Método de armadilha para determinar a atividade antioxidante. Método para determinar a atividade antioxidante total

A invenção refere-se à indústria alimentícia e pode ser usada para determinar a atividade antioxidante total. O método é realizado da seguinte forma: o analito interage com o reagente 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina. O ácido ascórbico (AA) interage com o mesmo reagente, que é adicionado na proporção de 1:100. Em seguida, incubado por pelo menos 90 minutos e fotômetro a 510±20 nm. Em seguida, estabelece-se a dependência do valor do sinal analítico com a quantidade de substância e calcula-se o valor do AOA total. O método apresentado permite a determinação menos demorada e mais confiável da atividade antioxidante total de materiais vegetais e produtos alimentícios baseados nele. 2 w.p. f-ly, 1 il., 5 tab.

A invenção refere-se à química analítica e pode ser usada na determinação da atividade antioxidante total (AOA) de materiais vegetais e produtos alimentícios baseados nela.

Método coulométrico conhecido para determinar o AOA total de chá, baseado na interação de extratos aquosos do produto com compostos de bromo gerados eletricamente (I.F. Abdulin, E.N. Turova, G.K. Chemistry, 2001, vol. 56, no. 6, pp. 627- 629). A escolha de compostos de bromo eletrogerado como titulante deve-se à sua capacidade de entrar em várias reações: radical, redox, substituição eletrofílica e adição por ligações múltiplas. Isso torna possível cobrir uma ampla gama de compostos de chá biologicamente ativos com propriedades antioxidantes. As desvantagens deste método são a possibilidade de reação de bromação com substâncias que não são antioxidantes, e a expressão do valor resultante do AOA total em unidades de quantidade de eletricidade (kC/100 g), o que dificulta a avaliação os resultados.

Um método voltamétrico conhecido para determinar a atividade antioxidante total pela mudança relativa na corrente de eletrorredução de oxigênio na faixa de potencial de 0,0 a -0,6 V (rel. sat. c.s.e.) em um eletrodo de filme de mercúrio (Pat. IPC 7 G 01 N 33/01 Método voltamétrico para determinação da atividade total de antioxidantes / E. I. Korotkova, Yu. A desvantagem deste método é a ocorrência de reações eletroquímicas laterais, o que reduz a eficiência da determinação de antioxidantes, o que leva a uma diminuição na confiabilidade dos resultados.

Um método conhecido para controlar o AOA total de agentes antioxidantes profiláticos e terapêuticos para peroxidação lipídica em aldeído malônico com detecção espectrofotométrica ou quimioluminescente (Pat. 2182706, Rússia, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. fundos / Pavlyuchenko I.I., Basov A.A., Fedosov S.R. - Nº 2001101389/14; pedido de 15/01/2001; publicação de 20/05/2002). Ao mesmo tempo, a atividade antioxidante é inversamente proporcional ao nível de produtos da peroxidação lipídica. A desvantagem deste método pode ser considerada uma gama limitada de objetos analisados, uma vez que nestas condições são determinados antioxidantes de apenas um grupo, os lipídios.

Um método conhecido para determinar o AOA total de um extrato vegetal, que consiste em incubar o extrato com linetol e sulfato de ferro (II), iniciando a reação de oxidação por irradiação UV e subsequente interação com ácido tiobarbitúrico na presença de triton X-100 ( Pedido 97111917/13, Rússia, IPC 6 G 01 N 33/00 Método para determinação da atividade antioxidante total / Rogozhin VV - Pedido de 08.07.1997; publ. 10.06.1999). Ao realizar a espectrofotometria, é utilizada uma mistura de etanol e clorofórmio na proporção de 7:3. O valor AOA de um material biológico é determinado pela razão do acúmulo do produto da reação - malondialdeído em uma amostra contendo um extrato para uma amostra com um pró-oxidante. A desvantagem deste método reside na possibilidade de reações colaterais durante a irradiação UV, o que reduz a confiabilidade dos resultados da análise.

Os métodos listados para determinar o AOA total têm várias desvantagens: alta intensidade de trabalho, baixa confiabilidade, o valor medido do AOA total não está relacionado e não é comparável com nenhuma substância convencional.

O análogo mais próximo da invenção reivindicada é um método para determinar o AOA total de plantas medicinais medindo a quimioluminescência que ocorre ao reagir com luminol na presença de um agente oxidante peróxido de hidrogênio (M.Kh. grama canário por quimioluminescência // Journal of Química Analítica, 2004, V.59, No. 1, P.84-86). Para uma avaliação quantitativa do AOA total, a capacidade redutora do extrato de matérias-primas medicinais e a atividade de um potente antioxidante - ácido ascórbico na quantidade de 25-110 μg foram comparadas. Comparado com os métodos acima, no protótipo, o peróxido de hidrogênio é usado como agente oxidante, interagindo com uma ampla gama de antioxidantes, e o valor medido do AOA total do objeto é determinado e expresso em relação ao ácido ascórbico, que é um antioxidante comum, o que permite obter resultados confiáveis mantendo outras desvantagens. As desvantagens também incluem a complexidade do equipamento utilizado no método.

O objetivo técnico da invenção reivindicada é o desenvolvimento de um método menos demorado e confiável para determinar a atividade antioxidante total de materiais vegetais e produtos alimentícios baseados nele.

Para resolver o problema técnico, propõe-se a interação do analito com o reagente 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina, e ácido ascórbico (AA) com o mesmo reagente, que é adicionado na proporção de 1:100 , incubado por pelo menos 90 minutos, fotometrado a 510±20 nm, seguido de estabelecimento da dependência do sinal analítico com a quantidade de substância e cálculo do AOA total. Em particular, o cálculo pode ser realizado de acordo com a fórmula (I), derivada da equação de correspondência quantitativa entre o objeto em estudo e o ácido ascórbico:

onde a, c são os coeficientes na equação de regressão para a dependência do sinal analítico da quantidade de AA;

a", c" - coeficientes na equação de regressão para a dependência do sinal analítico da quantidade do objeto em estudo;

x sol. - massa do agente redutor estudado (amostra), mg.

A utilização do reagente proposto nestas condições permitiu ampliar a faixa linear e reduzir o limite inferior das quantidades determinadas de ácido ascórbico. O conjunto proposto de características essenciais permite determinar o AOA total de uma ampla gama de materiais vegetais e produtos alimentícios com base nele.

As equações de correspondência quantitativa conectam a dependência do sinal analítico da quantidade de ácido ascórbico e a dependência do sinal analítico da quantidade do objeto em estudo, desde que a atividade antioxidante seja igual.

Após o processamento dos resultados das medições fotométricas da magnitude do sinal analítico pelo método dos mínimos quadrados (K. Derffel Statistics em química analítica. - M .: "Mir", 1994. S. 164-169; A.K. Charykov Processamento matemático do resultados da análise química - L.: Química, 1984. S.137-144) essas dependências foram descritas por uma função de regressão linear: y=ax+b, onde a é o coeficiente de regressão, b é um membro livre. O coeficiente a na equação de regressão é igual à tangente da inclinação da linha reta ao eixo x; coeficiente b - distância ao longo do eixo y da origem (0,0) ao primeiro ponto (x 1 , y 1).

Os coeficientes a e b são calculados pelas fórmulas:

A equação de regressão para a dependência de AS na quantidade de ácido ascórbico em um determinado momento tem a forma:

y AK \u003d a x AK (mg) + b,

equação de regressão para a dependência de AS na quantidade do objeto em estudo (agente redutor):

y VOST \u003d a "x VOST (mg) + b",

onde para AK, para VOST é a densidade óptica da solução fotométrica;

x AK (mg), x VOST (mg) - concentração de ácido ascórbico (agente redutor) em solução;

então, equacionando os valores das funções, obtemos a fórmula (I) para calcular a atividade antioxidante do objeto em estudo em unidades da quantidade (mg) de ácido ascórbico.

O desenho mostra a dependência do sinal analítico da quantidade de agente redutor.

A densidade óptica das soluções analisadas foi medida em um colorímetro fotoelétrico KFK-2MP.

Sabe-se (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Vunsch Complex compostos em química analítica - M.: Mir, 1975. - 531 p.) que a o-fenantrolina forma um quelato solúvel em água com ferro ( II) cor vermelho-alaranjada, caracterizada por um máximo de absorção em λ=512 nm. Portanto, no método proposto, a fotometria é realizada em λ=510±20 nm.

A otimização da composição do reagente e sua quantidade introduzida na reação foi realizada com base nos resultados do planejamento multifatorial do experimento usando o método do quadrado latino, que consistia em alterar todos os fatores estudados em cada experimento, e cada nível de cada fator apenas uma vez atende a diferentes níveis de outros fatores. Isso permite identificar e avaliar o efeito causado por cada fator em estudo separadamente.

Foram utilizados os seguintes fatores: as quantidades de Fe(III), o-fenantrolina e o volume do reagente introduzido na reação. A combinação de fatores deve fornecer uma ampla faixa de linearidade do sinal analítico (AS) com sensibilidade suficiente, por um lado, e estabilidade do reagente ao longo do tempo, por outro. Isso possibilitou destacar os seguintes níveis para cada fator:

a quantidade de Fe(III): 0,003 M (A 1); 0,006 M (A2); 0,009 M (A 3);

quantidade de o-fenantrolina: 0,01 M (B1); 0,02 M (B2); 0,03 M (B3);

volume do reagente: 0,5 ml (C1); 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C 3) (Tabela 1).

Para selecionar a combinação ótima de níveis de fatores, as dependências de calibração de AS na quantidade de ácido ascórbico foram obtidas na faixa de 10 a 150 μg (o que é necessário para confirmar a linearidade da função), a equação de regressão da dependência obtida foi calculado e, em seguida, o valor de AS em uma determinada quantidade (120 μg) de ácido ascórbico. Assim, para cada composição do reagente (fatores A, B), foi selecionado o volume (fator C), no qual o valor AC é máximo. Isso possibilitou reduzir o número de combinações consideradas para nove (Tabela 2).

Comparando o EA total para cada nível, foram identificados os valores com valor máximo: ΣA 2 (0,991); ΣB1 (1,066); ΣC2 (1,361). Isso permitiu concluir que a composição do reagente é ótima: 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolina com seu volume introduzido na reação, 1,0 ml por 100 ml de solução.

Na concentração ótima do reagente, estudamos a mudança na dependência do AS na concentração de ácido ascórbico e alguns agentes redutores comuns em objetos naturais (tanino, rutina, quercetina) em diferentes tempos de incubação da mistura de reação (30, 60 , 90, 120 minutos). Verificou-se que para todos os agentes redutores estudados, a dependência do AS em seu conteúdo é linear na faixa de 10-150 μg (ver desenho) e o valor do AS depende do tempo de incubação (tabela 3).

Pode-se ver pelo desenho que a mudança na AC sob a ação da rutina é insignificante, o tanino se aproxima e a quercetina excede a mesma dependência do ácido ascórbico. Ao considerar a variação da CA a partir do tempo de incubação para todos os agentes redutores estudados (Tabela 3), verificou-se que a estabilização do sinal analítico ao longo do tempo é observada a partir de 90 minutos.

