GEENITEKNIIKKA(syn. geenitekniikka) - molekyylibiologian ja genetiikan tutkimuksen suunta, jonka perimmäisenä tavoitteena on saada laboratoriotekniikoita käyttäen organismeja, joilla on uusia, myös luonnossa esiintymättömiä, perinnöllisten ominaisuuksien yhdistelmiä. G. ja. mahdollisuus määrätietoiseen manipulointiin nukleiinihappofragmenteilla molekyylibiologian ja genetiikan uusimpien saavutusten vuoksi. Näihin saavutuksiin kuuluu geneettisen koodin universaalisuuden vahvistaminen (katso), toisin sanoen se tosiasia, että kaikissa elävissä organismeissa samojen aminohappojen sisällyttämistä proteiinimolekyyliin koodaavat samat nukleotidisekvenssit DNA-ketjussa; geneettisen entsymologian onnistumiset, jotka tarjosivat tutkijalle joukon entsyymejä, jotka mahdollistavat erillisten geenien tai nukleiinihappofragmenttien saamisen eristetyssä muodossa, nukleiinihappofragmenttien in vitro -synteesin toteuttamiseksi - t:n yhdistämiseksi saadut fragmentit yhdeksi kokonaisuudeksi. Siten organismin perinnöllisten ominaisuuksien muutos G.:n ja. rajoittuu uuden geneettisen materiaalin rakentamiseen erilaisista fragmenteista, tämän materiaalin viemisestä vastaanottajaorganismiin, olosuhteiden luomiseen sen toiminnalle ja vakaalle perinnölle.

Yksi tavoista saada geenejä on kemia. synteesi. Sen jälkeen kun Holly (A. Holli) Yhdysvalloissa, A. A. Baev Neuvostoliitossa ja muut tutkijat onnistuivat tulkitsemaan erilaisten kuljetus-RBGK:n (tRNA) rakenteen, X. Koran ym. suorittivat kemian. leipomohiivan alaniini-tRNA:ta koodaavan DNA:n synteesi.

Mutta tehokkain keino keinotekoisen geenisynteesin menetelmä liittyy Baltimoren (D. Baltimore) ja Teminin (H. Temin) löytämän RNA-riippuvaisen DNA-polymeraasientsyymin (käänteiskopioijaentsyymin) käyttöön onkogeenisissä viruksissa (katso). Tämä entsyymi on eristetty ja puhdistettu soluista, jotka on infektoitunut tietyillä RNA:ta sisältävillä onkogeenisillä viruksilla, mukaan lukien linnun myeloblastoosivirus, Rous-sarkooma ja hiiren leukemia. Käänteistranskriptaasi tarjoaa DNA-synteesin lähetti-RNA (mRNA) -templaatissa. mRNA-molekyylien käyttö templaatteina DNA-synteesiä varten helpottaa suuresti korkeampien organismien yksittäisten rakennegeenien keinotekoista synteesiä, koska mRNA-molekyylin typpipitoisten emästen sekvenssi on tarkka kopio vastaavien rakennegeenien typpipitoisten emästen sekvenssistä, ja tekniikka erilaisten mRNA-molekyylien eristämiseksi on melko hyvin kehittynyt. Edistyminen ihmisen, eläimen ja linnun hemoglobiiniin kuuluvan globiiniproteiinin mRNA:n, silmälinssiproteiinin mRNA:n, immunoglobiinin mRNA:n, spesifisen pahanlaatuisen kasvaimen (myelooma) proteiinin mRNA:n eristämisessä mahdollisti geenien rakenneosan syntetisoinnin, joka koodaa joitakin näistä proteiineista käänteiskopioijaentsyymin avulla.

Kuitenkin elimistössä rakennegeenit toimivat yhdessä säätelygeenien kanssa, joiden nukleotidisekvenssiä ei toista mRNA-molekyyli. Siksi mikään näistä menetelmistä ei salli rakenne- ja säätelygeenien sarjan synteesiä. Ratkaisu tähän ongelmaan tuli mahdolliseksi yksittäisten geenien eristämismenetelmien kehittämisen jälkeen. Bakteerigeenien eristämiseen käytetään pieniä DNA:ta sisältäviä sytoplasmisia rakenteita, jotka voivat replikoitua (katso Replikaatio) bakteerikromosomista riippumatta. Nämä rakenteet muodostavat yhden ryhmän bakteerien ekstrakromosomaalisia geneettisiä elementtejä - plasmideja (katso Plasmidit). Jotkut niistä voidaan viedä bakteerin kromosomiin ja sitten spontaanisti tai esimerkiksi indusoivien aineiden vaikutuksen alaisena. UV-säteilytys, siirtyä kromosomista sytoplasmaan, viemällä mukanaan viereiset isännän kromosomigeenit-solut. Tällaisia ​​ominaisuuksia omaavien bakteerien ekstrakromosomaalisia geneettisiä elementtejä kutsutaan episomeiksi [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episomeja (katso) ovat kohtalaiset faagit (katso Bakteriofagi), bakteerien sukupuolitekijä, mikro-organismien lääkeresistenssitekijät (katso), bakteriosinogeeniset tekijät (katso). Sytoplasmassa episomien vangitsemat geenit replikoituvat koostumuksessaan ja muodostavat usein useita kopioita. Tehokkaan menetelmän kehittäminen plasmidien, erityisesti bakteerikromosomin geneettistä materiaalia sisältävien lauhkeiden faagien eristämiseksi ja bakteriofagin genomiin sisältyvän bakteerisolukromosomin fragmentin eristämiseksi mahdollisti vuonna 1969 J. Beckwithin ym. eristää laktoosioperoni, geeniryhmä, joka säätelee Escherichia colin laktoosin imeytymiseen tarvittavia synteesientsyymejä. Samanlaista tekniikkaa käytettiin Escherichia colin tyrosiinin siirto-RNA:n synteesiä säätelevän geenin eristämiseen ja puhdistamiseen (katso Ribonukleiinihapot).

Plasmidien käyttö mahdollistaa käytännössä minkä tahansa bakteerigeenin saamisen eristetyssä muodossa ja siten mahdollisuuden rakentaa DNA-molekyylejä eri lähteistä. Tällaisia ​​hybridirakenteita voidaan kerääntyä soluihin merkittäviä määriä, koska monet plasmidit replikoituvat tietyissä olosuhteissa intensiivisesti bakteerin sytoplasmassa muodostaen kymmeniä, satoja ja jopa tuhansia kopioita.

G:n menestykset ja. liittyy tekniikoiden kehittämiseen eri lähteistä peräisin olevien geneettisten rakenteiden yhdistämiseksi yhdeksi DNA-molekyyliksi. Ratkaiseva tekijä hybridimolekyylien suunnittelussa in vitro oli restriktioendonukleaasien käyttö - erityiset entsyymit, jotka pystyvät leikkaamaan DNA-molekyylejä tiukasti määritellyillä alueilla. Tällaisia ​​entsyymejä löytyy Escherichia coli -soluista, joissa on R-tyypin plasmideja, jotka aiheuttavat bakteerien vastustuskykyä tietyille lääkkeille, Haemophilus influenzae-, Serratia marcescens- ja muiden mikro-organismien soluissa. Yksi yleisimmin käytetyistä tämän tyyppisistä entsyymeistä on EcoRI-restriktioendonukleaasi, jota RI-plasmidi syntetisoi E. coli -soluissa. Entsyymi tunnistaa DNA:n osan, jolla on ainutlaatuinen kuuden emäsparin sekvenssi, ja katkaisee kaksijuosteisen DNA-rakenteen tässä osassa siten, että molemmille puolille muodostuu neljän nukleotidin yksijuosteiset päät (ns. tahmeat päät). Koska entsyymi leikkaa DNA-molekyylejä niiden alkuperästä riippumatta tiukasti määritellyllä tavalla, kaikilla entsyymin vaikutuksesta syntyvillä DNA-fragmenteilla on samat tahmeat päät. Minkä tahansa DNA-fragmentin komplementaariset tahmeat päät yhdistetään vetysidoksilla, jolloin muodostuu hybridi pyöreä DNA (kuvio). Hybridi-DNA-molekyylin stabiloimiseksi käytetään toista entsyymiä - polynukleotidiligaasia, joka palauttaa restriktioentsyymin katkaisemat kovalenttiset sidokset. EcoRI:n spesifisesti tunnistama sekvenssi esiintyy DNA:ssa korkeintaan 4 000 - 16 000 emäsparin etäisyydellä toisistaan. Siksi EcoRI:n vaikutuksesta muodostuva DNA-fragmentti voi sisältää ainakin yhden entsyymin vahingoittamattoman geenin (keskimäärin yksi geeni sisältää 1000–1500 emäsparia).

Restriktioendonukleaasien ja useiden muiden entsyymien käyttö mahdollistaa monimutkaisen rekombinantti-DNA:n saamisen. P. Bergin johtama yhdysvaltalainen tutkijaryhmä onnistui yhdistämään geneettisen tiedon kolmesta lähteestä osaksi yhtä DNA-molekyyliä: onkogeenisen apinaviruksen SV40 täydellisen genomin (katso), joka on osa lauhkean bakteriofagin genomia. λ ja E. coli -geenien ryhmä, joka vastaa galaktoosin assimilaatiosta. Suunniteltua rekombinanttimolekyyliä ei testattu toiminnallisen aktiivisuuden suhteen, koska tämän työn tekijät pysähtyivät ennen mahdollisen onkogeenisten eläinvirusten leviämisen vaaraa ihmisen suolistossa elävässä bakteeripopulaatiossa. On tunnettua, että virusten puhdistettu DNA voi tunkeutua erilaisiin nisäkässoluihin ja periä ne pysyvästi.

Ensimmäistä kertaa toiminnallisesti aktiivisia hybridi-DNA-molekyylejä konstruoivat Yhdysvalloissa S. Cohen et ai. Cohenin ryhmä ratkaisi johdonmukaisesti DNA-molekyylien yhdistämisen ja kloonauksen (selektiivisen kertymisen) ongelman, joka oli eristetty fylogeettisesti yhä kauempana toisistaan. Kloonausmenettely koostuu yleensä siitä, että eri lähteistä peräisin oleva DNA fragmentoidaan restriktioendonukleaaseilla, sitten nämä fragmentit yhdistetään in vitro yhteiseksi rakenteeksi ja viedään vastaanottajaorganismiin, joka Cohenin kokeissa on Escherichia coli. On osoitettu, että useiden bakteerilajien (mukaan lukien Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) solut voidaan transformoida (katso Transformaatio) käyttämällä yhdistelmä-DNA-molekyylejä. Tällöin hybridimolekyylin plasmidiosa (tai toinen plasmideista, jos hybridimolekyylissä on yhdistetty kaksi eri lähteestä peräisin olevaa plasmidia) toimii vektorina, eli varmistaa fylogeneettisesti vieraan geneettisen materiaalin siirtymisen vastaanottajasoluihin ja sen lisääntyminen niissä. Ensimmäinen plasmidi, jota Cohen ym. käytti vektorina, oli hänen in vitro hankkimansa plasmidi pSC101, joka säätelee bakteerien vastustuskykyä tetrasykliinille. Tämä pieni plasmidi on vain 8000 bp pitkä. EcoRI-entsyymi hyökkää siihen vain yhdessä paikassa, eikä entsyymi vahingoita plasmidin kykyä myöhemmin replikoitua E. coli -soluissa ja kontrolloida tetrasykliiniresistenssiä. Nämä ominaisuudet mahdollistivat sen käytön hybridi-DNA-molekyylien rakentamiseen in vitro. Ensimmäisissä vaiheissa eri bakteerilajeista ja sitten korkeammista organismeista eristetty plasmidi-DNA kiinnitettiin pSC101:een. Siten syntyi "kimeerisiä" plasmideja (eli jotka eivät voi esiintyä luonnollisissa olosuhteissa), jotka yhdistivät koostumukseensa Escherichia colin geneettisen materiaalin, kynsisammakon Xenopus laevis -sammakon munasoluista peräisin olevan DNA-segmentin, joka säätelee sammakon synteesiä. ribosomaalista RNA:ta ja merisiilin DNA-segmenttiä, joka ohjaa histoniproteiinien synteesiä tai hiiren mitokondrio-DNA:ta. Escherichia colin soluissa, joihin tällaisia ​​hybridejä, "kimeerisiä" plasmideja vietiin, korkeampien organismien geenien työ rekisteröitiin.

Toisin kuin pSC101, jota on solussa vain 4-6 kopiona, jotkin muut vektoreina käytetyt plasmidit voivat replikoitua useita kertoja tietyissä olosuhteissa muodostaen useita tuhansia kopioita yhdessä solussa. Tällaisia ​​ominaisuuksia on esimerkiksi ColEI-plasmidilla, joka säätelee kolisiinin synteesiä (katso Bakteriosinogeenisuus). Kuten pSC101, EcoRI-entsyymi pilkkoo ColEI:n vain yhdestä kohdasta, ja vieras DNA, joka on myös käsitelty EcoRI:llä, kiinnittyy helposti tuloksena olevaan lineaariseen molekyyliin tahmeilla päillä. Siten Escherichia colin tryptofaanioperonin geenit "ommeltiin" ColEI:hen. Soluissa, joissa oli useita kopioita konstruoidusta hybridiplasmidista, tryptofaanin biosynteesigeenien ohjaamien entsyymiproteiinien tuotanto lisääntyi dramaattisesti. In vitro -järjestelmässä oli mahdollista kiinnittää ColEI-plasmidi tiettyihin R-tekijöihin ja lauhkeaan faagiin. Tällainen työ suoritettiin ensimmäisen kerran Neuvostoliitossa akateemikko A. A. Baevin ja professori S. I. Alikhanyanin johdolla. ColEI- ja R-tekijöiden muodostamat yhdistetyt vektoriplasmidit pystyvät lisääntymään intensiivisesti bakteerisoluissa, kuten ColEI, ja samalla määrittämään solujen vastustuskyvyn antibiooteille, mikä yksinkertaistaa suuresti bakteerien - hybridiplasmidien kantajien - valintaa.

Lauhkeita faageja käytetään myös vektoreina. In vitro -järjestelmässä rakennettiin, jotka sisälsivät rakenteeseensa bakteerigeenejä, muiden faagien tai korkeampien organismien DNA:ta (esim. Drosophila-hedelmäkärpäsen DNA:ta).

