Pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) je povaha procesov prebiehajúcich v chromatografickej kolóne vo všeobecnosti identická s procesmi v plynovej chromatografii. Jediný rozdiel je v použití kvapaliny ako stacionárnej fázy. V dôsledku vysokej hustoty kvapalných mobilných fáz a vysokej odolnosti kolón sa plynová a kvapalinová chromatografia značne líšia v prístrojovom vybavení.

Pri HPLC sa ako mobilné fázy zvyčajne používajú čisté rozpúšťadlá alebo ich zmesi.

Na vytvorenie prúdu čistého rozpúšťadla (alebo zmesí rozpúšťadiel), ktorý sa v kvapalinovej chromatografii nazýva eluent, sa používajú čerpadlá zahrnuté v hydraulickom systéme chromatografu.

Adsorpčná chromatografia sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich separácii do zón počas pohybu s mobilnou fázou pozdĺž kolóny. Zónová separácia zložiek v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Najpoužívanejšie v HPLC sú silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami, povrchmi a priemermi pórov. Oxid hlinitý a iné adsorbenty sa používajú oveľa menej často. Hlavný dôvod:

Nedostatočná mechanická pevnosť, ktorá neumožňuje balenie a použitie pri vysokých tlakoch charakteristických pre HPLC;

silikagél má v porovnaní s oxidom hlinitým širší rozsah pórovitosti, plochy povrchu a priemeru pórov; Výrazne väčšia katalytická aktivita oxidu hlinitého vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie.

Detektory pre HPLC

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa používa na detekciu polárnych neprchavých látok, ktoré sa z nejakého dôvodu nedajú previesť do formy vhodnej pre plynovú chromatografiu, a to ani vo forme derivátov. Medzi takéto látky patria najmä sulfónové kyseliny, vo vode rozpustné farbivá a niektoré pesticídy, napríklad deriváty fenylmočoviny.

Detektory:

UV detektor na diódovej matrici. „Matrica“ fotodiód (je ich viac ako dvesto) neustále registruje signály v UV a viditeľnej oblasti spektra, čím zabezpečuje záznam UV-B spektier v režime skenovania. To umožňuje nepretržite zaznamenávať pri vysokej citlivosti neskreslené spektrá komponentov rýchlo prechádzajúcich špeciálnou bunkou.

V porovnaní s detekciou jednej vlnovej dĺžky, ktorá neposkytuje informácie o špičkovej čistote, možnosť porovnať celé spektrá diódového poľa poskytuje oveľa vyšší stupeň spoľahlivosti výsledku identifikácie.

Fluorescenčný detektor. Veľká obľuba fluorescenčných detektorov je spôsobená ich veľmi vysokou selektivitou a citlivosťou a skutočnosťou, že mnohé látky znečisťujúce životné prostredie fluoreskujú (napr. polyaromatické uhľovodíky).

Elektrochemický detektor sa používa na detekciu látok, ktoré sa ľahko oxidujú alebo redukujú: fenoly, merkaptány, amíny, aromatické nitro a halogénderiváty, aldehydy, ketóny, benzidíny.

Chromatografická separácia zmesi na kolóne v dôsledku pomalého postupu PF zaberá veľa času. Na urýchlenie procesu sa chromatografia uskutočňuje pod tlakom. Táto metóda sa nazýva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Modernizácia zariadení používaných v klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografii z nej urobila jednu z najsľubnejších a najmodernejších metód analýzy. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je vhodná metóda na separáciu, preparatívnu izoláciu a kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu neprchavých termolabilných zlúčenín s nízkou aj vysokou molekulovou hmotnosťou.

V závislosti od typu použitého sorbentu táto metóda využíva 2 možnosti chromatografie: na polárnom sorbente s použitím nepolárneho eluentu (možnosť priamej fázy) a na nepolárnom sorbente s použitím polárneho eluentu - tzv. -výkonná kvapalinová chromatografia (RPHPLC).

Počas prechodu z eluentu na eluent sa rovnováha v podmienkach HPLC nastaví mnohonásobne rýchlejšie ako v podmienkach polárnych sorbentov a nevodných PF. V dôsledku toho, ako aj pohodlnosti práce s vodnými a vodno-alkoholovými eluentmi, OFVLC teraz získal veľkú popularitu. Väčšina HPLC analýz sa vykonáva pomocou tejto metódy.

Detektory. Výstup jednotlivej zložky z kolóny sa zaznamenáva pomocou detektora. Na registráciu môžete použiť zmenu akéhokoľvek analytického signálu prichádzajúceho z mobilnej fázy a súvisiaceho s povahou a množstvom zložky zmesi. Kvapalinová chromatografia využíva analytické signály, ako je absorpcia svetla alebo svetelná emisia výstupného roztoku (fotometrické a fluorimetrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivosť (elektrochemické detektory) atď.

Priebežne detekovaný signál je zaznamenaný záznamníkom. Chromatogram je sekvencia signálov detektora zaznamenaná na záznamovej páske, generovaná, keď jednotlivé zložky zmesi opúšťajú kolónu. Ak je zmes oddelená, na vonkajšom chromatograme sú viditeľné jednotlivé píky. Poloha píku v chromatograme sa používa na účely identifikácie látky, výšky alebo plochy píku - na účely kvantitatívneho stanovenia.

Aplikácia

HPLC sa najčastejšie používa v nasledujúcich oblastiach chemickej analýzy (zvýraznené sú predmety analýzy, kde HPLC prakticky nemá konkurenciu):

· Kontrola kvality potravín - posilňujúce a dochucovacie prísady, aldehydy, ketóny, vitamíny, cukry, farbivá, konzervačné látky, hormonálne lieky, antibiotiká, triazín, karbamát a iné pesticídy, mykotoxíny, nitrozamíny, polycyklické aromatické uhľovodíky atď.

· Ochrana životného prostredia - fenoly, organické nitrozlúčeniny, mono- a polycyklické aromatické uhľovodíky, množstvo pesticídov, hlavné anióny a katióny.

· Forenzné - drogy, organické výbušniny a farbivá, silné liečivá.

· Farmaceutický priemysel - steroidné hormóny, takmer všetky produkty organickej syntézy, antibiotiká, polymérne prípravky, vitamíny, proteínové prípravky.

· Medicína - uvedené biochemické a liečivé látky a ich metabolity v biologických tekutinách (aminokyseliny, puríny a pyrimidíny, steroidné hormóny, lipidy) pri diagnostike ochorení, určovaní rýchlosti vylučovania liečiv z organizmu za účelom ich individuálneho dávkovania.

· Poľnohospodárstvo - stanovenie dusičnanov a fosforečnanov v pôdach na stanovenie potrebného množstva aplikovaných hnojív, stanovenie nutričnej hodnoty krmív (aminokyseliny a vitamíny), rozbor pesticídov v pôde, vode a poľnohospodárskych produktoch.

· Biochémia, bioorganická chémia, genetické inžinierstvo, biotechnológia - cukry, lipidy, steroidy, proteíny, aminokyseliny, nukleozidy a ich deriváty, vitamíny, peptidy, oligonukleotidy, porfyríny atď.

· Organická chémia - všetky stabilné produkty organickej syntézy, farbivá, termolabilné zlúčeniny, neprchavé zlúčeniny; anorganická chémia (takmer všetky rozpustné zlúčeniny vo forme iónov a komplexných zlúčenín).

· kontrola kvality a bezpečnosti potravín, alkoholických a nealkoholických nápojov, pitnej vody, chemikálií pre domácnosť, parfumov vo všetkých fázach ich výroby;

· určenie povahy znečistenia na mieste katastrofy spôsobenej ľudskou činnosťou alebo mimoriadnej udalosti;

· detekcia a analýza omamných, silných, jedovatých a výbušných látok;

· stanovenie prítomnosti škodlivých látok (polycyklické a iné aromatické uhľovodíky, fenoly, pesticídy, organické farbivá, ióny ťažkých kovov, alkalických kovov a kovov alkalických zemín) v kvapalných odpadoch, emisiách do ovzdušia a tuhých odpadoch z podnikov a v živých organizmoch;

· sledovanie procesov organickej syntézy, rafinácie ropy a uhlia, biochemickej a mikrobiologickej výroby;

analýza kvality pôdy na hnojenie, prítomnosť pesticídov a herbicídov v pôde, vode a produktoch, ako aj nutričná hodnota krmív; komplexné výskumné analytické úlohy; získavanie mikromnožstiev ultračistých látok.



Úvod.

Prudký rozvoj kvapalinovej chromatografie za posledných 10 rokov je spôsobený najmä intenzívnym rozvojom teoretických základov a praktickým využívaním jej vysoko účinnej verzie, ako aj tvorbou a priemyselnou výrobou potrebných sorbentov a zariadení.

Charakteristickým znakom vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) je použitie sorbentov s veľkosťou zŕn 3-10 mikrónov, čo zaisťuje rýchly prenos hmoty s veľmi vysokou separačnou účinnosťou.

V súčasnosti je HPLC na prvom mieste medzi inštrumentálnymi metódami z hľadiska rýchlosti vývoja, dokonca prekonala plynovú chromatografiu. Najdôležitejšou výhodou HPLC v porovnaní s plynovou chromatografiou je schopnosť študovať takmer akýkoľvek objekt bez akýchkoľvek obmedzení ich fyzikálno-chemických vlastností, napríklad bodov varu alebo molekulovej hmotnosti.

Dnes je HPLC dobre navrhnutá inštrumentálna metóda, ktorá je široko používaná v širokej škále oblastí vedy a techniky. Jeho význam je obzvlášť veľký v takých kritických oblastiach, ako je biochémia, molekulárna biológia, kontrola znečistenia životného prostredia, ako aj v chemickom, petrochemickom, potravinárskom a farmaceutickom priemysle.

keďže je potrebné brať do úvahy množstvo veľmi špecifických požiadaviek vzhľadom na nasledujúce vlastnosti metodiky.

A. HPLC kolóny sú naplnené médiom s veľmi malým priemerom častíc. Výsledkom je, že pri takých objemových rýchlostiach rozpúšťadla, ktoré sú potrebné na rýchlu separáciu vzorky, vzniká na kolóne vysoký tlak.

b. Detektory používané v HPLC sú citlivé na kolísanie prietoku eluentu a tlaku (šum). Navyše pri použití detektorov koncentrácie je potrebná ešte vyššia stabilita objemovej rýchlosti eluentu.

V. Proces chromatografickej separácie je sprevádzaný množstvom antagonistických efektov, napríklad disperzia vzorky v mobilnej fáze vedie k zmiešaniu separovaných zložiek a znižuje maximálnu koncentráciu látky v eluovanom píku (v detektore). Disperzia sa pozoruje vo všetkých oblastiach systému od bodu vstrekovania vzorky po detektor.

d. Rozpúšťadlá pôsobiace ako mobilná fáza môžu často spôsobiť koróziu zariadenia. To platí predovšetkým pre rozpúšťadlá používané v chromatografii na reverznej fáze, ktorá je preferovaná v biochemických HPLC aplikáciách.

Špecifiká HPLC ako inštrumentálnej techniky treba brať do úvahy pri vývoji, tvorbe a prevádzke týchto systémov. Trvalo viac ako desať rokov hľadania a výskumu, kým sa vytvorili komerčné vzorky chromatografických systémov a ich komponentov, ktoré sú dostatočne spoľahlivé, jednoduché a bezpečné na prevádzku s prijateľným pomerom medzi cenou a technickými vlastnosťami. Nedávne trendy zmenšovania stĺpov (dĺžky aj priemeru) si vynucujú nové požiadavky na nástroje.

1.1. EFEKTÍVNOSŤASELEKTIVITA

Chromatografia je metóda separácie zložiek zmesi na základe rozdielu v ich rovnovážnom rozdelení medzi dve "nemiešateľné fázy, z ktorých jedna je stacionárna a druhá je pohyblivá. Zložky vzorky sa pohybujú pozdĺž kolóny, keď sú v mobilnej fáze a zostávajú na mieste, keď sú v stacionárnej fáze Čím väčšia je afinita zložky k stacionárnej fáze a čím menšia je afinita k mobilnej fáze, tým pomalšie sa pohybuje kolónou a čím dlhšie je v nej zadržaná. Vďaka rozdielu v afinite zložiek zmesi k stacionárnej a mobilnej fáze je dosiahnutý hlavný cieľ chromatografie - prijateľný časový úsek zmesi na jednotlivé pásy (píky) zložiek pri ich pohybe pozdĺž kolóny s mobilnou fázou.

Z týchto všeobecných pojmov je zrejmé, že chromatografická separácia je možná len vtedy, ak zložky vzorky vstupujúce do kolóny pri zavádzaní vzorky sú po prvé rozpustené v mobilnej fáze a po druhé, interagujú (zadržujú sa) so stacionárnou fázou. . Ak pri zavádzaní vzorky niektoré zložky nie sú vo forme roztoku, budú filtrované a nezúčastňujú sa na chromatografickom procese. Podobne zložky, ktoré neinteragujú so stacionárnou fázou, prejdú kolónou s mobilnou fázou bez toho, aby sa rozdelili na svoje zložky.

Akceptujme podmienku, že niektoré dve zložky sú rozpustné v mobilnej fáze a interagujú so stacionárnou fázou, t.j. chroiatografický proces môže prebiehať bez porúch. V tomto prípade po prechode zmesi cez kolónu môžete získať chromatogramy formy a, b alebo V(obr. 1.1). Tieto chromatogramy ilustrujú chromatografické separácie, ktoré sa líšia účinnosťou (A a b) s rovnakou selektivitou a selektivitou (b A V) s rovnakou účinnosťou.

Čím užší je pík získaný pri rovnakom retenčnom čase, tým vyššia je účinnosť kolóny. Účinnosť kolóny sa meria počtom teoretických poschodí (NPT) N: tým vyššia je účinnosť

Ryža. 1.2. Parametre chromatografických píkov a výpočet počtu teoretických poschodí:

t R - špičkový retenčný čas; h - výška vrcholu; Wj/j - šírka píku v polovici jeho výšky

Ryža. 1.1. Typ chromatogramu v závislosti od účinnosti a selektivity kolóny:

A- normálna selektivita, znížená účinnosť (menej teoretických poschodí); b - obvyklá selektivita a účinnosť; V - spoločná účinnosť, zvýšená selektivita (vyšší pomer retenčných časov komponentov)

účinnosť, čím väčšia je FTT, tým menšie je rozšírenie píku pôvodne úzkeho pásma pri jeho prechode kolónou a užší pík na výstupe z kolóny. PTT charakterizuje počet krokov pri vytváraní rovnováhy medzi mobilnou a stacionárnou fázou.

Poznať počet teoretických poschodí na kolónu a dĺžku kolóny L (µm), ako aj priemerný priemer zŕn sorbentu d c (µm), je ľahké získať hodnoty výšky ekvivalentnej teoretickej rovine (HETT), ako aj zníženej výšky ekvivalentnej teoretickej rovine (RHETT):

STÁVKA = L/ N

PVETT = B3TT/d c.

S hodnotami FTT, HETT a PHETT je možné jednoducho porovnať účinnosť kolón rôznych typov, rôznych dĺžok, naplnených sorbentmi rôzneho charakteru a zrnitosti. Porovnaním PTT dvoch stĺpcov rovnakej dĺžky sa porovná ich účinnosť. Pri porovnávaní HETP sa porovnávajú kolóny so sorbentmi rovnakej zrnitosti a rôznych dĺžok. Nakoniec, hodnota PVETT umožňuje pre ľubovoľné dva stĺpce vyhodnotiť kvalitu sorbentu, po prvé, kvalitu plnenia stĺpcov a po druhé, bez ohľadu na dĺžku stĺpcov, granuláciu sorbentov jeho povahy.

Kolónová selektivita hrá veľkú úlohu pri dosahovaní chromatografickej separácie.

