Darah dan eritrosit. Kami terus menerbitkan materi tentang darah.
Seperti apa bentuk eritrosit? Dalam kondisi fisiologis normal dalam aliran darah, eritrosit memiliki bentuk bikonkaf dengan penebalan seragam di sepanjang tepinya dan dengan bagian tengah yang lebih ringan - pellor.
Dalam studi optik cahaya, eritrosit normal yang secara rutin diwarnai dengan pewarna asam memiliki bentuk cakram dengan diameter 6,9-7,7 dan hingga 9,0 mikron. Tergantung pada ukurannya, eritrosit dibagi menjadi mikro dan makrosit, tetapi sebagian besar diwakili oleh normosit / diskosit.
Sifat morfofungsional eritrosit
Eritrosit adalah sel bikonkaf bebas inti dengan volume rata-rata 90,0 m 3 dan luas 142 m 2 . Ketebalan terbesarnya adalah 2,4 m, minimumnya adalah 1 m.
Dalam sediaan kering, ukuran rata-rata eritrosit adalah 7,55 m; 95% dari bahan keringnya jatuh pada hemoglobin protein yang mengandung besi dan hanya 5% - pada bagian zat lain (protein dan lipid lain). Sel-sel tersebut mewakili mayoritas mutlak - lebih dari 85% - eritrosit manusia yang sehat.
Bentuk inti germinal eritrosit mudah dibedakan dari kebanyakan sel seri leukosit dengan tidak adanya granula di sitoplasmanya (kesalahan hanya mungkin terjadi saat mengidentifikasi sel blast). Eritroblas dicirikan oleh kromatin inti yang lebih granular dan lebih padat.
Rongga tengah (pellor) dari cakram eritrosit menyumbang 35 hingga 55% dari permukaannya, dan pada penampang, eritrosit berbentuk donat, yang, di satu sisi, memastikan pelestarian hemoglobin dan, pada di sisi lain, memungkinkan eritrosit melewati kapiler yang paling tipis sekalipun. Model struktur eritrosit yang tersedia saat ini sesuai dengan konsep sifat spesifik sel ini, terutama membrannya, yang, meskipun sensitif terhadap tekanan deformasi, memberikan ketahanan terhadap pembengkokan dan peningkatan permukaan total.
Data literatur menunjukkan bahwa ukuran dan deformabilitas membran eritrosit adalah karakteristik terpentingnya, yang terkait dengan fungsi normal sel-sel ini, termasuk kemampuan migrasi yang tinggi, partisipasi dalam proses metabolisme (terutama dalam pertukaran oksigen).
Perubahan sifat mikroelastometri eritrosit dan "transformasi" diskosit menjadi bentuk morfologi lain dapat disebabkan oleh berbagai agen. Dengan demikian, munculnya pertumbuhan superfisial menyebabkan penurunan elastisitas membran, yang mungkin disebabkan oleh kekuatan berlawanan yang timbul dalam proses deformasi eritrosit; deformasi meningkat dengan penurunan konsentrasi ATP dalam sel.
Jika integritas membran sel dilanggar, maka eritrosit kehilangan bentuk khasnya dan berubah menjadi sferoplas, yang, pada gilirannya, mengalami hemolisis. Struktur membran eritrosit (diskosit) seluruhnya sama; dan meskipun fakta bahwa depresi dan tonjolan dapat terjadi di berbagai bagiannya, perubahan tekanan intra atau ekstraseluler dengan penyebaran ± 15% tidak menyebabkan kerutan pada seluruh sel, karena memiliki margin "anti-deformabilitas" yang signifikan. . Membran eritrosit memiliki elastisitas yang cukup untuk menahan pengaruh berbagai faktor yang terjadi selama sirkulasi eritrosit melalui aliran darah.
Komposisi membran eritrosit meliputi: fosfolipid (36,3%), sfingomielin (29,6%), kolesterol (22,2%) dan glikolipid (11,9%). Dua elemen pertama adalah molekul amfifilik dalam media berair, membentuk lapisan ganda lipid yang khas, yang juga diresapi dengan molekul protein integral yang terkait di dalam eritrosit dengan sitoskeletonnya.
Lipid membran berada dalam keadaan cair, memiliki viskositas rendah (hanya 10-100 kali viskositas air). Lipid, asam sialat, oligosakarida antigenik, protein teradsorpsi terletak di permukaan luar membran; permukaan bagian dalam membran diwakili oleh enzim glikolitik, natrium dan kalsium, ATPase, glikoprotein dan hemoglobin.
Lapisan lipid ganda membran melakukan tiga fungsi: fungsi penghalang ion dan molekul, dasar struktural untuk fungsi reseptor dan enzim (protein, glikoprotein, glikolipid) dan mekanis. Dalam penerapan fungsi pernapasan khusus - transfer oksigen atau karbon dioksida - peran utama dimainkan oleh protein membran yang "tertanam" dalam lapisan ganda lipid. Eritrosit dewasa tidak mampu mensintesis asam nukleat dan hemoglobin; mereka dicirikan oleh tingkat metabolisme yang rendah, yang memastikan masa hidup sel-sel ini cukup lama (120 hari).
Seiring bertambahnya usia eritrosit, luas permukaannya berkurang, sedangkan kandungan hemoglobin tetap tidak berubah. Telah ditetapkan bahwa pada usia "dewasa", eritrosit mempertahankan komposisi kimia yang konstan untuk waktu yang lama, tetapi seiring bertambahnya usia sel, kandungan bahan kimia di dalamnya secara bertahap berkurang. Sitoskeleton eritrosit dibentuk dan dikendalikan oleh "keluarga" protein multigen dan terkait membran yang mengatur domain membran khusus yang mempertahankan fungsi dan bentuk sel yang sangat terspesialisasi ini.
Potensial listrik eritrosit
Membran eritrosit mengandung 50% protein, hingga 45% lipid, dan hingga 10% karbohidrat. Pada permukaan sel utuh, distribusi muatan "jaringan" ditentukan oleh glikoprotein yang mengandung asam sialic (neutramic), yang menentukan hingga 62% muatan negatif permukaan sel.
Dipercaya bahwa setiap muatan listrik sesuai dengan 1 molekul asam ini. Hilangnya asam sialat oleh permukaan eritrosit menyebabkan penurunan mobilitas elektroforesis (EPM) dan penekanan transpor kation. Akibatnya, ada "mosaik" muatan pada permukaan sel, ditentukan oleh kelompok kationik dan anionik, rasio yang menentukan total muatan listrik eritrosit.
Untuk mempertahankan keadaan homeostasis yang optimal, sel darah harus memiliki muatan yang stabil. Stabilitas tinggi EFP dipastikan oleh mekanisme regulasi yang halus - keseimbangan proses peroksidasi lipid (LPO) dalam membran eritrosit dan efek perlindungan dari sistem antioksidan.
Telah ditetapkan secara empiris bahwa reseptor untuk antibodi terletak di membran eritrosit, dan kehadirannya bahkan dalam jumlah kecil di permukaan dapat mengganggu fungsi fisiologis normal dalam tubuh dan mengubah EFP eritrosit. Ini dapat mempengaruhi tingkat hemoglobin pada yang terakhir, karena kandungan hemoglobin dan EFP sangat terkoordinasi.
Juga harus diperhitungkan bahwa di bawah efek ekstrim dari faktor negatif pada tubuh, produk peroksidasi lipid mempengaruhi sifat elektrokinetik eritrosit. Pada gilirannya, ini tercermin dalam laju proses peroksida dalam membrannya.
Berkat tolakan elektrostatik ("menyebar" menurut Chizhevsky) dari sel-sel eritrosit yang bermuatan serupa, yang terakhir bergerak bebas melalui pembuluh darah, melakukan fungsi transportasi oksigennya. Oleh karena itu, pelanggaran stabilitas muatan dapat dianggap sebagai indikator integral dari perubahan patologis dalam tubuh.
1.5 Topik kelas praktik
BAGIAN 1. BIOFISIKA MEMBRAN
1. 1. Membran biologis. Struktur, properti.
Kapasitansi listrik spesifik dari membran akson, diukur dengan mikroelektroda intraseluler, ternyata 0,5 mikrofarad/cm2. Menggunakan rumus kapasitor datar, perkirakan ketebalan lapisan hidrofobik membran dengan konstanta dielektrik 2.