Tabela 3 Mudança no AS dos agentes redutores ao longo do tempo
Substância de teste	m substâncias, mg/cm 3	Sinal analítico
Substância de teste	m substâncias, mg/cm 3	Tempo de incubação da mistura de reação, min
30	60	90	120
Vitamina C	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanino	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutina	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Quercetina	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Para comprovar a natureza somatória do valor de AOA determinado, estudou-se o efeito do reagente Fe(III) - o-fenantrolina em soluções modelo, que incluíam agentes redutores: tanino, rutina, quercetina e ácido ascórbico em várias proporções. A Tabela 4 apresenta os resultados da análise das misturas modelo.

Tabela 4 Resultados da análise de misturas modelo (P=0,95; n=3)
O número de componentes da mistura	AOA total, calculado, mcgAA	Total AOA, encontrado, mcgAA
introduzido	AOA total, calculado, mcgAA	Total AOA, encontrado, mcgAA	em termos de AK
AK	Tanino	Rutina	Quercetina	AK	Tanino	Rutina	Quercetina
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

O cálculo do valor teórico do AOA total foi realizado de acordo com as equações de correspondência quantitativa que caracterizam a capacidade antioxidante do agente redutor estudado em relação ao ácido ascórbico, em condições de igual atividade antioxidante: .

O valor do AOA experimental (encontrado) foi calculado usando a equação de regressão média para a dependência de AS na quantidade de ácido ascórbico. A partir dos resultados apresentados na Tabela 4, pode-se observar que os valores de AOA obtidos experimentalmente concordam satisfatoriamente com os calculados teoricamente.

Assim, o valor determinado de AOA é um indicador total, e a determinação de seu valor usando as equações de correspondência quantitativa é correta.

O método proposto foi testado em amostras reais. Para determinar o AOA total de uma amostra real ou seu extrato, as dependências de calibração de AS na quantidade de analito e ácido ascórbico foram obtidas em um tempo de incubação da mistura de reação de pelo menos 90 minutos. O cálculo do AOA total foi realizado de acordo com a fórmula (I) e expresso em mg de ácido ascórbico por grama do objeto de teste (mgAA/g).

Para confirmar a exatidão do método proposto, essas amostras foram testadas de acordo com métodos conhecidos, avaliando o teor de ácido ascórbico (GOST 24556-89 Produtos processados de frutas e vegetais. Métodos para determinação de vitamina C) e os agentes redutores predominantes: no chá - tanino (GOST 19885-74 Tea. Métodos para determinar o teor de tanino e cafeína), em roseira brava - a quantidade de ácidos orgânicos (GOST 1994-93 Rosehips. Especificações) (tabela 5).

], no entanto, a definição de antioxidantes como compostos químicos não dá uma visão completa das propriedades protetoras do objeto em estudo: elas são determinadas não apenas pela quantidade de um ou outro antioxidante, mas também pela atividade de cada um deles. . Atividade antioxidante, ou atividade antioxidante, AOA, é a constante de velocidade para a reação de um antioxidante com um radical livre (kInH). O método de quimioluminescência (CL) permite determinar a quantidade total de radicais que os antioxidantes se ligam na amostra (capacidade antioxidante total, TAU), e ao utilizar o método de modelagem matemática da cinética do CL, também a taxa de formação e reação de radicais com antioxidantes, ou seja, AOA [ , , ].

A modificação mais comum do método quimioluminescente para determinação da capacidade antioxidante total baseia-se no uso do luminol como ativador de quimioluminescência [ , , , ]. Uma amostra é colocada na cubeta do quimioluminômetro com a adição de luminol, peróxido de hidrogênio e um composto capaz de gerar radicais por decomposição espontânea (termólise), por exemplo, 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) dicloridrato (ABAP): ABAP → 2R. Na presença de oxigênio molecular, o radical alquil R forma um radical peroxil ROO : R + O 2 → ROO . Além disso, o radical peroxil oxida a sonda quimioluminescente luminol (LH2), e o radical luminol (LH) é formado: ROO + LH2 → ROOH + LH. A partir do LH, por meio da formação de intermediários (hidroperóxido de luminol e endoperóxido de luminol), forma-se uma molécula do produto final da oxidação do luminol, o ácido aminoftálico, em estado eletronicamente excitado, que emite um fóton e, como resultado, observa-se a quimioluminescência . A intensidade de CL é proporcional à taxa de produção de fótons, que, por sua vez, é proporcional à concentração estacionária de LH no sistema. Interagindo com os radicais, os antioxidantes interrompem a cadeia de transformações descrita e impedem a formação de um fóton.

Os compostos sujeitos à termólise não são a única fonte possível de radicais na análise da capacidade antioxidante de uma amostra pelo método quimioluminescente. Alternativas são os sistemas peroxidase de rábano-peróxido de hidrogênio [ , ], hemina-peróxido de hidrogênio, citocromo Com–cardiolipina–peróxido de hidrogênio, etc. O esquema das reações de oxidação do luminol pelas peroxidases é considerado no trabalho de Cormier et al. .

As curvas cinéticas do CL para esses sistemas refletem dois estágios da reação: o estágio de aumento na intensidade do CL e o estágio de platô ou uma diminuição gradual da luminescência, quando a intensidade do CL é constante ou diminui lentamente. O artigo descreve duas abordagens para medir a capacidade antioxidante total que levam em conta essa característica das curvas. O método TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) é baseado na medição do período latente do CL τ e podem ser usados para determinar antioxidantes como trolox ou ácido ascórbico: eles são caracterizados por um alto valor da constante de velocidade de reação com radicais e por isso podem ser chamados de antioxidantes fortes. Durante o período latente, ocorre sua oxidação completa. O método TAR (Reatividade Antioxidante Total) mede o grau de extinção da quimioluminescência q no platô ou no máximo da curva quimioluminescente: fórmula , onde I é a intensidade de quimioluminescência sem antioxidante, e I 1 é a intensidade de CL na presença de um antioxidante. Este método é usado se o sistema contém predominantemente antioxidantes fracos com baixas constantes de taxa de interação com os radicais - muito menor em comparação com a constante luminol.

A ação dos antioxidantes é caracterizada não apenas por indicadores τ e q. Como pode ser visto em [ , ], o efeito de antioxidantes como ácido úrico no sistema hemin-H2O2-luminol ou tocoferol, rutina e quercetina no citocromo Com–cardiolipina–H 2 O 2 –luminol, caracterizada por uma mudança na taxa máxima de elevação do CL ( vmax). Como mostram os resultados da modelagem matemática da cinética, os valores das constantes de velocidade da interação desses antioxidantes com os radicais estão próximos ao valor da constante luminol, portanto, tais antioxidantes podem ser chamados de antioxidantes de força média.

Se o material estudado, em particular as matérias-primas vegetais, contivesse apenas um tipo de antioxidante, seu conteúdo poderia ser caracterizado por um dos três indicadores listados acima ( τ , q ou vmax). Mas as matérias-primas vegetais contêm uma mistura de antioxidantes de diferentes forças. Para resolver este problema, alguns autores [ , , , ] utilizaram a mudança na soma da luz quimioluminescente ao longo de um determinado tempo ∆S, calculado pela fórmula , onde ∆ S0 e ∆ S S- somas de luz CL para um determinado tempo t nas amostras controle e teste, respectivamente. O tempo deve ser suficiente para a oxidação de todos os antioxidantes do sistema, ou seja, para que a curva CL da amostra teste atinja o nível da curva CL da amostra controle. Este último sugere que os pesquisadores não devem apenas registrar a soma luminosa da luminescência, mas também registrar a curva cinética do CL por um tempo suficientemente longo, o que está longe de ser sempre feito.

Como todos os indicadores medidos dependem do dispositivo e das condições de medição, o efeito antioxidante de uma substância no sistema em estudo é geralmente comparado com o efeito de um antioxidante tomado como padrão, por exemplo, Trolox [ , ].

O sistema peroxidase de rábano-peróxido de hidrogênio tem sido usado para analisar a capacidade antioxidante total de materiais vegetais por muitos autores. Nos trabalhos [ , ] utilizou-se o período latente do CL (método TRAP) para estimar a quantidade de antioxidantes nas amostras, e nos trabalhos [ , , ] foi utilizada a área sob a curva de desenvolvimento do CL. No entanto, os trabalhos listados não fornecem uma justificativa clara para a escolha de um ou outro parâmetro para estimar a TAU.

O objetivo do estudo foi determinar como a proporção de antioxidantes de vários tipos afeta o TAU e modificar o método de quimioluminescência de forma a poder determinar com mais precisão o TAU em materiais vegetais. Para fazer isso, nos propusemos várias tarefas. Primeiro, comparar a cinética do CL dos objetos estudados com a cinética dos antioxidantes padrão de três tipos (forte, médio e fraco) para entender qual tipo de antioxidante faz a principal contribuição para o TAE dos objetos estudados. Em segundo lugar, calcular o RAE dos objetos estudados medindo a diminuição da soma luminosa do CL sob a ação desses objetos em comparação com a ação do antioxidante, que fornece a maior contribuição para o TAC.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os objetos do estudo foram amostras industriais de frutos de espinheiro, cinza de montanha e rosa selvagem produzidos por Krasnogorskleksredstva JSC (Rússia), bem como frutos de framboesa coletados pelos autores na região de Moscou em condições de crescimento natural e secos a uma temperatura de 60–80 ° C até que parem de extrair suco e deformações de pressão.

Os reagentes para análise da capacidade antioxidante pelo método quimioluminescente foram: KH 2 PO 4 , solução tampão 20 mM (pH 7,4); peroxidase de raízes de rábano (atividade 112 U/mg, M = 44 173,9), solução aquosa 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetra-hidro-1,4-ftalazinodiona, hidrazida do ácido 3-aminoftálico, M=177,11), solução aquosa 1 mM; peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 , M = 34,01), solução aquosa 1 mM; soluções de antioxidantes (ácido ascórbico, quercetina, tocoferol). Todos os reagentes foram fabricados pela Sigma Aldrich (EUA).

Decocções de espinheiro, cinza de montanha e frutos de rosa selvagem e uma infusão de frutos de framboesa foram preparados de acordo com a metodologia da Farmacopeia Estatal da URSS, estabelecida no artigo farmacopéico geral "Infusões e decocções".

