yksikerroksisena kerroksena lipidikaksoiskerroksen pinnalle. Kalvoproteiinien ei-polaariset ominaisuudet viittasivat hydrofobisten kontaktien läsnäoloon proteiinien ja lipidikaksoiskerroksen sisäisen ei-polaarisen alueen välillä. Samaan aikaan kehitettiin menetelmiä, jotka mahdollistivat lipidikaksoiskerroksen juoksevuuden paljastamisen. Singer ja Nicholson yhdistivät kaikki nämä ideat luodakseen nestemäisen mosaiikkimallin. Tässä mallissa kalvo on esitetty nestemäisenä fosfolipidikaksoiskerroksena, johon on upotettu vapaasti diffundoituvia proteiineja. Vanha Devson-Danielli-malli oli staattinen ja selitti onnistuneesti tuolloin saatavilla olevat rakennetiedot, jotka saatiin melko alhaisella resoluutiolla. Samaan aikaan vuodesta 1970 lähtien on kiinnitetty paljon huomiota dynaamisten ominaisuuksien ja niiden suhteen kalvotoimintojen tutkimukseen. Viime vuosina myös nestemosaiikkimallia on muutettu, ja tämä prosessi jatkuu. Erityisesti nyt on käynyt selväksi, etteivät kaikki kalvoproteiinit diffundoidu vapaasti nestemäisessä lipidikaksoiskerroksessa. On olemassa tietoa lateraalisten j-domeenien olemassaolosta itse kalvossa. Sytoskeleton roolia tutkitaan myös huolellisesti. On käymässä yhä selvemmäksi, että jotkin kalvojen osat näyttävät poikkeavan rakenteeltaan klassisesta lipidikaksoiskerroksesta. Siitä huolimatta nestemosaiikkimalli erilaisissa muunnelmissaan toimii lähitulevaisuudessa käsitteellisenä perustana monille kalvotutkimuksille.
3. Kalvojen morfologiaKahdella menetelmällä oli tärkeä rooli kalvojen morfologian selvittämisessä: röntgendiffraktio ja elektronimikroskopia. Heidän avullaan kaksikerroksisen mallin oikeellisuus vahvistettiin. On kuitenkin pidettävä mielessä, että molemmilla näillä menetelmillä on useita rajoituksia kalvojen molekyyliorganisaation yksityiskohtaisen kuvan selvittämisessä.
3.1 Röntgendiffraktio
Röntgendiffraktiomenetelmällä tutkittaessa erittäin järjestettyjä kiteisiä näytteitä on mahdollista saada tietoa rakenteesta suurella resoluutiolla. Huonosti tilattujen valmisteiden tapauksessa tämän menetelmän mahdollisuudet ovat rajalliset. Joillakin erikoiskalvojärjestelmillä on jo säännöllinen rakenne, joten niitä voidaan tutkia röntgendiffraktiomenetelmillä. Esimerkki tällaisesta on ääreishermosäikeiden myeliinivaippa; se on kalvo, joka toistuvasti kietoutuessaan aksonin ympärille muodostaa säännöllisen samankeskisten kalvorakenteiden järjestelmän. 1930-luvulla tehdyt myeliinin röntgendiffraktiotutkimukset vahvistavat kalvojen kaksikerroksisen mallin riittävyyden. Sama johtopäätös tehdään tutkimalla selkärankaisten verkkokalvon sauvojen ulompaa segmenttiä, jotka ovat luonnollisia järjestettyjä kalvojärjestelmiä, sekä keinotekoisesti järjestettyjä järjestelmiä, jotka muodostuvat mitokondrioista ja erytrosyyteistä saatujen kalvorakkuloiden romahtamisen aikana sentrifugointiolosuhteissa. . Kaikissa näissä tapauksissa havaittiin samanlainen elektronitiheyden jakauma kalvossa, kuten kuvassa 1.4.
Röntgendiffraktiotietojen tulkitsemiseksi on välttämätöntä määrittää paitsi heijastusten intensiteetit myös niiden vaiheet. Säännöllisesti pakattujen kalvojärjestelmien tapauksessa ongelma yksinkertaistuu suuresti, koska nämä järjestelmät koostuvat toistuvista elementeistä, joilla on keskussymmetria.
Saadut tiedot osoittavat, että kaikkien kalvojen rakenne on samanlainen: niissä on hydrofobinen sisäalue, jolla on pieni elektronitiheys, ja kaksi kerrosta polaarisia ryhmiä, joilla on korkea elektronitiheys. Eri kalvoista saadut röntgendiffraktiotiedot eroavat vain vähän, vaikka niiden proteiinipitoisuudessa on suuria eroja. Vaikka röntgendiffraktiotiedot antavatkin tietoa siitä, kuinka suurin osa membraaniproteiineista sijaitsee kalvossa, röntgendiffraktioanalyysimenetelmä ei yleensä anna yksityiskohtaista molekyylikuvaa.