Berapa jarak pada permukaan membran eritrosit yang dilalui molekul fosfolipid dalam 1 detik sebagai akibat dari difusi lateral? Koefisien difusi lateral diambil sama dengan 10 -12 m 2 /s. Bandingkan dengan keliling eritrosit yang berdiameter 8 mikron.
Selama fase transisi fosfolipid membran dari bentuk kristal cair ke gel, ketebalan lapisan ganda berubah. Bagaimana kapasitansi listrik membran berubah dalam kasus ini? Bagaimana kekuatan medan listrik dalam membran berubah?
Dengan bantuan molekul fosfolipid berlabel spin, gradien viskositas melintasi ketebalan membran ditetapkan. Jelaskan eksperimen sebelumnya. Di mana viskositas lebih tinggi: di permukaan membran atau di tengahnya?
1.1.1. Ketebalan membran biologis:
10 A, 3. OD m
10 nm 4. 10 m
1.1.2. Model mosaik fluida dari membran biologis meliputi:
lapisan protein, polisakarida dan lipid permukaan
lipid monolayer dan kolesterol
lipid bilayer, protein, mikrofilamen
lapisan ganda lipid
1.1.3. Bagian lipid dari membran biologis berada dalam keadaan fisik berikut:
cair amorf
kristal padat
padat amorf
kristal cair
1.1.4. Kapasitansi listrik spesifik membran akson:
1.1.5. Waktu transfer karakteristik dari transfer molekul fosfolipid dari satu posisi setimbang ke posisi setimbang lainnya selama difusi:
1.1.6. Transisi fase lipid bilayer membran dari keadaan kristal cair ke gel disertai dengan:
penipisan membran
ketebalan membran tidak berubah
penebalan membran
1.2. Transportasi zat melintasi membran biologis.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
1. Parameter apa yang bergantung pada jari-jari kritis pori lipid dalam membran?
2. Hitung jari-jari pori kritis tanpa adanya potensial membran. Ambil tegangan tepi pori 10 -11 N, tegangan permukaan lapisan ganda lipid 0,3 mN/m.
3. Bagaimana difusi terfasilitasi ion kaoium dengan partisipasi molekul valinomisin berubah setelah transisi fase lipid membran dari bentuk kristal cair ke gel?
4. Kapasitansi listrik spesifik membran akson, diukur dengan mikroelektroda intraseluler, ternyata 0,5 mikrofarad/cm2. Menggunakan rumus kapasitor datar, perkirakan ketebalan lapisan hidrofobik membran dengan konstanta dielektrik 2.
Tes pemantauan model
1.2.1. Transpor ion terjadi dalam arah:
1.2.2. Persamaan difusi untuk non-elektrolit (Fika) ditulis:
2.3. Molekul valinomycin diangkut melintasi membran:
1.2.4. Perpindahan materi selama difusi terfasilitasi dibandingkan dengan difusi sederhana:
lebih lambat
1.3. Potensi bioelektrik.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
Transpor ion apa yang menciptakan perbedaan potensial membran: pasif atau aktif?
Mana yang lebih besar: kecepatan rambat sinyal listrik di sepanjang kabel telegraf laut atau kecepatan rambat impuls saraf di sepanjang membran akson? Mengapa?
Jelaskan mekanisme kerja biofisik racun Tetro-Dotoxin dan anestesi lokal tetraetilamonium.
Bagaimana permeabilitas membran akson cumi-cumi untuk berbagai ion saat istirahat dan selama eksitasi berkorelasi?
Bagaimana bentuk grafik potensial aksi berubah jika kita mengubah komposisi kimia di dalam dan di luar akson: axo-plasma diganti dengan cairan ekstraseluler, dan cairan ekstraseluler - dengan aksoplasma?
Berapa kuat medan listrik pada membran dalam keadaan diam, jika konsentrasi ion kalium di dalam sel adalah 125 mmol / l, di luar - 2,5 mmol / l, dan ketebalan membran adalah 8 nm?
(Jawaban: 1,3 * 10 7 V / m.)
7. Hitung amplitudo potensial aksi, jika kon-
konsentrasi kalium dan natrium di dalam sel jaringan yang dapat dirangsang
tidak masing-masing: 125 mmol / l, 1,5 mmol / l, dan di luar
2,5 mmol/l dan 125 mmol/l.(Jawaban: 160 mV.)
Tes pemantauan model
1.3.1 Potensial membran f m disebut:
1.3.2. Diameter ujung elektroda intraseluler yang digunakan untuk pengukuran potensial membran:
sesuai dengan ukuran sel
jauh lebih kecil dari sel
sel yang jauh lebih besar
1.4. Mekanisme pembangkitan potensial aksi.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
1. Apakah mungkin untuk proses pada membran sel yang dapat dieksitasi, di mana aliran ion yang berbeda dengan tanda muatan yang sama mengalir secara bersamaan?
2. Apa arti dari ungkapan
untuk fase II dari potensial aksi kardiomiosit?
3. Apa alasan arus yang melalui saluran bersifat diskrit, dan melalui membran - kontinu, berubah dengan lancar?
Tes pemantauan model
1.4.1. Pada fase depolarisasi selama eksitasi akson, aliran ion Na + diarahkan:
1. neraka 2. bd 3. neraka 4. di 5. ag
1. 4.2. Pada fase repolarisasi akson, aliran ion diarahkan:
1.ad 2.bd 3.be 4.d
4.3. Durasi potensial aksi kardiomiosit dibandingkan dengan potensial aksi akson
1. lebih besar dari 2. kurang dari 3. sama
4.4. Fase dataran tinggi dalam kardiomiosit ditentukan oleh fluks ion:
1. Antonov V.F. Biofisika membran // Jurnal pendidikan Sorovsky. - 1997. - T. - 6. S. 1-15.
2. Antonov V.F., Smirnova E.Yu., Shevchenko E.V. Membran lipid selama transformasi fase. - M.: Nauka, 1992. - S. 125.
3. Klenchin V.A. membran biologis. - 1993. - T. 10. -S. 5-19.
4. Chizmajaev Yu.A., Arakelyan V.B., Pastushenko V.F. Biofisika membran. - M.: Nauka, 1981. - S. 207-229.
5. Kotek A., Janacek K. transportasi membran. M.: Mir, 1980.
6. kaki ringan E. Fenomena transportasi dalam sistem kehidupan. M.: 1977.
7. Rubin A.B. Biofisika. M.: Lebih tinggi. Sk., 1987.
8. Selaput biologis: Koleksi / Bawah. Ed. D.S. Parsons. Moskow: Atomizdat, 1978.
9. Membran: Saluran ion: Sat. Seni. M.: Mir, 1981.
10. Bukit B.V. Duduk. Membran: saluran ion. M.: Mir, 1981.
11. Fisiologi dan patofisiologi jantung. Di bawah. ed. N. Sperelakis: M.: Kedokteran, 1998.
12. Fisiologi manusia. Di bawah. ed. Schmidt R. Dan Tevs G. T. 1. M.: Mir, 1996.
BAGIAN 2. BIOFISIKA SEL DAN ORGAN
2. 1. Aktivitas listrik organ.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
1. Apa prinsip generator setara? Berikan contoh penggunaan prinsip ini.
2. Mengapa masalah kebalikan dari elektrokardiografi merupakan tugas diagnostik, dan bukan tugas langsung?
3. Bagaimana mekanisme terbentuknya peta potensial listrik pada permukaan tubuh manusia?
4. Mengapa perlu merekam setidaknya 3 sadapan EKG, dan bukan, misalnya, satu?
Tes pemantauan model
2.1.1. Saat memodelkan EKG, diasumsikan bahwa lingkungan di sekitar dipol
sebuah. homogen a, heterogen
b. isotropik b", anisotropik
di. terbatas dalam", tak terbatas
1. abc 2. a"b"c" 3.ab"c 4.abc"
2.1.2. Apa alasan perubahan besar dan arah vektor listrik integral jantung selama siklus kerjanya?
kontraksi ventrikel jantung
cakupan berturut-turut dari gelombang eksitasi berbagai struktur jantung
aktivitas metabolisme kardiomiosit
memperlambat kecepatan gelombang di nodus atrioventrikular
2.1.3. Mengapa amplitudo gigi EKG yang sama pada waktu yang sama di sadapan yang berbeda tidak sama?
untuk sadapan yang berbeda, nilai vektor listrik integral E _
di sadapan yang berbeda, rotasi vektor E berbeda
proyeksi vektor E pada sadapan yang berbeda tidak sama
setiap lead memiliki vektor sendiri E
2.1.4. Vektor listrik integral jantung E menggambarkan loop P, QRS, T:
1.horisontal
2. di bidang permukaan dada
Z.dalam ruang volume XYZ
4. pada bidang yang menghubungkan titik-titik kaki kanan, tangan kiri dan kaki kiri
2.1.5 Perbedaan potensial yang tercatat
1. ag 2. menjadi 3. vg 4. dv
2.2. Proses gelombang otomatis di media aktif.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
Apa perbedaan mendasar antara gelombang otomatis di media aktif dan gelombang mekanik di media elastis?