A capacidade antioxidante total foi determinada pelo registro da quimioluminescência em um quimioluminômetro Lum-100 (DISoft, Rússia) usando o software PowerGraph 3.3. Para determinar a TAU em materiais vegetais, 40 µl de luminol a uma concentração de 1 mM, 40 µl de peroxidase de rábano a uma concentração de 0,1 µM, de 10 a 50 µl de uma decocção ou infusão (dependendo da concentração) e tampão fosfato na quantidade necessária para trazer o volume total da amostra para 1 ml. A cubeta foi instalada no aparelho e o CL foi registrado, observando-se o sinal de fundo. Após 48 s de registro do sinal de fundo, 100 µl de H2O2 a uma concentração de 1 mM foram adicionados à cubeta e o registro de CL continuou por 10 min. Quatro amostras foram preparadas com diferentes concentrações de cada um dos objetos vegetais. O CL também foi registrado para soluções de ácido ascórbico, quercetina e tocoferol em cinco concentrações diferentes para cada um dos antioxidantes. Posteriormente, o TAU das amostras de decocções e infusões foi recalculado para a quercetina.

As concentrações de luminol, peroxidase de rábano e peróxido de hidrogênio foram selecionadas para determinar a capacidade antioxidante de extratos aquosos de materiais de plantas medicinais em um tempo razoável (não mais que 10 min). Durante este tempo, as curvas de quimioluminescência para os antioxidantes ascorbato e o flavonóide quercetina (os principais antioxidantes dos materiais vegetais) atingiram um platô, o que indicou a destruição completa dos antioxidantes no sistema. As diluições das amostras estudadas e as concentrações das soluções de antioxidantes padrão (indicadas nas legendas das figuras) foram selecionadas de forma que todas as curvas cinéticas do CL fossem medidas na mesma sensibilidade do instrumento.

A capacidade antioxidante foi calculada a partir da mudança de área (∆ S) sob a curva cinética de quimioluminescência (soma da luz) com a adição de uma substância contendo um antioxidante. Para isso, contamos S0 para o sistema sem antioxidante e dele subtraiu a área S S caracterizando o sistema ao qual o antioxidante foi adicionado. valor ∆ S depende da sensibilidade do quimioluminômetro e das condições de medição. Razão ∆ S/C V(Onde C- concentração do material biológico estudado na cubeta, g/l, e V- volume da cuvete, l) expressa a capacidade antioxidante de 1 g do material estudado, ou seja, materiais vegetais.

A capacidade antioxidante ∆ SA uma solução de um antioxidante padrão, como a quercetina, colocada no mesmo volume da mistura de reação. Razão ∆ S A / C A V(Onde C A- concentração em peso do antioxidante na cuvete, g/l) expressa a capacidade antioxidante de 1 g do antioxidante.

Para cada um dos antioxidantes padrão, o sinal de soluções de várias concentrações foi registrado para garantir que os cálculos fossem realizados dentro dos limites de uma relação linear e os resultados obtidos fossem reprodutíveis. De fato, uma dependência linear foi obtida (∆ SA = k A C A) sinal da concentração a partir da qual o coeficiente estequiométrico foi calculado k A. De acordo com o critério de Fisher, os valores obtidos para antioxidantes padrão k A estatisticamente significante com probabilidade de 0,975. Em seguida, o sinal de quatro concentrações foi registrado para cada uma das quatro amostras de plantas, e para todas as amostras uma dependência linear do sinal na concentração (∆ S = kC), que foi usado para calcular o coeficiente estequiométrico k. Com uma probabilidade de 0,975 (teste de Fischer), os valores de k obtidos para amostras de plantas são estatisticamente significativos. A capacidade antioxidante total do material vegetal em termos do peso do antioxidante padrão (mg%) foi encontrada usando a fórmula .

Os valores foram apresentados como média aritmética ± desvio padrão (M ± δ) em p

RESULTADOS DO ESTUDO

Estudo da cinética de quimioluminescência na presença de ascorbato de sódio (Fig. 1. Influência do ascorbato de sódio na cinética de quimioluminescência" data-note="Concentrações dos componentes do sistema: luminol - 40 μM, peroxidase de rábano - 4 nM, peróxido de hidrogênio - 100 μM. Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM ascorbato de sódio. é proporcional à quantidade de antioxidante no sistema. Ao mesmo tempo, nem a inclinação das curvas do CL nem a intensidade do CL no platô mudam. Isso se deve ao fato de que o ácido ascórbico é um forte antioxidante que intercepta todos os radicais formado no sistema, incluindo os radicais luminol, e o CL não se desenvolve até que todo o ascorbato seja oxidado.

Outros pesquisadores também mostraram que os resultados da análise química e o valor de TAU determinado pelo método quimioluminescente muitas vezes não coincidem. No trabalho, a capacidade antioxidante total determinada no sistema peroxidase-luminol-peróxido de hidrogênio correlacionou-se com o teor de compostos triterpenos. No entanto, no trabalho dos mesmos autores, em que outra planta foi objeto de estudo, não foi observada correlação entre TAU e o teor de qualquer grupo de substâncias, incluindo flavonóides.

Essas discrepâncias estão relacionadas a pelo menos três fatores. Primeiro, a atividade dos antioxidantes é importante, ou seja, a taxa de sua interação com os radicais, que é diferente para os diferentes antioxidantes que compõem a amostra da planta. De acordo com Izmailov, as constantes de velocidade das reações correspondentes para mexidol, tocoferol e quercetina estão relacionadas como 0,04: 2: 60. Em segundo lugar, cada molécula antioxidante, entrando em uma reação química, pode interceptar um número diferente de radicais. De acordo com o trabalho , a quercetina, os ácidos úrico e ascórbico interceptaram 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 e 0,5 ± 0,2 radicais por molécula antioxidante reagida, respectivamente (foi utilizado o sistema hemina-H 2 O 2 – luminol). Em terceiro lugar, os resultados do estudo podem ser influenciados pela presença de atividade da peroxidase nas próprias amostras de plantas, como no trabalho, bem como a presença de cálcio nas amostras, que, como mostrado no trabalho, é capaz de aumentar a atividade da peroxidase de rábano sob certas condições. Isso geralmente causa uma maior intensidade de CL no platô do que nas curvas de controle, o que, no entanto, não observamos.

O primeiro fator limita fortemente o uso de tal parâmetro como uma mudança na soma de luz, uma vez que o tempo de medição da quimioluminescência deve ser maior que o tempo de consumo de todos os antioxidantes na amostra de teste. A aproximação deste momento pode ser julgada apenas medindo a cinética de quimioluminescência. Além disso, a contribuição de antioxidantes fracos para EOA é fortemente subestimada, uma vez que o tempo de sua oxidação completa é muitas vezes maior do que o tempo de medição aceitável (10-20 min).

De importância ainda maior é o coeficiente estequiométrico do antioxidante. Número de radicais n, interceptado por ele, é igual a , onde ρ - coeficiente estequiométrico, e ∆ m- alteração na concentração do antioxidante durante a medição, no nosso caso - a concentração inicial da substância de teste na amostra de teste.

A diferença na soma luminosa do brilho na ausência de um antioxidante e na sua presença é proporcional a n. O número total de radicais interceptados é , onde ρié o coeficiente estequiométrico de um antioxidante particular, e eu- sua concentração durante a medição. O número total de radicais interceptados obviamente não é igual à quantidade total de antioxidantes, uma vez que os coeficientes ρi não são apenas iguais à unidade, mas também diferem significativamente para diferentes antioxidantes.

Valor né proporcional à diferença nas somas de luz medidas ao longo de um certo tempo entre uma amostra contendo um antioxidante e uma amostra de controle que não contém antioxidantes: S = k n, Onde k- constante de coeficiente nas mesmas condições de medição.

O método considerado no artigo permite determinar a capacidade antioxidante total, enquanto a análise química permite determinar o teor total de antioxidantes no produto. Portanto, o método de quimioluminescência parece ser mais informativo do que as análises químicas.

As condições que selecionamos para avaliar a capacidade antioxidante total de matérias-primas vegetais registrando a cinética de quimioluminescência em um sistema que consiste em peroxidase de rábano, peróxido de hidrogênio e luminol (as concentrações dos componentes são 4 nM, 100 μM e 40 μM, respectivamente; 20 mM tampão fosfato, pH 7,4), garantiu a oxidação de antioxidantes fortes (ácido ascórbico) e antioxidantes moderados (quercetina) em 10 min. Esta duração da medição é conveniente e garante a qualidade necessária das medições.

Uma análise da cinética de quimioluminescência mostrou que nos objetos estudados (decocções de rowan, rosa selvagem, frutos de espinheiro e infusão de frutos de framboesa), os principais antioxidantes são antioxidantes de força média, incluindo flavonóides, e antioxidantes de força fraca (tocoferol, etc. ). Com base na diminuição da soma da luz quimioluminescente, foi calculada a capacidade antioxidante total para os objetos estudados. A comparação dos valores de TAU obtidos com os resultados da análise química mostrou que produtos contendo a mesma quantidade de antioxidantes com diferentes proporções podem diferir em sua capacidade de proteger efetivamente o corpo dos efeitos nocivos dos radicais livres. A técnica descrita é promissora para estudar objetos vegetais contendo uma mistura de vários antioxidantes. Ao mesmo tempo, caracteriza-se pela simplicidade e baixo custo de pesquisa. A combinação da medição da cinética de quimioluminescência com a modelagem matemática das reações não apenas automatizará o processo de determinação da TAU, mas também determinará a contribuição de grupos individuais de antioxidantes para o indicador.

trabalho de graduação

1.4 Métodos de pesquisa para antioxidantes

a atividade antioxidante é classificada: de acordo com os métodos de registro do AOA manifestado (volumétrico, fotométrico, quimioluminescente, fluorescente, eletroquímico); por tipo de fonte de oxidação; por tipo de composto oxidado; de acordo com o método de medição do composto oxidado.

No entanto, os métodos mais conhecidos para determinar a atividade antioxidante são:

1 TEAC (capacidade antioxidante equivalente trolox): o método baseia-se na seguinte reação:

Metmioglobina + H 2 O 2 > Ferrilglobina + ABTS > ABTS * + AO.

O Método de Equivalência Trolox (TEAC) baseia-se na capacidade dos antioxidantes de reduzir os catiões do radical 2,2-azinobis (ABTS) e, assim, inibir a absorção na parte do espectro de comprimento de onda longo (600 nm). Uma desvantagem significativa do método é a reação em dois estágios de obtenção de um radical. Isso aumenta o tempo de análise e pode aumentar a dispersão dos resultados, apesar de um conjunto padronizado de reagentes ser usado para análise.

2 FRAP (poder antioxidante redutor férrico): o método baseia-se na seguinte reação:

Fe(III)-Tripiridiltriazina+AO>Fe(II)-Tripiridiltriazina.

Capacidade redutora/antioxidante do ferro (FRAP). Aqui, a reação de redução de Fe(III)-tripiridiltriazina em Fe(II)-tripiridiltriazina é usada. No entanto, este método não pode determinar alguns antioxidantes, como a glutationa. Este método permite a determinação direta de antioxidantes de baixo peso molecular. Em pH baixo, a redução do complexo Tripiridiltriazina Fe(III) ao complexo Fe(II) é acompanhada pelo aparecimento de uma cor azul intensa. As medições são baseadas na capacidade dos antioxidantes de suprimir o efeito oxidativo das partículas de reação geradas na mistura de reação. Este método é simples, rápido e de baixo custo na execução.

