MICROSCOAPE CU SONDA DE SCANARE: TIPURI ȘI PRINCIPIUL DE FUNCȚIONARE

Kuvaytsev Alexander Viaceslavovich
Institutul de Inginerie și Tehnologie Dimitrovgrad Filiala a Universității Naționale de Cercetare Nucleară „MEPhI”
student

adnotare
Acest articol descrie principiul de funcționare al unui microscop cu sondă. Aceasta este o tehnologie fundamental nouă, care poate rezolva probleme în domenii atât de diverse precum comunicațiile, biotehnologia, microelectronica și energia. Nanotehnologia în microscopie va reduce semnificativ consumul de resurse și nu va pune presiune asupra mediului, acestea vor juca un rol principal în viața omenirii, deoarece, de exemplu, computerul a devenit o parte integrantă a vieții oamenilor.

MICROSCOPIE SONDE DE SCANARE: TIPURI ȘI PRINCIPII DE OPERARE

Kuvaytsev Aleksandr Viaceslavovici
Institutul de Inginerie și Tehnologie Dimitrovgrad al Universității Naționale de Cercetare Nucleară MEPHI
student

Abstract
Acest articol descrie principiul unui microscop cu sondă. Este o nouă tehnologie care poate rezolva probleme în domenii atât de diverse precum comunicațiile, biotehnologia, microelectronica și energia. Nanotehnologia în microscopie va reduce semnificativ consumul de resurse și nu va pune presiune asupra mediului, acestea vor juca un rol principal în viața umană, deoarece, de exemplu, computerul a devenit o parte integrantă a vieții oamenilor.

În secolul al XXI-lea, nanotehnologiile câștigă rapid popularitate, care pătrund în toate sferele vieții noastre, dar nu ar exista progrese în ele fără metode noi, experimentale de cercetare, una dintre cele mai informative este metoda de scanare cu sonde de microscopie, care a fost inventat si distribuit de laureatii Nobel in 1986 - Prof. Heinrich Rohrer si Dr. Gerd Binnig.

O adevărată revoluție a avut loc în lume odată cu apariția metodelor de vizualizare a atomilor. Au început să apară grupuri de entuziaști care își proiectau propriile dispozitive. Ca urmare, au fost obținute câteva soluții de succes pentru vizualizarea rezultatelor interacțiunii sondei cu suprafața. Au fost create tehnologii pentru producerea de sonde cu parametrii necesari.

Deci, ce este un microscop cu sondă? În primul rând, aceasta este sonda în sine, care examinează suprafața eșantionului; este, de asemenea, necesar un sistem de deplasare a sondei în raport cu eșantionul în reprezentare bidimensională sau tridimensională (se mișcă de-a lungul coordonatelor X-Y sau X-Y-Z). Toate acestea sunt completate de un sistem de înregistrare care fixează valoarea unei funcții care depinde de distanța de la sondă la probă. Sistemul de înregistrare fixează și reține valoarea uneia dintre coordonate.

Principalele tipuri de microscoape cu sondă de scanare pot fi împărțite în 3 grupuri:

1. Microscop cu scanare tunel - conceput pentru a măsura relieful suprafețelor conductoare cu rezoluție spațială mare.
   În STM, un ac metalic ascuțit este trecut peste probă la o distanță foarte mică. Când un curent mic este aplicat acului, între acesta și probă ia naștere un curent de tunel, a cărui valoare este înregistrată de sistemul de înregistrare. Acul este trecut pe întreaga suprafață a probei și surprinde cea mai mică modificare a curentului tunelului, datorită căreia iese o hartă în relief a suprafeței probei. STM este primul dintr-o clasă de microscoape cu sondă de scanare, restul au fost dezvoltate mai târziu.
2. Microscop cu forță atomică de scanare - folosit pentru a construi structura de suprafață a probei cu o rezoluție de până la atomică. Spre deosebire de STM, acest microscop poate fi folosit pentru a examina atât suprafețele conductoare, cât și cele neconductoare. Datorită capacității nu numai de a scana, ci și de a manipula atomii, se numește putere.
3. Un microscop optic în câmp apropiat este un microscop optic „avansat” care oferă o rezoluție mai bună decât un microscop optic convențional. O creștere a rezoluției BOM a fost obținută prin captarea luminii de la obiectul studiat la distanțe mai mici decât lungimea de undă. Dacă sonda microscopului este echipată cu un dispozitiv pentru scanarea câmpului spațial, atunci un astfel de microscop se numește microscop optic de scanare al câmpului apropiat. Un astfel de microscop face posibilă obținerea de imagini ale suprafețelor cu rezoluție foarte mare.

Imaginea (Fig. 1) prezintă cea mai simplă schemă a microscopului cu sondă.

Figura 1. - Schema de funcționare a unui microscop cu sondă

Funcționarea sa se bazează pe interacțiunea suprafeței probei cu o sondă, aceasta poate fi un cantilever, un ac sau o sondă optică. Cu o distanță mică între sondă și obiectul de studiu, acțiunile forțelor de interacțiune, cum ar fi repulsie, atracție etc., și manifestarea efectelor, cum ar fi tunelul de electroni, pot fi înregistrate folosind instrumente de înregistrare. Pentru detectarea acestor forțe se folosesc senzori foarte sensibili care pot detecta cele mai mici modificări. Tuburile piezo sau scanerele plan-paralele sunt folosite ca sistem de scanare a coordonatelor pentru a obține o imagine raster.

Principalele dificultăți tehnice în crearea microscoapelor cu sondă de scanare includ:

1. Asigurarea integritatii mecanice
2. Detectoarele trebuie să aibă sensibilitate maximă
3. Capătul sondei trebuie să aibă o dimensiune minimă
4. Creați un sistem de măturare
5. Asigurarea netezirii sondei

Aproape întotdeauna, imaginea obținută de un microscop cu sondă de scanare este greu de descifrat din cauza distorsiunilor în obținerea rezultatelor. De regulă, este necesară o prelucrare matematică suplimentară. Pentru aceasta se folosește software specializat.

În prezent, sonda de scanare și microscopia electronică sunt utilizate ca metode de cercetare complementare datorită unui număr de caracteristici fizice și tehnice. În ultimii ani, utilizarea microscopiei cu sonde a făcut posibilă obținerea de cercetări științifice unice în domeniile fizicii, chimiei și biologiei. Primele microscoape au fost doar dispozitive - indicatori care au ajutat în cercetare, iar mostrele moderne sunt stații de lucru cu drepturi depline, care includ până la 50 de metode de cercetare diferite.

Sarcina principală a acestei tehnici avansate este obținerea de rezultate științifice, dar aplicarea capacităților acestor dispozitive în practică necesită calificări înalte din partea unui specialist.

7. Aplicarea unui microscop cu sondă de scanare pentru studiul obiectelor biologice

7. Aplicarea unui microscop cu sondă de scanare pentru studiul obiectelor biologice 1

7.1. Obiectivele muncii 2

7.2. Informații pentru profesor 3

7.4. Ghid 31

7.5. Siguranța 32

7.6. Sarcina 32

7.7. Întrebări de securitate 32

7.8. Literatura 32

Lucrările de laborator au fost dezvoltate de Universitatea de Stat din Nijni Novgorod. N.I. Lobaciovski

7.1 Obiectivele lucrării

Studiul parametrilor morfologici ai structurilor biologice este o sarcină importantă pentru biologi, deoarece dimensiunea și forma unor structuri determină în mare măsură proprietățile lor fiziologice. Comparând datele morfologice cu caracteristicile funcționale, se pot obține informații complete despre participarea celulelor vii la menținerea echilibrului fiziologic al corpului uman sau animal.

Anterior, biologii și medicii aveau ocazia să-și studieze preparatele doar la microscoape optice și electronice. Aceste studii au oferit o imagine a morfologiei celulelor fixate, colorate și cu acoperiri metalice subțiri obținute prin pulverizare. Nu a fost posibil să se studieze morfologia obiectelor vii, modificările acesteia sub influența diverșilor factori, dar a fost foarte tentant.

Microscopia cu sondă de scanare (SPM) a deschis noi posibilități în studiul celulelor, bacteriilor, moleculelor biologice, ADN-ului în condiții cât mai apropiate de cele native. SPM vă permite să studiați obiecte biologice fără fixatori și coloranți speciali, în aer sau chiar într-un mediu lichid.

În prezent, SPM este utilizat într-o mare varietate de discipline, atât în ​​cercetarea științifică fundamentală, cât și în dezvoltările aplicate de înaltă tehnologie. Multe institute de cercetare din țară sunt echipate cu echipamente de microscopie cu sondă. În acest sens, cererea de specialiști cu înaltă calificare este în continuă creștere. Pentru a îndeplini această cerință, NT-MDT (Zelenograd, Rusia) a dezvoltat un laborator educațional și științific specializat pentru microscopia cu sonde de scanare Nanoeducator.

SPM NanoEducator special conceput pentru ca studenții să efectueze lucrări de laborator. Acest dispozitiv se adresează unui public studențesc: este controlat în totalitate de un computer, are o interfață simplă și intuitivă, suport pentru animație, implică dezvoltarea treptată a tehnicilor, absența setărilor complexe și consumabilelor ieftine.

În această lucrare de laborator, veți învăța despre microscopia cu sonde de scanare, vă veți familiariza cu elementele de bază ale acesteia, veți studia proiectarea și principiile educaționale. SPM NanoEducator, aflați cum să pregătiți preparatele biologice pentru cercetare, obțineți prima imagine SPM a unui complex de bacterii lactice și aflați elementele de bază ale procesării și prezentării rezultatelor măsurătorilor.