Wilkins ym. huomauttivat vuonna 1971, että röntgendiffraktiota voidaan käyttää myös kalvojen ja fosfolipidien vesidispersioiden tutkimiseen. Tässä tapauksessa kaksoiskerroksen molemmilla puolilla polaaristen alueiden synnyttämät heijastukset mahdollistavat sen paksuuden löytämisen napapäiden välisen etäisyyden kanssa, ja näiden ketjujen välinen etäisyys voidaan määrittää järjestettävien hiilivetyketjujen synnyttämien heijastusten perusteella. . Myös tässä tapauksessa eri lähteistä saadut kalvovalmisteet antoivat samanlaisen diffraktiokuvion, mikä vahvistaa kaksikerroksisen mallin universaalisuuden.
Yksityiskohtaisen molekyylikuvion saamisen mahdottomuus diffraktiomenetelmällä rajoittaa tämän menetelmän soveltamista biologisten kalvojen tutkimukseen. Se voi kuitenkin olla erittäin hyödyllinen tilattujen lipidi-vesijärjestelmien tutkimuksessa.
3.2 Elektronimikroskopia
Myeliinin ohuiden osien ja itse asiassa kaikkien muiden kalvojen paljastaa tyypillisen kolmikerroksisen rakenteen, joka koostuu kahdesta elektronitiheästä vyöhykkeestä, joita erottaa noin 80 A:n rako. Tämä kuva saadaan suurelta osin tulos valmisteiden käsittelystä osmiumtetroksidilla, jota yleensä käytetään tässä menetelmässä. Robertson kutsui havaittua rakennetta "yhtenäiseksi" korostaakseen sen universaalisuutta, ja vaikka osmiumilla tapahtuvan kalvon värjäytymisen molekyylimekanismeja ei tunneta, tätä rakennetta pidettiin vahvistuksena kalvon kaksikerroksisen mallin pätevyydestä. On kuitenkin selvää, että kalvoihin voi kohdistua haitallisia vaikutuksia valmistettaessa näytteitä tvarten. Erityisesti tiedetään, että käsittely osmiumtetroksidilla johtaa merkittävään proteiinin menetykseen erytrosyyttikalvosta. Ja vaikka tässä tapauksessa havaittu kolmikerroksinen rakenne heijastaa jossain määrin kaksikerroksisten kalvojen organisoitumista, tarkempaa tietoa proteiinien lokalisoinnista ei tällä menetelmällä saada.
Jonkin verran tietoa kalvoproteiinien järjestyksestä saatiin uusilla menetelmillä, joista on nyt tullut "klassisia" - jäädytys-pilkkomis- ja jäädytys-etsausmenetelmät. Näissä tapauksissa valmisteet jäätyvät nopeasti ilman, että ne altistuvat haitallisille vaikutuksille, kuten ohuita paloja valmistettaessa. Lääkkeen valmistusprosessi sisältää seuraavat toiminnot.
Pakastamisen jälkeen näyte, joka on solujen tai kalvojen suspensio, leikataan pois veitsellä matalassa lämpötilassa korkeassa tyhjiössä. Hakemuksen aikana syntyvät voimat johtavat näytteen läpi kulkevan leikkauksen muodostumiseen. Kävi ilmi, että kun leikkaustaso kulkee kalvon läpi, jälkimmäinen halkeaa pääasiassa sen keskialuetta pitkin ja jakautuu kahteen puolikkaaseen. Tämän seurauksena kalvon sisäinen alue paljastuu muodostuneilla katkaisutasoilla.
Tarvittaessa näyte syövytetään - tavallinen jään sublimaatio suoritetaan tyhjiössä. Tämä mahdollistaa solukalvojen pintarakenteiden paremman visualisoinnin.
Tämän jälkeen paljastetusta pinnasta saadaan ns. kopio. Juuri tätä kopiota tutkitaan elektronimikroskoopilla. Kopion saamiseksi platina kerrostetaan ensin näytteelle noin 45°:n kulmassa valmisteen topologisten ominaisuuksien paljastamiseksi. Sitten platinakopiolle annetaan mekaaninen lujuus levittämällä hiilikerros sen päälle. Sen jälkeen valmiste sulatetaan, kopio kelluu ylös ja se otetaan kiinni erityisellä verkolla.
