Hampir semua reaksi biokimia adalah enzimatik. Enzim(biokatalis) adalah zat yang bersifat protein yang diaktifkan oleh kation logam. Sekitar 2000 enzim yang berbeda diketahui, dan sekitar 150 di antaranya telah diisolasi, beberapa di antaranya digunakan sebagai obat. Tripsin dan kimotripsin digunakan untuk mengobati bronkitis dan pneumonia; pepsin - untuk pengobatan gastritis; plasmin - untuk pengobatan serangan jantung; pancreatin - untuk pengobatan pankreas. Enzim berbeda dari katalis konvensional dalam (a) aktivitas katalitik yang lebih tinggi; (b) spesifisitas tinggi, yaitu tindakan selektif.

Mekanisme reaksi enzimatik substrat tunggal dapat diwakili oleh skema:

dimana E adalah enzim,

S - substrat,

ES - kompleks enzim-substrat,

R adalah produk reaksi.

Ciri-ciri reaksi enzimatis tahap pertama adalah Konstanta Michaelis (K M). K M adalah kebalikan dari konstanta kesetimbangan:

konstanta Michaelis (KM) mencirikan stabilitas kompleks enzim-substrat (ES). Semakin kecil konstanta Michaelis (KM), semakin stabil kompleks tersebut.

Laju reaksi enzimatik sama dengan laju langkah pembatas lajunya:

di mana k 2 adalah konstanta laju, yang disebut jumlah putaran atau aktivitas molekuler enzim.

aktivitas molekul enzim(k 2) sama dengan jumlah molekul substrat yang mengalami transformasi di bawah pengaruh satu molekul enzim dalam 1 menit pada 25 0 C. Konstanta ini mengambil nilai dalam kisaran: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Untuk urease, yang mempercepat hidrolisis urea, k 2 = 1,85∙10 6 menit‾ 1; untuk adenosin trifosfatase, yang mempercepat hidrolisis ATP, k 2 = 6,24∙10 6 menit‾ 1; untuk katalase, yang mempercepat penguraian H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 menit‾ 1.

Namun, persamaan kinetik dari reaksi enzimatik dalam bentuk yang diberikan di atas praktis tidak mungkin digunakan karena ketidakmungkinan menentukan secara eksperimental konsentrasi kompleks enzim-substrat (). Menyatakan dalam besaran lain, mudah ditentukan secara eksperimental, kita peroleh persamaan kinetika reaksi enzimatik, ditelepon Persamaan Michaelis-Menten (1913):

,

di mana hasil kali k 2 [E]tot adalah nilai konstanta, yang dilambangkan dengan (kecepatan maksimum).

Masing-masing:

Pertimbangkan kasus khusus persamaan Michaelis-Menten.

1) Pada konsentrasi substrat rendah, K M >> [S], oleh karena itu

yang sesuai dengan persamaan kinetik reaksi orde pertama.

2) Pada konsentrasi tinggi substrat K m<< [S], поэтому

yang sesuai dengan persamaan kinetik reaksi orde nol.

Jadi, pada konsentrasi substrat yang rendah, laju reaksi enzimatik meningkat dengan peningkatan kandungan substrat dalam sistem, dan pada konsentrasi substrat yang tinggi, kurva kinetik mencapai dataran tinggi (laju reaksi tidak tergantung pada konsentrasi substrat) ( Gambar 30).

Gambar 30. - Kurva kinetik reaksi enzimatik

Jika [S] = K M, maka

yang memungkinkan Anda untuk menentukan secara grafis konstanta Michaelis K m (Gbr. 31).

Gambar 31. - Definisi grafis dari konstanta Michaelis

Aktivitas enzim dipengaruhi oleh: (a) suhu, (b) keasaman medium, (c) adanya inhibitor. Pengaruh suhu pada laju reaksi enzimatik dibahas dalam bab 9.3.

Pengaruh keasaman media pada laju reaksi enzimatik ditunjukkan pada Gambar 32. Aktivitas maksimum enzim sesuai dengan nilai optimal nilai pH (pH opt).

Gambar 32. - Pengaruh keasaman larutan terhadap aktivitas enzim

Untuk sebagian besar enzim, nilai pH optimal bertepatan dengan nilai fisiologis (7,3 - 7,4). Namun, ada enzim yang membutuhkan lingkungan asam kuat (pepsin - 1,5-2,5) atau cukup basa (arginase - 9,5 - 9,9) untuk berfungsi normal.

Inhibitor enzim- Ini adalah zat yang menempati bagian dari pusat aktif molekul enzim, akibatnya laju reaksi enzimatik menurun. Kation logam berat, asam organik dan senyawa lain bertindak sebagai inhibitor.

Kuliah 11

Struktur atom

Ada dua definisi istilah "atom". Atom adalah partikel terkecil dari unsur kimia yang mempertahankan sifat kimianya.

Atom adalah mikrosistem bermuatan listrik netral yang terdiri dari inti bermuatan positif dan kulit elektron bermuatan negatif.

Doktrin atom telah berkembang jauh. Tahapan utama dalam pengembangan atomistik meliputi:

1) tahap filosofis alami - periode pembentukan konsep struktur atom materi, tidak dikonfirmasi oleh eksperimen (abad ke-5 SM - abad ke-16 M);

2) tahap pembentukan hipotesis tentang atom sebagai partikel terkecil dari suatu unsur kimia (abad XVIII-XIX);

3) tahap pembuatan model fisik yang mencerminkan kompleksitas struktur atom dan memungkinkan untuk menggambarkan sifat-sifatnya (awal abad ke-20)

4) tahap modern atomistik disebut mekanika kuantum. Mekanika kuantum adalah cabang fisika yang mempelajari gerak partikel elementer.

RENCANA

11.1. Struktur nukleus. Isotop.

11.2. Model mekanika kuantum dari kulit elektron atom.

11.3. Sifat fisika dan kimia atom.

Struktur nukleus. isotop

inti atom- Ini adalah partikel bermuatan positif, terdiri dari proton, neutron, dan beberapa partikel dasar lainnya.

Secara umum diterima bahwa partikel dasar utama dari nukleus adalah proton dan neutron. Proton (p) - itu adalah partikel elementer yang massa atom relatifnya 1 sma dan muatan relatifnya +1. Neutron (n) - itu adalah partikel elementer yang tidak memiliki muatan listrik, yang massanya sama dengan massa proton.

Inti atom mengandung 99,95% massa atom. Gaya nuklir khusus perpanjangan bertindak antara partikel elementer, secara signifikan melebihi gaya tolakan elektrostatik.

Sifat dasar atom adalah mengenakan biaya miliknya inti, sama dengan jumlah proton dan bertepatan dengan nomor urut unsur dalam sistem periodik unsur kimia. Kumpulan (jenis) atom dengan muatan inti yang sama disebut unsur kimia. Elemen dengan angka dari 1 hingga 92 ditemukan di alam.

isotop- Ini adalah atom dari unsur kimia yang sama yang mengandung jumlah proton yang sama dan jumlah neutron yang berbeda dalam nukleus.

di mana nomor massa (A) adalah massa inti, z adalah muatan inti.

Setiap unsur kimia adalah campuran isotop. Sebagai aturan, nama isotop bertepatan dengan nama unsur kimia. Namun, nama khusus telah diperkenalkan untuk isotop hidrogen. Unsur kimia hidrogen diwakili oleh tiga isotop:

Nomor p Nomor n

Protium H 1 0

Deuterium D 1 1

Tritium T 1 2

Isotop suatu unsur kimia dapat berupa stabil atau radioaktif. Isotop radioaktif mengandung inti yang secara spontan runtuh dengan pelepasan partikel dan energi. Stabilitas inti ditentukan oleh rasio neutron-protonnya.

Masuk ke dalam tubuh, radionuklida mengganggu jalannya proses biokimia yang paling penting, mengurangi kekebalan, membuat tubuh terkena penyakit. Tubuh melindungi diri dari efek radiasi dengan selektif menyerap unsur-unsur dari lingkungan. Isotop stabil lebih diutamakan daripada isotop radioaktif. Dengan kata lain, isotop stabil menghalangi akumulasi isotop radioaktif dalam organisme hidup (Tabel 8).

Buku S. Shannon "Nutrisi di Zaman Atom" memberikan data berikut. Jika dosis pemblokiran isotop yodium stabil, sama dengan ~ 100 mg, diminum selambat-lambatnya 2 jam setelah I-131 masuk ke dalam tubuh, maka penyerapan radioiodin di kelenjar tiroid akan berkurang 90%.

Radioisotop digunakan dalam pengobatan

untuk diagnosis penyakit tertentu,

untuk pengobatan segala bentuk kanker,

untuk studi patofisiologi.

Tabel 8 - Efek pemblokiran isotop stabil

Kinetika reaksi enzimatik. Kinetika mempelajari laju, mekanisme reaksi dan pengaruh faktor-faktor seperti konsentrasi enzim dan substrat, suhu, pH medium, keberadaan inhibitor atau aktivator.

Pada konsentrasi substrat yang konstan, laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Grafik ketergantungan laju reaksi enzimatik pada konsentrasi substrat berbentuk hiperbola sama kaki.

Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada konsentrasi enzim (a) dan substrat (b)

Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada konsentrasi substrat dijelaskan persamaan Michaelis-Menten:

di mana V adalah laju stasioner dari reaksi biokimia; Vmax - kecepatan maksimum; Km - konstanta Michaelis; [S] - konsentrasi substrat.

Jika konsentrasi substrat rendah, yaitu [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Kemudian

Jadi, pada konsentrasi substrat yang rendah, laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi substrat dan dijelaskan oleh persamaan orde pertama. Ini sesuai dengan bagian lurus awal dari kurva V = f[S] (gambar b).

Pada konsentrasi substrat tinggi [S] >> Km, ketika Km dapat diabaikan, persamaan Michaelis-Menten mengambil bentuk, yaitu. V = V maks.

Jadi, pada konsentrasi substrat yang tinggi, laju reaksi menjadi maksimum dan dijelaskan oleh persamaan orde nol. Ini sesuai dengan bagian dari kurva V = f [S], sejajar dengan sumbu x.

Pada konsentrasi substrat yang secara numerik sebanding dengan konstanta Michaelis, laju reaksi meningkat secara bertahap. Ini cukup konsisten dengan gagasan tentang mekanisme reaksi enzimatik:

di mana S adalah substrat; E - enzim; ES - kompleks enzim-substrat; P - produk; k1 adalah konstanta laju untuk pembentukan kompleks enzim-substrat; k2 adalah konstanta laju penguraian kompleks enzim-substrat dengan pembentukan reagen awal; k3 adalah konstanta laju penguraian kompleks enzim-substrat dengan pembentukan produk.

Tingkat Konversi Substrat dengan pembentukan produk (P) sebanding dengan konsentrasi kompleks enzim-substrat. Pada konsentrasi substrat yang rendah, larutan mengandung sejumlah molekul enzim bebas (E) yang tidak terikat menjadi kompleks (ES). Oleh karena itu, dengan peningkatan konsentrasi substrat, konsentrasi kompleks meningkat, dan akibatnya, laju pembentukan produk juga meningkat. Pada konsentrasi substrat yang tinggi, semua molekul enzim terikat ke dalam kompleks ES (fenomena saturasi enzim), oleh karena itu, peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi substrat praktis tidak meningkatkan konsentrasi kompleks, dan laju pembentukan produk tetap konstan.

Dengan demikian, arti fisik dari laju maksimum reaksi enzimatik menjadi jelas. Vmax adalah tingkat di mana suatu enzim bereaksi, yang ada seluruhnya sebagai kompleks enzim-substrat..