7.2 Informații pentru profesor 1

Lucrările de laborator se desfășoară în mai multe etape:

1. Pregătirea probei se face de fiecare elev în mod individual.

2. Obținerea primei imagini se realizează pe un dispozitiv sub supravegherea unui profesor, apoi fiecare elev își examinează eșantionul în mod independent.

3. Prelucrarea datelor experimentale de către fiecare elev se realizează individual.

Eșantion pentru cercetare: bacterii de acid lactic pe o lamă.

Înainte de a începe lucrul, este necesar să selectați o sondă cu cea mai caracteristică caracteristică amplitudine-frecvență (un singur maxim simetric), pentru a obține o imagine a suprafeței probei studiate.

Raportul de laborator trebuie să includă:

1. partea teoretică (răspunsuri la întrebările de control).

2. rezultatele părții experimentale (descrierea cercetării, rezultatele obținute și concluziile trase).

1. Metode de studiere a morfologiei obiectelor biologice.

2. Microscop cu sondă de scanare:

proiectare SPM;

soiuri de SPM: STM, AFM;

Format de date SPM, vizualizarea datelor SPM.

3. Pregătirea probelor pentru studiile SPM:

morfologia și structura celulelor bacteriene;

pregătirea preparatelor pentru studiul morfologiei folosind SPM.

4. Cunoașterea programului de proiectare și control al SPM NanoEducator.

5. Obținerea unei imagini SPM.

6. Prelucrarea și analiza imaginilor primite. Caracterizarea cantitativă a imaginilor SPM.

Metode de studiere a morfologiei obiectelor biologice

Diametrul caracteristic al celulelor este de 10  20 µm, bacterii - de la 0,5 la 3  5 µm, aceste valori sunt de 5 ori mai mici decât cea mai mică particulă vizibilă cu ochiul liber. Prin urmare, primul studiu al celulelor a devenit posibil abia după apariția microscoapelor optice. La sfârşitul secolului al XVII-lea. Antonio van Leeuwenhoek a realizat primul microscop optic, înainte de asta oamenii nu bănuiau existența microbilor și bacteriilor patogeni [Ref. 7 -1].

microscopie optică

Dificultățile în studierea celulelor se datorează faptului că acestea sunt incolore și transparente, astfel încât descoperirea structurilor lor de bază a avut loc abia după introducerea coloranților în practică. Coloranții au oferit un contrast suficient de imagine. Folosind un microscop optic, se pot distinge obiectele care sunt la 0,2 µm unul de celălalt, adică Cele mai mici obiecte care pot fi încă distinse la un microscop optic sunt bacteriile și mitocondriile. Imaginile elementelor celulare mai mici sunt distorsionate de efectele cauzate de natura ondulatorie a luminii.

Pentru a pregăti preparate de lungă durată, celulele sunt tratate cu un agent de fixare pentru a le imobiliza și conserva. În plus, fixarea crește accesibilitatea celulelor la coloranți, deoarece. macromoleculele celulare sunt ținute împreună prin legături încrucișate, care le stabilizează și le fixează într-o anumită poziție. Cel mai adesea, aldehidele și alcoolii acționează ca fixatori (de exemplu, glutaraldehida sau formaldehida formează legături covalente cu grupări amino libere ale proteinelor și reticulă moleculele învecinate). După fixare, țesutul este de obicei tăiat cu un microtom în secțiuni foarte subțiri (1 până la 10 µm grosime), care sunt apoi plasate pe o lamă de sticlă. Cu această metodă de preparare, structura celulelor sau macromoleculelor poate fi deteriorată, astfel încât congelarea rapidă este metoda preferată. Țesutul congelat este tăiat cu un microtom plasat într-o cameră rece. După secționare, celulele sunt colorate. Practic, coloranții organici sunt folosiți în acest scop (verde malachit, Sudan negru etc.). Fiecare dintre ele se caracterizează printr-o anumită afinitate pentru componentele celulare, de exemplu, hematoxilina are o afinitate pentru moleculele încărcate negativ, prin urmare, face posibilă detectarea ADN-ului în celule. Dacă una sau alta moleculă este prezentă în celulă într-o cantitate mică, atunci este cel mai convenabil să utilizați microscopia cu fluorescență.

Microscopia cu fluorescență

Coloranții fluorescenți absorb lumina de o lungime de undă și emit lumină de altă lungime de undă, mai mare. Dacă o astfel de substanță este iradiată cu lumină a cărei lungime de undă coincide cu lungimea de undă a luminii absorbite de colorant și apoi se folosește pentru analiză un filtru care transmite lumină cu o lungime de undă corespunzătoare luminii emise de colorant, molecula fluorescentă poate fi detectat prin strălucirea într-un câmp întunecat. Intensitatea ridicată a luminii emise este o trăsătură caracteristică a unor astfel de molecule. Utilizarea coloranților fluorescenți pentru colorarea celulelor implică utilizarea unui microscop fluorescent special.Un astfel de microscop este similar cu unul optic convențional, dar lumina de la un iluminator puternic trece prin două seturi de filtre - unul pentru a opri o parte din radiația iluminatorului. în fața probei și celălalt pentru a filtra lumina primită de la eșantion. Primul filtru este ales în așa fel încât să transmită doar lumină de lungimea de undă care excită un anumit colorant fluorescent; în același timp, cel de-al doilea filtru blochează această lumină incidentă și permite lumina cu lungimea de undă emisă de colorant atunci când este fluorescent.

Microscopia cu fluorescență este adesea folosită pentru a identifica proteine ​​specifice sau alte molecule care devin fluorescente după ce sunt legate covalent de coloranți fluorescenți. În acest scop, se folosesc de obicei doi coloranți - fluoresceina, care dă o fluorescență galben-verzuie intensă după excitarea cu lumină albastră deschisă și rodamină, provocând fluorescență roșu închis după excitarea cu lumină galben-verde. Folosind atât fluoresceină, cât și rodamină pentru colorare, se poate obține distribuția diferitelor molecule.

Microscopie în câmp întunecat

Cel mai simplu mod de a vedea detaliile structurii celulare este de a observa lumina împrăștiată de diferitele componente ale celulei. Într-un microscop cu câmp întunecat, razele de la iluminator sunt direcționate din lateral și doar razele împrăștiate intră în obiectivul microscopului. În consecință, celula arată ca un obiect iluminat într-un câmp întunecat. Unul dintre principalele avantaje ale microscopiei în câmp întunecat este capacitatea de a observa mișcarea celulelor în timpul diviziunii și migrării. Mișcările celulare tind să fie foarte lente și greu de observat în timp real. În acest caz, se utilizează microfilmarea cadru cu cadru (time-lapse) sau înregistrarea video. În acest caz, cadrele consecutive sunt separate în timp, dar când înregistrarea este redată la viteză normală, imaginea evenimentelor reale se accelerează.

În ultimii ani, camerele video și tehnologiile de imagistică aferente au crescut foarte mult capacitățile microscopiei optice. Datorită aplicării lor, a fost posibilă depășirea dificultăților cauzate de particularitățile fiziologiei umane. Ei sunt ca:

1. În condiții normale, ochiul nu înregistrează o lumină foarte slabă.

2. Ochiul nu poate detecta mici diferențe de intensitate a luminii pe un fundal luminos.

Prima dintre aceste probleme a fost depășită prin atașarea la microscop a camerelor video cu sensibilitate ultra-înaltă. Acest lucru a făcut posibilă observarea celulelor pentru o lungă perioadă de timp la iluminare scăzută, excluzând expunerea prelungită la lumină puternică. Sistemele de imagistică sunt deosebit de importante pentru studiul moleculelor fluorescente din celulele vii. Deoarece imaginea este produsă de o cameră video sub formă de semnale electronice, aceasta poate fi convertită în mod corespunzător în semnale numerice, trimisă la un computer și apoi supusă unei procesări suplimentare pentru a extrage informații ascunse.

Contrastul ridicat care poate fi realizat cu microscopia de interferență computerizată face posibilă observarea chiar și a obiectelor foarte mici, cum ar fi microtubuli individuali, al căror diametru este mai mic de o zecime din lungimea de undă a luminii (0,025 µm). Microtubulii individuali pot fi observați și folosind microscopia cu fluorescență. Cu toate acestea, în ambele cazuri, efectele de difracție sunt inevitabile, care modifică puternic imaginea. În acest caz, diametrul microtubulilor este supraestimat (0,2 μm), ceea ce face imposibilă distingerea microtubulilor individuali de un mănunchi de mai mulți microtubuli. Pentru a rezolva această problemă, este nevoie de un microscop electronic, a cărui limită de rezoluție este deplasată cu mult dincolo de lungimea de undă a luminii vizibile.

microscopia electronică

Relația dintre lungimea de undă și limita de rezoluție este păstrată și pentru electroni. Cu toate acestea, pentru un microscop electronic, limita de rezoluție este mult mai mică decât limita de difracție. Lungimea de undă a unui electron scade pe măsură ce viteza acestuia crește. Într-un microscop electronic cu o tensiune de 100.000 V, lungimea de undă a unui electron este de 0,004 nm. Conform teoriei, rezoluția unui astfel de microscop este de 0,002 nm în limită. Cu toate acestea, în realitate, datorită deschiderilor numerice mici ale lentilelor electronice, rezoluția microscoapelor electronice moderne este în cel mai bun caz de 0,1 nm. Dificultățile în pregătirea probei și deteriorarea acesteia de către radiații reduc semnificativ rezoluția normală, care pentru obiectele biologice este de 2 nm (de aproximativ 100 de ori mai mare decât cea a unui microscop cu lumină).