Tunnusomaisimpia kalvojen tutkimuksessa pakastepilkkomismenetelmällä havaittuja rakenteita ovat lukuisat kalvonsisäiset hiukkaset, joiden halkaisija on 80-100 Å ja jotka sijaitsevat kalvon katkaisujen tasolla. Yleensä ne sijaitsevat satunnaisesti, mutta joskus ne muodostavat ryhmiä. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä hiukkaset ovat mahdollisesti kalvoproteiineja. Kummallista kyllä, ohuiden osien elektronimikroskopia ei paljasta tällaisia rakenteita. Jaetun kalvon kahdesta puolikkaasta saadut kopiot eivät aina ole topologisesti toisiaan täydentäviä. Tämä tarkoittaa, että jotkut hiukkaset ovat sitoutuneet vain toiseen kalvon puolikkaasta. Singer ja Nicholson käyttivät laajasti kalvojen nestemosaiikkimallin kehittämisessä jäädytyshalkaisutietoja, koska ne osoittivat vakuuttavasti, että pallomaiset proteiinit eivät sijaitse vain kalvon pinnalla, vaan myös kaksoiskerroksen sisällä.
Kuva 1.6 esittää elektronimikrokuvaa proteoliposomivalmisteesta, joka on rekonstruoitu munan fosfatidyylikoliinista, ja fraktioimattomasta vyöhykkeen 3 proteiinin valmisteesta ihmisen erytrosyyttikalvosta; Valmiste saatiin pakaste-pilkkomismenetelmällä.
Vyöhykkeen 3 proteiini on erytrosyyttikalvon pääproteiinikomponentti ja sen tiedetään kuljettavan anioneja. Jos fosfolipidivesikkelit eivät sisällä tätä proteiinia, tuloksena olevilla jäädytetyillä lastuvalmisteilla on sileä pinta.
Kun vyöhykkeen 3 proteiini liitetään fosfolipidirakkuloihin, halkeamiin ilmaantuu kalvonsisäisiä hiukkasia, jotka ovat käytännössä erottamattomia erytrosyyttikalvoissa havaituista partikkeleista. Lisäksi pH-arvossa 5,5 punasolukalvossa näkyvät hiukkaset aggregoituvat, ja tämä aggregaatio tapahtuu vyöhykkeen 3 proteiinin vuorovaikutuksen seurauksena kahden muun proteiinin, spektriinin ja aktiinin kanssa.
Jälkimmäiset ovat erytrosyyttikalvon sisäpinnalla sijaitsevia sytoskeleton komponentteja. Rekonstruoitu järjestelmä, joka koostuu vyöhykkeen 3 proteiinista ja fosfatidyylikoliinista, käyttäytyy samalla tavalla, ja partikkelien aggregaatiota havaitaan spektriinin ja aktiinin läsnä ollessa pH:ssa 5,5, mutta ei pH:ssa 7,6.
Nämä tiedot vahvistivat edelleen käsitystä kalvoproteiineista pallomaisina hiukkasina, jotka liikkuvat vapaasti kalvotasossa. Mielenkiintoista on, että staattiset mikrovalokuvat valmisteista, jotka on saatu jäädytyssirutusmenetelmällä, auttoivat tutkijoita tutkimaan kalvojen dynaamisia ominaisuuksia. Kuten näemme, kalvoissa on monia proteiineja, jotka eivät voi uida vapaasti lipidimeressä.
4. Kalvojen eristäminenViimeisten kolmen vuosikymmenen aikana on tullut yhä selvemmäksi, että suurin osa solujen toiminnoista suoritetaan kalvojen suoran vaikutuksen avulla.
Sekä kasvi- että eläinsolut on jaettu osastoihin, ja monet sytoplasmiset organellit, kuten luvussa 1.1 esitetään, ovat luonteeltaan membraaneja.
Useimmille soluille tyypillisten organellien lisäksi on olemassa myös erikoistuneita kalvojärjestelmiä, kuten lihassolujen sarkoplasminen verkkokalvo, ääreishermosäikeiden myeliinivaippa, kloroplastien tylakoidikalvot ja verkkokalvon sauvojen levyjen kalvot. Prokaryoottisilla organismeilla on myös kalvoja, vaikkakaan eivät niin kehittyneitä kuin eukaryoottisilla organismeilla.
Grampositiivisilla bakteereilla, kuten Bacillus subtiliksella, on vain sytoplasminen kalvo, kun taas gramnegatiivisilla bakteereilla, kuten Escherichia colilla, on myös ulompi kalvo, joka sijaitsee ohuen peptidoglykaanin soluseinän päällä.
Joitakin erikoistuneita organelleja on löydetty myös prokaryoottisoluista. Joillakin eläimille patogeenisillä viruksilla, kuten vaipallisilla viruksilla, on todellinen kalvo, ja tällaiset kalvot ovat osoittautuneet erittäin mielenkiintoisiksi tutkia.
Kalvojen tutkimus liittyy pääsääntöisesti niiden puhdistukseen, ja jokaiselle kalvotyypille on ominaista omat olosuhteet preparatiivista eristystä varten.