3 ORAC (capacidade de absorção de radicais de oxigênio): o método é baseado na seguinte reação:

Fe (II) + H 2 O 2 > Fe (III) + OH * + AO> OH * + Luminol.

Determinação da capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC). Neste método, a fluorescência do substrato (ficoeritrina ou fluoresceína) é registrada, o que ocorre como resultado de sua interação com ROS. Se houver antioxidantes na amostra de teste, observa-se uma diminuição na fluorescência em comparação com a amostra de controle. Este método foi originalmente desenvolvido pelo Dr. Guohua Cao no Instituto Nacional do Envelhecimento em 1992. Em 1996, o Dr. Cao juntou-se ao Dr. Ronald Pryer em um grupo conjunto no Centro de Pesquisa do USDA para o Envelhecimento, onde um método semi-automatizado foi desenvolvido.

4 TRAP (parâmetro antioxidante total de aprisionamento de radicais): o método é baseado na seguinte reação:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Este método utiliza a capacidade dos antioxidantes de interagir com o radical peroxil 2,2-azobis(2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH). As modificações TRAP consistem em métodos para registrar um sinal analítico. Na maioria das vezes, no estágio final da análise, o radical peroxi AAPH interage com um substrato luminescente (luminol), fluorescente (diacetato de diclorofluoresceína, DCFH-DA) ou outro substrato opticamente ativo.

O derivado solúvel em água da vitamina E Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxi) é usado como padrão para os métodos TEAC, ORAC e TRAP.

Recentemente, aumentou o interesse no uso de métodos eletroquímicos para a avaliação da atividade antioxidante. Esses métodos são altamente sensíveis e de análise rápida.

A avaliação da atividade antioxidante de alguns produtos alimentícios é realizada pelo método da potenciometria, baseado no uso da propriedade de substâncias antioxidantes de participar de reações redox devido aos grupos enol (-OH) e sulfidrila (-SH).

A determinação das propriedades antioxidantes das soluções é baseada na interação química dos antioxidantes com o sistema mediador, o que leva a uma alteração no seu potencial redox. A célula eletroquímica é um recipiente contendo uma solução tampão K-Na-fosfato, um sistema mediador Fe(III)/Fe(II) e um eletrodo complexo antes de medir o potencial redox. A atividade antioxidante é estimada em g-eq/l.

O método amperométrico para determinar a atividade antioxidante baseia-se na medição da corrente elétrica que ocorre durante a oxidação da substância de teste na superfície do eletrodo de trabalho, que está sob um determinado potencial. A sensibilidade do método amperométrico é determinada tanto pela natureza do eletrodo de trabalho quanto pelo potencial aplicado a ele. O limite de detecção do detector amperométrico de polifenóis, flavonóides ao nível de nano-picogramas, em concentrações tão baixas, há uma menor probabilidade de influência mútua de diferentes antioxidantes em sua presença conjunta, em particular, a manifestação do fenômeno de sinergismo . As desvantagens do método incluem sua especificidade: nessas condições, antioxidantes que são oxidados ou reduzidos na região dos potenciais de eletrorredução do oxigênio não podem ser analisados. As vantagens do método incluem sua rapidez, próstata e sensibilidade.

Método de coulometria galvanostática usando oxidantes eletrogerados - o método é aplicável à análise de antioxidantes lipossolúveis.

Vários métodos foram desenvolvidos para a determinação de ácido ascórbico:

um método amperométrico usando um eletrodo de alumínio modificado com um filme de hexacianoferrato de níquel(II) por um método simples de imersão em solução;

um método para determinação espectrofotométrica em fase sólida e teste visual de ácido ascórbico usando xerogel de ácido silícico modificado com reagente de Wawel e cobre (II) como pó indicador;

a determinação quimioluminescente de ácido ascórbico pode ser realizada pelo método de injeção em fluxo de acordo com a reação quimioluminescente de rodamina B com cério (IV) em meio de ácido sulfúrico.

determinação de ácido ascórbico na faixa de 10 -8 -10 -3 g/cm 3 por voltametria anódica em meio aquoso e aquoso-orgânico.

O mais comum é o método FRAP, pois é expresso, altamente sensível. Nas últimas décadas, um grande número de variedades de métodos para determinar a atividade antioxidante pelo método FRAP foi desenvolvido (tabela 1).

Tabela 1 Desenvolvimento do método FRAP e sua aplicação para determinar a atividade antioxidante de vários objetos

	Objetos de análise	Notas
	plasma sanguíneo	t=4min. A estequiometria da reação e a aditividade foram estudadas.
	chá, vinho	Determinação de AOA devido a polifenóis
		Os valores AOA de diferentes tipos de chá são comparados
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Soluções modelo	t=30min. A influência do solvente não aquoso foi revelada
	Plantas
	sangue, tecido	Método PIA. A influência de substâncias estranhas foi verificada.
Firuzi, Lacanna, Petrucci e.a.	Soluções modelo	A sensibilidade da determinação de diferentes OAs em função de sua estrutura e potencial redox foi estudada.
Katalinic, Milos,	Vários vinhos
Temerdashev, Tsyupko e outros.	Misturas de modelos
Logonova, Konovalova	Medicamentos. Preparações	método de teste
Temerdashev, Tsyupko e outros.	vinhos tintos secos	Correlação do AOA com outros indicadores de qualidade do vinho
Tabela 1 continuação
	Misturas de modelos	A sensibilidade da determinação de diferentes AO
Vershinin, Vlasova, Tsyupko	Misturas de modelos	A não aditividade do sinal com a falta de um agente oxidante foi revelada
Anisimovitch, Deineka e outros.	Soluções modelo	Parâmetros cinéticos para estimação de AOA são propostos.

Notas: convencionalmente rotulado: análise de injeção de fluxo de PIA, TPTZ-tripiridiltriazina, DIP-2,2, -dipiridil, PHEN-o-fenantrolina, ácido DPA-piridinodicarboxílico, FZ-ferrozina, ácido AA-ascórbico, CT-catecol, t - tempo de exposição, min.

Interação entre proteínas e polieletrólitos em soluções aquosas

Vários métodos de análise são usados para caracterizar complexos proteína-polieletrólito. Métodos instrumentais fornecem informações sobre propriedades estruturais e ópticas, bem como determinam a dinâmica e a natureza da ligação do PEC...

Efeito de compostos d-metal na taxa de dissociação de uma molécula de água em uma membrana bipolar

No processo de síntese de novos BPMs, muita atenção deve ser dada ao estudo das propriedades das amostras obtidas para a posterior escolha de condições de síntese que garantam a melhoria das características eletroquímicas das membranas sintetizadas...

Drogas de designer e canabinóides sintéticos

A detecção de canabinóides sintéticos em misturas de ervas pode ser realizada por vários métodos físico-químicos, como cromatografia gasosa-espectrometria de massas, cromatografia gasosa, de camada fina e líquida de alta eficiência ...

Desenvolvimento de um método para determinação de flavonóides em materiais de plantas medicinais

Síntese e propriedades farmacológicas das quinolinonas-2

Objeto de estudo: Quinolinona-2. Método de pesquisa: Utilizando o programa de computador "Marvin JS", foi criada a estrutura da substância. Em seguida, ela foi enviada ao site "http://www.way2drug.com/PASSONline/predict.php" para maiores investigações...

Método Termoespectral para Estudo dos Produtos da Evaporação de um Polímero Epóxi

Tecnologia para obter quitosana altamente purificada a partir de conchas de crustáceos

Determinação do peso molecular do quitosano O peso molecular do quitosano foi determinado viscometricamente de acordo com o procedimento padrão. Soluções com concentração de 0,05 e 0,5 g/dl foram preparadas dissolvendo uma porção pesada do pó de polímero em um tampão de acetato (0...

Características físicas e geográficas do território do parque natural

Palavras-chave

radical livre/antioxidante/ atividade antioxidante / capacidade antioxidante total / quimioluminescência/ luminol / radical livre / antioxidante / atividade antioxidante / capacidade antioxidante total / quimioluminescência / luminol

anotação artigo científico em ciências químicas, autor de artigo científico - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Os materiais de plantas medicinais são uma das fontes de antioxidantes para o corpo humano. Entre os métodos para determinar o conteúdo de antioxidantes em objetos vegetais, o método de análise quimioluminescente é bastante difundido. No presente trabalho, ele foi usado para estimar capacidade antioxidante total(OAU) decocções de frutos de sorveira, rosa selvagem e espinheiro e infusão de frutos de framboesa. A cinética foi registrada no experimento quimioluminescência em um sistema que consiste em peroxidase de rábano, peróxido de hidrogênio e luminol. As concentrações e os volumes dos componentes do sistema na amostra foram escolhidos para que antioxidantes fortes (ácido ascórbico) e antioxidantes moderadamente fortes (quercetina) fossem completamente oxidados durante o tempo de medição (10 min). Propõe-se e justifica-se um método de cálculo da TAU com base na alteração da soma luminosa. quimioluminescência na presença de amostras de plantas. Análise cinética quimioluminescência mostraram que nos objetos estudados predominam antioxidantes de força média, incluindo flavonóides, e antioxidantes fracos (tocoferol, etc.). A comparação dos valores de TAU calculados para os objetos estudados e os dados de sua análise química mostraram que produtos contendo a mesma quantidade de antioxidantes com diferentes proporções por tipos podem diferir em sua capacidade de proteger o corpo dos efeitos nocivos dos radicais livres. A técnica descrita é promissora para o estudo de objetos vegetais contendo uma mistura de antioxidantes de vários tipos.

Tópicos relacionados artigos científicos em ciências químicas, autor de artigo científico - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

2016 / Georgiy Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Determinação de antioxidantes por quimioluminescência ativada usando 2,2"-azo-bis(2-amidinopropano)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Ação antioxidante da dihidroquercetina e rutina nas reações de peroxidase catalisadas pelo citocromo c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Avaliação da capacidade oxidativa e antioxidante de substratos biológicos por quimioluminescência induzida pela reação de Fenton
2016 / Piskarev Igor Mikhailovich, I.P. Ivanova
Determinação do conteúdo de lipohidroperóxidos em lipoproteínas do soro sanguíneo usando o sistema microperoxidase-luminol
2011 / Teselkin Yuri Olegovich, Babenkova Irina Vladimirovna
Métodos para o estudo de antioxidantes
2004 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V.
Atividade antioxidante de plantas utilizadas na etnomedicina de Tuva
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Estudo das propriedades antioxidantes do Fosprenil em vários sistemas de testes biológicos
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova
Influência de diferentes doses de bifenilos policlorados no estado de quimioluminescência dependente de luminol espontânea e imunoglobulina do sangue total
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samohodova O.V.
Avaliação do sistema de peroxidação lipídica de proteção antioxidante em crianças com hipertensão arterial essencial utilizando métodos de espectrofotometria e quimioluminescência
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Determinação quimioluminescente da capacidade antioxidante total em material vegetal medicinal.