Sursa de electroni în microscop electronic cu transmisie (TEM) este un filament catodic situat în vârful unei coloane cilindrice înalte de aproximativ doi metri. Pentru a evita împrăștierea electronilor în timpul coliziunilor cu moleculele de aer, se creează un vid în coloană. Electronii emiși de filamentul catodic sunt accelerați de un anod din apropiere și intră printr-o gaură minusculă, formând un fascicul de electroni care trece în partea de jos a coloanei. De-a lungul coloanei, la o anumită distanță, sunt magneți inel care concentrează fasciculul de electroni, precum lentilele de sticlă care focalizează fasciculul de lumină într-un microscop optic. Proba este plasată prin ecluza din interiorul coloanei, pe calea fasciculului de electroni. O parte din electroni în momentul trecerii prin eșantion este împrăștiată în conformitate cu densitatea substanței în această zonă, restul electronilor este focalizat și formează o imagine (similar cu formarea unei imagini într-un microscop optic) pe o placă fotografică sau pe un ecran fosforescent.

Unul dintre cele mai mari dezavantaje ale microscopiei electronice este că probele biologice trebuie supuse unei procesări speciale. Mai întâi, se fixează mai întâi cu glutaraldehidă și apoi cu acid osmic, care leagă și stabilizează stratul dublu de lipide și proteine. În al doilea rând, electronii au o putere de penetrare scăzută, așa că trebuie să faci secțiuni ultra-subțiri, iar pentru aceasta probele sunt deshidratate și impregnate cu rășini. În al treilea rând, pentru a spori contrastul, probele sunt tratate cu săruri ale metalelor grele precum osmiul, uraniul și plumbul.

Pentru a obține o imagine tridimensională a suprafeței se folosește microscop electronic cu scanare (SEM), unde se folosesc electroni care sunt împrăștiați sau emiși de suprafața probei. Proba în acest caz este fixată, uscată și acoperită cu o peliculă subțire de metal greu și apoi scanată cu un fascicul de electroni îngust. În acest caz, se estimează numărul de electroni împrăștiați în timpul iradierii la suprafață. Valoarea obținută este folosită pentru a controla intensitatea celui de-al doilea fascicul, deplasându-se sincron cu primul și formând o imagine pe ecranul monitorului. Rezoluția metodei este de aproximativ 10 nm și nu este aplicabilă studiului organitelor intracelulare. Grosimea probelor studiate prin această metodă este determinată de puterea de penetrare a electronilor sau de energia lor.

Principalele și semnificative dezavantaje ale tuturor acestor metode sunt durata, complexitatea și costul ridicat al pregătirii probelor.

Microscopie cu sondă de scanare

Într-un microscop cu sondă de scanare (SPM), în loc de un fascicul de electroni sau de radiație optică, se folosește o sondă ascuțită, un ac, care scanează suprafața probei. Figurat vorbind, putem spune că dacă o probă este examinată la microscop optic sau electronic, atunci se simte în SPM. Ca rezultat, este posibil să se obțină imagini tridimensionale ale obiectelor în diferite medii: vid, aer, lichid.

Proiectele speciale ale SPM adaptate pentru cercetarea biologică fac posibilă, simultan cu observația optică, scanarea atât a celulelor vii în medii lichide diferite, cât și a preparatelor fixe în aer.

Microscop cu sondă de scanare

Numele microscopului cu sondă de scanare reflectă principiul funcționării acestuia - scanarea suprafeței probei, în care se realizează citirea punct cu punct a gradului de interacțiune dintre sondă și suprafață. Mărimea zonei de scanare și numărul de puncte din ea N X N Y pot fi setate. Cu cât specificați mai multe puncte, cu atât rezoluția imaginii de suprafață este mai mare. Distanța dintre punctele de citire a semnalului se numește pas de scanare. Etapa de scanare ar trebui să fie mai mică decât detaliile suprafeței studiate. Mișcarea sondei în timpul scanării (vezi Fig. 7-1) se efectuează liniar în direcția înainte și înapoi (în direcția scanării rapide), trecerea la următoarea linie se efectuează în direcția perpendiculară (în direcția direcția de scanare lentă).

Orez. 7 1. Reprezentarea schematică a procesului de scanare
(citirea semnalului se realizează pe cursul direct al scanerului)

În funcție de natura semnalului citit, microscoapele de scanare au nume și scopuri diferite:

microscop de forță atomică (AFM), se citesc forțele interacțiunii interatomice dintre atomii sondei și atomii probei;

microscop de tunel (STM), citirea curentului de tunel care curge între proba conductivă și sonda conductivă;

microscopul cu forță magnetică (MFM), se citesc forțele de interacțiune dintre sonda acoperită cu material magnetic și proba de detectare a proprietăților magnetice;

Microscopul cu forță electrostatică (ESM) permite obținerea unei imagini a distribuției potențialului electric pe suprafața probei. Se folosesc sonde, al căror vârf este acoperit cu o peliculă conductoare subțire (aur sau platină).

Design SPM

SPM constă din următoarele componente principale (Figura 7-2): o sondă, actuatoare piezoelectrice pentru a muta sonda în X, Y, Z pe suprafața probei de testat, un circuit de feedback și un computer pentru a controla procesul de scanare și achizitie de imagini.

Figura 7 2. Schema unui microscop cu sondă de scanare

senzor sondă - o componentă a unui microscop cu sondă de putere care scanează preparatul. Senzorul sondei conține un cantilever (consola cu arc) de tipuri dreptunghiulare (în formă de I) sau triunghiulare (în formă de V) (Fig. 7-3), la capătul căruia se află o sondă ascuțită (Fig. 7-3). , care are de obicei o formă conică sau piramidală . Celălalt capăt al consolei este îmbinat cu substratul (cu așa-numitul cip). Senzorii cu sondă sunt fabricați din siliciu sau nitrură de siliciu. Caracteristica principală a consolei este constanta de forță (constanta de rigiditate), aceasta variază de la 0,01 N/m la 1020 N/m. Pentru studiul obiectelor biologice se folosesc sonde „moale” cu o duritate de 0,01  0,06 N/m.

Orez. 7 3. Imagini ale sondelor AFM piramidale
obtinut cu un microscop electronic:
a - tipul în formă de I, b - tipul în formă de V, c - piramidă la vârful consolei

Actuatoare piezoelectrice sau scanere - pentru mișcarea controlată a sondei peste eșantion sau proba în sine față de sondă la distanțe ultra-mici. Actuatoarele piezoelectrice folosesc materiale piezoceramice care își schimbă dimensiunile atunci când li se aplică o tensiune electrică. Procesul de modificare a parametrilor geometrici sub acțiunea unui câmp electric se numește efect piezoelectric invers. Cel mai comun piezomaterial este titanatul de zirconat de plumb.

Scannerul este o structură piezoceramică care asigură mișcarea de-a lungul a trei coordonate: x, y (în planul lateral al probei) și z (vertical). Există mai multe tipuri de scanere, dintre care cele mai comune sunt trepied și tub (Fig. 7-4).

Orez. 7 4. Design scaner: a) – trepied, b) – tubular

Într-un scaner cu trepied, mișcările în trei coordonate sunt asigurate de trei tije piezoceramice independente care formează o structură ortogonală.

Într-un scaner cu tub, un tub piezoelectric gol se îndoaie în planurile XZ și ZY și se extinde sau se contractă de-a lungul axei Z atunci când electrozii care controlează mișcările tubului sunt aplicate tensiuni adecvate. Electrozii pentru controlul mișcării în planul XY sunt amplasați pe suprafața exterioară a tubului, pentru a controla mișcarea în Z, electrozii X și Y sunt aplicați tensiuni egale.

Circuitul de feedback - un set de elemente SPM, cu ajutorul cărora sonda este ținută la o distanță fixă ​​de suprafața probei în timpul scanării (Fig. 7-5). În timpul procesului de scanare, sonda poate fi amplasată pe zone ale suprafeței probei cu relief diferit, în timp ce distanța sondă-probă Z se va modifica, iar valoarea interacțiunii sondă-probă se va modifica în consecință.

Orez. 7 5. Schema de feedback a unui microscop cu sondă de scanare

Pe măsură ce sonda se apropie de suprafață, forțele de interacțiune sondă-probă cresc, iar semnalul dispozitivului de înregistrare crește, de asemenea V(t), care exprimată în unități de tensiune. Comparatorul compară semnalul V(t) cu tensiune de referinţă V de bazăși generează un semnal corectiv V corr. Semnal de corectare V corr este alimentat la scaner, iar sonda este retrasă din probă. Tensiune de referință - tensiunea corespunzătoare semnalului dispozitivului de înregistrare atunci când sonda se află la o distanță dată de probă. Menținând această distanță specificată sondă-probă în timpul scanării, sistemul de feedback menține forța de interacțiune sondă-probă specificată.

Orez. 7 6. Traiectoria mișcării relative a sondei în procesul de menținere a unei forțe constante a interacțiunii sondă-probă de către sistemul de feedback

Pe Fig. 7-6 arată traiectoria sondei în raport cu probă menținând în același timp o forță constantă de interacțiune sondă-probă. Dacă sonda este deasupra foveei, scanerului i se aplică o tensiune, la care scanerul se prelungește, coborând sonda.