Selektivita kolóny závisí od mnohých faktorov a zručnosť experimentátora je do značnej miery určená schopnosťou ovplyvniť selektivitu separácie. Na to sú v rukách chromatografa tri veľmi dôležité faktory: výber chemickej povahy sorbentu, výber zloženia rozpúšťadla a jeho modifikátorov a zohľadnenie chemickej štruktúry a vlastností separovaných zložiek. . Niekedy má citeľný vplyv na selektivitu zmena teploty kolóny, ktorá mení distribučné koeficienty látok medzi mobilnou a stacionárnou fázou.

Pri zvažovaní a hodnotení separácie dvoch zložiek v chromatograme je dôležitým parametrom rozlíšenie. R s, ktorý dáva do súvisu výstupné časy a šírky píkov oboch oddelených zložiek

Rozlíšenie ako parameter charakterizujúci separáciu píkov sa zvyšuje so zvyšujúcou sa selektivitou, čo sa prejavuje zvýšením čitateľa a zvyšuje sa účinnosť, čo sa prejavuje znížením hodnoty menovateľa v dôsledku zmenšenia šírky píkov. Rýchly pokrok kvapalinovej chromatografie preto viedol k zmene pojmu „vysokotlaková kvapalinová chromatografia“ - bola nahradená „kvapalinovou chromatografiou s vysokým rozlíšením“ (pričom skrátená forma termínu v angličtine zostala zachovaná HPLC ako najsprávnejšie charakterizujúce smer vývoja modernej kvapalinovej chromatografie).

Tým sa zníži vymývanie kolóny a zvýši sa účinnosť, keď sa použije jemnejší sorbent, rovnomernejšie zloženie (úzka frakcia), hustejšie a rovnomernejšie naplnené v kolóne, používajú sa tenšie vrstvy naočkovanej fázy, menej viskózne rozpúšťadlá a optimálne prietoky.

Spolu s rozmazaním pásu chromatografickej zóny pri separačnom procese v kolóne sa však môže vymývať aj v zariadení na zavádzanie vzorky, v prepojovacích kapilárach injektor - kolóna a kolóna - detektor, v detekčnej cele a v niektorých pomocné zariadenia (mikrofiltre na zachytávanie mechanických častíc zo vzoriek inštalovaných za injektorom, predkolóny, špirálové reaktory a pod.) - Čím väčší je objem mimo kolóny v porovnaní so zadržaným objemom píku, tým väčšia je erózia. Je tiež dôležité, kde sa mŕtvy objem nachádza: čím užší je chromatografický signál, tým väčšie je rozmazanie mŕtveho objemu. Preto je potrebné venovať osobitnú pozornosť konštrukcii tej časti chromatografu, kde je chromatografická zóna najužšia (injektor a zariadenia od injektora po kolónu) - tu je erózia mimo kolóny najnebezpečnejšia a má najväčší vplyv. Hoci sa verí, že v dobre navrhnutých chromatografoch by sa mali zdroje dodatočného riedenia mimo kolóny zredukovať na minimum, napriek tomu každé nové zariadenie, každá úprava chromatografu musí nevyhnutne skončiť testovaním na kolóne a porovnaním výsledného chromatogramu s tým pasom. Ak sa spozoruje špičkové skreslenie alebo prudký pokles účinnosti, kapiláry a iné zariadenia novo zavedené do systému by sa mali starostlivo skontrolovať.

Vymývanie mimo kolóny a jej nesprávne posúdenie môže viesť k významnej (viac ako 50 %) strate účinnosti, najmä v prípadoch, keď sa pokúšajú použiť relatívne staré chromatografy na vysokorýchlostnú HPLC, mikrokolónovú HPLC a iné varianty modernej HPLC, ktoré vyžadujú mikroinjektory, spojovacie kapiláry s vnútorným priemerom minimálnej dĺžky 0,05-0,15 mm, kolóny s kapacitou 10-1000 µl, detektory s mikrokyvetami s kapacitou 0,03-1 µl a vysokorýchlostné, vysokorýchlostné zapisovače a integrátory .

1.2. ZADRŽANIE A SILA ROZPÚŠŤADLA

Aby sa analyty separovali na kolóne, ako je uvedené vyššie, kapacitný koeficient k" musí byť väčšia ako 0, t.j. látky musia byť zadržané stacionárnou fázou, sorbentom. Kapacitný faktor by však nemal byť príliš vysoký na získanie prijateľného elučného času. Ak sa pre danú zmes látok vyberie stacionárna fáza, ktorá ich zadrží, potom ďalšia práca na vývoji analytickej techniky spočíva vo výbere rozpúšťadla, ktoré by v ideálnom prípade poskytovalo odlišné pre všetky zložky, ale prijateľne nie príliš veľké. k". To sa dosiahne zmenou elučnej sily rozpúšťadla.

V prípade adsorpčnej chromatografie na silikagéli alebo oxide hlinitom sa spravidla zvyšuje sila dvojzložkového rozpúšťadla (napríklad hexánu s prídavkom izopropanolu) zvýšením obsahu polárnej zložky (izopropanolu), alebo znížené znížením obsahu izopropanolu. Ak je polárna zložka príliš malá (menej ako 0,1 %), mala by sa nahradiť menšou elučnou silou. Urobí sa to isté, pričom sa nahradí buď polárna alebo nepolárna zložka inými, aj keď tento systém neposkytuje požadovanú selektivitu vzhľadom na zložky, ktoré sú predmetom záujmu v zmesi. Pri výbere systémov rozpúšťadiel sa berie do úvahy tak rozpustnosť zložiek zmesi, ako aj eluotropná séria rozpúšťadiel zostavená rôznymi autormi.

Sila rozpúšťadla sa volí približne rovnakým spôsobom pri použití očkovaných polárnych fáz (nitril, amino, diol, nitro atď.), pričom sa berú do úvahy možné chemické reakcie a vylúčia sa rozpúšťadlá nebezpečné pre fázu (napríklad ketóny pre aminofáza).

V prípade chromatografie na reverznej fáze sa sila rozpúšťadla zvyšuje zvýšením obsahu organickej zložky v eluente (metanol, acetonitril alebo THF) a znižuje sa pridaním väčšieho množstva vody. Ak nie je možné dosiahnuť požadovanú selektivitu, použijú inú organickú zložku alebo sa ju pokúsia zmeniť pomocou rôznych prísad (kyseliny, iónové párové činidlá atď.).

Pri separáciách pomocou iónomeničovej chromatografie sa sila rozpúšťadla mení zvýšením alebo znížením koncentrácie tlmivého roztoku alebo zmenou pH, v niektorých prípadoch sa používa modifikácia organickými látkami.

Najmä v prípade komplexných prírodných a biologických zmesí však často nie je možné zvoliť silu rozpúšťadla tak, aby sa všetky zložky vzorky eluovali v prijateľnom čase. Potom sa musíte uchýliť k gradientovej elúcii, t. j. použiť rozpúšťadlo, ktorého sila elúcie sa počas procesu analýzy mení tak, že sa neustále zvyšuje podľa vopred určeného programu. Táto technika umožňuje dosiahnuť elúciu všetkých zložiek komplexných zmesí v relatívne krátkom čase a ich rozdelenie na zložky vo forme úzkych píkov.

1.3. VEĽKOSŤ, PRIEPUSTNOSŤ A ÚČINNOSŤ ČASTÍC SORBENTU

Vzhľadom na eróziu v kolóne sme naznačili, že účinnosť kolóny (HETT) závisí od veľkosti častíc sorbentu. Rýchly rozvoj HPLC za posledných 10 až 12 rokov bol do značnej miery spôsobený predovšetkým vývojom metód výroby sorbentov s veľkosťou častíc od 3 do 10 mikrónov a s úzkym frakčným zložením, ktoré poskytujú vysokú účinnosť s dobrou permeabilitu a po druhé spôsoby vývoja plnenia kolón týmito sorbentmi a po tretie vývoj a sériovú výrobu kvapalinových chromatografov s vysokotlakovými čerpadlami, injektormi a detektormi s maloobjemovými kyvetami schopnými zaznamenávať maloobjemové píky.

V prípade dobre naplnených kolón naplnených kašou môže byť znížená ekvivalentná teoretická výška poschodia (LPHE) 2 bez ohľadu na to, či sa na plnenie použijú častice s veľkosťou 3, 5, 10 alebo 20 μm. V tomto prípade dostaneme stĺpy (so štandardnou dĺžkou 250 mm) s účinnosťou 41670, 25000, 12500 a 6250 t.t. Zdá sa prirodzené vybrať najefektívnejšiu kolónu naplnenú 3 µm časticami. Táto účinnosť však bude za cenu veľmi vysokého tlaku a relatívne nízkej rýchlosti separácie, pretože existujúce čerpadlo bude s najväčšou pravdepodobnosťou schopné pumpovať rozpúšťadlo cez takúto kolónu vysokou objemovou rýchlosťou. Tu stojíme pred otázkou vzťahu medzi veľkosťou častíc sorbentu, účinnosťou a priepustnosťou kolón.

Ak odtiaľto vyjadríme koeficient odporu stĺpca - bezrozmernú veličinu, dostaneme nasledujúcu rovnicu:

Faktor odporu pre kolóny naplnené mikročasticami rovnakého typu s použitím rovnakej metódy sa mierne líši a má nasledujúce hodnoty:

Typ častice „... Nepravidelný guľovitý

formulár formulára

Suché balenie. . . . . 1000-2000 800-1200

Závesné balenie. . . 700-1500 500-700

Vstupný tlak kolóny je úmerný lineárnej rýchlosti prúdenia, koeficientu odporu kolóny, viskozite rozpúšťadla a dĺžke kolóny a je nepriamo úmerný druhej mocnine priemeru častíc.

Aplikovaním tohto vzťahu na vyššie opísané kolóny s časticami s priemerom 3, 5, 10 a 20 µm a za predpokladu konštantného lineárneho prietoku, faktora odporu kolóny a viskozity rozpúšťadla získame pomer vstupného tlaku 44:16:4:1 pre stĺpce rovnakej dĺžky. Ak teda pre sorbent s reverznou fázou s veľkosťou častíc 10 μm pri použití metanolových rozpúšťadlových systémov - . voda (70:30) zvyčajne na štandardnej kolóne pri prietoku rozpúšťadla 1 ml/min, tlak na vstupe do kolóny je 5 MPa, ďalej pre častice 5 μm - 20 MPa a pre 3 μm - 55 MPa . Pri použití silikagélu a menej viskózneho systému rozpúšťadiel hexán - izopropanol (100:2) budú hodnoty výrazne nižšie: 1, 4 a 11 MPa. Ak je v prípade sorbentu s reverznou fázou použitie častíc s veľkosťou 3 μm veľmi problematické a 5 μm je možné, ale nie na všetkých zariadeniach, potom pre sorbent s normálnou fázou nie sú problémy s tlakom. Je potrebné poznamenať, že moderná vysokorýchlostná HPLC zvyčajne používa vyšší prietok rozpúšťadla ako vo vyššie uvedenom príklade, takže požiadavky na tlak sa zvyšujú ešte viac.

Avšak v prípadoch, keď je na separáciu potrebný určitý počet teoretických poschodí a je žiaduce vykonať rýchlostnú analýzu, obraz sa trochu zmení. Keďže dĺžky kolón so sorbentmi s veľkosťou zŕn 3, 5, 10 mikrónov pri rovnakej účinnosti budú 7,5, resp. 12,5 a 25 cm, potom sa pomer tlakov na vstupe do kolón zmení na 3:2:1. V súlade s tým bude trvanie analýzy na takýchto kolónach s rovnakou účinnosťou v pomere 0,3:0,5:1, t.j. pri pohybe z 10 na 5 a 3 mikróny sa trvanie analýzy skráti 2 a 3,3 krát. Táto rýchlejšia analýza prichádza za cenu úmerne vyššieho tlaku na vstupe do kolóny.

Uvedené údaje platia pre tie prípady, keď sorbenty rôznych veľkostí zŕn majú rovnaké krivky distribúcie veľkosti častíc, kolóny sú plnené rovnakým spôsobom a majú rovnaký faktor odporu kolóny. Treba mať na pamäti, že obtiažnosť získania úzkych frakcií sorbentu sa zvyšuje so znižovaním veľkosti častíc a to. Frakcie od rôznych výrobcov majú rôzne frakčné zloženie. Preto sa faktor odporu kolóny bude líšiť v závislosti od veľkosti zrna, typu sorbentu, spôsobu plnenia kolóny atď.

KLASIFIKÁCIA METÓD HPLC PODĽA SEPARAČNÉHO MECHANIZMU

Väčšina separácií uskutočňovaných pomocou HPLC je založená na zmiešanom mechanizme interakcie látok so sorbentom, ktorý poskytuje väčšiu alebo menšiu retenciu zložiek v kolóne. Separačné mechanizmy vo viac-menej čistej forme sú v praxi pomerne zriedkavé, napríklad adsorpcia pri použití absolútne bezvodého silikagélu a bezvodého hexánu na separáciu aromatických uhľovodíkov.

So zmiešaným retenčným mechanizmom pre látky s rôznou štruktúrou a molekulovou hmotnosťou je možné vyhodnotiť príspevok k retencii adsorpčných, distribučných, exkluzívnych a iných mechanizmov. Pre lepšie pochopenie a pochopenie separačných mechanizmov v HPLC sa však odporúča považovať separácie s prevahou jedného alebo druhého mechanizmu za súvisiace s určitým typom chromatografie, napríklad iónomeničovou chromatografiou.

2.1.1 ADSORPČNÁ CHROMATOGRAFIA

Separácia adsorpčnou chromatografiou sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich separácii do zón počas pohybu s mobilnou fázou pozdĺž kolóny. Zónová separácia zložiek v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Sorpcia na povrchu adsorbentu obsahujúceho hydroxylové skupiny je založená na špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom adsorbentu a polárnymi (alebo polarizovateľnými) skupinami alebo úsekmi molekúl. Takéto interakcie zahŕňajú interakciu dipól-dipól medzi permanentnými alebo indukovanými dipólmi, tvorbu vodíkovej väzby až po tvorbu r-komplexov alebo komplexov prenosu náboja. Možným a pomerne častým výskytom v praktickej práci je prejav chemisorpcie, ktorý môže viesť k výraznému zvýšeniu retenčného času, prudkému zníženiu účinnosti, vzniku produktov rozkladu alebo nevratnej sorpcii látky.

Adsorpčné izotermy látok majú lineárny, konvexný alebo konkávny tvar. Pri lineárnej adsorpčnej izoterme je pík látky symetrický a retenčný čas nezávisí od veľkosti vzorky. Adsorpčné izotermy látok sú najčastejšie nelineárne a majú konvexný tvar, čo vedie k určitej asymetrii vrcholu s tvorbou chvosta.

Najpoužívanejšie v HPLC sú silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami pórov, povrchmi a priemermi pórov. Oxid hlinitý sa používa oveľa menej často a iné adsorbenty, široko používané v klasickej kolónovej a tenkovrstvovej chromatografii, sa používajú extrémne zriedkavo. Hlavným dôvodom je nedostatočná mechanická pevnosť väčšiny ostatných adsorbentov, ktorá neumožňuje ich balenie alebo použitie pri vysokých tlakoch charakteristických pre HPLC.

Polárne skupiny, ktoré spôsobujú adsorpciu a nachádzajú sa na povrchu silikagélu a oxidu hlinitého, majú podobné vlastnosti. Preto je zvyčajne poradie elúcie zmesí látok a eluotropný rad rozpúšťadiel pre ne rovnaké. Rozdiel v chemickej štruktúre silikagélu a oxidu hlinitého však niekedy vedie k rozdielom v selektivite - potom sa dáva prednosť tomu alebo inému adsorbentu, ktorý je pre danú konkrétnu úlohu vhodnejší. Napríklad oxid hlinitý poskytuje väčšiu selektivitu na separáciu určitých viacjadrových aromatických uhľovodíkov.

Uprednostňovanie silikagélu v porovnaní s oxidom hlinitým sa vysvetľuje širším výberom silikagélov, pokiaľ ide o pórovitosť, povrch a priemer pórov, ako aj výrazne vyššia katalytická aktivita oxidu hlinitého, čo často vedie k skresleniu výsledkov analýzy. v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie .

