ფერმენტები არის კატალიზატორები ცილოვანი ბუნების ქიმიური რეაქციებისთვის, რომლებიც განსხვავდებიან მათი მოქმედების სპეციფიკურობით გარკვეული ქიმიური რეაქციების კატალიზებასთან მიმართებაში. ისინი წარმოადგენენ ნიადაგის ყველა ცოცხალი ორგანიზმის ბიოსინთეზის პროდუქტებს: მერქნიანი და ბალახოვანი მცენარეები, ხავსები, ლიქენები, წყალმცენარეები, მიკროორგანიზმები, პროტოზოები, მწერები, უხერხემლოები და ხერხემლიანები, რომლებიც ბუნებრივ გარემოში წარმოდგენილია გარკვეული აგრეგატებით - ბიოცენოზებით.

ცოცხალ ორგანიზმებში ფერმენტების ბიოსინთეზი ხორციელდება გენეტიკური ფაქტორების გამო, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან მეტაბოლიზმის ტიპის მემკვიდრეობით გადაცემაზე და მის ადაპტაციურ ცვალებადობაზე. ფერმენტები არის სამუშაო აპარატი, რომლითაც ხდება გენების მოქმედება. ისინი ახდენენ ორგანიზმებში ათასობით ქიმიურ რეაქციას, რომლებიც საბოლოოდ ქმნიან უჯრედულ მეტაბოლიზმს. მათი წყალობით ორგანიზმში ქიმიური რეაქციები დიდი სიჩქარით მიმდინარეობს.

ამჟამად ცნობილია 900-ზე მეტი ფერმენტი. ისინი იყოფა ექვს ძირითად კლასად.

1. ოქსირედუქტაზები, რომლებიც ახდენენ რედოქს რეაქციებს.

2. სხვადასხვა ქიმიური ჯგუფის და ნარჩენების ინტერმოლეკულური გადაცემის რეაქციების კატალიზატორი ტრანსფერაზები.

3. ჰიდროლაზები, რომლებიც ახდენენ ინტრამოლეკულური ბმების ჰიდროლიზური დაშლის რეაქციებს.

4. ლიაზები, რომლებიც ახდენენ ორმაგ ბმებში ჯგუფების დამატებას და ასეთი ჯგუფების აბსტრაქციის საპირისპირო რეაქციებს.

5. იზომერიზაციის რეაქციების კატალიზატორი იზომერაზები.

6. ლიგაზები, რომლებიც ახდენენ ქიმიურ რეაქციებს ატფ-ის (ადენოზინტრიფოსფორის მჟავას) გამო ობლიგაციების წარმოქმნის კატალიზირებას.

როდესაც ცოცხალი ორგანიზმები იღუპებიან და ლპება, მათი ზოგიერთი ფერმენტი ნადგურდება, ზოგი კი, ნიადაგში მოხვედრისას, ინარჩუნებს თავის აქტივობას და ახდენს ნიადაგის მრავალ ქიმიურ რეაქციას, მონაწილეობს ნიადაგის წარმოქმნის პროცესებში და ნიადაგის თვისებრივი ნიშნის ფორმირებაში - ნაყოფიერება. სხვადასხვა ტიპის ნიადაგებში გარკვეული ბიოცენოზის ქვეშ წარმოიქმნა საკუთარი ფერმენტული კომპლექსები, რომლებიც განსხვავდებოდა ბიოკატალიტიკური რეაქციების აქტივობით.

VF Kuprevich და TA Shcherbakova (1966) აღნიშნავენ, რომ ნიადაგის ფერმენტული კომპლექსების მნიშვნელოვანი მახასიათებელია ფერმენტების არსებული ჯგუფების მოქმედების მოწესრიგება, რაც გამოიხატება იმაში, რომ უზრუნველყოფილია სხვადასხვა ჯგუფის წარმომადგენელი რამდენიმე ფერმენტის ერთდროული მოქმედება. ; გამორიცხულია ნიადაგში ჭარბად არსებული ნაერთების წარმოქმნა და დაგროვება; ჭარბი დაგროვილი მობილური მარტივი ნაერთები (მაგალითად, NH 3) ამა თუ იმ გზით დროებით შეკრულია და იგზავნება ციკლებში, რომლებიც მთავრდება მეტ-ნაკლებად რთული ნაერთების წარმოქმნით. ფერმენტული კომპლექსები დაბალანსებული თვითრეგულირებადი სისტემებია. ამაში მთავარ როლს ასრულებენ მიკროორგანიზმები და მცენარეები, რომლებიც მუდმივად ავსებენ ნიადაგის ფერმენტებს, რადგან ბევრი მათგანი ხანმოკლეა. ფერმენტების რაოდენობა ირიბად ფასდება მათი აქტივობით დროთა განმავლობაში, რაც დამოკიდებულია რეაგენტების ქიმიურ ბუნებაზე (სუბსტრატი, ფერმენტი) და ურთიერთქმედების პირობებზე (კომპონენტების კონცენტრაცია, pH, ტემპერატურა, გარემოს შემადგენლობა, აქტივატორების მოქმედება, ინჰიბიტორები და ა.შ.).

ეს თავი განიხილავს ფერმენტების ზოგიერთ ქიმიურ ნიადაგურ პროცესებში მონაწილეობას ჰიდროლაზების კლასიდან - ინვერტაზას, ურეაზას, ფოსფატაზას, პროტეაზას აქტივობა და ოქსიდორედუქტაზების კლასიდან - კატალაზას, პეროქსიდაზას და პოლიფენოლ ოქსიდაზას აქტივობას, რომლებსაც დიდი მნიშვნელობა აქვთ. აზოტისა და ფოსფორის შემცველი ორგანული ნივთიერებების, ნახშირწყლების ბუნების ნივთიერებების გარდაქმნასა და ჰუმუსის წარმოქმნის პროცესებში. ამ ფერმენტების აქტივობა ნიადაგის ნაყოფიერების მნიშვნელოვანი მაჩვენებელია. გარდა ამისა, ამ ფერმენტების აქტივობა ტყის და სახნავი ნიადაგების კულტივირების სხვადასხვა ხარისხის დამახასიათებელი იქნება ჭუჭყიან-პოძოლური, ნაცრისფერი ტყის და ჭუჭყიანი კირქვიანი ნიადაგების მაგალითით.

ნიადაგის ფერმენტების მახასიათებლები

ინვერტაზა - აკატალიზებს საქაროზის ჰიდროლიზური დაშლის რეაქციებს გლუკოზისა და ფრუქტოზის თანაბარი რაოდენობით, ასევე მოქმედებს სხვა ნახშირწყლებზე ფრუქტოზის მოლეკულების წარმოქმნით - ენერგეტიკული პროდუქტი მიკროორგანიზმების სასიცოცხლო აქტივობისთვის, აკატალიზებს ფრუქტოზის ტრანსფერაზას რეაქციებს. მრავალი ავტორის კვლევებმა აჩვენა, რომ ინვერტაზას აქტივობა სხვა ფერმენტებთან შედარებით უკეთ ასახავს ნიადაგის ნაყოფიერების დონეს და ბიოლოგიურ აქტივობას.

ურეაზა - ახდენს შარდოვანას ჰიდროლიზური დაშლის რეაქციებს ამიაკად და ნახშირორჟანგად. აგრონომიულ პრაქტიკაში შარდოვანას გამოყენებასთან დაკავშირებით გასათვალისწინებელია, რომ ურეაზას აქტივობა უფრო მაღალია უფრო ნაყოფიერ ნიადაგებში. ის იზრდება ყველა ნიადაგში მათი უდიდესი ბიოლოგიური აქტივობის პერიოდში - ივლის-აგვისტოში.

ფოსფატაზა (ტუტე და მჟავა) - აკატალიზებს რიგი ფოსფორორგანული ნაერთების ჰიდროლიზს ორთოფოსფატის წარმოქმნით. ფოსფატაზას აქტივობა საპირისპირო კავშირშია მცენარეთა ხელმისაწვდომ ფოსფორით უზრუნველყოფასთან, ამიტომ ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც დამატებითი ინდიკატორი ნიადაგზე ფოსფატური სასუქების საჭიროების დადგენისას. ფოსფატაზას ყველაზე მაღალი აქტივობა მცენარეთა რიზოსფეროშია.

პროტეაზები არის ფერმენტების ჯგუფი, რომელთა მონაწილეობით ცილები იშლება პოლიპეპტიდებად და ამინომჟავებად, შემდეგ ჰიდროლიზდება ამიაკის, ნახშირორჟანგის და წყალში. ამ მხრივ, პროტეაზებს დიდი მნიშვნელობა ენიჭება ნიადაგის ცხოვრებაში, რადგან ისინი დაკავშირებულია ორგანული კომპონენტების შემადგენლობის ცვლილებებთან და მცენარეების მიერ შეთვისებული აზოტის ფორმების დინამიკასთან.

კატალაზა - მისი გამააქტიურებელი მოქმედების შედეგად წყალბადის ზეჟანგი, რომელიც ტოქსიკურია ცოცხალი ორგანიზმებისთვის, იყოფა წყალად და თავისუფალ ჟანგბადად. მცენარეულობა დიდ გავლენას ახდენს მინერალური ნიადაგების კატალაზურ აქტივობაზე. როგორც წესი, მძლავრი ღრმად შეღწევადი ფესვთა სისტემის მქონე მცენარეთა ნიადაგები ხასიათდება კატალაზის მაღალი აქტივობით. კატალაზას აქტივობის თავისებურება ის არის, რომ ის ოდნავ ცვლის პროფილს, აქვს საპირისპირო კავშირი ნიადაგის ტენიანობასთან და პირდაპირი კავშირი ტემპერატურასთან.

პოლიფენოლ ოქსიდაზა და პეროქსიდაზა - ისინი მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ნიადაგში ჰუმუსის წარმოქმნის პროცესებში. პოლიფენოლ ოქსიდაზა კატალიზებს პოლიფენოლების დაჟანგვას ქინონებამდე თავისუფალი ატმოსფერული ჟანგბადის თანდასწრებით. პეროქსიდაზა აკატალიზებს პოლიფენოლების დაჟანგვას წყალბადის ზეჟანგის ან ორგანული პეროქსიდების თანდასწრებით. ამავდროულად, მისი როლი არის პეროქსიდების გააქტიურება, რადგან მათ აქვთ სუსტი ჟანგვის ეფექტი ფენოლებზე. ქინონების შემდგომი კონდენსაცია ამინომჟავებთან და პეპტიდებთან შეიძლება მოხდეს ჰუმინის მჟავის პირველადი მოლეკულის წარმოქმნით, რომელიც შეიძლება კიდევ უფრო რთული გახდეს განმეორებითი კონდენსაციის გამო (Kononova, 1963).