Viteza de răspuns a buclei de feedback la o modificare a distanței sondă-probă (interacțiuni sondă-probă) este determinată de constanta buclei de feedback K. Valori K depind de caracteristicile de proiectare ale unui anumit SPM (design și caracteristici ale scanerului, electronică), modul de funcționare SPM (dimensiunea zonei de scanare, viteza de scanare etc.), precum și de caracteristicile suprafeței studiate (scara caracteristicilor de relief , duritatea materialului etc.).

Soiuri de SPM

Microscop tunel de scanare

În STM, dispozitivul de înregistrare (Fig. 7-7) măsoară curentul de tunel care curge între sonda metalică, care variază în funcție de potențialul de pe suprafața probei și de topografia suprafeței acesteia. Sonda este un ac ascuțit ascuțit, a cărui rază de vârf poate atinge câțiva nanometri. Ca material pentru sondă se folosesc de obicei metale cu duritate mare și rezistență chimică: wolfram sau platină.

Orez. 7 7. Schema senzorului sondei tunel

Se aplică o tensiune între sonda conductivă și proba conductivă. Când vârful sondei se află la o distanță de aproximativ 10A de probă, electronii din probă încep să pătrundă prin decalaj în sondă sau invers, în funcție de semnul tensiunii (Fig. 7-8).

Orez. 7 8. Reprezentarea schematică a interacțiunii vârfului sondei cu proba

Curentul rezultat din tunel este măsurat de un dispozitiv de înregistrare. Amploarea sa eu T proporţională cu tensiunea aplicată contactului tunelului Vși depinde exponențial de distanța de la ac la probă d.

Astfel, mici modificări ale distanței de la vârful sondei la probă d corespund unor modificări exponențial mari ale curentului de tunel eu T(presupunând tensiune V menținut constant). Din această cauză, sensibilitatea senzorului sondei tunel este suficientă pentru a înregistra modificări de înălțime mai mici de 0,1 nm și, în consecință, pentru a obține o imagine a atomilor de pe suprafața unui solid.

Microscop de forță atomică

Cel mai comun senzor cu sondă de interacțiune a forței atomice este un cantilever cu arc (din engleză cantilever - consolă) cu o sondă amplasată la capăt. Cantitatea de îndoire în consolă datorită interacțiunii forței dintre probă și sondă (Fig. 7-9) este măsurată folosind o schemă de înregistrare optică.

Principiul de funcționare al senzorului de forță se bazează pe utilizarea forțelor atomice care acționează între atomii sondei și atomii probei. Când forța sondei-probă se modifică, cantitatea de îndoire în consolă se modifică, iar o astfel de modificare este măsurată de sistemul de înregistrare optic. Astfel, senzorul de forță atomică este o sondă ascuțită de înaltă sensibilitate, care face posibilă înregistrarea forțelor de interacțiune între atomi individuali.

Pentru curburi mici, raportul dintre forța sondă-probă Fși deformarea vârfului cantilever X determinat de legea lui Hooke:

Unde k este constanta de forță (constanta de rigiditate) a consolei.

De exemplu, dacă se folosește o consolă cu o constantă k aproximativ 1 N/m, apoi sub acțiunea unei forțe de interacțiune sondă-probă de aproximativ 0,1 nanoNewton, deviația cantileverului va fi de aproximativ 0,1 nm.

Pentru a măsura astfel de deplasări mici, se folosește de obicei un senzor optic de deplasare (Fig. 7-9), format dintr-un laser semiconductor și o fotodiodă cu patru secțiuni. Când cantileverul este îndoit, fasciculul laser reflectat de acesta se deplasează în raport cu centrul fotodetectorului. Astfel, îndoirea consolei poate fi determinată din modificarea relativă a iluminării jumătăților superioare (T) și inferioare (B) ale fotodetectorului.

Fig 7 9. Schema senzorului de forță

Dependența forțelor de interacțiune vârf-eșantion de distanța vârf-eșantion

Când sonda se apropie de eșantion, aceasta este mai întâi atrasă la suprafață datorită prezenței forțelor atractive (forțe van der Waals). Pe măsură ce sonda se apropie mai mult de eșantion, învelișurile de electroni ale atomilor de la capătul sondei și atomii de pe suprafața probei încep să se suprapună, ceea ce duce la apariția unei forțe de respingere. Pe măsură ce distanța scade și mai mult, forța de respingere devine dominantă.

În general, dependența puterii interacțiunii interatomice F de la distanța dintre atomi R se pare ca:

.

constante Ași bși exponenți mși n depind de tipul de atomi și de tipul de legături chimice. Pentru forțele van der Waals m=7 și n=3. Calitativ, dependența F(R) este prezentată în Fig. 7-10.

Orez. 7 10. Dependenţa forţei de interacţiune dintre atomi de distanţă

Format de date SPM, vizualizarea datelor SPM

Datele despre morfologia suprafeței, obținute în timpul studiului la microscop optic, sunt prezentate ca o imagine mărită a unei suprafețe. Informația obținută cu SPM este scrisă ca o matrice bidimensională de numere întregi A ij . Pentru fiecare valoare ij corespunde unui punct specific de pe suprafață din câmpul de scanare. Reprezentarea grafică a acestei matrice de numere se numește imaginea scanată SPM.

Imaginile scanate pot fi fie bidimensionale (2D), fie tridimensionale (3D). Cu vizualizarea 2D, fiecare punct al suprafeței Z= f(X y) i se atribuie un anumit ton de culoare în conformitate cu înălțimea punctului de suprafață (Fig. 7-11 a). În vizualizarea 3D, imaginea de suprafață Z= f(X y) este construită într-o perspectivă axonometrică cu ajutorul pixelilor sau liniilor de relief calculate într-un anumit mod. Cea mai eficientă modalitate de a colora imaginile 3D este de a simula condițiile de iluminare a suprafeței printr-o sursă punctiformă situată într-un anumit punct din spațiu deasupra suprafeței (Fig. 7-11 b). În acest caz, este posibil să se sublinieze trăsăturile individuale mici ale reliefului.

Orez. 7 11. Limfocite din sângele uman:
a) Imagine 2D, b) Imagine 3D cu iluminare laterală

Pregătirea probelor pentru cercetarea SPM

Morfologia și structura celulelor bacteriene

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare care au o formă diversă și o structură complexă, ceea ce determină diversitatea activității lor funcționale. Bacteriile se caracterizează prin patru forme principale: sferice (sferice), cilindrice (în formă de tijă), contorte și filamentoase [Ref. 7-2].

coci (bacterii sferice) - în funcție de planul de diviziune și de localizarea indivizilor, aceștia sunt împărțiți în micrococi (coci situati separat), diplococi (coci perechi), streptococi (lanțuri de coci), stafilococi (având aspectul unor ciorchini de struguri). ), tetracoci (formații din patru coci) și sarcine (pachete de 8 sau 16 coci).

În formă de tijă - bacteriile sunt localizate sub formă de celule unice, diplo- sau streptobacterii.

Colectie - vibrioni, spirilla și spirochete. Vibrionii au aspectul unor tije ușor curbate, spirilla - o formă întortocheată cu mai multe bucle spiralate.

Dimensiunile bacteriilor variază de la 0,1 la 10 µm. Compoziția unei celule bacteriene include o capsulă, perete celular, membrană citoplasmatică și citoplasmă. Citoplasma conține nucleotide, ribozomi și incluziuni. Unele bacterii sunt echipate cu flageli și vilozități. O serie de bacterii formează spori. Depășind dimensiunea transversală inițială a celulei, sporii îi conferă o formă de fus.

Pentru a studia morfologia bacteriilor la microscop optic, din ele se prepară preparate native (vitale) sau frotiuri fixe colorate cu colorant de anilină. Există metode speciale de colorare pentru a detecta flagelii, peretele celular, nucleotidele și diverse incluziuni citoplasmatice.

Pentru studiul SPM al morfologiei celulelor bacteriene, nu este necesară colorarea preparatului. SPM face posibilă determinarea formei și mărimii bacteriilor cu un grad ridicat de rezoluție. Cu pregătirea atentă a preparatului și utilizarea unei sonde cu o rază mică de curbură, flagelii pot fi detectați. Totodată, datorită rigidității mari a peretelui celular bacterian, este imposibil să „sondezi” structurile intracelulare, așa cum se poate face la unele celule animale.

Pregătirea preparatelor pentru studiul SPM al morfologiei

Pentru prima experiență cu SPM, se recomandă alegerea unui preparat biologic care nu necesită o preparare complexă. Bacteriile lactice ușor accesibile și nepatogene din saramură de varză murată sau produse din lapte fermentat sunt destul de potrivite.

Pentru studiile SPM în aer, este necesară fixarea fermă a obiectului studiat pe suprafața substratului, de exemplu, pe o lamelă. În plus, densitatea bacteriilor din suspensie ar trebui să fie astfel încât celulele să nu se lipească împreună în timpul depunerii pe substrat, iar distanța dintre ele să nu fie prea mare, astfel încât să poată fi luate mai multe obiecte în timpul scanării într-un cadru. Aceste condiții sunt îndeplinite dacă modul de preparare a probei este ales corect. Dacă pe substrat se aplică o picătură dintr-o soluție care conține bacterii, se va produce precipitarea treptată și aderența acestora. În acest caz, concentrația de celule în soluție și timpul de sedimentare ar trebui să fie considerate ca parametri principali. Concentrația bacteriilor din suspensie este determinată de un standard de turbiditate optică.