Hybridi-DNA:n toiminnallinen aktiivisuus määräytyy niiden mahdollisuudesta siirtyä vastaanottajaorganismien soluihin ja myöhempään lisääntymiseen (amplifikaatioon) näissä soluissa. Ei pelkästään bakteereja, kuten edellä mainittiin, vaan myös korkeampien organismien soluja käytetään jo tehokkaasti vastaanottajina, kuitenkin toistaiseksi vain kehon ulkopuolella viljellyn kudosviljelmän muodossa. On viitteitä siitä, että bakteerigeenejä sisältävien faagien DNA voi tunkeutua ihmisen sidekudossoluihin (fibroblasteihin), protoplasteihin tai erilaistumattomaan kasvisoluviljelmään (kallus). Vuonna 1971 Amer. tutkija Merrill (S. R. Merril) et ai. raportoivat kokeista, joilla korjataan perinnöllinen vika - galaktosemia (katso) tuomalla "sairaisiin" soluihin transdusoivan faagin DNA:han sisältyvien bakteerien galaktoosigeenejä. Tämän seurauksena galaktosemiaa sairastavan potilaan solut, jotka olivat puutteellisia beeta-D-galaktoosi-1-fosfaattiuridyylitransferaasientsyymissä, eivät kyenneet assimiloimaan galaktoosia, palauttivat normaalin kykynsä kasvaa galaktoosin läsnä ollessa ja aiemmin puuttunut entsymaattinen aktiivisuus. rekisteröity otteisiinsa. Samanlaisen tuloksen saivat Horst (J. Horst) et ai. ottamalla käyttöön bakteerigeenin, joka säätelee beeta-galaktosidaasin synteesiä potilaan fibroblasteissa, joilla on yleistynyt gangliosidoosi, jolle on tunnusomaista tämän entsyymin vakava puute. Manion (W. Munyon) ja hänen työtoverinsa. käyttämällä herpesvirusta, he siirsivät tymidiinikinaasin synteesiä säätelevän geenin ihmissoluista hiiren soluihin palauttaen viallisten hiiren fibroblastien kyvyn syntetisoida tätä entsyymiä.

Yksi tavoista siirtää geneettistä tietoa ihmis-, eläin- ja kasvisoluviljelmässä on somaattisten solujen hybridisaatio, jonka ovat kehittäneet Ephrussi (V. Ephrussi) ja Barsky (G. Barski). Tämän menetelmän tehokkuus on parantunut merkittävästi sen jälkeen, kun havaittiin, että inaktivoidun Sendai-tyypin parainfluenssaviruksen hiukkaset lisäävät solufuusion tiheyttä monista eri lähteistä. Mahdollisuus siirtää yksittäisiä geenejä eristetyistä kiinanhamsterin kromosomeista hiiren sidekudossoluihin on osoitettu. Kuvataan ihmisen ja hiiren solujen hybridejä, joissa osa ihmisen kromosomeista poistetaan, kun taas toinen osa pysyy toiminnallisesti aktiivisena. Solumikrokirurgiamenetelmien kehittäminen mahdollisti soluytimien siirtämisen somaattisista soluista hedelmöitettyihin munasoluihin ja tuloksena täysin identtisten organismien saamiseksi. Soluhybridisaatio mahdollisti ihmisen globiinin synteesin indusoimisen sammakon sukusoluissa. Kaikki nämä esimerkit osoittavat G.:n potentiaalin ja.

Käytännön arvo G. ja. lääketieteessä liittyy mahdollisuuksiin korjata ihmisen perinnöllisiä aineenvaihduntahäiriöitä (katso Geeniterapia), luoda mikro-organismeja, jotka ovat menettäneet patogeenisyytensä, mutta säilyttäneet kyvyn muodostaa immuniteettia, antibioottien, aminohappojen, hormonien, vitamiinien, entsyymien synteesiä, immunoglobuliinit jne., jotka perustuvat vastaavia geenejä sisältävien mikro-organismien käyttöön. Poikkeuksellisia tuloksia voidaan saada lähitulevaisuudessa G. ja. kasvit. G.:n menetelmien ja. he yrittävät luoda kasveja, jotka voivat imeä ilmakehän typpeä ja parantaa kasviperäisten elintarvikkeiden proteiinikoostumusta. Näiden ongelmien onnistunut ratkaiseminen lisää dramaattisesti kasvien tuottavuutta, vähentää mineraalityppien tuotantoa ja kulutusta ja parantaa siten merkittävästi ympäristöä (katso). Tutkitaan mahdollisuutta luoda täysin uusia eläin- ja kasvimuotoja ylittämällä lajien väliset risteytysesteet. Kuitenkin G:n arvion mukaan ja. Uutena luonnontutkimuksen muotona tulee ottaa huomioon paitsi sen mahdollinen vallankumouksellinen rooli biologiassa, lääketieteessä ja maataloudessa, myös sen kehityksen yhteydessä syntyvät mahdollisuudet uusien patogeenisten mikro-organismien muotojen syntymiselle, hybridi-DNA:n leviäminen ihmisissä elävien, onkogeenisiä viruksia kantavien bakteerien populaatioissa jne. Tieteen saavutusten, mukaan lukien G. ja., tahallinen käyttö epäinhimillisiin, ihmisvihallisiin tarkoituksiin on tietysti mahdollista vain yhteiskunnassa, jossa ihmisen etu uhrataan voitolle ja aggressiolle.

Lisämateriaaleista

Geenitekniikka on edelleen nopeasti kehittyvä tutkimusmenetelmä molekyylibiologiassa ja genetiikassa. On huomattava, että käsitteet "geenitekniikka" ja "geenitekniikka" eivät ole täysin synonyymejä, koska geenitekniikkaan liittyvä tutkimus ei rajoitu geenien manipulointiin sinänsä. Tällä hetkellä geenitekniikan menetelmät mahdollistavat syvällisimmän ja yksityiskohtaisimman analyysin luonnollisista nukleiinihapoista - aineista, jotka vastaavat geneettisen tiedon tallentamisesta, siirtämisestä ja toteuttamisesta (katso Nukleiinihapot.), sekä luoda muunnettuja tai täysin uusia, jotka ovat ei esiinny luonnossa geenejä (katso geeni), geeniyhdistelmiä ja ekspressoivat niitä suurella tehokkuudella elävässä solussa (katso geenin ilmentävyys). Geenitekniikan konkreettisista käytännön saavutuksista viimeisen vuosikymmenen aikana tärkein pitäisi olla biologisesti aktiivisten proteiinien - insuliinin (katso), interferonin (katso), kasvuhormonin (katso Somatotrooppinen hormoni) jne. - tuottajien luominen. geenitekniikan menetelmien kehittyessä näiden aineenvaihdunnan linkkien aktivointi, to-ruis liittyvät pienimolekyylisten biologisesti aktiivisten aineiden muodostumiseen. Tällä tavalla saadaan aikaan tiettyjen antibioottien, aminohappojen ja vitamiinien tuottajia, jotka ovat monta kertaa tehokkaampia kuin näiden perinteisillä geneettisillä ja valintamenetelmillä johdettujen aineiden tuottajat. Puhtaiden proteiinirokotteiden saamiseksi hepatiitti-, influenssa-, herpes- ja suu- ja sorkkatautiviruksia vastaan ​​kehitetään menetelmiä, on toteutettu ajatus rokotteen käytöstä vacciniaviruksella, jonka genomissa on proteiinien synteesiä koodaavia geenejä. muita viruksia (esim. hepatiitti- tai influenssaviruksia) on upotettu: tuloksena rokotukset tällä tavalla konstruoidulla viruksella kehittävät immuunijärjestelmän paitsi isorokkoa, myös hepatiittia, influenssaa tai muita tämän viruksen aiheuttamia sairauksia vastaan, to-rogo-proteiinia koodaa sisäänrakennettu geeni.

Maailmanlaajuinen restriktioendonukleaasien - restriktaasien, geenimanipulaatioiden tärkeimpien "työkalujen" kokoelma, on kasvanut merkittävästi. Yli 400 rajoittavaa "tunnistamista" noin. 100 spesifistä kohtaa (kohtaa), joilla on erilainen rakenne DNA-molekyyleissä (katso Deoksiribonukleiinihapot) ja DNA-polynukleotidiketjun pilkkominen näissä kohdissa. Yhtä tällaista entsyymiä tai useiden restriktioentsyymien yhdistelmää käyttämällä voidaan eristää melkein mikä tahansa geeni osana yhtä tai useampaa DNA-fragmenttia (niin kutsuttuja restriktiofragmentteja). Tämä laajensi geenitekniikan mahdollisuuksia paitsi geenien eristämiseen, myös niiden työn aktivoimiseen, geenien rakenteen ja niiden molekyyliympäristön analysointiin. On kehitetty menetelmiä kokonaisten geenien synteesiin tietyllä nukleotidisekvenssillä, on tullut mahdolliseksi toimittaa syntetisoituja ja luonnollisia geenejä erilaisilla säätelynukleotidisekvensseillä, korvata, insertoida, poistaa yksittäisiä nukleotideja tiukasti määritellyissä geenin osissa, lyhentää tai täydentää nukleotidiketjunsa yhden nukleotidin tarkkuudella.

Geenitekniikan saavutus oli sen tunkeutuminen perinnöllisyyden mekanismien organisointiin ja toimintaan korkeampien organismien, myös ihmisten, soluissa. Juuri korkeammista eukaryooteista mielenkiintoisinta tietoa on saatu geenitekniikan menetelmillä. Geenitekniikan menestys liittyy suurelta osin uusien erikoisvektoreiden tuotantoon, jotka mahdollistavat yksittäisten DNA-fragmenttien (geenien) tehokkaan kloonauksen (lisäyksen) ja näiden geenien koodaamien proteiinien syntetisoinnin.

DNA-vektoreihin yhdistetyt restriktiofragmentit kloonataan elävään soluun käyttämällä tällaisten vektoreiden kykyä lisääntyä (replikoitua) solussa useissa kopioissa. Kloonattavien fragmenttien koosta ja tutkimuksen tarkoituksesta riippuen käytetään yhtä neljästä tyypistä vektoreita - plasmideja (katso), faageja (katso Bakteriofagi), kosmideja tai faagien johdannaisia, joissa on yksijuosteinen DNA.

Suhteellisen pienten DNA-fragmenttien (jopa 10 tuhatta emäsparia) kloonaukseen käytetään plasmidivektoreita (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19 jne.). Geenitekniikan saavutus viime vuosina on ollut faagi X:ään (Charon 4A, gtwes-B) perustuvien vektoreiden tuotanto, joissa osa genomista on korvattu vieraan DNA:n fragmentilla. Hybridigenomi on keinotekoisesti "pakattu" proteiinikuoreen ja bakteerit infektoidaan tällä rekonstruoidulla faagilla. Muodostaen useita tuhansia kopioita lisääntymisen aikana solussa, rekonstruoitu faagi hajottaa sen ja vapautuu viljelyalustaan. Tällaisten vektoreiden avulla kloonataan 10-25 tuhannen emäsparin DNA-fragmentteja.

Kosmidivektorit (pIB8, MUA-3) ovat faagi X:n ja plasmidin hybridejä. Ne sisältävät ns Faagi-DNA:n COS-sekvenssit, joita tarvitaan faagigenomien pakkaamiseen proteiinikuoreen, ja plasmidi-DNA:n segmentti, joka sallii kosmidivektorien replikoitumisen bakteereissa samalla tavalla kuin plasmidit. Näin ollen tuloksena oleva rekombinanttigenomi infektoi bakteereja suurella tehokkuudella kuten bakteriofagi, mutta lisääntyy niissä kuten plasmidi aiheuttamatta bakteerisolun kuolemaa. Kosmideja käytetään jopa 35-45 tuhannen emäsparin pituisten DNA-fragmenttien kloonaukseen.

Vektorit, jotka ovat yksijuosteisen DNA:n sisältävien faagien johdannaisia ​​(M13 mp8, M13, mp73 jne.), konstruoidaan M13-bakteriofagin pyöreän DNA-molekyylin perusteella. Vieraan DNA:n upottamiseen käytetään replikatiivista kaksijuosteista faagi-DNA-molekyyliä. Vieraan DIC:n sisältävä vektori viedään bakteerisoluihin, joissa rekombinanttimolekyylit lisääntyvät hajottamatta tätä solua ja "puntuvat pois" viljelyalustaan ​​viruspartikkelina, jossa on yksijuosteinen DNA-molekyyli. Näitä vektoreita käytetään DNA-fragmenttien (jopa 300-400 emäsparin) kloonaamiseen.

Geenimanipulaatioihin tarvittava geeni saadaan kloonaamalla sopivat yhdistelmä-DNA-molekyylit ja valitsemalla sellaiset kloonit. Niissä tapauksissa, joissa korkeampien organismien ja ihmisten geenit kloonataan / ilmentäminen to-rykh:iin E. colissa (useimmiten käytetään sellaisiin tarkoituksiin) on mahdotonta, kloonaus- ja valintamenettely suoritetaan useissa vaiheissa. Ensimmäisessä vaiheessa ns geenikirjasto DNA-fragmenteista (kloonattu suoraan solugenomista) tai vastaavan lähetti-RNA:n kloonatuista DNA-kopioista (cDNA). Vertaamalla genomisen DNA:n fragmenttien ja vastaavan cDNA:n rakennetta he saavat tärkeää tietoa geneettisen materiaalin järjestäytymisestä ja perinnöllisten sairauksien tapauksessa geneettisen materiaalin poikkeavuuksien luonteesta, jonka seurauksena on sairaus. Geenikirjastosta voidaan nykyaikaisilla tekniikoilla erottaa tarvittava geeni ympäröivien genomialueiden kanssa. Tällä hetkellä on luotu täydellisiä monien mikro-organismien, kasvien ja eläinten (nisäkkäisiin ja ihmisiin) geenikirjastoja. Useita satoja geenejä ja muita nukleotidisekvenssejä ihmisen DNA:ssa on jo kloonattu ja jossain määrin tutkittu.

Geenitekniikan tutkimuksen mahdollisuudet eivät rajoitu geenin kloonaamiseen ja suuren määrän kopioimiseen. Usein ei tarvitse vain kloonata geeniä, vaan myös varmistaa sen ilmentyminen solussa, eli toteuttaa sen sisältämä informaatio tämän geenin koodaaman proteiinin polypeptidiketjun aminohapposekvenssiin. Jos bakteerisoluun lisätty geeni saadaan saman (tai läheisen) lajin bakteereista, saattaa riittää, että geeni eristetään säätelyelementeillä, jotka säätelevät sen ilmentymistä. Muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta evolutionaarisesti etäisten organismien säätelevät nukleotidisekvenssit eivät kuitenkaan ole keskenään vaihdettavissa. Siksi, jotta saavutetaan esimerkiksi eukaryoottigeenin ilmentyminen E. coli -soluissa, säätelyalue poistetaan siitä ja tällaisen geenin rakenneosa kiinnitetään (tietyllä etäisyydellä) säätelyalueelle. bakteerigeenistä. Tämän tekniikan kehityksessä saavutettiin merkittävää edistystä, kun löydettiin Ba131-nukleaasientsyymi, jolla on ainutlaatuinen ominaisuus hydrolysoida kaksijuosteisen lineaarisen DNA-molekyylin molemmat ketjut molekyylin päästä alkaen, eli tämä entsyymi poistaa "ylimääräiset" ” minkä tahansa pituiset nukleotidisekvenssit DNA-fragmentin päästä . Tällä hetkellä rakenteelliset ja säätelyalueet eristetään erikseen käyttämällä niitä restrikaaseja, joiden "tunnistus"kohdat sijoittuvat onnistuneesti polynukleotidiketjuun, sitten "ylimääräiset" nukleotidisekvenssit poistetaan ja eukaryoottigeenin rakennealue liitetään bakteerigeenin säätelyalue. Tällä tavalla on mahdollista saavuttaa ei vain eukaryoottisten geenien ilmentyminen bakteerisoluissa, vaan päinvastoin bakteerigeenit korkeampien ja alempien eukaryoottien soluissa.