2.1.2 Nevýhody adsorpčnej chromatografie, ktoré obmedzujú jej použitie

Popularita adsorpčnej chromatografie postupne klesala s vývojom metódy HPLC, ktorá bola stále viac nahrádzaná a naďalej nahrádzaná inými možnosťami, ako je HPLC na reverznej fáze a na normálnej fáze na sorbentoch s naočkovanou fázou. Aké sú nevýhody adsorpčnej chromatografie, ktoré k tomu viedli?

V prvom rade je to dlhé trvanie procesov ekvilibrácie adsorbentov s rozpúšťadlami obsahujúcimi vodu v stopových množstvách, náročnosť prípravy takýchto rozpúšťadiel s určitou a reprodukovateľnou vlhkosťou. To má za následok zlú reprodukovateľnosť parametrov retencie, rozlíšenia a selektivity. Z rovnakého dôvodu nie je možné použiť gradientovú elúciu - návrat do východiskového stavu je taký dlhý, že výrazne presahuje čas získaný použitím gradientu.

Významné nevýhody adsorbentov, najmä oxidu hlinitého, spojené s častými prípadmi preskupovania zlúčenín citlivých na katalýzu, ich rozkladom a nevratnou sorpciou, sú tiež dobre známe a boli opakovane zaznamenané v literatúre. Nenávratne sorbované látky, hromadiace sa na počiatočnom úseku kolóny, menia charakter sorbentu a môžu viesť k zvýšeniu odolnosti kolóny až k jej úplnému upchatiu. Posledný nedostatok je možné odstrániť použitím predstĺpca, ktorý podľa- So zvyšujúcou sa odolnosťou a zanášaním sa vymieňa za nový* alebo sa napĺňa novým sorbentom. Nevratná sorpcia, ku ktorej dochádza aj v tomto prípade, však vedie k chromatogramu, v ktorom zložky vzorky citlivé na sorpciu alebo katalytický rozklad úplne alebo čiastočne chýbajú.

2.2. DISTRIBUČNÁ CHROMATOGRAFIA

Deliaca chromatografia je variantom HPLC, pri ktorej sa separácia zmesi na zložky uskutočňuje v dôsledku rozdielu v ich distribučných koeficientoch medzi dvoma nemiešateľnými fázami: rozpúšťadlom (mobilná fáza) a fázou na sorbente (stacionárna fáza). Historicky prvé boli sorbenty tohto typu, ktoré sa získavali nanášaním kvapalných fáz (oxydipropionitril, parafínový olej a pod.) na porézne nosiče, podobne ako boli a sú pripravované sorbenty pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu (GLC). Okamžite sa však odhalili nevýhody takýchto sorbentov, z ktorých hlavným bolo pomerne rýchle opláchnutie fázy z nosiča. V dôsledku toho sa množstvo fázy v kolóne postupne znižovalo, retenčné časy sa tiež znižovali a v počiatočnej časti kolóny sa objavili adsorpčné centrá nepokryté fázou, čo spôsobilo tvorbu koncov píkov. Táto nevýhoda bola vyriešená nasýtením rozpúšťadla aplikovanou fázou predtým, ako vstúpila do kolóny. Strhávanie sa tiež znížilo, keď sa použili viskóznejšie a menej rozpustné polymérne fázy, ale v tomto prípade sa v dôsledku obtiažnosti difúzie z hrubých polymérnych filmov výrazne znížila účinnosť kolóny.

Logické sa ukázalo navrúbľovať kvapalnú fázu na nosič chemickými väzbami tak, že jej odstránenie sa stáva fyzikálne nemožné, teda premeniť nosič a fázu v jedno - na takzvaný sorbent s navrúbľovanou fázou.

Následné úsilie výskumníkov bolo zamerané na hľadanie činidiel, ktorých štepenie by prebehlo pomerne rýchlo a úplne a vytvorené väzby by boli čo najstabilnejšie. Takýmito činidlami boli alkylchlórsilány a ich deriváty, ktoré umožnili pomocou podobnej technológie získať vrúbľované sorbenty rôznych typov a s rôznymi polárnymi a nepolárnymi skupinami na povrchu.

Úspešná aplikácia posledného typu sorbentov pre HPLC prispela k nárastu ich výroby u širokej škály výrobcov. Každá spoločnosť vyrábala takéto sorbenty spravidla na základe vlastného typu silikagélu vlastnou technológiou, ktorá zvyčajne predstavuje výrobné „know-how“. Výsledkom je, že veľké množstvo sorbentov, chemicky nazývaných úplne rovnako (napríklad oktadecylsilánom vrúbľovaný silikagél), má veľmi odlišné chromatografické charakteristiky. Je to spôsobené tým, že silikagél môže mať širšie alebo užšie póry, iný povrch, pórovitosť, jeho povrch pred naočkovaním môže byť hydroxylovaný alebo nie, možno navrúbľovať mono-, di- alebo trichlórsilány, podmienky naočkovania môžu poskytnúť monomérne, polymérne alebo zmiešanej vrstve, na odstránenie zvyškových činidiel sa používajú rôzne metódy, môže alebo nemusí byť použitá ďalšia deaktivácia silanolu a iných aktívnych skupín.

Zložitosť technológie vrúbľovania činidiel a prípravy surovín a materiálov, jej viacstupňový charakter vedie k tomu, že aj šarže sorbentov získané tou istou technológiou od jednej výrobnej spoločnosti môžu mať mierne odlišné chromatografické charakteristiky. To platí najmä v prípadoch, keď sa takéto sorbenty používajú na analýzu viaczložkových zmesí obsahujúcich látky, ktoré sa výrazne líšia počtom a polohou funkčných skupín a typom funkčnosti.

Berúc do úvahy vyššie uvedené, treba sa vždy snažiť zabezpečiť, aby sa pri použití analytickej techniky opísanej v literatúre použil rovnaký sorbent a rovnaké prevádzkové podmienky. V tomto prípade je pravdepodobnosť, že dielo nebude reprodukované, minimálna. Ak to nie je možné, ale odoberá sa sorbent od inej firmy s podobnou štepenou fázou, treba sa pripraviť na to, že prepracovanie techniky bude trvať dlho. Zároveň existuje možnosť (a treba to brať do úvahy), že s týmto sorbentom sa ani po dlhom vývoji nemusí dosiahnuť požadovaná separácia. Prítomnosť mnohých opísaných separačných techník na starých sorbentoch, ktoré sa v literatúre vyrábajú, stimuluje z tohto dôvodu ich ďalšiu výrobu a použitie. V prípadoch, keď je však potrebné prejsť k vývoju originálnych metód, najmä vo vzťahu k látkam náchylným na rozklad, chemisorpciu, preskupenia, je vhodné začať pracovať na sorbentoch, ktoré boli vyvinuté v poslednej dobe a vyrábané s použitím nových, vylepšených verzie technológie. Nové sorbenty majú jednotnejšie frakčné zloženie, rovnomernejšie a úplnejšie pokrytie povrchu očkovanou fázou a pokročilejšie konečné fázy spracovania sorbentov.

2.3. IÓNOVÁ VÝMENNÁ CHROMATOGRAFIA

Pri iónomeničovej chromatografii sa separácia zložiek zmesi dosiahne reverzibilnou interakciou ionizujúcich látok s iónovými skupinami sorbentu. Zachovanie elektrickej neutrality sorbentu je zabezpečené prítomnosťou protiiónov schopných iónovej výmeny umiestnených v tesnej blízkosti povrchu. Ión zavedenej vzorky, interagujúci s fixným nábojom sorbentu, sa vymieňa s protiiónom. Látky s rôznou afinitou k fixným nábojom sú separované na aniónomeničoch alebo katiónomeničoch majú na povrchu kladne nabité skupiny a katiónomeniče podľa toho obsahujú skupiny s -negatívnym nábojom, ktoré interagujú s katiónmi.

Ako mobilná fáza sa používajú vodné roztoky solí kyselín, zásad a rozpúšťadiel ako je kvapalný amoniak, teda systémy rozpúšťadiel s vysokou dielektrickou konštantou e a väčším sklonom k ​​ionizácii zlúčenín Obvykle pracujú s tlmivými roztokmi, ktoré umožňujú pH hodnotu, ktorá sa má upraviť.

Počas chromatografickej separácie ióny analytu súťažia s iónmi obsiahnutými v eluente a majú tendenciu interagovať s opačne nabitými skupinami sorbentu. Z toho vyplýva, že iónomeničová chromatografia môže byť použitá na oddelenie akýchkoľvek zlúčenín, ktoré môžu byť nejakým spôsobom ionizované. Je možné analyzovať aj neutrálne molekuly cukru vo forme ich komplexov s boritanovým iónom:

Cukor + VO 3 2 - = Cukor -VO 3 2 -.

Iónová výmenná chromatografia je nevyhnutná na separáciu vysoko polárnych látok, ktoré nie je možné analyzovať pomocou GLC bez konverzie na deriváty. Tieto zlúčeniny zahŕňajú aminokyseliny, peptidy a cukry.

Iónová výmenná chromatografia má široké využitie v medicíne, biológii, biochémii, na monitorovanie životného prostredia, pri analýze obsahu liečiv a ich metabolitov v krvi a moči, pesticídov v potravinových surovinách, ako aj na separáciu anorganických zlúčenín, vrátane rádioizotopov, lantanoidov, aktinidov atď. Analýza biopolymérov (proteínov, nukleových kyselín atď.), ktorá zvyčajne trvala hodiny alebo dni, sa vykonáva pomocou iónomeničovej chromatografie za 20-40 minút s lepšou separáciou. Použitie iónomeničovej chromatografie v biológii umožnilo pozorovať vzorky priamo v biologických médiách, čím sa znížila možnosť preskupenia alebo izomerizácie, čo môže viesť k nesprávnej interpretácii konečného výsledku. Je zaujímavé použiť túto metódu na sledovanie zmien vyskytujúcich sa v biologických tekutinách. Použitie poréznych slabých aniónomeničov na báze silikagélu umožnilo separáciu peptidov. V

Mechanizmus výmeny iónov možno znázorniť vo forme nasledujúcich rovníc:

na výmenu aniónov

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

na výmenu katiónov |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

V prvom prípade vzorkový ión X~ súťaží s iónom mobilnej fázy Y~ o iónové centrá R+ iónomeniča a v druhom prípade katióny vzorky X+ súťažia s iónmi Y+ mobilnej fázy o R+. ~ iónové centrá.

Prirodzene, ióny vzorky, ktoré slabo interagujú s iónomeničom, budú počas tejto súťaže slabo zadržané na kolóne a budú z nej vymyté ako prvé, a naopak, silnejšie zadržané ióny budú z kolóny eluovať ako posledné. . Typicky dochádza k interakciám BTqpH4Hbie neiónovej povahy v dôsledku adsorpcie alebo vodíkových väzieb vzorky s neiónovou časťou matrice alebo v dôsledku obmedzenej rozpustnosti vzorky v mobilnej fáze. Je ťažké izolovať „klasickú“ iónomeničovú chromatografiu v jej „čistej“ forme, a preto niektorí chromatografovia vychádzajú pri ionexovej chromatografii skôr z empirických ako z teoretických princípov.

Separácia konkrétnych látok závisí predovšetkým od výberu najvhodnejšieho sorbentu a mobilnej fázy. Ako stacionárne fázy v iónomeničovej chromatografii sa používajú iónomeničové živice a silikagély s naočkovanými ionogénnymi skupinami.

2.4. SEKCIA VYLUČUJÚCA CHROMATOGRAFIA

Vylučovacia chromatografia je možnosť! kvapalinová chromatografia, pri ktorej dochádza k separácii v dôsledku distribúcie molekúl medzi rozpúšťadlom umiestneným vo vnútri pórov sorbentu a prúdiacim rozpúšťadlom " medzi jeho časticami.

Na rozdiel od iných možností HPLC, kde separácia prichádza V dôsledku rôznych interakcií zložiek s povrchom sorbentu je úlohou tuhého plniva pri vylučovacej chromatografii len vytvárať póry určitej veľkosti a stacionárna fáza je rozpúšťadlo, ktoré tieto póry vypĺňa. Preto je používanie termínu „sorbent“ pre tieto plnivá do určitej miery ľubovoľné.

Základnou vlastnosťou metódy je schopnosť separovať molekuly podľa ich veľkosti v roztoku v rozsahu takmer akejkoľvek molekulovej hmotnosti - od 10 2 do 10 8, čo ju robí nevyhnutnou pre štúdium syntetických a biopolymérov.

Tradične sa proces uskutočňovaný v organických rozpúšťadlách stále často nazýva gélová permeačná chromatografia a vo vodných systémoch - gélová filtračná chromatografia. V tejto knihe je pre obe možnosti prevzatý jeden termín, ktorý pochádza z anglického „Size Exclusion“ – vylúčenie podľa veľkosti – a najviac odráža mechanizmus procesu.

Podrobná analýza existujúcich predstáv o veľmi komplexnej teórii procesu vylučovacej chromatografie je vykonaná v monografiách.

Celkový objem rozpúšťadla v kolóne Vt (často sa to nazýva celkový objem stĺpca, pretože Vd nezúčastňuje sa na chromatografickom procese) je súčtom objemov mobilnej a stacionárnej fázy.

Retencia molekúl vo vylučovacej kolóne je určená pravdepodobnosťou ich difúzie do pórov a závisí od pomeru veľkostí molekúl a pórov, čo je schematicky znázornené na obr. 2.15. Distribučný koeficient Ka, ako v iných variantoch chromatografie ide o pomer koncentrácií látky v stacionárnej a mobilnej fáze.

Keďže mobilná a stacionárna fáza majú rovnaké zloženie Kd látka, pre ktorú sú obe fázy rovnako prístupné, sa rovná jednote. Táto situácia je realizovaná pre molekuly C najmenších veľkostí (vrátane molekúl rozpúšťadla), ktoré prenikajú do všetkých pórov (pozri obr. 2.15), a preto sa kolónou pohybujú najpomalšie. Ich retenčný objem sa rovná celkovému objemu rozpúšťadla Vt-

Ryža. 2.15. Model molekulárnej separácie meraním vo veľkostnej vylučovacej chromatografii

Všetky molekuly, ktorých veľkosť je väčšia ako veľkosť pórov sorbentu, do nich nemôžu vstúpiť (úplné vylúčenie) a prechádzať kanálmi medzi časticami. Eluujú z kolóny s rovnakým retenčným objemom, ktorý sa rovná objemu mobilnej fázy V 0 - Rozdeľovací koeficient pre tieto molekuly je nula.

Molekuly strednej veľkosti, schopné preniknúť len do niektorých pórov, sú zadržané v stĺpci podľa ich veľkosti. Distribučný koeficient týchto molekúl sa mení od nuly do jednej a charakterizuje podiel objemu pórov prístupný molekulám danej veľkosti. Ich zadržaný objem je určený súčtom Vo a prístupnej časti objemu pórov.

KVALITATÍVNA ANALÝZA

Chromatograf, ktorý vstupuje do oblasti vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, sa musí oboznámiť so základmi kvalitatívnej analýzy. Kvalitatívna analýza sa používa na identifikáciu známeho produktu, získaného novým spôsobom alebo nájdeného v zmesi s inými produktmi." Je potrebná pri izolácii rôznych komponentov z komplexných biologických a chemických zmesí, čo je dôležité najmä v medicíne, forenznej, ekológii, na sledovanie prítomnosti niektorých liečivých chemických produktov a ich metabolitov v bioml.ter..„.„Znalosť základov kvalitatívnej“ analýzy pomôže vyhnúť sa bežným chybám, napr./rozlíšenie nečistôt vo vzorke od nečistôt v a. rozpúšťadlo alebo kontrola čistoty látky na viac ako jednej vlnovej dĺžke, ale na rôznych atď.