În cazul nostru, un singur parametru va juca un rol - timpul de incubație. Cu cât picătura este păstrată mai mult timp pe sticlă, cu atât va fi mai mare densitatea celulelor bacteriene. În același timp, dacă o picătură de lichid începe să se usuce, preparatul va fi prea puternic contaminat de componentele precipitate ale soluției. O picătură dintr-o soluție care conține celule bacteriene (saramură) se aplică pe o lamela, incubată timp de 5-60 de minute (în funcție de compoziția soluției). Apoi, fără a aștepta ca picăturile să se usuce, acestea se spală bine cu apă distilată (înmuiând preparatul cu penseta într-un pahar de mai multe ori). După uscare, preparatul este gata pentru măsurare pe SPM.

De exemplu, preparatele de bacterii lactice au fost preparate din saramură de varză murată. Timpul de expunere al picăturii de saramură pe lamela a fost ales să fie de 5 minute, 20 de minute și 1 oră (picătura începuse deja să se usuce). SPM - cadrele sunt prezentate în Fig. 7 -12, Fig. 7-13,
Orez. 7-14.

Din figuri se poate observa că pentru această soluție timpul optim de incubare este de 510 min. O creștere a timpului de păstrare a unei picături pe suprafața substratului duce la aderența celulelor bacteriene. În cazul în care o picătură de soluție începe să se usuce, componentele soluției sunt depuse pe sticlă, care nu poate fi spălată.

Orez. 7 12. Imagini cu bacterii lactice pe o lametă,
obtinut folosind SPM.

Orez. 7 13. Imagini cu bacterii lactice pe o lamela,
obtinut folosind SPM. Timp de incubare a soluției 20 min

Orez. 7 14. Imagini cu bacterii lactice pe o lametă,
obtinut folosind SPM. Timp de incubare a soluției 1 oră

Pe unul dintre preparatele selectate (Fig. 7-12), am încercat să luăm în considerare ce sunt bacteriile lactice, ce formă le este caracteristică în acest caz. (Fig. 7-15)

Orez. 7 15. AFM - imaginea bacteriilor lactice pe o lamela.
Timp de incubare a soluției 5 min

Orez. 7 16. AFM - imaginea unui lanț de bacterii lactice pe o lamă de acoperire.
Timp de incubare a soluției 5 min

Saramura se caracterizează prin forma bacteriilor în formă de tijă și aranjarea sub formă de lanț.

Orez. 7 17. Fereastra programului de control al NanoEducator SPM educațional.
Bara de instrumente

Folosind instrumentele programului educațional SPM NanoEducator, am determinat dimensiunea celulelor bacteriene. Au variat de la aproximativ 0,5 × 1,6 µm
până la 0,8 × 3,5 µm.

Rezultatele obţinute sunt comparate cu datele date în determinantul bacteriei Bergey [Lit. 7-3].

Bacteriile lactice aparțin lactobacililor (Lactobacillus). Celulele sunt în formă de baston, de obicei o formă regulată. Bețișoarele sunt lungi, uneori aproape cocoide, de obicei în lanțuri scurte. Dimensiuni 0,5 - 1,2 X 1,0 - 10 microni. Disputa nu se formează; în cazuri rare, sunt mobile din cauza flagelilor peritric. Distribuit pe scară largă în mediul înconjurător, întâlnit în special în alimentele de origine animală și vegetală. Bacteriile lactice fac parte din microflora normală a tractului digestiv. Toată lumea știe că varza murată, pe lângă conținutul de vitamine din ea, este utilă pentru îmbunătățirea microflorei intestinale.

Proiectarea unui microscop cu sondă de scanare Nanoeducator

Pe Fig. 7-18 arată aspectul capului de măsurare SPM NanoEducator si sunt indicate principalele elemente ale aparatului folosit in lucrare.

Orez. 7 18. Aspectul capului de măsurare SPM NanoEducator
1 bază, suport pentru 2 probe, 3 senzori de interacțiune, șurub de fixare cu 4 senzori,
5-șuruburi pentru apropiere manuală, 6-șuruburi pentru deplasarea scanerului cu o probă în plan orizontal, 7-capac de protecție cu o cameră video

Pe Fig. 7-19 prezintă proiectarea capului de măsurare. Pe baza 1 se află un scanner 8 cu un suport de probă 7 și un mecanism pentru aducerea probei la sonda 2 pe baza unui motor pas cu pas. În cel educațional SPM NanoEducator proba este fixată pe scaner, iar proba este scanată în raport cu sonda fixă. Sonda 6, fixată pe senzorul de interacțiune a forței 4, poate fi, de asemenea, abordată de probă folosind șurubul de apropiere manuală 3. Selecția preliminară a locului de studiu pe eșantion se realizează cu ajutorul șurubului 9.

Orez. 7 19. Construcția SPM NanoEducator: 1 – bază, 2 – mecanism de abordare,
3 – șurub de apropiere manuală, 4 – senzor de interacțiune, 5 – șurub de fixare a senzorului, 6 – sondă,
7 - suport de probă, 8 - scaner, 9, 10 - șuruburi pentru deplasarea scanerului cu proba

Instruire SPM NanoEducator constă dintr-un cap de măsurare conectat prin cabluri, un controler SPM și un computer de control. Microscopul este echipat cu o cameră video. Semnalul de la senzorul de interacțiune după conversie în preamplificator intră în controlerul SPM. Managementul muncii SPM NanoEducator se realizează de pe computer prin intermediul controlerului SPM.

Senzor de interacțiune de forță și sondă

În aparat Nanoeducator Senzorul este realizat sub forma unui tub piezoceramic cu o lungime l=7 mm, diametru d=1,2 mm și grosimea peretelui h\u003d 0,25 mm, fixat rigid la un capăt. Un electrod conductiv este depus pe suprafața interioară a tubului. Pe suprafața exterioară a tubului sunt depuși doi electrozi semicilindrici izolați electric. La capătul liber al tubului este atașat un fir de tungsten cu un diametru
100 µm (Fig. 7-20).

Orez. 7 20. Designul senzorului universal al NanoEducator

Capătul liber al firului folosit ca sondă este împământat electrochimic, raza de curbură este de 0,2  0,05 µm. Sonda are contact electric cu electrodul intern al tubului conectat la corpul împământat al instrumentului.

Prezența a doi electrozi externi pe tubul piezoelectric face posibilă utilizarea unei părți a tubului piezoelectric (superior, în conformitate cu Fig. 7-21) ca senzor de interacțiune a forței (senzor de vibrații mecanice) și utilizarea celeilalte părți. ca piezovibrator. Piezovibratorul este furnizat o tensiune electrică alternativă cu o frecvență egală cu frecvența de rezonanță a senzorului de putere. Amplitudinea oscilației la o distanță mare vârf-eșantion este maximă. După cum se poate observa din fig. 7-22, în timpul procesului de oscilație, sonda se abate de la poziția de echilibru cu o cantitate A o egală cu amplitudinea oscilațiilor sale mecanice forțate (este fracțiuni de micrometru), în timp ce pe a doua parte a acestuia apare o tensiune electrică alternativă. piezotubul (senzor de oscilație), proporțional cu deplasarea sondei, care și măsurat de instrument.

Când sonda se apropie de suprafața probei, sonda începe să atingă proba în timpul oscilației. Aceasta conduce la o schimbare a caracteristicii amplitudine-frecvență (AFC) a oscilațiilor senzorului spre stânga în comparație cu AFC măsurată departe de suprafață (Fig. 7-22). Deoarece frecvența oscilațiilor de antrenare ale piezotubului este menținută constantă și egală cu frecvența de oscilație о în stare liberă, atunci când sonda se apropie de suprafață, amplitudinea oscilațiilor sale scade și devine egală cu A. Această amplitudine de oscilație este înregistrată din partea a doua a piezotubului.

Orez. 7 21. Principiul de funcționare al tubului piezoelectric
ca senzor de interacțiune a forței

Orez. 7 22. Modificarea frecvenței de oscilație a senzorului de forță
când se apropie de suprafața probei

Scanner

Metoda de organizare a micro-mișcărilor utilizată în dispozitiv Nanoeducator, se bazează pe utilizarea unei membrane metalice prinse în jurul perimetrului, pe suprafața căreia se lipește o placă piezoelectrică (Fig. 7-23 a). O modificare a dimensiunilor plăcii piezoelectrice sub acțiunea unei tensiuni de control va duce la o îndoire a membranei. Prin plasarea unor astfel de membrane pe trei laturi perpendiculare ale cubului și conectarea centrelor lor cu împingătoare metalice, puteți obține un scanner cu 3 coordonate (Fig. 7-23 b).

Orez. 7 23. Principiul de funcționare (a) și design (b) al scanerului NanoEducator

Fiecare element piezoelectric 1, fixat pe fețele cubului 2, atunci când i se aplică o tensiune electrică, poate deplasa împingătorul 3 atașat de el într-una din cele trei direcții reciproc perpendiculare - X, Y sau Z. După cum se poate vedea din figura, toate cele trei împingătoare sunt conectate la un punct 4 Cu o anumită aproximare, putem presupune că acest punct se mișcă de-a lungul a trei coordonate X, Y, Z. În același punct este atașat rack 5 cu suportul pentru probă 6. Astfel, proba se deplasează de-a lungul a trei coordonate sub acțiunea a trei surse independente de tensiune. În aparate Nanoeducator deplasarea maximă a probei este de aproximativ 5070 µm, ceea ce determină aria maximă de scanare.