Geenitekniikan menestys liittyy läheisesti DNA-molekyylien nukleotidisekvenssin (sekvensoinnin) määritysmenetelmien kehittämiseen ja parantamiseen. Merkittävä määrä tutkijoiden käytössä olevia restriktaaseja mahdollistaa tiettyjen DNA-fragmenttien eristämisen ehdottoman spesifisyydellä, ja kloonausmenetelmien kehittäminen ja parantaminen mahdollistaa jopa ainutlaatuisten geenien fragmenttien saamisen analysointiin tarpeellisina määrinä. DNA-sekvensointimenetelmät ovat osoittautuneet niin tehokkaiksi, että usein DNA-nukleotidisekvenssiä määrittämällä saadaan tietoa vastaavien RNA-molekyylien nukleotidisekvenssistä ja syntetisoidun proteiinimolekyylin aminohappotähteiden sekvenssistä. DNA-sekvensoinnin tulosten käsittelyssä tietokoneita käytetään laajalti. Saatujen kokeellisten tietojen täydellisempää ja nopeampaa tulkintaa varten luodaan kansallisia ja kansainvälisiä nukleotidisekvenssien "tietokonepankkeja". Tällä hetkellä useiden bakteeriplasmidien ja virusten genomien täydelliset nukleotidisekvenssit on määritetty, ja ongelmana on määrittää ensin yksittäisten kromosomien täydelliset nukleotidisekvenssit ja sitten korkeampien organismien, mukaan lukien ihmiset, koko genomi. ratkaistaan.

Geenitekniikan menetelmien avulla löydettiin poikkeamia ihmisen geenien tiettyjen osien rakenteesta, mikä oli syynä perinnöllisiin sairauksiin. Useimmiten tämä menetelmä on ns. b erän analyysi. Eristetty solu-DNA altistetaan restriktioentsyymihydrolyysille, saadut fragmentit erotetaan koon mukaan käyttämällä agaroosi- taiesia. Erotetut fragmentit siirretään ("uudelleenpainetaan") erityisesti käsitellylle kromatografiselle paperille, nitroselluloosa- tai nailonsuodattimelle ja alistetaan jälleen elektroforeettiselle erottelulle. Leikkaa pois paikat elektroferogrammeista, jotka vastaavat yksittäisiä fraktioita ja sisältävät samantyyppisiä DNA-fragmentteja; elektroforegrammien leikattuja osia inkuboidaan aiemmin kloonatun geenin tai sen osan tai kemiallisesti saadun geenin kanssa. synteesi radioaktiivisen leiman sisältävän nukleotidisekvenssin avulla. Merkitty DNA koskettaa vain niitä fragmentteja analysoidusta solu-DNA:sta, jonka rukiissa on sille komplementaarisia nukleotidisekvenssejä. Muutos kiinteän leiman jakautumisessa ja määrässä normiin verrattuna mahdollistaa uudelleenjärjestelyjen arvioimisen analysoitavassa geenissä tai sen vieressä olevissa nukleotidisekvensseissä.

Tiettyjen restrikaasien "tunnistuskohdat" DNA-molekyylissä ovat jakautuneet epätasaisesti, joten näiden entsyymien hydrolyysin aikana DNA-molekyyli hajoaa useiksi eripituisiksi fragmenteiksi. DNA-rakenteen uudelleenjärjestely, jonka seurauksena olemassa olevat "tunnistuskohdat" katoavat tai ilmestyvät, johtaa näiden fragmenttien (ns. restriktiofragmenttien) joukon muutokseen, eli restriktiofragmentin pituuden ilmaantumiseen. polymorfismi (GVDRF). Uudelleenjärjestelyt DNA-molekyylissä voivat tai eivät saa aiheuttaa muutoksia synteesin aikana tai koodatun proteiinin rakenteessa; Uudelleenjärjestelyt, jotka eivät aiheuta muutoksia, ovat valtaosa, ja ne aiheuttavat normaalin RFLP:n. Kävi ilmi, että RFLP on selkeä geneettinen ominaisuus. Tällä hetkellä RFLP-analyysistä on tullut yksi tarkimmista ihmisgenetiikassa ja lääketieteellisessä genetiikassa käytetyistä menetelmistä. Useille perinnöllisille sairauksille kuvataan RFLP:n muotoja, jotka osoittavat suoraan sairauden olemassaolon tai patologisesti muuttuneen geenin kantajan.

Geenitekniikka merkitsi alkua uudelle tutkimussuunnalle, jota kutsutaan nimellä "genetics inverse". Perinteinen geneettinen analyysi (katso) suoritetaan seuraavassa järjestyksessä: merkki valitaan, merkkiyhteys geneettiseen determinanttiin selvitetään ja tämän determinantin sijainti suhteessa jo tunnettuun. Käänteisessä genetiikassa kaikki tapahtuu käänteisessä järjestyksessä: valitaan DNA-fragmentti, jolla on tuntematon toiminto, tämän DNA-fragmentin kytkentä genomin muihin alueisiin ja yhteys tiettyihin ominaisuuksiin. Tämä lähestymistapa mahdollisti menetelmien kehittämisen sellaisten sairauksien, kuten Huntingtonin korean, Duchennen taudin, kystisen fibroosin, kantajien varhaiseen diagnosointiin ja havaitsemiseen, joiden perinnöllisten vaurioiden biokemiallista luonnetta ei vielä tunneta. Käyttämällä genealogista menetelmää Huntingtonin korean perinnöllisen leviämismallien määrittämiseksi osoitettiin, että ihmisen genomista eristetty G8-DNA-fragmentti on läheisesti yhteydessä geeniin, joka määrää taudin, ja RFLP:n G8-fragmentin muotoa tässä populaatiossa. voi diagnosoida tämän taudin ja tunnistaa viallisten geenien kantajat.

Geenitekniikan menetelmien käyttöönotossa lääketieteelliseen käytäntöön liittyy edelleen monia teknisiä vaikeuksia. Monet laboratoriot ympäri maailmaa kehittävät aktiivisesti käytännössä sopivia geenitekniikan diagnostisia menetelmiä, ja näille menetelmille toivotaan lähitulevaisuudessa käyttöä, jos ei väestön lääketieteellisen tutkimuksen aikana suoritettavaan massaseulontaan (seulontaan), niin klo. ainakin perinnöllisten sairauksien riskiryhmien otantatutkimuksessa.

Geenitekniikan avulla voidaan paitsi kopioida luonnollisia yhdisteitä ja prosesseja, myös muokata niitä ja tehostaa niitä. Esimerkki tästä on uusi tutkimuslinja, jota kutsutaan proteiinitekniikaksi. Aminohapposekvenssiä ja proteiinimolekyylien avaruudellista järjestystä koskevien tietojen perusteella tehdyt laskelmat osoittavat, että tiettyjen aminohappotähteiden tietyillä korvauksilla useiden entsyymien molekyyleissä niiden entsymaattinen aktiivisuus on mahdollista merkittävästi. Eristetyssä geenissä, joka koodaa tietyn entsyymin synteesiä, tiettyjen nukleotidien tiukasti kontrolloitu korvaaminen suoritetaan geenitekniikan menetelmillä. Entsymaattisen proteiinin synteesin aikana sellaisen muunnetun geenin ohjauksessa tapahtuu ennalta suunniteltu tiukasti määriteltyjen aminohappotähteiden korvaaminen polypeptidiketjussa, mikä lisää entsymaattista aktiivisuutta moninkertaisesti luonnollisen aktiivisuuteen verrattuna. prototyyppi.

Maatalouden alalla geenitekniikan odotetaan antavan suuren panoksen uusien korkeasatoisten, kuivuutta, tauteja ja tuholaisia ​​kestävien kasvilajikkeiden valintaan sekä uusien erittäin tuottavien kasvilajikkeiden kehittämiseen. eläimet.

Kuten mitä tahansa tieteen saavutusta, geenitekniikan onnistumisia voidaan käyttää paitsi hyödyksi, myös ihmiskunnan vahingoksi. Erityisesti tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että yhdistelmä-DNA:n hallitsemattoman leviämisen vaara ei ole niin suuri kuin aiemmin luultiin. Yhdistelmä-DNA ja niitä kantavat bakteerit osoittautuivat erittäin epävakaiksi ympäristövaikutuksille, eivät eläviä ihmisillä ja eläimillä. Tiedetään, että luonnossa ja ilman ihmisen puuttumista on olemassa olosuhteita, jotka tarjoavat aktiivisen geneettisen tiedon vaihdon, tämä on ns. geenivirtaa. Luonto on kuitenkin luonut monia tehokkaita esteitä vieraan geneettisen tiedon tunkeutumiselle kehoon. Tällä hetkellä on selvää, että useimpien rekombinantti-DNA-molekyylien kanssa työskennellessä tavanomaiset varotoimet ovat varsin riittävät, ruista käyttävät esimerkiksi mikrobiologit työskennellessään tarttuvan materiaalin kanssa. Erikoistapauksia varten on kehitetty tehokkaita menetelmiä sekä biologiseen suojeluun että koekohteiden fyysiseen eristämiseen ihmisistä ja ympäristöstä. Siksi yhdistelmä-DNA:n kanssa työskentelyä koskevien sääntöjen erittäin tiukat ensimmäiset versiot tarkistettiin ja pehmennettiin merkittävästi. Mitä tulee geenitekniikan saavutusten tarkoitukselliseen käyttöön ihmisten vahingoittamiseen, niin tutkijoiden kuin yleisön on taisteltava aktiivisesti varmistaakseen, että tämä vaara on vain teoreettisesti mahdollinen.

Katso myös Biotekniikka.

Bibliografia: Alikhanyan S. I. Geenitekniikan menestys ja tulevaisuudennäkymät, Genetics, osa 12, Jvft 7, s. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. et ai. Toimivien rekombinanttien (hybridi-) DNA-molekyylien saaminen, in vitro, ibid., osa I, nro 11, s. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Geenitekniikka, Priroda, M1, s. 8, 1976; Tikhomirova L.P. ja muut. Faagin X ja plasmidien hybridi-DNA-molekyylit ColEl, Dokl. Neuvostoliiton tiedeakatemia, osa 223, nro 4, s. 995, 1975, bibliogr.; Ruskea D.D.a. S t e r n R. Methods of gene isolation, Ann. Rev. Biochem., v. 43, s. 667, 1974, bibliogr.; K a n g A. C. Y. a. o. Hiiren mitokondrio-DNA:n tutkimukset Escherichia colissa, Cell, v. 6, s. 231.1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. DNA-nukleotidisekvenssi, jonka R1-endonukleaasi rajoittaa, Proc. nat. Acad. sci. (Pesu.), v. 69, s. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V.a. o. Plasmidi ColEl molekyylivehikkelinä DNA:n kloonaukseen ja monistamiseen, ibid., v. 71, s. 3455, 1974; Huomenna J. F. a. o. Eukaryoottisen DNA:n replikaatio ja transkriptio Escherichia colissa, ibid., s. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-tani S. RNA-riippuvainen DNA-polymeraasi Rous-sarkoomaviruksen virioneissa, Nature (Lond.), v. 226, s. 1211, 1970.

Biotekniikka, toim. A. A. Baeva, M., 1984; B noin h - noin julkaisussa N. P., Zakharov A. F. ja Ivanov V. I. Medical genetics, M., 1984; M a n i a-tis G., FrichE. ja Sambrook J. Geenitekniikan menetelmät. Molekyylikloonaus, trans. Englannista, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. Ihmisen globiinigeeniklusterien DNA-polymorfismi ja molekyylipatologia, Hum. Genet., v. 69, s. 1, 1985; Beaudet A. L. Kloonattujen ihmisen ja muiden valittujen DNA:iden bibliografia, Amer. J. hum. Genet., v. 37, s. 386, 1985; In o t s t e i n D. a. o. Geneettisen kytkentäkartan rakentaminen ihmisellä restriktiofragmentin pituuden polymorfismeilla, ibid., v. 32, s. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. DNA-markkerit hermoston sairauksille, Science, v. 225, s. 1320, 1984; Motulsky A. G. Geenimanipulaation vaikutus yhteiskuntaan ja lääketieteeseen, ibid., v. 219, s. 135, 1983; Valkoinen R. a. o. Läheisesti liittyvä geneettinen merkkiaine kystiselle fibroosille, Nature (Lond.), v. 318, s. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s to y A. S. a. Guttler F. Klassisen fenyyliketonurian synnytystä edeltävä diagnoosi geenikartoituksella, J. Amer. med. Ass., v. 251, s. 1998, 1984.

L. S. Chernin, V. H. Kalinin.

geenitekniikka

Moderni biologia poikkeaa perustavanlaatuisesti perinteisestä biologiasta paitsi kognitiivisten ideoiden laajemmalla kehityssyvyydellä, myös läheisemmällä yhteydellä yhteiskunnan elämään, käytäntöön. Voimme sanoa, että meidän aikanamme biologiasta on tullut keino muuttaa elävää maailmaa vastaamaan yhteiskunnan aineellisia tarpeita. Tätä johtopäätöstä havainnollistaa ensinnäkin biologian ja biotekniikan välinen tiivis suhde, josta on tullut materiaalituotannon tärkein alue, tasavertainen kumppani ihmisen tekemille mekaanisille ja kemiallisille teknologioille sekä lääketieteelle.

Biologia ja biotekniikka ovat alusta asti kehittyneet yhdessä, ja alusta alkaen biologia on ollut biotekniikan tieteellinen perusta. Pitkään aikaan oman tiedon puute ei kuitenkaan antanut biologialle kovin suurta vaikutusta bioteknologiaan. Tilanne muuttui dramaattisesti luomisen myötä 1900-luvun jälkipuoliskolla. geenitekniikan metodologia, joka ymmärretään geenimanipulaatioksi, jonka tarkoituksena on rakentaa uusia ja rekonstruoida olemassa olevia genotyyppejä. Koska geenitekniikka on luonteeltaan menetelmällinen saavutus, se ei johtanut vallitsevien biologisia ilmiöitä koskevien käsitysten hajoamiseen, ei vaikuttanut biologian perussäännöksiin, aivan kuten radioastronomia ei horjuttanut astrofysiikan perussäännöksiä, geenitekniikan perustamista. "lämmön mekaaninen ekvivalentti" ei johtanut muutokseen lämmönjohtavuuden laeissa, ja todiste Aineen atomistinen teoria ei muuttanut termodynamiikan, hydrodynamiikan ja elastisuusteorian suhteita (A.A. Baev).