O material vegetal medicinal é uma das fontes de antioxidantes para o corpo humano. A análise de quimioluminescência é um dos métodos comuns para determinar o conteúdo de antioxidantes em materiais vegetais. Em nosso trabalho, a análise de quimioluminescência foi usada para determinar a capacidade antioxidante total (TAC) de decocções de frutas de freixo, rosa e espinheiro, bem como infusão de framboesa. Experimentos estabeleceram a cinética da quimioluminescência de um sistema composto por peroxidase de rábano, peróxido de hidrogênio e luminol. Concentrações e volumes dos componentes do sistema foram escolhidos de modo que antioxidantes fortes (ácido ascórbico) e antioxidantes de força média (quercetina) fossem completamente oxidados durante a medição (10 minutos). Um método para cálculo de TAC baseado em mudanças na soma de luz de quimioluminescência na presença de amostras de plantas foi proposto e comprovado. A análise da cinética de quimioluminescência mostrou que antioxidantes de força média dominam nos objetos estudados, incluindo flavonóides e antioxidantes fracos (tocoferol e outros). A comparação dos valores de TAC calculados para os objetos em estudo e seus dados de análise química mostraram que produtos contendo a mesma quantidade de antioxidantes com diferentes proporções de antioxidantes por tipos podem variar em sua capacidade de proteger o corpo contra os efeitos nocivos dos radicais livres . A técnica descrita é promissora para o estudo de objetos vegetais contendo uma mistura de diferentes tipos de antioxidantes.

O texto do trabalho científico sobre o tema "Método quimioluminescente para determinação da capacidade antioxidante total em materiais de plantas medicinais"

método quimioluminescente para determinação da capacidade antioxidante total em materiais de plantas medicinais

G. K. Vladimirov1, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Departamento de Biofísica Médica, Faculdade de Medicina Fundamental, Lomonosov Moscow State University, Moscou

2 Departamento de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia,

I. M. Sechenov Primeira Universidade Médica Estatal de Moscou, Moscou

Os materiais de plantas medicinais são uma das fontes de antioxidantes para o corpo humano. Entre os métodos para determinar o conteúdo de antioxidantes em objetos vegetais, o método de análise de quimioluminescência é bastante difundido. No presente trabalho, foi utilizado para avaliar a capacidade antioxidante total (TOA) de decocções de frutos de sorveira, rosa selvagem e espinheiro e infusão de framboesa. No experimento, a cinética da quimioluminescência foi registrada em um sistema que consiste em peroxidase de rábano, peróxido de hidrogênio e luminol. As concentrações e os volumes dos componentes do sistema na amostra foram escolhidos para que antioxidantes fortes (ácido ascórbico) e antioxidantes moderadamente fortes (quercetina) fossem completamente oxidados durante o tempo de medição (10 min). Um método para calcular o RAE baseado na mudança na soma de luz de quimioluminescência na presença de amostras de plantas é proposto e fundamentado. Uma análise da cinética de quimioluminescência mostrou que antioxidantes moderadamente fortes, incluindo flavonóides, e antioxidantes fracos (tocoferol, etc.) predominam nos objetos estudados. A comparação dos valores de TAU calculados para os objetos estudados e os dados de sua análise química mostraram que produtos contendo a mesma quantidade de antioxidantes com diferentes proporções por tipos podem diferir em sua capacidade de proteger o corpo dos efeitos nocivos dos radicais livres. A técnica descrita é promissora para o estudo de objetos vegetais contendo uma mistura de antioxidantes de vários tipos.

Palavras-chave: radical livre, antioxidante, atividade antioxidante, capacidade antioxidante total, quimioluminescência, luminol

Financiamento: O trabalho foi financiado pela Russian Science Foundation, bolsa nº 14-15-00375.

Ex3 Correspondência deve ser endereçada: Georgy Konstantinovich Vladimirov

119192, Moscou, Lomonosovsky pr-t, 31, prédio 5; [e-mail protegido]

Artigo recebido: 10/03/2016 Artigo aceito para publicação: 18/03/2016

determinação quimioluminescente da capacidade antioxidante total em material de plantas medicinais

1 Departamento de Biofísica Médica, Faculdade de Medicina Fundamental, Lomonosov Moscow State University, Moscou, Rússia

2 Departamento de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia,

The First Sechenov Moscow State Medical University, Moscou, Rússia

Palavras-chave: radical livre, antioxidante, atividade antioxidante, capacidade antioxidante total, quimioluminescência, luminol

Financiamento: este trabalho foi financiado pela Russian Science Foundation, subvenção no. 14-15-00375.

Agradecimentos: os autores agradecem a Andrey Alekseev da Lomonosov Moscow State University por sua assistência na condução do experimento. A correspondência deve ser endereçada: George Vladimirov

Lomonosovskiy prospekt, d. 31, c. 5, Moscou, Rússia, 119192; [e-mail protegido] Recebido: 10/03/2016 Aceito: 18/03/2016

Os radicais livres gerados no corpo perturbam a estrutura das membranas celulares, o que, por sua vez, leva ao desenvolvimento de várias condições patológicas. O efeito oxidativo destrutivo dos radicais é impedido pelo sistema de defesa antioxidante do organismo, no qual os compostos de baixo peso molecular - captadores de radicais (armadilhas) desempenham um papel importante. Uma das fontes de antioxidantes são as matérias-primas de plantas medicinais, bem como as preparações à base delas, cujo estudo do potencial antioxidante ajuda a aumentar seu efeito preventivo e terapêutico.

Os principais métodos para determinação de antioxidantes são considerados nos trabalhos, no entanto, a definição de antioxidantes como compostos químicos não dá uma visão completa das propriedades protetoras do objeto em estudo: eles são determinados não apenas pela quantidade de um ou outro antioxidante , mas também pela atividade de cada um deles. Atividade antioxidante, ou atividade antioxidante, AOA, é a constante de velocidade para a reação de um antioxidante com um radical livre (kInH). O método de quimioluminescência (CL) permite determinar a quantidade total de radicais que os antioxidantes se ligam na amostra (capacidade antioxidante total, TAU), e ao usar o método de modelagem matemática da cinética do CL, também a taxa de formação e reação de radicais com antioxidantes, ou seja, AOA.

A modificação mais comum do método quimioluminescente para determinação da capacidade antioxidante total baseia-se no uso do luminol como ativador de quimioluminescência. Uma amostra é colocada na cubeta do quimioluminômetro com a adição de luminol, peróxido de hidrogênio e um composto capaz de gerar radicais por decomposição espontânea (termólise), por exemplo, 2,2"-azobis-(2-amidinopropano ) dicloridrato (ABAP):

Na presença de oxigênio molecular, o radical alquil R^ forma um radical peroxil ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv A partir do LH, através da formação de substâncias intermediárias (hidroperóxido de luminol e endoperóxido de luminol), forma-se uma molécula do produto final da oxidação do luminol, o ácido aminoftálico, em estado eletronicamente excitado, que emite um fóton , e como resultado, observa-se quimioluminescência . A intensidade de CL é proporcional à taxa de produção de fótons, que, por sua vez, é proporcional à concentração estacionária de LH no sistema. Interagindo com os radicais, os antioxidantes interrompem a cadeia de transformações descrita e impedem a formação de um fóton.

Os compostos sujeitos à termólise não são a única fonte possível de radicais na análise da capacidade antioxidante de uma amostra pelo método quimioluminescente. As alternativas são peroxidase de rábano-peróxido de hidrogênio, hemina-peróxido de hidrogênio, citocromo c-cardiolipina-peróxido de hidrogênio, etc. O esquema de reações de oxidação do luminol por peroxidases é considerado no trabalho de Cormier et al. .

As curvas cinéticas do CL para esses sistemas refletem dois estágios da reação: o estágio de aumento da intensidade do CL e o estágio de platô ou diminuição gradual da luminescência, quando

A intensidade do CL é constante ou diminui lentamente. O artigo descreve duas abordagens para medir a capacidade antioxidante total que levam em conta essa característica das curvas. O método TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) é baseado na medição da latência do CL t e pode ser usado para determinar antioxidantes como trolox ou ácido ascórbico: eles são caracterizados por uma alta constante de velocidade de reação com radicais e por isso podem ser chamados de antioxidantes fortes. Durante o período latente, ocorre sua oxidação completa. O método TAR (Reatividade Antioxidante Total) mede o grau de extinção de quimioluminescência q no platô ou no máximo da curva de quimioluminescência:

onde I é a intensidade de quimioluminescência sem um antioxidante e 11 é a intensidade de CL na presença de um antioxidante. Este método é usado se o sistema contém predominantemente antioxidantes fracos com baixas constantes de taxa de interação com os radicais - muito menor em comparação com a constante luminol.

A ação dos antioxidantes é caracterizada não apenas pelos indicadores de te c. Como pode ser visto nos trabalhos, a ação de antioxidantes como ácido úrico no sistema hemin-H202-luminol ou tocoferol, rutina e quercetina no sistema citocromo c-cardiolipina-H202-luminol é caracterizada por uma alteração na taxa máxima de aumento do CL (utx). Como mostram os resultados da modelagem matemática da cinética, os valores das constantes de velocidade da interação desses antioxidantes com os radicais estão próximos ao valor da constante luminol, portanto, tais antioxidantes podem ser chamados de antioxidantes de força média.

DE = DE0 - DE,

onde DE0 e DE5 são somas de luz CL para um determinado tempo? nas amostras controle e teste, respectivamente. O tempo deve ser suficiente para a oxidação de todos os antioxidantes do sistema, ou seja, para que a curva CL da amostra teste atinja o nível da curva CL da amostra controle. Este último sugere que os pesquisadores não devem apenas registrar a soma luminosa da luminescência, mas também registrar a curva cinética do CL por um tempo suficientemente longo, o que está longe de ser sempre feito.

Como todos os indicadores medidos dependem do instrumento e das condições de medição, o efeito antioxidante de uma substância no sistema em estudo é geralmente comparado com o efeito de um antioxidante tomado como padrão, como o Trolox.

O sistema peroxidase de rábano-peróxido de hidrogênio foi utilizado para analisar a capacidade antioxidante total de materiais vegetais por vários autores. Nos trabalhos, para estimar a quantidade de antioxidantes nas amostras, foi utilizado o período latente do CL (método TRAP), e nos trabalhos, a área sob a curva de desenvolvimento do CL. No entanto, esses trabalhos não dão uma justificativa clara

a escolha de um ou outro parâmetro para estimar a OUA.