Joten jos sinun on tutkittava minkä tahansa solun plasmakalvoa, sinun on ensin eristettävä nämä solut kudoksesta. Sitten on valittava optimaaliset olosuhteet solujen hajottamiseksi ja kiinnostavien kalvojen erottamiseksi muista solukomponenteista. Eristettyjen kalvojen puhtauskriteerit ansaitsevat erityistä huomiota.
4.1 Solujen tuhoaminen
On toivottavaa valita tekniikka, joka tuhoaa tehokkaasti itse solut säilyttäen samalla eristettävien kalvojen rakenteen. Monille eläinsoluille voidaan käyttää suhteellisen hellävaraista menettelyä, kuten homogenointia lasiseinäisissä Downs- tai Potter-Elveheim-homogenisoijissa teflonsurvin kanssa. Tässä tapauksessa solut tuhoutuvat leikkausvoimien vuoksi, joita syntyy, kun suspensio pakotetaan teflonsurvin ja homogenisaattorin lasiseinämän välisen kapean raon läpi. Tällä hoidolla plasmakalvo "hajoaa" ja sidokset erilaisten organellien välillä tuhoutuvat samalla kun itse organellien eheys säilyy. Tällä menetelmällä voidaan myös erottaa toisistaan plasmakalvon erikoisalueita, esimerkiksi epiteelisolujen kalvon basolateraaliset tai apikaaliset alueet. On toivottavaa toimia olosuhteissa, joissa organellien eheys säilyy hydrolyyttisten entsyymien vapautumisen mahdollisuuden minimoimiseksi ja myöhempien kalvoerotusoperaatioiden helpottamiseksi.
Seinämäisten solujen tuhoamiseksi tarvitaan tiukempia menetelmiä. Joskus ennen solujen tuhoutumista niitä käsitellään ensin entsyymeillä, jotka hajottavat soluseinän komponentteja sen myöhemmän tuhoutumisen helpottamiseksi. Esimerkiksi käsittelyä Tris-EDTA-puskurilla ja lysotsyymillä käytetään tuhoamaan E. coli -soluja. Tiukempia tekniikoita ovat solujen hankaus, sonikointi ja ekstrudointi. Hionta suoritetaan yleensä erilaisten hankaavien materiaalien - hiekan, alumiinioksidin tai lasihelmien - läsnä ollessa. Pienet määrät materiaalia voidaan jauhaa huhmareessa, mutta suurempia määriä varten on käytettävä erityisiä mekaanisia laitteita. Bakteerisolut tuhoutuvat usein ultraäänellä. Uskotaan, että tässä tapauksessa tuhoutuminen tapahtuu kavitaatiosta johtuvien leikkausvoimien vaikutuksesta. Samat voimat esiintyvät, kun solususpensio pakotetaan pienen reiän läpi, esimerkiksi kun solut tuhotaan ranskalaisella puristimella. Näitä menetelmiä on monia erilaisia, ja niiden valinta riippuu tutkittavan kalvojärjestelmän ominaisuuksista.
On huomattava, että solujen tuhoutumisen aikana saadut kalvofragmentit muodostavat yleensä spontaanisti rakkuloita. Esimerkki on:
1) mikrosomit, jotka ovat peräisin plasmakalvosta, endoplasmisesta retikulumista tai erikoistuneista järjestelmistä, kuten sarkoplasmakalvosta;
2) submitokondriaaliset partikkelit sisäisestä mitokondriokalvosta;
3) synaptosomit, jotka muodostuvat, kun hermopäätteet repeytyvät irti synaptisten kontaktien alueella;
4) E. colin plasmakalvosta muodostuneet bakteerikalvorakkulat. Vesikkelejä muodostuu myös muista kalvojärjestelmistä, esimerkiksi Golgi-laitteen kalvoista. Niiden koko riippuu useimmissa tapauksissa voimakkaasti solujen tuhoamismenetelmästä. Tämä on erityisen tärkeää, koska rakkuloiden koko määrää suurelta osin niiden sedimentoitumisnopeuden sentrifugoinnin aikana ja niiden käyttäytymisen kalvonpuhdistuksen myöhemmissä vaiheissa. Jotkut kalvot eivät muodosta rakkuloita, erityisesti toistensa kanssa kosketuksissa olevien eläinsolujen sivupintojen kalvot. Kun tällaiset solut tuhoutuvat, pari vierekkäistä kalvofragmenttia repeytyy irti, joita kosketusalue pitää yhdessä. Tällaisten kontaktien läsnäolo estää fragmenttien sulkeutumisen vesikkeleiksi, joten kalvot vapautuvat levyjen tai nauhamaisten rakenteiden muodossa.