Konstanta Michaelis secara numerik sesuai dengan konsentrasi substrat di mana kecepatan stasioner sama dengan setengah maksimum. Konstanta ini mencirikan konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat:

Arti fisik dari konstanta Michaelis dalam hal itu mencirikan afinitas enzim untuk substrat. Km memiliki nilai kecil ketika k1 > (k2 + k3), yaitu. proses pembentukan kompleks ES menang atas proses disosiasi ES. Oleh karena itu, semakin rendah nilai Km, semakin besar afinitas enzim terhadap substrat. Sebaliknya, jika Km besar, maka (k2 + k3) > k1 dan proses disosiasi ES mendominasi. Dalam hal ini, afinitas enzim terhadap substrat rendah.

Inhibitor dan aktivator enzim . Inhibitor enzim disebut zat yang mengurangi aktivitas enzim. Setiap agen denaturasi (misalnya, garam logam berat, asam) adalah inhibitor enzim non-spesifik.

Inhibitor reversibel adalah senyawa yang berinteraksi secara non-kovalen dengan enzim. inhibitor ireversibel- ini adalah senyawa yang secara khusus mengikat gugus fungsi dari pusat aktif dan membentuk ikatan kovalen dengan enzim.

Inhibisi reversibel dibagi menjadi kompetitif dan non-kompetitif. Penghambatan kompetitif menunjukkan kesamaan struktural antara inhibitor dan substrat. Inhibitor menempati tempat di situs aktif enzim, dan sejumlah besar molekul enzim diblokir. Penghambatan kompetitif dapat dihilangkan dengan meningkatkan konsentrasi substrat. Dalam hal ini, substrat menggantikan inhibitor kompetitif dari situs aktif.

Penghambatan reversibel dapat tidak kompetitif mengenai substrat. Dalam hal ini, inhibitor tidak bersaing untuk tempat perlekatan enzim. Substrat dan inhibitor mengikat ke situs yang berbeda, sehingga ada kemungkinan pembentukan kompleks IE, serta kompleks IES terner, yang dapat terurai dengan pelepasan produk, tetapi pada tingkat yang lebih lambat daripada kompleks ES .

Oleh sifat tindakan Anda inhibitor dibagi menjadi:

• spesifik,
• tidak spesifik.

Inhibitor spesifik memiliki efeknya pada enzim, bergabung dengan ikatan kovalen di pusat aktif enzim dan mematikannya dari bidang aksi.

Penghambatan non-spesifik melibatkan efek pada enzim agen denaturasi (garam logam berat, urea, dll.). Dalam hal ini, sebagai akibat dari penghancuran struktur kuaterner dan tersier protein, aktivitas biologis enzim hilang.

Aktivator Enzim adalah zat yang meningkatkan laju reaksi enzimatik. Paling sering, ion logam (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, dll.) bertindak sebagai aktivator. Bedakan antara logam yang merupakan bagian dari metaloenzim, yaitu: kofaktor dan bertindak sebagai aktivator enzim. Kofaktor dapat mengikat kuat pada bagian protein enzim, tetapi untuk aktivator, mereka mudah dipisahkan dari apoenzim. Logam tersebut adalah peserta wajib dalam tindakan katalitik, yang menentukan aktivitas enzim. Aktivator meningkatkan efek katalitik, tetapi ketidakhadiran mereka tidak mencegah reaksi enzimatik berlangsung. Sebagai aturan, kofaktor logam berinteraksi dengan kelompok substrat bermuatan negatif. Sebuah logam dengan valensi variabel mengambil bagian dalam pertukaran elektron antara substrat dan enzim. Selain itu, mereka terlibat dalam pembentukan konformasi transisi yang stabil dari enzim, yang berkontribusi pada pembentukan kompleks ES yang lebih cepat.

Regulasi aktivitas enzim . Salah satu mekanisme utama untuk mengatur metabolisme adalah pengaturan aktivitas enzim. Salah satu contohnya adalah regulasi alosterik, regulasi oleh aktivator dan inhibitor. Sering terjadi bahwa produk akhir dari jalur metabolisme adalah penghambat enzim pengatur. Jenis penghambatan ini disebut retroinhibisi, atau inhibisi umpan balik negatif.

Banyak enzim diproduksi sebagai prekursor proenzim tidak aktif dan kemudian diaktifkan pada waktu yang tepat oleh proteolisis parsial. Proteolisis parsial- pembelahan bagian dari molekul, yang mengarah pada perubahan struktur tersier protein dan pembentukan pusat aktif enzim.

Beberapa enzim oligomer dapat mengubah aktivitasnya karena asosiasi - disosiasi subunit termasuk dalam komposisi mereka.

Banyak enzim dapat ditemukan dalam dua bentuk: sebagai protein sederhana dan sebagai fosfoprotein. Transisi dari satu bentuk ke bentuk lain disertai dengan perubahan aktivitas katalitik.

Laju reaksi enzimatik bergantung pada jumlah enzim, yang di dalam sel ditentukan oleh rasio laju sintesis dan peluruhannya. Cara mengatur laju reaksi enzimatik ini adalah proses yang lebih lambat daripada pengaturan aktivitas enzim.

Kinetika enzimatik mempelajari laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim tergantung pada berbagai kondisi (konsentrasi, suhu, pH, dll.) interaksinya dengan substrat.

Namun, enzim merupakan protein yang peka terhadap pengaruh berbagai pengaruh luar. Oleh karena itu, ketika mempelajari laju reaksi enzimatik, terutama konsentrasi reaktan diperhitungkan, dan pengaruh suhu, pH medium, aktivator, inhibitor, dan faktor lainnya dicoba untuk diminimalkan dan kondisi standar dibuat. Pertama, ini adalah nilai pH optimal media untuk enzim ini. Kedua, dianjurkan untuk menjaga suhu pada 25 ° C, jika memungkinkan. Ketiga, saturasi lengkap enzim dengan substrat tercapai. Poin ini sangat penting, karena pada konsentrasi substrat yang rendah, tidak semua molekul enzim berpartisipasi dalam reaksi (Gbr. 6.5, sebuah), yang artinya akan jauh dari hasil yang maksimal. Kekuatan tertinggi dari reaksi yang dikatalisis, hal-hal lain dianggap sama, dicapai jika setiap molekul enzim terlibat dalam transformasi, yaitu. pada konsentrasi tinggi kompleks enzim-substrat (Gbr. 6.5, di). Jika konsentrasi substrat tidak menjamin saturasi lengkap enzim (Gbr. 6.5, b), maka laju reaksi yang berlangsung tidak mencapai nilai maksimum.

Beras. 65.

sebuah - pada konsentrasi substrat rendah; 6 - dengan konsentrasi substrat yang tidak mencukupi; di - ketika enzim benar-benar jenuh dengan substrat

Laju reaksi enzimatik, diukur pada kondisi di atas, dan saturasi lengkap enzim dengan substrat disebut laju maksimum reaksi enzimatik (V).

Laju reaksi enzimatik, ditentukan ketika enzim tidak sepenuhnya jenuh dengan substrat, dilambangkan v.

Katalisis enzimatik dapat dijelaskan secara sederhana oleh skema

di mana F adalah enzim; S - substrat; FS - kompleks enzim-substrat.

Setiap tahap proses ini ditandai dengan kecepatan tertentu. Satuan untuk mengukur laju reaksi enzimatik adalah jumlah mol substrat yang diubah menjadi satuan waktu(seperti laju reaksi normal).

Interaksi enzim dengan substrat mengarah pada pembentukan kompleks enzim-substrat, tetapi proses ini reversibel. Laju reaksi maju dan reaksi balik tergantung pada konsentrasi reaktan dan dijelaskan oleh persamaan yang sesuai:

Persamaan (6.3) berlaku dalam kesetimbangan, karena laju reaksi maju dan reaksi balik adalah sama.

Dengan mensubstitusi laju reaksi langsung (6.1) dan reaksi balik (6.2) ke dalam persamaan (6.3), kita memperoleh persamaan:

Keadaan ekuilibrium dicirikan oleh persamaan konstanta kesetimbangan K p, sama dengan rasio konstanta reaksi langsung dan reaksi balik (6.5). Kebalikan dari konstanta kesetimbangan disebut konstanta substrat K s , atau konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat:

Dari persamaan (6.6) jelas bahwa konstanta substrat menurun pada konsentrasi tinggi kompleks enzim-substrat, yaitu. dengan stabilitas yang besar. Oleh karena itu, konstanta substrat mencirikan afinitas enzim dan substrat dan rasio konstanta laju untuk pembentukan dan disosiasi kompleks enzim-substrat.

Fenomena kejenuhan suatu enzim dengan substrat dipelajari oleh Leonor Michaelis dan Maud Mepten. Berdasarkan pemrosesan matematis dari hasil, mereka memperoleh persamaan (6.7), yang menerima namanya, dari mana jelas bahwa pada konsentrasi substrat yang tinggi dan nilai konstanta substrat yang rendah, laju reaksi enzimatik cenderung secara maksimal. Namun, persamaan ini terbatas karena tidak memperhitungkan semua parameter:

Kompleks enzim-substrat selama reaksi dapat mengalami transformasi dalam arah yang berbeda:

• terdisosiasi menjadi zat aslinya;
• diubah menjadi produk dari mana enzim dipisahkan tidak berubah.

Oleh karena itu, untuk menggambarkan efek keseluruhan dari proses enzimatik, konsep Konstanta Michaelis K t, yang menyatakan hubungan konstanta laju ketiga reaksi katalisis enzimatik (6.8). Jika kedua suku dibagi dengan konstanta laju reaksi pembentukan kompleks enzim-substrat, maka persamaan (6.9) akan diperoleh:

Akibat wajar penting berikut dari persamaan (6.9): konstanta Michaelis selalu lebih besar dari konstanta substrat dengan k 2 /kv

Secara numerik K t sama dengan konsentrasi substrat di mana laju reaksi setengah dari laju maksimum yang mungkin dan sesuai dengan kejenuhan enzim dengan substrat, seperti pada Gambar. 6.5, b. Karena dalam praktiknya tidak selalu mungkin untuk mencapai saturasi lengkap enzim dengan substrat, itu adalah K t digunakan untuk membandingkan karakteristik kinetik enzim.

Laju reaksi enzimatik dalam kasus kejenuhan yang tidak sempurna antara enzim dengan substrat (6.10) tergantung pada konsentrasi kompleks enzim-substrat. Koefisien proporsionalitas adalah konstanta reaksi untuk pelepasan enzim dan produk, karena ini mengubah konsentrasi kompleks enzim-substrat:

Setelah transformasi, dengan mempertimbangkan ketergantungan yang disajikan di atas, laju reaksi enzimatik dalam kasus saturasi enzim yang tidak lengkap dengan substrat dijelaskan oleh persamaan (6.11), yaitu. tergantung pada konsentrasi enzim, substrat dan afinitasnya Ks:

Ketergantungan grafis dari laju reaksi enzimatik pada konsentrasi substrat tidak linier. Seperti yang jelas dari Gambar. 6.6, dengan peningkatan konsentrasi substrat, peningkatan aktivitas enzim diamati. Namun, ketika saturasi maksimum enzim dengan substrat tercapai, laju reaksi enzimatik menjadi maksimum. Oleh karena itu, faktor yang membatasi laju reaksi adalah pembentukan kompleks enzim-substrat.

Praktek telah menunjukkan bahwa konsentrasi substrat, sebagai suatu peraturan, dinyatakan dalam nilai yang jauh lebih kecil dari satu (10 6 -10 3 mol). Cukup sulit untuk beroperasi dengan jumlah seperti itu dalam perhitungan. Oleh karena itu, G. Lineweaver dan D. Burke mengusulkan untuk menyatakan ketergantungan grafis dari laju reaksi enzimatik tidak dalam koordinat langsung, tetapi dalam koordinat terbalik. Mereka berangkat dari asumsi bahwa untuk nilai yang sama, timbal balik mereka juga sama:

Beras. 6.6.