Siitä huolimatta geenitekniikka on avannut uuden aikakauden biologiassa siitä syystä, että on ilmaantunut uusia mahdollisuuksia tunkeutua biologisten ilmiöiden syvyyksiin, jotta voidaan edelleen karakterisoida elävän aineen olemassaolon muotoja, tutkia tehokkaammin geenien rakennetta ja toimintaa. molekyylitasolla ja ymmärtää työn hienovaraisia ​​mekanismeja, geneettistä laitteistoa. Geenitekniikan kehitys merkitsee vallankumousta modernissa

luonnontiede. Ne määrittelevät nykyaikaisten käsitysten arvokriteerit elävän aineen molekyyli- ja solutasojen rakenteellisista ja toiminnallisista piirteistä. Nykyaikaisella tiedolla elävistä olennoista on valtava kognitiivinen merkitys, koska ne antavat ymmärryksen yhdestä orgaanisen maailman tärkeimmistä näkökohdista ja antavat siten korvaamattoman panoksen tieteellisen maailmankuvan luomiseen. Siten kognitiivista perustaansa jyrkästi laajentanut biologia geenitekniikan kautta vaikutti myös biotekniikan nousuun.

Geenitekniikka luo pohjaa tielle, jolla ymmärretään tapoja ja keinoja "suunnitella" uusia tai parantaa olemassa olevia organismeja, mikä antaa niille suurta taloudellista arvoa ja kykyä lisätä dramaattisesti bioteknisten prosessien tuottavuutta. Geenitekniikka on kuitenkin luonut lääketieteelle uusia näköaloja monien sekä ei-perinnöllisten että perinnöllisten sairauksien diagnosoinnissa ja hoidossa. Hän avasi uusia väyliä uusien lääketieteessä käytettävien lääkkeiden ja materiaalien etsimiseen. Geenitekniikka ja biotekniikka ovat edistäneet bionanoteknologian menetelmien kehitystä.

Geenitekniikan puitteissa on geneettinen ja solu suunnittelu. Geenitekniikka on manipulointia yhdistelmä-DNA-molekyylien luomiseksi. Tätä menetelmää kutsutaan usein molekyylikloonaukseksi, geenikloonaukseksi, yhdistelmä-DNA-tekniikaksi tai yksinkertaisesti geneettiseksi manipulaatioksi. On tärkeää korostaa, että geenitekniikan kohteena ovat DNA-molekyylit, yksittäiset geenit. Päinvastoin, solutekniikka ymmärretään geneettisiksi manipuloinneiksi eristettyjen yksittäisten solujen tai kasvi- ja eläinsoluryhmien kanssa.

GEENITEKNIIKKA JA SEN TYÖKALUT

Geenitekniikka on joukko erilaisia ​​kokeellisia menetelmiä (tekniikoita), jotka mahdollistavat DNA-molekyylien ja geenien rakentamisen (rekonstruoimisen), kloonauksen tietyillä tavoitteilla.

Geenitekniikan menetelmiä käytetään tietyssä järjestyksessä (kuva 127), ja toteutuksessa erotetaan useita vaiheita

tyypillinen geenitekniikan koe, jonka tarkoituksena on kloonata geeni, nimittäin:

1. Plasmidi-DNA:n eristäminen kiinnostuksen kohteena olevan organismin soluista (alku) ja DNA-vektorin eristäminen.

2. Alkuperäisen organismin DNA:n leikkaaminen (restriktio) fragmenteiksi, jotka sisältävät mielenkiinnon kohteena olevat geenit käyttämällä yhtä restriktioentsyymeistä ja näiden geenien eristäminen restriktioseoksesta. Samanaikaisesti vektori-DNA leikataan (rajoitetaan) muuttamalla se pyöreästä rakenteesta lineaariseksi.

3. Kiinnostuksen kohteena olevan DNA-segmentin (geenin) yhdistäminen vektori-DNA:han hybridi-DNA-molekyylien saamiseksi.

4. Yhdistelmä-DNA-molekyylien tuominen transformoimalla johonkin muuhun organismiin, esim. E. coli tai somaattiset solut.

5. Bakteerien, joihin on viety hybridi-DNA-molekyylejä, istuttaminen ravintoalustaan, joka mahdollistaa vain hybridi-DNA-molekyylejä sisältävien solujen kasvun.

6. Hybridi-DNA-molekyylejä sisältävistä bakteereista koostuvien pesäkkeiden tunnistaminen.

7. Kloonatun DNA:n (kloonattujen geenien) eristäminen ja sen karakterisointi, mukaan lukien typpipitoisten emästen sekvensointi kloonatussa DNA-fragmentissa.

Riisi. 127.Geenitekniikan kokeen peräkkäiset vaiheet

Evoluution aikana bakteerit kehittivät kyvyn syntetisoida niin sanottuja restriktioentsyymejä (endonukleaaseja), joista tuli osa solujen (bakteerien) restriktio-modifikaatiojärjestelmää. Bakteereissa restriktiomodifiointijärjestelmät ovat solunsisäinen immuunipuolustusjärjestelmä vierasta DNA:ta vastaan. Toisin kuin korkeammissa organismeissa, joissa virusten, bakteerien ja muiden patogeenien tunnistaminen ja tuhoutuminen tapahtuu solunulkoisesti, bakteereissa suoja vieraalta DNA:lta (kasvien ja eläinten DNA:lta, jossa ne elävät) tapahtuu solunsisäisesti, ts. kun vieras DNA pääsee bakteerien sytoplasmaan. Suojellakseen itseään bakteerit ovat myös kehittäneet kyvyn "merkitä" omaa DNA:taan metyloivilla emäksillä tietyissä sekvensseissä. Samasta syystä vieras DNA, koska siinä ei ole metyyliryhmiä samoissa sekvensseissä, sulatetaan (leikataan) fragmenteiksi erilaisten bakteerirestriktaasien vaikutuksesta ja hajotetaan sitten bakteerien eksonukleaasien toimesta nukleotideiksi. Voimme sanoa, että tällä tavalla bakteerit suojaavat itseään kasvien ja eläinten DNA:lta, joiden organismissa ne elävät tilapäisesti (patogeeneinä) tai pysyvästi (saprofyyteinä).

Restriktioentsyymit eristettiin ensin E. coli Vuonna 1968. Kävi ilmi, että he pystyvät leikkaamaan (sulattamaan) DNA-molekyylejä eri restriktiokohdista (paikoista). Näitä entsyymejä kutsuttiin luokan I endonukleaaseiksi. Sitten bakteereista löydettiin luokan II endonukleaaseja, jotka tunnistavat spesifisesti restriktiokohdat vieraassa DNA:ssa ja suorittavat myös restriktiokohdat näissä kohdissa. Juuri tämän luokan entsyymejä alettiin käyttää geenitekniikassa. Samaan aikaan löydettiin luokan III entsyymejä, jotka sulattavat DNA:ta tunnistuskohtien läheltä, mutta näillä entsyymeillä ei ole merkitystä geenitekniikassa.

Restriktio-modifikaatiojärjestelmän toimintaa "rationalisoivat" typpipitoisten emästen niin kutsutut palindromiset (tunnistavat) sekvenssit, jotka ovat DNA:n restriktiokohtia. Palindromiset sekvenssit ovat emässarjoja, jotka lukevat samaa eteenpäin ja taaksepäin, kuten kirjainsarja tutka. Koska DNA-säikeillä on vastasuuntainen suunta, sekvenssiä pidetään palindromana, jos se on identtinen luettuna suunnassa 5" - 3" päähän yläjuosteesta ja alajuosteesta 3" - 5" päähän. loppu, nimittäin:

Palindromit voivat olla minkä kokoisia tahansa, mutta useimmat restriktioentsyymin tunnistuskohtina käytetyistä palindromeista ovat 4, 5, 6 ja harvoin 8 emäksen pituisia.

Restriktioentsyymit ovat ehdottoman välttämätön työkalu geenitekniikassa kiinnostavien fragmenttien (geenien) leikkaamiseen suurista DNA-molekyyleistä. Koska tunnetaan yli 100 restriktioentsyymiä, tämä mahdollistaa restriktioentsyymien valinnan ja fragmenttien selektiivisen leikkaamisen alkuperäisestä DNA:sta.

Restriktaasien merkittävä ominaisuus on, että ne tuottavat molekyylejä useiksi DNA-fragmenteiksi (rajoituksiksi) kielekkeissä, minkä seurauksena yksi juoste on pidempi kuin toinen tuloksena olevista päistä muodostaen eräänlaisen hännän. Tällaisia ​​päitä (häntä) kutsutaan "tahmeiksi" päiksi, koska ne pystyvät täydentämään itseään.

Harkitse rajoituksen tuloksia yhden tunnetuimman restriktiasin esimerkissä EcoRI rajoitus-muokkausjärjestelmästä E. coi. Sen sijaan, että tämä entsyymi sulattaisi DNA:n palindromisen tunnistussekvenssin keskellä, se sulattaa DNA:n keskuksen ulkopuolella ja tuottaa 4 itsekomplementaarista ("tahmea") päätä, jotka koostuvat eri määrästä nukleotideja, nimittäin:

Nämä "tahmeat" päät ovat hyödyllisiä geenitekniikassa, koska ne voidaan yhdistää uudelleen komplementaarisesti alhaisissa lämpötiloissa, mikä mahdollistaa DNA-fragmenttien tehokkaan sulkemisen.

Tunnistuspaikoilla ja sulamispaikoilla muiden rajoitusten tapauksessa on eri sisältö, nimittäin:

DNA-restriktion jälkeen restriktioseoksesta eristetään restriktio-DNA-fragmentteja (DNA-restriktiot), joita sitten tarvitaan vektoriin liittymiseen. Rajoitettu DNA eristetään elektroforeesilla, koska rajoitettujen fragmenttien koon ja vakioiden sähkövarausmassasuhteiden vuoksi on erittäin helppoa fraktioida rajoittunutta DNA:ta tällä menetelmällä. Sähkökentässä olevat fragmentit liikkuvat elektroforeesin aikana niiden koosta (massasta) riippuvaisella taajuudella. Mitä suurempi (pidempi) fragmentti, sitä hitaammin se liikkuu sähkökentässä. Materiaali, jossa elektroforeesi suoritetaan, on ei-latautuva agaroosi tai polyakryyliamidi. Fragmenttien tunnistamiseen käytetään etidiumbromidia, joka värjää fragmentit, mikä helpottaa niiden havaitsemista.

Elektroforeesin tehokkuus on erittäin korkea, koska sillä voidaan erottaa fragmentteja, joiden koko vaihtelee 2 - 50 000 emäksen välillä.

Elektroforeesin jälkeen fragmentit agaroosista eristetään käyttämällä erilaisia ​​menetelmiä. Perustuu kokovertailutuloksiin

Eri restriktioentsyymeillä saadut saman DNA:n rajoitukset muodostavat restriktiokartat, jotka osoittavat kunkin käytetyn restriktioentsyymin restriktiokohdat. Käytännössä restriktiokartat mahdollistavat paitsi rajoitusten koon määrittämisen, myös tiettyjen geenien lokusten sijainnin selvittämisen DNA-molekyyleissä.

Koska korkeammissa organismeissa transkription aikana syntetisoituu heterogeenista DNA:ta, jota korjataan prosessoinnilla, geenitekniikassa käytetään yleensä komplementaarista DNA:ta (cDNA), joka saadaan käyttämällä templaattina mRNA:ta, jolle käänteiskopioija syntetisoi yksijuosteista DNA:ta ( cDNA), joka on kopio mRNA:sta. Tämän jälkeen nämä yksijuosteiset DNA:t muunnetaan kaksijuosteisiksi DNA:iksi. Oletetaan, että cDNA sisältää jatkuvia nukleotidisekvenssejä (transkriptoituja ja transloituja). Se on cDNA, jota käytetään restriktioon.

Agaroosigeeleistä elektroforeesin jälkeen eristetyt DNA-fragmentit (rajoitukset) voidaan alustavasti altistaa sekvensoinnille; määrittää niiden nukleotidisekvenssin. Tätä varten käytetään kemiallisia ja entsymaattisia sekvensointimenetelmiä. Kemiallinen menetelmä perustuu radioaktiivisella fosforilla (32 P) leimattujen fragmenttien saamiseen ja yhden emäksen poistamiseen näistä fragmenteista, minkä jälkeen otetaan huomioon näitä fragmentteja sisältävien geelien radioautografian tulokset. Entsymaattinen menetelmä perustuu siihen, että analysoitavan fragmentin loppuun lisätään nukleotidi, jota sitten käytetään eri fragmenttien synteesissä. in vitro, analysoidaan nukleotidisekvenssin suhteen elektroforeettisesti. DNA-molekyylin spesifisten nukleotidisekvenssien tutkimiseksi käytä

myös hybridisaatio DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern-

ja Southern blots.

Geneettiset vektorit. Molekyylikloonaukseen tarkoitetun DNA-segmentin (geenin) on kyettävä replikoitumaan, kun se siirretään bakteerisoluun, ts. olla kopio. Hänellä ei kuitenkaan ole tätä kykyä. Siksi kloonattujen geenien siirron ja havaitsemisen varmistamiseksi soluissa ne yhdistetään niin kutsuttuihin geneettisiin vektoreihin. Jälkimmäisellä on oltava vähintään kaksi ominaisuutta. Ensinnäkin vektorien on kyettävä replikoitumaan

soluissa ja useissa päissä. Toiseksi niiden tulisi mahdollistaa vektorin sisältävien solujen valinta, ts. niillä on markkeri, jolle on mahdollista vastaselekoida solut, jotka sisältävät vektorin yhdessä kloonatun geenin kanssa (yhdistelmä-DNA-molekyylit). Plasmidit ja faagit täyttävät nämä vaatimukset. Plasmidit ovat hyviä vektoreita, koska ne ovat replikoneja ja voivat sisältää geenejä vastustuskykyyn mille tahansa antibiootille, mikä mahdollistaa bakteerien valinnan vastustuskykyisiksi tälle antibiootille ja siten yhdistelmä-DNA-molekyylien helpon havaitsemisen.

(Kuva 128).

Riisi. 128. Vektori pBRl

Koska luonnollisia plasmidivektoreita ei ole, kaikki tähän mennessä tunnetut plasmidivektorit on konstruoitu keinotekoisesti. R-plasmidit toimivat lähtöaineena useiden geneettisten vektoreiden luomisessa, joissa liialliset DNA-sekvenssit, mukaan lukien ne, joissa oli useita restriktiokohtia, poistettiin restriktaasien avulla. Tämän poiston määritti se tosiasia, että plasmidivektorissa pitäisi olla vain yksi tunnistuskohta yhdelle restriktioentsyymille, ja tämän kohdan tulisi sijaita plasmidigenomin toiminnallisesti merkityksettömällä alueella. Esimerkiksi pBR 322 -plasmidivektori, jossa on ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssigeenit, mikä tekee siitä erittäin kätevän.

kloonatun DNA-segmentin sisältävien bakteerien valintaa varten siinä on yksittäiset restriktiokohdat yli 20 restriktioentsyymille, mukaan lukien sellaiset hyvin tunnetut restriktioentsyymit kuin EcoRI, Hind III, Pst I, Pva II ja Sal I.