აღინიშნა (Chunderova, 1970), რომ პოლიფენოლ ოქსიდაზას (S) აქტივობის თანაფარდობა პეროქსიდაზას (D) აქტივობასთან, გამოხატული პროცენტულად (), დაკავშირებულია ნიადაგებში ჰუმუსის დაგროვებასთან, ამიტომ ეს მნიშვნელობა არის ჰუმუსის დაგროვების პირობითი კოეფიციენტი (K). უდმურტიის სახნავი ცუდად დამუშავებულ ნიადაგებში მაისიდან სექტემბრის ჩათვლით შეადგენდა: სველ-პოძოლიურ ნიადაგში - 24%, ნაცრისფერ ტყეში პოდზოლირებულ ნიადაგში - 26% და სველ-კირქვა ნიადაგში - 29%.

ფერმენტული პროცესები ნიადაგებში

ნიადაგების ბიოკატალიტიკური აქტივობა მნიშვნელოვნად შეესაბამება მიკროორგანიზმებით მათი გამდიდრების ხარისხს (ცხრილი 11), დამოკიდებულია ნიადაგის ტიპზე და ცვალებადია გენეტიკური ჰორიზონტების მიხედვით, რაც დაკავშირებულია ჰუმუსის შემცველობის, რეაქციის, Red-Ox-ის ცვლილებასთან. პოტენციალი და სხვა ინდიკატორები პროფილის გასწვრივ.

ხელუხლებელი ტყის ნიადაგებში ფერმენტული რეაქციების ინტენსივობას ძირითადად ტყის ნარჩენების ჰორიზონტები, ხოლო სახნავ ნიადაგებში სახნავი ფენებით განსაზღვრავს. როგორც ზოგიერთ, ისე სხვა ნიადაგში, ყველა ბიოლოგიურად ნაკლებად აქტიური გენეტიკური ჰორიზონტი, რომელიც მდებარეობს A ან A p ჰორიზონტების ქვეშ, აქვს ფერმენტის დაბალი აქტივობა, რომელიც ოდნავ იცვლება დადებითი მიმართულებით ნიადაგების გაშენებისას. სახნავ-სათესი მიწებისთვის ტყის ნიადაგების განვითარების შემდეგ, წარმოქმნილი სახნავი ჰორიზონტის ფერმენტული აქტივობა ტყის ნარჩენებთან შედარებით მკვეთრად მცირდება, მაგრამ კულტივირებისას ის იზრდება და მაღალკულტივირებულ სახეობებში უახლოვდება ან აღემატება ამას. ტყის ნაგავი.

11. ნიადაგების ბიოგენურობის და ფერმენტული აქტივობის შედარება შუა ცის-ურალებში (პუხიდსკაია და კოვრიგო, 1974 წ.)

განყოფილების ნომერი, ნიადაგის სახელი	ჰორიზონტი, სინჯის სიღრმე, სმ		მიკროორგანიზმების საერთო რაოდენობა, ათასი 1 გ აბს. მშრალი ნიადაგი (საშუალოდ 1962 წ. 1964-1965 წწ.)	ფერმენტის აქტივობის ინდიკატორები (საშუალო 1969-1971 წწ.)
				ინვერტაზა, მგ გლუკოზა 1 გ ნიადაგზე პირველი დღისთვის	ფოსფატაზა, მგ ფენოლფთალეინი 100 გრ ნიადაგზე 1 საათის განმავლობაში	ურეაზა, მგ NH, 1 გ ნიადაგზე 1 დღის განმავლობაში	კატალაზა, მლ 0 2 1 გრ ნიადაგზე 1 წთ	პოლიფენოლ ოქსიდაზა		პეროქსიდაზა
								მგ პურპუროგალინი 100 გ ნიადაგზე
3. სოდ-საშუალო პოდზოლური საშუალო თიხნარი (ტყის ქვეშ)
					Არ არის განსაზღვრული
1. სველი საშუალო პოდზოლური საშუალო თიხნარი ცუდად კულტივირებული
10. რუხი ტყე პოდზოლირებული მძიმე თიხნარი ცუდად კულტივირებული
2. სოდ-კარბონატული, ოდნავ გაჟღენთილი, მსუბუქი თიხნარი, ცუდად კულტივირებული

იცვლება ბიოკატალიტიკური რეაქციების აქტივობა ნიადაგებში. ყველაზე დაბალია გაზაფხულზე და შემოდგომაზე, ყველაზე მაღალი კი ჩვეულებრივ ივლის-აგვისტოში, რაც შეესაბამება ნიადაგებში ბიოლოგიური პროცესების ზოგადი მიმდინარეობის დინამიკას. თუმცა, ნიადაგების სახეობიდან და მათი გეოგრაფიული მდებარეობიდან გამომდინარე, ფერმენტული პროცესების დინამიკა ძალიან განსხვავებულია.

აკონტროლეთ კითხვები და ამოცანები

1. რა ნაერთებს უწოდებენ ფერმენტებს? რა არის მათი წარმოება და მნიშვნელობა ცოცხალი ორგანიზმებისთვის? 2. დაასახელეთ ნიადაგის ფერმენტების წყაროები. რა როლს ასრულებენ ცალკეული ფერმენტები ნიადაგის ქიმიაში? 3. მიეცით ნიადაგების ფერმენტული კომპლექსის ცნება და მისი ფუნქციონირება. 4. მიეცით ზოგადი აღწერა ფერმენტული პროცესების მიმდინარეობის შესახებ ქალწულ და სახნავ ნიადაგებში.

მიკროორგანიზმების ფერმენტული აქტივობა მდიდარი და მრავალფეროვანია. მისი გამოყენებით შესაძლებელია არა მხოლოდ მიკრობის სახეობა და ტიპი, არამედ მისი ვარიანტების (ე.წ. ბიოვარების) დადგენა. განვიხილოთ ძირითადი ფერმენტული თვისებები და მათი ხარისხობრივი განმარტება.

ნახშირწყლების დაშლა (საქაროლიზური აქტივობა), ანუ შაქრისა და პოლიჰიდრული სპირტების დაშლის უნარი მჟავის ან მჟავისა და აირის წარმოქმნით, შესწავლილია Hiss მედიაზე, რომელიც შეიცავს ამა თუ იმ ნახშირწყალს და ინდიკატორს. ნახშირწყლების დაშლის დროს წარმოქმნილი მჟავის მოქმედებით, ინდიკატორი ცვლის საშუალო ფერს. ამიტომ ამ მედიას „ჭრელი სერიები“ ეწოდება. მიკრობები, რომლებიც არ დუღენ ამ ნახშირწყალს, იზრდება საშუალოზე მისი შეცვლის გარეშე. გაზის არსებობა დგინდება აგარით მედიაში ბუშტების წარმოქმნით ან მისი დაგროვებით თხევად მედიაზე „მოცურავში“. „Float“ - ვიწრო შუშის მილაკი დალუქული ბოლოთი ზევით, რომელიც სტერილიზაციამდე მოთავსებულია საცდელ მილში საშუალო შემცველობით.

გარდა ამისა, საქაროლიზური აქტივობა შესწავლილია Endo, EMS, Ploskirev მედიაზე. მიკროორგანიზმები, რომლებიც ადუღებენ რძის შაქარს (ლაქტოზას) ამ გარემოში მჟავად, ქმნიან ფერად კოლონიებს - მჟავა ცვლის გარემოში არსებული ინდიკატორის ფერს. მიკრობების კოლონიები, რომლებიც არ დუღენ ლაქტოზას, უფეროა.

რძე ლაქტოზას დუღილის მიკრობების ზრდით კოაგულირებს.

მიკროორგანიზმების ზრდით, რომლებიც ქმნიან ამილაზას, ხსნადი სახამებლის შემცველ გარემოზე, იგი იშლება. ეს ცნობილია კულტურაში ლუგოლის ხსნარის რამდენიმე წვეთი დამატებით - გარემოს ფერი არ იცვლება. მოუნელებელი სახამებელი ამ ხსნარით ლურჯ ფერს აძლევს.

პროტეოლიზური თვისებები (ანუ ცილების, პოლიპეპტიდების და ა.შ. დაშლის უნარი) შესწავლილია ჟელატინის, რძის, შრატის, პეპტონის შემცველ მედიაზე. ჟელატინის გარემოზე ჟელატინის დუღილის მიკრობების გამრავლებით, საშუალო თხევადდება. სხვადასხვა მიკრობებით გამოწვეული გათხევადების ბუნება განსხვავებულია. მიკრობები, რომლებიც ანადგურებენ კაზეინს (რძის ცილას) იწვევენ რძის პეპტონიზაციას - ის შრატის იერს იღებს. პეპტონების გაყოფის დროს შეიძლება გამოიყოფა ინდოლი, წყალბადის სულფიდი, ამიაკი. მათი ფორმირება ხდება ინდიკატორის ქაღალდის ნაჭრების გამოყენებით. ფილტრის ქაღალდი წინასწარ გაჟღენთილია გარკვეული ხსნარებით, აშრობენ, ჭრიან ვიწრო ზოლებად 5-6 სმ სიგრძის და კულტურის BCH-ზე დათესვის შემდეგ ათავსებენ კორპის ქვეშ მასსა და სინჯარის კედელს შორის. თერმოსტატში ინკუბაციის შემდეგ მხედველობაში მიიღება შედეგი. ამიაკი იწვევს ლაკმუსის ქაღალდის გალურჯებას; როდესაც წყალბადის სულფიდი გამოიყოფა ტყვიის აცეტატისა და ნატრიუმის ბიკარბონატის 20%-იან ხსნარში დასველებულ ქაღალდზე, წარმოიქმნება ტყვიის სულფატი - ქაღალდი შავდება; ინდოლი იწვევს ოქსილის მჟავას ხსნარში დასველებული ქაღალდის გაწითლებას.

ამ მედიის გარდა, მიკროორგანიზმების უნარი დაშალონ სხვადასხვა საკვები სუბსტრატები, განისაზღვრება გარკვეული რეაგენტებით გაჟღენთილი ქაღალდის დისკების გამოყენებით (ქაღალდის ინდიკატორი სისტემები "SIB"). ეს დისკები შესწავლილ კულტურასთან ერთად ჩაყრიან საცდელ მილებში და უკვე 37°C თერმოსტატში ინკუბაციიდან 3 საათის შემდეგ ნახშირწყლების, ამინომჟავების, ცილების და ა.შ დაშლა ფასდება დისკის ფერის ცვლილებით.

ჰემოლიზური თვისებები (სისხლის წითელი უჯრედების განადგურების უნარი) შესწავლილია სისხლით გარემოზე. ამ შემთხვევაში, თხევადი მედია ხდება გამჭვირვალე და გამჭვირვალე ზონა ჩნდება კოლონიის გარშემო მკვრივ მედიაზე. როდესაც მეტემოგლობინი იქმნება, საშუალო ხდება მწვანე.

კულტურების კონსერვაცია

მეცნიერების ან წარმოებისთვის ღირებული იზოლირებული და შესწავლილი კულტურები (შტამები) ინახება ცოცხალი კულტურის მუზეუმებში. გაერთიანებული მუზეუმი მდებარეობს V.I.-ს სახელობის სამედიცინო ბიოლოგიური პრეპარატების სტანდარტიზაციისა და კონტროლის სახელმწიფო კვლევით ინსტიტუტში. ლ.ა.ტარასევიჩი (GISK).