Pred pokračovaním v analýze je potrebné určiť, či sa celá vzorka eluuje z kolóny daným rozpúšťadlovým systémom alebo nie. Pre istotu úplnej elúcie je potrebné zozbierať všetku kvapalinu vytekajúcu z kolóny, odpariť rozpúšťadlo, odvážiť zvyšok a zistiť stupeň výťažnosti vzorky.

Identifikácia zložiek v HPLC sa môže uskutočniť tromi spôsobmi: 1) použitím retenčných informácií; 2) skúmať zóny získané počas separácie v kolóne kvapalinového chromatografu s použitím metód spektrálnej alebo chemickej analýzy; 3) spektrálny analyzátor pripojte priamo k kolóne.

Retenčný objem sa používa na zaznamenávanie píkov v chromatografii. V R alebo retenčný čas t R. Obe veličiny sú charakteristické pre látku v danom chromatografickom systéme. Pretože retenčný čas separovanej látky pozostáva z času interakcie v kolóne a času prechodu prázdnych častí skúmavky, líši sa od prístroja k prístroju. Je vhodné mať látku, ktorá nie je zadržaná v danej kolóne, pričom sa považuje za štandard, ktorého retenčný čas a objem t 0 , V o. Chromatografia látky a štandardu sa musí vykonať za rovnakých podmienok (tlak a prietok). Pri identifikácii pomocou retenčných údajov sa známe jednotlivé látky, ktoré môžu byť prítomné vo vzorkách, separujú na rovnakom chromatografickom systéme a získajú sa pre ne hodnoty. t R. Porovnanie týchto hodnôt t R s retenčným časom neznámeho píku možno zistiť, že sa buď zhodujú, v takom prípade je pravdepodobné, že píky zodpovedajú rovnakej látke, alebo t R známa látka nezodpovedá t R neznáma zóna. Potom je stále možný približný odhad hodnôt t R látky, ktoré nie sú dostupné na priame meranie stupňa ich retencie. Zvážme obe možnosti.

V prvom prípade je samozrejme potrebná predbežná štúdia vzorky, aby sa predpokladala prítomnosť špecifických látok v nej. Pri práci s jednoduchými zmesami nie je ťažké určiť, či sa stupeň retencie zón vzorky a známych látok zhoduje alebo nie, t.j. tB rovnaké alebo odlišné. V prípade komplexných zmesí môže niekoľko látok eluovať s podobnými hodnotami. t R, a zóny skutočne získané počas chromatografickej separácie sa prekrývajú. Výsledkom je získanie presných hodnôt t R sa stáva nemožným pre rôzne zóny. Spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje so zvyšujúcim sa rozlíšením, starostlivejšou kontrolou podmienok separácie a opakovaným meraním hodnôt t R a spriemerovanie zistených hodnôt. V tomto prípade sa musí striedať chromatografická separácia známych a neznámych látok. Pri oddeľovaní zložitých zmesí je hodnota t R látky sa môžu meniť pod vplyvom matrice samotnej vzorky. Tento efekt je možný na začiatku chromatogramu a keď sa píky prekrývajú; Ako už bolo spomenuté, je tiež možné sprísniť zóny.

V takýchto prípadoch by sa mal štandard pridať do vzorky v pomere 1:1. Ak sú látky identické, hodnota t R východisková látka sa nemení a na chromatograme sa získa iba jeden pík. Ak máte zariadenie so systémom cyklickej chromatografie, pre spoľahlivú identifikáciu je vhodné nechať zmes niekoľkokrát prejsť kolónou.

Informácie o mierach zadržania možno nájsť aj v literatúre, ale hodnota týchto informácií je obmedzená. Keďže stĺpce dokonca z tej istej šarže poskytujú zlú reprodukovateľnosť, hodnoty z literatúry nie vždy zodpovedajú skutočnej hodnote t R na tomto stĺpci. Pre adsorpčnú chromatografiu je však možné predpovedať t R na základe údajov z literatúry. Ďalšia ťažkosť spojená s používaním literárnych významov t R, - ťažkosti pri ich hľadaní v odbornej literatúre, hoci bibliografické prehľady uverejnené v časopise Journal of chromatografia majú aktualizovaný index podľa typu látky.

V druhom prípade, keď sa retenčné časy známych zlúčenín a zón vzorky nezhodujú, je možné predpovedať retenčný čas neznámej zložky. Predpovede relatívnej retencie na základe údajov o štruktúre v stérickej vylučovacej chromatografii sú celkom spoľahlivé. Sú menej presné v adsorpčnej a deliacej chromatografii a najmä pri práci na chemicky viazanej fáze. Pre iónovú a iónovo-párovú chromatografiu látok so známym p Ka Je možné len približné určenie hodnôt tR. Vždy je jednoduchšie predpovedať relatívne zadržanie alebo hodnoty *x než absolútne hodnoty k". Relatívne hodnoty t R ľahšie posúdiť príbuzné zlúčeniny alebo deriváty, ako sú substituované alkylkarboxylové kyseliny alebo deriváty benzénu.

Pri izokratickom oddeľovaní homológov alebo oligomérov sa niekedy pozoruje nasledujúci vzorec:

\ gk" = A + Bn,

Kde A A IN- konštanty pre určitý počet vybraných vzoriek a pre daný chromatografický systém (na tej istej kolóne, s rovnakou mobilnou a stacionárnou fázou); P- počet rovnakých štruktúrnych jednotiek v molekule vzorky.

Zavedenie funkčnej skupiny / do molekuly vzorky povedie k zmene k" v prvej rovnici nejakým konštantným koeficientom a/ v danom chromatografickom systéme. Je možné získať skupinové konštanty a/ pre rôzne skupiny substituentov/, ktorých hodnoty sa budú zvyšovať so zvyšujúcou sa polaritou funkčných skupín vo všetkých typoch chromatografie, okrem reverznej fázy, kde hodnoty konštánt klesajú s zvýšenie polarity.

Niektoré skupinové konštanty a/ pre rôzne skupiny substituentov/ sú uvedené v tabuľke. 9.1.

V adsorpčnej chromatografii prvá rovnica nie je vždy použiteľná, pretože platí za predpokladu, že všetky izoméry majú rovnakú hodnotu k", čo sa nie vždy dodržiava. Je však možné vykresliť logfe" rovnakých zlúčenín na jednej kolóne oproti logfe" rovnakých zlúčenín na inej kolóne alebo proti zodpovedajúcim charakteristikám v chromatografii na tenkej vrstve, napríklad log[(l- Rf) IRf].

Hodnoty kapacitných koeficientov možno použiť pri porovnávaní údajov o uchovávaní k", pretože na rozdiel od neho t R rýchlosť mobilnej fázy a geometrické vlastnosti kolóny nie sú ovplyvnené.

Separácie chemicky viazaných fáz sú podobné deliacim chromatografickým separáciám s podobnými fázami, a preto možno na predpovedanie retenčných časov použiť údaje o extrakcii v ustálenom stave.

Pri iónomeničovej chromatografii ovplyvňujú stupeň retencie tri faktory: stupeň ionizácie kyselín a zásad, náboj ionizovanej molekuly a schopnosť látky z vodnej mobilnej fázy použitej pri iónomeničovej chromatografii migrovať do organickej fáza. Ten závisí od molekulovej hmotnosti zlúčeniny a jej hydrofóbnosti. Silnejšie kyseliny alebo zásady sú preto silnejšie zadržané počas aniónovej výmeny alebo katexovej separácie. Pri znižovaní pK a jednotlivej kyseliny obsiahnutej vo vzorke sa retencia zvyšuje, keď sa v dôsledku aniónovej výmeny oddelí množstvo kyselín, a so zvýšením p/C o sa zvyšuje retencia zásad, keď sa oddeľujú v dôsledku výmeny katiónov.

Zhoda retenčných časov známej látky s pozorovanou teda umožňuje predpokladať ich identitu. Spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje, ak sa chromatogramy známej látky a neznámej zložky porovnávajú za rôznych podmienok. Ak sa látky správajú identicky v adsorpčnej a reverznej fáze alebo iónomeničovej a rozmerovo vylučovacej chromatografii, spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje. Ak je spoľahlivosť identifikácie s rovnakou relatívnou retenciou 90 %, potom pri štúdiu správania rovnakých látok za výrazne odlišných podmienok je spoľahlivosť identifikácie už 99 %.

Cennou charakteristikou látky použitej pri identifikácii je pomer signálov získaných pre danú látku na dvoch rôznych detektoroch. Analyzovaná látka po opustení kolóny prechádza najprv cez prvý detektor, potom cez druhý a signály prichádzajúce z detektorov sa zaznamenávajú súčasne pomocou viacperového zapisovača alebo na dvoch zapisovačoch. Typicky sa používa sériové spojenie ultrafialového detektora (citlivejšieho, ale selektívneho) s refraktometrom, alebo ultrafialového s fluorescenčným detektorom, alebo dvoch ultrafialových detektorov pracujúcich na rôznych vlnových dĺžkach. Relatívna odozva, t. j. pomer signálu refraktometra k signálu fotometra, je charakteristikou látky za predpokladu, že oba detektory pracujú vo svojom lineárnom rozsahu; to sa testuje podávaním rôznych množstiev tej istej látky. Kvalitatívne informácie možno získať prácou s fotometrickými detektormi vybavenými zariadením na zastavenie prietoku, ktoré umožňuje zaznamenať spektrum píku vychádzajúceho z kolóny, kým je v prietokovej kyvete, a porovnať ho so spektrom známej zlúčeniny.

Značný záujem o identifikáciu majú moderné, stále drahé spektrofotometre s diódovým poľom.

Úplne neznámu látku nie je možné identifikovať len pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, sú potrebné aj iné metódy.

KVANTITATÍVNA ANALÝZA

Kvantitatívna kvapalinová chromatografia je dobre vyvinutá analytická metóda, ktorá nie je v presnosti nižšia ako kvantitatívna plynová chromatografia a výrazne prevyšuje presnosť TLC alebo elektroforézy Bohužiaľ, v HPLC neexistuje žiadny detektor, ktorý by mal blízku citlivosť na zlúčeniny rôznych chemických štruktúr (. ako katharometer v GLC. Preto je na získanie kvantitatívnych výsledkov potrebná kalibrácia zariadenia.

Kvantitatívna analýza pozostáva z nasledujúcich krokov: 1) chromatografická separácia; 2) meranie plôch alebo výšok vrcholov; 3) výpočet kvantitatívneho zloženia zmesi na základe chromatografických údajov; 4) interpretácia získaných výsledkov, teda štatistické spracovanie. Zvážme všetky tieto fázy.

4.1. CHRMATOGRAFICKÁ SEPARÁCIA

Počas odberu vzoriek sa môžu vyskytnúť chyby. Je obzvlášť dôležité vyhnúť sa chybám a získať adekvátnu reprezentatívnu vzorku heterogénnych tuhých látok, prchavých alebo nestabilných látok a poľnohospodárskych produktov a biomateriálov. Heterogénne vzorky, napríklad potravinárske výrobky, sa dôkladne premiešajú a rozštvrtia. Mnohonásobným vykonaním tejto operácie sa dosiahne homogenita vzorky.

Chyby a straty látok sa môžu vyskytnúť v štádiu extrakcie, izolácie, čistenia atď.

Vzorky sa musia úplne rozpustiť a ich roztoky sa musia pripraviť s presnosťou ±0,1 %. Vzorku je vhodné rozpustiť v mobilnej fáze, čím sa vylúči možnosť jej vyzrážania po zavedení do chromatografu. Ak rozpustenie v mobilnej fáze nie je možné, potom by sa malo použiť rozpúšťadlo, ktoré je s ňou miešateľné, a objem vzorky (menej ako 25 µl) by sa mal zaviesť do chromatografu.

Počas vstrekovania vzorky sa môžu vyskytnúť významné chyby v dôsledku frakcionácie vzorky, presakovania a rozmazania vrcholov. Rozmazanie píkov spôsobuje tvorbu chvostov, čo vedie k čiastočnému prekrývaniu píkov a v dôsledku toho k chybám pri detekcii. Zariadenia so slučkovým ventilom sú vhodnejšie ako injekčné striekačky na zavádzanie vzorky pri kvantitatívnej analýze kvôli vyššej presnosti a menšej závislosti operátora.

Pri chromatografickej separácii látok môžu nastať aj komplikácie, ktoré vedú k skresleniu údajov: kvantitatívna analýza. Počas chromatografického procesu môže dôjsť k rozkladu alebo konverzii vzorky alebo k ireverzibilnej adsorpcii látky na kolónu. Je dôležité zabezpečiť absenciu týchto nežiaducich javov a v prípade potreby kolónu zregenerovať alebo vymeniť. Prekrývanie píkov a chvostovanie môžu byť tiež znížené zmenou chromatografických podmienok.

Vrcholy s falošnými alebo nejasnými tvarmi, ako aj vrcholy, ktorých čas uvoľnenia je blízky do, pretože ich oddelenie nemusí byť dostatočné. Typicky sa používajú píky s hodnotou d"^0,5. Najvyššia účinnosť kolóny sa dosiahne zavedením 10~ 5 -10~ 6 g rozpustenej látky na 1 g sorbentu. Pri zavádzaní veľkých množstiev vzorky závisí závislosť výška píku na záťaži sa môže ukázať ako nelineárna a vyžaduje sa kvantitatívne hodnotenie plôch píkov.

Chyby spojené s detekciou alebo amplifikáciou vedú k výraznému skresleniu výsledkov chromatografickej separácie. Každý detektor sa vyznačuje špecifickosťou, linearitou a citlivosťou. Testovanie selektivity je obzvlášť dôležité pri analýze stopových nečistôt. Odozva UV detektorov sa môže líšiť o faktor 104 na látky s podobnými funkčnými skupinami. Je potrebné kalibrovať odozvu detektora pre každý analyt. Prirodzene, látky, ktoré neabsorbujú v UV oblasti, nevydajú signál do zapisovača, ak sa použijú ako fotometrický detektor. Pri použití refraktometra sa môžu objaviť negatívne píky. Okrem toho musí byť tento detektor termostatovaný, čo sa pre UV detektor nevyžaduje.

Linearita detektora určuje veľkosť vstrekovanej vzorky. Je dôležité si uvedomiť, že prietok kolónou, teplota kolóny a detektora a dizajn detektora ovplyvňujú presnosť kvantitatívnej analýzy. Chyby pri prenose elektrického signálu do výstupného zariadenia (rekordéra), integrátora alebo počítača môžu vzniknúť v dôsledku indukcie šumu, neuzemnenia, kolísania napätia v sieti a pod.

4.2. MERANIE PLOCHY VRCHOLU ALEBO VÝŠKY

Výška vrcholu h (Obr. 10.1) je vzdialenosť od vrcholu píku k základnej čiare, meria sa lineárne alebo počítaním počtu dielikov na zapisovači. Niektoré elektronické integrátory a počítače poskytujú informácie o výškach vrcholov. Poloha základnej čiary posunutých vrcholov sa zistí interpoláciou hodnôt ordinátov zodpovedajúcich začiatku a koncu vrcholu (vrchol 1 a 3 pozri obr. 10.1). Na zlepšenie presnosti je potrebné mať rovnú stabilnú základnú čiaru. V prípade nerozdelených píkov sa základná čiara nakreslí medzi začiatkom a koncom píku a nenahradí sa nulovou čiarou. Pretože výšky píkov sú menej závislé od vplyvu susedných prekrývajúcich sa píkov, odhad výšky píkov je presnejší a takmer vždy sa používa v stopovej analýze.

Oblasť vrcholu sa dá určiť rôznymi spôsobmi. Pozrime sa na niektoré z nich.

1. Planimetrická metóda zahŕňa sledovanie vrcholu pomocou ručného planimetra, čo je zariadenie, ktoré mechanicky určuje plochu vrcholu. Metóda je presná, ale náročná na prácu a zle reprodukovateľná. Táto metóda sa neodporúča.

2. Metóda papierovej siluety - šilt sa vystrihne a zváži. Metóda je vysoko reprodukovateľná, ale náročná na prácu a chromatogram je zničený. Jeho použiteľnosť závisí od rovnomernosti pruhu grafu. Metódu tiež nemožno široko odporúčať.