Setelah transformasi ekspresi (6.13), sebuah ekspresi diperoleh, yang disebut Persamaan Lineweaver-Burk (6.14):

Ketergantungan grafis dari persamaan Lineweaver-Burk adalah linier (Gbr. 6.7). Karakteristik kinetik enzim ditentukan sebagai berikut:

• segmen yang dipotong pada sumbu y sama dengan 1/V;
• ruas yang terpotong pada sumbu x adalah -1 /Kt.

Beras. 6.7.

Diyakini bahwa metode Lineweaver - Burke memungkinkan Anda untuk lebih akurat menentukan laju reaksi maksimum daripada dalam koordinat langsung. Informasi berharga mengenai penghambatan enzim juga dapat diekstraksi dari grafik ini.

Ada cara lain untuk mengubah persamaan Michaelis-Menten. Ketergantungan grafis digunakan dalam mempelajari pengaruh berbagai pengaruh eksternal pada proses enzimatik.

Bagian enzimologi ini mempelajari pengaruh berbagai faktor pada laju reaksi enzimatik. Dengan mempertimbangkan persamaan umum katalisis enzimatik dari reaksi reversibel dari transformasi satu substrat menjadi satu produk (1),

faktor utama yang mempengaruhi laju reaksi enzimatik harus diberi nama: konsentrasi substrat [S], konsentrasi enzim [E], dan konsentrasi produk reaksi [P].

Interaksi beberapa enzim dengan substratnya dapat digambarkan dengan kurva hiperbolik ketergantungan laju reaksi enzimatik V pada konsentrasi substrat [S] (Gbr. 19):

Gambar 19. Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada konsentrasi substrat.

Tiga segmen dapat dibedakan pada kurva ini, yang dapat dijelaskan dengan posisi mekanisme interaksi enzim dengan substrat: OA adalah segmen ketergantungan berbanding lurus V pada [S], situs aktif enzim secara bertahap diisi dengan molekul substrat dengan pembentukan kompleks ES yang tidak stabil; bagian AB - ketergantungan lengkung V pada [S], saturasi lengkap dari pusat aktif enzim dengan molekul substrat belum tercapai. Kompleks ES sebelum mencapai keadaan transisi tidak stabil, kemungkinan disosiasi balik ke E dan S masih tinggi; bagian BC - ketergantungan dijelaskan oleh persamaan orde nol, bagian sejajar dengan sumbu [S], saturasi lengkap enzim aktif dengan molekul substrat tercapai, V=V max .

Bentuk karakteristik kurva dijelaskan secara matematis oleh persamaan Briggs-Haldane:

V=V maks ● [S]/ Km + [S] (2),

di mana Km adalah konstanta Michaelis-Menten, secara numerik sama dengan konsentrasi substrat di mana laju reaksi enzimatik sama dengan setengah V max .

Semakin rendah K m enzim, semakin tinggi afinitas enzim untuk substrat, semakin cepat keadaan transisi untuk substrat tercapai, dan berubah menjadi produk reaksi. Pencarian nilai Km untuk masing-masing substrat enzim dengan spesifisitas kelompok penting dalam menentukan peran biologis enzim ini di dalam sel.

Untuk sebagian besar enzim, tidak mungkin untuk membuat kurva hiperbolik (Gbr. 19) Dalam hal ini, metode timbal balik ganda (Lineweaver-Burk) digunakan, yaitu. ketergantungan grafis 1/[V] pada 1/[S] diplot (Gbr. 20). Metode pembuatan kurva seperti itu dalam percobaan sangat mudah ketika mempelajari pengaruh berbagai jenis inhibitor pada aktivitas enzim (lihat teks di bawah).

Gambar 20. Plot 1/[V] versus 1/[S] (metode Lineweaver-Burk),

dimana y-cut-off area - , dan x – cut-off area - , garis singgung sudut - .

Ketergantungan laju reaksi enzimatik V pada konsentrasi enzim [E].

Ketergantungan grafis ini (Gbr. 21) dianggap pada suhu dan pH optimal lingkungan, pada konsentrasi substrat yang jauh lebih tinggi daripada konsentrasi saturasi situs aktif enzim.

Beras. 21. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi enzimatik.

Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada konsentrasi kofaktor atau koenzim. Untuk enzim kompleks, harus diingat bahwa kekurangan bentuk koenzim vitamin dalam hipovitaminosis, pelanggaran asupan ion logam ke dalam tubuh tentu menyebabkan penurunan konsentrasi enzim yang sesuai yang diperlukan untuk proses metabolisme. proses. Oleh karena itu, harus disimpulkan bahwa aktivitas enzim secara langsung tergantung pada konsentrasi kofaktor atau koenzim.

Pengaruh konsentrasi produk pada laju reaksi enzimatik. Untuk reaksi reversibel yang terjadi dalam tubuh manusia, harus diperhitungkan bahwa produk reaksi langsung dapat digunakan oleh enzim sebagai substrat untuk reaksi balik. Oleh karena itu, arah aliran dan momen mencapai Vmax bergantung pada rasio konsentrasi substrat awal dan produk reaksi. Misalnya, aktivitas alanine aminotransferase, yang mengkatalisis transformasi:

Alanin + Alfa-ketoglutarat Piruvat + Glutamat

tergantung di dalam sel pada rasio konsentrasi:

[alanin + alfa-ketoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MEKANISME AKSI ENZIM. TEORI KATALISIS ENZIM

Enzim, seperti katalis non-protein, meningkatkan laju reaksi kimia karena kemampuannya untuk menurunkan energi aktivasi reaksi tersebut. Energi aktivasi reaksi enzimatik dihitung sebagai selisih antara nilai energi dalam sistem reaksi yang sedang berlangsung yang telah mencapai keadaan transisi dan energi yang ditentukan pada awal reaksi (lihat grafik ketergantungan pada Gambar 22).

Beras. 22. Ketergantungan grafis dari keadaan energi reaksi kimia tanpa enzim (1) dan dengan adanya enzim (2) pada waktu reaksi.

Karya V. Henry dan, khususnya, L. Michaelis, M. Menten tentang studi mekanisme reaksi enzimatik reversibel monosubstrat memungkinkan untuk mendalilkan bahwa enzim E pertama secara reversibel dan relatif cepat bergabung dengan substratnya S untuk membentuk kompleks enzim-substrat (ES):

E+S<=>ES (1)

Pembentukan ES terjadi karena ikatan hidrogen, elektrostatik, interaksi hidrofobik, dalam beberapa kasus kovalen, ikatan koordinasi antara radikal samping residu asam amino dari pusat aktif dan gugus fungsi substrat. Dalam enzim kompleks, bagian non-protein dari struktur juga dapat melakukan fungsi kontak dengan substrat.

Kompleks enzim-substrat kemudian dipecah dalam reaksi reversibel kedua yang lebih lambat untuk membentuk produk reaksi P dan enzim bebas E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

Saat ini, berkat karya para ilmuwan yang disebutkan di atas, serta Kaylin D., Chance B., Koshland D. (teori "kesesuaian yang diinduksi"), ada ketentuan teoretis tentang empat poin utama dalam mekanisme kerja enzim pada substrat, yang menentukan kemampuan enzim untuk mempercepat reaksi kimia.

1. Orientasi dan kedekatan . Enzim mampu mengikat molekul substrat sedemikian rupa sehingga ikatan yang diserang oleh enzim tidak hanya terletak di sekitar gugus katalitik, tetapi juga berorientasi dengan benar terhadapnya. Probabilitas kompleks ES akan mencapai keadaan transisi karena orientasi dan pendekatan sangat meningkat.

2. Stres dan ketegangan : kecocokan yang diinduksi. Perlekatan substrat dapat menyebabkan perubahan konformasi pada molekul enzim, yang menyebabkan ketegangan pada struktur situs aktif, serta agak merusak substrat terikat, sehingga memfasilitasi pencapaian keadaan transisi oleh kompleks ES. Ada apa yang disebut korespondensi induksi antara molekul E dan S.

PEKERJAAN KURSUS

Kinetika reaksi enzimatik

pengantar

Dasar kehidupan organisme apa pun adalah proses kimia. Hampir semua reaksi dalam organisme hidup berlangsung dengan partisipasi biokatalis alami - enzim.

Berzelius pada tahun 1835 untuk pertama kalinya menyarankan bahwa reaksi organisme hidup dilakukan karena kekuatan baru, yang disebutnya "katalitik". Dia memperkuat ide ini terutama dengan pengamatan eksperimental: diastase dari kentang menghidrolisis pati lebih cepat daripada asam sulfat. Pada awal tahun 1878, Kuhne menyebut zat yang memiliki kekuatan katalitik dalam organisme hidup sebagai enzim.

Kinetika kerja enzim adalah cabang dari enzim yang mempelajari ketergantungan laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim pada sifat kimia dan kondisi interaksi substrat dengan enzim, serta pada faktor lingkungan. Dengan kata lain, kinetika enzim memungkinkan untuk memahami sifat mekanisme aksi molekuler dari faktor-faktor yang mempengaruhi laju katalisis enzimatik. Bagian ini dibentuk di persimpangan ilmu-ilmu seperti biokimia, fisika dan matematika. Upaya paling awal untuk menggambarkan reaksi enzimatik secara matematis dilakukan oleh Duclos pada tahun 1898.

Sebenarnya, bagian tentang studi enzim ini sangat penting di zaman kita, yaitu untuk pengobatan praktis. Ini memberi ahli farmakologi alat untuk mengubah metabolisme sel, sejumlah besar obat-obatan dan berbagai racun - ini adalah penghambat enzim.

Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mempertimbangkan pertanyaan tentang ketergantungan laju reaksi pada berbagai faktor, bagaimana laju reaksi dapat dikendalikan dan bagaimana hal itu dapat ditentukan.

1. Kinetika Michaelis-Menten

Percobaan pendahuluan pada studi kinetika reaksi enzimatik menunjukkan bahwa laju reaksi, bertentangan dengan harapan teoritis, tidak bergantung pada konsentrasi enzim (E) dan substrat (S) dengan cara yang sama seperti dalam kasus konvensional. reaksi orde dua.

Brown dan, terlepas dari dia, Henri adalah orang pertama yang mengajukan hipotesis tentang pembentukan kompleks enzim-substrat selama reaksi. Kemudian asumsi ini dikonfirmasi oleh tiga fakta eksperimental:

a) papain membentuk senyawa yang tidak larut dengan fibrin (Wurtz, 1880);

b) substrat invertase sukrosa dapat melindungi enzim dari denaturasi termal (O'Sullivan dan Thompson, 1890);

c) enzim telah terbukti menjadi katalis stereokimia tertentu (Fischer, 1898-1899).

Mereka memperkenalkan konsep kecepatan maksimum dan menunjukkan bahwa kurva saturasi(yaitu, ketergantungan laju reaksi pada konsentrasi substrat) adalah hiperbola sama kaki. Mereka membuktikan bahwa kecepatan maksimum yang diamati adalah salah satu asimtot pada kurva, dan segmen dipotong pada sumbu x (di wilayah nilai negatifnya) oleh asimtot kedua, yaitu. konstan dalam persamaan laju, sama dalam nilai absolut dengan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai setengah dari laju maksimum.

Michaelis dan Menten menyarankan bahwa laju reaksi ditentukan oleh pemecahan kompleks ES, yaitu konstanta k2 . Ini hanya mungkin dalam kondisi bahwa k 2 adalah konstanta laju terkecil. Dalam hal ini, kesetimbangan antara kompleks enzim-substrat, enzim bebas dan substrat terbentuk dengan cepat dibandingkan dengan laju reaksi (keseimbangan cepat).