Mecanism pentru apropierea automată a sondei de probă (captură de feedback)

Intervalul de mișcare a scanerului de-a lungul axei Z este de aproximativ 10 µm; prin urmare, înainte de scanare, este necesar să se apropie sonda de probă la această distanță. În acest scop, este proiectat mecanismul de abordare, a cărui schemă este prezentată în Fig. 7-19. Motorul pas cu pas 1, atunci când i se aplică impulsuri electrice, rotește șurubul de alimentare 2 și mișcă bara 3 cu sonda 4, apropiindu-l sau mai departe de proba 5 instalată pe scanerul 6. Valoarea unui pas este aproximativ 2 μm.

Orez. 7 24. Schema mecanismului de apropiere a sondei de suprafața probei

Deoarece pasul mecanismului de apropiere depășește semnificativ valoarea distanței necesare sondă-probă în timpul scanării, pentru a evita deformarea sondei, abordarea acesteia se realizează cu funcționarea simultană a motorului pas cu pas și mișcări ale scanerului de-a lungul Z. axă conform următorului algoritm:

1. Sistemul de feedback este oprit și scanerul „se retrage”, adică coboară proba în poziția extremă inferioară.

2. Mecanismul de apropiere a sondei face un pas și se oprește.

3. Sistemul de feedback este pornit, iar scanerul ridică fără probleme proba, în timp ce interacțiunea sondă-probă este analizată.

4. Dacă nu există interacțiune, procesul se repetă de la punctul 1.

Dacă apare un semnal diferit de zero în timp ce scanerul este tras în sus, sistemul de feedback va opri mișcarea ascendentă a scanerului și va fixa nivelul de interacțiune la un anumit nivel. Mărimea interacțiunii forței la care se va opri apropierea sondei și procesul de scanare va avea loc în dispozitiv Nanoeducator caracterizat prin parametru Suprimarea amplitudinii (AmplitudineSuprimarea) :

A=Ao. (1-Suprimarea amplitudinii)

Obținerea unei imagini SPM

După apelarea programului Nanoeducator fereastra principală a programului apare pe ecranul computerului (Fig. 7-20). Lucrarea ar trebui să înceapă de la elementul de meniu Fişier iar în ea alege Deschis sau Nou sau butoanele corespunzătoare din bara de instrumente (, ).

Selectarea echipei Fişier Nouînseamnă trecerea la măsurătorile SPM și alegerea comenzii Fişier Deschisînseamnă o tranziție la vizualizarea și procesarea datelor primite anterior. Programul vă permite să vizualizați și să procesați datele în paralel cu măsurătorile.

Orez. 7 25. Fereastra principală NanoEducator

După executarea comenzii Fişier Nou Pe ecran apare o casetă de dialog, care vă permite să selectați sau să creați un folder de lucru în care rezultatele măsurătorii curente vor fi salvate implicit. Pe parcursul măsurătorilor, toate datele obţinute sunt înregistrate secvenţial în fişiere cu numele ScanData+i.spm, unde indicele i este resetat la zero când programul este pornit și este incrementat cu fiecare măsurătoare nouă. Fișiere ScanData+i.spm sunt plasate în folderul de lucru, care este setat înainte de începerea măsurătorilor. Este posibil să selectați un folder de lucru diferit în timpul măsurătorilor. Pentru a face acest lucru, apăsați butonul , situat pe bara de instrumente a ferestrei principale a programului și selectați elementul de meniu Schimbați folderul de lucru.

Pentru a salva rezultatele măsurătorii curente, apăsați butonul Salvează caîn fereastra Scanare din caseta de dialog care apare, selectați un folder și specificați un nume de fișier, în timp ce fișierul ScanData+i.spm, care servește ca fișier temporar de salvare a datelor în timpul măsurătorilor, va fi redenumit cu numele de fișier specificat. În mod implicit, fișierul va fi salvat în folderul de lucru alocat înainte de începerea măsurătorilor. Dacă nu efectuați operația de salvare a rezultatelor măsurătorilor, atunci data viitoare când porniți programul, rezultatele vor fi înregistrate în fișiere temporare ScanData+i.spm, va fi suprascris secvenţial (cu excepţia cazului în care directorul de lucru este schimbat). Despre prezența fișierelor temporare de rezultate de măsurare în folderul de lucru, este emis un avertisment înainte de închidere și după pornirea programului. Schimbarea folderului de lucru înainte de a începe măsurătorile vă permite să protejați rezultatele experimentului anterior împotriva ștergerii. Nume implicit ScanData poate fi modificat prin specificarea acestuia în fereastra de selectare a folderului de lucru. Fereastra pentru selectarea unui folder de lucru este apelată atunci când este apăsat butonul. , situat pe bara de instrumente a ferestrei principale a programului. De asemenea, puteți salva rezultatele măsurătorilor în fereastră Scanați browserul, selectând fișierele necesare unul câte unul și salvându-le în folderul selectat.

Este posibil să exportați rezultatele obținute cu NanoEducator în formatele ASCII și Nova (NTMDT), care pot fi importate prin programul NTMDT Nova, Analiza imaginii și alte programe. Imaginile scanate, datele secțiunilor lor transversale, rezultatele măsurătorilor spectroscopice sunt exportate în format ASCII. Pentru a exporta date, faceți clic pe butonul Export situat în bara de instrumente a ferestrei principale a aplicației sau selectați Exportîn elementul de meniu Fişier această fereastră și selectați formatul de export corespunzător. Datele pentru procesare și analiză pot fi trimise imediat către programul de analiză a imaginii pre-lansat.

După închiderea ferestrei de dialog, panoul de control al instrumentului este afișat pe ecran.
(Fig. 7-26).

Orez. 7 26. Panoul de control al instrumentelor

În partea stângă a panoului de control al instrumentului există butoane pentru selectarea configurației SPM:

SSM- microscop cu forță de scanare (SFM)

STM– microscop cu scanare tunel (STM).

Efectuarea măsurătorilor pe antrenamentul SPM NanoEducator constă în efectuarea următoarelor operații:

1. Instalarea probei

ATENŢIE! Înainte de a introduce proba, este necesar să scoateți senzorul cu sonda pentru a nu deteriora sonda.

Există două moduri de a repara proba:

pe o masă magnetică (în acest caz, proba trebuie atașată la un substrat magnetic);

pe bandă adezivă cu două fețe.

ATENŢIE! Pentru a instala proba pe bandă adezivă cu două fețe, este necesar să deșurubați suportul de pe suport (pentru a nu deteriora scanerul), apoi să îl înșurubați înapoi până când se oprește ușor.

În cazul unei monturi magnetice, proba poate fi schimbată fără a deșuruba suportul pentru probă.

2. Instalarea sondei

ATENŢIE! Instalați întotdeauna senzorul cu sonda după plasarea probei.

După ce ați selectat senzorul sondei dorit (țineți sonda de marginile metalice ale bazei) (vezi Fig. 7-27), slăbiți șurubul de fixare a sondei 2 de pe capacul capului de măsurare, introduceți sonda în mufa suport până când se oprește , înșurubați șurubul de fixare în sensul acelor de ceasornic până se oprește ușor.

Orez. 7 27. Instalarea sondei

3. Selectarea unei locații de scanare

Atunci când alegeți un loc pentru cercetarea unui eșantion, utilizați șuruburile pentru mutarea tabelului cu două coordonate situat în partea de jos a dispozitivului.

4. Abordarea preliminară a sondei de probă

Operația de apropiere preliminară nu este obligatorie pentru fiecare măsurătoare, necesitatea implementării acesteia depinde de distanța dintre probă și vârful sondei. Este de dorit să se efectueze operația de apropiere preliminară dacă distanța dintre vârful sondei și suprafața probei depășește 0,51 mm. Atunci când se utilizează o abordare automată a sondei de probă de la o distanță mare între ele, procesul de abordare va dura foarte mult timp.

Utilizați șurubul de mână pentru a coborî sonda în timp ce controlați vizual distanța dintre aceasta și suprafața probei.

5. Construirea unei curbe de rezonanță și setarea frecvenței de operare

Această operație se efectuează neapărat la începutul fiecărei măsurători, iar până la efectuarea acesteia, trecerea la etapele ulterioare de măsurare este blocată. În plus, în timpul procesului de măsurare, apar uneori situații care necesită reefectuarea acestei operațiuni (de exemplu, când se pierde contactul).

Fereastra de căutare a rezonanței este accesată prin apăsarea butonului de pe panoul de comandă al instrumentului. Efectuarea acestei operații presupune măsurarea amplitudinii oscilațiilor sondei atunci când se modifică frecvența oscilațiilor forțate, stabilită de generator. Pentru a face acest lucru, apăsați butonul ALERGA(Fig. 7-28).

Orez. 7 28. Fereastra de operare de căutare a rezonanței și setarea frecvenței de operare:
a) - modul automat, b) - modul manual

În modul Auto frecvența oscilatorului este setată automat egală cu frecvența la care a fost observată amplitudinea maximă a oscilațiilor sondei. Un grafic care arată modificarea amplitudinii oscilațiilor sondei într-un interval de frecvență dat (Fig. 7-28a) vă permite să observați forma vârfului rezonant. Dacă vârful de rezonanță nu este suficient de pronunțat sau amplitudinea la frecvența de rezonanță este mică ( mai putin de 1V), atunci este necesară modificarea parametrilor de măsurare și redeterminarea frecvenței de rezonanță.