4. Triangulačná metóda pozostáva zo zostrojenia trojuholníka nakreslením dotyčníc k stranám píku. Vrchná časť trojuholníka je vyššia ako horná časť vrcholu. Zväčšenie plochy vytvorenej týmto rozšíreným vrcholom bude konzistentné v celom chromatograme a nebude mať veľký vplyv na presnosť. Okrem toho sa vykompenzuje určitá oblasť stratená pri kreslení dotyčníc. Základňa trojuholníka je určená priesečníkom dotyčníc so základňou a plocha je určená súčinom 7 g základne a výšky. Táto metóda je najlepšia na určenie oblastí asymetrických píkov. Avšak reprodukovateľnosť pri konštrukcii dotyčníc rôznymi operátormi je odlišná, a preto; nízka.

5. Metóda diskového integrátora je založená na elektromechanickom zariadení pripojenom k ​​rekordéru. Pero pripojené k integrátoru sa pohybuje pozdĺž pásika v spodnej časti pásky rýchlosťou úmernou pohybu zapisovacieho pera.

Rovnako ako pri manuálnych meraniach by mal pík zostať na stupnici zapisovača, ale úpravy na kompenzáciu posunov základnej čiary a neúplného oddelenia susedných píkov znižujú spoľahlivosť a predlžujú čas analýzy.

Metóda je presnejšia ako manuálne metódy merania, najmä pre asymetrické vrcholy, a ponúka výhodu rýchlosti. Okrem toho poskytuje trvalý kvantitatívny záznam analýzy.

6. Metódy využívajúce elektronické integrátory, ktoré určujú plochu píku a tlačia informácie o tejto ploche a retenčných časoch, môžu zahŕňať korekciu posunu základnej čiary a určovať plochu iba čiastočne oddelených píkov. Hlavnými výhodami sú presnosť, rýchlosť, nezávislosť konania od prevádzky záznamníka. Integrátory majú pamäť a môžu byť naprogramované na špecifickú analýzu pomocou predinštalovaného programu. Medzi výhody integrátora patrí jeho schopnosť použiť korekčné faktory pre odozvu detektora pri prepočte pôvodných údajov o plochách píkov, kompenzujúcich rozdiely v citlivosti detektora na rôzne látky. Takéto systémy šetria čas, zlepšujú analytickú presnosť a sú užitočné pre rutinné analytické analýzy.

7. V kvapalinovej chromatografii sú počítače široko používané na meranie plôch píkov. Vytlačia kompletnú správu vrátane názvov látok, oblastí píkov, retenčných časov, korekčných faktorov odozvy detektora a množstva (% hmotn.) pre rôzne zložky vzorky.

Kvapalinová chromatografia je metóda na separáciu a analýzu komplexných zmesí látok, v ktorých kvapalina slúži ako mobilná fáza. Je použiteľná na separáciu širšieho spektra látok ako plynová chromatografia. Je to spôsobené tým, že väčšina látok nie je prchavá, mnohé z nich sú pri vysokých teplotách nestabilné (najmä vysokomolekulové zlúčeniny) a pri premene do plynného skupenstva sa rozkladajú. Separácia látok kvapalinovou chromatografiou sa najčastejšie uskutočňuje pri teplote miestnosti.

Vlastnosti všetkých typov kvapalinovej chromatografie sú spôsobené tým, že mobilná fáza v nej je kvapalná a sorpcia zložiek z plynného a kvapalného eluentu prebieha odlišne. Ak pri plynovej chromatografii plní nosný plyn iba transportnú funkciu a nie je sorbovaný stacionárnou fázou, potom je kvapalná mobilná fáza v kvapalinovej chromatografii aktívnym eluentom, jej molekuly môžu byť sorbované stacionárnou fázou. Pri prechode kolónou musia molekuly zložiek analyzovanej zmesi nachádzajúcich sa v eluente vytesniť molekuly eluentu z povrchovej vrstvy sorbentu, čo vedie k zníženiu energie interakcie molekúl analytu. s povrchom sorbentu. Preto hodnoty zadržaných objemov V R, úmerná zmene voľnej energie systému, je v kvapalinovej chromatografii menšia ako v plynovej chromatografii a rozsah linearity sorpčnej izotermy v kvapalinovej chromatografii je širší.

Použitím rôznych eluentov je možné zmeniť retenčné parametre a selektivitu chromatografického systému. Selektivita v kvapalinovej chromatografii, na rozdiel od plynovej chromatografie, nie je určená jedným, ale dvoma faktormi - povahou mobilnej (eluentnej) a stacionárnej fázy.

Kvapalná mobilná fáza má vyššiu hustotu a viskozitu ako plynná fáza, difúzne koeficienty D a o 3–4 rády nižšie ako v plyne. To vedie k pomalšiemu prenosu hmoty pri kvapalinovej chromatografii v porovnaní s plynovou chromatografiou. Van Deemterova rovnica kvôli tomu, že člen IN nezohráva úlohu v kvapalinovej chromatografii ( D a  D G), mení sa aj grafická závislosť účinnosti N z lineárneho prietoku mobilnej fázy má tvar znázornený na obr. 1.9.

Pri klasickej verzii stĺpcovej kvapalinovej chromatografie sa analyzovaná vzorka rozpustená v eluente zavedie do sklenenej kolóny vysokej 1–2 m, naplnenej sorbentom s veľkosťou častíc 100 μm a eluentom a eluent prechádza cez výberom častí eluátu na výstupe z kolóny. Táto verzia kvapalinovej chromatografie sa stále používa v laboratórnej praxi, ale keďže rýchlosť prechodu eluentu pod vplyvom gravitácie je nízka, analýza je zdĺhavá.

Moderná verzia kvapalinovej chromatografie, tzv. vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPLC, využíva volumetrické a povrchovo porézne sorbenty s veľkosťou častíc 5–10 mikrónov, vstrekovacie čerpadlá zabezpečujúce tlak v systéme až 400 atm a vysoko citlivé detektory. Rýchly prenos hmoty a vysoká separačná účinnosť umožňujú použitie HPLC na separáciu molekúl (kvapalinová adsorpcia a kvapalinová kvapalinová deliaca chromatografia), na separáciu iónov (iónová výmena, iónová, iónovo-párová chromatografia), na separáciu makromolekuly (vylučovacia chromatografia podľa veľkosti).

1.3. ZADRŽANIE A SILA ROZPÚŠŤADLA

Aby sa analyzované látky separovali na kolóne, ako je uvedené vyššie, kapacitný koeficient k" musí byť väčší ako 0, t.j. látky musia byť zadržané stacionárnou fázou, sorbentom. Kapacitný koeficient by však nemal byť byť príliš veľké na to, aby sa dosiahol prijateľný elučný čas. Ak sa pre danú zmes látok vyberie stacionárna fáza, ktorá ich zadrží, potom ďalšia práca na vývoji analytickej techniky spočíva vo výbere rozpúšťadla, ktoré by v ideálnom prípade poskytovalo iné, ale prijateľné. nie veľmi veľké k “. To sa dosiahne zmenou elučnej sily rozpúšťadla.

V prípade adsorpčnej chromatografie na silikagéli alebo oxide hlinitom sa spravidla zvyšuje sila dvojzložkového rozpúšťadla (napríklad hexánu s prídavkom izopropanolu) zvýšením obsahu polárnej zložky (izopropanolu), alebo znížené znížením obsahu izopropanolu. Ak sa obsah polárnej zložky príliš zníži (menej ako 0,1 %), mala by sa nahradiť slabšou elučnou silou. Urobí sa to isté, pričom sa nahradí buď polárna alebo nepolárna zložka inými, aj keď tento systém neposkytuje požadovanú selektivitu vzhľadom na zložky, ktoré sú predmetom záujmu v zmesi. Pri výbere systémov rozpúšťadiel sa berie do úvahy tak rozpustnosť zložiek zmesi, ako aj eluotropné série rozpúšťadiel zostavené rôznymi autormi.

Sila rozpúšťadla sa volí približne rovnakým spôsobom pri použití očkovaných polárnych fáz (nitril, amino, diol, nitro atď.), pričom sa berú do úvahy možné chemické reakcie a vylúčia sa rozpúšťadlá nebezpečné pre fázu (napríklad aldehydy a ketóny). pre amino fázu).

V prípade chromatografie na reverznej fáze sa sila rozpúšťadla zvyšuje zvýšením obsahu organickej zložky v eluente (metanol, acetonitril alebo THF) a znižuje sa pridaním väčšieho množstva vody. Ak nie je možné dosiahnuť požadovanú selektivitu, použijú inú organickú zložku alebo sa ju pokúsia zmeniť pomocou rôznych prísad (kyseliny, iónové párové činidlá atď.).

Pri separáciách pomocou iónomeničovej chromatografie sa sila rozpúšťadla mení zvýšením alebo znížením koncentrácie tlmivého roztoku alebo zmenou pH, v niektorých prípadoch sa používa modifikácia organickými látkami.

Najmä v prípade komplexných prírodných a biologických zmesí však často nie je možné zvoliť silu rozpúšťadla tak, aby sa všetky zložky vzorky eluovali v prijateľnom časovom rámci. Potom sa musíte uchýliť k gradientovej elúcii, t.j. použiť rozpúšťadlo, ktorého elučná sila sa počas procesu analýzy mení tak, že sa neustále zvyšuje podľa vopred určeného programu. Táto technika umožňuje dosiahnuť elúciu všetkých zložiek komplexných zmesí v relatívne krátkom čase a ich rozdelenie na zložky vo forme úzkych píkov.

1.6.1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia. Adsorpčná kvapalinová chromatografia sa v závislosti od polarity stacionárnej a mobilnej fázy delí na chromatografiu s normálnou fázou (NPC) a chromatografiu s reverznou fázou (RPC). V NPC sa používa polárny adsorbent a nepolárne mobilné fázy, v OPC sa používa nepolárny adsorbent a polárne mobilné fázy, ale pri oboch možnostiach je výber mobilnej fázy často dôležitejší ako výber mobilnej fázy. stacionárna fáza. Stacionárna fáza musí zadržiavať separované látky. Mobilná fáza, t.j. rozpúšťadlo, musí poskytovať rôzne kapacity kolóny a účinnú separáciu v prijateľnom čase.

Polárne a nepolárne jemne rozptýlené porézne materiály so špecifickým povrchom viac ako 50 m 2 /g sa používajú ako stacionárna fáza v adsorpčnej kvapalinovej chromatografii. Polárne adsorbenty (SiO 2, Al 2 O 3, florisil atď.) majú na povrchu slabé kyslé skupiny, ktoré dokážu zadržiavať látky so zásaditými vlastnosťami. Tieto adsorbenty sa používajú najmä na separáciu nepolárnych a stredne polárnych zlúčenín. Ich nevýhodou je vysoká citlivosť na obsah vody v použitých eluentoch. Na odstránenie tejto nevýhody sa polárne sorbenty upravujú amínmi, diolmi a inými činidlami, čo má za následok očkovanie povrchu týchto činidiel, modifikáciu povrchu a zmenu selektivity voči analytom.

Nepolárne adsorbenty (grafitizované sadze, kremelina, kremelina) sú neselektívne voči polárnym molekulám. Na získanie nepolárnych adsorbentov sa nepolárne skupiny často navrúbľujú na povrch napríklad silikagélu, napríklad alkylsilyl-SiR3, kde R-alkylové skupiny sú C2-C22.

Mobilná fáza musí úplne rozpustiť analyzovanú vzorku, musí mať nízku viskozitu (aby boli difúzne koeficienty dostatočne veľké) a je žiaduce, aby z nej bolo možné izolovať oddelené zložky. Musí byť inertný voči materiálom všetkých častí chromatografu, bezpečný, lacný a vhodný pre detektor.

Mobilné fázy používané v kvapalinovej chromatografii sa líšia svojou elučnou silou. Elučná sila rozpúšťadla ukazuje, koľkokrát je sorpčná energia daného eluentu na danom adsorbente väčšia ako sorpčná energia eluentu zvoleného ako štandard, napríklad n-heptánu. Slabé rozpúšťadlá sú slabo adsorbované stacionárnou fázou, preto sú distribučné koeficienty sorbovaných látok (sorbátov) vysoké. Naopak, silné rozpúšťadlá sa dobre adsorbujú, takže rozdeľovacie koeficienty sorbátu sú nízke. Čím silnejšie je rozpúšťadlo, tým vyššia je rozpustnosť analyzovanej vzorky v ňom a tým silnejšia je interakcia rozpúšťadlo-sorbát.

Na zabezpečenie vysokej účinnosti separácie na kolóne je potrebné zvoliť mobilnú fázu, ktorá má polaritu optimálnu pre zmes, ktorá sa má separovať za zvolených separačných podmienok. Typicky sa najprv vyberie stacionárna fáza, ktorá má polaritu blízku polarite separovaných zložiek. Potom sa vyberie mobilná fáza, čím sa zabezpečí, že koeficient kapacity k" ukázalo sa, že je v rozsahu od 2 do 5. Ak je polarita mobilnej fázy príliš blízko k polarite stacionárnej fázy, retenčný čas komponentov bude príliš krátky a ak polarity mobilnej a stacionárnej fázy fázy sú veľmi odlišné, retenčný čas bude príliš dlhý.

Pri výbere mobilných fáz sa riadia takzvaným eluotropným radom, založeným na použití indexov polarity. Snyder R", ktorý rozdeľuje všetky rozpúšťadlá na silné (polárne) a slabé (slabo polárne a nepolárne). Stupnica polarity je založená na rozpustnosti látok používaných ako mobilné fázy v dioxáne, nitrometáne a etanole.

Tabuľka 1.2 ukazuje hodnoty indexov polarity a elučnej sily (vo vzťahu k SiO 2) pre množstvo rozpúšťadiel najčastejšie používaných v kvapalinovej chromatografii ako mobilné fázy. Sú tu tiež uvedené limity priehľadnosti týchto rozpúšťadiel pre krátke vlnové dĺžky, čo uľahčuje výber podmienok na detekciu zložiek zmesi.

Tabuľka 1.2

Charakteristika rozpúšťadiel používaných v kvapalinovej chromatografii

Solventný	Index polarity	Elučná sila (SiO 2)	Limit priehľadnosti pre krátke vlnové dĺžky
Fluóralkán
cyklohexán
n-Hexán
Tetrachlorid uhličitý
Diizopropyléter
dietyléter
dichlórmetán
tetrahydrofurán
Chloroform
Octová kyselina
Acetonitril
nitrometán

V kvapalinovej chromatografii sa často používajú skôr ich zmesi ako jednotlivé rozpúšťadlá. Často malé pridanie iného rozpúšťadla, najmä vody, výrazne zvýši silu elučného činidla.

Pri separácii viaczložkových zmesí nemusí jediná mobilná fáza ako eluent oddeliť všetky zložky vzorky v prijateľnom čase. V tomto prípade sa používa postupná alebo gradientová elúcia, pri ktorej sa počas chromatografického procesu postupne používajú stále silnejšie eluenty, čo umožňuje elúciu vysoko zadržaných látok za kratší čas.

V kvapalinovej chromatografii sú niektoré empirický pravidlá, ktoré sú veľmi užitočné pri výbere eluentu:

- sorpcia zlúčeniny sa spravidla zvyšuje so zvyšujúcim sa počtom dvojitých väzieb a OH skupín v nej;

 pokles sorpcie v rade organických zlúčenín: kyseliny alkoholyaldehydyketónyesterynenasýtené uhľovodíkynasýtené uhľovodíky;

 na oddelenie látok rôznej polarity a separácie látok rôznych tried sa používa chromatografia na normálnej fáze: analyzovaná vzorka sa rozpustí a eluuje nepolárnym eluentom, zlúčeniny rôznych tried opúšťajú kolónu s polárnym adsorbentom v rôznych časoch, pričom retenčný čas zlúčenín s rôznymi funkčnými skupinami sa zvyšuje pri prechode z nepolárnych zlúčenín na slabo polárne. Pre veľmi polárne molekuly sú retenčné časy také dlhé, že analýza nie je možná s nepolárnym eluentom. Ak chcete skrátiť retenčný čas polárnych zložiek, prejdite na polárne eluenty;

 vo verzii s reverznou fázou stacionárna fáza (nepolárny adsorbent) silnejšie adsorbuje nepolárnu zložku z polárnych eluentov, napríklad z vody;

- Znížením polarity eluentu pridaním menej polárneho rozpúšťadla sa môže znížiť retencia zložiek.