Mengapa gelombang otomatis merambat dalam media aktif tanpa redaman?
Apakah interferensi gelombang otomatis diamati pada media aktif?
Parameter gelombang otomatis dalam media aktif bergantung pada apa?
Potensi ambang batas untuk sel-sel di wilayah miokard adalah - 30 mV. Potensi transmembran sel di daerah ini pada suatu saat mencapai nilai 40 mV. Dapatkah gelombang eksitasi ditransmisikan melalui area miokardium ini?
Tes pemantauan model
2.2.1. Gelombang eksitasi (autowave), merambat melalui media aktif (misalnya, melalui struktur miokardium), tidak meluruh:
dengan mentransfer energi dari satu sel ke sel lainnya
akan mendeteksi pelepasan energi yang disimpan oleh setiap sel
sebagai akibat dari transfer energi mekanik dari kontraksi miokard
sebagai hasil dari penggunaan energi medan listrik
2.2.2 Panjang gelombang eksitasi dalam media aktif tergantung pada:
sebuah. amplitudo potensial aksi kardiomiosit
b. pada kecepatan rambat gelombang melalui miokardium
di. pada frekuensi nadi alat pacu jantung
g.dari durasi periode refraktori dari tereksitasi
sel1. ab 2. bg 3. cg 4. ag
2.2.3 Peredaran gelombang otomatis (masuk kembali) berdurasi X dalam sebuah cincin dengan keliling / dapat terjadi pada kondisi:
2.2.4. Jika dalam media aktif yang tidak homogen terdapat zona dengan refraktori R 1 dan R 2 (R 2 > R :) dan impuls dari alat pacu jantung mengikuti dengan periode T, maka transformasi ritme dapat terjadi dalam kondisi:
1. T
R 1 3.T = R 2 -R 1 2.3. Biofisika kontraksi otot.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
Mengapa kontraksi isometrik memiliki bentuk ketergantungan F(t) yang berbeda pada panjang otot awal yang berbeda?
Apakah mungkin untuk menentukan beban maksimum yang dapat ditahan otot dari kurva Bukit V(P)?
Apakah efisiensi kontraksi otot meningkat dengan meningkatnya panas yang dihasilkan oleh otot itu?
Apa perbedaan antara kopling elektromekanis pada kardiomiosit dan otot rangka?
Tes pemantauan model
2.3.1. Selama kontraksi otot:
sebuah. Filamen aktin meluncur ke sarkomer di sepanjang miosin
b. myosin kompres seperti pegas
di. jembatan menempel pada situs aktif aktin
d.jembatan terbuka
1. av 2. bg 3. bv 4. ag
2.3.2. Kekuatan kontraksi yang dihasilkan oleh otot ditentukan oleh:
1. panjang utas aktif
2 perubahan gaya yang dihasilkan oleh satu jembatan
jumlah jembatan yang ditutup secara bersamaan
elastisitas filamen miosin
2.3.3. Ketergantungan kecepatan v dari kontraksi otot tunggal pada beban P memiliki bentuk:
2.3.4 Kopling elektromekanis ditentukan oleh rantai peristiwa berikut:
sebuah. pelepasan ion Ca2+ pada miofibril
b. eksitasi membran sel
di. transpor aktif ion Ca2+ ke dalam retikulum sarkoplasma
d.penutupan jembatan ke pusat aktif aktin
e. meluncurnya aktin ke dalam sarkomer
1. Fisiologi manusia. T. 2. M.: Mir, 1996.
2. Vasiliev V.A., Romanovsky Yu.N., Yakhno V.G. Proses gelombang otomatis. Moskow: Nauka, 1987.
3.Ivanitsky G.R., Krinsky V.I., Selkov E.E. Biofisika matematis sel. Moskow: Nauka, 1978.
4. Chernysh A.M. Biomekanik ketidakhomogenan otot jantung. Moskow: Nauka, 1993.
5. Bendol J. Otot, molekul, dan gerakan. M.: Mir, 1989.
BAGIAN 3. BIOFISIKA SISTEM KOMPLEKS
3.1. Pemodelan proses biofisik.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
Berapa lama setelah injeksi 10% dari massa awal obat akan tetap berada dalam darah jika konstanta ekskresi k = 0,3 (1/jam)?
Konstanta ekskresi dua obat yang berbeda berbeda dengan faktor dua. Gambarkan grafik kualitatif perubahan massa obat dalam darah selama injeksi untuk dua kasus ini. Berapa kali laju ekskresi berbeda pada t = O?
Beberapa saat setelah pasien diberi infus (ketika konsentrasi obat mencapai tingkat stasioner), ia diberi suntikan. Gambarlah grafik kualitatif perubahan massa obat dari waktu ke waktu.
Tes pemantauan model
3.1.1. Model predator-mangsa menunjukkan bahwa populasi predator dan mangsa melakukan osilasi harmonik. Apakah frekuensi dan fase osilasi ini sama?
sebuah. frekuensinya sama. fasenya sama
b. frekuensi berbeda d. fase berbeda
1. av 2. bv 3. ag 4. bg
3.1.2. Model apa yang memadai untuk studi elektrogenesis dalam sel?
1. liposom 2. membran lipid bilayer
3. akson cumi-cumi 4. Model Frank
3.2. Biofisika sistem peredaran darah.
Kontrol pertanyaan, tugas, tugas untuk seminar
Kompleks pendidikan dan metodologis pada disiplin "peraturan ekonomi negara"
Kompleks pelatihan dan metodologi... pendidikan-metodiskomplekspadadisiplin"PERATURAN NEGARA PEREKONOMIAN" UFA -2007 Peraturan negara bidang ekonomi: pendidikan-metodiskompleks... ilmu ekonomi pendidikan-metodiskomplekspadadisiplin"Negara...
Kompleks pendidikan dan metodologis dalam disiplin pelatihan profesional umum "teori dan metode pengajaran biologi" khusus "050102 65 - biologi"
Kompleks pelatihan dan metodologipendidikan-metodiskomplekspadaKompleks pelatihan dan metodologi
... __________________________________________________________ (Nama lengkap.) pendidikan-metodiskomplekspadadisiplin Organisasi komputer dan ... Samme G.V. pendidikan-metodiskomplekspadadisiplin Organisasi komputer dan sistem (nama disiplin ilmu) disusun...
Jari-jari kapal telah dibelah dua. Berapa kali kecepatan aliran darah volumetrik berubah dengan penurunan tekanan konstan?
Hitung tekanan darah pada jarak 5 cm dari awal pembuluh, jika pada awal pembuluh tekanannya 10 4 Pa, jari-jarinya 1 mm, kekentalan darah 0,005 Pa s, kecepatan linier dari darah adalah 20 cm/s.
Berapa kali laju penurunan tekanan pada awal diastol berubah jika tahanan hidrolik pembuluh kecil meningkat 20%?
Berapa kali hambatan hidrolik dari bagian aorta (jari-jari aorta 1,25 cm) lebih kecil dari hambatan hidrolik dari bagian arteri dengan panjang yang sama (jari-jari arteri 2,5 mm)? Viskositas darah di arteri adalah 0,9 dari viskositas darah di aorta.
Berapa kali tekanan darah harus meningkat pada awal pembuluh darah besar sehingga ketika lumennya menyempit sebesar 30%, tekanan di pintu keluar pembuluh darah dan laju aliran darah volumetrik tetap sama? Dengan tidak adanya penyempitan, penurunan tekanan di bejana adalah 0,2 dari tekanan di awal bejana.
dalam Biologi, Kandidat Ilmu Pediatrik, Associate Professor Osipova I.V. metodis instruksi kepada siswa pada mempelajari disiplin ilmuDisiplin"Metodologi ekstrakurikuler ...