O objetivo do estudo foi determinar como a proporção de antioxidantes de vários tipos afeta o TAU e modificar o método de quimioluminescência de forma a poder determinar com mais precisão o TAU em materiais vegetais. Para fazer isso, nos propusemos várias tarefas. Primeiro, comparar a cinética do CL dos objetos estudados com a cinética dos antioxidantes padrão de três tipos (forte, médio e fraco) para entender qual tipo de antioxidante faz a principal contribuição para o TAE dos objetos estudados. Em segundo lugar, calcular o TAE dos objetos estudados medindo a diminuição da soma luminosa do CL sob a ação desses objetos em comparação com a ação do antioxidante, que fornece a maior contribuição para o TAE.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os objetos do estudo foram amostras industriais de frutos de espinheiro, freixo de montanha e rosa mosqueta produzidos por Krasnogorskleksredstva JSC (Rússia), bem como frutos de framboesa coletados pelos autores na região de Moscou em condições de crescimento natural e secos a uma temperatura de 60-80 ° C até que parem de isolar as deformações do suco e da pressão.

Os reagentes para análise da capacidade antioxidante pelo método quimioluminescente foram: KH2PO4, solução tampão 20 mM (pH 7,4); peroxidase de raízes de rábano (atividade 112 U/mg, M = 44 173,9), solução aquosa 1 mM; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetra-hidro-1,4-ftalazinodiona, hidrazida do ácido 3-aminoftálico, M=177,11), solução aquosa 1 mM; peróxido de hidrogênio (H2O2, M = 34,01), solução aquosa 1 mM; soluções de antioxidantes (ácido ascórbico, quercetina, tocoferol). Todos os reagentes foram fabricados pela Sigma Aldrich (EUA).

A capacidade antioxidante total foi determinada registrando a quimioluminescência em um quimioluminômetro Lum-100 (DISoft, Rússia) usando o software PowerGraph 3.3. Para determinar a TAU em materiais vegetais, 40 µl de luminol a uma concentração de 1 mM, 40 µl de peroxidase de rábano a uma concentração de 0,1 µM, de 10 a 50 µl de uma decocção ou infusão (dependendo da concentração) e tampão fosfato na quantidade necessária para trazer o volume total da amostra para 1 ml. A cubeta foi instalada no aparelho e o CL foi registrado, observando-se o sinal de fundo. Após 48 s de registro do sinal de fundo, 100 μl de H2O2 a uma concentração de 1 mM foram adicionados à cubeta e o registro de CL continuou por 10 min. Quatro amostras foram preparadas com diferentes concentrações de cada um dos objetos vegetais. O CL também foi registrado para soluções de ácido ascórbico, quercetina e tocoferol em cinco concentrações diferentes para cada um dos antioxidantes. Posteriormente, o TAU das amostras de decocções e infusões foi recalculado para a quercetina.

atingiu um platô, que indicou a destruição completa dos antioxidantes no sistema. As diluições das amostras estudadas e as concentrações das soluções de antioxidantes padrão (indicadas nas legendas das figuras) foram selecionadas para que todas as curvas cinéticas do CL fossem medidas na mesma sensibilidade do instrumento.

A capacidade antioxidante foi calculada a partir da mudança na área (AS) sob a curva cinética de quimioluminescência (soma da luz) após a adição de uma substância contendo um antioxidante. Para isso, calculamos S0 para o sistema sem antioxidante e dele subtraímos a área SS, que caracteriza o sistema ao qual o antioxidante foi adicionado. O valor AS depende da sensibilidade do quimioluminômetro e das condições de medição. A razão AS/C ■ V (onde C é a concentração do material biológico estudado na cubeta, g/le V é o volume da cubeta, l) expressa a capacidade antioxidante de 1 g do material estudado, ou seja, , material vegetal.

A capacidade antioxidante ASa de uma solução de um antioxidante padrão, por exemplo, quercetina, colocada no mesmo volume da mistura reacional foi calculada de maneira semelhante. A razão AS/CÄ ■ V (onde CA é a concentração em peso do antioxidante na cubeta, g/l) expressa a capacidade antioxidante de 1 g do antioxidante.

Para cada um dos antioxidantes padrão, o sinal de soluções de várias concentrações foi registrado para garantir que os cálculos fossem realizados dentro dos limites de uma relação linear e os resultados obtidos fossem reprodutíveis. Com efeito, obteve-se uma dependência linear (ASa = kA ■ CA) do sinal na concentração, a partir da qual foi calculado o coeficiente estequiométrico kA. De acordo com o critério de Fisher, os valores de kA obtidos para antioxidantes padrão são estatisticamente significativos com probabilidade de 0,975. Em seguida, o sinal de quatro concentrações foi registrado para cada uma das quatro amostras de plantas, e para todas as amostras foi obtida uma dependência linear do sinal na concentração (AS = k ■ C), a partir do qual o coeficiente estequiométrico k foi calculado. Com uma probabilidade de 0,975 (teste de Fischer), os valores de k obtidos para amostras de plantas são estatisticamente significativos. A capacidade antioxidante total do material vegetal em termos do peso do antioxidante padrão (mg%) foi encontrada pela fórmula

OAU = k ■ 105. k

Os valores foram apresentados como média aritmética ± desvio padrão (M ± 5) em p<0,05.

RESULTADOS DO ESTUDO

O estudo da cinética de quimioluminescência na presença de ascorbato de sódio (Fig. 1) mostrou que este antioxidante é caracterizado por um período latente, quando o CL é quase completamente suprimido. Sua duração é proporcional à quantidade de antioxidante no sistema. Neste caso, nem a inclinação das curvas do CL nem a intensidade do CL no platô mudam. Isso é explicado pelo fato de que o ácido ascórbico é um forte antioxidante que intercepta todos os radicais formados no sistema, incluindo os radicais luminol, e o CL não se desenvolve até que todo o ascorbato seja oxidado.

A ação do tocoferol (Fig. 2) foi manifestada por uma diminuição da intensidade de CL em um platô, o que é típico para antioxidantes fracos, embora o tocoferol seja considerado um dos mais

poderosos antioxidantes. Talvez essa discrepância se deva ao fato de que em nosso experimento os radicais livres estavam em solução aquosa, enquanto o efeito do tocoferol é geralmente estudado em meios apolares. No trabalho , onde o complexo de citocromo c com cardiolipina serviu como fonte de radicais e a reação com luminol ocorreu dentro desse complexo, o tocoferol apresentou propriedades de antioxidante de força média.

Tendo estudado o efeito de várias concentrações de quercetina em nosso sistema (Fig. 3) e comparando as curvas cinéticas para ele e ascorbato de sódio e tocoferol, pode-se notar que o principal efeito da quercetina se manifesta em uma mudança na inclinação do curvas, ou seja, a taxa de desenvolvimento de CL, que é típica para antioxidantes moderados.

As curvas do CL para todas as decocções estudadas (Fig. 4) assemelham-se às curvas da quercetina com uma ligeira diminuição da intensidade do CL no final, ou seja, ao atingir

Tempo, min

Arroz. 1. Efeito do ascorbato de sódio na cinética de quimioluminescência

As concentrações dos componentes do sistema: luminol - 40 μM, peroxidase de rábano - 4 nM, peróxido de hidrogênio - 100 μM. Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,05 μM; 3 - 0,10 μM; 4 - 0,15 μM; 5 - 0,2 μM; 6 - 0,25 μM de ascorbato de sódio.

platô. Conforme mostrado no trabalho, esse comportamento é típico para antioxidantes de força média, que no nosso caso incluem polifenóis - flavonóides e taninos. Para uma infusão de frutas de framboesa (Fig. 4, D), é perceptível uma diminuição da quimioluminescência no nível do platô, o que é típico para antioxidantes fracos, que neste caso é o tocoferol. Em termos de quercetina e tocoferol, a infusão de framboesa contém 4,7 ± 0,9 µmol/g de quercetina e 11,9 ± 0,8 µmol/g de tocoferol.

Ao comparar as curvas de quimioluminescência obtidas para diferentes concentrações dos quatro extratos aquosos estudados de materiais vegetais, foi mostrado que a contribuição de antioxidantes médios e fracos para a capacidade antioxidante total das amostras diminuiu na seguinte ordem: infusão de framboesa (Fig. 4, D), decocção de frutos de rosa mosqueta (Fig. 4, C), uma decocção de frutos de rowan (Fig. 4, A), uma decocção de frutos de espinheiro (Fig. 4, B). Os valores de AS em termos da concentração C da substância estudada na cuvete e os valores da capacidade antioxidante total em termos de quercetina são mostrados na tabela.

A DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Os dados obtidos durante os experimentos e os valores de TAU dos objetos estudados calculados com base neles foram comparados com o conteúdo dos principais antioxidantes neles, determinados usando métodos químicos de análise. Apesar de ser inegável uma correlação positiva entre a quantidade total de antioxidantes e TAU em diferentes objetos, existem diferenças perceptíveis entre esses indicadores. Por exemplo, se tomarmos a soma do conteúdo de flavonóides, taninos e ácido ascórbico, acaba sendo mais do que o TAU calculado para todos os objetos estudados, exceto a decocção de frutos de espinheiro (tabela).

46 Tempo, min

Eu" "h chi----.

Arroz. 2. Efeito do tocoferol na cinética de quimioluminescência

As concentrações dos componentes do sistema: luminol - 40 μM, peroxidase de rábano - 4 nM, peróxido de hidrogênio - 100 μM. Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,01 μM; 3 - 0,025 μM; 4 - 0,06 μM; 5 - 0,1 μM; 6 - 0,2 μM de tocoferol.

46 Tempo, min

Arroz. Fig. 3. Efeito da quercetina na cinética de quimioluminescência Concentrações dos componentes do sistema: luminol - 40 μM, peroxidase de rábano - 4 nM, peróxido de hidrogênio - 100 μM. Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,02 μM; 3 - 0,03 μM; 4 - 0,04 μM; 5 - 0,05 μM; 6 - 0,06 μM de quercetina.

Tempo, min

46 Tempo, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Tempo, min

Arroz. Fig. 4. Influência de decocções de frutos de sorveira (A), espinheiro (B), rosa selvagem (C) e infusão de frutos de framboesa (D) na cinética de quimioluminescência. (A) Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l decocção de frutos de sorveira. (B) Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l decocção de frutos de espinheiro. (C) Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l decocção de rosa mosqueta. (D) Curvas: 1 - amostra controle; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l de infusão de framboesas.

no sistema peroxidase-luminol-peróxido de hidrogênio correlacionado com o teor de compostos de triterpeno. No entanto, no trabalho dos mesmos autores, em que outra planta foi objeto de estudo, não foi observada correlação entre TAU e o teor de qualquer grupo de substâncias, incluindo flavonóides.

Essas discrepâncias estão relacionadas a pelo menos três fatores. Primeiro, a atividade dos antioxidantes é importante, ou seja, a taxa de sua interação com os radicais, que é diferente para os diferentes antioxidantes que compõem a amostra da planta. De acordo com Izmailov, as constantes de velocidade das reações correspondentes para mexidol, tocoferol e quercetina estão relacionadas como 0,04: 2: 60. Em segundo lugar, cada molécula antioxidante, entrando em uma reação química, pode interceptar um número diferente de radicais. De acordo com o trabalho, a quercetina, os ácidos úrico e ascórbico interceptaram 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 e 0,5 ± 0,2 radicais por molécula antioxidante reagida, respectivamente (foi utilizado o sistema gemin-H202-luminol). Em terceiro lugar, os resultados do estudo podem ser influenciados pela presença de atividade da peroxidase nas próprias amostras de plantas, como no trabalho, bem como a presença de cálcio nas amostras, que, como mostrado no trabalho, é capaz de aumentar a atividade da peroxidase de rábano sob certas condições. Isso geralmente resulta em mais

maior intensidade de CL no platô do que nas curvas de controle, o que, no entanto, não observamos.