1.6.2. Deliaca kvapalinová chromatografia. Pri deliacej alebo kvapalinovej chromatografii je oddelenie zložiek analyzovanej vzorky spôsobené rozdielmi v koeficientoch ich distribúcie medzi dvoma nemiešateľnými kvapalnými fázami, z ktorých jedna je stacionárna a nachádza sa na povrchu alebo v póroch pevnej látky. stacionárny nosič a druhý je mobilný.

Z hľadiska povahy interakčných síl, ktoré určujú rozdielnu distribúciu medzi dvoma fázami látok, ktoré sa líšia svojou chemickou štruktúrou, je deliaca chromatografia podobná adsorpčnej chromatografii, t. j. aj tu je separácia založená na rozdiele v sily intermolekulárnej interakcie medzi zložkami analyzovanej vzorky a stacionárnou a mobilnou kvapalnou fázou.

V závislosti od techniky môže byť deliaca chromatografia, podobne ako adsorpčná chromatografia, stĺpcová alebo rovinná (papierová alebo tenkovrstvová).

Ako pevné nosiče sa používajú látky, ktoré sú indiferentné k mobilnému rozpúšťadlu a zložkám analyzovanej vzorky, ale sú schopné udržať stacionárnu fázu na povrchu a v póroch. Najčastejšie sa ako nosiče používajú polárne látky (celulóza, silikagél, škrob). Aplikuje sa na ne stacionárna fáza — polárne rozpúšťadlo, najčastejšie voda alebo alkohol. V tomto prípade sa ako mobilné fázy používajú menej polárne alebo nepolárne látky (alkoholy, amíny, ketóny, uhľovodíky atď.). Tento typ deliacej chromatografie sa nazýva normálna fáza. Používa sa na oddelenie polárnych látok.

Druhá verzia rozdeľovacej chromatografie sa líši v tom, že ako stacionárna tuhá fáza sa používajú nepolárne nosiče (kaučuk, fluoroplast, hydrofobizovaný silikagél), ako stacionárna kvapalná fáza sa používajú nepolárne rozpúšťadlá (uhľovodíky) a ako stacionárna kvapalná fáza sa používajú polárne rozpúšťadlá (alkoholy). aldehydy) sa používajú ako mobilná kvapalná fáza, ketóny atď., často voda). Táto verzia deliacej chromatografie sa nazýva obrátená fáza a používa sa na separáciu nepolárnych látok.

Na dosiahnutie optimálnej separácie zložiek analyzovanej vzorky je veľmi dôležitý výber mobilnej fázy. Rozpúšťadlá (mobilné a stacionárne kvapalné fázy) je potrebné voliť tak, aby sa distribučné koeficienty zložiek zmesi značne líšili. Pre kvapalné fázy platia tieto požiadavky: požiadavky:

1) použité rozpúšťadlá musia dobre rozpúšťať separované látky a ich rozpustnosť v stacionárnej fáze musí byť väčšia ako v mobilnej fáze;

2) rozpúšťadlá používané ako mobilná a stacionárna fáza musia byť vzájomne nasýtené, t.j. zloženie rozpúšťadla musí byť počas prechodu kolónou konštantné;

3) interakcia rozpúšťadiel používaných ako mobilná fáza so stacionárnou fázou by mala byť minimálna.

Najčastejšie sa pri deliacej kvapalinovej chromatografii ako mobilné kvapalné fázy nepoužívajú jednotlivé látky, ale ich zmesi v rôznych pomeroch. To umožňuje regulovať polaritu mobilnej fázy, meniť pomer polarít mobilnej a stacionárnej fázy a dosiahnuť optimálne podmienky pre separáciu zložiek konkrétnej analyzovanej zmesi.

Významnou nevýhodou tejto chromatografickej metódy je, že nanesená stacionárna kvapalná fáza sa z nosiča rýchlo vymýva. Na jej odstránenie sa rozpúšťadlo použité ako mobilná fáza nasýti látkou používanou ako stacionárna kvapalná fáza alebo sa stacionárna kvapalná fáza stabilizuje naočkovaním na nosič.

Variáciou deliacej kvapalinovej chromatografie je široko používaná metóda HPLC.

Najbežnejšie chromatografické systémy sú systémy, ktoré majú modulárny princíp zostavy. Ako samostatné moduly sú k dispozícii čerpadlá, odplyňovacie zariadenia, detektory, dávkovače (autosamplery), stĺpcové termostaty, zberače frakcií, riadiace jednotky chromatografického systému a záznamové zariadenia. Široký výber modulov umožňuje flexibilne riešiť rôzne analytické problémy a v prípade potreby rýchlo meniť konfiguráciu systému s minimálnymi nákladmi. Zároveň sa vyrábajú aj monomodulárne (integrované) LC, ktorých hlavnou výhodou je miniaturizácia jednotlivých jednotiek a kompaktnosť zariadenia.

V závislosti od elučnej metódy sa kvapalinové chromatografy delia na izokratické a gradientové.

Schéma izokratického chromatografu

Mobilná fáza z nádoby (1) cez vstupný filter (9) je dodávaná presným vysokotlakovým čerpadlom (2) do systému vstrekovania vzorky (3) - ručného injektoru alebo autosampleru a tam sa vzorka tiež zavádza. . Ďalej cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaznamená a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), z klávesníc každého z modulov systému alebo riadiacim programom z osobného počítača.

V prípade gradientovej elúcie sa používajú dva zásadne odlišné typy kvapalinových chromatografov. Líšia sa bodom, v ktorom sa tvorí gradient zloženia mobilnej fázy.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na nízkotlakovej linke.

Mobilná fáza z nádob (1) cez vstupné filtre (9) a gradientový programátor (10) je dodávaná presným vysokotlakovým čerpadlom (2) do systému vstrekovania vzoriek (3) - ručného injektoru alebo autosampleru a je tam zavedená aj vzorka. Činnosť ventilov gradientového programátora je riadená buď riadiacim modulom systému (čerpadlo alebo regulátor) alebo riadiacim programom PC. Systémy tohto typu tvoria binárny, trojrozmerný a štvorrozmerný gradient. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Ďalej cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaznamená a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od konštrukcie funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), alebo vykonávať riadiaci program z osobného počítača. V prípade ovládania riadiacim modulom je možné samostatne ovládať detektor z vlastnej klávesnice.

Napriek zjavnej atraktivite takýchto systémov (používajú iba jedno presné vysokotlakové čerpadlo) majú tieto systémy množstvo nevýhod, z ktorých hlavnou je snáď striktná potreba dôkladného odplynenia komponentov mobilnej fázy ešte pred nízkotlakový mixér (komora gradientového programátora). Vykonáva sa pomocou špeciálnych prietokových odplyňovačov. Vďaka tomu sa ich cena stáva porovnateľnou s iným typom gradientových systémov - systémami s tvorbou gradientovej kompozície mobilnej fázy na vysokotlakovej linke.

Zásadným rozdielom medzi systémami s tvorbou gradientovej kompozície mobilnej fázy na vysokotlakovej linke je miešanie komponentov vo vysokotlakovej linke, prirodzene, pri tomto prístupe je počet presných čerpadiel určený počtom nádrží na miešanie mobilnej fázy. Týmto prístupom sa výrazne znižujú požiadavky na dôkladné odplynenie komponentov.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na vysokotlakovej linke.

Mobilná fáza z nádob (1) cez vstupné filtre (9) je dodávaná presnými vysokotlakovými čerpadlami (2 a 11) cez statický alebo dynamický prietokový mixér (10) do systému vstupu vzorky (3) - ručný injektor resp. autosampler a vzorka je tam tiež zavedená. Prevádzka riadených čerpadiel je riadená buď riadiacim modulom systému (hlavné čerpadlo alebo ovládač) alebo riadiacim programom PC. V tomto prípade sú všetky čerpadlá ovládateľné. Systémy tohto typu tvoria binárny alebo trojrozmerný gradient. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Ďalej cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez predkolónu do separačnej kolóny. Eluát potom vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaznamená a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od konštrukcie funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), alebo vykonávať riadiaci program z osobného počítača. V prípade ovládania riadiacim modulom je možné samostatne ovládať detektor z vlastnej klávesnice.

Navrhované schémy sú dosť zjednodušené. Súčasťou systémov môžu byť prídavné zariadenia - stĺpcový termostat, postkolónové derivatizačné systémy, systémy prípravy a koncentrácie vzoriek, recyklátor rozpúšťadiel, membránové systémy na potlačenie elektrickej vodivosti pozadia (pre iónovú chromatografiu), prídavné ochranné systémy (filtre, kolóny), atď. Diagramy tiež nezobrazujú manometrické moduly samostatne. Spravidla sú tieto zariadenia zabudované do čerpacích jednotiek. Tieto jednotky môžu kombinovať niekoľko čerpadiel, čerpadlo s gradientovým programátorom a spoločný systémový ovládač. Štruktúra systému závisí od jeho konfigurácie a každého konkrétneho výrobcu.

Takáto radikálna komplikácia technického zabezpečenia chromatografického procesu vedie k vzniku množstva požiadaviek na vlastnosti mobilnej fázy, ktoré v klasickej kolónovej a planárnej chromatografii chýbajú. Kvapalná fáza musí byť vhodná na detekciu (priehľadná v danej oblasti spektra alebo musí mať nízky index lomu, určitú elektrickú vodivosť alebo dielektrickú konštantu atď.), inertná k materiálom častí chromatografického traktu, nesmie tvoriť plyn bubliny vo ventiloch čerpadla a detekčnej cele, bez mechanických nečistôt.

V kvapalinovej chromatografii Používa sa veľa druhov čerpadiel. Pre nízkotlakové LC sa často používajú peristaltické čerpadlá (obr. 1).

Obr. 1 Programovateľné peristaltické čerpadlo MasterFlex.

Pri HPLC sa používajú vysokotlakové čerpadlá na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy kolónou so špecifikovanými parametrami.

Medzi najdôležitejšie technické charakteristiky čerpadiel HPLC patria: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácie dodávky rozpúšťadla.

V závislosti od povahy prívodu rozpúšťadla môžu mať čerpadlá konštantný prívod (prietok) a konštantný tlak. V zásade sa pri analytických prácach používa režim konštantného prietoku a pri plnení kolón sa používa režim konštantného tlaku.

Na základe princípu činnosti sa čerpadlá HPLC delia na: striekačka a ďalej piest recipročné .

Injekčné pumpy

Hlavnou charakteristickou črtou týchto čerpadiel je cyklický charakter ich činnosti, a preto sa chromatografy, v ktorých sa tieto čerpadlá používajú, vyznačujú aj svojou cyklickou prevádzkou.

Ryža. 2. Základná konštrukcia injekčnej pumpy pre HPLC.

Ryža. 2A. Injekčná pumpa.

Riadiaca jednotka BU napája motor D napätím, ktoré určuje rýchlosť a smer jeho otáčania. Otáčanie motora pomocou prevodovky P sa premieňa na pohyb piestu P vo vnútri valca D. Čerpadlo pracuje v 2 cykloch. Počas cyklu plnenia je ventil K2 zatvorený, K1 otvorený, rozpúšťadlo prúdi zo zásobníka do valca C. V režime zásobovania je ventil K1 zatvorený a cez ventil K2 vstupuje mobilná fáza do dávkovacieho zariadenia.

Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií v toku mobilnej fázy počas prevádzky.

Nevýhody čerpadla:

a) vysoká spotreba času a rozpúšťadla na umývanie pri výmene rozpúšťadla;

b) objem PF je obmedzený objemom injekčnej striekačky, a preto je čas separácie obmedzený;

c) pozastavenie separácie pri plnení čerpadla;

d) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebný je výkonný motor a veľká sila piesta s jeho veľkou plochou).

Piestové čerpadlá s vratným pohybom.

Ryža. 3. Základná konštrukcia piestového čerpadla.

Princíp fungovania.

Motor D cez prevodovku P uvádza piest P do vratného pohybu, ktorý sa pohybuje v pracovnej hlave čerpadla. Ventily K1 a K2 sa otvárajú, keď je čerpadlo vo fáze nasávania a výtlaku. Množstvo objemového posuvu je určené tromi parametrami: priemerom piesta (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúdou (12-18 mm) a frekvenciou (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prísun mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny prevádzkový tlak 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml/min. Opakovateľnosť objemového posuvu -0,5 %. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo sa do systému dodáva vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, takže dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku (obr. 4). To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a zníženej citlivosti takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických.

Obr.4. Pulzácie piestového čerpadla.

Spôsoby, ako sa vysporiadať s pulzáciami.

1. Aplikácia tlmiacich zariadení.

Sú to špirálové rúrky špeciálneho profilu vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, zapojené sériovo alebo paralelne do systému medzi pumpou a dávkovačom.

Ryža. 5. Špirálový tlmič.

Tlmič sa odvíja, keď sa v ňom zvyšuje tlak (zrýchlenie čerpadla). Pri poklese tlaku sa krúti, zmenšuje sa jeho objem, vytláča časť rozpúšťadla, pričom udržiava konštantný prietok a znižuje pulzácie. Tento tlmič funguje dobre pri tlakoch 50 atm a vyšších.

Pri tlaku 5-30 atm lepšie vyhladzuje pulzácie vzduchová klapka, vyrobený zo stĺpika (obr. 6.). Vzduch v tlmenej kolóne (6x200 mm) je stlačený a pulzácie sú tlmené. Vzduch sa v ňom rozpustí do 24 hodín.

Ryža. 6. Vzduchová klapka.

2. Aplikácia elektronických zariadení.

Pri použití elektronického tlakového snímača môžete použiť hodnoty snímača na riadenie prevádzky čerpadla. Pri poklese tlaku sa otáčky motora zvýšia a vykompenzujú pokles tlaku. Je tiež možné kompenzovať netesnosti vo ventiloch a čiastočne v manžetách. Použitie elektronického tlmiča (BPZh-80, KhPZh-1 atď.) Umožňuje znížiť tlakové pulzácie na 1 atm pri tlaku 100-150 kgf / cm2.

1.6.3. Iónová výmena, iónová, iónovo-párová chromatografia. Metódy iónovej výmeny, iónovej a iónovo-párovej chromatografie sú založené na dynamickom procese nahrádzania iónov spojených so stacionárnou fázou elučnými iónmi vstupujúcimi do kolóny. Hlavným cieľom chromatografického procesu je separácia anorganických alebo organických iónov rovnakého znamienka. Retencia pri týchto typoch chromatografie je určená zmenou voľnej energie iónomeničovej reakcie. Pomer koncentrácií vymenených iónov v roztoku a v sorbentovej fáze je charakterizovaný iónomeničovou rovnováhou. Iónová výmena spočíva v tom, že niektoré látky (iónomeniče), keď sú ponorené do roztoku elektrolytu, absorbujú z neho katióny alebo anióny, pričom do roztoku uvoľňujú ekvivalentné množstvo iných iónov s nábojom rovnakého znamienka. K výmene katiónov dochádza medzi katexom a roztokom a k výmene aniónov medzi aniónomeničom a roztokom.

Katiónomeniče sú najčastejšie špeciálne syntetizované nerozpustné polymérne látky obsahujúce vo svojej štruktúre ionogénne skupiny kyslého charakteru: –SO 3 H; -COOH; -OH; -P03H2; -As03H2.

Chemické vzorce katexov môžu byť schematicky znázornené ako R-S03H; R-S03Na. V prvom prípade je katex v H-forme, v druhom v Na-forme. R – polymérna matrica.