Faagivektoreilla on myös useita etuja. Ne voivat sisältää suurempia (pidempiä) kloonattuja DNA-fragmentteja plasmavektoreihin verrattuna. Lisäksi kloonatun fragmentin siirto faagien toimesta soluihin jälkimmäisten infektion seurauksena on tehokkaampaa kuin DNA-transformaatio. Lopuksi faagivektorit mahdollistavat tehokkaamman seulonnan (tunnistuksen) kloonattua geeniä kantavia soluja sisältävien pesäkkeiden agarpinnalla. Monet faagivektorit perustuvat lambda-faagiin.

Faagin lisäksi käytetään myös muita herpesviruksen perusteella konstruoituja virusvektoreita sekä hiivan DNA:n perusteella konstruoituja vektoreita.

Jos geenikloonaus suoritetaan nisäkäs- tai kasvisoluilla, vektoreita koskevat vaatimukset ovat samat kuin bakteerisoluihin kloonattaessa.

Rekombinantti-DNA-molekyylien rakentaminen. Rekombinantti-DNA-molekyylien suora rakentaminen seuraa sen jälkeen, kun tutkitun DNA:n ja vektori-DNA:n restriktio on saatu. Se koostuu tutkitun DNA:n restriktiosegmenttien sulkemisesta vektori-DNA-restriktiolla, joka restriktion seurauksena muuttuu pyöreästä lineaariseksi DNA:ksi.

Tutkittavan DNA-fragmenttien sulkemiseksi vektorin DNA:lla käytetään DNA-ligaasia (kuvio 129). Ligaatio onnistuu, jos liitettävissä rakenteissa on 3'-hydroksyyli- ja 5'-fosfaattiryhmiä ja jos nämä ryhmät sijaitsevat sopivassa suhteessa toisiinsa. Fragmentit yhdistetään niiden "tahmeiden" päiden kautta itsensä täydentävyyden seurauksena. Suurilla fragmenttien pitoisuuksilla jälkimmäiset tulevat aika ajoin oikeaan asentoon (toisiaan vastapäätä). Monet restrikaasit, kuten Eco RI, tuottavat neljän emäksen "tahmeita" päitä. Neljästä emäksestä koostuvien "tahmeiden" päiden ligaatioprosessi tapahtuu alhaisessa lämpötilassa (jopa 12 °C).

Riisi. 129. DNA-ligaatio

Jos restriktiossa muodostuu fragmentteja, joissa ei ole "tahmeita" päitä, ne muunnetaan "pakottaen" molekyyleiksi, joissa on "tahmeita" päitä käyttämällä transferaasientsyymiä. Tämä entsyymi lisää nukleotideja DNA:n 3" päähän. Poly-A-häntä voidaan lisätä yhteen fragmenttiin ja poly-T-häntä toiseen. Polymeraasiketjureaktiota (PCR) käytetään myös haluttujen DNA-päiden muodostamiseen. PCR:n periaate perustuu soluista eristetyn DNA:n denaturointiin ja sen "pariutumiseen" lisäämällä renaturoiviin ketjuihin DNA-oligonukleotideja, joista kukin koostuu 15-20 nukleotidista. Näiden oligonukleotidien tulee olla komplementaarisia sekvensseille ketjuissa, jotka erotetaan toisistaan 50-2000 nukleotidia DNA-synteesi in vitro, ne sallivat DNA-polymeraasin kopioida ne alueet, jotka ovat "siementen" välissä. Tämä kopiointi tuottaa suuren määrän kopioita tutkitusta DNA-fragmentista.

Yhdistelmä-DNA-molekyylien vieminen soluihin. Sen jälkeen kun mielenkiinnon kohteena oleva DNA-fragmentti (geeni) on fuusioitu geneettiseen vektoriin DNA-ligaasia käyttäen, tuloksena olevat rekombinanttimolekyylit viedään soluihin niiden replikoitumisen saavuttamiseksi (geneettisen vektorin vuoksi) ja kopioiden lukumäärän lisäämiseksi. Suosituin tapa viedä yhdistelmä-DNA-molekyylejä soluihin, joissa vektori on plasmidi, on transformaatio E. coli. Tätä tarkoitusta varten bakteerisolut esikäsitellään kalsiumilla tai rubidiumilla (ioneilla).

niin, että heistä tulee "päteviä" yhdistelmä-DNA:n havaitsemisessa. DNA:n soluihin tunkeutumistiheyden lisäämiseksi käytetään elektroporaatiomenetelmää, joka koostuu solujen lyhyestä altistamisesta voimakkaalle sähkökentällä. Tämä käsittely luo onteloita solukalvoihin, mikä helpottaa solujen DNA:n ottamista. Kun yhdistelmä-DNA-molekyylejä on viety bakteereihin, jälkimmäiset kylvetään antibiooteilla rikastettuun MPA:han (liha-peptoniagar) haluttujen solujen valitsemiseksi, ts. solut, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä. Muutoksen taajuus on alhainen. Tyypillisesti yksi transformantti esiintyy 105 ympättyä solua kohti. Jos vektori on faagi, solut (bakteerit tai hiiva) transfektoidaan faagilla. Mitä tulee eläinten somaattisiin soluihin, ne transfektoidaan DNA:lla kemikaalien läsnä ollessa, jotka helpottavat DNA:n kulkemista plasmamembraanien läpi. DNA:n suora mikroinjektio munasoluihin, viljeltyihin somaattisiin soluihin ja nisäkäsalkioihin on myös mahdollista.

Tärkein molekyylikloonaukseen liittyvä kohta on menetelmän etsiminen sen selvittämiseksi, onko kloonattu fragmentti todella sisällytetty vektoriin ja onko se yhdessä vektorin kanssa, joka muodostaa yhdistelmä-DNA-molekyylin, siirtynyt soluihin. Jos puhumme bakteerisoluista, niin yksi menetelmistä perustuu plasmidin (vektorin) resistenssigeenin insertionaalisen inaktivaation huomioon ottamiseen. Esimerkiksi plasmidivektorissa pBR 322, joka määrittää resistenssin ampisilliinille ja tetrasykliinille, ainoa Pst I -restriktioentsyymin kohta sijaitsee ampisilliiniresistenssigeenin miehittämässä lokuksessa. Tässä kohdassa sulava Pst I tuottaa tahmeita päitä, jotka mahdollistavat kloonatun fragmentin ligoinnin vektori-DNA:han. Kuitenkin tässä tapauksessa plasmidi (vektori) ampisilliiniresistenssigeeni inaktivoituu, kun taas vektorissa oleva tetrasykliiniresistenssigeeni pysyy ehjänä. Se on tetrasykliiniresistenssigeeni, jota käytetään rekombinantti-DNA-molekyylien transformoimien solujen valitsemiseen. Näin voidaan varmistaa, että tetrasykliiniä sisältävällä alustalla kasvaneiden pesäkkeiden solut todella sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä. Ne tarkistetaan ns. "pistetestillä" kahdella levyparilla kiinteällä alustalla, joista toinen sisältää ampisilliinia, kun taas toisessa ei ole tätä antibioottia. Kloonattava DNA on

vain tetrasykliiniresistenteissä transformanteissa. Mitä tulee sekä ampisilliinille että tetrasykliinille (ArTc) resistenteisiin transformantteihin, ne sisältävät plasmidi- (vektori)molekyylejä, jotka ovat saaneet spontaanisti pyöreän muodon ilman, että niihin on sisällytetty vierasta (kloonattua) DNA:ta.

Toinen menetelmä vieraiden (kloonattujen) fragmenttien lisäyksen havaitsemiseksi plasmidivektoriin perustuu p-galaktosidaasigeenin sisältävän vektorin käyttöön. Vieraan DNA:n liittäminen tähän geeniin inaktivoi väistämättä β-galaktosidaasin synteesin, joka voidaan havaita kylvämällä transformoidut solut β-galaktosidaasisubstraatteja sisältävälle alustalle. Tämä väliaine mahdollistaa värjäytyneiden solupesäkkeiden valinnan. On myös muita menetelmiä.

Kuten jo mainittiin, vektori-DNA:n lineaariset restriktiofragmentit pystyvät palauttamaan ympyränmuotoisen rakenteen sisällyttämättä niihin kloonattuja segmenttejä. Tällaisten sirkulaaristen vektori-DNA-molekyylien spontaanin muodostumisen frekvenssin vähentämiseksi vektorin DNA-restriktiota käsitellään fosfataasilla. Tämän seurauksena ympyränmuotoisten DNA-molekyylien muodostuminen tulee mahdottomaksi, koska ligaasin toiminnan kannalta välttämättömät 5'-PO 4:n päät puuttuvat.

Selektiivisellä alustalla kasvatettu transformanttipesäkkeiden sarja on joukko soluja, jotka sisältävät kloonatun genomisen tai cDNA:n eri fragmenttien (geenien) klooneja. Näiden kloonien kokoelmat muodostavat niin sanottuja DNA-kirjastoja, joita käytetään laajalti geenitekniikassa.

Geenikloonauksen viimeinen vaihe on kloonatun DNA:n eristäminen ja tutkiminen, mukaan lukien sekvensointi. Lupaavat bakteerikannat tai somaattiset solut, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka ohjaavat kaupallista arvoa omaavien kiinnostavien proteiinien synteesiä, siirtyvät teollisuudelle.

SOLUTEKNIIKKA

Kuten luvun alussa todettiin, solutekniikalla tarkoitetaan eristettyjen eläin- ja kasvisolujen geneettistä manipulointia. Nämä manipulaatiot ovat usein in vitro, ja niiden päätavoitteena on saada genotyyppejä näistä organismeista, joilla on halutut ominaisuudet ja jotka ovat ensisijaisesti taloudellisesti hyödyllisiä. Mitä tulee -

Xia mies, sitten solutekniikka soveltui hänen sukusoluihinsa.

Ihmisten ja eläinten solutekniikan kehittämisen edellytyksenä oli menetelmien kehittäminen niiden somaattisten solujen viljelemiseksi keinotekoisilla ravintoalustoilla sekä somaattisten solujen hybridien, myös lajien välisten hybridien, saaminen. Kehitys somaattisten solujen viljelyssä on puolestaan ​​vaikuttanut sukusolujen ja hedelmöittymisen tutkimukseen ihmisillä ja eläimillä. 60-luvulta lähtien. 20. vuosisata Useissa laboratorioissa ympäri maailmaa on tehty lukuisia kokeita somaattisten solujen ytimien siirtämisestä muniin, joissa ei ole keinotekoisesti ytimiä. Näiden kokeiden tulokset olivat usein ristiriitaisia, mutta yleisesti ottaen ne johtivat soluytimien kyvyn havaitsemiseen munasolun normaalin kehityksen varmistamiseksi (katso luku IV).

Perustuu 60-luvun hedelmöityneiden munien kehityksen tutkimuksen tuloksiin. 20. vuosisata tutkimukset aloitettiin myös munasolujen hedelmöittymisen mahdollisuuden selvittämiseksi äidin kehon ulkopuolella. Hyvin nopeasti nämä tutkimukset johtivat mahdollisuuteen hedelmöittää munasolut siittiöillä in vitro ja tällä tavalla muodostuneiden alkioiden jatkokehitykseen, kun ne istutettiin naisen kohtuun. Tällä alalla kehitettyjen menetelmien parantaminen on johtanut siihen, että "koeputkilasten" syntymästä on tullut todellisuutta. Jo vuoteen 1981 mennessä maailmaan syntyi 12 lasta, joiden elämä annettiin laboratoriossa, koeputkessa. Tällä hetkellä tämä solutekniikan osa on yleistynyt, ja "koeputkien" lapsia on jo kymmeniä tuhansia (kuva 130). Venäjällä työ "koeputkien" lasten saamiseksi aloitettiin vasta vuonna 1986.

Vuonna 1993 kehitettiin tekniikka monotsygoottisten ihmisen kaksosten saamiseksi in vitro jakamalla alkiot blastomeereiksi ja kasvattamalla viimeksi mainitut 32 soluksi, minkä jälkeen ne voidaan istuttaa naisen kohtuun.

Koeputkivauvoihin liittyvien tulosten vaikutuksesta eläimet ovat myös kehittäneet teknologian nimeltä elinsiirrot alkiot. Se liittyy menetelmän kehittämiseen poliovulaation indusoimiseksi, menetelmien munasolujen keinohedelmöitykseen ja alkioiden istuttamiseen eläinten elimistöön - sijaisäideihin. Tämän tekniikan ydin on seuraava:

schuschy. Erittäin tuottavaan lehmään ruiskutetaan hormoneja, mikä johtaa poliovulaatioon, jossa 10-20 solua kypsyy kerralla. Sitten munat hedelmöitetään keinotekoisesti urospuolisilla sukusoluilla munanjohtimessa. 7-8. päivänä alkiot pestään ulos kohdusta ja siirretään muiden lehmien (sipuliemojen) kohtuun, jotka synnyttävät kaksoisvasikkaa. Vasikat perivät alkuperäisten vanhempiensa geneettisen tilan.

Riisi. 130."Tube" lapset

Toinen eläinten solutekniikan alue on siirtogeenisten eläinten luominen. Yksinkertaisin tapa saada tällaisia ​​eläimiä on viedä lineaarisia DNA-molekyylejä alkuperäisten eläinten muniin. Näin hedelmöittyneistä munista kehittyvät eläimet kantavat mukanaan kopion lisätystä geenistä yhdessä kromosomissaan ja lisäksi ne välittävät tämän geenin periytyvästi. Monimutkaisempi menetelmä siirtogeenisten eläinten saamiseksi on kehitetty hiirille, jotka eroavat turkin väristä, ja se on seuraava. Ensin neljän päivän ikäiset alkiot poistetaan raskaana olevan harmaahiiren kehosta ja murskataan yksittäisiksi soluiksi. Sitten ytimet uutetaan alkiosoluista, ne siirretään mustien hiirten muniin, joilta on aiemmin poistettu ytimet. Vieraita ytimiä sisältävät mustat hiiren munat laitetaan koeputkiin

ravinneliuoksella jatkokehitystä varten. Mustien hiirten munista kehitetyt alkiot istutetaan valkoisten hiirten kohtuun. Siten näissä kokeissa oli mahdollista saada klooni hiiristä, joiden turkin väri oli harmaa, ts. kloonaa alkiosoluja halutuilla ominaisuuksilla. Luvussa IV tarkastelimme tuloksia lampaanmunien keinotekoisesti ytimistä vailla olevien hedelmöityksestä saman lajin eläinten somaattisten solujen ydinmateriaalilla. Erityisesti lampaiden munista poistettiin tumat ja sitten somaattisten solujen ytimet (alkiot, hedelmät tai aikuisten eläinten solut) vietiin tällaisiin muniin, minkä jälkeen tällä tavalla hedelmöittyneet munat vietiin munan kohtuun. aikuiset lampaat. Syntyneet karitsat osoittautuivat identtisiksi lampaiden luovuttajan kanssa. Esimerkkinä on lammas Dolly. Myös vasikoita, hiiriä, kaneja, kissoja, muuleja ja muita eläimiä on kloonattu. Tällainen siirtogeenisten eläinten rakentaminen on suora tapa kloonata eläimiä, joilla on taloudellisesti hyödyllisiä ominaisuuksia, mukaan lukien tiettyä sukupuolta olevat yksilöt.