Suuri merkitys solujen tuhoamisessa on myös oikea väliaineen valinta. Esimerkiksi kalvoorganellien pitämiseksi suljettuna tulisi käyttää väliainetta, joka on isoosmoottinen niiden sisäisen sisällön suhteen. Useimmiten tähän käytetään sakkaroosiliuosta, jonka pitoisuus on 0,25-0,30 M. Joissakin tapauksissa on parempi käyttää sorbitolia ja mannitolia. On huomattava, että isotonisuuden säilymisellä on myös tärkeä rooli koskemattomien organellien preparatiivisen eristämisen myöhemmissä vaiheissa.
4.2 Kalvojen erottaminen
Tällä hetkellä sentrifugointia käytetään yleisimmin kalvojen erottamiseen. Kalvohiukkaset voidaan luokitella niiden sedimentaationopeuden tai kelluvuustiheyden mukaan. Ensimmäistä menetelmää kutsutaan vyöhykesentrifugoinniksi ja erotus tapahtuu S-arvojen mukaan ja toinen on isopycnic sentrifugointi ja erotus tapahtuu tasapainotiheysolosuhteissa. Käytännössä käytetään yleensä jotakin näiden kahden menetelmän yhdistelmää. Kuva 1.7 esittää joidenkin solun aliyksiköiden sijainnin "S-g" koordinaattitasolla.
Abskissa näyttää hiukkasten sedimentaatiokertoimet ja ordinaatta näyttää tiheyden.
Sedimentaationopeudella tapahtuvan erottelun periaate on helppo ymmärtää vertaamalla eri fraktioiden S-arvoja. Esimerkiksi ytimillä on suhteellisen korkeat S-arvot, ts. niiden sedimentaationopeus on paljon korkeampi kuin useimpien muiden solun alaisten organellien. Tumat voidaan pelletoida selektiivisesti sentrifugoimalla soluhomogenaattia, jolloin kaikki muut organellit jäävät supernatanttiin. Samanaikaisesti sileää ja karkeaa endoplasmista retikulumaa ei voida erottaa vyöhykesentrifugoinnilla.
Niiden tiheyseroja käytetään usein eri kalvofraktioiden eristämiseen soluhomogenaatista. Tätä tarkoitusta varten suoritetaan sentrifugointi tiheysgradientissa. Useimmiten sakkaroosia käytetään tiheysgradientin luomiseen, mutta tällä menetelmällä on vakavia haittoja. Eri kalvofraktioiden erottamiseen tarvittavan tiheyden saavuttamiseksi on välttämätöntä valmistaa korkean sakkaroosipitoisuuden omaavia liuoksia, joilla on korkea viskositeetti ja jotka ovat myös hypertonisia. Subsellulaaristen organellien vieminen hypertoniseen sakkaroosiliuokseen johtaa niiden kuivumiseen, ja myöhempi liuoksen säätäminen isotonisiin olosuhteisiin liittyy usein hajoamiseen ja organellien vaurioitumiseen. Toinen ongelma on, että monet kalvoorganellit ovat sakkaroosin läpäiseviä. Se voi myös johtaa organellien osmoottiseen tuhoutumiseen. Sakkaroosin tunkeutuminen erotettaviin kalvoorganelleihin voi muuttaa niiden tehollista tiheyttä.
Taulukko 1.1. Fyysinen aika käyttää yhä enemmän muita välineitä tiheysgradientin luomiseen. Jotkut näistä ympäristöistä on lueteltu taulukossa 1.1
Näiden ongelmien ratkaisemiseksi viimeiset ominaisuudet gradienttimedian.
1. Ficoll. Korkean molekyylipainon hydrofiilinen sakkaroosipolymeeri, jota voidaan käyttää C "-liuoksien saamiseksi, tiheys jopa 1,2 g / ml. Sen tärkein etu on liuosten alhainen osmoottinen paine verrattuna liuoksiin, joissa on vastaava sakkaroosipitoisuus. Tästä johtuen on mahdollista luoda liuoksia, jotka ovat isotonisia kaikilla pitoisuuksilla, koska väliaineeseen on lisätty sakkaroosia tai fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja. Haittoja ovat saatujen liuosten korkea viskositeetti ja viskositeetin ja osmolaarisuuden merkittävästi epälineaarinen riippuvuus. keskittyminen.