Laju reaksi awal dapat dinyatakan dengan rumus berikut:

v = k2

Karena konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat adalah

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

maka konsentrasi enzim bebas dapat dinyatakan sebagai

[E]=K S / [S]

Konsentrasi total enzim dalam campuran reaksi ditentukan oleh rumus

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Reaksi mencapai tingkat maksimumnya ketika konsentrasi substrat cukup tinggi sehingga semua molekul enzim berada dalam bentuk kompleks ES (kelebihan substrat yang sangat besar). Rasio kecepatan awal dengan kecepatan maksimum yang mungkin secara teoritis sama dengan rasio [ES] terhadap [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Ini adalah persamaan klasik Michaelis dan Menten, yang, sejak diterbitkan pada tahun 1913, telah menjadi prinsip dasar semua studi kinetik enzim selama beberapa dekade dan, dengan beberapa keterbatasan, tetap demikian hingga hari ini.

Kemudian ditunjukkan bahwa persamaan Michaelis-Menten asli memiliki beberapa kendala. Itu adil, yaitu menggambarkan dengan benar kinetika reaksi yang dikatalisis oleh enzim ini hanya jika semua kondisi restriktif berikut terpenuhi:

) kompleks enzim-substrat yang stabil secara kinetik terbentuk;

) konstanta K S adalah konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat: ini benar hanya jika ;

) konsentrasi substrat tidak berubah selama reaksi, mis. konsentrasi substrat bebas sama dengan konsentrasi awalnya;

) produk reaksi dengan cepat terputus dari enzim, yaitu tidak ada jumlah yang signifikan secara kinetik dari kompleks ES yang terbentuk;

) tahap kedua reaksi tidak dapat diubah; lebih tepatnya, kami hanya memperhitungkan kecepatan awal, ketika reaksi balik (karena kurangnya produk yang sebenarnya) masih dapat diabaikan;

) hanya satu molekul substrat yang mengikat setiap sisi aktif enzim;

) untuk semua reaktan, konsentrasinya dapat digunakan sebagai pengganti aktivitas.

Persamaan Michaelis-Menten berfungsi sebagai titik awal untuk setiap deskripsi kuantitatif dari aksi enzim. Harus ditekankan bahwa perilaku kinetik sebagian besar enzim jauh lebih rumit daripada yang mengikuti skema ideal yang mendasari persamaan Michaelis-Menten. Dalam menurunkan persamaan ini, diasumsikan bahwa hanya ada satu kompleks enzim-substrat. Sementara itu, pada kenyataannya, pada sebagian besar reaksi enzimatik, paling tidak terbentuk dua atau tiga kompleks seperti itu, yang muncul dalam urutan tertentu.

Di sini, EZ menunjukkan kompleks yang sesuai dengan keadaan transisi yang sebenarnya, dan EP menunjukkan kompleks antara enzim dan produk reaksi. Dapat juga ditunjukkan bahwa dalam sebagian besar reaksi enzimatik, lebih dari satu substrat terlibat dan dua atau lebih produk terbentuk, masing-masing. Pada reaksi dengan dua substrat, S 1 dan S 2 , dapat terbentuk tiga kompleks enzim-substrat, yaitu ES 1 , ES 2 dan ES 1 S 2 . Jika reaksi menghasilkan dua produk, P 1 dan P 2 , maka mungkin ada setidaknya tiga kompleks tambahan EP 1 , EP 2 dan EP 1 P 2 . Dalam reaksi seperti itu, ada banyak langkah antara, yang masing-masing dicirikan oleh konstanta lajunya sendiri. Analisis kinetik reaksi enzimatik yang melibatkan dua atau lebih reaktan seringkali sangat kompleks dan membutuhkan penggunaan komputer elektronik. Namun, ketika menganalisis kinetika semua reaksi enzimatik, titik awalnya selalu persamaan Michaelis-Menten yang dibahas di atas.

1.1 Sifat konstantaKdalam persamaan

persamaan kinetika reaksi enzimatik

Postulat kedua menyatakan bahwa konstanta K S dalam persamaan adalah konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat.

Briggs dan Haldane membuktikan pada tahun 1925 bahwa persamaan Michaelis-Menten asli hanya berlaku untuk , yaitu. ketika keseimbangan tahap dasar E+S ES ditetapkan dengan sangat cepat dibandingkan dengan laju tahap berikutnya. Oleh karena itu, mekanisme kinetik seperti itu (mematuhi kondisi awal Michaelis-Menten dan memiliki satu tahap dasar lambat, yang dengannya kesetimbangan di semua tahap dasar lainnya ditetapkan dengan cepat) disebut memenuhi asumsi "keseimbangan cepat". Namun, jika k 2 sebanding dalam urutan besarnya dengan k -1 , perubahan konsentrasi kompleks enzim-substrat dari waktu ke waktu dapat dinyatakan dengan persamaan diferensial berikut:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Karena kita sedang mempertimbangkan laju reaksi awal, yaitu saat reaksi balik belum terjadi, dan tahap pra-stasioner telah berlalu, maka karena kelebihan substrat, jumlah kompleks enzim-substrat yang terbentuk sama dengan jumlah yang terdekomposisi. ( prinsip stasioneritas, atau kinetika Briggs dan Haldane, atau prinsip Bodenstein dalam kinetika kimia) dan memang benar bahwa

t/t=0

Mengganti ini ke dalam persamaan diferensial, kami memperoleh ekspresi untuk konsentrasi enzim bebas:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Persamaan keadaan tunak:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Karena v = k 2 , maka diperoleh

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

Pada kasus ini

V maks = k 2 [E] T

dan sama dengan kecepatan maksimum yang diperoleh dari persamaan Michaelis-Menten. Namun, konstanta penyebut persamaan Michaelis-Menten bukanlah K S , itu. bukan konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat, tetapi yang disebut Konstanta Michaelis:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m sama dengan K S hanya jika .

Dalam hal ini, konstanta penyebut persamaan kecepatan dinyatakan dengan rumus

K k \u003d k 2 / k 1

dan disebut, menurut Van Slyke, konstanta kinetik.

Persamaan keadaan tunak juga dapat diperoleh dari persamaan diferensial tanpa asumsi bahwa d / dt = 0. Jika kita substitusikan nilai [E] = [E] T - ke dalam persamaan diferensial, setelah transformasi kita peroleh

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Untuk mendapatkan persamaan keadaan tunak dari persamaan ini tidak harus d / dt = 0. Cukup pertidaksamaan d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Persamaan keadaan tunak terdiferensiasi terlihat seperti ini:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Ekspresi ini jelas tidak sama dengan 0.

1.2 Transformasi persamaan Michaelis-Menten

Persamaan Michaelis-Menten asli adalah persamaan hiperbolik, di mana salah satu konstanta (V max) adalah asimtot pada kurva. Konstanta lain (K m), nilai negatifnya ditentukan oleh asimtot kedua, sama dengan konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai V max / 2. Ini mudah diverifikasi, karena jika

v=Vmaks / 2, maka

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], mis. [S] = K m untuk v = V maks /2.

Persamaan Michaelis-Menten dapat diubah secara aljabar menjadi bentuk lain yang lebih sesuai untuk representasi grafis dari data eksperimen. Salah satu transformasi yang paling umum adalah dengan menyamakan kebalikan sisi kiri dan kanan persamaan

Sebagai hasil dari transformasi, kami memperoleh ekspresi

yang menyandang nama Persamaan Lineweaver-Burk. Menurut persamaan ini, grafik yang diplot pada koordinat 1/[S] dan 1/v adalah garis lurus, yang kemiringannya sama dengan K m /V max , dan ruas yang dipotong pada sumbu y adalah sama untuk 1/V maks. Grafik timbal balik ganda seperti itu memiliki keuntungan yang memungkinkan untuk menentukan V max lebih tepat; pada kurva yang diplot dalam koordinat [S] dan v, V max adalah kuantitas asimtotik dan ditentukan dengan kurang akurat. Segmen yang terpotong pada sumbu x pada plot Lineweaver-Burk sama dengan -1/K m . Informasi berharga mengenai penghambatan enzim juga dapat diekstraksi dari grafik ini.

Transformasi lain dari persamaan Michaelis-Menten adalah kedua ruas persamaan Lineweaver-Burk dikalikan dengan V max *v dan setelah beberapa transformasi tambahan kita peroleh

Plot yang sesuai dalam koordinat v dan v/[S] direpresentasikan dengan e 4, gambar. satu]. Grafik seperti itu ( Bagan Edie-Hofsty) tidak hanya memungkinkan untuk dengan mudah menentukan nilai V max dan K m , tetapi juga memungkinkan Anda untuk mengidentifikasi kemungkinan penyimpangan dari linearitas yang tidak terdeteksi pada plot Lineweaver-Burk.

Persamaan juga dapat dilinierkan dalam bentuk lain

[S] / v = K m / V maks + [S] / V maks

Dalam hal ini, ketergantungan [S] / v pada [S] harus dibangun. Kemiringan garis lurus yang dihasilkan adalah 1/V max; segmen yang dipotong pada sumbu ordinat dan absis masing-masing sama dengan (K m / V max) dan (- K m). Bagan ini dinamai menurut nama penulisnya Bagan Haynes.

Analisis statistik menunjukkan bahwa metode Edie-Hofstee dan Haynes memberikan hasil yang lebih akurat daripada metode Lineweaver-Burk. Alasan untuk ini adalah bahwa dalam grafik Edie - Hofstee dan Haynes, variabel dependen dan independen termasuk dalam nilai yang diplot pada kedua sumbu koordinat.

1.3 Pengaruh konsentrasi substrat pada kinetika reaksi

Dalam banyak kasus, kondisi konsentrasi substrat yang konstan tidak terpenuhi. Di satu sisi, kelebihan substrat tidak digunakan dalam reaksi in vitro dengan beberapa enzim karena sering terjadi penghambatan aktivitas enzimatik substrat. Dalam hal ini, hanya konsentrasi optimalnya yang dapat digunakan, dan ini tidak selalu memberikan kelebihan substrat yang diperlukan untuk memenuhi persamaan kinetik dari mekanisme yang dibahas di atas. Selain itu, dalam sel in vivo, kelebihan substrat yang dibutuhkan untuk memenuhi kondisi ini biasanya tidak tercapai.

Dalam reaksi enzimatik dimana substrat tidak berlebihan dan, oleh karena itu, konsentrasinya berubah selama reaksi, konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat adalah

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - konsentrasi substrat pada t = 0). Dalam hal ini, laju reaksi awal (dalam keadaan tunak) diberikan oleh

v= V maks / (K m + )

dimana adalah konsentrasi substrat pada suatu titik waktu.

Namun, dimungkinkan untuk menulis solusi perkiraan untuk dua kasus di mana [S] o = :

) jika pertidaksamaan ini dipenuhi karena nilai t yang besar, mis. ketika lebih dari 5% dari konsentrasi awal substrat dikonsumsi selama reaksi;

) jika konsentrasi enzim tidak dapat diabaikan dibandingkan dengan konsentrasi substrat dan dengan demikian konsentrasi kompleks enzim-substrat harus diperhitungkan.

Jika t besar dan konsentrasi dapat diabaikan dibandingkan dengan [S] 0 , maka persamaan untuk konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat menjadi sebagai berikut:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Untuk nilai konsentrasi , yang berubah selama reaksi, nilai ([S] 0 + )/2 berfungsi sebagai perkiraan yang memuaskan. Karena = [S] 0 - [P], kecepatan rata-rata; dapat dinyatakan sebagai

Mengganti ekspresi ini dan nilai perkiraan menjadi

v= V maks / (K m + ),

kita mendapatkan:

Saat membandingkan nilai yang dihitung berdasarkan pendekatan ini dengan nilai yang diperoleh dari persamaan Michaelis-Menten yang eksak dan terintegrasi, ternyata kesalahan dalam menentukan K m adalah 1 dan 4% ketika menghabiskan 30 dan 50% substrat, masing-masing. Oleh karena itu, kesalahan dalam pendekatan ini dapat diabaikan dibandingkan dengan kesalahan pengukuran.