Siirtogeenisiä eläimiä saatiin myös käyttämällä eri lajeihin kuuluvaa lähdemateriaalia. Erityisesti tunnetaan menetelmä kasvuhormonia säätelevän geenin siirtämiseksi rotista hiiren muniin sekä menetelmä lampaiden blastomeerien yhdistämiseksi vuohen blastomeerien kanssa, mikä johti hybridieläinten (lehmien) syntymiseen. Nämä kokeet osoittavat mahdollisuuden voittaa lajien yhteensopimattomuus varhaisessa kehitysvaiheessa. Erityisen houkuttelevat näkymät avautuvat (jos lajien yhteensopimattomuus on voitettu kokonaan) tapa hedelmöittää yhden lajin munat toisen lajin somaattisten solujen ytimillä. Puhumme todellisesta mahdollisuudesta luoda taloudellisesti arvokkaita eläinten hybridejä, joita ei voida saada risteyttämällä.

On huomattava, että ydinsiirtotyö ei ole vielä kovin tehokasta. Sammakkoeläimillä ja nisäkkäillä tehdyt kokeet ovat yleensä osoittaneet, että niiden tehokkuus on alhainen, ja se riippuu luovuttajaytimien ja vastaanottajan munasolujen välisestä yhteensopimattomuudesta. Lisäksi tuloksena olevat kromosomipoikkeamat siirretyissä ytimissä jatkokehityksen aikana, joihin liittyy siirtogeenisten eläinten kuolema, ovat myös menestyksen este.

Soluhybridisaatiotutkimuksen ja immunologisten tutkimusten risteyksessä nousi esiin ongelma, joka liittyy niin kutsuttujen monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantoon ja tutkimukseen. Kuten edellä on todettu, vasta-aineet, joita keho tuottaa vasteena antigeenin (bakteerit, virukset, punasolut jne.) viemiseen, ovat proteiineja, joita kutsutaan immunoglobuliineiksi ja ne muodostavat olennaisen osan kehon puolustusjärjestelmää taudinaiheuttajia vastaan. Mutta mikä tahansa kehoon tuotu vieras kappale on sekoitus erilaisia ​​antigeenejä, jotka stimuloivat erilaisten vasta-aineiden tuotantoa. Esimerkiksi ihmisen punasoluissa ei ole vain veriryhmien A (II) ja B (III) antigeenejä, vaan myös monia muita antigeenejä, mukaan lukien Rh-tekijä. Lisäksi bakteerien soluseinän proteiinit tai virusten kapsidit voivat toimia myös erilaisina antigeeneinä aiheuttaen erilaisten vasta-aineiden muodostumista. Samaan aikaan kehon immuunijärjestelmän lymfoidisoluja edustavat yleensä kloonit. Tämä tarkoittaa, että jo pelkästään tästä syystä immunisoitujen eläinten veriseerumissa vasta-aineet ovat aina sekoitus, joka koostuu eri kloonien solujen tuottamista vasta-aineista. Sillä välin käytännön tarkoituksiin tarvitaan vain yhden tyyppisiä vasta-aineita; niin sanotut monospesifiset seerumit, jotka sisältävät vain yhden tyyppisiä vasta-aineita tai, kuten niitä kutsutaan, monoklonaalisia vasta-aineita.

Etsiessään menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi sveitsiläiset tutkijat löysivät vuonna 1975 hybridisaatiomenetelmän yhdellä tai toisella antigeenillä immunisoitujen hiiren lymfosyyttien ja viljeltyjen luuytimen kasvainsolujen välillä. Tällaisia ​​hybridejä kutsutaan "hybridomaksi". "Lymfosyyttisestä" osasta, jota edustaa yhden kloonin lymfosyytti, yksittäinen hybridooma perii kyvyn aiheuttaa tarvittavien ja samantyyppisten vasta-aineiden muodostumista, ja "kasvain (myelooma)" -osan ansiosta siitä tulee kykenevät, kuten kaikki kasvainsolut, lisääntymään loputtomasti keinotekoisilla ravintoaineilla, jolloin saadaan suuri joukko hybridejä. Kuvassa 131 esittää kaavion monoklonaalisia vasta-aineita syntetisoivien solulinjojen eristämiseksi. Monoklonaalisia vasta-aineita tuottavat hiiren solulinjat eristetään fuusioimalla myeloomasolut lymfosyyttien kanssa viisi päivää aikaisemmin immunisoitujen hiirten pernasta.

haluttu antigeeni. Solufuusio saavutetaan sekoittamalla niitä polyetyleeniglykolin läsnä ollessa, mikä saa aikaan solukalvojen fuusion, ja sitten siirrostamalla ne ravintoalustaan, joka mahdollistaa vain hybridisolujen (hybridooma) kasvun ja lisääntymisen. Hybridoomien lisääntyminen tapahtuu nestemäisessä alustassa, jossa ne kasvavat edelleen ja erittävät vasta-aineita viljelynesteeseen, ja vain yhtä tyyppiä, rajattomasti. Näitä vasta-aineita kutsutaan monoklonaalisiksi. Vasta-aineiden muodostumistiheyden lisäämiseksi turvaudutaan hybridooman kloonaukseen, ts. yksittäisten hybridoomipesäkkeiden valintaan, jotka pystyvät tuottamaan suurimman määrän halutun tyyppisiä vasta-aineita. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat löytäneet laajan sovelluksen lääketieteessä useiden sairauksien diagnosoinnissa ja hoidossa. Samalla monoklonaalisen teknologian tärkein etu on, että sillä voidaan tuottaa vasta-aineita materiaaleja vastaan, joita ei voida puhdistaa. Päinvastoin, on mahdollista saada monoklonaalisia vasta-aineita eläinten hermosolujen solukalvoja (plasma) vastaan. Tätä varten hiiret immunisoidaan eristetyillä hermosolukalvoilla, minkä jälkeen niiden pernan lymfosyytit yhdistetään myeloomasolujen kanssa ja sitten edetään edellä kuvatulla tavalla.

Riisi. 131. Monoklonaalisten vasta-aineiden saaminen

GEENITEKNIIKKA JA LÄÄKETEET

Lääketieteessä geenitekniikka osoittautui erittäin lupaavaksi, ennen kaikkea uusien tekniikoiden luomisessa lääkkeinä käytettävien fysiologisesti aktiivisten proteiinien (insuliini, somatostatiini, interferonit, somatotropiini jne.) saamiseksi.

Insuliinia käytetään diabetesta sairastavien ihmisten hoitoon, mikä on kolmanneksi yleisin kuolinsyy sydänsairauksien ja syövän jälkeen. Maailman insuliinin kysyntä on useita kymmeniä kiloja. Perinteisesti sitä saadaan sikojen ja lehmien haimarauhasista, mutta näiden eläinten hormonit eroavat hieman ihmisinsuliinista. Sian insuliini eroaa yhdellä aminohapolla, kun taas naudan insuliini eroaa kolmella. Uskotaan, että eläininsuliini aiheuttaa usein sivuvaikutuksia. Vaikka insuliinin kemiallista synteesiä on tehty pitkään, mutta tähän asti hormonien teollinen tuotanto on pysynyt erittäin kalliina. Nyt halpaa insuliinia saadaan geenitekniikan menetelmällä insuliinigeenin kemiallis-entsymaattisella synteesillä, jonka jälkeen tämä geeni viedään E. coliin, joka sitten syntetisoi hormonin. Tällainen insuliini on enemmän "biologinen", koska se on kemiallisesti identtinen ihmisen haimasolujen tuottaman insuliinin kanssa.

Interferonit ovat proteiineja, joita solut syntetisoivat pääasiassa vasteena kehon virusinfektioille. Interferonit ovat lajispesifisiä. Esimerkiksi ihmisillä on kolme interferoniryhmää, joita eri solut tuottavat vastaavien geenien ohjauksessa. Kiinnostus interferoneja kohtaan määräytyy sen perusteella, että niitä käytetään laajalti kliinisessä käytännössä monien ihmisten, erityisesti virussairauksien, hoitoon.

Koska interferonimolekyylit ovat suuret, ne ovat tuskin saatavilla synteesiä varten. Siksi suurin osa interferoneista saadaan nykyään ihmisverestä, mutta saanto tällä menetelmällä on pieni. Samaan aikaan interferonin tarve on erittäin suuri. Tämä asetti haasteen löytää tehokas menetelmä interferonin tuottamiseksi teollisissa määrissä. Geenitekniikka on nykyaikaisen "bakteeriperäisen" interferonin tuotannon taustalla.

Geenitekniikan vaikutus niiden lääkeaineiden teknologiaan, joita on pitkään luotu biologisella tekniikalla, on lisääntynyt. Takaisin 40- ja 50-luvuilla. 20. vuosisata luotiin

biologinen teollisuus antibioottien tuotantoon, jotka ovat tehokkain osa nykyaikaisen lääketieteen lääkearsenaalia. Viime vuosina bakteerien, erityisesti antibioottien, lääkeresistenssi on kuitenkin lisääntynyt merkittävästi. Syynä on bakteerien lääkeresistenssin määräävien plasmidien laaja levinneisyys mikrobimaailmassa. Tästä syystä monet aiemmin kuuluisat antibiootit ovat menettäneet entisen tehokkuutensa. Toistaiseksi ainoa tapa voittaa bakteerien vastustuskyky antibiooteille on etsiä uusia antibiootteja. Asiantuntijoiden mukaan maailmassa syntyy vuosittain noin 300 uutta antibioottia. Useimmat niistä ovat kuitenkin joko tehottomia tai myrkyllisiä. Vain muutama antibiootti otetaan käyttöön vuosittain, mikä edellyttää antibioottiteollisuuden kapasiteetin ylläpitämisen lisäksi myös lisäämistä geenitekniikan kehityksen pohjalta.

Geenitekniikan päätehtävät niissä lääkeainetekniikoissa, joissa mikro-organismit ovat lääkkeiden tuottajia, määräytyvät jälkimmäisten geenitekniikan rekonstruoinnin tarpeesta niiden toiminnan lisäämiseksi. Samalla

Samaan aikaan alettiin toteuttaa ajatus lääkkeiden luomisesta pienten molekyylien muodossa, mikä edistää niiden tehokkuutta.

Immuunibioteknologia liittyy ensisijaisesti uuden sukupolven rokotteiden tuotantoon ihmisten ja eläinten tartuntatautien ehkäisyyn. Ensimmäiset kaupalliset tuotteet, jotka luotiin geenitekniikalla, olivat rokotteet ihmisen hepatiittia, eläinten suu- ja sorkkatautia ja joitain muita vastaan. Erittäin tärkeä suunta tällä alalla liittyy monoklonaalisten vasta-aineiden, taudinaiheuttajien diagnosointiin tarvittavien reagenssien sekä hormonien, vitamiinien ja erilaisten proteiinien (entsyymien, toksiinien jne.) puhdistamiseen.

Merkittävä käytännön kiinnostava on menetelmä keinotekoisen hemoglobiinin saamiseksi tuomalla hemoglobiinigeenejä tupakkakasveihin, jolloin näiden geenien ohjauksessa tuotetaan a- ja p-globiiniketjuja, jotka yhdistetään hemoglobiiniksi. Tupakkakasvien soluissa syntetisoitu hemoglobiini on täysin toimiva (sitoutuu happea). Ihmisiin sovellettu solutekniikka ei liity pelkästään ihmisen biologian perusongelmien ratkaisemiseen, vaan myös ennen kaikkea naisten hedelmättömyyden voittamiseen. Koska taajuus positiivisia tapauksia implantaatiota naisen kohtuun alkioiden saatu in vitro, on pieni, jolloin saadaan yksitsygoottisia kaksoisalkioita in vitro on myös tärkeä, koska uudelleenistutuksen mahdollisuus kasvaa "varaalkioiden" vuoksi. Erityisen kiinnostavia ovat mahdollisuudet käyttää kantasoluja solujen ja kudosten korvaamisen lähteenä sairauksien, kuten diabeteksen, selkäydinvamman, sydänkivun, nivelrikon ja Parkinsonin taudin hoidossa. Mutta näiden näkymien toteuttamiseksi tarvitaan perusteellinen tutkimus kantasolujen biologiasta.

Geenitekniikan käytössä lääketieteen ongelmissa on erityisen tärkeä tehtävä kehittää geenitekniikan menetelmiä perinnöllisten sairauksien radikaaliin hoitoon, jotka eivät valitettavasti ole vielä hoidettavissa olemassa olevilla menetelmillä. Tämän tehtävän sisältönä on kehittää tapoja korjata (normalisoida) perinnöllisiin sairauksiin johtavia mutaatioita ja varmistaa "korjausten" siirtyminen perinnöllisesti. Uskotaan, että perinnöllisten sairauksien hoitoon geneettisesti muokattuja menetelmiä kehitetään onnistuneesti

osallistua ihmisgenomia koskeviin tietoihin, jotka on saatu kansainvälisen tieteellisen ohjelman "Human Genome" täytäntöönpanon tuloksena.

GENEETTISEN TEKNIIKAN YMPÄRISTÖONGELMAT

Bioteknologiaa uudelle tasolle nostamalla geenitekniikka on löytänyt sovellusta myös ympäristön pilaantumisen määrittämis- ja eliminointimenetelmien kehittämisessä. Erityisesti on konstruoitu bakteerikantoja, jotka ovat eräänlainen indikaattori kemiallisten kontaminanttien mutageenisesta aktiivisuudesta. Toisaalta plasmideja sisältäviä bakteerikantoja on muunnettu geneettisesti säätelemään sellaisten entsyymien synteesiä, jotka pystyvät tuhoamaan monia ympäristöä saastuttavia kemiallisia yhdisteitä. Erityisesti jotkut plasmidia sisältävät bakteerit kykenevät hajottamaan öljyä ja öljytuotteita ympäristöön erilaisten onnettomuuksien tai muiden epäsuotuisten syiden seurauksena vaarattomille yhdisteille.

Geenitekniikka on kuitenkin geneettisen materiaalin muuntamista, jota luonnossa ei ole. Näin ollen geenitekniikan tuotteet ovat täysin uusia tuotteita, joita ei ole luonnossa. Siksi se on tuotteidensa tuntemattomuudesta johtuen vaarallinen sekä luonnolle ja ympäristölle että geenitekniikan menetelmiä käyttävissä laboratorioissa tai geenitekniikan yhteydessä syntyneillä rakenteilla työskentelevälle henkilökunnalle.