შენახვის ამოცანაა მიკროორგანიზმების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნება და მათი ცვალებადობის პრევენცია. ამისათვის საჭიროა მიკრობული უჯრედში გაცვლის შესუსტება ან შეჩერება.

კულტურების გრძელვადიანი შენარჩუნების ერთ-ერთი ყველაზე მოწინავე მეთოდი - ლიოფილიზაცია - გაყინული მდგომარეობიდან ვაკუუმში გაშრობა საშუალებას გაძლევთ შექმნათ შეჩერებული ანიმაციის მდგომარეობა. გაშრობა ხორციელდება სპეციალურ მოწყობილობებში. კულტურები ინახება დალუქულ ამპულებში 4 °C ტემპერატურაზე, სასურველია -30-70 °C ტემპერატურაზე.

გამხმარი კულტურების აღდგენა.

ამპულის წვერი ძლიერად თბება საწვავის ცეცხლში და ეხება ცივი წყლით ოდნავ დასველებული ბამბის ტამპონით ისე, რომ მინაზე წარმოიქმნება მიკრობზარები, რომლებითაც ჰაერი ნელ-ნელა ჩაედინება ამპულაში. ამავდროულად, ნაპრალების გახურებულ კიდეებზე გავლისას ხდება ჰაერის სტერილიზაცია.

არ დაგავიწყდეთ, რომ დალუქულ ამპულაში არის ვაკუუმი. თუ ჰაერი მაშინვე შედის მასში დიდი ხვრელის მეშვეობით, ამპულაში არსებული კულტურა შეიძლება შეისხუროს და გამოდევნოს.

ჰაერის შეღწევის შემდეგ, სწრაფად გატეხეთ პინცეტი და ამოიღეთ ამპულის ზედა ნაწილი. ხვრელი მსუბუქად იწვება და გამხსნელი (ბულიონი ან იზოტონური ხსნარი) შეჰყავთ ამპულაში სტერილური პასტერის პიპეტით ან შპრიცით. შეურიეთ ამპულის შიგთავსი და ჩაატარეთ მედიაზე. პირველ კულტურებში რეგენერირებული კულტურების ზრდა შეიძლება შენელდეს.

ასევე შესაძლებელია კულტურების დიდი ხნით შენახვა თხევად აზოტში (-196°C) სპეციალურ მოწყობილობებში.

კულტურების მოკლევადიანი შენარჩუნების მეთოდები შემდეგია: 1) სუბკულტივაცია (პერიოდული გადატანა ახალ გარემოში) ინტერვალებით, რაც დამოკიდებულია მიკროორგანიზმის თვისებებზე, გარემოსა და კულტივირების პირობებზე. კულტურები ინახება 4°C ტემპერატურაზე ხელახლა დათესვას შორის; 2) შენახვა ზეთის ფენის ქვეშ. კულტურას ზრდიან აგარში 5-6 სმ სიმაღლის სვეტში, ასხამენ სტერილური ვაზელინის ზეთით (ზეთის ფენა დაახლოებით 2 სმ) და ინახება ვერტიკალურად მაცივარში. სხვადასხვა მიკროორგანიზმების შენახვის ვადა განსხვავებულია, შესაბამისად, პერიოდულად ითესება საცდელი მილებიდან კულტურა მისი სიცოცხლისუნარიანობის შესამოწმებლად; 3) შენახვა -20-70 °С ტემპერატურაზე; 4) შენახვა დალუქულ მილებში. საჭიროებისამებრ, შენახული მასალა ითესება ახალ გარემოზე.

თავი 8. FAGI

ფაგები არის ბაქტერიების და რიგი სხვა მიკროორგანიზმების ვირუსები. გარკვეულ პირობებში ისინი იწვევენ მასპინძლების ლიზისს (დაშლას). ფაგების მოქმედება ვლინდება ბუნებაში და გამოიყენება პრაქტიკაში.

სურ.42 ბაქტერიოფაგები

ფაგის აღმოჩენისა და შესწავლის ისტორია. 1898 წელს N.F. Gamaley-მ აჩვენა, რომ ჯილეხის ბაცილების ფილტრატი იწვევს ამ მიკროორგანიზმების ახალი კულტურების ლიზას, ბაქტერიული ფილტრები, ხოლო ინარჩუნებს მიკროორგანიზმების ახალი კულტურების დაშლის უნარს. აღწერილია მიკროორგანიზმების ლიზისის ფენომენი, მაგრამ მისი ბუნება შესწავლილი არ არის. სწორედ ამიტომ, ბაქტერიოფაგის აღმოჩენის პატივი კანადელ მეცნიერ დ'ჰერელს ეკუთვნის.

დ "ერელმა (1917) შეისწავლა განავლის ფილტრატები, რომლებსაც ყოველდღიურად იღებდა დიზენტერიით დაავადებული პაციენტისგან და შეჰყავდა სინჯარებში ამ დაავადების გამომწვევი აგენტის ახლად დარგული კულტურით. თერმოსტატში ინკუბაციის შემდეგ კულტურა გაიზარდა. მაგრამ ერთ დღეს ის არ გაიზარდა, მაგრამ დაიშალა, ეს დაემთხვა პაციენტის გამოჯანმრთელების დაწყებას.

დ "ერელმა აჩვენა, რომ განავლის ფილტრატების ლიზისის უნარი გაიზარდა ბაქტერიების ახალ კულტურებზე თანმიმდევრული გავლისას. აქედან მეცნიერმა დაასკვნა, რომ ის ხსნის მათ ცოცხალ აგენტს ბაქტერიული ფილტრების, ანუ ვირუსის გავლით. ამჟამად მისი თვალსაზრისი მიღებულია. მეცნიერთა უმრავლესობის მიერ.

ღია ვირუსი d "Erell უწოდა ბაქტერიოფაგ-მჭამელი ბაქტერიების (ბერძნულიდან phagos - შთანთქმის), ხოლო ფენომენი - ბაქტერიოფაგია.

ელექტრონული მიკროსკოპის აღმოჩენით დადასტურდა ფაგის კორპუსკულური ბუნება და შეისწავლა მისი მორფოლოგია.

d'Herelle-ს აღმოჩენამ მიიპყრო ექიმების ყურადღება, რომლებიც იყენებდნენ ფაგებს რიგი ინფექციური დაავადებების სამკურნალოდ და პროფილაქტიკისთვის. ამჟამად ფაგები ფართოდ გამოიყენება სამედიცინო პრაქტიკაში და სხვადასხვა ბიოლოგიურ კვლევებში. ბაქტერიოლოგები, ვირუსოლოგები, ბიოქიმიკოსები, გენეტიკოსები, ბიოფიზიკოსები, მოლეკულური ბიოლოგები, ფაგებით დაკავებულნი არიან ექსპერიმენტული ონკოლოგები, გენეტიკური ინჟინერიისა და ბიოტექნოლოგიის სპეციალისტები და ა.შ. ფაგის შესწავლა გრძელდება როგორც ბიოლოგიის ერთ-ერთი ყველაზე საინტერესო თავი.

ფაგების თვისებები

ფაგის მორფოლოგია. ფაგების უმეტესობა შედგება თავისა და კუდისგან, ამიტომ მათ ადარებენ თათებს ან სპერმატოზოვას. Escherichia coli-ს T-ფაგები ყველაზე შესწავლილია). მათი პროცესი არის ღრუ ცილინდრი (ღერო), რომელიც დაფარულია გარსით და მთავრდება ბაზალური ფირფიტით ეკლებითა და ფიბრილებით. სხვადასხვა ფაგებში განსხვავებულია ფაგების ზომა, თავის ფორმა და ზომა, პროცესის სიგრძე და სტრუქტურა. მაგალითად, არის ფაგები ხანგრძლივი პროცესით, რომელთა გარსი არ იკუმშება, ფაგები მოკლე პროცესით, პროცესის გარეშე და ძაფისებრი.

ფაგების ქიმიური შემადგენლობა. ყველა ვირუსის მსგავსად, ფაგები შედგება ერთი ტიპის ნუკლეინის მჟავისგან (უფრო გავრცელებულია დნმ-ის ფაგები) და ცილისგან. ნუკლეინის მჟავას მოლეკულა, სპირალურად გადაბმული, მდებარეობს ფაგის თავში. ფაგის გარსი (კაფსიდი) და პროცესი ცილოვანი ხასიათისაა. პროცესის თავისუფალი დასასრული შეიცავს ლიზურ ფერმენტს, ჩვეულებრივ ლიზოზიმს ან ჰიალურონიდაზას.

ფაგის ურთიერთქმედება მგრძნობიარე უჯრედთანგადის თანმიმდევრულ ეტაპებს. მთელი ციკლი იღებს სხვადასხვა სისტემის ფაგ-ბაქტერიებს რამდენიმე წუთიდან 1-2 საათამდე.მოდით, გავაანალიზოთ ამ პროცესის თანმიმდევრობა Escherichia coli-ს T-ლუწი ფაგის მაგალითით.

I ეტაპი - ფაგის ნაწილაკების ადსორბცია უჯრედის ზედაპირულ რეცეპტორებზე ხორციელდება კუდის პროცესის ძაფების დახმარებით. ასობით ფაგის შეწოვა შესაძლებელია ერთ უჯრედზე (ერთი საკმარისია უჯრედის ლიზისისთვის). ფაგის ადსორბცია სპეციფიკურია.

II სტადია - ფაგის ნუკლეინის მჟავის შეღწევა (ინექცია) სხვადასხვა ფაგების უჯრედებში სხვადასხვა გზით ხდება. E. coli T-ფაგებში ბაზალური ლამინატის წვერები კონტაქტშია უჯრედის კედელთან. ჯოხი უჯრედის კედელს „ხვრეტს“. პროცესში ნაპოვნი ფერმენტი, ყველაზე ხშირად ლიზოზიმი, ანადგურებს ციტოპლაზმურ მემბრანას. ამავდროულად, პროცესის გარსი იკუმშება და ფაგის ნუკლეინის მჟავა ღეროს არხით უჯრედში „შეჰყავს“. ფაგის ცარიელი ცილის გარსი ("ჩრდილი") რჩება გარეთ.

III ეტაპი - ფაგის ცილის და ნუკლეინის მჟავის რეპროდუქცია უჯრედის შიგნით.

IV ეტაპი - მომწიფებული ფაგის ნაწილაკების შეკრება და ფორმირება.

სურ.43 ფაგის სტრუქტურა.

1 - თავი; 2 - დნმ; 3 - როდ; 4 - საფარი; 5 - ბაზალური ფირფიტა; 6 მწვერვალი; 7 - კუდის ფიბრილები.

სურ.44 ფაგის მორფოლოგია.

1 - ფაგები თავით, პროცესით და შეკუმშვის გარსით; 2 - თავი და პროცესი, შეკუმშვის გარეშე; 3 - თავი და მოკლე პროცესი; 4 - უკუდო ფაგები; 5-ძაფისებრი ფაგები.