Ketika konsumsi substrat tidak melebihi 5% dari konsentrasi awal, tetapi konsentrasi enzim sangat tinggi sehingga, dibandingkan dengan [S] 0, tidak dapat diabaikan, konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat adalah sama ke:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Solusinya tentang memberi

Dari dua solusi yang mungkin, hanya solusi negatif yang dapat dipilih, karena hanya memenuhi kondisi awal: = 0 pada [S] 0 = 0 atau [E] T = 0. Dengan analogi dengan persamaan untuk rasio v/V max, kita telah memperoleh persamaan kecepatan awal. Persamaan kuadrat yang diperoleh dari persamaan konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat, ditemukan tepat di atas, menggunakan rumus v \u003d k 2 dan V max \u003d k 2 [E] T, dapat direduksi menjadi bentuk berikut:

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Dua kasus yang membatasi harus dipertimbangkan. Dalam kasus pertama [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

Jadi, kita telah memperoleh reaksi orde pertama yang tampak dan k=V max /K m - konstanta kinetik orde pertama yang tampak. Dimensi sebenarnya adalah waktu -1 , tetapi merupakan kombinasi dari konstanta laju orde pertama dan kedua dari beberapa tahap dasar, yaitu. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Di bawah kondisi orde pertama yang jelas k adalah ukuran kemajuan reaksi.

Kasus pembatas lainnya: [S] >> K m. Di sini konstanta K m diabaikan dibandingkan dengan [S], dan dengan demikian kita mendapatkan v = V max .

1.4 Pembentukan kompleks produk enzim yang stabil secara kinetik

Jika kompleks produk enzim yang stabil secara kinetik terbentuk selama reaksi, mekanisme reaksinya adalah sebagai berikut:

Dengan menerapkan asumsi keadaan tunak, kita dapat menulis persamaan diferensial:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Dari persamaan tersebut didapat bahwa

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Karena v = k 3

dan [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

kita mendapatkan

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Itu adalah

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

Dalam hal ini, sudah sangat sulit untuk menghitung nilai spesifik dari konstanta laju individu, karena hanya rasionya yang dapat diukur secara langsung. Situasi menjadi lebih rumit ketika mekanisme reaksi enzimatik menjadi lebih kompleks, ketika lebih dari dua kompleks terlibat dalam reaksi, karena jumlah konstanta laju dalam persamaan, tentu saja, jauh lebih besar, dan rasionya juga lebih besar. lebih rumit.

Namun, situasinya disederhanakan jika, setelah reaksi reversibel dari pembentukan kompleks pertama, langkah-langkah elementer berikutnya tidak dapat diubah. Perwakilan penting dari enzim yang mematuhi mekanisme ini adalah enzim proteolitik dan esterase. Mekanisme reaksinya dapat ditulis sebagai berikut:

di mana ES` adalah zat antara asil-enzim yang terurai saat terpapar air. Kita bisa menulis

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k cat [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 cat / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

Konstanta Michaelis dari langkah asilasi adalah K m "K s. Semakin besar rasio k cat / K m , semakin tinggi spesifisitas substrat.

Penentuan konstanta sangat disederhanakan jika percobaan dilakukan dengan adanya zat nukleofilik (N) yang mampu bersaing dengan air. Kemudian

k 3 \u003d k 3 ' dan P i (i \u003d 1, 2, 3) adalah produk.

v i = k cat, i [S] / (K m + [S]) cat, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) cat, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) cat, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Karena diketahui bahwa K s / k 2 = K m / k cat, dan jika nukleofil tidak ada, maka

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

dan untuk menentukan konstanta, Anda dapat menggunakan titik potong garis pada koordinat 1/v N (dan 1/v) - 1/[S]. Dua garis lurus dalam koordinat terbalik ganda berpotongan di kuadran kedua. Dengan tidak adanya nukleofil, titik perpotongan garis dengan sumbu vertikal didefinisikan sebagai 1/V max dan 1/k cat , dan dengan sumbu horizontal sebagai -1/K m . Koordinat titik potong dua garis: -1/K s dan 1/k 3 . Jarak antara 1/V max dan 1/k 3 adalah 1/k 2 .

1.5 Analisis kurva kinetika reaksi lengkap

Persamaan Michaelis - Menten dalam bentuk aslinya hanya mengacu pada reaksi ireversibel, yaitu. untuk reaksi di mana hanya laju awal yang dipertimbangkan, dan reaksi sebaliknya tidak muncul karena jumlah produk yang tidak mencukupi dan tidak mempengaruhi laju reaksi. Dalam kasus reaksi ireversibel, kurva kinetik lengkap dapat dengan mudah dianalisis (untuk interval waktu t . yang berubah-ubah). ), mengintegrasikan persamaan Michaelis-Menten asli. Dalam hal ini, oleh karena itu, asumsi tetap bahwa hanya satu kompleks enzim-substrat antara yang terbentuk selama reaksi. Karena untuk selang waktu t tidak ada batasan, konsentrasi substrat pada saat analisis tidak dapat sama dengan konsentrasi awal yang dimasukkan. Jadi, perubahan [S] juga perlu diperhitungkan selama reaksi berlangsung. Biarkan S 0 menjadi konsentrasi awal substrat, (S 0 - y ) - konsentrasi pada waktu t . Kemudian, berdasarkan persamaan Michaelis-Menten asli (jika y adalah jumlah substrat yang dikonversi), kita dapat menulis

dy / dt \u003d V maks (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Mengambil kebalikan dan membagi variabel, kami mengintegrasikan lebih dari y antara 0 dan y (V max ditunjukkan sebagai V):

(2,303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Jadi, setelah memplot ketergantungan sisi kiri persamaan pada y / t (koordinat Foster-Niemann) , mendapatkan garis lurus dengan kemiringan (-1/K m) , segmen cutoff pada sumbu y (V/K m) , dan pada sumbu absis - segmen V. Persamaan integral juga dapat dilinierkan dengan cara yang berbeda:

t / 2.3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

atau t/y = 2.3031 K m lg / V y +1/V

Jika kita mempelajari reaksi reversibel, kita perlu memperhatikan interval waktu yang kita hadapi. Pada saat pencampuran enzim dengan substrat, apa yang disebut fase pra-stasioner dimulai, berlangsung beberapa mikro atau milidetik, di mana kompleks enzim-substrat yang sesuai dengan keadaan stasioner terbentuk. Dalam studi reaksi reversibel dalam interval waktu yang cukup lama, fase ini tidak memainkan peran penting, karena dalam fase ini reaksi tidak berjalan dengan kecepatan penuh ke segala arah.

Untuk reaksi yang berlangsung dari kiri ke kanan, kompleks enzim-substrat yang terlibat dalam reaksi mencapai konsentrasi pembatas laju hanya pada akhir fase pra-stasioner. Keadaan kuasi-stasioner, di mana konsentrasi kompleks enzim-substrat penentu laju mendekati nilai maksimum konsentrasi dalam keadaan tunak, berlangsung beberapa persepuluh detik atau satu detik. Selama fase ini, laju pembentukan produk (atau konsumsi substrat) hampir linier dalam waktu. Secara teoritis, pembentukan produk belum terjadi di sini, tetapi dalam praktiknya konsentrasinya sangat rendah sehingga laju reaksi balik tidak mempengaruhi laju reaksi langsung. Fase linier ini disebut laju reaksi awal, dan sejauh ini kita hanya memperhitungkannya.

Reaksi dari kanan ke kiri pada fase berikutnya juga dipercepat karena peningkatan konsentrasi produk secara bertahap. (keadaan transisi; linearitas yang diamati sejauh ini dalam waktu menghilang). Fase ini berlanjut sampai laju reaksi dari kiri ke kanan sama dengan laju reaksi dari kanan ke kiri. Ini adalah negara bagian keseimbangan dinamis, karena reaksi berlangsung dua arah dengan laju yang sama.

2. Faktor-faktor yang bergantung pada laju reaksi enzimatik

.1 Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada suhu

Dengan peningkatan suhu medium, laju reaksi enzimatik meningkat, mencapai maksimum pada beberapa suhu optimal, dan kemudian turun ke nol. Untuk reaksi kimia, ada aturan bahwa dengan peningkatan suhu sebesar 10 ° C, laju reaksi meningkat dua hingga tiga kali lipat. Untuk reaksi enzimatik, koefisien suhu ini lebih rendah: untuk setiap 10 °C, laju reaksi meningkat dengan faktor 2 atau bahkan kurang. Penurunan berikutnya dalam laju reaksi ke nol menunjukkan denaturasi blok enzim. Nilai suhu optimal untuk sebagian besar enzim berada pada kisaran 20 - 40 0 ​​C. Termolabilitas enzim dikaitkan dengan struktur proteinnya. Beberapa enzim sudah didenaturasi pada suhu sekitar 40 0 ​​C, tetapi sebagian besar menjadi tidak aktif pada suhu di atas 40 - 50 0 C. Beberapa enzim dinonaktifkan oleh dingin, mis. pada suhu mendekati 0°C, terjadi denaturasi.

Peningkatan suhu tubuh (demam) mempercepat reaksi biokimia yang dikatalisis oleh enzim. Mudah untuk menghitung bahwa peningkatan suhu tubuh untuk setiap derajat meningkatkan laju reaksi sekitar 20%. Pada suhu tinggi sekitar 39-40 ° C, penggunaan substrat endogen yang boros dalam sel organisme yang sakit diperlukan untuk mengisi kembali asupannya dengan makanan. Selain itu, pada suhu sekitar 40°C, beberapa enzim yang sangat termolabil dapat didenaturasi, yang mengganggu proses alami biokimia.

Suhu rendah menyebabkan inaktivasi enzim yang reversibel karena sedikit perubahan dalam struktur spasialnya, tetapi cukup untuk mengganggu konfigurasi yang sesuai dari pusat aktif dan molekul substrat.

2.2 Ketergantungan laju reaksi pada pH medium

Untuk sebagian besar enzim, ada nilai pH tertentu di mana aktivitasnya maksimum; di atas dan di bawah nilai pH ini, aktivitas enzim ini menurun. Namun, tidak dalam semua kasus kurva yang menggambarkan ketergantungan aktivitas enzim pada pH berbentuk lonceng; terkadang ketergantungan ini juga dapat diekspresikan secara langsung. Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada pH terutama menunjukkan keadaan gugus fungsi dari pusat aktif enzim. Mengubah pH medium mempengaruhi ionisasi gugus asam dan basa residu asam amino dari pusat aktif, yang terlibat baik dalam pengikatan substrat (di area kontak) atau dalam transformasinya (di area katalitik). Oleh karena itu, efek spesifik pH dapat disebabkan oleh perubahan afinitas substrat terhadap enzim, atau oleh perubahan aktivitas katalitik enzim, atau keduanya.

Sebagian besar substrat memiliki gugus asam atau basa, sehingga pH mempengaruhi derajat ionisasi substrat. Enzim lebih disukai berikatan dengan bentuk substrat yang terionisasi atau tidak terionisasi. Jelas, pada pH optimal, kedua gugus fungsi dari pusat aktif berada dalam keadaan paling reaktif, dan substrat berada dalam bentuk yang lebih disukai untuk diikat oleh gugus enzim ini.

Saat membuat kurva yang menggambarkan ketergantungan aktivitas enzim pada pH, pengukuran pada semua nilai pH biasanya dilakukan dalam kondisi saturasi enzim dengan substrat, karena nilai Km untuk banyak enzim berubah dengan pH.

Kurva yang mencirikan ketergantungan aktivitas enzim pada pH dapat memiliki bentuk yang sangat sederhana dalam kasus-kasus ketika enzim bekerja pada substrat yang netral secara elektrostatis atau substrat di mana gugus bermuatan tidak memainkan peran penting dalam tindakan katalitik. Contoh enzim tersebut adalah papain, serta invertase, yang mengkatalisis hidrolisis molekul sukrosa netral dan mempertahankan aktivitas konstan dalam kisaran pH 3,0-7,5.