Koska geenien kloonauksen mahdollisuudet ovat loputtomat, jo näiden tutkimusten alussa, tutkijoiden keskuudessa heräsi kysymyksiä luotujen organismien luonteesta. Samaan aikaan esitettiin useita tämän metodologian ei-toivottuja seurauksia, ja nämä ehdotukset saivat kannatusta myös suuren yleisön keskuudessa. Erityisesti erimielisyyksiä syntyi geenitekniikan kokeissa eläingeenejä saaneiden bakteerien ominaisuuksista. Esimerkiksi pidättyvätkö bakteerit E. coli niiden lajisidonnaisuus johtuen niihin tuotujen eläingeenien sisällöstä (esim. insuliinigeeni) vai pitäisikö niitä pitää uutena lajina? Lisäksi kuinka kestäviä tällaiset bakteerit ovat, missä ekologisissa markkinarakoissa ne voivat

olla olemassa? Mutta tärkeintä oli pelkojen ilmaantuminen siitä, että yhdistelmä-DNA-molekyylien tuotannon ja manipuloinnin aikana voidaan luoda geneettisiä rakenteita, joiden ominaisuudet ovat odottamattomia ja vaarallisia ihmisten terveydelle, sillä historiallisesti vakiintunut ekologinen tasapaino. Samaan aikaan alettiin vaatia geenitekniikan moratoriota. Vetoomukset aiheuttivat kansainvälistä kohua ja johtivat vuonna 1975 Yhdysvalloissa pidettyyn kansainväliseen konferenssiin, jossa keskusteltiin laajasti alan tutkimuksen mahdollisista seurauksista. Sitten maissa, joissa geenitekniikka alkoi kehittyä, kehitettiin säännöt työskentelylle yhdistelmä-DNA-molekyylien kanssa. Näillä säännöillä pyritään estämään geenitekniikan laboratorioiden toiminnan tuotteiden pääsy elinympäristöön.

Toinen näkökohta geenitekniikan työn ei-toivotuista seurauksista liittyy geenitekniikan menetelmiä käyttävissä laboratorioissa työskentelevän henkilöstön terveyshaittoihin, koska tällaiset laboratoriot käyttävät fenolia, etidiumbromidia, UV-säteilyä, jotka ovat terveydelle haitallisia tekijöitä. Lisäksi näissä laboratorioissa on mahdollisuus kontaminoitumiseen bakteereilla, jotka sisältävät yhdistelmä-DNA-molekyylejä, jotka hallitsevat ei-toivottuja ominaisuuksia, kuten bakteerien lääkeresistenssiä. Nämä ja muut kohdat määräävät tarpeen parantaa geenitekniikan työturvallisuuden tasoa.

Lopuksi ongelma geneettisesti muunnettujen tuotteiden (muuntogeeniset tomaatit, perunat, maissi, soijapavut) sekä tällaisten tuotteiden, kuten leivän, pastan, makeisten, jäätelön, juuston, kasviöljyn, lihavalmisteiden, vaarasta. maat, erityisesti Yhdysvalloissa, ovat yleistyneet. Maatalouden 12 000 vuoden ajan ihmiset ovat käyttäneet luonnontuotteita. Siksi oletetaan, että geneettisesti muunnetun ruoan kanssa ihmiskehoon pääsee uusia myrkkyjä, allergeeneja, bakteereja ja karsinogeeneja, mikä johtaa täysin uusiin tulevien sukupolvien sairauksiin. Tämä herättää kysymyksen geneettisesti muunnettujen elintarvikkeiden aidosti tieteellisestä arvioinnista.

KESKUSTELUA KOSKEVAT KYSYMYKSET

1. Mitä tarkoitetaan geeni-, solu- ja geenitekniikalla? Onko näiden käsitteiden ja molekyylikloonauksen välillä eroa?

2. Mikä on geenitekniikan progressiivinen luonne verrattuna muihin biologian menetelmiin?

3. Listaa geenitekniikan tärkeimmät "työkalut".

4. Mitä ovat restriktioentsyymit, mitkä ovat niiden ominaisuudet ja rooli geenitekniikassa?

5. Muodostavatko kaikki restrikaasit tutkitun DNA:n "tahmeita" päitä ja riippuuko "tahmeiden" päiden rakenne restriktaasin tyypistä?

6. Määrittele geneettiset vektorit. Onko olemassa luonnollisia vektoreita?

7. Miten geneettisiä vektoreita saadaan laboratoriossa? Mitkä biologiset kohteet ovat lähdemateriaalina vektorien saamiseen?

8. Mikä on DNA:n typpipitoisten emässekvenssien maksimipituus, joka voidaan vielä sisällyttää geneettiseen vektoriin? Eroavatko vektorit "voimassa"?

9. Kuvaile DNA-ligaasin ominaisuuksia ja määritä sen rooli geenitekniikassa.

10. Miten kloonattu DNA-segmentti (geeni) liitetään geneettiseen vektoriin?

11. Kuinka usein yhdistelmä-DNA-molekyylejä viedään bakteerisoluihin?

12. Millä periaatteella yhdistelmä-DNA-molekyylejä sisältävien bakteerisolujen valinta perustuu? Anna yksi esimerkki tällaisesta valinnasta.

14. Monilla bakteerikannoilla on samat entsyymit, jotka tarjoavat lähes saman aineenvaihdunnan. Samaan aikaan bakteerien restriktiomodifikaatiojärjestelmien nukleotidispesifisyys on erilainen. Voitko selittää tämän ilmiön?

15. Miksi restriktioentsyymin tunnistuskohtia edustavat DNA-sekvenssit eivät voi sisältää yli kahdeksaa emäsparia?

16. Kuinka monta kertaa Hae III -restriktioentsyymin tunnistama HHCC-sekvenssi esiintyy 50 000 bp DNA-segmentissä, jossa on 30, 50 ja 70 prosenttia HC:tä?

17. Restriktioentsyymit BamHI ja Bgl I sulattavat G GATCC- ja T GATCA -sekvenssit, vastaavasti. Voidaanko Bgl I -restriktiolla tuotettuja DNA-fragmentteja sisällyttää BamHI-kohtaan? Jos kyllä, miksi? Jos käytetty plasmidi (vektori) sisältää yhden Bgl I -restriktiokohdan, niin millä ravintoalustalla voidaan valita bakteereja, tällä plasmidilla?

18. Laske bakteeritransformaatioiden esiintymistiheys DNA-molekyyliä kohti, jos muodostuu 5-105 transformanttia 5000 plasmidiemäsparia kohden?

19. Onko mahdollista kloonata DNA:n replikaation 0-piste? E. coli ja jos on, niin miten?

20. Onko mahdollista määrittää kuinka monta DNA-molekyyliä tarvitaan yhden solun transformoimiseen? E. coli?

21. Onko mahdollista määrittää silmukointikohta mRNA:sta käyttämällä polymeraasiketjureaktiota?

22. Kuinka polymeraasiketjureaktiota voidaan käyttää halutun restriktiokohdan lisäämiseksi kiinnostavaan kohtaan kloonattavassa DNA-fragmentissa?

23. Nimeä eläimiin sovelletut solutekniikan menetelmät. Mikä on näillä menetelmillä tuotettujen eläinten taloudellinen arvo?

24. Määrittele termit "siirtogeeniset kasvit" ja "siirtogeeniset eläimet". Säilyttävätkö siirtogeeniset organismit lajinsa vai voidaanko niitä pitää uusien lajien organismeina?

25. Mitä ovat hybridoomat ja monoklonaaliset vasta-aineet? Miten ne otetaan vastaan?

26. Sovelletaanko solutekniikkaa ihmisiin?

27. Oletetaan, että vieraan DNA:n injektointi hiiren munaan ja tällä tavalla hedelmöitetty munasolun istuttaminen hiiren kehoon päättyi hänen raskauteensa ja hiirten syntymiseen, jotka sisälsivät kopioita injektoidusta DNA:sta genomissa. Hiiret osoittautuivat kuitenkin mosaiikeiksi; Jotkut heidän soluistaan ​​sisältävät kopioita injektoidusta DNA:sta, kun taas toisista puuttuu tämä DNA. Voitko selittää tämän ilmiön luonteen?

28. Pidätkö geneettisesti muunnetuista elintarvikkeista valmistettua ruokaa geneettisesti vaarallisena?

29. Onko geneettisesti muunnettujen elintarvikkeiden tieteellinen tarkastelu tarpeen?

Kognitio määräytyy sen perusteella, mitä vahvistamme totuudeksi.

P.A. Florensky, 1923

Kun geenitekniikkaa sovelletaan ihmisiin, sitä voitaisiin käyttää perinnöllisten sairauksien hoitoon. Potilaan itsensä hoidon ja hänen jälkeläisten genomin muuttamisen välillä on kuitenkin teknisesti merkittävä ero.

Aikuisen genomin muuttaminen on jonkin verran vaikeampaa kuin uusien geneettisesti muokattujen eläinrotujen jalostaminen, koska tässä tapauksessa on tarpeen muuttaa jo muodostuneen organismin useiden solujen genomi, ei vain yhtä alkion munaa. Tätä varten on ehdotettu viruspartikkelien käyttöä vektorina. Viruspartikkelit pystyvät tunkeutumaan merkittävään prosenttiosuuteen aikuisista soluista upottamalla niihin perinnöllisen tietonsa; viruspartikkelien mahdollinen hallittu lisääntyminen kehossa. Samanaikaisesti sivuvaikutusten vähentämiseksi tutkijat yrittävät välttää geneettisesti muokatun DNA:n joutumista sukuelinten soluihin, jolloin vältetään altistuminen potilaan tuleville jälkeläisille. On myös syytä huomioida tämän teknologian merkittävä kritiikki tiedotusvälineissä: geenimanipuloitujen virusten kehittyminen on monien mielestä uhka koko ihmiskunnalle.

Geeniterapian avulla on tulevaisuudessa mahdollista muuttaa ihmisen genomia. Tällä hetkellä kehitetään ja testataan tehokkaita menetelmiä ihmisen genomin modifioimiseksi kädellisillä. Apinoiden geenitekniikassa oli pitkään vakavia vaikeuksia, mutta vuonna 2009 kokeet kruunasi menestys: Nature-lehdessä ilmestyi julkaisu geenimanipuloitujen virusvektorien menestyksekkäästä käytöstä aikuisen urosapinan parantamiseksi värisokeudesta. Samana vuonna ensimmäinen geneettisesti muunneltu kädellinen (kasvatettu muunnetusta munasta) antoi jälkeläisiä - tavallisen marmosetin.

Vaikkakin pienessä mittakaavassa, geenitekniikkaa käytetään jo antamaan naisille, joilla on tietyntyyppinen hedelmättömyys, mahdollisuus tulla raskaaksi. Käytä tätä varten terveen naisen munia. Tämän seurauksena lapsi perii genotyypin yhdeltä isältä ja kahdelta äidiltä.

Mahdollisuus tehdä merkittävämpiä muutoksia ihmisen genomiin liittyy kuitenkin useisiin vakaviin eettisiin ongelmiin.

_____________________________________________________________________________________________

Geenitekniikka (geenitekniikka)

Tämä on joukko tekniikoita, menetelmiä ja teknologioita rekombinantti-RNA:n ja DNA:n saamiseksi, geenien eristämiseksi organismista (soluista), geenien manipuloimiseksi ja niiden viemiseksi muihin organismeihin.

Geenitekniikka ei ole tiedettä laajimmassa merkityksessä, vaan työkalu biotekniikka käyttämällä biologisten tieteiden menetelmiä, kuten molekyyli- ja solubiologia, sytologia, genetiikka, mikrobiologia, virologia.

Tärkeä osa bioteknologiaa on geenitekniikka. Hän on syntynyt 70-luvun alussa, ja hän on saavuttanut suurta menestystä tänään. Geeniteknologiat muuttavat bakteeri-, hiiva- ja nisäkässolut "tehtaiksi" minkä tahansa proteiinin laajamittaista tuotantoa varten. Tämä mahdollistaa proteiinien rakenteen ja toiminnan yksityiskohtaisen analysoinnin ja niiden käytön lääkkeinä.

Tällä hetkellä Escherichia colista (E. coli) on tullut sellaisten tärkeiden hormonien toimittaja kuin insuliini ja somatotropiini. Aikaisemmin insuliini saatiin eläinten haimasoluista, joten hinta oli erittäin korkea. 100 g kiteistä insuliinia saadakseen tarvitaan 800-1000 kg haimaa ja lehmän yksi rauhanen painaa 200-250 grammaa. Tämä teki insuliinista kallista ja vaikeasti saatavilla useille diabeetikoille. Vuonna 1978 Genentechin tutkijat valmistivat ensimmäisen insuliinin erityisesti muokattuun Escherichia coli -kantaan. Insuliini koostuu kahdesta polypeptidiketjusta A ja B, jotka ovat 20 ja 30 aminohappoa pitkiä. Kun ne yhdistetään disulfidisidoksilla, muodostuu luonnollinen kaksiketjuinen insuliini. On osoitettu, että se ei sisällä E. coli -proteiineja, endotoksiineja ja muita epäpuhtauksia, sillä ei ole sivuvaikutuksia, kuten eläininsuliini, eikä se eroa siitä biologisen aktiivisuuden suhteen. Myöhemmin proinsuliini syntetisoitiin E. coli -soluissa, joista syntetisoitiin DNA-kopio RNA-templaatille käänteiskopioijaentsyymiä käyttäen. Saadun proinsuliinin puhdistuksen jälkeen se jaettiin ja saatiin luontainen insuliini, samalla kun hormonin uutto- ja eristysvaiheet minimoitiin. 1000 litrasta viljelynestettä saadaan jopa 200 grammaa hormonia, mikä vastaa sian tai lehmän haiman 1600 kilosta erittyvän insuliinin määrää.

Somatotropiini on ihmisen kasvuhormoni, jota aivolisäke erittää. Tämän hormonin puute johtaa aivolisäkkeen kääpiökasvuun. Jos somatotropiinia annetaan annoksina 10 mg painokiloa kohden kolme kertaa viikossa, niin sen puutteesta kärsivä lapsi voi kasvaa vuodessa 6 cm:n lopullinen lääkevalmiste. Siten saatavilla olevan hormonin määrät olivat rajalliset, lisäksi tällä menetelmällä tuotettu hormoni oli heterogeeninen ja saattoi sisältää hitaasti kehittyviä viruksia. Yritys "Genentec" kehitti vuonna 1980 teknologian somatotropiinin tuotantoon bakteereilla, josta puuttui nämä puutteet. Vuonna 1982 ihmisen kasvuhormonia saatiin E. colin ja eläinsolujen viljelystä Pasteur-instituutissa Ranskassa, ja vuodesta 1984 lähtien insuliinin teollinen tuotanto on aloitettu Neuvostoliitossa. Interferonin tuotannossa käytetään sekä E. colia, S. cerevisae (hiiva) että fibroblastien tai transformoitujen leukosyyttien viljelmää. Myös turvallisia ja halpoja rokotteita saadaan vastaavilla menetelmillä.

Erittäin spesifisten DNA-koettimien tuotanto perustuu rekombinantti-DNA-teknologiaan, jonka avulla tutkitaan geenien ilmentymistä kudoksissa, geenien lokalisaatiota kromosomeissa ja tunnistetaan geenejä, joilla on siihen liittyviä tehtäviä (esim. ihmisillä ja kanoilla). ). DNA-koettimia käytetään myös erilaisten sairauksien diagnosoinnissa.
Yhdistelmä-DNA-tekniikka on mahdollistanut epätavanomaisen proteiini-geenilähestymistavan, jota kutsutaan käänteiseksi genetiikaksi. Tällä lähestymistavalla proteiini eristetään solusta, tämän proteiinin geeni kloonataan ja sitä modifioidaan, jolloin syntyy mutanttigeeni, joka koodaa proteiinin muuttunutta muotoa. Tuloksena oleva geeni viedään soluun. Jos se ekspressoituu, sitä kantava solu ja sen jälkeläiset syntetisoivat muuttuneen proteiinin. Tällä tavoin viallisia geenejä voidaan korjata ja perinnöllisiä sairauksia hoitaa.