V სტადია - უჯრედის ლიზისი და მისგან მომწიფებული ფაგის ნაწილაკების გათავისუფლება. ჩვეულებრივ, უჯრედის კედელი იშლება და რამდენიმე ასეული ახალი ფაგები გამოიყოფა გარემოში, რომლებსაც შეუძლიათ ახალი უჯრედების დაინფიცირება. ასეთ ლიზას შიგნიდან ლიზისს უწოდებენ.

შიგნიდან ლიზისისგან განსხვავებით, ლიზისი გარედან ხდება მაშინ, როდესაც ფაგების ძალიან დიდი რაოდენობა უჯრედზე ერთდროულად შეიწოვება. ისინი უჯრედის კედელში უამრავ ხვრელს აკეთებენ, რომლითაც უჯრედის შიგთავსი გამოდის. ამრიგად, გარედან ლიზისის დროს ფაგი არ მრავლდება და მისი ნაწილაკების რაოდენობა არ იზრდება.

მიკროორგანიზმებზე მოქმედების ხასიათის მიხედვით განასხვავებენ ვირუსულ და ზომიერ ფაგებს.

ვირულენტური ფაგები იწვევენ ინფიცირებული უჯრედის ლიზას გარემოში დიდი რაოდენობით ფაგის ნაწილაკების განთავისუფლებით, რომლებსაც შეუძლიათ ახალი უჯრედების დაინფიცირება. ამ შემთხვევაში მიკროორგანიზმების კულტურა ლიზდება. თხევადი გარემო ხდება გამჭვირვალე - ხდება ფაგოლიზატის წარმოქმნა - გარემო, რომელშიც დიდი რაოდენობითაა ფაგები. მკვრივ გარემოზე მზარდ ბაქტერიებში ვირულენტური ფაგის განვითარებით, ან წარმოიქმნება უწყვეტი ლიზისის გამჭვირვალე უბნები, ან იზრდება ცალკეული გამჭვირვალე წარმონაქმნები - ფაგის კოლონიები. მათ უარყოფით კოლონიებს (დაფებს) უწოდებენ. კოლონიები - სხვადასხვა ფაგები განსხვავდება ზომითა და სტრუქტურით.

ზომიერი ფაგები არ ასუფთავებენ პოპულაციის ყველა უჯრედს. ზოგიერთ მათგანთან ფაგები შედიან სიმბიოზში: ფაგის ნუკლეინის მჟავა (მისი გენომი) ინტეგრირებულია უჯრედის ქრომოსომაში და ეწოდება პროფაგი. იქმნება ერთი ქრომოსომა. ბაქტერიული უჯრედი არ კვდება. პროფაგი, რომელიც გახდა უჯრედის გენომის ნაწილი, შეიძლება გადაეცეს შეუზღუდავი რაოდენობის შთამომავლებს მისი გამრავლების დროს, ანუ ახალ უჯრედებს. მიკრობული უჯრედის სიმბიოზის ფენომენს ზომიერ ფაგთან (პროფაგთან) ეწოდება ლიზოგენია, ხოლო კულტურას, რომელშიც არის პროფაგი - ლიზოგენური. ეს სახელი ასახავს პროფაგის უნარს, სპონტანურად დატოვოს უჯრედის ქრომოსომა და ციტოპლაზმაში გადასვლისას, გადაიქცეს ვირულენტულ ფაგად. კულტურის ის უჯრედები, რომლებშიც წარმოიქმნა ვირულენტური ფაგი, იღუპება (ლიზი), დანარჩენი რჩება ლიზოგენური.

ფაგისა და ბაქტერიული უჯრედის ურთიერთქმედების ძირითადი ეტაპების სქემა.

1 – ფაგის ნუკლეინის მჟავის შეყვანა კლერკში; 2-ახალგაზრდა, მეცხოველეობა

ფაგები; 3 - მომწიფებული ფაგები; 4 - ფაგების იზოლაცია.

ლიზოგენური კულტურები არ განსხვავდება მათი ძირითადი თვისებებით ორიგინალური კულტურებისგან, მაგრამ ისინი მდგრადია ამავე სახელწოდების ფაგის ხელახალი ინფექციის მიმართ. როდესაც ლიზოგენური კულტურა ექვემდებარება გამჭოლი რადიაციას (გარკვეული დოზები და რენტგენის სხივების, კოსმოსური სხივების ზემოქმედება), გარკვეული ქიმიკატები და რიგი სხვა ფაქტორები, საგრძნობლად იზრდება ვირულენტური ფაგის გამომუშავება და მის მიერ კულტურის უჯრედების ლიზი.

ზომიერი ფაგები შეიძლება საზიანო იყოს მიკრობიოლოგიური წარმოებისთვის. მაგალითად, თუ ვაქცინების, ანტიბიოტიკების და სხვა ბიოლოგიური ნივთიერებების მწარმოებელი შტამები ლიზოგენურია, არსებობს საშიშროება, რომ ზომიერი ფაგი გახდეს ვირულენტური, რაც გამოიწვევს წარმოების შტამის ლიზას.

ზომიერი ფაგები მიკროორგანიზმების ცვალებადობის მძლავრი ფაქტორია. პროფაგს შეუძლია შეცვალოს მიკრობული კულტურის ზოგიერთი თვისება, მაგალითად, გახადოს მას ტოქსინის გამომუშავება, რაც შეინიშნება დიფტერიის ბაცილებს შორის, ალისფერი ცხელების გამომწვევი აგენტი და ა.შ. ფაგს შეუძლია დაიჭიროს მასპინძელი უჯრედის ქრომოსომის ნაწილი და გადაიტანოს ქრომოსომის ეს ნაწილი სხვა უჯრედში, სადაც ფაგი კვლავ გადაიქცევა პროფაგად და უჯრედი შეიძენს ახალ თვისებებს.

ბუნებაში ფაგების განაწილება ყველგან არის. ფაგები გვხვდება იქ, სადაც მათ მიმართ მგრძნობიარე მიკროორგანიზმები გვხვდება: წყალში, ნიადაგში, კანალიზაციაში, ადამიანებისა და ცხოველების ექსკრეციაში და ა.შ. თითქმის ყველა ცნობილი ბაქტერია მათთვის სპეციფიკური ფაგების მასპინძელია.

ფაგების წინააღმდეგობა ფიზიკური და ქიმიური ფაქტორების მიმართ უფრო მაღალია, ვიდრე მათი მასპინძლების ვეგეტატიური ფორმების წინააღმდეგობა. ფაგები უძლებენ გათბობას .75°C-მდე, ხანგრძლივ გაშრობას, pH 2.0-დან 8.5-მდე. ისინი არ არიან მგრძნობიარე ანტიბიოტიკების, თიმოლის, ქლოროფორმისა და რიგი სხვა ნივთიერებების მიმართ, რომლებიც ანადგურებენ თანმხლებ მიკროფლორას. ამიტომ, ეს ნივთიერებები გამოიყენება ფაგების იზოლაციისა და შენარჩუნებისთვის. მჟავები და სადეზინფექციო საშუალებები საზიანოა ფაგებისთვის.

ფაგების პრაქტიკული გამოყენება

ფაგების გამოყენება ეფუძნება მათ მკაცრ სპეციფიკას და მიკრობული უჯრედების განადგურების ან მათთან სიმბიოზში შესვლის უნარს.

ფაგოპროფილაქტიკა და ფაგოთერაპია, ინფექციების პროფილაქტიკა და მკურნალობა ფაგების დახმარებით ეფუძნება იმ ფაქტს, რომ როდესაც ფაგი ხვდება პაციენტის ორგანიზმში პათოგენს, ის ანადგურებს მას. ამჟამად, ფაგები ფართოდ გამოიყენება სტაფილოკოკური და სტრეპტოკოკური ინფექციების სამკურნალოდ და პროფილაქტიკაში, თუნდაც ის, ვინც არ ექვემდებარება ანტიბიოტიკებს, ასევე ქოლერას, ჭირისა და რიგი სხვა ინფექციების, როგორიცაა Escherichia coli და Proteus გამოწვეული ინფექციები.

ფაგის დიაგნოსტიკა მოიცავს: ა) იზოლირებული კულტურების იდენტიფიკაციას ცნობილი (დიაგნოსტიკური) ფაგების გამოყენებით. კულტურა შეესაბამება ფაგს, რომელმაც მოახდინა ის. მაგალითად, თუ ქოლერის ფაგმა გამოიწვია ლიზისი, მაშინ ეს არის ვიბრიო ქოლერის კულტურა. ტიპიური ფაგების მკაცრი სპეციფიკა შესაძლებელს ხდის სახეობების (ფაგოვარების) ვარიანტების აკრეფას. ეპიდემიოლოგიაში დიდი მნიშვნელობა ენიჭება ფაგის ტიპიზაციას, რადგან ის შესაძლებელს ხდის ინფექციის წყაროს დადგენას და რიგი სხვა საკითხების გადაჭრას; ბ) უცნობი ფაგის იდენტიფიკაცია მიკრობების საცდელი კულტურით. თუ ფაგი აანალიზებს დიზენტერიის გამომწვევი აგენტის კულტურას, მაშინ ეს არის დიზენტერიის ფაგი; გ) დაჩქარებული დიაგნოსტიკური მეთოდი RNTF ფაგის ტიტრის გაზრდის რეაქციის გამოყენებით არ საჭიროებს პათოგენის სუფთა კულტურის იზოლაციას. ნახარშს ემატება საცდელი მასალა (პაციენტიდან ან გარემოს ობიექტებიდან) და ინდიკატორი ფაგი, რომლის ტიტრიც მკაცრად არის დადგენილი.

ზომიერი ფაგები ფართოდ გამოიყენება ბიოლოგიის კარდინალური პრობლემების გადასაჭრელად. მათი დახმარებით შესწავლილია გენეტიკური კოდი, მიღწეულია დიდი წარმატება გენური ინჟინერიაში, გამოიყენება სიმსივნის ზრდის შესასწავლად, მიკროორგანიზმების ცვალებადობის ფაქტორად და სხვა კვლევებში. ვინაიდან ლიზოგენური კულტურები, განსხვავებით "ჯანმრთელი" კულტურებისგან, მგრძნობიარეა რადიაციის მიმართ, ისინი ემსახურებიან კოსმოსური სხივებისგან კოსმოსური ხომალდის დაცვის საიმედოობის დადგენას: არასაიმედო დაცვით, პროფაგი გადადის ვირუსულ ფორმაში და ასუფთავებს კულტურას.

ფაგის პრეპარატები

ფაგის პრეპარატების წარმოებისას გამოიყენება მიკროორგანიზმების და ფაგების კარგად შესწავლილი შტამები, რომლებიც ჩვეულებრივ იზრდებიან რეაქტორებში, რაც შესაძლებელს ხდის დიდი რაოდენობით ფაგოლიზატის მიღებას.