2. Metritsamidi. Trijodisubstituoidun glukoosibentsamidin metrisamidiliuosten tiheys on suurempi kuin ficoll-liuoksilla samoilla pitoisuuksilla. Metritsamidiliuosten tärkein etu on niiden erittäin alhainen viskositeetti, joka mahdollistaa nopeamman erottumisen.35 % metritsamidiliuoksella on lähes fysiologinen osmolaarisuus, joten useimmat kalvoerotuksen toiminnot voidaan suorittaa altistamatta niitä hypertonisille liuoksille. Natriummetritsoaatti on samankaltainen yhdiste, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuin metritsamidilla, sillä ainoalla erolla, että sen liuos on isotoninen noin 20 %:n pitoisuudella. Natriummetritsoaattia käytetään ensisijaisesti ehjien solujen eristämiseen. Naikodenz on myös trijodibentsoehapon johdannainen, mutta sillä on kolme hydrofiilistä sivuketjua. Sentrifugoitaessa se kehittää nopeasti oman tiheysgradienttinsa; käytetään eristämään subsellulaarisia organelleja.
Percoll. Polyvinyylipyrrolidonilla päällystetty silikageelikolloidinen suspensio. Tämä pinnoite vähentää silikageelin myrkyllistä vaikutusta. Percollin tärkein etu on, että se ei tunkeudu biologisten kalvojen läpi, ja sen liuoksilla on alhainen viskositeetti ja alhainen osmolaarisuus. Suuresta hiukkaskoosta johtuen Percoll-liuoksen sentrifugointi kohtuullisilla nopeuksilla johtaa tiheysgradientin muodostumiseen. Siksi eroaminen tapahtuu yleensä hyvin nopeasti. Sentrifugoinnissa käytetty väliaine voi olla isotoninen koko tilavuudessa johtuen suoloista tai sakkaroosista. Hellävaraisen gradientin luominen ei ole vaikeaa, mikä mahdollistaa kalvofraktioiden erittäin tehokkaan erottelun niiden kelluvuustiheyden mukaan.
Sorbitoli ja mannitoli. Näitä aineita käytetään joskus sakkaroosin sijasta, koska julkaistujen tietojen mukaan ne tunkeutuvat joidenkin biologisten kalvojen läpi huonommin kuin sakkaroosi.
Huomaa, että glyserolia ei käytetä tiheysgradientin luomiseen, koska sillä ei voida saavuttaa riittävän korkeita tiheysarvoja. Alkalimetallisuoloja, kuten CsCl:a, käytetään vain silloin, kun tarvitaan suuritiheyksisiä liuoksia. On kuitenkin pidettävä mielessä, että tasapainotiheyden luomiseen vaadittavilla pitoisuuksilla näillä suoloilla on usein vaurioittava vaikutus kalvon organelleihin.
Myös muita menetelmiä käytetään kalvojen eristämiseen soluhomogenaateista, vaikkakaan ei niin usein kuin sentrifugointia.
1. Vaiheen jakautuminen. Tässä tapauksessa kalvohiukkasten erottuminen tapahtuu niiden pintaominaisuuksien mukaisesti. Tätä tarkoitusta varten muodostetaan kaksi sekoittumatonta kerrosta eri vesiliukoisten polymeerien vesiliuoksia. Esimerkkejä ovat polyetyleeniglykolidekstraanin ja dekstraanikollin seokset. Kalvohiukkaset erotetaan niiden affiniteetin mukaan näihin faaseihin. Jälkimmäiset voidaan valita siten, että ne erottavat kalvot niiden pintavarauksen tai hydrofobisuuden perusteella.
Jatkuva vapaan virtauksen elektroforeesi. Tässä tapauksessa hiukkasten erottuminen tapahtuu niiden sähkövarauksen mukaisesti. Jaettavaa lääkettä syötetään jatkuvasti ohueen puskurikerrokseen, joka virtaa alas pystysuoraa seinämää pitkin. Tässä tapauksessa sähkökenttä kohdistetaan kohtisuoraan virtaussuuntaan nähden. Siten hiukkasten elektroforeettinen erottuminen tapahtuu virtaavan puskurin yli, joka kerätään kammion pohjalle erillisinä fraktioina.
affiniteettiadsorptio. Erotus perustuu biospesifiseen vuorovaikutukseen kalvokomponenttien ja kiinteän faasin välillä. Monoklonaalisten vasta-aineiden löytämisen myötä tuli mahdolliseksi luoda preparatiivisia tekniikoita, jotka perustuvat spesifisten antigeenisten komponenttien käyttöön kalvon eristämiseen. Saadut vasta-aineet voidaan kiinnittää kovalenttisesti kiinteään kantajaan ja niiden avulla suorittaa vastaavien kalvojen spesifinen sitoutuminen. Useimmiten tätä menetelmää käytetään kalvoproteiinien eristämiseen. Yksi tässä esiin nousevista ongelmista liittyy sellaisten kalvon eluutio-olosuhteiden valintaan, jotka eivät aiheuta proteiinien denaturaatiota.