Nilai pH yang sesuai dengan aktivitas maksimum enzim tidak selalu sesuai dengan karakteristik nilai pH lingkungan intraseluler normal enzim ini; yang terakhir dapat berada di atas dan di bawah pH optimum. Hal ini menunjukkan bahwa pengaruh pH pada aktivitas enzim mungkin menjadi salah satu faktor yang bertanggung jawab untuk regulasi aktivitas enzimatik di dalam sel. Karena sel mengandung ratusan enzim, dan masing-masing enzim bereaksi berbeda terhadap perubahan pH, nilai pH di dalam sel mungkin merupakan salah satu elemen penting dalam sistem regulasi metabolisme seluler yang kompleks.

2.3 Menentukan jumlah enzim berdasarkan aktivitasnya

) stoikiometri total dari reaksi yang dikatalisis;

) kemungkinan kebutuhan kofaktor - dalam ion logam atau koenzim;

) ketergantungan aktivitas enzim pada konsentrasi substrat dan kofaktor, mis. Nilai K m untuk substrat dan kofaktor;

) nilai pH yang sesuai dengan aktivitas maksimum enzim;

) kisaran suhu di mana enzim stabil dan mempertahankan aktivitas tinggi.

Selain itu, Anda perlu memiliki beberapa teknik analisis yang cukup sederhana yang memungkinkan Anda menentukan laju hilangnya substrat atau laju munculnya produk reaksi.

Bila memungkinkan, analisis enzim dilakukan di bawah kondisi standar yang mempertahankan pH optimal dan mempertahankan konsentrasi substrat di atas konsentrasi saturasi; dalam hal ini, laju awal sesuai dengan orde nol reaksi terhadap substrat dan hanya sebanding dengan konsentrasi enzim. Untuk enzim yang membutuhkan kofaktor, ion logam atau koenzim, konsentrasi kofaktor ini juga harus melebihi konsentrasi saturasi sehingga konsentrasi enzim merupakan faktor pembatas laju. Secara umum, pengukuran laju pembentukan produk reaksi dapat dilakukan dengan akurasi yang lebih besar daripada pengukuran laju hilangnya substrat, karena substrat umumnya harus ada dalam konsentrasi yang relatif tinggi untuk mempertahankan kinetika orde nol. Laju pembentukan produk reaksi (atau produk) dapat diukur dengan metode kimia atau spektrum-fotometri. Metode kedua lebih nyaman, karena memungkinkan Anda untuk terus merekam jalannya reaksi pada tungau perekam.

Berdasarkan kesepakatan internasional, satuan aktivitas enzimatik adalah jumlah enzim yang mampu menyebabkan konversi satu mikromol substrat per menit pada suhu 25 °C dalam kondisi optimal. Aktivitas tertentu enzim adalah jumlah unit aktivitas enzimatik per 1 mg protein. Nilai ini digunakan sebagai kriteria kemurnian preparasi enzim; itu meningkat saat enzim dimurnikan dan mencapai nilai maksimumnya untuk persiapan murni yang ideal. Dibawah jumlah putaran memahami jumlah molekul substrat yang mengalami transformasi per satuan waktu per satu molekul enzim (atau per satu situs aktif) dalam kondisi di mana laju reaksi dibatasi oleh konsentrasi enzim.

2.4 Aktivasi enzim

Pengaturan enzim dapat dilakukan melalui interaksi dengannya berbagai komponen biologis atau senyawa asing (misalnya, obat-obatan dan racun), yang biasa disebut pengubah atau regulator enzim. Di bawah pengaruh pengubah pada enzim, reaksi dapat dipercepat (aktivator) atau diperlambat ( inhibitor).

Aktivasi enzim ditentukan oleh percepatan reaksi biokimia yang terjadi setelah aksi modifier. Satu kelompok aktivator terdiri dari zat-zat yang mempengaruhi daerah sisi aktif enzim. Ini termasuk kofaktor enzim dan substrat. Kofaktor (ion logam dan koenzim) tidak hanya elemen struktural wajib enzim kompleks, tetapi juga pada dasarnya aktivator mereka.

Ion logam adalah aktivator yang cukup spesifik. Seringkali, beberapa enzim membutuhkan ion bukan hanya satu, tetapi beberapa logam. Misalnya, untuk Na + , K + -ATPase, yang mengangkut kation monovalen melalui membran sel, ion magnesium, natrium dan kalium diperlukan sebagai aktivator.

Aktivasi dengan bantuan ion logam dilakukan dengan mekanisme yang berbeda. Dalam beberapa enzim, mereka adalah bagian dari situs katalitik. Dalam beberapa kasus, ion logam memfasilitasi pengikatan substrat ke pusat aktif enzim, membentuk semacam jembatan. Seringkali, logam tidak bergabung dengan enzim, tetapi dengan substrat, membentuk kompleks logam-substrat, yang lebih disukai untuk kerja enzim.

Kekhususan partisipasi koenzim dalam pengikatan dan katalisis substrat menjelaskan aktivasi reaksi enzimatik oleh mereka. Efek pengaktifan kofaktor terutama terlihat ketika bekerja pada enzim yang tidak jenuh dengan kofaktor.

Substrat juga merupakan aktivator dalam batas konsentrasi yang diketahui. Setelah mencapai konsentrasi substrat yang jenuh, aktivitas enzim tidak meningkat. Substrat meningkatkan stabilitas enzim dan memfasilitasi pembentukan konformasi yang diinginkan dari situs aktif enzim.

Ion logam, koenzim dan prekursornya serta analog aktifnya,

substrat dapat digunakan dalam praktek sebagai persiapan yang mengaktifkan enzim.

Aktivasi beberapa enzim dapat dilakukan dengan modifikasi yang tidak mempengaruhi pusat aktif molekulnya. Beberapa modifikasi dimungkinkan:

1) aktivasi pendahulu yang tidak aktif - proenzim, atau zimogen. Misalnya, konversi pepsinogen menjadi pepsin ;

2) aktivasi dengan menempelkan setiap kelompok pengubah spesifik ke molekul enzim;

3) aktivasi dengan disosiasi protein kompleks tidak aktif - enzim aktif.

2.5 Penghambatan enzim

Ada reagen yang dapat berinteraksi kurang lebih secara khusus dengan satu atau lain rantai samping protein, yang mengarah pada penghambatan aktivitas enzim. Fenomena ini memungkinkan untuk mempelajari sifat residu samping asam amino yang terlibat dalam reaksi enzimatik ini. Namun, dalam praktiknya, orang harus mempertimbangkan banyak seluk-beluk yang membuat interpretasi yang tidak ambigu dari hasil yang diperoleh dengan inhibitor spesifik agak sulit dan sering meragukan. Pertama-tama, agar reaksi dengan inhibitor cocok untuk mempelajari sifat rantai samping yang terlibat dalam reaksi, harus memenuhi kriteria berikut:

) menjadi spesifik, yaitu inhibitor harus memblokir hanya kelompok yang diinginkan;

) menghambat aktivitas enzim, dan penghambatan ini harus menjadi lengkap dengan peningkatan jumlah kelompok yang dimodifikasi;

) reagen tidak boleh menyebabkan denaturasi protein yang tidak spesifik.

Ada 2 kelompok inhibitor: aksi reversibel dan ireversibel. Pembagian didasarkan pada kriteria untuk pemulihan aktivitas enzim setelah dialisis atau pengenceran yang kuat dari larutan enzim dengan inhibitor.

Menurut mekanisme aksi, penghambatan kompetitif, non-kompetitif, non-kompetitif, substrat dan alosterik dibedakan.

Penghambatan kompetitif

Penghambatan kompetitif ditemukan dalam studi penghambatan yang disebabkan oleh analog substrat. Ini adalah penghambatan reaksi enzimatik yang disebabkan oleh pengikatan ke pusat aktif enzim dari suatu inhibitor yang strukturnya mirip dengan substrat dan mencegah pembentukan kompleks enzim-substrat. Dalam inhibisi kompetitif, inhibitor dan substrat, yang memiliki struktur serupa, bersaing untuk situs aktif enzim. Senyawa molekul, yang lebih besar, berikatan dengan pusat aktif.

Gagasan seperti itu tentang mekanisme penghambatan dikonfirmasi oleh eksperimen tentang kinetika reaksi penghambatan kompetitif. Dengan demikian, ditunjukkan bahwa, dalam kasus penghambatan kompetitif, analog substrat tidak mempengaruhi laju dekomposisi kompleks enzim-substrat yang sudah terbentuk; ketika menggunakan kelebihan substrat yang "sangat besar", tingkat maksimum yang sama diperoleh baik dengan adanya maupun tanpa adanya inhibitor. Sebaliknya, inhibitor mempengaruhi nilai konstanta disosiasi dan konstanta Michaelis. Dari sini kita dapat menyimpulkan bahwa inhibitor bereaksi dengan kelompok protein yang terlibat dalam satu atau lain cara dalam mengikat substrat, oleh karena itu, karena interaksinya dengan kelompok-kelompok ini, kekuatan pengikatan substrat menurun (yaitu, jumlah molekul enzim yang mampu mengikat. substrat berkurang).

Kemudian, ditunjukkan bahwa penghambatan kompetitif secara kinetik dapat disebabkan tidak hanya oleh analog substrat, tetapi juga oleh reagen lain, yang struktur kimianya benar-benar berbeda dari substrat. Dalam kasus ini, diasumsikan juga bahwa reagen ini berinteraksi dengan kelompok yang bertanggung jawab untuk mengikat substrat.

Secara teoritis ada dua kemungkinan untuk penghambatan kompetitif:

1) situs pengikatan dan katalitik dari enzim tumpang tindih; inhibitor mengikat mereka, tetapi hanya mempengaruhi kelompok pusat pengikatan;

2) pusat pengikatan dan pusat katalitik dalam molekul enzim diisolasi secara spasial; inhibitor berinteraksi dengan situs pengikatan.

di mana I adalah inhibitor, dan K I adalah konstanta disosiasi kompleks enzim-inhibitor.

Laju relatif (rasio laju reaksi enzimatik yang diukur dengan adanya inhibitor (v i) , dengan kecepatan maksimum) sama dengan

v i / V = ​​/ [E] T

karena untuk konsentrasi total enzim itu benar

[E]T = [E] + +

maka 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Jelas, jika [I] = K I , maka kemiringan garis lurus menjadi dua kali lebih besar dari ketergantungan 1/v 0 pada [S] (v 0 adalah laju reaksi enzimatik tanpa adanya inhibitor).

Jenis inhibisi biasanya ditentukan secara grafis. Inhibisi kompetitif paling mudah dikenali dengan memplot plot Lineweaver-Burk (yaitu plot dalam 1/v i dan 1/[S]) pada konsentrasi inhibitor yang berbeda. Dengan penghambatan kompetitif sejati, diperoleh serangkaian garis lurus yang berbeda dalam garis singgung sudut kemiringan dan memotong sumbu y (sumbu 1/v i) di satu titik. Pada setiap konsentrasi inhibitor, dimungkinkan untuk menggunakan substrat dengan konsentrasi tinggi sehingga aktivitas enzim akan maksimal.

Contoh penghambatan kompetitif adalah efek berbagai zat pada aktivitas suksinat dehidrogenase. Enzim ini merupakan bagian dari sistem siklik enzimatik - siklus Krebs. Substrat alaminya adalah suksinat, dan penghambat kompetitifnya adalah oksaloasetat, produk antara dari siklus Krebs yang sama:

Inhibitor kompetitif serupa dari suksinat dehidrogenase adalah asam malonat, yang sering digunakan dalam penelitian biokimia.