1.Percobaan Pfefer, Hardy-Fischer, Overton. Sifat membran sel dan alternatif untuk membran sel.
2. Metode probe fluoresen dalam mempelajari membran sel.
3. Kapasitansi listrik spesifik membran akson, diukur dengan elektroda intraseluler, adalah 0,5 F/cm 2 . menggunakan rumus kapasitor datar, tentukan ketebalan lapisan hidrofobik membran. lipid dianggap sama dengan 2.
4.Mekanisme pembangkitan potensial aksi cardiomycetes.
5. Metode spin probe dalam mempelajari membran sel.
6. Berapa jarak pada permukaan membran eritrosit yang dilalui molekul fosfolipid dalam 1 detik sebagai akibat difusi lateral? Koefisien difusi lateral diambil sama dengan 10 -12 m 2 /s. bandingkan dengan keliling eritrosit yang berdiameter 8 m.
7. Struktur saluran ion.
8.Metode mikrokalorimetri diferensial.
9. Selama fase transisi fosfolipid membran dari bentuk kristal cair menjadi gel, ketebalan lapisan ganda berubah. Bagaimana kapasitansi membran berubah dalam kasus ini?
10. Kanal ion pada membran sel.
11. Analisis struktural sinar-X dalam studi membran sel. Prinsip dan contoh.
12. Selama fase transisi fosfolipid membran dari bentuk kristal cair ke gel, ketebalan lapisan ganda berubah. Bagaimana kekuatan medan listrik dalam membran berubah dalam kasus ini?
13. Arus ionik di akson. Model Hodgkin-Huxley.
14.Metode untuk mempelajari permeabilitas membran.
15. Dengan bantuan molekul fosfolipid berlabel spin, gradien ketebalan viskositas dalam membran ditetapkan. Jelaskan percobaan.
16.Mekanisme pembangkitan potensial aksi.
17. Penerapan konduktometri dalam studi membran. percobaan Fricke.
18. Dimana viskositas lapisan hidrofobik lebih tinggi: pada permukaan membran atau ketebalannya. Bagaimana cara menginstalnya?
19. Distribusi impuls saraf di sepanjang serat yang dapat dirangsang.
20. Fenomena elektrokinetik dalam sel dan suspensi.
21. Bagaimana difusi terfasilitasi ion kalium dengan partisipasi molekul valinomisin berubah setelah transisi fase lipid membran dari bentuk kristal cair ke gel?
22. Potensial aksi. mekanisme fisik.
23. Elektrosmosis pada sel dan jaringan hidup.
24. Apakah akan terjadi efek osmotik (pembengkakan pada larutan hipotonik dan kerutan pada larutan hipertonik) selama akumulasi ion natrium menurut skema antiport?
25. Potensi istirahat. sifatnya.
26. Sifat osmosis pada sel hidup.
27. Apakah akan terjadi efek osmotik (pembengkakan pada larutan hipotonik dan kerutan pada larutan hipertonik) selama akumulasi ion natrium menurut skema symport?
28. Sifat potensi bioelektrik.
29. Sel itu seperti osmometer. Contoh penentuan isotonisitas larutan menggunakan sel hidup.
30. Tunjukkan bahwa persamaan Nernst-Planck direduksi menjadi persamaan Fick untuk kasus difusi partikel tak bermuatan.
31. Perbedaan antara saluran protein dan pori-pori lipid.
32. Sifat pengendapan sel-sel mati. Fisik kimia dasar metode ESR.
33. Enzim Na + -K + - ATPase dalam membran plasma eritrosit telah menyelesaikan enam siklus. Berapa banyak ion natrium dan kalium yang diangkut secara aktif? Berapa banyak energi yang dihabiskan dalam kasus ini, jika hidrolisis satu mol ATP disertai dengan pelepasan 33,6 kJ?. Efisiensi kopling diasumsikan 100%.
34.mekanisme permeabilitas membran untuk molekul air. Hipotesis ketegaran.
35. Spektroskopi NMR dalam studi membran. Contoh dan prinsip.
36. Tiga pompa ion dikenal dalam membran sel: natrium-kalium, proton, dan kalsium. Bagaimana transpor aktif gula dan asam amino dilakukan?
37. Model pembentukan pori selama transisi fase.
38.Metode untuk mengukur mikroviskositas dalam membran.
39. Apakah transfer ion kalium dan natrium transmembran secara simultan dimungkinkan menurut skema symport?
40. pemecahan listrik lipid membran.
42.metode probe spektral.
43. Apakah transfer ion kalium dan natrium transmembran simultan dimungkinkan menurut skema antiport?
44. model pori lipid kritis.
45. penerapan elektroda selektif ion dalam studi permeabilitas membran.
46.Apakah transfer ion kalium dan natrium transmembran secara simultan dimungkinkan menurut skema uniport?
47. pori-pori lipid dalam hal stabilitas membran.
48. metode eritrogram. nilai informasi mereka.
49. Transpor ion apa yang menciptakan perbedaan potensial membran: pasif atau aktif?
50. Mekanisme dan pola transpor aktif sekunder ion.
51. Kriteria eksperimental untuk difusi terfasilitasi.
52. Berapakah kecepatan rambat sinyal listrik di sepanjang kabel telegraf laut atau kecepatan rambat impuls saraf di sepanjang membran akson? Mengapa?
53. Pompa ion elektrogenik.
54. Metode fraksinasi sel.
55. Bagaimana mekanisme biofisik kerja dari anestesi lokal tetraylammonium?
56. Pengalaman dan skema Ussing.
57. Sifat kekuatan interaksi lipid-lipid dalam membran. Metode penelitian.
Rencana tematik kalender untuk disiplin
"Organisasi molekuler membran biologis"
tahun ajaran 2011/2012 tahun (tahun ke-4, semester ke-7 Fasilitas Biofisika Seluruh Rusia)
tanggal nomor p / p Jenis dan nama modul pelatihan Dukungan pendidikan dan metodologis dari modul pelatihan KULIAH: Membran biologis sebagai formasi struktural dan fungsional universal sistem kehidupan. Ringkasan kuliah. Organisasi struktural biomembran. Ringkasan kuliah. Protein membran dan lipid. Ringkasan kuliah. Interaksi protein-lipid. Ringkasan kuliah. Sifat dinamis membran. Ringkasan kuliah. Pemodelan struktur membran. Ringkasan kuliah. Perhitungan struktur membran Ringkasan kuliah. JUMLAH - 14 jam Lokakarya * Perhitungan kapasitansi listrik dan impedansi membran. Kelas komputer departemen. Penentuan ketebalan membran eritrosit dengan konduktivitas listrik. Kelas komputer departemen. Studi kekuatan mekanik membran eritrosit. Kelas komputer departemen. Studi efek kolesterol pada deformabilitas membran eritrosit. Kelas komputer departemen. Perhitungan kekuatan membran eritrosit. Kelas komputer departemen. Studi pengaruh medan magnet pada sifat mekanik membran eritrosit Kelas komputer departemen. Total - 22 jam * - setiap pelajaran praktis dirancang selama 4 jam.
Disetujui pada rapat departemen _____________________________________________
1. Dari sini disimpulkan bahwa membran eritrosit terdiri dari molekul lipid yang tersusun dalam dua lapisan.
Rupanya, kesimpulan Gorter dan Grendel ini ternyata benar hanya karena saling kompensasi kesalahan, namun, secara historis, pekerjaan ini sangat penting, sejak itu konsep lipid bilayer sebagai dasar struktural biologis membran telah menjadi dominan dan ternyata benar.
Konsep membran lipid bimolekuler dikembangkan lebih lanjut dalam model Devson-Danielli 1935, atau model "sandwich", di mana protein diasumsikan menutupi permukaan lapisan ganda lipid. Ini adalah model yang luar biasa sukses, dan selama 30 tahun ke depan, banyak data eksperimen, terutama yang diperoleh dengan menggunakan difraksi sinar-X dan mikroskop elektron, sepenuhnya mengkonfirmasi kecukupannya. Namun, pada saat yang sama, ditemukan bahwa membran melakukan berbagai macam fungsi, dan untuk menjelaskan fenomena ini, model asli Devson-Danielli telah dimodifikasi berulang kali.