Menetelmä, joka perustuu silikageelimikrorakeiden käyttöön. Plasmakalvojen osuus eukaryoottisolujen kaikkien kalvojen kokonaismassasta on yleensä enintään 1°7o. Siksi ehdottoman puhtaiden plasmakalvojen eristämiseen liittyy suuria vaikeuksia. Yksi lähestymistapa, joka on kehitetty erityisesti plasmakalvojen eristämiseen, perustuu kationisoitujen silikageelimikrohelmien käyttöön. Nämä rakeet adsorboituvat voimakkaasti ehjien solujen plasmakalvon ulkopinnalle, ja rakeisiin liittyvä plasmakalvojen fraktio erottuu helposti sakkaroositiheysgradientissa muista kalvoista johtuen rakeiden suuremmasta tiheydestä. Tämän menetelmän piirre on, että tuloksena olevassa valmisteessa plasmamembraani sisäpinnallaan muutetaan liuokseksi.
4.3 Puhtauskriteerit kalvofraktioille
Ehkä objektiivisin kriteeri eristetyn kalvofraktion puhtaudelle on se, että siinä on jokin ainutlaatuinen komponentti, joka sisältyy vain tähän kalvoon tai on siinä vallitseva. Tyypillisesti tällaiset komponentit ovat entsyymejä, joita tässä tapauksessa kutsutaan markkereiksi. Lista markkerientsyymeistä, joita käytetään säätelemään kalvofraktioiden puhtautta, on esitetty taulukossa 1.2. Entsyymin aktiivisuutta määritettäessä tulee ottaa huomioon, että se voi olla piilevässä muodossa esim. tosiasia, että se sijaitsee erittyneiden kalvorakkuloiden sisäpinnalla. Muita eristettyjen kalvojen puhtauden arviointiin liittyviä ongelmia tarkastellaan katsauksessa. On huomattava, että suositellut menetelmät ovat useimmissa tapauksissa hyvin kehitettyjä ja standardoituja.
Joissakin tapauksissa sopivammat kalvomarkkerit eivät ole entsyymejä, vaan lektiinien, hormonien, toksiinien tai vasta-aineiden spesifisiä reseptoreita. Jos tutkittavat järjestelmät ovat hyvin karakterisoituja, kalvofraktion puhtaus voidaan arvioida sen proteiinikoostumuksen perusteella, joka on määritetty polyaknatriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa. Esimerkiksi gramnegatiivisten bakteerien ulkokalvolla on tyypillinen joukko polypeptidejä, joita ei ole läsnä sytoplasmisessa kalvossa.
Taulukko 1.2 Markkerit, joita käytetään nisäkässoluista eristettyjen kalvofraktioiden puhtauden säätelyyn
Kalvofraktio markkerientsyymi Plasmakalvot 5"-nukleotidaasi Alkalinen fosfodiesteraasi Na * / K + -ATPaasi (basolateraalinen-
epiteelin kalvo solut) Adenylaattisyklaasi (perus hepatosyyttikalvo) Aminopeptidaasi (kalvo harjan reunan epiteeli) Mitokondriot (sisäinen Sytokromi c oksidaasi kalvo) Sukkinaatti-sytokromi-c-oksido- reduktaasi Mitokondriot (ulompi Monoamiinioksidaasi kalvo) Lysosomit Hapan fosfataasi 0-galaktosendaasi Peroksisomit Katalaasi uraattioksidaasi D-aminohappooksidaasi Laitteiden kalvot Galaktosyylitransferaasi Golgi Endoplasminen Glukoosi-6-fosfataasi verkkokalvo Koliinifosfotransferaasi NADPH-sytokromi-c-oksido- reduktaasi Sytosoli laktaattidehydrogenaasi Muita kriteerejä, joita voidaan käyttää arvioitaessa kalvojen puhtautta, ovat niiden morfologia, joka havaitaan elektronimikroskopialla, ja kemiallisen koostumuksen ominaisuudet. Esimerkiksi fraktiot, jotka edustavat plasmakalvoa, Golgin laitetta tai mitokondrioita, voidaan tunnistaa niiden morfologian perusteella. Joissakin tapauksissa lääkkeelle on ominaista sen kolesterolipitoisuus. Esimerkiksi mitokondriokalvot sisältävät paljon vähemmän kolesterolia kuin Golgi- ja plasmakalvot.
Pesuainemolekyylit miselliä kohden. Kalvotutkimuksessa käytetään melko rajoitettua valikoimaa pesuaineita. Taulukossa. 1 esittää ne, joita käytetään useimmiten kalvojen liuottamiseen ja rekonstruoimiseen. Näille pesuaineille on ominaista melko korkeat CMC-arvot (10-4-10-2 M) ja se, että ne kuuluvat niin kutsuttujen pehmeiden pesuaineiden luokkaan, toisin sanoen ...