ფაგები იწარმოება თხევადი სახით (ამპულები და ფლაკონები), ტაბლეტებში და სუპოზიტორებში. პერორალური მიღებისთვის განკუთვნილი ფაგების ტაბლეტები დაფარულია მჟავა რეზისტენტული საფარით, რომელიც იცავს ფაგებს კუჭის მარილმჟავას მოქმედებისგან.

ყველა ფაგის პრეპარატი ექვემდებარება სავალდებულო კონტროლს უცხო ფლორის, უვნებლობისა და აქტივობის (ტიტრის) არარსებობის გამო, რომელიც ტარდება მათ მწარმოებელ საწარმოში. სელექციური კონტროლი ტარდება სამედიცინო ბიოლოგიური პრეპარატების სტანდარტიზაციისა და კონტროლის სახელმწიფო კვლევით ინსტიტუტში ვ.ი. ლ.ა. ტარასევიჩი. გამოთავისუფლებული ფაგი აღჭურვილია ეტიკეტით, რომელშიც მითითებულია: მისი მწარმოებელი დაწესებულება, ფაგის დასახელება, სერია, საკონტროლო ნომერი და ვარგისიანობის ვადა. თითოეულ შეფუთვას მოჰყვება ფაგის გამოყენებისა და შენახვის ინსტრუქცია.

ფერმენტის აქტივობა.ქვეშ ფერმენტის აქტივობა გაიგეთ მისი რაოდენობა, რომელიც კატალიზებს სუბსტრატის გარკვეული რაოდენობის ტრანსფორმაციას დროის ერთეულზე. ფერმენტული პრეპარატების აქტივობის გამოსახატავად გამოიყენება ორი ალტერნატიული ერთეული: საერთაშორისო (IU) და კატალი (კატა). პერ საქმიანობის საერთაშორისო ერთეული მიღებული ფერმენტის რაოდენობა ისეთია, რომ იგი კატალიზებს 1 მკმოლი სუბსტრატის პროდუქტად გადაქცევას 1 წუთში სტანდარტულ პირობებში (ჩვეულებრივ ოპტიმალური). ერთი შემოვიდა აღნიშნავს ფერმენტის რაოდენობას, რომელიც კატალიზებს 1 მოლი სუბსტრატის გარდაქმნას 1 წამში (1 კატა = 6 ∙ 10 7 სე). ბიმოლეკულურ რეაქციაში A + B = C + D, ფერმენტის აქტივობის ერთეული მიიღება ისეთი რაოდენობით, რომელიც კატალიზებს 1 μmol A ან B, ან 2 μmol A (თუ B = A) გარდაქმნას 1 წუთის განმავლობაში.

ხშირად ფერმენტული პრეპარატები ხასიათდება სპეციფიკური აქტივობით, რაც ასახავს ფერმენტის გაწმენდის ხარისხს. კონკრეტული აქტივობა არის ფერმენტის აქტივობის ერთეულების რაოდენობა 1 მგ ცილაზე.

მოლეკულური აქტივობა (ფერმენტების ბრუნვის რაოდენობა) არის სუბსტრატის მოლეკულების რაოდენობა, რომლებიც გარდაიქმნება ერთი ფერმენტის მოლეკულის მიერ 1 წუთში, როდესაც ფერმენტი მთლიანად გაჯერებულია სუბსტრატით. იგი უდრის ფერმენტის აქტივობის ერთეულების რაოდენობას გაყოფილი ფერმენტის რაოდენობაზე, გამოხატული მიკრომოლებით. მოლეკულური აქტივობის კონცეფცია გამოიყენება მხოლოდ სუფთა ფერმენტებზე.

როდესაც ცნობილია ფერმენტის მოლეკულაში აქტიური ცენტრების რაოდენობა, შემოდის კონცეფცია კატალიზური საიტის აქტივობა . იგი ხასიათდება სუბსტრატის მოლეკულების რაოდენობით, რომლებიც განიცდიან ტრანსფორმაციას 1 წუთში ერთ აქტიურ ცენტრში.

ფერმენტების აქტივობა ძლიერ არის დამოკიდებული გარე პირობებზე, რომელთა შორის საშუალო ტემპერატურა და pH უმნიშვნელოვანესია. ტემპერატურის მატება 0-50°C დიაპაზონში ჩვეულებრივ იწვევს ფერმენტული აქტივობის თანდათანობით ზრდას, რაც ასოცირდება ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის წარმოქმნის პროცესების დაჩქარებასთან და კატალიზის ყველა შემდგომ მოვლენასთან. ტემპერატურის ყოველი 10°C მატებაზე რეაქციის სიჩქარე დაახლოებით ორმაგდება (ვან ჰოფის წესი). თუმცა ტემპერატურის შემდგომ მატებას (>50°C) თან ახლავს ინაქტივირებული ფერმენტის რაოდენობის ზრდა მისი ცილოვანი ნაწილის დენატურაციის გამო, რაც გამოიხატება აქტივობის დაქვეითებით. თითოეული ფერმენტი ხასიათდება ტემპერატურა ოპტიმალური- ტემპერატურის მნიშვნელობა, რომელზედაც აღირიცხება მისი უდიდესი აქტივობა.

ფერმენტის აქტივობის დამოკიდებულება გარემოს pH მნიშვნელობაზე რთულია. თითოეულ ფერმენტს აქვს საკუთარი ოპტიმალური pH გარემოსადაც ის ყველაზე აქტიურია. როგორც თქვენ შორდებით ამ მნიშვნელობას ამა თუ იმ მიმართულებით, ფერმენტული აქტივობა მცირდება. ეს გამოწვეულია ფერმენტის აქტიური ცენტრის მდგომარეობის ცვლილებით (ფუნქციური ჯგუფების იონიზაციის დაქვეითება ან ზრდა), ისევე როგორც მთელი ცილის მოლეკულის მესამეული სტრუქტურა, რაც დამოკიდებულია კატიონურ და ანიონურ ცენტრების თანაფარდობაზე. მასში. ფერმენტების უმეტესობას აქვს ოპტიმალური pH ნეიტრალურ დიაპაზონში. თუმცა, არსებობს ფერმენტები, რომლებიც აჩვენებენ მაქსიმალურ აქტივობას pH 1,5 (პეპსინი) ან 9,5 (არგინაზა). ფერმენტებთან მუშაობისას pH უნდა შენარჩუნდეს შესაბამისი ბუფერული ხსნარით.

ფერმენტის აქტივობა ექვემდებარება მნიშვნელოვან რყევებს ექსპოზიციის მიხედვით ინჰიბიტორები(ნივთიერებები, რომლებიც ნაწილობრივ ან მთლიანად ამცირებს აქტივობას) და აქტივატორები(ნივთიერებები, რომლებიც ზრდის აქტივობას). მათ როლს ასრულებენ ლითონის კათიონები, ზოგიერთი ანიონი, ფოსფატის ჯგუფების მატარებლები, აღმდგენი ეკვივალენტები, სპეციფიკური ცილები, მეტაბოლიზმის შუალედური და საბოლოო პროდუქტები და ა.შ.

ფერმენტული კინეტიკის პრინციპები.კინეტიკური კვლევების არსი არის ფერმენტული რეაქციის მაქსიმალური სიჩქარის განსაზღვრა ( ვ max) და Michaelis მუდმივი K M. ენზიმური კინეტიკა სწავლობს ზოგიერთი ნივთიერების რაოდენობრივ გარდაქმნას სხვებად ფერმენტების მოქმედებით. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარე იზომება სუბსტრატის დაკარგვით ან შედეგად მიღებული პროდუქტის ზრდით დროის ერთეულზე, ან კოენზიმის ერთ-ერთი მიმდებარე ფორმის კონცენტრაციის ცვლილებით.

გავლენა ფერმენტის კონცენტრაციარეაქციის სიჩქარეზე გამოიხატება შემდეგნაირად: თუ სუბსტრატის კონცენტრაცია მუდმივია (სუბსტრატის სიჭარბის გათვალისწინებით), მაშინ რეაქციის სიჩქარე პროპორციულია ფერმენტის კონცენტრაციისა. კინეტიკური კვლევებისთვის გამოიყენება ფერმენტის კონცენტრაცია აქტიური ცენტრების 10-8 მ. ფერმენტის კონცენტრაციის ოპტიმალური მნიშვნელობა განისაზღვრება მის კონცენტრაციაზე ფერმენტის აქტივობის დამოკიდებულების გრაფიკიდან. მიჩნეულია, რომ ოპტიმალური მნიშვნელობა დევს მიღებული გრაფიკის პლატოზე ფერმენტის აქტივობის მნიშვნელობების დიაპაზონში, რომელიც ნაკლებად არის დამოკიდებული მის კონცენტრაციაზე (ნახ. 4.3).

ბრინჯი. 4.3. ფერმენტული რეაქციის სიჩქარის დამოკიდებულება

ფერმენტის კონცენტრაციაზე

გავლენის შესასწავლად სუბსტრატის კონცენტრაციაფერმენტული რეაქციის სიჩქარეზე, ჯერ ააგეთ კინეტიკური მრუდი, რომელიც ასახავს სუბსტრატის (S 1) ან პროდუქტის (P 1) კონცენტრაციის ცვლილებას დროთა განმავლობაში (ნახ. 4.4) და გაზომეთ საწყისი სიჩქარე ( ვ 1) რეაქციები, როგორც ტანგენსის ფერდობის ტანგენსი მრუდზე ნულოვან წერტილში.

ბრინჯი. 4.4. ფერმენტული რეაქციის კინეტიკური მრუდები

მოცემული სუბსტრატის (S 2 , S 3 , S 4 და ა.შ.) ან პროდუქტის (P 2 , P 3 , P 4 და ა.შ.) სხვა კონცენტრაციებისთვის კინეტიკური მრუდების აგებით და საწყისი მაჩვენებლების განსაზღვრით ( ვ 2, ვ 3 , ვ 4 და ა.შ.) რეაქციის, დახაზეთ ფერმენტული რეაქციის საწყისი სიჩქარის დამოკიდებულება სუბსტრატის კონცენტრაციაზე (ფერმენტის მუდმივ კონცენტრაციაზე), რომელსაც აქვს ჰიპერბოლის ფორმა (ნახ. 4.5).

ბრინჯი. 4.5. ფერმენტული რეაქციის საწყისი სიჩქარის დამოკიდებულება

სუბსტრატის კონცენტრაციიდან

მრავალი ფერმენტული რეაქციის კინეტიკა აღწერილია მიქაელის-მენტენის განტოლებით. ფერმენტის მუდმივი კონცენტრაციით და სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაცია[S] საწყისი რეაქციის სიჩქარე პირდაპირპროპორციულია [S]-ის (ნახ. 4.5). ამ შემთხვევაში ჩვენ ვსაუბრობთ ფერმენტის ნახევრად გაჯერებაზე სუბსტრატით, როდესაც ფერმენტის მოლეკულების ნახევარი ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის სახითაა და რეაქციის სიჩქარე. ვ = 1/2ვმაქს. სუბსტრატთან მიმართებაში რეაქციას აქვს 1-ლი რიგი (რეაქციის სიჩქარე პირდაპირპროპორციულია ერთი რეაქტანტის კონცენტრაციაზე) ან მე-2 რიგის (რეაქციის სიჩქარე პროპორციულია ორი რეაქტანტის კონცენტრაციის პროდუქტის).