Jos hybridi-DNA viedään hedelmöitettyyn munasoluun, voidaan saada siirtogeenisiä organismeja, jotka ilmentävät mutanttigeeniä ja välittävät sen jälkeläisille. Eläinten geneettinen transformaatio mahdollistaa yksittäisten geenien ja niiden proteiinituotteiden roolin selvittämisen sekä muiden geenien toiminnan säätelyssä että erilaisissa patologisissa prosesseissa. Geenitekniikan avulla on luotu virustaudeille vastustuskykyisiä eläinlinjoja sekä eläinrotuja, joilla on ihmisille hyödyllisiä ominaisuuksia. Esimerkiksi naudan somatotropiinigeenin sisältävän rekombinantti-DNA:n mikroinjektio kanin tsygoottiin mahdollisti siirtogeenisen eläimen, jolla oli tämän hormonin ylituotantoa. Tuloksena olevilla eläimillä oli selvä akromegalia.
Nyt on jopa vaikea ennustaa kaikkia tulevien vuosikymmenten aikana toteutuvia mahdollisuuksia.

Geenitekniikka on biotekniikan ala, joka sisältää genotyyppien uudelleenjärjestämisen. Geenitekniikan avulla voidaan nykyäänkin kytkeä yksittäisiä geenejä päälle ja pois päältä ja siten ohjata organismien toimintaa sekä siirtää geneettisiä ohjeita organismista toiseen, myös toisen lajin eliöt. Kun geneetikot oppivat yhä enemmän geenien ja proteiinien toiminnasta, tulee yhä todellisemmaksi mahdollisuus mielivaltaisesti ohjelmoida genotyyppi (ensisijaisesti ihmisen) ja saavuttaa helposti mitä tahansa tuloksia: kuten säteilynkestävyys, kyky elää veden alla , kyky vaurioituneiden elinten uusiutumiseen ja jopa kuolemattomuuteen.

Tietosanakirja YouTube

• 1 / 5

  Geenitekniikan avulla saavutetaan muunnetun tai muuntogeenisen organismin halutut ominaisuudet. Toisin kuin perinteinen jalostus, jonka aikana genotyyppiä muutetaan vain epäsuorasti, geenitekniikan avulla voit suoraan häiritä geneettistä laitteistoa käyttämällä molekyylikloonaustekniikkaa. Esimerkkejä geenitekniikan sovelluksista ovat uusien muuntogeenisten viljelykasvilajikkeiden tuotanto, ihmisinsuliinin tuotanto geneettisesti muunnetuilla bakteereilla, erytropoietiinin tuotanto soluviljelmässä tai uudet kokeelliset hiiret tieteelliseen tutkimukseen.

  Mikrobiologisen, biosynteettisen teollisuuden perusta on bakteerisolu. Teolliseen tuotantoon tarvittavat solut valitaan tiettyjen kriteerien mukaan, joista tärkein on kyky tuottaa, syntetisoida mahdollisimman suurina määrinä tiettyä yhdistettä - aminohappoa tai antibioottia, steroidihormonia tai orgaanista happoa. . Joskus tarvitaan mikro-organismia, joka voi esimerkiksi käyttää öljyä tai jätevettä "ruokana" ja jalostaa ne biomassaksi tai jopa rehun lisäaineiksi sopivaksi proteiiniksi. Joskus tarvitaan organismeja, jotka voivat kasvaa korkeissa lämpötiloissa tai sellaisten aineiden läsnä ollessa, jotka ovat kiistatta tappavia muun tyyppisille mikro-organismeille.

  Tehtävä tällaisten teollisten kantojen saamiseksi on erittäin tärkeä, niiden muuntamista ja valintaa varten on kehitetty lukuisia menetelmiä aktiivisesti soluun vaikuttamiseksi - käsittelystä voimakkailla myrkkyillä radioaktiiviseen säteilytykseen. Näiden tekniikoiden tarkoitus on sama - saada aikaan muutos solun perinnöllisissä, geneettisissä laitteissa. Niiden tuloksena syntyy lukuisia mutanttimikrobeja, joista tutkijat yrittävät sitten valita sopivimman tiettyyn tarkoitukseen sadoista ja tuhansista. Kemiallisen tai säteilymutageneesin tekniikoiden luominen oli erinomainen saavutus biologiassa, ja sitä käytetään laajasti nykyaikaisessa biotekniikassa.

  Mutta niiden kykyjä rajoittaa itse mikro-organismien luonne. Ne eivät pysty syntetisoimaan monia arvokkaita aineita, jotka kerääntyvät kasveihin, ensisijaisesti lääke- ja eteerisiin öljykasveihin. He eivät pysty syntetisoimaan aineita, jotka ovat erittäin tärkeitä eläinten ja ihmisten elämälle, useita entsyymejä, peptidihormoneja, immuuniproteiineja, interferoneja ja monia muita yksinkertaisempia yhdisteitä, joita syntetisoidaan eläimissä ja ihmisissä. Mikro-organismien mahdollisuudet eivät tietenkään ole vielä loppuneet. Mikro-organismien runsaudesta vain pieni osa on tieteen ja erityisesti teollisuuden käytössä. Mikro-organismien valinnan kannalta kiinnostavia ovat esimerkiksi anaerobiset bakteerit, jotka voivat elää ilman happea, valoenergiaa käyttävät fototrofit, kuten kasvit, kemoautotrofit, termofiiliset bakteerit, jotka voivat elää lämpötilassa, kuten hiljattain löydettiin. , noin 110 °C jne.

  Ja silti "luonnollisen materiaalin" rajoitukset ovat ilmeisiä. He yrittivät ja yrittävät kiertää rajoituksia kasvien ja eläinten soluviljelmien ja kudosten avulla. Tämä on erittäin tärkeä ja lupaava tapa, jota toteutetaan myös biotekniikassa. Muutaman viime vuosikymmenen aikana tiedemiehet ovat kehittäneet menetelmiä, joilla kasvi- tai eläinkudoksen yksittäiset solut voidaan saada kasvamaan ja lisääntymään erillään kehosta, kuten bakteerisoluista. Tämä oli tärkeä saavutus - saatuja soluviljelmiä käytetään kokeisiin ja tiettyjen aineiden teolliseen tuotantoon, joita ei voida saada bakteeriviljelmillä.

  Toinen tutkimussuunta on proteiineja koodaaville ja organismien toiminnalle tarpeettomien geenien poistaminen DNA:sta ja sellaiseen DNA:han perustuvien keinotekoisten organismien luominen "typistetyllä geenijoukolla". Tämä mahdollistaa muunnettujen organismien vastustuskyvyn jyrkän lisäämisen viruksille.

  Kehityshistoria ja saavutettu teknologian taso

  1900-luvun jälkipuoliskolla tehtiin useita tärkeitä löytöjä ja keksintöjä, jotka ovat taustalla geenitekniikka. Monien vuosien yritykset "lukea" geeneihin "tallennettua" biologista tietoa on saatu onnistuneesti päätökseen. Tämän työn aloittivat englantilainen tiedemies Frederick Senger ja amerikkalainen Walter Gilbert (Nobelin kemianpalkinto vuonna 1980). Kuten tiedät, geenit sisältävät informaatio-ohjeita RNA-molekyylien ja proteiinien synteesiä varten kehossa, mukaan lukien entsyymit. Jotta solu pakotetaan syntetisoimaan sille uusia, epätavallisia aineita, on välttämätöntä, että siihen syntetisoidaan vastaavat entsyymisarjat. Ja tätä varten on tarpeen joko tarkoituksellisesti muuttaa siinä olevia geenejä tai tuoda siihen uusia, aiemmin puuttuneita geenejä. Elävien solujen geenien muutokset ovat mutaatioita. Ne esiintyvät esimerkiksi mutageenien - kemiallisten myrkkyjen tai säteilyn - vaikutuksen alaisena. Mutta tällaisia ​​muutoksia ei voida hallita tai ohjata. Siksi tutkijat ovat keskittäneet ponnistelunsa yrittäessään kehittää menetelmiä uusien, hyvin spesifisten ihmisen tarvitsemien geenien tuomiseksi soluun.

  Geenitekniikan ongelman ratkaisemisen päävaiheet ovat seuraavat:

  1. Eristetyn geenin hankkiminen.
  2. Geenin vieminen vektoriin organismiin siirtämistä varten.
  3. Geenin sisältävän vektorin siirto modifioituun organismiin.
  4. Kehon solujen transformaatio.
  5. Geneettisesti muunnettujen organismien valinta ( GMO) ja poistamalla ne, joita ei ole muokattu onnistuneesti.

  Geenisynteesiprosessi on tällä hetkellä erittäin hyvin kehittynyt ja jopa suurelta osin automatisoitu. On olemassa erityisiä tietokoneilla varustettuja laitteita, joiden muistiin on tallennettu ohjelmia erilaisten nukleotidisekvenssien synteesiä varten. Tällainen laite syntetisoi DNA-segmenttejä, joiden pituus on 100-120 typpiemästä (oligonukleotideja). Tekniikka on tullut laajalle levinneeksi, joka mahdollistaa polymeraasiketjureaktion käytön DNA-synteesiin, mukaan lukien mutantti-DNA. Siinä käytetään DNA:n templaattisynteesiin lämpöstabiilia entsyymiä, DNA-polymeraasia, jota käytetään keinotekoisesti syntetisoitujen nukleiinihappopalojen - oligonukleotidien siemenenä. Käänteistranskriptaasientsyymi mahdollistaa DNA:n syntetisoinnin käyttämällä tällaisia ​​alukkeita (alukkeita) soluista eristettyyn RNA-matriisiin. Tällä tavalla syntetisoitua DNA:ta kutsutaan komplementaariseksi (RNA) tai cDNA:ksi. Eristetty, "kemiallisesti puhdas" geeni voidaan myös saada faagikirjastosta. Tämä on bakteriofagivalmisteen nimi, jonka genomiin on lisätty satunnaisia ​​fragmentteja genomista tai cDNA:sta, ja faagi toistaa sen kaiken DNA:n kanssa.

  Tekniikka geenien viemiseksi bakteereihin kehitettiin sen jälkeen, kun Frederick Griffith löysi bakteeritransformaatioilmiön. Tämä ilmiö perustuu primitiiviseen seksuaaliseen prosessiin, johon bakteereissa liittyy pienten ei-kromosomaalisten DNA-fragmenttien, plasmidien, vaihto. Plasmiditekniikat loivat perustan keinotekoisten geenien viemiselle bakteerisoluihin.

  Merkittäviä vaikeuksia liittyi valmiin geenin viemiseen kasvi- ja eläinsolujen perinnölliseen laitteistoon. Luonnossa on kuitenkin tapauksia, joissa vieras DNA (viruksen tai bakteriofagin) sisällytetään solun geneettiseen laitteistoon ja alkaa aineenvaihduntamekanismiensa avulla syntetisoida "omaa" proteiiniaan. Tiedemiehet tutkivat vieraan DNA:n viemisen ominaisuuksia ja käyttivät sitä periaatteena geneettisen materiaalin viemiseksi soluun. Tätä prosessia kutsutaan transfektioksi.

  Jos yksisoluisia organismeja tai monisoluisten solujen viljelmiä modifioidaan, kloonaus alkaa tässä vaiheessa, eli niiden organismien ja niiden jälkeläisten (kloonien) valinta, jotka ovat muuttuneet. Kun tehtävänä on saada monisoluisia organismeja, niin muuttuneella genotyypillä omaavia soluja käytetään kasvien vegetatiiviseen lisäykseen tai ruiskutetaan korvikeäidin blastokysteihin, kun kyse on eläimistä. Tämän seurauksena syntyy muuttuneella tai muuttumattomalla genotyypillä omaavia pentuja, joista valitaan ja risteytetään keskenään vain ne, jotka osoittavat odotettuja muutoksia.

  Sovellus tieteellisessä tutkimuksessa

  Vaikkakin pienessä mittakaavassa, geenitekniikkaa käytetään jo antamaan naisille, joilla on tietyntyyppinen hedelmättömyys, mahdollisuus tulla raskaaksi. Käytä tätä varten terveen naisen munia. Tämän seurauksena lapsi perii genotyypin yhdeltä isältä ja kahdelta äidiltä.

  Mahdollisuus tehdä suurempia muutoksia ihmisen genomiin liittyy kuitenkin useisiin vakaviin eettisiin ongelmiin. Vuonna 2016 joukko tiedemiehiä Yhdysvalloissa sai hyväksynnän kliinisille kokeille syövän hoitomenetelmässä, jossa käytetään potilaan omia immuunisoluja, jotka on altistettu geenimuunnoksille CRISPR/Cas9-teknologialla.

  Solutekniikka

  Solutekniikka perustuu sellaisten kasvi- ja eläinsolujen ja kudosten viljelyyn, jotka kykenevät tuottamaan ihmiselle välttämättömiä aineita kehon ulkopuolella. Tätä menetelmää käytetään arvokkaiden kasvimuotojen klonaaliseen (aseksuaaliseen) lisäämiseen; saada hybridisoluja, joissa yhdistyvät esimerkiksi veren lymfosyyttien ja kasvainsolujen ominaisuudet, mikä mahdollistaa vasta-aineiden nopean hankkimisen.

  Geenitekniikka Venäjällä

  Todetaan, että GMO:ien valtion rekisteröinnin käyttöönoton jälkeen joidenkin julkisten organisaatioiden ja valtion duuman yksittäisten kansanedustajien toiminta, jotka yrittävät estää innovatiivisten biotekniikoiden käyttöönottoa Venäjän maataloudessa, on lisääntynyt huomattavasti. Yli 350 venäläistä tutkijaa allekirjoitti Venäjän federaation geenitekniikan kehittämistä tukevan tiedeseuran avoimen kirjeen. Avoimessa kirjeessä todetaan, että muuntogeenisten organismien kielto Venäjällä ei ainoastaan ​​vahingoita tervettä kilpailua maatalousmarkkinoilla, vaan johtaa merkittävään viiveeseen elintarviketuotannon teknologioissa, lisää riippuvuutta elintarvikkeiden tuonnista ja heikentää Venäjän arvovaltaa valtiona. jonka innovatiivisen kehityksen kurssi on virallisesti ilmoitettu [ tosiasian merkitys? ] .

  Katso myös

  Huomautuksia

  1. Aleksanteri Panchin Jumalan lyöminen // Popular Mechanics . - 2017. - Nro 3. - S. 32-35. - URL-osoite: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo genomien muokkaus  käyttämällä korkean tehon TALEN järjestelmää(Englanti) . luonto. Haettu 10. tammikuuta 2017.
  3. Elementit – tiedeuutisia: apinat paranivat värisokeudesta geeniterapialla (määrätön) (18. syyskuuta 2009). Haettu 10. tammikuuta 2017.