Katiónové výmenné reakcie sú napísané ako bežné heterogénne chemické reakcie:

RNa+Na+RNa+H+

Aniónomeniče obsahujú vo svojej štruktúre základné ionogénne skupiny: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + atď. Ich chemické vzorce môžu byť znázornené ako RNH3OH a RNH3Cl alebo ROH, RCl. V prvom prípade je aniónomenič vo forme OH, v druhom prípade vo forme Cl. Reakciu výmeny aniónov možno zapísať takto:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Sú známe amfotérne iónomeniče, ktoré vo svojej štruktúre obsahujú kyslé aj zásadité skupiny. Iónomeniče obsahujúce rovnaký typ (napríklad SO 3 H) kyslé (bázické) skupiny sa nazývajú monofunkčné; iónomeniče obsahujúce rôzne typy (napríklad SO 3 H, OH) kyslé (bázické) skupiny sú polyfunkčné.

Monofunkčné iónomeniče sa získavajú polymerizačnou reakciou. Polykondenzačná reakcia umožňuje získať multifunkčné iónomeniče. Aby výsledné iónomeniče mali dostatočne vysoké výkonové charakteristiky, musia byť nerozpustné, ale napučiavajúce vo vhodnom rozpúšťadle a musia mať dostatočne veľký počet ionogénnych skupín schopných výmeny s ionogénnymi skupinami analyzovanej vzorky. To sa dá dosiahnuť, ak sú výsledné polymérne reťazce dostatočne rozvetvené a navzájom spojené zosieťovacími mostíkmi. Napríklad pri výrobe katexov polymerizačného typu na báze styrénu sa ako sieťovadlo najčastejšie používa divinylbenzén, ktorého zavedenie v množstve do 16 % zaisťuje výrobu iónomeničov s rôznym stupňom napučiavania resp. , teda umožňuje regulovať pórovitosť iónomeniča. Stupeň napučania iónomeniča, vyjadrený v mililitroch/gram, je objem 1 g vzduchom vysušeného iónomeniča naplneného v kolóne.

Iónomenič spravidla absorbuje jeden z protiiónov - iónov prítomných v mobilnej fáze, t.j. vykazuje určitú selektivitu. Experimentálne bola stanovená afinitná séria alebo selektivita iónov vzhľadom na rôzne typy iónomeničov. Napríklad pri nízkych koncentráciách roztoku na silne kyslých katexoch sa ióny s rovnakým nábojom sorbujú v nasledujúcom poradí:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Pre ióny s rôznym nábojom sa sorpcia zvyšuje so zvyšujúcim sa nábojom:

Na+ Ca 2+

Zmena podmienok iónomeničovej reakcie však môže viesť k obráteniu série. Afinitné série boli tiež stanovené pre anexy. Napríklad sorbovateľnosť aniónov na silných bázických anexoch sa zvyšuje v nasledujúcom poradí:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre silne kyslé alebo silne zásadité skupiny vstupujú do iónomeničových reakcií s akýmikoľvek iónmi v roztoku s nábojmi rovnakého znamienka ako je znamienko protiiónu. Takéto iónomeniče sa nazývajú univerzálne.

Proces výmeny iónov medzi analytom a iónomeničom sa môže uskutočniť jedným z troch spôsobov: statický, dynamický (metóda iónomeničového filtra) a chromatografický.

Statická metóda iónová výmena spočíva v tom, že vzorka iónomeniča sa privedie do kontaktu s určitým objemom roztoku a určitý čas sa mieša alebo pretrepáva, kým sa nenastolí rovnováha. Ide o rýchlu a jednoduchú metódu iónovej výmeny, ktorá sa používa na koncentrovanie iónov zo zriedených roztokov, odstránenie nepotrebných nečistôt, ale nezabezpečuje úplnú absorpciu iónov, pretože iónová výmena je nerovnovážny proces a v dôsledku toho nezaručuje úplné oddelenie. iónov.

Pri vykonávaní výmeny iónov dynamickým spôsobom cez kolónu s iónomeničom prechádza roztok, ktorý pri pohybe po kolóne prichádza do kontaktu s novými granulami iónomeniča. Tento proces poskytuje úplnejšiu výmenu ako statická metóda, pretože produkty výmeny sa odstraňujú prúdom roztoku. Môžu koncentrovať ióny zo zriedených roztokov a oddeľovať ióny, ktoré sa veľmi líšia vlastnosťami, napríklad ióny s rôznym nábojom (oddelené katióny od aniónov), ale oddelenie iónov s rovnakým znamienkom náboja je takmer nemožné. Kvantitatívna separácia takýchto iónov je možná len pri opakovanom opakovaní sorpčno-desorpčných elementárnych aktov za dynamických podmienok, t.j. chromatografická metóda . Pri práci s touto metódou sa používajú vysoké vrstvy iónomeniča a do tejto vrstvy sa zavádza separovaná zmes v množstve výrazne menšom ako je kapacita kolóny, čím je zabezpečené viacnásobné opakovanie elementárnych úkonov iónovej výmeny.

Pokiaľ ide o analytickú techniku, iónomeničová chromatografia je podobná molekulárnej chromatografii a môže sa vykonávať s použitím eluentu (vyvíjacieho), frontálneho a vytesňovacieho. Rozdiel medzi molekulárnou a iónomeničovou chromatografiou je v tom, že pri molekulárnej chromatografii sa oddelené zložky zmesi eluujú z kolóny čistým eluentom, zatiaľ čo pri iónomeničovej chromatografii sa ako eluent používa roztok elektrolytu. V tomto prípade by sa vymenený ión eluentu mal sorbovať menej selektívne ako ktorýkoľvek z iónov zo separovanej zmesi.

Pri najčastejšie používanej vyvolávacej iónomeničovej chromatografii sa kolóna naplnená iónomeničom najskôr premýva roztokom elektrolytu, kým sa všetky jej ióny úplne nenahradia v iónomeniči iónmi obsiahnutými v eluente. Potom sa do kolóny zavedie malý objem roztoku analytu, ktorý obsahuje oddelené ióny v množstve asi 1 % kapacity iónomeniča. Potom sa kolóna premyje elučným roztokom, vyberú sa frakcie eluátu a analyzujú sa.

Zmes iónov Cl – , Br – , J – je možné oddeliť na vysoko zásaditom aniónomeniči (zosieťovaný polystyrén obsahujúci skupiny kvartérnych amóniových báz – N (CH 3) 3 +), napr. AB-17, ktorý má číslo selektivity (selektivity): NO 3 – Cl – Br – J – . Výsledkom je, že ako eluent sa používa roztok NaN03. Najprv tento roztok prechádza cez iónomenič, kým sa úplne nenasýti iónmi NO 3 –. Keď sa zmes, ktorá sa má separovať, zavádza do kolóny, ióny Cl –, Br –, J – sú absorbované meničom aniónov, čím sa vytlačia ióny NO 3 –. Pri následnom premývaní kolóny roztokom NaNO 3 sa ióny Cl –, Br –, J – v horných vrstvách aniónomeniča postupne opäť nahradia iónmi NO 3 –. Cl – ióny budú vytesnené najrýchlejšie a J – ióny zostanú v stĺpci najdlhšie. Rozdiel v selektivite iónomeniča k iónom zmesi vedie k vytvoreniu oddelených zón sorbovaných iónov Cl –, Br – a J – v kolóne, pohybujúcich sa pozdĺž kolóny rôznymi rýchlosťami. Ako sa pohybujete pozdĺž stĺpca, vzdialenosť medzi zónami sa zvyšuje. V každej zóne je len jeden z aniónov zmesi, ktorá sa oddeľuje, a anión elučného činidla je v intervale medzi zónami iba anión elučného činidla. Na výstupe z kolóny sa tak v eluente objavia frakcie, ktoré obsahujú jednotlivé zložky separovanej zmesi.

Na riešenie praktických problémov sa podmienky separácie iónov menia výberom vhodnej mobilnej fázy (zloženie, koncentrácia, pH, iónová sila) alebo zmenou pórovitosti polymérnej matrice iónomeniča, t.j. počtu medzireťazcových väzieb v matricu a vytváranie iónomeničových sít, ktoré sú priepustné pre niektoré ióny a schopné ich výmeny a pre iné nepreniknuteľné. Je tiež možné zmeniť povahu a relatívne usporiadanie ionogénnych skupín, ako aj získať sorbenty schopné selektívnych chemických reakcií v dôsledku tvorby komplexov. Vysokú selektivitu majú napríklad komplexotvorné iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre chelatačné skupiny organických činidiel dimetylglyoxím, ditizón, 8-hydroxychinolín atď., ako aj korunové étery.

Najväčšie využitie v iónomeničovej, iónovej a iónovo-párovej chromatografii majú syntetické makro- a mikrosieťové organické iónomeniče s veľkou výmennou kapacitou (3–7 mmol/g), ako aj anorganické iónomeničové materiály. Mikrosieťové iónomeniče sú schopné vymieňať ióny iba v napučanom stave, zatiaľ čo makrosieťové iónomeniče sú schopné vymieňať ióny iba v napučanom a nenapučanom stave. Ďalším konštrukčným typom iónomeničov sú iónomeniče s povrchovým filmom, ktorých pevné jadro je vyrobené z neporézneho kopolyméru styrénu a divinylbenzénu, skla alebo silikagélu a je obklopené tenkým filmom iónomeniča. Celkový priemer takejto častice je približne 40 um, hrúbka iónomeničového filmu je 1 um. Nevýhodou takýchto iónomeničov je relatívne veľký priemer častíc a nízka výmenná kapacita v dôsledku nízkeho špecifického povrchu, v dôsledku čoho je potrebné pracovať s malými vzorkami a teda používať vysoko citlivé detektory. Okrem toho sú takéto iónomeniče rýchlo otrávené a nie sú schopné regenerácie.

Vo vysokovýkonnej iónomeničovej a iónovej chromatografii sa používajú objemové porézne polystyrénové iónomeniče, objemové porézne siliky s priemerom granúl asi 10 mikrónov, ako aj prakticky nenapučiavajúce povrchovo pórovité a povrchovo modifikované kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s ionogénnym sulfo - a používajú sa aminoskupiny.

Pri iónovo-párovej chromatografii sa používajú „kefkové“ sorbenty - silikagély s navrúbľovanými reverznými fázami C 2, C 8, C 18, ktoré sa pri absorpcii iónových tenzidov z mobilnej fázy ľahko premieňajú na katexové látky, napríklad alkylsulfáty resp. soli kvartérnych amóniových zásad.

Pri chromatografickej separácii na iónomeničoch sa ako mobilná fáza najčastejšie používajú vodné roztoky solí. Je to spôsobené tým, že voda má vynikajúce rozpúšťacie a ionizačné vlastnosti, vďaka ktorým sa molekuly analyzovanej vzorky okamžite disociujú na ióny, iónomeničové skupiny iónomeniča sú hydratované a tiež sa transformujú do úplne alebo čiastočne disociovanej formy. To zaisťuje rýchlu výmenu protiiónov. Elučnú silu mobilnej fázy ovplyvňuje najmä pH, iónová sila, povaha tlmivého roztoku a obsah organického rozpúšťadla alebo povrchovo aktívnej látky (iónovo-párová chromatografia).

Hodnota pH sa volí v závislosti od povahy ionogénnych skupín, separovaných iónov a matrice. So silne kyslými a silne zásaditými iónomeničmi môžete pracovať pri pH = 2–12, so slabo kyslými pri pH = 5–12, so slabo zásaditými pri pH = 2–6. Sorbenty na báze oxidu kremičitého nemožno použiť pri pH 9. Iónová sila mobilnej fázy ovplyvňuje kapacitu iónomeniča. So zvyšujúcou sa iónovou silou sa zvyčajne znižuje sorpcia iónov, pretože sa zvyšuje elučná sila mobilnej fázy. Na začiatku separácie by preto mala mať mobilná fáza nízku iónovú silu (0,05–0,1) a výsledná hodnota tejto charakteristiky by nemala presiahnuť 2. Pri gradientovej elúcii sa často používajú tlmivé roztoky so zvyšujúcou sa iónovou silou.

Na selektívnu elúciu iónov absorbovaných iónomeničom možno použiť vodu, tlmivé roztoky (fosfát, acetát, boritan, hydrouhličitan atď.) s určitou hodnotou pH a iónovou silou, minerálne roztoky (chlorovodík, dusík, síra, fosfor) a organické kyseliny (fenol, citrónová, mliečna, vínna, šťaveľová, EDTA). Výber eluentu uľahčuje skutočnosť, že limitné distribučné koeficienty väčšiny prvkov medzi vodnými (vodno-organickými) roztokmi mnohých komplexantov a štandardným typom iónomeničov sú stanovené a uvedené v tabuľkách.

1.6.4. Veľkostne vylučovacia chromatografia. Veľkostná vylučovacia chromatografia je typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej je separácia zložiek založená na distribúcii molekúl podľa ich veľkosti medzi rozpúšťadlom nachádzajúcim sa v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami. Počas separačného procesu malé molekuly vstupujú do polymérnej siete, v ktorej póroch slúži rozpúšťadlo ako stacionárna fáza, a tam sa zadržiavajú. Veľké molekuly nedokážu preniknúť do polymérnej siete a mobilnou fázou sa vymývajú z kolóny. Najprv sa eluujú najväčšie molekuly, potom stredne veľké a nakoniec malé.

Vylučovacia chromatografia je rozdelená na gélovú permeáciu a gélovú filtráciu. Pri gélovej permeačnej chromatografii dochádza k separácii na polyméroch, ktoré napučiavajú v organických rozpúšťadlách. Gélová filtračná verzia vylučovacej chromatografie zahŕňa použitie polymérov, ktoré napučiavajú vo vode ako stacionárne fázy.

Trvanie retencie zložiek analyzovanej vzorky vo veľkostnej vylučovacej kolóne závisí od veľkosti ich molekúl a difúzie do pórov sorbentu, ako aj od veľkosti pórov stacionárnej fázy.

Pri tomto type kvapalinovej chromatografie je distribučný koeficient D pre najmenšie molekuly analyzovanej vzorky, ktoré sa v chromatografickej kolóne pohybujú najnižšou rýchlosťou a prenikajú do siete stacionárnej fázy, sa rovná 1, pretože mobilná fáza a rozpúšťadlo nachádzajúce sa v póroch stacionárnej fázy majú rovnaké zloženie. V tomto prípade má základná rovnica stĺpcovej chromatografie tvar

Veľké molekuly, ktoré sa nezmestia do pórov stacionárnej fázy, sa eluujú z kolóny spolu s mobilnou fázou. Pre nich D= 0, a V R =V m. Tento rozsah hodnôt distribučných koeficientov (od 0 do 1) je typický len pre vylučovaciu chromatografiu.

Všetky molekuly analyzovanej viaczložkovej látky by sa mali z kolóny vymyť prechodom malého objemu rozpúšťadla V m predtým V m +V s a separácia končí pred uvoľnením píku rozpúšťadla. Preto je pri tomto type chromatografie potrebné použiť dosť dlhé kolóny s veľkým voľným objemom V m a veľké množstvo pórov v sorbente.

Rozlíšenie chromatografických píkov pri separáciách podľa veľkosti sa môže zlepšiť použitím gradientovej elúcie so zmiešanými rozpúšťadlami.

Každý sorbent používaný pri vylučovacej chromatografii je charakterizovaný určitým objemom pórov, a preto má určitú oblasť separovateľných molekulových hmotností a určitú kalibračnú krivku. V tomto prípade má kalibračný graf charakterizujúci závislosť zadržaného objemu od molekulovej hmotnosti alebo veľkosti molekuly spravidla komplexný vzhľad.