ზე მაღალი ღირებულებები სუბსტრატის კონცენტრაცია[S] რეაქციის სიჩქარე თითქმის დამოუკიდებელია [S]-ისგან: [S]-ის შემდგომი მატებასთან ერთად, რეაქციის სიჩქარე უფრო და უფრო ნელა იზრდება და საბოლოოდ ხდება მუდმივი (მაქსიმუმი) (ნახ. 4.5). ამ შემთხვევაში, ფერმენტის სრული გაჯერება სუბსტრატით მიიღწევა, როდესაც ფერმენტის ყველა მოლეკულა ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის სახითაა და ვ = ვმაქს. რაც შეეხება სუბსტრატს, რეაქციას აქვს 0-ე რიგი (რეაქციის სიჩქარე არ არის დამოკიდებული რეაქტანტების კონცენტრაციაზე).

1913 წელს ლ. მიქაელისმა და მ. მენტენმა შემოგვთავაზეს მარტივი მოდელი ასეთი კინეტიკის ასახსნელად. ამ მოდელის მიხედვით, სპეციფიკური ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსის ფორმირება კატალიზის აუცილებელი შუალედური ეტაპია.

კ 1 კ 3

E + S ⇄ ES → E + P

ფერმენტ E აერთიანებს სუბსტრატს S-ს და ქმნის ES კომპლექსს. ამ პროცესის სიჩქარის მუდმივი კერთი . ES კომპლექსის ბედი ორგვარია: მას შეუძლია დაიშალა ფერმენტ E-ად და სუბსტრატ S-ად სიჩქარის მუდმივით. კ 2, ან განიცდიან შემდგომ ტრანსფორმაციას, წარმოქმნის პროდუქტს P და თავისუფალ ფერმენტ E-ს, სიჩქარის მუდმივობით კ 3 . ვარაუდობენ, რომ რეაქციის პროდუქტი არ გარდაიქმნება თავდაპირველ სუბსტრატში. ეს მდგომარეობა შეინიშნება რეაქციის საწყის ეტაპზე, ხოლო პროდუქტის კონცენტრაცია დაბალია.

კატალიზის სიჩქარე განისაზღვრება სტაციონარული პირობებიროდესაც შუალედური პროდუქტების კონცენტრაცია რჩება მუდმივი, ხოლო საწყისი მასალების და საბოლოო პროდუქტების კონცენტრაცია იცვლება. ეს ხდება მაშინ, როდესაც ES კომპლექსის ფორმირების სიჩქარე უდრის მისი დაშლის სიჩქარეს.

შეგიძლიათ შემოიტანოთ ახალი მუდმივი K M - მიქაელის მუდმივი(მოლ/ლ), რაც უდრის

მიქაელის-მენტენის განტოლება, რომელიც გამოხატავს რაოდენობრივ კავშირს ფერმენტული რეაქციის სიჩქარესა და სუბსტრატის კონცენტრაციას შორის, აქვს ფორმა

(4.2)

ეს განტოლება შეესაბამება რეაქციის სიჩქარის ნახაზს სუბსტრატის კონცენტრაციასთან მიმართებაში. ზე სუბსტრატის დაბალი კონცენტრაციაროდესაც [S] გაცილებით დაბალია ვიდრე K M, ვ = ვ max [S] / K M, ანუ რეაქციის სიჩქარე პირდაპირპროპორციულია სუბსტრატის კონცენტრაციისა. ზე სუბსტრატის მაღალი კონცენტრაციაროდესაც [S] გაცილებით მაღალია ვიდრე K M, ვ = ვ max, ანუ რეაქციის სიჩქარე მაქსიმალურია და არ არის დამოკიდებული სუბსტრატის კონცენტრაციაზე.

თუ [S] = K M, მაშინ ვ = ვმაქსიმუმ / 2.

ამრიგად, კ მ უდრის სუბსტრატის კონცენტრაციას, რომლის დროსაც რეაქციის სიჩქარე მაქსიმუმის ნახევარია.

მიქაელის მუდმივი (KM) და მაქსიმალური რეაქციის სიჩქარე ( ვ max) არის მნიშვნელოვანი სიჩქარის მახასიათებლები სუბსტრატის სხვადასხვა კონცენტრაციაზე. ვ max არის მუდმივი მნიშვნელობა თითოეული ფერმენტისთვის, რაც შესაძლებელს ხდის შეაფასოს მისი მოქმედების ეფექტურობა.

მიქაელის მუდმივი აჩვენებს სუბსტრატის აფინურობას ფერმენტის მიმართ (იმ შემთხვევაში, როდესაც კ 2 >> კ 3): რაც უფრო დაბალია K M, მით მეტია აფინურობა და უფრო მაღალია რეაქციის სიჩქარე და პირიქით. თითოეული სუბსტრატი ხასიათდება მისი KM მნიშვნელობით მოცემული ფერმენტისთვის და მათი მნიშვნელობები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ფერმენტის სუბსტრატის სპეციფიკის შესაფასებლად. მაიკლისის მუდმივი დამოკიდებულია სუბსტრატის ბუნებაზე, ტემპერატურაზე, pH-ზე, ხსნარის იონურ სიძლიერესა და ინჰიბიტორების არსებობაზე.

იმის გამო, რომ განსაზღვრება ვ max და K M უშუალოდ მიქაელის - მენტენის გრაფიკული დამოკიდებულებიდან (სურ. 4.5) ორაზროვანია, ისინი მიმართავენ ამ განტოლების წრფივებას. ამისათვის ის გარდაიქმნება ისეთ ფორმაში, რომ გრაფიკულად გამოიხატება სწორი ხაზით. არსებობს რამდენიმე ხაზოვანი მეთოდი, რომელთა შორის ყველაზე ხშირად გამოიყენება Lineweaver-Burk და Edie-Hofstee მეთოდები.

ტრანსფორმაცია ლაინვივერ-ბურკი ფორმა აქვს

(4.3)

შექმენით დამოკიდებულების გრაფიკი 1/ ვ = ვ(1/[S]) და მიიღეთ სწორი ხაზი, რომლის გადაკვეთა y ღერძთან იძლევა მნიშვნელობას 1/ ვმაქს ; აბსცისის ღერძზე სწორი ხაზით მოწყვეტილი სეგმენტი იძლევა მნიშვნელობას −1 / K M, ხოლო სწორი ხაზის დახრილობის კუთხის ტანგენსი აბსცისის ღერძზე არის K M /. ვმაქს (ნახ. 4.6). ეს გრაფიკი საშუალებას გაძლევთ უფრო ზუსტად განსაზღვროთ ვმაქს. როგორც ქვემოთ დავინახავთ, ღირებული ინფორმაცია ფერმენტის აქტივობის დათრგუნვასთან დაკავშირებით ასევე შეიძლება ამოღებული იყოს ამ გრაფიკიდან.

ბრინჯი. 4.6. მიქაელის-მენტენის განტოლების წრფივირების მეთოდი

(Lineweaver-Burke-ის მიხედვით)

მეთოდი ედი - ჰოფსტი ეფუძნება მიქაელის-მენტენის განტოლების გარდაქმნას ორივე მხარის გამრავლებით ვმაქს:

(4.4)

გრაფიკი კოორდინატებში ვდა ვ/[S] არის სწორი ხაზი, რომლის გადაკვეთა y ღერძთან იძლევა მნიშვნელობას ვ max და აბსცისის ღერძზე სწორი ხაზით მოწყვეტილი სეგმენტი არის მნიშვნელობა ვ max / K M (ნახ. 4.7). ძალიან აადვილებს K M და ვ max , ასევე აღმოაჩინოს შესაძლო გადახრები წრფივისაგან, რომლებიც არ იყო გამოვლენილი წინა გრაფიკში.

ბრინჯი. 4.7. მიქაელის-მენტენის განტოლების წრფივირების მეთოდი

(ედი-ჰოფსტიის მიხედვით)

ფერმენტის აქტივობის დათრგუნვა.ფერმენტების მოქმედება შეიძლება მთლიანად ან ნაწილობრივ დათრგუნოს გარკვეული ქიმიკატებით - ინჰიბიტორები . მათი მოქმედების ბუნებით, ინჰიბიტორები იყოფა შექცევად და შეუქცევად. ეს დაყოფა ემყარება ინჰიბიტორის შეკავშირების ძალას ფერმენტთან.

შექცევადი ინჰიბიტორები - ეს ის ნაერთებია, რომლებიც ფერმენტთან არაკოვალენტურად ურთიერთქმედებენ და მათი მოცილებისას ფერმენტის აქტივობა აღდგება. შექცევადი ინჰიბირება შეიძლება იყოს კონკურენტუნარიანი, არაკონკურენტული და არაკონკურენტული.

Მაგალითი კონკურენტული დათრგუნვაეს არის სუბსტრატის სტრუქტურული ანალოგების მოქმედება, რომელსაც შეუძლია შეუერთდეს ფერმენტის აქტიურ ცენტრს სუბსტრატის მსგავსად, მაგრამ პროდუქტად გადაქცევის გარეშე და ფერმენტის ნამდვილ სუბსტრატთან ურთიერთქმედების თავიდან აცილების გარეშე, ანუ არსებობს კონკურენცია. სუბსტრატსა და ფერმენტის აქტიურ ცენტრთან შეკავშირების ინჰიბიტორს შორის. ფერმენტ-ინჰიბიტორების (EI) კომპლექსების წარმოქმნის შედეგად მცირდება ES-კომპლექსების კონცენტრაცია და შედეგად მცირდება რეაქციის სიჩქარე. სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, კონკურენტული ინჰიბიტორი ამცირებს კატალიზის სიჩქარეს ფერმენტის მოლეკულების პროპორციის შემცირებით, რომლებიც აკავშირებენ სუბსტრატს.

რეაქციის სიჩქარის გაზომვა სუბსტრატის სხვადასხვა კონცენტრაციაზე შესაძლებელს ხდის განასხვავოს კონკურენტული ინჰიბიცია არაკონკურენტული ინჰიბიციისგან. კონკურენტული დათრგუნვით დამოკიდებულების გრაფიკზე 1/ ვ=ვ(1/[S]) წრფეები კვეთენ y-ღერძს ერთ წერტილში 1/ ვ max ინჰიბიტორის არსებობის მიუხედავად, მაგრამ ინჰიბიტორის არსებობისას იზრდება სწორი ხაზის დახრილობის ტანგენსი აბსცისის ღერძზე, ე.ი. ვ max არ იცვლება, ხოლო KM იზრდება, რაც მიუთითებს ფერმენტისადმი სუბსტრატის აფინურობის შემცირებაზე ინჰიბიტორის არსებობისას (ნახ. 4.8). ამიტომ, სუბსტრატის საკმარისად მაღალი კონცენტრაციის პირობებში, ფერმენტის აქტიური ადგილისთვის კონკურენციის პირობებში, როდესაც სუბსტრატი ანაცვლებს ინჰიბიტორს აქტიური ადგილიდან, დათრგუნვა შეიძლება აღმოიფხვრას და აღდგება კატალიზებული რეაქციის სიჩქარე. ამ შემთხვევაში მიქაელის − მენტენის განტოლებას აქვს ფორმა

(4.5)

სადაც [I] არის ინჰიბიტორის კონცენტრაცია; კ მე არის დათრგუნვის მუდმივი.