Acest mod este destinat Manual. Când acest mod este selectat în fereastră Determinarea frecvenței de rezonanță apare un panou suplimentar
(Fig. 7-28b), care vă permite să reglați următorii parametri:

Tensiunea de balansare a sondei dat de generator. Se recomandă setarea acestei valori la minim (până la zero) și nu mai mult de 50 mV.

Câștig de amplitudine ( Câștig de amplitudine). Dacă amplitudinea oscilației sondei este insuficientă (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Câștig de amplitudine.

Pentru a începe operația de căutare a rezonanței, apăsați butonul start.

Modul Manual vă permite să modificați manual frecvența selectată prin mișcarea cursorului verde pe grafic cu mouse-ul, precum și să clarificați natura modificării amplitudinii oscilației într-un interval restrâns de valori în jurul frecvenței selectate (pentru a face acest lucru, trebuie să setați comutatorul Mod manualîn poziție Exactși apăsați butonul start).

6. Captarea interacțiunii

Pentru a surprinde interacțiunea, procedura de apropiere controlată a sondei și a probei se realizează folosind mecanismul de abordare automată. Fereastra de control pentru această procedură este accesată prin apăsarea butonului de pe panoul de control al instrumentului. Când lucrați cu CCM, acest buton devine disponibil după efectuarea operației de căutare și setarea frecvenței de rezonanță. Fereastră CCM, plumb(Fig. 7-29) conține controale de apropiere a sondei, precum și indicații de parametri care vă permit să analizați progresul procedurii.

Orez. 7 29. Fereastra de apropiere a sondei

La fereastră livra Utilizatorul are capacitatea de a monitoriza următoarele valori:

extensia scanerului ( ScannerZ) de-a lungul axei Z în raport cu maximul posibil, luat ca unitate. Valoarea alungirii relative a scanerului este caracterizată de nivelul de umplere al indicatorului din stânga cu culoarea corespunzătoare zonei în care se află în prezent scanerul: culoare verde - zona de lucru, albastru - în afara zonei de lucru, roșu - scanerul s-a apropiat prea mult de suprafața probei, ceea ce poate duce la deformarea sondei. În acest din urmă caz, programul emite un avertisment sonor;

amplitudinea oscilației sondei raportat la amplitudinea oscilațiilor sale în absența interacțiunii forțelor, luate ca unitate. Valoarea amplitudinii relative a oscilațiilor sondei este afișată pe indicatorul din dreapta prin nivelul de umplere a acesteia în visiniu. Marcaj orizontal pe indicator Amplitudinea oscilației sondei indică nivelul, la trecere, prin care se efectuează analiza stării scanerului și ieșirea automată a acestuia în poziția de lucru;

numărul de pași ( Wagi) trecut într-o direcție dată: Apropiere - apropiere, Retragere - îndepărtare.

Înainte de a începe procesul de coborâre a sondei, trebuie să:

Verificați dacă parametrii de apropiere sunt setați corect:

Câștig de feedback câștig OS setat la valoare 3 ,

Asigurați-vă că parametrul suprimareAmplitudine (Forță) are o valoare de aproximativ 0,2 (vezi Fig. 7-29). În caz contrar, apăsați butonul Putere iar în fereastră Setarea parametrilor de interacțiune (Figura 7-30) valoarea stabilită suprimareamplitudine egal 0.2. Pentru o abordare mai delicată, valoarea parametrului suprimareamplitudine poate mai putin .

Verificați dacă setările sunt corecte în fereastra de parametri Opțiuni, pagina Parametrii de abordare.

Dacă există sau nu o interacțiune poate fi determinat de indicatorul din stânga ScannerZ. Extensie completă a scanerului (întregul indicator ScannerZ colorat în albastru), precum și un indicator visiniu complet umbrit Amplitudinea oscilației sondei(Fig. 7-29) indică nicio interacțiune. După efectuarea căutării rezonanței și setarea frecvenței de operare, se ia ca unitate amplitudinea vibrațiilor libere ale sondei.

Dacă scanerul nu este complet extins înainte sau în timpul apropierii, sau programul afișează un mesaj: „Eroare! Sonda este prea aproape de probă. Verificați parametrii de apropiere sau nodul fizic. Doriți să vă mutați într-un loc sigur”, se recomandă suspendarea procedurii de apropiere și:

A. schimba una dintre optiuni:

crește cantitatea de interacțiune, parametru suprimareamplitudine, sau

creste valoarea câștig OS, sau

măriți timpul de întârziere dintre pașii de apropiere (parametrul Timp de integrare Pe pagina Parametrii de abordare fereastră Opțiuni).

b. măriți distanța dintre vârful sondei și probă (pentru a face acest lucru, urmați pașii descriși în paragraf și efectuați operația Rezonanţă, apoi reveniți la procedură livra.

Orez. 7 30. Fereastra pentru setarea valorii interacţiunii dintre sondă şi probă

După capturarea interacțiunii, mesajul „ Lead finalizat”.

Dacă este necesar să vă apropiați cu un pas, apăsați butonul. În acest caz, mai întâi se execută pasul, apoi se verifică criteriile de captare a interacțiunii. Pentru a opri mișcarea, apăsați butonul. Pentru a efectua operația de retragere, trebuie să apăsați butonul pentru retragere rapidă

sau apăsați butonul pentru retragere lentă. Dacă este necesar, retrageți cu un pas, apăsați butonul. În acest caz, mai întâi se execută pasul, apoi se verifică criteriile de captare a interacțiunii.

7. Scanați

După finalizarea procedurii de apropiere ( livra) și capturarea interacțiunii, scanarea devine disponibilă (butonul din fereastra panoului de control al instrumentului).

Prin apăsarea acestui buton (vederea ferestrei de scanare este prezentată în Fig. 7-31), utilizatorul trece direct la măsurare și obținerea rezultatelor măsurătorii.

Înainte de a efectua procesul de scanare, trebuie să setați parametrii de scanare. Aceste opțiuni sunt grupate în partea dreaptă a barei de sus a ferestrei. Scanare.

Prima dată după pornirea programului, acestea sunt instalate implicit:

Zona de scanare - regiune (Xnm*Ynm): 5000*5000nm;

Suma de punctemăsurători de-a lungul axelor- X Y: NX=100, New York=100;

Calea de scanare - Direcţie definește direcția de scanare. Programul vă permite să selectați direcția axei de scanare rapidă (X sau Y). Când pornește programul, se instalează Direcţie

După setarea parametrilor de scanare, trebuie să faceți clic pe butonul aplica pentru a confirma introducerea parametrilor și butonul start pentru a începe scanarea.

Orez. 7 31. Fereastra pentru gestionarea procesului și afișarea rezultatelor scanării CCM

7.4 Orientări

Citiți manualul de utilizare [Ref. 7-4].

7.5.Siguranță

Dispozitivul este alimentat de o tensiune de 220 V. Microscopul cu sondă de scanare NanoEducator trebuie operat în conformitate cu PTE și PTB ale instalațiilor electrice de consum cu tensiune de până la 1000 V.

7.6 Sarcină

1. Pregătiți-vă propriile probe biologice pentru studiile SPM.

2. Practicați designul general al NanoEducator.

3. Familiarizați-vă cu programul de control NanoEducator.

4. Obțineți prima imagine SPM sub supravegherea unui profesor.

5. Procesați și analizați imaginea rezultată. Ce forme de bacterii sunt tipice pentru soluția dvs.? Ce determină forma și dimensiunea celulelor bacteriene?

6. Luați Burgey's Bacteria Key și comparați rezultatele cu cele descrise acolo.

7.7.Întrebări de control

1. Care sunt metodele de studiu a obiectelor biologice?

2. Ce este microscopia cu sondă de scanare? Ce principiu stă la baza ei?

3. Numiți principalele componente ale SPM și scopul lor.

4. Ce este efectul piezoelectric și cum se aplică în SPM. Descrieți diferitele modele de scanere.

5. Descrieți designul general al NanoEducator.

6. Descrieți senzorul de interacțiune a forței și principiul său de funcționare.

7. Descrieți mecanismul de apropiere a sondei de probă în NanoEducator. Explicați parametrii care determină puterea interacțiunii dintre sondă și probă.

8. Explicați principiul scanării și funcționarea sistemului de feedback. Spuneți-ne despre criteriile de selectare a opțiunilor de scanare.

7.8 Literatură

Lit. 7 1. Paul de Kruy. Vânători de microbi. M. Terra. 2001.

Lit. 7 2. Ghid de exerciţii practice de microbiologie. Sub conducerea lui Egorov N.S. Moscova: Nauka, 1995.

Lit. 7 3. Holt J., Krieg N., P. Sneath, J. Staley, S. Williams. // Determinant al bacteriei Burgey. M.: Mir, 1997. Vol. Nr. 2. C. 574.

Lit. 7 4. Manual de utilizare al instrumentului Nanoeducator.. Nijni Novgorod. Centrul științific și educațional...

Note de curs la cursul „Scanning probe microscopy in biology” Plan de curs

Abstract

... scanaresondămicroscopieîn biologie" Plan de prelegeri: Introducere, istoria SPM. limite aplicatii... și nanostructuri, cercetarebiologicobiecte: laureatii Nobel... pentrucercetare eșantion specific: B scanaresondămicroscopiepentru ...

Programul preliminar al celei de-a xxiii conferințe rusești de microscopie electronică 1 iunie marți dimineața 10 00 – 14 00 deschiderea discursului introductiv conferinței

Program

B.P. Karadzhyan, Yu.L. Ivanova, Yu.F. Ivlev, V.I. Popenko Aplicațiesondăși confocale scanaremicroscopiepentrucercetare procese de reparare folosind grefe nanodispersate...