Kemajuan pesat dalam membranologi, yang telah menghasilkan pembentukan konsep-konsep modern, sebagian besar telah dicapai karena kemajuan dalam studi sifat-sifat protein membran. Studi mikroskopis elektron menggunakan metode geser-beku menunjukkan bahwa partikel globular tertanam dalam membran. Sementara itu, ahli biokimia yang menggunakan deterjen berhasil memisahkan membran menjadi "partikel" yang aktif secara fungsional. Data spektral menunjukkan bahwa protein membran dicirikan oleh kandungan heliks-a yang tinggi dan bahwa mereka mungkin membentuk globul daripada didistribusikan sebagai lapisan tunggal pada permukaan lapisan ganda lipid. Sifat nonpolar protein membran menunjukkan adanya kontak hidrofobik antara protein dan daerah nonpolar bagian dalam dari bilayer lipid. Pada saat yang sama, metode dikembangkan yang memungkinkan untuk mengungkapkan fluiditas lapisan ganda lipid. Singer dan Nicholson menyatukan semua ide ini untuk menciptakan model mosaik yang mengalir. Dalam model ini, membran direpresentasikan sebagai lapisan ganda fosfolipid cair, di mana protein yang berdifusi bebas direndam. Model lama Devson-Danielli statis dan berhasil menjelaskan data struktural yang tersedia pada saat itu, diperoleh pada resolusi yang cukup rendah. Pada saat yang sama, sejak tahun 1970, banyak perhatian telah diberikan pada studi sifat dinamis dan hubungannya dengan fungsi membran. Dalam beberapa tahun terakhir, model mosaik cair juga telah dimodifikasi, dan proses ini akan terus berlanjut. Secara khusus, sekarang menjadi jelas bahwa tidak semua protein membran berdifusi secara bebas dalam lapisan ganda lipid cair. Ada data tentang keberadaan domain-j lateral dalam membran itu sendiri. Peran sitoskeleton juga sedang dipelajari dengan cermat. Hal ini menjadi semakin jelas bahwa beberapa bagian dari membran tampak berbeda dalam struktur dari bilayer lipid klasik. Namun demikian, di masa mendatang, model mosaik fluida dalam berbagai modifikasinya akan berfungsi sebagai dasar konseptual untuk banyak studi membran.
3. Morfologi membranDua metode memainkan peran penting dalam menjelaskan morfologi membran: difraksi sinar-x dan mikroskop elektron. Dengan bantuan mereka kebenaran model bilayer dikonfirmasi. Namun, harus diingat bahwa kedua metode ini menghadapi sejumlah keterbatasan dalam menjelaskan gambaran rinci tentang organisasi molekuler membran.
3.1 difraksi sinar-X
Dalam studi sampel kristal yang sangat teratur menggunakan metode difraksi sinar-X, dimungkinkan untuk memperoleh informasi tentang struktur dengan resolusi tinggi. Dalam hal persiapan yang dipesan dengan buruk, kemungkinan metode ini terbatas. Beberapa sistem membran khusus sudah memiliki struktur yang teratur, dan oleh karena itu mereka dapat dipelajari dengan metode difraksi sinar-X. Contoh dari jenis ini adalah selubung mielin dari serabut saraf perifer; itu adalah membran yang, berulang kali membungkus akson, membentuk sistem struktur membran konsentris yang teratur. Studi difraksi sinar-X pada mielin, yang dilakukan pada tahun 1930-an, mengkonfirmasi kecukupan model membran bilayer. Kesimpulan yang sama ditarik oleh studi segmen luar batang retina vertebrata, yang merupakan sistem membran alami, serta sistem buatan yang terbentuk selama keruntuhan di bawah kondisi sentrifugasi vesikel membran yang diperoleh dari mitokondria dan eritrosit. . Dalam semua kasus ini, distribusi kerapatan elektron yang serupa dalam membran diamati, ditunjukkan pada Gambar. 1.4
Untuk menafsirkan data difraksi sinar-X, perlu untuk menentukan tidak hanya intensitas refleksi, tetapi juga fase mereka. Dalam kasus sistem membran yang dikemas secara teratur, masalahnya sangat disederhanakan, karena sistem ini terdiri dari elemen berulang dengan simetri pusat.
Data yang diperoleh menunjukkan bahwa struktur semua membran serupa: mereka memiliki daerah dalam hidrofobik dengan kerapatan elektron rendah dan dua lapisan gugus polar dengan kerapatan elektron tinggi. Data difraksi sinar-X yang diperoleh untuk membran yang berbeda hanya sedikit berbeda, meskipun ada perbedaan besar dalam kandungan proteinnya. Meskipun data difraksi sinar-X memberikan beberapa informasi tentang bagaimana sebagian besar protein membran terletak di dalam membran, secara umum, metode analisis difraksi sinar-X tidak memberikan gambaran molekuler yang terperinci.
Wilkins dkk mencatat pada tahun 1971 bahwa difraksi sinar-X juga dapat digunakan untuk mempelajari dispersi berair dari membran dan fosfolipid. Dalam hal ini, refleksi yang dihasilkan oleh daerah kutub di kedua sisi bilayer memungkinkan untuk menemukan ketebalannya sama dengan jarak antara kepala kutub, dan jarak antara rantai ini dapat ditentukan dari refleksi yang dihasilkan oleh rantai hidrokarbon yang dipesan. . Dalam hal ini juga, preparasi membran yang diperoleh dari sumber yang berbeda memberikan pola difraksi yang serupa, yang menegaskan universalitas model bilayer.
Ketidakmungkinan untuk memperoleh pola molekuler yang terperinci dengan menggunakan metode difraksi membatasi penerapan metode ini untuk mempelajari membran biologis. Namun, ini bisa sangat berguna dalam studi sistem lipid-aqueous yang dipesan.
3.2 Mikroskop elektron
Mikroskop elektron transmisi dari bagian tipis mielin, dan pada kenyataannya semua membran lainnya, mengungkapkan struktur tiga lapis karakteristik yang terdiri dari dua pita padat elektron yang dipisahkan oleh celah sekitar 80 A. Gambar ini sebagian besar diperoleh sebagai hasil pengolahan preparat dengan osmium tetroksida, biasanya digunakan dalam metode ini. Robertson menyebut struktur yang diamati "kesatuan" untuk menekankan universalitasnya, dan meskipun mekanisme molekuler pewarnaan membran dengan osmium tidak diketahui, struktur ini dianggap sebagai konfirmasi validitas model membran bilayer. Jelas, bagaimanapun, bahwa membran mungkin terpengaruh selama persiapan spesimen untuk mikroskop elektron transmisi. Secara khusus, diketahui bahwa pengobatan dengan osmium tetroksida menyebabkan hilangnya protein yang signifikan dari membran eritrosit. Dan meskipun struktur tiga lapisan yang diamati dalam kasus ini mencerminkan sampai batas tertentu organisasi membran bilayer, informasi lebih rinci tentang lokalisasi protein tidak dapat diperoleh dengan metode ini.
Beberapa informasi tentang susunan protein membran diberikan oleh metode baru, yang sekarang telah menjadi "klasik" - metode pembelahan-pembekuan dan etsa-beku. Dalam kasus ini, preparat dibekukan dengan cepat tanpa menyebabkan efek merusak, seperti saat mendapatkan irisan tipis. Proses persiapan obat meliputi operasi berikut.
Setelah pembekuan, sampel, yang merupakan suspensi sel atau membran, dipotong dengan pisau pada suhu rendah dalam ruang hampa tinggi. Kekuatan yang dihasilkan selama chipping mengarah pada pembentukan potongan yang melewati sampel. Ternyata ketika bidang yang dipotong melewati membran, yang terakhir terbelah terutama di sepanjang wilayah tengahnya dan terbelah menjadi dua bagian. Akibatnya, wilayah internal membran terpapar pada bidang pembelahan yang terbentuk.
Jika perlu, sampel dikenai etsa - sublimasi es yang biasa dilakukan dalam ruang hampa. Hal ini memungkinkan visualisasi yang lebih baik dari struktur permukaan membran sel.
Setelah itu, apa yang disebut replika dari permukaan yang terbuka diperoleh. Replika inilah yang dipelajari di bawah mikroskop elektron. Untuk mendapatkan replika, platinum pertama-tama diendapkan pada sampel pada sudut sekitar 45° untuk mengungkapkan karakteristik topologi preparasi. Kemudian replika platina tersebut diberi kekuatan mekanik dengan mengoleskan lapisan karbon di atasnya. Setelah itu preparat dicairkan, replikanya mengapung, dan ditangkap menggunakan jaring khusus.