ინჰიბიციის მუდმივი ახასიათებს ფერმენტის აფინურობას ინჰიბიტორთან და არის EI კომპლექსის დისოციაციის მუდმივი:

(4.6)

კონკურენტული ინჰიბიტორის თანდასწრებით, სწორი ხაზის დახრილობა x-ღერძზე იზრდება (1 + [I]/) კ მე).

ბრინჯი. 4.8. კონკურენტული დათრგუნვა:

a - სქემა; b - გრაფიკული გამოხატულება Lineweaver-ის მიხედვით - Burke

ზე არაკონკურენტული დათრგუნვაინჰიბიტორი სტრუქტურით განსხვავდება სუბსტრატისგან და უკავშირდება არა ფერმენტის აქტიურ, არამედ ალოსტერულ ადგილს. ეს იწვევს ფერმენტის აქტიური ადგილის კონფორმაციის ცვლილებას, რასაც თან ახლავს ფერმენტის კატალიზური აქტივობის დაქვეითება. უფრო მეტიც, ინჰიბიტორს შეუძლია დაუკავშირდეს არა მხოლოდ თავისუფალ ფერმენტს (E + I → EI), არამედ ფერმენტ-სუბსტრატის კომპლექსს (ES + I → ESI). ორივე ფორმა EI და ESI არ არის აქტიური. სუბსტრატსა და ინჰიბიტორს შეიძლება ერთდროულად შეუერთდეს ფერმენტის მოლეკულა, მაგრამ მათი დამაკავშირებელი ადგილები არ ემთხვევა ერთმანეთს. არაკონკურენტული ინჰიბიტორის მოქმედება არის ფერმენტების ბრუნვის რაოდენობის შემცირება და არა სუბსტრატთან დაკავშირებული ფერმენტის მოლეკულების პროპორციის შემცირება. ინჰიბიტორი ხელს არ უშლის ES კომპლექსების წარმოქმნას, მაგრამ აფერხებს სუბსტრატის პროდუქტად გადაქცევას. ამით ვ max მცირდება, ანუ ინჰიბიტორის არსებობისას სწორი ხაზის გადაკვეთა y-ღერძთან მოხდება უფრო მაღალ წერტილში (ნახ. 4.9). იმავე ზომით, სწორი ხაზის დახრილობის კუთხის ტანგენსი აბსცისის ღერძზე, ტოლია K M / ვმაქსიმუმ მე. K M განსხვავებით ვ max არ იცვლება, ამიტომ არაკონკურენტული დათრგუნვა არ შეიძლება აღმოიფხვრას სუბსტრატის კონცენტრაციის გაზრდით.

ბრინჯი. 4.9. არაკონკურენტული ინჰიბირება:

a - სქემა; b - გრაფიკული გამოხატულება Lineweaver-ის მიხედვით - Burke

რეაქციის მაქსიმალური სიჩქარე ვ max I არაკონკურენტული ინჰიბიტორის თანდასწრებით აღწერილია განტოლებით

(4.7)

კონკრეტულ შემთხვევაში არაკონკურენტული დათრგუნვაროდესაც ინჰიბიტორი უკავშირდება მხოლოდ ES-კომპლექსს და არ უკავშირდება თავისუფალ ფერმენტს, დამოკიდებულების გრაფიკზე 1/ ვ = ვ(1/[S]) ხაზები ერთმანეთის პარალელურია და კვეთს ორდინატთა და აბსცისის ღერძებს სხვადასხვა წერტილში (ნახ. 4.10).

ბრინჯი. 4.10. არაკონკურენტული დათრგუნვა:

a - სქემა; b - გრაფიკული გამოხატულება Lineweaver-ის მიხედვით - Burke

შეუქცევადი ინჰიბიტორები - ეს არის სხვადასხვა ქიმიური ბუნების უაღრესად რეაქტიული ნაერთები, რომლებსაც შეუძლიათ ურთიერთქმედება აქტიური ცენტრის ფუნქციურად მნიშვნელოვან ჯგუფებთან, ქმნიან ძლიერ კოვალენტურ ბმებს. ეს იწვევს ფერმენტის აქტივობის შეუქცევად დაკარგვას. ამასთან დაკავშირებით, მიქაელის-მენტენის თეორია, რომელიც ეფუძნება ვარაუდს, რომ ინჰიბიტორის მიმაგრება ფერმენტზე შექცევადია, ამ შემთხვევაში არ გამოიყენება.

შეუქცევადი ინჰიბირების მაგალითია ფერმენტების ურთიერთქმედება მძიმე მეტალის იონებთან, რომლებიც მიმაგრებულია ფერმენტის ცისტეინის ნარჩენების სულფჰიდრილ ჯგუფებთან და ქმნიან მერკაპტიდებს, რომლებიც პრაქტიკულად არადისოციაციური ნაერთებია, ან ფერმენტის კოვალენტური მოდიფიკაცია. ალკილირების აგენტების მოქმედება.

ფერმენტის აქტივობის კონცეფცია

ყოველდღიურ ბიოქიმიურ პრაქტიკაში პრაქტიკულად არ არის შეფასებული ფერმენტის რაოდენობა, არამედ მხოლოდ მისი აქტივობა. აქტივობა უფრო ფართო ცნებაა, ვიდრე რაოდენობა. ეს გულისხმობს უპირველეს ყოვლისა რეაქციის შედეგს, კერძოდ, სუბსტრატის დაკარგვას ან პროდუქტის დაგროვებას. ბუნებრივია, არ შეიძლება უგულებელვყოთ ფერმენტის მუშაობის დრო და ფერმენტის მოლეკულების რაოდენობა. მაგრამ რადგანაც, როგორც წესი, არარეალურია ფერმენტის მოლეკულების რაოდენობის გამოთვლა, გამოიყენება ფერმენტის შემცველი ბიოლოგიური მასალის რაოდენობა (მოცულობა ან მასა).

ამრიგად, ფერმენტების აქტივობის განსაზღვრისას, ერთდროულად უნდა იქნას გათვალისწინებული სამი ცვლადი:

• მიღებული პროდუქტის ან გაუჩინარებული სუბსტრატის მასა;
• რეაქციაზე დახარჯული დრო;
• ფერმენტის რაოდენობა, მაგრამ რეალურად ბიოლოგიური მასალის მასა ან მოცულობა, რომელიც შეიცავს ფერმენტს.

ამ ფაქტორებს შორის ურთიერთობის გასაგებად, ნათელი და მარტივი მაგალითი შეიძლება იყოს ორი შენობის მშენებლობა. შენობები უტოლდება რეაქციის პროდუქტს, მუშები ფერმენტებია, დაე, გუნდი შეესაბამებოდეს ბიოლოგიური მასალის მოცულობას. ასე რომ, დავალებები მე-3 კლასიდან:

1. ერთი კორპუსის მშენებლობაზე 10 კაციანი გუნდი მუშაობდა, იმავე ტიპის სხვა შენობაზე 5 კაციანი გუნდი. მშენებლობა ერთდროულად და სრულად დასრულდა. სად არის უფრო მაღალი მუშების აქტივობა?
2. ერთი 3 სართულიანი შენობის მშენებლობაზე 10 კაციანი გუნდი მუშაობდა, მეორე 12 სართულიანი - 10 კაციანი გუნდი. მშენებლობა ერთდროულად და სრულად დასრულდა. სად არის უფრო მაღალი მუშების აქტივობა?
3. ერთი 5 სართულიანი კორპუსის მშენებლობაზე მუშაობდა 10 კაციანი გუნდი, იმავე შენობის მეორე - 10 კაციანი გუნდი. პირველი კორპუსის მშენებლობა 20 დღეში გაგრძელდა, მეორე კი 10 დღეში დასრულდა. სად არის უფრო მაღალი მუშების აქტივობა?

ფერმენტული აქტივობის რაოდენობრივი განსაზღვრის საფუძვლები

1. ფერმენტის აქტივობა გამოიხატება როგორც პროდუქტის დაგროვების სიჩქარე ან სუბსტრატის დაკარგვის სიჩქარე ფერმენტის შემცველი მასალის ოდენობით.

პრაქტიკაში, ისინი ჩვეულებრივ იყენებენ:

• ნივთიერების რაოდენობის ერთეული - მოლი (და მისი წარმოებულები მმოლი, მკმოლი), გრამი (კგ, მგ),
• დროის ერთეული - წუთი, საათი, წამი,
• მასის ან მოცულობის ერთეული - გრამი (კგ, მგ), ლიტრი (მლ).

ასევე აქტიურად გამოიყენება სხვა წარმოებულები - კატალი (მოლ/წმ), აქტივობის საერთაშორისო ერთეული (IU, Unit) შეესაბამება μmol/min.

ამრიგად, ფერმენტის აქტივობა შეიძლება გამოიხატოს, მაგალითად, მმოლ/ს×ლ, გ/სთ×ლ, სე/ლ, კატა/მლ და ა.შ.

მაგალითად, ცნობილია

2. სტანდარტული პირობების შექმნა, რათა შესაძლებელი იყოს სხვადასხვა ლაბორატორიაში მიღებული შედეგების შედარება - ოპტიმალური pH და ფიქსირებული ტემპერატურა, მაგალითად, 25°C ან 37°C, სუბსტრატის ინკუბაციის დროის დაცვა ფერმენტთან.

მიკროორგანიზმების ფერმენტული აქტივობა მდიდარი და მრავალფეროვანია. მისი გამოყენებით შესაძლებელია არა მხოლოდ მიკრობის სახეობა და ტიპი, არამედ მისი ვარიანტების (ე.წ. ბიოვარების) დადგენა. განვიხილოთ ძირითადი ფერმენტული თვისებები და მათი ხარისხობრივი განმარტება.

ნახშირწყლების დაშლა(საქაროლიზური აქტივობა), ანუ შაქრისა და პოლიჰიდრული სპირტების დაშლის უნარი მჟავის ან მჟავისა და აირის წარმოქმნით, შესწავლილია Giss მედიაზე, რომელიც შეიცავს ამა თუ იმ ნახშირწყალს და ინდიკატორს. ნახშირწყლების დაშლის დროს წარმოქმნილი მჟავის მოქმედებით, ინდიკატორი ცვლის საშუალო ფერს. ამიტომ ამ მედიას „ჭრელი სერიები“ ეწოდება. მიკრობები, რომლებიც არ დუღენ ამ ნახშირწყალს, იზრდება საშუალოზე მისი შეცვლის გარეშე. გაზის არსებობა დგინდება აგარით მედიაში ბუშტების წარმოქმნით ან მისი დაგროვებით თხევად მედიაზე „მოცურავში“. „Float“ - ვიწრო მინის მილაკი დალუქული ბოლოთი ზევით, რომელიც სტერილიზაციამდე მოთავსებულია საცდელ მილში გარემოსთან ერთად (სურ. 18).