De importância ainda maior é o coeficiente estequiométrico do antioxidante. O número de radicais n interceptados por eles é igual a

onde p é o coeficiente estequiométrico e Am é a mudança na concentração de antioxidante durante a medição, no nosso caso, a concentração inicial da substância de teste na amostra de teste.

A diferença na soma luminosa da luminescência na ausência de um antioxidante e na sua presença é proporcional a n. O número total de radicais interceptados é n = Y.p. m,

onde é o coeficiente estequiométrico de um determinado antioxidante, e m é sua concentração durante a mudança

Objeto de estudo Flavonóides, mg%* Taninos, mg%* Ácido ascórbico, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. unidades OAU, mg% de quercetina

Decocção de frutos de sorveira 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Decocção de rosa mosqueta 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Decocção de frutos de espinheiro 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Infusão de framboesas secas 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Nota: * - dados da literatura, . AS - mudança na soma de luz para a amostra, rel. unidades, C - concentração da amostra na cuvete, g/l. Os valores calculados são confiáveis em p<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

rênio. O número total de radicais interceptados obviamente não é igual à quantidade total de antioxidantes, uma vez que os coeficientes pt não são apenas iguais à unidade, mas também diferem significativamente para diferentes antioxidantes.

O valor de n é proporcional à diferença nas somas de luz medidas ao longo de um certo tempo entre uma amostra contendo um antioxidante e uma amostra de controle sem antioxidantes:

onde k é um coeficiente que é constante nas mesmas condições de medição.

garantiu a oxidação de antioxidantes fortes (ácido ascórbico) e antioxidantes moderados (quercetina) em 10 min. Esta duração da medição é conveniente e garante a qualidade necessária das medições.

Literatura

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Radicais livres como participantes em processos regulatórios e patológicos. In: Grigoriev A. I., Vladimirov Yu. A., editores. Ciências fundamentais - medicina. Biophys. querida. tecnologia Moscou: MAKS Press; 2015. vol. 1. p. 38-71.

3. Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V. Métodos para o estudo de antioxidantes. Química raste. matérias-primas. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Batovska D. I., Trofimov A. V. Antioxidant activity of chalcones. Determinação quimioluminescente de reactividade e cálculo quântico-químico de energias e estruturas de reagentes e intermediários. Cinética e catálise. 2010; 51(4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil "ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

Quimioluminescência mediada por radicais: diversidade mecanicista e fundamentos para ensaio antioxidante. Arkivoc. 2007; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Avaliação da capacidade antirradical por quimioluminescência de luminol induzida por H2O2-hemina. J Agric Food Chem. 3 de dezembro de 2003; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Radicais livres e quimioluminescência celular. Sucessos biol. química 2009; 49:341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu. Quimiluminescência cinética como método para estudar reações de radicais livres. Biofísica. 2011; 56(6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Determinação da atividade antioxidante medindo a cinética de quimioluminescência. Fotobiologia e fotomedicina. 2011; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescência induzida por termólise de 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropano). Livre

Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Sobre o uso da extinção da luminescência do luminol para avaliar a atividade da SOD. Free Radic Biol Med. 1994 junho; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Avaliação do potencial antioxidante total (TRAP) e reatividade antioxidante total a partir de medições de quimioluminescência com luminol. Free Radic Biol Med. fevereiro de 1995; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Uma investigação do mecanismo da peroxidação luminescente do luminol por técnicas de fluxo interrompido. J Biol Chem. 25 de setembro de 1968; 243(18): 4706-14.

21. Alekseev A. V., Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Determinação de antioxidantes por quimioluminescência ativada usando 2,2'-azo-bis(2-amidinopropano). Boletim da Universidade Estadual de Moscou. Ser. 2. Khim. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Ministério da Saúde da Farmacopeia Estatal da URSS XI ed. Questão. 2 “Métodos gerais de análise. Materiais de plantas medicinais". M.: Medicina; 1987. pág. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Estudo de preparações de extrato de rosa mosqueta. Farmacia. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Estudo de frutos de espinheiro em várias formas de preservação e extração de água. Farmacia. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Substâncias biologicamente ativas de frutas e extratos de água de framboesa comum. Farmacia. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Estudo de substâncias biologicamente ativas de frutos de espinheiro - matérias-primas para a preparação de tinturas de matriz homeopática. No satélite. científico tr. Baseado em materiais do XXIV Mosk. internacional homeopata. conf. "Desenvolvimento do método homeopático na medicina moderna"; 24 a 25 de janeiro de 2014; Moscou. M.; 2014. pág. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Estudo da composição de substâncias biologicamente ativas em matérias-primas de plantas medicinais de vários métodos de preservação. No satélite. resumos baseados em XX Ross. nat. congr. "Homem e medicina"; 15 a 19 de abril de 2013; Moscou. Moscou: EkoOnis; 2013. pág. 184-90.

30. Alexandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Estudo da atividade da peroxidase em extratos de rizomas e raízes de rábano e sua estabilidade a várias influências. Vestn. Universidade Estadual de Moscou. Ser. 2. Química. 2006; 47(5):350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Livre radikaly kak uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. In: Grigor "ev AI, Vladimirov YuA, editores. Fundamental" nye nauki - meditsine. Biofizicheskie meditsinskie tekhnologii. Moscou: MAKS Press; 2015.v. 1. p. 38-71. Russo.

2. Chanda S, Dave R. Modelos in vitro para avaliação da atividade antioxidante e algumas plantas medicinais com propriedades antioxidantes: uma visão geral. Afr J Microbiol Res. dezembro de 2009; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel "nogo Syr" ja. 2004; (3): 63-75. Russo.

4. Vasil "ev RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii i stroeniya reagenteov i intermediatov. Cinética e catálise. 2010; 51(4): 533-41. Russo.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Potencial antioxidante de compostos relacionados à curcumina estudados por cinética de quimioluminescência, eficiência de quebra de cadeia, atividade de eliminação (ORAC) e cálculos de DFT. Beilstein J Org Chem. 11 de agosto de 2015; 11:1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasil'ev RF, Veprintsev TL. Quimioluminescência mediada por radicais peroxi: diversidade mecanicista e fundamentos para ensaio antioxidante. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasil'ev RF.Ensaio de quimioluminescência fácil para propriedades antioxidantes de lipídios vegetais: fundamentos e exemplos ilustrativos.Analista. 2009 Out; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert CR, Baader WJ. Avaliação da capacidade antirradicalar por luminol induzido por H2O2-hemina

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Livre radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49:341-88. Russo.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya como metodo izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. biofísica. 2011; 56(6): 1081-90. Russo.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Fotobiologiya e fotomeditsina. 2011; 7(2):70-6. Russo.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminol luminescência induzida por termólise de 2,2"-Azo-bis(2-amidinopropano). Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Sobre o uso da extinção da luminescência do luminol para avaliar a atividade da SOD. Free Radic Biol Med. 1994 junho; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Quimioluminescência visível associada à reação entre metemoglobina ou oxiemoglobina com peróxido de hidrogênio. Photochem Photobiol. novembro de 1994; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV, et al. Avaliação in vitro da atividade antioxidante de flavonóis lipossomais pelo sistema HRP-H2O2-luminol. J Microencapsul. 2011; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, Prichard PM. Uma investigação do mecanismo

da peroxidação luminescente de luminol por técnicas de fluxo interrompido. J Biol Chem. 25 de setembro de 1968; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Características fitoquímicas, atividades de eliminação de radicais livres e neuroproteção de cinco extratos de plantas medicinais. Complemento baseado em Evid Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 10 de agosto de 2011.

19. Chang CL, Lin CS. Composição fitoquímica, atividade antioxidante e efeito neuroprotetor de extratos de Terminalia chebula Retzius. Complemento baseado em Evid Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 5 de julho.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Avaliação da atividade antioxidante de diferentes flavonóides pelo método de quimioluminescência. AAPS PharmSci. 2003; 5(2):111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Boletim de Química da Universidade de Moscou. 2012; 53(3): 187-93. Russo.

22. Pogacnik L, Ulrih NP. Aplicação de ensaio de quimioluminescência otimizado para determinação da capacidade antioxidante de extratos vegetais. Luminescência. 2012 Nov-Dez; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Antioxidantes totais de baixo peso molecular como parâmetro de resumo, quantificados em amostras biológicas por um ensaio de inibição de quimioluminescência. Protocolo Nat. setembro de 2010; 5(10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11ª edição. Iss. 2. "Análise da metodologia Obshchie.

Lekarstvennoe rastitel "noe syr" e", Moscou: Medltsina, 1987, p. 147-8. Russo.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. Farmacia. 2012; (2): 14-6. Russo.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii i vodnykh izvlechenii. Farmácia. 2010; (5): 16-8. Russo.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov i vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmácia. 2014; (1): 8-10. Russo.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr "ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Anais da 14ª Conferência Homeopática Internacional de Moscou "Razvitie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi meditsine"; 2014 24-25 de janeiro; Moscou.

29. Sergunova EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr" e razlichnykh sposobov konservatsii. Anais do 20º Congresso Nacional Russo "Chelovek i lekarstvo"; 2013 abril 1519; Moscou. Moscou: EkoOnis; 2013. pág. 184-90. Russo.

30. Aleksandrova EYu, Orlova MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Boletim de Química da Universidade de Moscou. 2006; 47 (5): 350-2. Russo.

1 Milentiev V. N. 2Sannikov D. P. 3Kazmin V. M. 2

1 Instituto Estadual de Economia e Comércio de Oryol

2 Instituição do Orçamento do Estado Federal "Centro de Química e Radiologia Agrícola "Orlovsky"

3 Orçamento do Estado Federal Instituição de Ensino Superior Profissional "Universidade Estadual - Complexo Educacional, Científico e Industrial"

Foi estudada a possibilidade de usar a quimioluminescência para avaliar a atividade antioxidante de substâncias alimentares. O método proposto baseia-se na quimioluminescência do luminol em meio alcalino, cuja intensidade depende da quantidade de peróxidos na amostra quimioluminescente. A quimioluminescência foi registrada usando uma configuração desenvolvida contendo uma bomba de dosagem, uma câmara à prova de luz, um tubo fotomultiplicador a vácuo de vidro e um sistema de computador. Para aumentar a quimioluminescência, uma solução de ferricianeto de potássio foi adicionada ao luminol. As mudanças na intensidade da quimioluminescência foram registradas no momento da introdução da amostra analisada na solução de luminol. O extrato de dente-de-leão obtido por destilação seca a baixa temperatura foi usado como amostra analisada. Contém compostos fenólicos conhecidos por sua alta atividade antioxidante. Foi estabelecido que o método de quimioluminescência pode ser usado para determinar as propriedades antioxidantes de vários compostos alimentares.

quimioluminescência

atividade antioxidante

peróxidos

nutrientes

1. Vasiliev R.F. Brilho químico // Química e químicos, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (data de acesso: 22.08.13).