Struktur paling khas yang diamati dalam studi membran dengan metode pembelahan beku adalah banyak partikel intramembran dengan diameter 80 hingga 100 , terletak di bidang pembelahan membran. Biasanya mereka terletak secara acak, tetapi kadang-kadang mereka membentuk kelompok. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa partikel-partikel ini kemungkinan merupakan protein membran. Anehnya, mikroskop elektron dari bagian tipis tidak mengungkapkan struktur seperti itu. Replika yang diperoleh dari dua bagian membran yang terbelah tidak selalu saling melengkapi secara topologi. Ini berarti bahwa beberapa partikel terikat hanya pada salah satu bagian dari membran. Data pemecahan beku banyak digunakan oleh Singer dan Nicholson dalam pengembangan model mosaik fluida membran, karena mereka secara meyakinkan menunjukkan bahwa protein globular terletak tidak hanya pada permukaan membran, tetapi juga di dalam bilayer.
Gambar 1.6 menunjukkan mikrograf elektron dari preparat proteoliposom yang direkonstruksi dari fosfatidilkolin telur dan preparat protein pita 3 yang tidak terfraksi dari membran eritrosit manusia; Sediaan diperoleh dengan metode pembekuan-pembelahan.
Protein pita 3 adalah komponen protein utama dari membran eritrosit dan diketahui mengangkut anion. Jika vesikel fosfolipid tidak mengandung protein ini, maka sediaan chip beku yang dihasilkan memiliki permukaan yang halus.
Setelah penggabungan protein pita 3 ke dalam vesikel fosfolipid, partikel intramembran muncul pada pembelahan, yang secara praktis tidak dapat dibedakan dari partikel yang diamati pada membran eritrosit. Selain itu, pada pH 5,5, partikel-partikel yang terlihat pada membran eritrosit beragregasi, dan agregasi ini dilakukan sebagai hasil interaksi protein pita 3 dengan dua protein lain, spektrin dan aktin.
Yang terakhir adalah komponen sitoskeleton yang terletak di permukaan bagian dalam membran eritrosit. Sistem yang direkonstruksi yang terdiri dari protein pita 3 dan fosfatidilkolin berperilaku serupa, dengan agregasi partikel diamati dengan adanya spektrin dan aktin pada pH 5,5, tetapi tidak pada pH 7,6.
Data ini semakin memperkuat konsep protein membran sebagai partikel globular yang bergerak bebas di bidang membran. Menariknya, mikrofotograf statis dari preparat yang diperoleh dengan metode freeze-chipping membantu para peneliti dalam mempelajari sifat-sifat dinamis membran. Seperti yang akan kita lihat, ada banyak protein dalam membran yang tidak dapat berenang bebas di lautan lipid.
4. Isolasi membranSelama tiga dekade terakhir, menjadi semakin jelas bahwa sebagian besar fungsi seluler dilakukan dengan keterlibatan langsung membran.
Baik sel tumbuhan dan hewan dibagi menjadi kompartemen, dan banyak organel sitoplasma, seperti yang ditunjukkan pada Bagian 1.1, bersifat membran.
Selain karakteristik organel sebagian besar sel, ada juga sistem membran khusus, seperti retikulum sarkoplasma sel otot, selubung mielin serabut saraf perifer, membran tilakoid kloroplas, dan membran cakram di batang retina. Organisme prokariotik juga memiliki membran, meskipun tidak berkembang seperti eukariotik.
Bakteri gram positif, seperti Bacillus subtilis, hanya memiliki membran sitoplasma, sedangkan bakteri Gram negatif, seperti Escherichia coli, juga memiliki membran luar yang terletak di atas dinding sel peptidoglikan yang tipis.
Beberapa organel khusus juga telah ditemukan dalam sel prokariotik. Beberapa virus patogen bagi hewan, seperti virus berselubung, memiliki membran sejati, dan membran semacam itu terbukti sangat menarik untuk dipelajari.
Studi tentang membran, sebagai suatu peraturan, dikaitkan dengan pemurniannya, dan setiap jenis membran dicirikan oleh kondisinya sendiri untuk isolasi preparatif.
Jadi, jika Anda harus mempelajari membran plasma sel apa pun, Anda harus terlebih dahulu mengisolasi sel-sel ini dari jaringan. Kondisi optimal untuk mengganggu sel dan memisahkan membran yang diinginkan dari komponen seluler lainnya harus dipilih. Kriteria kemurnian membran terisolasi layak mendapat perhatian khusus.
4.1 Penghancuran sel
Diinginkan untuk memilih teknik yang secara efektif menghancurkan sel-sel itu sendiri sambil mempertahankan struktur membran yang akan diisolasi. Untuk banyak sel hewan, prosedur yang relatif lembut seperti homogenisasi dalam Downs berdinding kaca atau homogenizer Potter-Elveheim dengan alu Teflon dapat digunakan. Dalam hal ini, sel-sel dihancurkan karena gaya geser yang terjadi ketika suspensi dipaksa melalui celah sempit antara alu teflon dan dinding kaca homogenizer. Dengan perawatan ini, membran plasma "rusak" dan ikatan antara berbagai organel dihancurkan sambil mempertahankan integritas organel itu sendiri. Dengan menggunakan prosedur ini, daerah khusus membran plasma juga dapat dipisahkan satu sama lain, misalnya, daerah basolateral atau apikal membran sel epitel. Diinginkan untuk beroperasi di bawah kondisi di mana integritas organel dipertahankan untuk meminimalkan kemungkinan pelepasan enzim hidrolitik dan untuk memfasilitasi operasi pemisahan membran berikutnya.
Untuk penghancuran sel dengan dinding, diperlukan metode yang lebih ketat. Kadang-kadang, sebelum sel dihancurkan, mereka terlebih dahulu diperlakukan dengan enzim yang memecah komponen dinding sel untuk memfasilitasi penghancuran selanjutnya. Misalnya, pengobatan dengan buffer Tris-EDTA dan lisozim digunakan untuk menghancurkan sel E. coli. Teknik yang lebih ketat termasuk menggosok sel, sonikasi mereka, dan ekstrusi mereka. Penggilingan biasanya dilakukan dengan adanya berbagai bahan abrasif - pasir, alumina atau manik-manik kaca. Sejumlah kecil material dapat ditumbuk dalam lesung dan alu, tetapi untuk volume yang lebih besar, perangkat mekanis khusus harus digunakan. Sel bakteri sering dihancurkan menggunakan ultrasound. Diyakini bahwa dalam kasus ini, kehancuran terjadi di bawah aksi gaya geser yang dihasilkan dari kavitasi. Kekuatan yang sama terjadi ketika suspensi sel dipaksa melalui lubang kecil, misalnya, ketika sel dihancurkan menggunakan mesin press Prancis. Ada banyak jenis metode ini, dan pilihannya tergantung pada karakteristik sistem membran yang akan dipelajari.
Perlu dicatat bahwa fragmen membran yang diperoleh selama penghancuran sel biasanya secara spontan membentuk vesikel. Contohnya adalah:
1) mikrosom yang berasal dari membran plasma, retikulum endoplasma, atau sistem khusus seperti membran sarkoplasma;
2) partikel submitochondrial dari membran mitokondria bagian dalam;
3) sinaptosom terbentuk ketika ujung saraf robek di area kontak sinaptik;
4) vesikel membran bakteri yang terbentuk dari membran plasma E. coli. Vesikel juga terbentuk dari sistem membran lain, misalnya, dari membran aparatus Golgi. Ukurannya dalam banyak kasus sangat tergantung pada metode penghancuran sel. Ini sangat penting, karena ukuran vesikel sangat menentukan laju sedimentasi selama sentrifugasi dan perilakunya pada tahap pemurnian membran selanjutnya. Beberapa membran tidak membentuk vesikel, khususnya membran permukaan lateral sel hewan yang bersentuhan satu sama lain. Ketika sel-sel tersebut dihancurkan, sepasang fragmen membran yang berdekatan robek, disatukan oleh area kontak. Kehadiran kontak semacam itu mencegah penutupan fragmen menjadi vesikel, oleh karena itu, membran dilepaskan dalam bentuk pelat atau struktur seperti pita.