Tindakan banyak persiapan farmakologis, pestisida yang digunakan untuk menghancurkan hama pertanian, dan agen perang kimia didasarkan pada prinsip penghambatan kompetitif.

Misalnya, sekelompok obat antikolinesterase, yang meliputi turunan basa amonium kuaterner dan senyawa organofosfor, merupakan penghambat kompetitif enzim kolinesterase terhadap substrat asetilkolinnya. Cholinesterase mengkatalisis hidrolisis asetilkolin, mediator sistem kolinergik (sinapsis neuromuskular, sistem parasimpatis, dll). Zat antikolinesterase bersaing dengan asetilkolin untuk situs aktif enzim, mengikatnya, dan mematikan aktivitas katalitik enzim. Obat-obatan seperti prozerin, physostigmine, sevin menghambat enzim secara reversibel, sedangkan obat-obatan organofosfat seperti armin, nibufin, chlorophos, soman bekerja secara ireversibel, memfosforilasi kelompok katalitik enzim. Sebagai hasil dari tindakan mereka, asetilkolin terakumulasi dalam sinapsis di mana ia merupakan mediator eksitasi saraf, yaitu. organisme diracuni oleh akumulasi asetilkolin. Kerja inhibitor reversibel berangsur-angsur menghilang, karena semakin banyak asetilkolin terakumulasi, semakin cepat menggantikan inhibitor dari pusat aktif kolinesterase. Toksisitas inhibitor ireversibel jauh lebih tinggi, oleh karena itu, mereka digunakan untuk memerangi hama pertanian, serangga rumah tangga dan hewan pengerat (misalnya, klorofos) dan sebagai agen perang kimia (misalnya, sarin, soman, dll.).

Inhibisi nonkompetitif

Dalam inhibisi non-kompetitif, inhibitor spesifik tidak mempengaruhi konstanta disosiasi kompleks enzim-substrat. Di sisi lain, laju reaksi maksimum yang dapat dicapai lebih rendah dengan adanya inhibitor daripada tanpa adanya inhibitor, bahkan pada kelebihan substrat yang sangat besar. Adanya inhibisi membuktikan bahwa inhibitor berikatan dengan protein. Invarian dari konstanta disosiasi baik dengan adanya dan tidak adanya inhibitor, pada gilirannya, menunjukkan bahwa, tidak seperti substrat, inhibitor mengikat kelompok lain. Dari sudut pandang teoretis, mekanisme penghambatan tersebut dapat ditafsirkan dalam berbagai cara.

a) Situs pengikatan dan situs katalitik enzim berbeda. Dalam hal ini, inhibitor yang terkait dengan pusat katalitik mengurangi aktivitas enzim dan hasil maksimum yang dapat dicapai
kecepatan tanpa mempengaruhi pembentukan kompleks enzim-substrat.

b) Situs pengikatan dan situs katalitik tumpang tindih pada
permukaan enzim, dan inhibitor mengikat kelompok lain dari protein. Karena pengikatan inhibitor ke permukaan enzim, informasi protein berubah dan menjadi tidak menguntungkan untuk implementasi katalisis.

c) Inhibitor tidak mengikat baik situs katalitik atau situs pengikatan, dan dengan demikian tidak mempengaruhi konformasi protein. Namun, secara lokal dapat mengubah distribusi muatan pada wilayah permukaan protein. Penghambatan aktivitas juga dapat terjadi dalam kasus ini, jika, misalnya, ionisasi gugus esensial untuk manifestasi aktivitas dibuat tidak mungkin, atau jika, sebaliknya, ionisasi gugus aktif hanya terjadi dalam bentuk tak terionisasi. Fenomena ini diamati terutama ketika menggunakan reagen asam kuat atau basa kuat.

Inhibitor dan substrat tidak mempengaruhi ikatan satu sama lain pada enzim, tetapi kompleks enzim yang mengandung inhibitor sama sekali tidak aktif. Dalam hal ini, tahapan dasar berikut dapat diasumsikan:

v i / V = ​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Jika [I] = K I, kemiringan garis lurus dan ordinat titik perpotongan dengan sumbu vertikal digandakan dibandingkan dengan 1/v 0 .

Inhibitor non-kompetitif adalah, misalnya, sianida, yang sangat terkait dengan besi besi, yang merupakan bagian dari situs katalitik enzim hemin - sitokrom oksidase. Blokade enzim ini mematikan rantai pernapasan, dan sel mati. Inhibitor enzim non-kompetitif termasuk ion logam berat dan senyawa organiknya. Oleh karena itu, ion logam berat merkuri, timbal, kadmium, arsenik dan lainnya sangat beracun. Mereka memblokir, misalnya, gugus SH yang termasuk dalam situs katalitik enzim.

Inhibitor non-kompetitif adalah sianida, yang sangat terkait dengan besi besi, yang merupakan bagian dari situs katalitik enzim hemik - sitokrom oksidase. Blokade enzim ini mematikan rantai pernapasan, dan sel mati. Tidak mungkin untuk menghilangkan aksi inhibitor non-kompetitif dengan substrat berlebih (sebagai aksi kompetitif), tetapi hanya dengan zat yang mengikat inhibitor - reaktivator.

Inhibitor non-kompetitif digunakan sebagai agen farmakologis, zat beracun untuk pengendalian hama di bidang pertanian dan untuk keperluan militer. Dalam pengobatan, preparat yang mengandung merkuri, arsenik, bismut digunakan, yang secara non-kompetitif menghambat enzim dalam sel-sel tubuh atau bakteri patogen, yang menentukan satu atau lain efeknya. Dalam kasus keracunan, pengikatan racun atau pemindahannya dari kompleks enzim-inhibitor dimungkinkan dengan bantuan reaktivator. Ini termasuk semua kompleks yang mengandung SH (sistein, dimerkaptopropanol), asam sitrat, asam etilendiamintetraasetat, dll.

Inhibisi tidak kompetitif

Jenis penghambatan ini juga disebut penghambatan antikompetitif dalam literatur. atau penghambatan terkait , namun, istilah "inhibisi tidak kompetitif" adalah yang paling banyak digunakan. Ciri khas dari jenis penghambatan ini adalah bahwa penghambat tidak dapat menempel pada enzim, tetapi dapat menempel pada kompleks enzim-substrat.

Dalam kasus inhibisi tidak kompetitif, kompleks yang mengandung inhibitor tidak aktif:

v i / V = ​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

penghambatan substrat

Inhibisi substrat adalah penghambatan reaksi enzimatik yang disebabkan oleh kelebihan substrat. Penghambatan tersebut terjadi karena pembentukan kompleks enzim-substrat yang tidak mampu menjalani transformasi katalitik.Kompleks ES 2 tidak produktif dan membuat molekul enzim menjadi tidak aktif. Penghambatan substrat disebabkan oleh kelebihan substrat, oleh karena itu dihilangkan ketika konsentrasinya menurun.

penghambatan alosterik

Regulasi alosterik adalah karakteristik hanya untuk kelompok khusus enzim dengan struktur kuaterner, yang memiliki pusat regulasi untuk mengikat efektor alosterik. Efektor negatif yang menghambat konversi substrat di situs aktif enzim bertindak sebagai inhibitor alosterik. Efektor alosterik positif, sebaliknya, mempercepat reaksi enzimatik, dan oleh karena itu mereka disebut sebagai aktivator alosterik. Efektor alosterik enzim paling sering adalah berbagai metabolit, serta hormon, ion logam, dan koenzim. Dalam kasus yang jarang terjadi, molekul substrat berperan sebagai efektor alosterik enzim.

Mekanisme kerja inhibitor alosterik pada enzim adalah mengubah konformasi situs aktif. Penurunan laju reaksi enzimatik merupakan akibat dari peningkatan K m atau penurunan laju maksimum V max pada konsentrasi substrat jenuh yang sama, yaitu. enzim sebagian menganggur.

Enzim alosterik berbeda dari enzim lain dalam kurva spesifik berbentuk S dari laju reaksi versus konsentrasi substrat. Kurva ini mirip dengan kurva saturasi oksigen hemoglobin; ini menunjukkan bahwa pusat aktif subunit tidak berfungsi secara mandiri, tetapi secara kooperatif, mis. afinitas masing-masing pusat aktif berikutnya untuk substrat ditentukan oleh tingkat kejenuhan pusat sebelumnya. Kerja terkoordinasi dari pusat ditentukan oleh efektor alosterik.

Regulasi alosterik memanifestasikan dirinya dalam bentuk penghambatan oleh produk akhir dari enzim pertama dalam rantai. Struktur produk akhir setelah serangkaian transformasi zat awal (substrat) tidak mirip dengan substrat, sehingga produk akhir dapat bekerja pada enzim awal rantai hanya sebagai penghambat alosterik (efektor). Secara lahiriah, regulasi semacam itu mirip dengan regulasi oleh mekanisme umpan balik dan memungkinkan Anda untuk mengontrol output produk akhir, jika terjadi akumulasi di mana kerja enzim pertama dalam rantai berhenti. Misalnya, aspartat carbamoyltransferase (ACTase) mengkatalisis reaksi pertama dari enam reaksi dalam sintesis cytidine triphosphate (CTP). CTP adalah penghambat AKTase alosterik. Oleh karena itu, ketika CTP terakumulasi, penghambatan AKTase terjadi dan sintesis CTP lebih lanjut berhenti. Regulasi alosterik enzim dengan bantuan hormon telah ditemukan. Misalnya, estrogen adalah penghambat alosterik enzim glutamat dehidrogenase, yang mengkatalisis deaminasi asam glutamat.

Jadi, bahkan persamaan kinetik paling sederhana untuk reaksi enzimatik mengandung beberapa parameter kinetik, yang masing-masing bergantung pada suhu dan lingkungan tempat reaksi berlangsung.

Inhibitor memungkinkan tidak hanya untuk memahami esensi dari katalisis enzimatik, tetapi juga merupakan semacam alat untuk mempelajari peran reaksi kimia individu, yang secara khusus dapat dimatikan dengan bantuan inhibitor enzim yang diberikan.

3. Beberapa perangkat yang berguna untuk menentukan laju reaksi awal

Banyak masalah kinetika enzimatik mengarah pada penentuan laju reaksi awal (v 0). Keuntungan utama dari metode ini adalah bahwa nilai v0 yang ditentukan pada saat awal waktu akan memberikan representasi paling akurat dari aktivitas enzim yang diteliti, karena produk reaksi yang terakumulasi belum memiliki waktu untuk melakukan penghambatan. efek pada enzim dan, di samping itu, sistem yang bereaksi berada dalam keadaan kesetimbangan stasioner.

Namun, dalam praktik laboratorium, ketika menggunakan spektrofotometri konvensional, titrimetri, atau teknik lain untuk merekam kemajuan reaksi tersebut, paling baik, hingga 15-20 detik dari waktu awal untuk memasukkan enzim ke substrat, pencampuran sistem reaksi, pengaturan sel, dll hilang. Dan ini tidak dapat diterima, karena dalam kasus ini garis singgung dibawa ke titik di mana tg 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без pencampuran konstan selanjutnya diperumit oleh fluktuasi konsentrasi reagen berdasarkan volume.

Perangkat sederhana yang diusulkan di bawah ini untuk spektrofotometer, pH meter, dan sejenisnya memungkinkan untuk secara signifikan mengurangi sumber kesalahan yang ditunjukkan dalam menentukan v 0 .

3.1 Perangkat ke spektrofotometer

Perangkat untuk spektrofotometer terdiri dari dispenser 1, benang Teflon berputar 2 (pengaduk) dan tutup pemasangan 3.

Dispenser adalah mikropipet, salah satu ujungnya dibentuk dengan jarum 4, yang lain - dengan pelebaran 5 (untuk mencegah enzim memasuki ujung karet 6).