Kaksoiskerroksen muodostuminen on lipidimolekyylien erityinen ominaisuus, ja se toteutuu jopa solun ulkopuolella. Kaksoiskerroksen tärkeimmät ominaisuudet: - itserakentumiskyky - juoksevuus - epäsymmetria. 1.2. Vaikka biologisten kalvojen pääominaisuudet määräytyvät lipidikaksoiskerroksen ominaisuuksien perusteella, useimmat spesifiset toiminnot saadaan aikaan membraaniproteiineilla. Suurin osa niistä tunkeutuu kaksoiskerroksen läpi yhden...
Punasolujen plasmakalvon sisältämien proteiinien tutkiminen mahdollisti uusien ideoiden muodostamisen kalvojen rakenteesta. Erityisesti oletettiin, että ainakin joillakin kalvoilla on "luuranko". Ihmisen erytrosyyttien kalvo sisältää viisi pääproteiinia ja suuren joukon pieniä proteiineja. Useimmat kalvoproteiinit ovat glykoproteiineja. Punasolukalvon kiinteät proteiinit sisältävät glykoforiinin ("sokerin kantaja"). Sen molekyylipaino on 30 000; glykoforiini sisältää 130 aminohappotähdettä ja monia sokeritähteitä, jotka muodostavat noin 60 % koko molekyylistä. Polypeptidiketjun toisessa päässä on monimutkaisen rakenteen hydrofiilinen pää, joka sisältää jopa 15 oligosakkaridiketjua, joista jokainen koostuu noin 10 sokeritähteestä. Glykoforiinin polypeptidiketjun toisessa päässä on suuri määrä glutamiini- ja asparagiinihappojäännöksiä (kuvat 12-20), jotka sisältävät negatiivisen varauksen pH:ssa 7,0. Molekyylin keskellä, kahden hydrofiilisen pään välissä, on polypeptidiketjun osa, joka sisältää noin 30 hydrofobista aminohappotähdettä. Glykoforiinimolekyylin sokeririkas pää sijoittuu erytrosyyttikalvon ulkopinnalle, työntyen siitä esiin pensaan muodossa. Uskotaan, että glykoforiinimolekyylin keskellä sijaitseva hydrofobinen alue kulkee lipidikaksoiskerroksen läpi ja napainen pää negatiivisesti varautuneilla aminohappotähteillä on upotettu sytosoliin. Glykoforiinin sokeririkas pää sisältää antigeenisiä determinantteja, jotka määrittävät verityypin (A, B tai O). Lisäksi siinä on kohtia, jotka sitovat joitain patogeenisiä viruksia.
Toisen punasolukalvon tärkeän proteiinin - spektrinon - osuus on jopa 20 % kalvon proteiinien kokonaismäärästä.
Riisi. 12-20. Glykoforiinimolekyyli erytrosyyttikalvossa. Kalvosta ulkonevissa haarautuneissa hiilihydraattiketjuissa on tiettyjä kohtia, jotka määrittävät veriryhmän, sekä kohtia, jotka ovat vastuussa tiettyjen virusten sitoutumisesta.
Tämä perifeerinen proteiini sijaitsee kalvon sisäpinnalla; se on helppo purkaa. Spektriinimolekyyli koostuu neljästä polypeptidiketjusta, joiden kokonaismolekyylipaino on noin 1 miljoona; nämä ketjut muodostavat pitkiä 100–200 nm pitkiä joustavia sauvoja. Sitoutumalla tiettyihin proteiineihin ja lipideihin erytrosyyttikalvon sisäpinnalla spektrimolekyylit muodostavat joustavan hilan, jolla ilmeisesti on kalvorungon rooli. Aktiinimikrofilamentit sitoutuvat myös spektriiniin, ja on hyvin todennäköistä, että ne yhdistävät spektriinisauvat toisiinsa. Voidaan siis sanoa, että erytrosyyttikalvolla on luuranko eli runko, johon on kiinnittynyt spesifisiä lipidejä ja kalvoproteiineja (kuvat 12-21).
Muiden solujen plasmakalvoilla on monimutkaisempi rakenne.
Riisi. 12-21. Kaaviomainen esitys punasolukalvon osasta. Kaavio esittää oligosakkaridi"antenneja", jotka muodostuvat kalvon glykoproteiineista ja glykolipideistä, glykoforiinin sivuoligosakkaridiketjuista sekä spektriinimolekyylien rungosta, jotka on kiinnitetty kalvon sisäpintaan ja jotka on yhdistetty toisiinsa lyhyillä aktiinifilamenteilla.
Solujen ulkopinnalla monissa tiheissä kudoksissa on toinen tärkeä glykoproteiini, fibronektiini (luku 11.12), jolla on korkea tarttumiskyky ja joka mahdollisesti mahdollistaa samantyyppisten solujen kiinnittymisen toisiinsa.
vastakkaiseen suuntaan