Sangat penting dalam penghancuran sel juga merupakan pilihan media yang tepat. Misalnya, untuk menjaga agar organel membran tetap tertutup, seseorang harus menggunakan media yang isoosmotik terhadap isi internalnya. Paling sering, larutan sukrosa pada konsentrasi 0,25-0,30 M digunakan untuk ini.Dalam beberapa kasus, lebih baik menggunakan sorbitol dan manitol. Perlu dicatat bahwa pelestarian isotonisitas juga memainkan peran penting pada tahap selanjutnya dari isolasi preparatif organel utuh.
4.2 Pemisahan membran
Saat ini, sentrifugasi paling umum digunakan untuk memisahkan membran. Partikel membran dapat diklasifikasikan menurut laju sedimentasi atau kepadatan apungnya. Metode pertama disebut sentrifugasi zonal dan pemisahan terjadi sesuai dengan nilai S, dan yang kedua adalah sentrifugasi isopik dan pemisahan terjadi di bawah kondisi densitas kesetimbangan. Dalam prakteknya, beberapa hibrida dari dua metode ini biasanya digunakan. Gambar 1.7 menunjukkan posisi beberapa unit subselular pada bidang koordinat "S-g".
Absis menunjukkan koefisien sedimentasi partikel, dan ordinat menunjukkan densitas.
Prinsip pemisahan dengan laju sedimentasi dapat dengan mudah dipahami dengan membandingkan nilai S untuk fraksi yang berbeda. Misalnya, inti memiliki nilai S yang relatif tinggi, mis. tingkat sedimentasi mereka jauh lebih tinggi daripada kebanyakan organel subselular lainnya. Nukleus dapat dipelet secara selektif dengan sentrifugasi homogenat sel, meninggalkan semua organel lain di supernatan. Pada saat yang sama, retikulum endoplasma halus dan kasar tidak dapat dipisahkan dengan sentrifugasi zonal.
Perbedaan kerapatannya sering digunakan untuk mengisolasi fraksi membran yang berbeda dari homogenat sel. Untuk tujuan ini, sentrifugasi dalam gradien densitas dilakukan. Paling sering, sukrosa digunakan untuk membuat gradien kepadatan, tetapi metode ini memiliki kelemahan serius. Untuk mendapatkan kepadatan yang diperlukan untuk memisahkan fraksi membran yang berbeda, perlu untuk menyiapkan larutan dengan konsentrasi sukrosa tinggi, yang memiliki viskositas tinggi dan juga hipertonik. Pengenalan organel subselular ke dalam larutan sukrosa hipertonik menyebabkan dehidrasi, dan penyesuaian larutan selanjutnya ke kondisi isotonik sering disertai dengan lisis dan kerusakan organel. Masalah lain adalah bahwa banyak organel membran yang permeabel terhadap sukrosa. Hal ini juga dapat menyebabkan penghancuran osmotik organel. Penetrasi sukrosa ke dalam organel membran yang dapat dipisahkan dapat mengubah kerapatan efektifnya.
Tabel 1.1. Waktu fisik semakin banyak menggunakan media lain untuk membuat gradien kepadatan. Beberapa lingkungan ini tercantum dalam Tabel 1.1
Untuk mengatasi masalah ini, properti terakhir dari media gradien.
1. Ficoll. Polimer hidrofilik sukrosa dengan berat molekul tinggi, yang dapat digunakan untuk mendapatkan larutan dengan kepadatan C "hingga 1,2 g / ml. Keuntungan utamanya adalah tekanan osmotik larutan yang rendah dibandingkan dengan larutan dengan konsentrasi sukrosa yang setara. Oleh karena itu, dimungkinkan untuk membuat larutan yang isotonik di seluruh rentang konsentrasi karena penambahan tambahan sukrosa atau garam yang dapat diterima secara fisiologis dalam media. Kerugiannya adalah viskositas tinggi dari larutan yang dihasilkan dan ketergantungan viskositas dan osmolaritas non-linier yang signifikan pada konsentrasi.
2. Metrizamid. Glukosa benzamida tersubstitusi triiodo Larutan metrizamida memiliki densitas yang lebih tinggi daripada larutan ficoll pada konsentrasi yang sama. Keuntungan utama dari larutan metrizamide adalah viskositasnya yang sangat rendah, yang memungkinkan pemisahan lebih cepat.Larutan metrizamide 35% memiliki osmolaritas yang hampir fisiologis, sehingga sebagian besar operasi selama pemisahan membran dapat dilakukan tanpa memaparkannya ke larutan hipertonik. Sodium metrizoate adalah senyawa terkait dengan sifat yang mirip dengan metrizamide, dengan satu-satunya perbedaan bahwa larutannya isotonik pada konsentrasi sekitar 20%. Sodium metrizoate digunakan terutama untuk isolasi sel utuh. Naikodenz juga merupakan turunan dari asam triiodobenzoat, tetapi memiliki tiga rantai samping hidrofilik. Ketika disentrifugasi, ia dengan cepat mengembangkan gradien kepadatannya sendiri; digunakan untuk mengisolasi organel subseluler.
Perkol. Suspensi koloid silika gel dilapisi polivinilpirolidon. Lapisan ini mengurangi efek toksik dari silika gel. Keuntungan utama percoll adalah tidak menembus membran biologis, dan larutannya memiliki viskositas rendah dan osmolaritas rendah. Karena ukuran partikel yang besar, sentrifugasi larutan Percoll pada kecepatan sedang menghasilkan pembentukan gradien densitas. Oleh karena itu, pemisahan biasanya terjadi dengan sangat cepat. Media yang digunakan untuk sentrifugasi mungkin isotonik di seluruh volume karena masuknya garam atau sukrosa di dalamnya. Tidak sulit untuk membuat gradien lembut, yang memungkinkan pemisahan fraksi membran yang sangat efisien menurut kerapatan daya apungnya.
Sorbitol dan manitol. Zat-zat ini kadang-kadang digunakan sebagai pengganti sukrosa karena, menurut data yang dipublikasikan, mereka menembus beberapa membran biologis lebih buruk daripada sukrosa.
Perhatikan bahwa gliserol tidak digunakan untuk membuat gradien densitas karena tidak dapat mencapai nilai densitas yang cukup tinggi. Garam logam alkali seperti CsCl hanya digunakan jika larutan dengan densitas tinggi diperlukan. Namun, harus diingat bahwa pada konsentrasi yang diperlukan untuk menciptakan kepadatan keseimbangan, garam-garam ini sering memiliki efek merusak pada organel membran.
Metode lain juga digunakan untuk mengisolasi membran dari homogenat sel, meskipun tidak sesering sentrifugasi.
1. Distribusi fase. Dalam hal ini, pemisahan partikel membran terjadi sesuai dengan sifat permukaannya. Untuk tujuan ini, dua lapisan larutan berair yang tidak bercampur dari berbagai polimer yang larut dalam air terbentuk. Contohnya adalah campuran polietilen glikol dekstran dan dekstranfikol. Partikel membran dipisahkan menurut afinitasnya terhadap fase-fase ini. Yang terakhir ini dapat dipilih untuk memisahkan membran berdasarkan muatan permukaan atau hidrofobisitasnya.
Elektroforesis aliran bebas kontinu. Dalam hal ini, pemisahan partikel terjadi sesuai dengan muatan listriknya. Obat yang akan dibagi secara terus menerus dimasukkan ke dalam lapisan tipis buffer yang mengalir ke bawah dinding vertikal. Dalam hal ini, medan listrik diterapkan tegak lurus terhadap arah aliran. Dengan demikian, pemisahan partikel secara elektroforesis terjadi melintasi buffer yang mengalir, yang dikumpulkan di bagian bawah ruangan dalam bentuk fraksi terpisah.
adsorpsi afinitas. Pemisahan didasarkan pada interaksi biospesifik antara komponen membran dan fase padat. Dengan ditemukannya antibodi monoklonal, menjadi mungkin untuk menciptakan teknik persiapan berdasarkan penggunaan komponen antigenik spesifik untuk isolasi membran. Antibodi yang dihasilkan dapat dilekatkan secara kovalen pada penyangga padat dan dengan bantuannya untuk melakukan pengikatan spesifik dari masing-masing membran. Paling sering, metode ini digunakan untuk mengisolasi protein membran. Salah satu masalah yang muncul di sini adalah terkait dengan pemilihan kondisi elusi membran yang tidak akan menyebabkan denaturasi protein.