Metode de Conferință științifică primară rusească pentru studierea compoziției și structurii materialelor funcționale

Document

MULTI-ELEMENT OBIECTE NEREFERENȚĂ... Lyakhov N.Z. CERCETARE NANOCOMPOZITE BIOLOGIC ACTIV... Aliev V.Sh. APLICARE METODĂ SONDĂMICROSCOPIIPENTRUCERCETARE EFECT... SCANARE CALORIMETRIE SI CURENTI TERMOSTIMULATI PENTRUCERCETARE ...

(Engleză) Microscop electronic cu scanare, SEM) este un dispozitiv care vă permite să obțineți imagini ale suprafeței probei cu o rezoluție mare (mai puțin de un micrometru). Imaginile obținute cu ajutorul unui microscop electronic cu scanare sunt tridimensionale și convenabile pentru studierea structurii unei suprafețe scanate. O serie de metode suplimentare (metode EDX, WDX) fac posibilă obținerea de informații despre compoziția chimică a straturilor apropiate de suprafață.

Principiul de funcționare

Eșantionul studiat este scanat în condiții de vid industrial de un fascicul de electroni de energie medie focalizat. În funcție de mecanismul de înregistrare a semnalului, există mai multe moduri de funcționare a unui microscop electronic cu scanare: modul electronic reflectat, modul electron secundar, modul catodoluminiscență etc. Tehnicile dezvoltate fac posibilă investigarea nu numai a proprietăților suprafeței probei, ci și de asemenea, vizualizați și obțineți informații despre proprietățile structurilor subterane, situate la o adâncime de câțiva microni de suprafața scanată.

Moduri de operare

Detectarea electronilor secundari

Radiația care formează imaginea suprafeței probei în majoritatea modelelor de dispozitive este tocmai electronii secundari care intră în detectorul de tip Everhart-Thornley, unde se formează imaginea primară, care, după procesarea software-procesor, intră pe ecranul monitorului. Ca și în cazul microscoapelor electronice cu transmisie, filmul a fost folosit anterior pentru fotografie. Camera a capturat imagini pe un ecran alb-negru de înaltă definiție al unui tub catodic. Acum, imaginea generată este pur și simplu afișată în fereastra de interfață a programului de calculator care controlează microscopul, iar după focalizarea de către operator, poate fi salvată pe hard diskul computerului. Imaginea formată de microscoapele de scanare se caracterizează prin contrast ridicat și adâncimea focalizării. În unele modele de dispozitive moderne, datorită utilizării tehnologiei multibeam și utilizării unui software special, este posibilă obținerea unei imagini 3D a suprafeței obiectului studiat. De exemplu, astfel de microscoape sunt produse de compania japoneză JEOL.

permisiune

Rezoluția spațială a unui microscop electronic cu scanare depinde de dimensiunea transversală a fasciculului de electroni, care, la rândul său, depinde de caracteristicile sistemului electron-optic care focalizează fasciculul. Rezoluția este, de asemenea, limitată de dimensiunea zonei de interacțiune dintre sonda de electroni și probă, adică din materialul țintă. Dimensiunea sondei de electroni și dimensiunea regiunii de interacțiune dintre sondă și probă sunt distanțe mult mai mari dintre atomii țintă, astfel încât rezoluția microscopului electronic de scanare nu este suficient de mare pentru a afișa scale atomice, după cum este posibil, de exemplu, într-un microscop electronic cu transmisie. Cu toate acestea, microscopul electronic cu scanare are avantajele sale, inclusiv capacitatea de a vizualiza o zonă relativ mare a probei, capacitatea de a examina ținte masive (nu doar filme subțiri) și o varietate de metode analitice care permit studierea caracteristicile fundamentale ale materialului țintă. În funcție de dispozitivul specific și de parametrii experimentului, este posibil să se obțină valori de rezoluție de la zeci la unități de nanometri.

Aplicație

Microscoapele de scanare sunt utilizate în principal ca instrument de cercetare în fizică, știința materialelor, electronică și biologie. În principal pentru a obține o imagine a probei de testat, care poate varia foarte mult în funcție de tipul de detector care este utilizat. Aceste diferențe în imaginile obținute fac posibilă tragerea de concluzii despre proprietățile fizice ale suprafeței, realizarea de studii ale topografiei suprafeței. Microscopul electronic este practic singurul instrument care poate oferi o imagine a suprafeței unui microcip modern sau o etapă intermediară a procesului de fotolitografie.

Pentru un studiu detaliat al suprafeței solidelor, există multe metode diferite. Microscopia, ca mijloc de obținere a unei imagini mărite, își are originea în secolul al XV-lea. când au fost făcute pentru prima dată lupe simple pentru a studia insectele. La sfârşitul secolului al XVII-lea. Antonio van Leeuwenhoek a realizat un microscop optic, care a făcut posibilă stabilirea existenței celulelor individuale, a microbilor patogeni și a bacteriilor. Deja în secolul al XX-lea, au fost dezvoltate metode de microscopie folosind fascicule de electroni și ioni.

În toate metodele descrise se aplică următorul principiu: iluminarea obiectului studiat cu un flux de particule și transformarea lui ulterioară. Microscopia cu sondă de scanare folosește un principiu diferit - în loc de sondarea particulelor, folosește o sondă mecanică, un ac. Figurat vorbind, putem spune că dacă o probă este examinată la microscop optic sau electronic, atunci într-un SPM se simte.

Un alt principiu important reflectat în denumirea metodei SPM este principiul scanării, adică. obtinerea de informatii nu medii despre obiectul de studiu, ci deplasarea discreta (de la punct la punct, de la linie la linie) a sondei si citirea informatiilor in fiecare punct.

Designul general al unui microscop cu sondă de scanare este prezentat în Fig. 1.

Tipuri de senzori.

Microscopia cu sondă de scanare se bazează pe detectarea interacțiunii locale care are loc între sondă și suprafața probei de testat atunci când acestea se apropie una de cealaltă până la o distanță de ~l, unde l este lungimea caracteristică de dezintegrare a „probă-sondă” interacţiune. În funcție de natura interacțiunii „sondă-probă”, există: microscop de scanare cu tunel (STM, curentul de tunel este detectat), microscop cu forță de scanare (SFM, interacțiunea forță este detectată), microscop optic cu scanare în câmp apropiat (SNOM, electromagnetic). radiația este detectată), etc. Microscopia cu forță de scanare, la rândul său, este împărțită în microscopie cu forță atomică (AFM), microscopie cu forță magnetică (MFM), microscopie cu forță electrică (ESM) și altele, în funcție de tipul de interacțiune a forței.

Orez. 2.

La măsurarea curentului de tunel în senzorul de tunel (Fig. 2), este utilizat un convertor curent-tensiune (CVT), care este inclus în circuitul de curgere a curentului dintre sonde și probă. Sunt posibile două opțiuni de comutare: cu o sondă cu împământare, atunci când o tensiune de polarizare este aplicată probei în raport cu sonda cu împământare, sau cu o eșantion cu împământare, când o tensiune de polarizare este aplicată sondei în raport cu eșantionul.

Orez. 2.

Un senzor tradițional de interacțiune a forței este un microgrindă de siliciu, cantilever sau cantilever (din engleză cantilever - cantilever) cu o schemă optică pentru detectarea mărimii îndoirii cantilever care rezultă din interacțiunea forței dintre probă și sondă situată la capătul cantilever (Fig. 3).

Există metode de contact, fără contact și contact intermitent („semi-contact”) de conducere a microscopiei de forță. Utilizarea metodei de contact presupune că sonda se sprijină pe probă. Când cantileverul este îndoit sub acțiunea forțelor de contact, fasciculul laser reflectat de acesta este deplasat față de centrul fotodetectorului cadran. Astfel, deformarea cantileverului poate fi determinată din modificarea relativă a iluminării jumătăților superioare și inferioare ale fotodetectorului.

Când se utilizează metoda fără contact, sonda este îndepărtată de la suprafață și se află în zona de acțiune a forțelor atractive cu rază lungă. Forțele atractive și gradienții lor sunt mai slabe decât forțele de contact respingătoare. Prin urmare, o tehnică de modulare este de obicei utilizată pentru a le detecta. Pentru a face acest lucru, folosind un piezovibrator, cantileverul se balansează vertical la frecvența de rezonanță. Departe de suprafață, amplitudinea oscilațiilor cantilever are o valoare maximă. Pe măsură ce se apropie de suprafață, datorită acțiunii gradientului forțelor de atracție, frecvența de rezonanță a oscilațiilor cantilever se modifică, în timp ce amplitudinea oscilațiilor sale scade. Această amplitudine este înregistrată folosind un sistem optic prin modificarea relativă a iluminării variabile a jumătăților superioare și inferioare ale fotodetectorului.

Cu metoda de măsurători „semi-contact” se folosește și o tehnică de modulare pentru măsurarea interacțiunii forței. În modul „semi-contact”, sonda atinge parțial suprafața, fiind alternativ atât în ​​zona de atracție, cât și în zona de repulsie.

Există și alte metode mai simple pentru detectarea interacțiunii forței, în care interacțiunea forței este transformată direct într-un semnal electric. Una dintre aceste metode se bazează pe utilizarea efectului piezoelectric direct, atunci când îndoirea unui material piezoelectric sub acțiunea interacțiunii forței duce la apariția unui semnal electric.