Penutup teflon 3 yang menutupi kuvet spektral 7 memiliki dua lubang: satu (8) di tengah penutup, yang kedua (9) di atas tengah celah antara dinding buram kuvet 7 dan berkas cahaya 10. Teflon tabung 11 (diameter dalam 1-1,5 mm) dipasang di satu ujung di lubang 9, yang lain - pada langkan tetap 12 di depan rotor motor 13. Benang teflon 2 dimasukkan ke dalam tabung (ketebalan benang 0,5-0,6 mm ). Salah satu ujung ulir dipasang pada rotor berputar motor 13, yang kedua - dilewatkan ke dalam kuvet 7 - dibentuk dalam bentuk spiral (untuk meningkatkan pencampuran). Posisi ulir ditentukan oleh tutup pemasangan 3, terlepas dari jarak motor, yang nyaman saat bekerja yang membutuhkan penggantian kuvet yang sering.

Prinsip operasi. Kuvet kuarsa spektrofotometer 7 diisi dengan substrat 14 (sekitar 1,5-2,0 ml), dimasukkan ke dalam dudukan kuvet termostatik spektrofotometer, ditutup dengan penutup 3 dengan benang Teflon berputar 2, yang direndam dalam substrat 14, dan semua operasi lebih lanjut sudah dilakukan dalam berkas cahaya spektrofotometer dan direkam pada perekam.

Pada awal pekerjaan, substrat dicampur, dan pena perekam menulis garis horizontal datar (atau "nol"). Dispenser (dengan enzim) dimasukkan ke dalam lubang 8 (jarum direndam dalam larutan substrat 14), dengan cepat meremas ujung 6, enzim (biasanya sekitar 0,03-0,05 ml) dimasukkan ke dalam substrat, dan dispenser dihapus. Pencampuran komponen berakhir dalam 2,5-3 detik, dan pena perekam menetapkan awal reaksi dengan menyimpangkan kurva kerapatan optik (ΔA) versus waktu.

Perangkat semacam itu juga memungkinkan untuk mengambil sampel dari sistem reaksi untuk analisis; menambahkan inhibitor dan aktivator ke sistem; mengubah kondisi reaksi (mengubah pH, ​​kekuatan ionik, dll.) tanpa mengganggu pendaftaran jalur reaksi, yang sangat nyaman, misalnya, saat mempelajari pemisahan n-NFF "asam" fosfatase, di mana pembelahan n-NFF dilakukan pada pH 5.0 (atau pH 6-7), dan aktivitas enzim ditentukan oleh akumulasi n-ion ​​nitrofenolat pada pH 9,5-10,0.

Perangkat semacam itu juga nyaman untuk melakukan titrasi spektrofotometri enzim, dll.

3.2 Perangkat untuk pengukur pH

Perangkat untuk pH meter terdiri dari ujung modifikasi elektroda aliran 1, semi-mikrosel 2, dispenser 3, dan sirkuit elektronik untuk menghubungkan pH meter ke perekam. Selain itu, perangkat ini mencakup elektroda pH meter standar (4), penutup dudukan sel (5), ruang aliran termostatik (6), larutan substrat (7), magnet pasif (8), dan magnet aktif ( 9).

Ujung standar elektroda aliran pH meter (LPU-01) diganti dengan tabung Teflon 1 (diameter dalam 1,3-1,5 mm), diisi dengan benang asbes, pra-perawatan dengan larutan KCl jenuh. Kepadatan pengisian benang dikontrol sehingga laju aliran larutan KCl melalui tabung mendekati laju aliran elektroda asli yang tidak dimodifikasi. Penggantian ujung ini memungkinkan untuk mengurangi ukuran sel kerja asli dari 20-25 menjadi 2 ml, yang memungkinkan untuk mengelola dengan volume minimal (1,5 ml) larutan preparat biokimia yang mahal.

Sirkuit elektronik untuk menghubungkan pH meter (LPU-01) ke perekam terdiri dari sumber daya (baterai DC 12 V), resistansi kabel variabel R 1 (10 - 100 Ohm), yang menetapkan tegangan 9 V pada Dioda zener D809, resistansi kabel variabel R 2 (15-150 Ohm), yang mengatur pengaturan "nol" (titik referensi) pembacaan pH meter pada skala perekam, dan resistansi kabel variabel R 3 (35-500 Ohm), yang mengatur skala pemuaian (amplifikasi) dari pembacaan skala pH - meter pada perekam. Sirkuit beroperasi dengan andal hingga tegangan sumber turun di bawah 9 V.

Prinsip operasi. 1,5 ml substrat dimasukkan ke dalam sel (silinder kaca 1,7x2,4 cm), dan sel dipasang pada tutup pemasangan 5. Pengadukan 9 dihidupkan, dan pena perekam menulis garis referensi genap (dasar). . Dengan bantuan dispenser, 0,03 ml larutan enzim dimasukkan ke dalam substrat, dan pena perekam menetapkan awal reaksi dengan menyimpangkan kurva pH versus waktu (t).

Perangkat semacam itu tidak menggantikan status pH, tetapi dengan mempertimbangkan kemungkinan perluasan skala pengukur pH, perangkat ini memungkinkan Anda untuk merekam perubahan kecil pada pH 0,004-0,005 dengan andal.

3.3 Penggaris nomogram, nyaman untuk menentukan kecepatan awal

Kompleksitas yang cukup besar dalam menentukan kecepatan awal dalam metode garis singgung adalah perhitungan rasio perubahan konsentrasi reagen (Δ[S]) per satuan waktu (Δt), yaitu. ekspresi v 0 dalam M/menit dari kondisi yang

v 0 = lim [S] / t, at, t 0.

Dalam praktiknya, prosedur seperti itu biasanya terdiri dari tiga atau empat operasi terpisah: garis singgung ditarik ke bagian awal kurva reaksi, kemudian jumlah unit dari nilai yang terdaftar (kerapatan optik, sudut rotasi, dll.) per titik tertentu. interval waktu dihitung, dan ini mengarah ke satuan waktu dan, akhirnya, menghitung ulang pembacaan perekam untuk perubahan konsentrasi reagen selama 1 menit (M/menit). Dua jenis penggaris nomogram yang diusulkan memungkinkan untuk menyederhanakan prosedur ini.

Penguasa persegi panjang. v 0 adalah rasio [S]/Δt, mis. tg , di mana adalah sudut kemiringan garis singgung terhadap sumbu waktu t. Garis singgung yang sama juga merupakan sisi miring dari segitiga siku-siku yang bersesuaian dengan kaki [S] dan t. Semakin besar v 0 , semakin curam kemiringan garis singgung. Oleh karena itu, jika kita membatasi diri pada selang waktu tertentu, misalnya 1 menit, maka kita akan mendapatkan rangkaian segitiga siku-siku dengan nilai kaki [S] yang berbeda (sebenarnya nilai v 0 berbeda ). Namun, jika kedua kaki diukur: horizontal - dalam satuan waktu referensi (1 menit), dan vertikal - dalam satuan perubahan konsentrasi reagen, misalnya, dalam milimol (mM), dan terapkan segmen yang dihasilkan ke format yang sesuai dari bahan transparan (plexiglass setebal sekitar 2 mm) , maka Anda bisa mendapatkan penggaris yang nyaman untuk menentukan laju reaksi awal. Semua angka dan garis dicetak di sisi sebaliknya dari penggaris untuk menghilangkan kesalahan paralaks saat menentukan v 0 .

Prosedur untuk menentukan v 0 direduksi dalam kasus ini menjadi dua operasi sederhana: sebuah garis singgung ditarik ke bagian awal kurva kinetik t 2 dan menggabungkan titik nol dari kaki horizontal t penggaris dengan awal garis singgung, kelanjutan garis singgung sekarang akan melintasi skala konsentrasi [S] pada titik yang menentukan nilai v 0 dalam M/menit (ketika kaki t horizontal, tidak diperlukan operasi tambahan.

Garis busur. Prosedur untuk menentukan v 0 dapat disederhanakan menjadi satu operasi jika skala konsentrasi diplot sepanjang busur dengan radius tertentu.

Garis lurus ("dasar") 2 diterapkan pada pelat bahan transparan (semua angka dan garis juga diterapkan pada sisi sebaliknya dari penggaris) dan dari titik nol (t=0, min) dari garis ini dengan a jari-jari sama dengan panjang kaki t=1 min [ , gambar busur [S], dari atas ke bawah di mana skala perubahan konsentrasi reagen (misalnya, substrat dalam mM) diletakkan.

Jenis penggaris yang dijelaskan, perangkat untuk spektrofotometer dan pengukur pH telah digunakan selama beberapa tahun untuk menentukan laju reaksi awal (v 0), dalam studi spesifisitas substrat enzim, untuk titrasi spektrofotometri, dll.

Kesimpulan

Dalam makalah ini, bagian dari enzim dianggap yang mempelajari ketergantungan laju reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim pada sejumlah faktor lingkungan. Pendiri ilmu ini dianggap Michaelis dan Menten, yang menerbitkan teori mereka tentang mekanisme umum reaksi enzimatik, diturunkan persamaan yang telah menjadi prinsip dasar dari semua studi kinetik enzim, ini berfungsi sebagai titik awal untuk deskripsi kuantitatif tindakan enzim. Persamaan Michaelis-Menten asli adalah persamaan hiperbolik; Lineweaver dan Burke berkontribusi pada kinetika dengan mengubah persamaan Michaelis-Menten dan memperoleh grafik garis lurus dari mana nilai V max dapat ditentukan dengan paling akurat.

Seiring waktu, perubahan laju reaksi enzimatik dalam reaksi enzimatik dalam kondisi eksperimental menurun. Penurunan laju dapat terjadi karena sejumlah faktor: penurunan konsentrasi substrat, peningkatan konsentrasi produk yang dapat memiliki efek penghambatan, perubahan pH larutan, dan perubahan suhu medium dapat terjadi. Jadi, untuk setiap kenaikan suhu 10°C, laju reaksi menjadi dua kali lipat atau bahkan lebih kecil. Suhu rendah secara reversibel menonaktifkan enzim. Ketergantungan laju reaksi enzimatik pada pH menunjukkan keadaan gugus fungsi dari pusat aktif enzim. Setiap enzim bereaksi berbeda terhadap perubahan pH. Reaksi kimia dapat dihentikan dengan bekerja pada mereka dengan berbagai jenis penghambatan. Laju reaksi awal dapat ditentukan dengan cepat dan akurat dengan bantuan perangkat seperti penggaris nomogram, perangkat spektrofotometer, dan pH meter. Hal ini memungkinkan representasi paling akurat dari aktivitas enzim yang dipelajari.

Semua ini secara aktif digunakan hari ini dalam praktik medis.

Daftar sumber yang digunakan

1. Belyasova N.A. Biokimia dan biologi molekuler. - Minsk: rumah buku, 2004. - 416 hal., sakit.

Keleti T. Dasar-dasar kinetika enzimatik: Per. dari bahasa Inggris. - M.: Mir, 1990. -350 hal., sakit.

3. Knorre D.G. Kimia biologi: Proc. untuk kimia, biol. dan madu. spesialis. universitas. - Edisi ke-3, Pdt. - M.: Lebih tinggi. sekolah 2002. - 479 hal.: sakit.

4. Krupyanenko V.I. Metode vektor untuk mewakili reaksi enzimatik. - M.: Nauka, 1990. - 144 hal.

5. Lehninger A. Biokimia. Basis molekul struktur dan fungsi sel: Per. dari bahasa Inggris. - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Kimia Biologi: Buku Ajar untuk Farmasi. in-tov dan farmasi. palsu sayang. di-teman. - M.: Sekolah Tinggi, 1986. - 479 hal., sakit.

Severin E.S. Biokimia. sebuah. - edisi ke-5. - M.: GEOTAR - Media, 2009. - 786 hal., sakit.