Sebuah metode berdasarkan penggunaan mikrogranul silika gel. Biasanya, bagian membran plasma tidak lebih dari 1°7o massa total semua membran sel eukariotik. Oleh karena itu, isolasi membran plasma yang benar-benar murni dikaitkan dengan kesulitan besar. Salah satu pendekatan yang telah dikembangkan secara khusus untuk isolasi membran plasma didasarkan pada penggunaan microbeads silika gel terkationisasi. Granula ini teradsorpsi kuat pada permukaan luar membran plasma sel utuh, dan fraksi membran plasma yang terkait dengan granula mudah dipisahkan dalam gradien densitas sukrosa dari membran lain karena densitas granula yang lebih tinggi. Fitur dari metode ini adalah bahwa dalam persiapan yang dihasilkan, membran plasma dengan permukaan bagian dalamnya diubah menjadi larutan.
4.3 Kriteria kemurnian untuk fraksi membran
Mungkin kriteria paling objektif untuk kemurnian fraksi membran yang diisolasi adalah adanya beberapa komponen unik di dalamnya yang hanya terkandung dalam membran ini atau dominan di dalamnya. Biasanya, komponen tersebut adalah enzim, yang dalam hal ini disebut penanda. Daftar enzim penanda yang digunakan untuk mengontrol kemurnian fraksi membran diberikan pada Tabel 1.2 Ketika menentukan aktivitas suatu enzim, harus diperhitungkan bahwa ia dapat dalam bentuk laten, misalnya, karena fakta bahwa itu terlokalisasi di permukaan bagian dalam vesikel membran yang disekresikan. Masalah lain yang terkait dengan evaluasi kemurnian membran terisolasi dipertimbangkan dalam tinjauan. Perlu dicatat bahwa metode yang direkomendasikan dalam banyak kasus dikembangkan dengan baik dan distandarisasi.
Dalam beberapa kasus, penanda membran yang lebih cocok bukanlah enzim, tetapi reseptor spesifik untuk lektin, hormon, toksin, atau antibodi. Jika sistem yang diteliti dikarakterisasi dengan baik, maka kemurnian fraksi membran dapat dinilai dari komposisi proteinnya yang ditentukan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dengan adanya natrium dodesil sulfat. Misalnya, membran luar bakteri Gram-negatif memiliki seperangkat polipeptida yang khas yang tidak ada dalam membran sitoplasma.
Tabel 1.2 Marker yang digunakan untuk mengontrol kemurnian fraksi membran yang diisolasi dari sel mamalia
Fraksi membran enzim penanda Membran plasma 5 "-Nukleotidase Fosfodiesterase alkali Na * / K + -ATPase (basolateral-
membran epitel sel) Adenilat siklase (basal membran hepatosit) Aminopeptidase (membran epitel batas sikat) Mitokondria (bagian dalam) Sitokrom c oksidase selaput) Suksinat-sitokrom c-oksida- reduktase Mitokondria (luar Monoamin oksidase selaput) Lisosom Asam fosfatase 0-Galaktosendase Peroksisom Katalase oksidase urat D-asam amino oksidase Membran peralatan Galaktosiltransferase golgi Endoplasma Glukosa-6-fosfatase retikulum Kolin fosfotransferase NADPH-sitokrom c-oksida- reduktase sitosol dehidrogenase laktat Kriteria lain yang dapat digunakan untuk menilai kemurnian membran meliputi morfologinya, yang dideteksi menggunakan mikroskop elektron, dan karakteristik komposisi kimianya. Misalnya, fraksi yang mewakili membran plasma, aparatus Golgi, atau mitokondria dapat diidentifikasi berdasarkan morfologinya. Dalam beberapa kasus, obat tersebut ditandai dengan kandungan kolesterol di dalamnya. Misalnya, membran mitokondria mengandung kolesterol jauh lebih sedikit daripada Golgi dan membran plasma.
Molekul deterjen per misel. Dalam penelitian membran, kisaran deterjen yang digunakan agak terbatas. Di meja. 1 menyajikan yang paling sering digunakan untuk pelarutan dan rekonstruksi membran. Deterjen ini dicirikan oleh nilai CMC yang agak tinggi (10-4-10-2 M) dan fakta bahwa mereka termasuk dalam kategori yang disebut deterjen lunak, yaitu, seperti ...
Pembentukan bilayer adalah sifat khusus dari molekul lipid dan diwujudkan bahkan di luar sel. Sifat paling penting dari lapisan ganda: - kemampuan untuk merakit sendiri - fluiditas - asimetri. 1.2. Meskipun sifat utama membran biologis ditentukan oleh sifat lapisan ganda lipid, sebagian besar fungsi spesifik disediakan oleh protein membran. Kebanyakan dari mereka menembus lapisan ganda dalam bentuk ...
Studi tentang protein yang terkandung dalam membran plasma eritrosit memungkinkan untuk merumuskan ide-ide baru tentang struktur membran. Secara khusus, ada asumsi bahwa setidaknya beberapa membran memiliki "kerangka". Membran eritrosit manusia mengandung lima protein utama dan sejumlah besar protein kecil. Sebagian besar protein membran adalah glikoprotein. Protein integral dalam membran eritrosit termasuk glikoforin ("pembawa gula"). Berat molekulnya adalah 30.000; glikoforin mengandung 130 residu asam amino dan banyak residu gula, yang merupakan sekitar 60% dari keseluruhan molekul. Di salah satu ujung rantai polipeptida adalah kepala hidrofilik dari struktur kompleks, yang mencakup hingga 15 rantai oligosakarida, yang masing-masing terdiri dari sekitar 10 residu gula. Di ujung lain rantai polipeptida glikoforin terdapat sejumlah besar residu asam glutamat dan aspartat (Gbr. 12-20), yang pada pH 7,0 membawa muatan negatif. Di tengah molekul, di antara dua ujung hidrofilik, ada bagian rantai polipeptida yang mengandung sekitar 30 residu asam amino hidrofobik. Ujung molekul glikoforin yang kaya gula terlokalisasi di permukaan luar membran eritrosit, menonjol darinya dalam bentuk semak. Dipercayai bahwa daerah hidrofobik yang terletak di tengah molekul glikoforin melewati lapisan ganda lipid, dan ujung kutub dengan residu asam amino bermuatan negatif terbenam dalam sitosol. Kepala glikoforin yang kaya gula mengandung penentu antigenik yang menentukan golongan darah (A, B, atau O). Selain itu, ia memiliki situs yang mengikat beberapa virus patogen.
Bagian protein penting lain dari membran eritrosit - spektrino - menyumbang hingga 20% dari jumlah total protein dalam membran.
Beras. 12-20. molekul glikoforin pada membran eritrosit. Rantai karbohidrat bercabang yang menonjol dari membran membawa situs spesifik yang menentukan golongan darah, serta situs yang bertanggung jawab untuk pengikatan virus tertentu.
Protein perifer ini terletak di permukaan bagian dalam membran; mudah untuk mengekstraknya. Molekul spektrin terdiri dari empat rantai polipeptida, berat molekul totalnya sekitar 1 juta; rantai ini membentuk batang fleksibel panjang 100-200 nm. Dengan mengikat protein dan lipid tertentu pada permukaan bagian dalam membran eritrosit, molekul spektrin membentuk kisi fleksibel, yang tampaknya memainkan peran kerangka membran. Mikrofilamen aktin juga mengikat spektrin, dan sangat mungkin mereka menghubungkan batang spektrin satu sama lain. Dengan demikian, kita dapat mengatakan bahwa membran eritrosit memiliki kerangka, atau kerangka, di mana lipid dan protein membran tertentu melekat (Gbr. 12-21).
Membran plasma sel lain memiliki struktur yang lebih kompleks.
Beras. 12-21. Representasi skematis dari bagian membran eritrosit. Skema menunjukkan "antena" oligosakarida yang dibentuk oleh glikoprotein dan glikolipid membran, rantai oligosakarida samping glikoforin, serta basis kerangka molekul spektrin yang melekat pada permukaan bagian dalam membran, saling berhubungan oleh filamen aktin pendek.
Pada permukaan luar sel di banyak jaringan padat, terdapat glikoprotein penting lainnya, fibronektin (Bag. 11.12), yang memiliki kemampuan rekat tinggi dan, mungkin, memberikan perlekatan sel-sel dengan tipe yang sama satu sama lain.
berlawanan arah