2. Vladimirov Yu.A. Radicais livres e antioxidantes // Vestn. RAMN. - 1998. - Nº 7. - P. 43-51.

3. Kondrashova E.A. Quimioluminescência como método mais sensível de imunoensaio enzimático e sua aplicação Diagnóstico laboratorial clínico. - 1999. - Nº 9. - P. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Análise quimioluminescente // Imunologia. - 1991. - No. 1. - P. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Quimioluminescência reativa no sistema de fagocitose // Microbiologia. - 1987. - No. 1. - S. 109-115.

6. Sherstnev M.P. Vias de geração de quimioluminescência celular dependentes e independentes de cálcio. - 1991. - No. 2. - S. 1–4.

Hoje, a quimioluminescência é uma grande área da ciência localizada na interface entre química, física e biologia. Com a quimioluminescência, há uma conversão direta de energia química em energia de oscilações eletromagnéticas, ou seja, no mundo. Usando a quimioluminescência, pode-se aprender como a reação ocorre, qual é o seu mecanismo, o que é necessário para a condução eficiente e racional dos processos tecnológicos. Se o processo tecnológico de obtenção de qualquer produto químico for acompanhado por quimioluminescência, sua intensidade pode servir como medida da velocidade do processo: quanto mais rápida a reação, mais brilhante o brilho. Durante a reação de quimioluminescência, são obtidos produtos ricos em energia, que então liberam energia emitindo luz, ou seja, a energia química é convertida em energia de radiação eletromagnética.

O objetivo do estudo foi explorar a possibilidade de usar a quimioluminescência para avaliar a atividade antioxidante de substâncias alimentares.

Resultados da pesquisa e discussão

O problema de avaliar a atividade antioxidante de substâncias alimentares é muito relevante. O uso do termo "atividade antioxidante" para mostrar a utilidade de um determinado produto é muitas vezes feito sem qualquer argumento químico e bioquímico. Como regra, a atividade antioxidante de qualquer substância refere-se à eficácia de reduzir o valor de peróxido. O próprio conceito de valor de peróxido também não revela totalmente sua essência química, pois não corresponde totalmente à cinética e termodinâmica das etapas do metabolismo de um determinado produto alimentício. Além disso, esse valor é usado para caracterizar os lipídios na forma de gorduras. No entanto, os processos de oxidação e formação de peróxidos no organismo ocorrem não apenas com o uso de gorduras, mas também com outros produtos. Em outras palavras, pode-se dizer que o teor de peróxido em um determinado produto é “pesado” em uma espécie de balança, onde o “peso de referência” é uma unidade de concentração em um ambiente ácido de um íon iodeto oxidado por peróxidos, como um resultado do qual o iodo molecular é formado:

I- - e → I; (1)

I + I → I20. (2)

Quando o iodo molecular é titulado com uma solução contendo tiossulfato de sódio, sua concentração é estabelecida e, consequentemente, a quantidade de oxidantes de íons iodeto é determinada, ou seja, compostos de peróxido, que na verdade é chamado de número de peróxido. A determinação do valor de peróxido usando este tipo de "pesagem" é baseada na reação mostrada na fig. 1.

Arroz. 1. Determinação do valor de peróxido usando tiossulfato de sódio

Assim, a concentração de peróxidos é determinada a partir da equação

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

onde ϒ é o coeficiente de correlação entre a concentração de iodo molecular e a concentração de peróxidos.

O método proposto para determinação de peróxidos em produtos é baseado na quimioluminescência do luminol (C[lm]) em meio alcalino, cuja intensidade (Ichl) depende da concentração de peróxidos (C[-O-O-]), em um amostra quimioluminescente:

DIH. = Ϧchl ω, (4)

onde Ϧchl é o rendimento quântico de quimioluminescência; ω - taxa de reação envolvendo peróxidos:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

onde kchl é a constante de velocidade de reação ou em:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

A quantidade de peróxidos (-O-O-) é determinada pela soma de luz (S):

O valor de S depende do grau de completude do consumo de peróxido na reação quimioluminescente.

Para determinar a constante K, uma curva de calibração é construída para a dependência da soma luminosa S da concentração de peróxido, que é determinada por titulação:

S = f(C[-O-O-]). (9)

O peróxido de hidrogênio H2O2 é usado como peróxidos.

Em seguida, os dados obtidos da equação (3) e (9) são comparados. Com base na comparação de ϒ e K, conclui-se sobre a concordância dos mecanismos de reação subjacentes à determinação de peróxidos por esses métodos. Verificou-se que nesta faixa de concentrações de peróxido ϒ e K realmente concordam entre si e, portanto, podem ser usados para determinar o valor de peróxido.

A quimioluminescência foi observada em meio alcalino contendo luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1,4-ftalazinodiona, hidrazida 3-aminoftálica, H2L). Foi registrado usando uma configuração quimioluminescente, incluindo um fotomultiplicador a vácuo de vidro. O fotomultiplicador é alimentado por um retificador de alta tensão (7) acoplado a um bloco (9) que amplifica o sinal do fotomultiplicador, que é registrado no monitor do computador (5).

Arroz. 2. Registro de quimioluminescência do produto analisado: 1 - bomba dosadora; 2 - câmara à prova de luz; 3 - espelho; 4 - cubeta; 5 - sistema informático; 6 - fotomultiplicador; 7 - retificador de alta tensão; 8 - um dispositivo que permite determinar a região espectral da radiação quimioluminescente; 9 - bloco amplificando o sinal do fotomultiplicador

É necessária uma bomba doseadora (1) para introduzir a amostra analisada numa cuvete (4) contendo uma solução quimioluminescente de luminol. Este dispensador atua como um agitador para a amostra injetada com uma solução quimioluminescente. Para aumentar a taxa de reação e a intensidade da quimioluminescência, uma solução de ferricianeto de potássio foi adicionada ao luminol. A mistura é realizada por bolhas de ar obtidas pelo bombeamento de ar através do líquido da solução com uma bomba. O espelho (3) localizado na câmara opaca (2) serve para melhor captação da luz da radiação quimioluminescente incidente no fotocátodo do fotomultiplicador (6) montado na câmara opaca. O dispensador permite inserir os componentes desejados do líquido na cubeta sem abrir a câmara à prova de luz (2) durante os experimentos. Neste caso, estes líquidos entram na cuvete (4) através de tubos de vidro ou plástico. O sistema computacional permite registrar a dependência da intensidade de luminescência I no tempo t, ou seja, a cinética de quimioluminescência:

O sistema computacional reflete as constantes de subida e descida na função I = f(t), que são conjugadas com as constantes de velocidade das reações que causam a quimioluminescência, ou seja, com sua cinética. Um dispositivo (8) está incluído na câmara quimioluminescente, que permite determinar a região espectral da radiação quimioluminescente, ou seja, a dependência:

I = f1(λ). (onze)

Este bloco é um cassete na forma de um disco, no qual são montados filtros de limite. A troca dos filtros de luz é realizada girando o cassete do disco em torno do eixo horizontal que conecta os centros do plano dos filtros de luz e o plano do fotocátodo do fotomultiplicador.

O processo de medição é realizado da seguinte forma:

1. A resposta do fotomultiplicador às mudanças na tensão de alimentação e às mudanças na intensidade da fonte de luz de referência que incide em seu cátodo é definida.

2. A cubeta é preenchida com uma solução de luminol em meio alcalino.

3. O dispensador é preenchido com a amostra analisada.

4. A dependência da intensidade de quimioluminescência no tempo t é registrada. A quimioluminescência é monitorizada até o tempo t1, no qual a mudança em I1 a partir do tempo t é mínima: I1 = f1(t).

5. Uma porção da solução analisada é alimentada usando um dispensador.

6. Observa-se a quimioluminescência da amostra analisada, cuja cinética é I = f(t).

Na fig. A Figura 3 mostra um gráfico da dependência das funções (I1 = f1(t)), conjugado com um gráfico (I = f(t)), após a introdução da solução analisada.

Como pode ser visto a partir da fig. 3, a intensidade da quimioluminescência do luminol muda: um aumento acentuado é seguido por uma diminuição acentuada da luminescência após a adição da amostra analisada.

Uma vez que o aumento da quimioluminescência durante a oxidação do luminol está associado à formação de peróxidos, a diminuição da intensidade da quimioluminescência após a introdução da amostra analisada indica uma diminuição do seu número. Portanto, podemos falar sobre a presença de atividade antioxidante nos compostos que compõem a amostra analisada.

Ressalta-se que o extrato de dente-de-leão obtido por destilação seca a baixa temperatura, que contém compostos fenólicos conhecidos por sua alta atividade antioxidante, foi utilizado como amostra analisada.

Arroz. Fig. 3. Gráfico de dependência de funções (I1 = f1(t)), conjugado com o gráfico (I = f(t)), após a introdução da solução analisada

Além disso, durante o experimento verificou-se que por meio da quimioluminescência é possível determinar a quantidade de peróxidos em sistemas superdiluídos, o que é importante para avaliar o início da oxidação dos produtos, por exemplo, durante o armazenamento.

Assim, os estudos realizados mostraram que o método de determinação de peróxidos em produtos, baseado na quimioluminescência do luminol em meio alcalino, possibilita avaliar a atividade antioxidante de substâncias alimentares e pode ser utilizado para estabelecer as propriedades antioxidantes de diversos alimentos. compostos.

Revisores:

Litvinova E.V., Doutor em Ciências Técnicas, Professor do Departamento de Tecnologia, Organização e Higiene Alimentar, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., Doutor em Ciências Biológicas, Diretor de INITs, FSBEI HPE "Oryol State Agrarian University", Orel.

O trabalho foi recebido pelos editores em 08 de novembro de 2013.

Link bibliográfico

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. USO DA QUIMILUMINESCÊNCIA PARA AVALIAR AS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES DOS ALIMENTOS // Pesquisa Fundamental. - 2013. - Nº 10-11. – S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (data de acesso: 17/12/2019). Chamamos a sua atenção as revistas publicadas pela editora "Academia de História Natural"

Portal para o aluno. Autotreinamento

1.4 Métodos de pesquisa para antioxidantes

anotação artigo científico em ciências químicas, autor de artigo científico - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Tópicos relacionados artigos científicos em ciências químicas, autor de artigo científico - Georgy Konstantinovich Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Determinação quimioluminescente da capacidade antioxidante total em material vegetal medicinal.

O texto do trabalho científico sobre o tema "Método quimioluminescente para determinação da capacidade antioxidante total em materiais de plantas medicinais"

Link bibliográfico

ARTIGOS RELACIONADOS