ბრინჯი. 18. მიკროორგანიზმების საქაროლიზური აქტივობის შესწავლა. I - "ჭრელი სერია": ა - თხევადი გარემო ნახშირწყლებით და ანდრედეს ინდიკატორით; ბ - ნახევრად თხევადი გარემო BP ინდიკატორით: 1 - მიკროორგანიზმები არ დუღენ ნახშირწყლებს; 2 - მიკროორგანიზმები ადუღებენ ნახშირწყლებს მჟავის წარმოქმნით; 3 - მიკროორგანიზმები ადუღებენ ნახშირწყლებს მჟავისა და აირის წარმოქმნით; II - მიკროორგანიზმების კოლონიები, რომლებიც არ იშლება (უფერო) და იშლება ლაქტოზა (იისფერი EMS გარემოზე - მარცხნივ, წითელი Endo გარემოზე - მარჯვნივ)

გარდა ამისა, საქაროლიზური აქტივობა შესწავლილია Endo, EMS, Ploskirev მედიაზე. მიკროორგანიზმები, რომლებიც ადუღებენ რძის შაქარს (ლაქტოზას) ამ გარემოში მჟავად, ქმნიან ფერად კოლონიებს - მჟავა ცვლის გარემოში არსებული ინდიკატორის ფერს. მიკრობების კოლონიები, რომლებიც არ ადუღებენ ლაქტოზას, უფეროა (იხ. სურ. 18).

რძე ლაქტოზას დუღილის მიკრობების ზრდით კოაგულირებს.

მიკროორგანიზმების ზრდით, რომლებიც ქმნიან ამილაზას, ხსნადი სახამებლის შემცველ გარემოზე, იგი იშლება. ეს ცნობილია კულტურაში ლუგოლის ხსნარის რამდენიმე წვეთი დამატებით - გარემოს ფერი არ იცვლება. მოუნელებელი სახამებელი ამ ხსნარით ლურჯ ფერს აძლევს.

პროტეოლიზური თვისებები(ანუ ცილების, პოლიპეპტიდების და ა.შ. დაშლის უნარი) შესწავლილია ჟელატინის, რძის, შრატის, პეპტონის შემცველ მედიაზე. ჟელატინის გარემოზე ჟელატინის დუღილის მიკრობების გამრავლებით, საშუალო თხევადდება. სხვადასხვა მიკრობებით გამოწვეული გათხევადების ბუნება განსხვავებულია (სურ. 19). მიკრობები, რომლებიც ანადგურებენ კაზეინს (რძის ცილას) იწვევენ რძის პეპტონიზაციას - ის შრატის იერს იძენს. პეპტონების გაყოფის დროს შეიძლება გამოიყოფა ინდოლი, წყალბადის სულფიდი, ამიაკი. მათი ფორმირება ხდება ინდიკატორის ქაღალდის ნაჭრების გამოყენებით. ფილტრის ქაღალდს წინასწარ სვამენ გარკვეული ხსნარებით, აშრობენ, ჭრიან ვიწრო ზოლებად 5-6 სმ სიგრძის და კულტურის დათესვის შემდეგ BCH-ზე ათავსებენ კორპის ქვეშ მასსა და სინჯარის კედელს შორის. თერმოსტატში ინკუბაციის შემდეგ მხედველობაში მიიღება შედეგი. ამიაკი იწვევს ლაკმუსის ქაღალდის გალურჯებას; როდესაც წყალბადის სულფიდი გამოიყოფა ტყვიის აცეტატისა და ნატრიუმის ბიკარბონატის 20%-იან ხსნარში დასველებულ ქაღალდზე, წარმოიქმნება ტყვიის სულფატი - ქაღალდი შავდება; ინდოლი იწვევს ოქსილის მჟავას ხსნარში დასველებული ქაღალდის გაწითლებას (იხ. სურ. 19).

ბრინჯი. 19. მიკროორგანიზმების პროტეოლიზური თვისებები. 1 - ჟელატინის გათხევადების ფორმები; II - წყალბადის სულფიდის განსაზღვრა; III - ინდოლის განსაზღვრა: 1 - უარყოფითი შედეგი; 2 - დადებითი შედეგი

ამ მედიის გარდა, მიკროორგანიზმების უნარი დეგრადირება გაუკეთონ სხვადასხვა საკვებ სუბსტრატს, განისაზღვრება გარკვეული რეაგენტებით გაჟღენთილი ქაღალდის დისკების გამოყენებით (ქაღალდის ინდიკატორი სისტემები "SIB"). ეს დისკები ჩაედინება საცდელ მილებში შესასწავლ კულტურასთან ერთად და უკვე 3 საათის ინკუბაციიდან 37°C თერმოსტატში, ნახშირწყლების, ამინომჟავების, ცილების და ა.შ. დაშლა ფასდება ფერის ცვლილებით. დისკები.

ჰემოლიზური თვისებები (სისხლის წითელი უჯრედების განადგურების უნარი) შესწავლილია სისხლით გარემოზე. ამ შემთხვევაში, თხევადი მედია ხდება გამჭვირვალე და გამჭვირვალე ზონა ჩნდება კოლონიის გარშემო მკვრივ მედიაზე (სურ. 20). როდესაც მეტემოგლობინი იქმნება, საშუალო ხდება მწვანე.

ბრინჯი. 20. ჰემოლიზი სისხლის აგარზე მზარდი კოლონიების ირგვლივ

კულტურების შენარჩუნება

მეცნიერების ან წარმოებისთვის ღირებული იზოლირებული და შესწავლილი კულტურები (შტამები) ინახება ცოცხალი კულტურის მუზეუმებში. გაერთიანებული მუზეუმი მდებარეობს V.I.-ს სახელობის სამედიცინო ბიოლოგიური პრეპარატების სტანდარტიზაციისა და კონტროლის სახელმწიფო კვლევით ინსტიტუტში. ლ.ა.ტარასევიჩი (GISK).

შენახვის ამოცანაა მიკროორგანიზმების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნება და მათი ცვალებადობის პრევენცია. ამისათვის საჭიროა მიკრობული უჯრედში გაცვლის შესუსტება ან შეჩერება.

კულტურების გრძელვადიანი შენარჩუნების ერთ-ერთი ყველაზე მოწინავე მეთოდი - ლიოფილიზაცია - გაყინული მდგომარეობიდან ვაკუუმში გაშრობა საშუალებას გაძლევთ შექმნათ შეჩერებული ანიმაციის მდგომარეობა. გაშრობა ხორციელდება სპეციალურ მოწყობილობებში. კულტურები ინახება დალუქულ ამპულებში 4°C ტემპერატურაზე, სასურველია -30-70°C ტემპერატურაზე.

გამხმარი კულტურების აღდგენა. ამპულის წვერი ძლიერად თბება საწვავის ცეცხლში და ეხება ცივი წყლით ოდნავ დასველებული ბამბის ტამპონით ისე, რომ მინაზე წარმოიქმნება მიკრობზარები, რომლებითაც ჰაერი ნელ-ნელა ჩაედინება ამპულაში. ამავდროულად, ნაპრალების გახურებულ კიდეებზე გავლისას ხდება ჰაერის სტერილიზაცია.

* (ნაცხზე წყლის ჭარბი რაოდენობით, მას შეუძლია მოხვდეს ამპულაში და დაარღვიოს კულტურის სტერილობა: იგი შეიწოვება წარმოქმნილი მიკრობზარების მეშვეობით, რადგან ამპულაში არის ვაკუუმი.)

ყურადღება! არ დაგავიწყდეთ, რომ დალუქულ ამპულაში არის ვაკუუმი. თუ ჰაერი მაშინვე შედის მასში დიდი ხვრელის მეშვეობით, ამპულაში არსებული კულტურა შეიძლება შეისხუროს და გამოდევნოს.

ჰაერის შეღწევის შემდეგ, სწრაფად გატეხეთ პინცეტი და ამოიღეთ ამპულის ზედა ნაწილი. ხვრელი მსუბუქად იწვება და გამხსნელი (ბულიონი ან იზოტონური ხსნარი) შეჰყავთ ამპულაში სტერილური პასტერის პიპეტით ან შპრიცით. შეურიეთ ამპულის შიგთავსი და ჩაატარეთ მედიაზე. პირველ კულტურებში რეგენერირებული კულტურების ზრდა შეიძლება შენელდეს.

ასევე შესაძლებელია კულტურების შენარჩუნება თხევად აზოტში (-196 ° C) სპეციალურ მოწყობილობებში დიდი ხნის განმავლობაში.

კულტურების მოკლევადიანი შენარჩუნების მეთოდები შემდეგია: 1) სუბკულტივაცია (პერიოდული გადატანა ახალ გარემოში) ინტერვალებით, რაც დამოკიდებულია მიკროორგანიზმის თვისებებზე, გარემოსა და კულტივირების პირობებზე. კულტურები ინახება 4°C ტემპერატურაზე ხელახლა დათესვას შორის; 2) შენახვა ზეთის ფენის ქვეშ. კულტურას ზრდიან აგარში 5-6 სმ სიმაღლის სვეტში, ასხამენ სტერილური ვაზელინის ზეთით (ზეთის ფენა დაახლოებით 2 სმ) და ინახება ვერტიკალურად მაცივარში. სხვადასხვა მიკროორგანიზმების შენახვის ვადა განსხვავებულია, შესაბამისად, პერიოდულად ითესება საცდელი მილებიდან კულტურა მისი სიცოცხლისუნარიანობის შესამოწმებლად; 3) შენახვა -20-70°C-ზე; 4) შენახვა დალუქულ მილებში. საჭიროებისამებრ, შენახული მასალა ითესება ახალ გარემოზე.

ტესტის კითხვები

1. რა შედის „ბაქტერიოლოგიური კვლევის“ ცნებაში?

2. როგორი უნდა იყოს ასეთი კვლევის კულტურა?

3. რა არის მიკრობული კოლონია, კულტურა, შტამი, კლონი?

4. რას მოიცავს „მიკრობების კულტურული თვისებების“ კონცეფცია?

ვარჯიში

1. შეისწავლეთ და აღწერეთ რამდენიმე კოლონია. გადაიტანეთ ისინი აგარის დახრილობაზე და სექტორში.

2. შეისწავლეთ და აღწერეთ ზრდის სქემა - აგარის დახრილი კულტურები. განსაზღვრეთ კულტურის სისუფთავე და მორფოლოგია შეღებილ პრეპარატში.

3. გადაიტანეთ კულტურა აგარის დახრილიდან ბულიონზე და დიფერენციალურ დიაგნოსტიკაზე. შეისწავლეთ და ჩაიწერეთ ოქმში კულტურის ზრდის ნიმუში ამ გარემოზე და მისი ფერმენტული თვისებები.