Stacionárne fázy vo veľkostnej vylučovacej chromatografii sa vyberajú na základe špecifických analytických úloh. Najprv sa stanoví, ktorý systém rozpúšťadiel možno použiť na analýzu (vodný alebo vodno-organický). V závislosti od toho sa určuje typ sorbentu. V prípade potreby separácie vo vode rozpustných vzoriek sa ako stacionárne fázy používajú napríklad vodou napučiavajúce zosieťované dextrány (Sephadex) alebo polyakrylamidy (Biogel R). Separáciu látok rozpustných v organických rozpúšťadlách je možné realizovať na polystyrénoch s rôznym stupňom zosieťovania, napučiavania v organických rozpúšťadlách (styrogel, poragel, biobid C). Takéto napučané gély sú typicky tlakovo nestabilné a umožňujú veľmi nízke prietoky mobilnej fázy, čo predlžuje čas analýzy. Na implementáciu vysoko účinnej verzie vylučovacej chromatografie je potrebné použiť stacionárne fázy s pevnými matricami – silikagélmi, ktorých nevýhoda – vysoká adsorpčná aktivita – je eliminovaná silanizáciou povrchu alebo výberom eluentu, ktorý je vhodný v polarita.

Látky, ktoré možno použiť ako mobilné fázy pri vylučovacej chromatografii, sú:

- úplne rozpustiť analyzovanú vzorku;

- dobre navlhčite sorbent;

- pôsobiť proti adsorpcii zložiek vzorky na sorbente;

 majú nízku viskozitu a toxicitu.

1.6.5. Rovinná chromatografia. Rovinná chromatografia zahŕňa chromatografiu na tenkej vrstve a papierovú chromatografiu. Tieto typy kvapalinovej chromatografie sú z hľadiska techniky jednoduché, rýchle a nevyžadujú drahé vybavenie, čo je ich nepopierateľná výhoda.

Separáciu zmesi látok týmito metódami je možné uskutočniť pomocou rôznych chromatografických systémov. Preto sa rozlišuje adsorpčná, distribučná, normálna a reverzná fáza, iónovýmenná atď. papierová a tenkovrstvová chromatografia. V súčasnosti sa najviac používa tenkovrstvová chromatografia.

Papierová a tenkovrstvová chromatografia sú v technike podobné. Papierové celulózové vlákno sa používa ako stacionárna fáza v papierovej chromatografii v tenkovrstvovej chromatografii, rôzne sorbenty (Al 2 O 3, silikagél a pod.) sa nanášajú v rovnomernej tenkej (100–300 μm) vrstve na sklo, kovový alebo plastový substrát (nosič) . Adsorbčná vrstva na nosiči môže alebo nemusí byť pripojená.

Chromatografická separácia v rovinných metódach, ako aj na kolóne, je spôsobená prenosom zložiek analytu mobilnou fázou pozdĺž vrstvy stacionárnej fázy rôznymi rýchlosťami v súlade s distribučnými koeficientmi separovaných látok. V oboch prípadoch sa používajú chromatografické systémy: kvapalina - pevný sorbent (adsorbčný separačný mechanizmus), kvapalina - kvapalina - pevný nosič (distribúcia, iónová výmena a iné mechanizmy).

Ako mobilné fázy sa používajú rôzne rozpúšťadlá alebo ich zmesi, organické alebo anorganické kyseliny.

Praktická výroba planárnych chromatogramov je nasledovná.

Na prúžku chromatografického papiera alebo na tenkej vrstve sorbentu vyznačte ceruzkou štartovaciu čiaru vo vzdialenosti 1 cm od spodného okraja prúžku alebo platne. Pomocou mikropipety naneste vzorku na štartovaciu čiaru vo forme škvrny s priemerom maximálne 2–3 mm. Okraj prúžku alebo dosky sa potom spustí do nádoby obsahujúcej mobilnú fázu umiestnenú v utesnenej komore. Keď mobilná fáza stúpa pozdĺž pásu alebo platne a dochádza k viacnásobným elementárnym dejom sorpcie-desorpcie, distribúcie medzi dve kvapalné fázy, iónovej výmeny atď., ktoré sú bežné v chromatografii, zložky analyzovanej zmesi sa oddelia. Proces zvyčajne pokračuje, kým rozpúšťadlo neprejde od štartovacej čiary 10 cm. Potom sa pás alebo platňa vyberie z komory a vysuší. Ak sú zložky analytu sfarbené, vytvárajú na chromatograme zodpovedajúce farebné škvrny. Na zistenie nesfarbených zložiek analytu sa musí vytvoriť chromatogram. Vytvorenie chromatogramu a detekcia zložiek vzorky sa môže uskutočniť rôznymi metódami a závisí od zloženia analyzovaných zmesí. Manifestácia sa môže uskutočniť:

- pomocou UV osvetlenia. Metóda je použiteľná na detekciu látok schopných emitovať vlastné žiarenie (luminiscenciu) vo viditeľnom rozsahu vlnových dĺžok pod vplyvom UV žiarenia;

- prostredníctvom vyvíjacích činidiel. Napríklad prítomnosť aminokyselín v analyzovanej zmesi možno detegovať pomocou ninhydrínu. Vysušený chromatogram sa ponorí do 0,2 % roztoku ninhydrínu v acetóne a potom sa vysuší. Škvrny zodpovedajúce rôznym zložkám zmesi získavajú vizuálnu a spravidla farbu špecifickú pre každú látku;

- pomocou jódu. V tomto prípade sa detegovaný chromatogram vloží do nádoby, na dne ktorej sú kryštály jódu. Jódové výpary sú na škvrnách silnejšie adsorbované, vďaka čomu sú škvrny viditeľné. Jód je nešpecifické vývojové činidlo. Pomocou špecifických činidiel je možné nielen určiť počet zložiek zmesi, ale aj identifikovať oddelené látky podľa farby škvŕn.

Papierová a tenkovrstvová chromatografia sa najčastejšie uskutočňuje v takzvanej vzostupnej verzii opísanej vyššie. Pomerne často je na zlepšenie kvality chromatogramov potrebné použiť zložitejšie varianty planárnej chromatografie, napríklad zostupnú, kruhovú, dvojrozmernú. Pri vykonávaní zostupnej papierovej alebo tenkovrstvovej chromatografie sa analyt aplikuje na štartovaciu čiaru platne alebo papierového prúžku umiestnenom navrchu a eluent sa neprivádza zdola, ale zhora. Pozitívny efekt zlepšenia separácie je spôsobený príspevkom gravitácie zložiek k separačnému procesu.

Vzostupná aj zostupná chromatografia sa môže vykonávať v jednorozmernej a dvojrozmernej verzii. Na rozdiel od vyššie opísaného jednorozmerného separačného procesu na plochom lôžku sa pri dvojrozmernej chromatografickej separácii vzorka, ktorá sa má analyzovať, najprv oddelí v jednom rozpúšťadle, potom sa oddelí v smere kolmom k prvému s použitím iného rozpúšťadla, pričom sa prvý chromatogram otáča. o 90°C.

Pri vykonávaní kruhovej chromatografie sa analyt aplikuje ako kvapka do stredu platne alebo hárku chromatografického papiera. Tu sa tiež po kvapkách pridáva jedno alebo viac rozpúšťadiel. Výsledkom je, že výsledný chromatogram je súborom radiálnych škvŕn.

Poloha škvŕn (zón), ktoré tvoria oddelené zložky analytu na plochom chromatograme, je charakterizovaná relatívnou rýchlosťou pohybu zložiek v tenkej vrstve. R fi. Experimentálne hodnotu R fi definovaný ako pomer vzdialenosti L i prešiel i-tá zložka, do diaľky L prejdené rozpúšťadlom od štartovacej čiary k prednej línii (obr. 1.10):

Rozsah R fi závisí od charakteru zodpovedajúcej zložky analyzovanej vzorky, charakteru stacionárnej fázy, jej hrúbky, charakteru a kvality mobilnej fázy, spôsobu aplikácie vzorky a ďalších faktorov, ale vždy R fi 1.

Rozsah R fi je v skutočnosti identický s retenčným časom látky alebo jej retenčným objemom, ktorý charakterizuje rýchlosť prechodu látky cez chromatografickú kolónu a môže sa použiť na kvalitatívnu identifikáciu zložiek analyzovanej vzorky a priemeru škvrny je identická s výškou alebo plochou chromatografického píku, a preto do určitej miery odráža kvantitatívny obsah látky.

V najjednoduchšom prípade je možné kvantitatívne určenie zloženia analyzovanej vzorky posúdiť vizuálne podľa intenzity vlastnej farby škvŕn alebo intenzity fluorescenčnej žiary výsledných škvŕn počas UV detekcie. Na tieto účely sa široko používa elúcia chromatografických škvŕn. V tomto prípade sa škvrna získaná na chromatograme opatrne vyreže alebo zoškrabe, ošetrí sa vhodným rozpúšťadlom a výsledný roztok sa preskúma pomocou vhodnej fyzikálno-chemickej metódy. Môžete tiež použiť metódu váženia, pri ktorej sa z chromatogramu vyreže a odváži príslušný bod. Množstvo látky je určené rozdielom hmotnosti čistého papiera rovnakej plochy a papiera s látkou.

Papier (BH ) A chromatografia na tenkej vrstve (TLC ) podľa separačného mechanizmu patrí deliaca chromatografia . Pri BH metóde je nosič špeciálny chromatografický papier s určitými vlastnosťami. Stacionárna fáza voda sa adsorbuje na povrchu a póroch papiera (do 20%), mobilné je organické rozpúšťadlo, miešateľné alebo nemiešateľné s vodou, vodou alebo roztokmi elektrolytov.

Mechanizmus Na papieri je to dosť komplikované. V stacionárnej fáze môže byť látka zadržaná nielen v dôsledku rozpustenia vo vode adsorbovanej papierom, ale aj adsorbovať priamo z celulózy. Vytlačené na papieri zdieľané komponenty prechádzajú do mobilnej fázy a pohybujú sa cez kapiláry papiera rôznymi rýchlosťami v súlade s koeficient rozdelenia na rozhraní každý z nich. Najprv chromatografia časť látky z papiera ide do mobilná fáza a ísť ďalej. Keď organické rozpúšťadlo dosiahne časť papiera, ktorá neobsahuje rozpustenú látku, dôjde k tomu znova. prerozdeľovanie : z organickej fázy látka prechádza do vodnej fázy, sorbovaná na papieri. Keďže komponenty majú rôzne afinitu k sorbentu , keď sa eluent pohybuje, dochádza k separácii: niektoré látky sú zadržané na začiatku cesty, iné sa pohybujú ďalej. Tu sa kombinujú termodynamické (ustanovenie rovnovážneho rozdelenia látok medzi fázami) a kinetická (pohyb komponentov rôznou rýchlosťou) aspekty separácie. Výsledkom je, že každá zložka je sústredená na konkrétnu oblasť listu papiera: zóny jednotlivých komponentov na chromatogram . Použitie chromatografie na papieri má množstvo významných nevýhod: závislosť separačného procesu od zloženia a vlastností papiera, zmeny obsahu vody v póroch papiera pri zmene podmienok skladovania, veľmi nízka rýchlosť chromatografie ( až niekoľko dní) a nízka reprodukovateľnosť výsledkov. Tieto nedostatky vážne ovplyvňujú rozšírenie papierovej chromatografie ako chromatografickej metódy.

IN TLC metóda proces oddeľovania zmesi látok sa uskutočňuje v tenkej vrstve sorbent , uložený na inertnom pevnom substráte a je zabezpečený pohybom mobilná fáza (rozpúšťadlo) cez sorbent pod vplyvom kapilárne sily . Autor:separačný mechanizmus odlíšiť deliaca, adsorpčná a iónomeničová chromatografia . K separácii zložiek v týchto prípadoch dochádza buď v dôsledku ich rozdielneho distribučného koeficientu medzi dvoma kvapalnými fázami ( deliaca chromatografia ), alebo v dôsledku rozdielnej adsorbovateľnosti zlúčenín sorbentom ( adsorpčná chromatografia ). Adsorpčná metóda je založená na rôznych stupňoch sorpcie-desorpcie separovaných zložiek na stacionárnej fáze. Adsorpcia vykonávané na náklady van der Waalsove sily , čo je základ fyzikálna adsorpcia , polymolekulárne (tvorba niekoľkých vrstiev adsorbátu na povrchu adsorbentu) a chemisorpcia (chemická interakcia adsorbentu a adsorbátu).

V prípade použitia takých sorbentov pre TLC ako oxid hlinitý alebo silikagél hrať úlohu pri odlúčení distribúcia , takže adsorpcia na vyvinutom aktívnom povrchu sorbentu (150–750 m 2 /g). Distribúcia zložky zmesi sa vyskytujú medzi vodou na povrchu nosiča (napr adsorbenty , Ako oxid hlinitý , škrob , celulóza , kremelina - A voda formulár stacionárna fáza ) a rozpúšťadlo pohybujúce sa cez túto stacionárnu fázu ( mobilná fáza ). Zložka zmesi, ktorá je rozpustnejšia vo vode, sa pohybuje pomalšie ako zložka, ktorá je rozpustnejšia v mobilnej fáze.

Adsorpcia sa prejavuje tým, že medzi dopravca napríklad oxid hlinitý a zložky zmesi sa zakladajú adsorpčné rovnováhy – každý komponent má svoje, výsledkom čoho je rôzne rýchlosti pohybu zložky zmesi. Možno rozlíšiť dva extrémne prípady:

a) koncentrácia látky na adsorbente je nulová. Látka sa úplne rozpustí v mobilnej fáze a je ňou unášaná (pohybuje sa spolu s rozpúšťadlové čelo ).

b) látka je úplne adsorbovaná, neinteraguje s rozpúšťadlom a zostáva na začiatku.

V praxi so zručným výberom rozpúšťadla a adsorbenta distribúcia zlúčeniny sa nachádzajú medzi týmito extrémnymi prípadmi a látka postupne prenesené z jednej vrstvy sorbentu do druhej v dôsledku súčasne prebiehajúcich procesov sorpcia A desorpcia .

Rozpúšťadlo prechádzajúce cez sorbent je tzv eluent , proces pohybu látky spolu s eluentom  elúcia . Pri pohybe kvapaliny po platni dochádza pôsobením síl k oddeľovaniu zmesi látok adsorpcia , distribúcia , iónová výmena alebo kombinácia všetkých týchto faktorov. V dôsledku toho oddelené chromatografické zóny zložky zmesi, t.j. ukázalo sa chromatogram .

Správny výber sorbent A eluent určuje účinnosť separácie zmesi. Mobilita testovanej látky závisí od jej afinity k sorbentu a elučná sila (polarita) eluentu. So zvyšujúcou sa polaritou zlúčeniny sa zvyšuje aj jej afinita k polárnemu sorbentu. Zvyšovaním stupňa adsorpcie silikagél organické zlúčeniny sú usporiadané v rade: uhľovodíky<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь pre silikagél eluenty môžu byť usporiadané v poradí zvyšujúcej sa „polarity“ ( elučná kapacita ) a tvoria sériu rozpúšťadiel ( eluotropný rad ) v súlade s experimentálnymi údajmi: alkány>benzén>chloroform>dietyléter>etylacetát>alkoholy C2-C4>voda>acetón>kyselina octová>metanol. Polárna zlúčenina, alkohol, je teda dosť silne adsorbovaná na silikagéli, a preto sa pod vplyvom nepolárneho rozpúšťadla, ako je hexán, pohybuje slabo a zostáva blízko štartovacej čiary. Na druhej strane, nepolárny aromatický uhľovodík bifenyl je výrazne mobilnejší v hexáne, ale aj tu dosiahnuť R f asi 0,5, je potrebný polárnejší aprotický eluent - metylénchlorid. Elučná sila regulovať pomocou zmesí rozpúšťadiel, ktoré susedia eluotropný rad s rôznou polaritou.

V súčasnosti sa v TLC používajú najmä: sorbenty : na delenie lipofilné látky  silikagél , oxid hlinitý , acetylovaná celulóza , polyamidy ; na oddelenie hydrofilné látky  celulóza , celulózové iónomeniče , kremelina , polyamidy . Najdôležitejšou vlastnosťou sorbentu je jeho činnosť , t.j. schopnosť sorb (podržať) zložky zmesi, ktoré sa majú oddeliť. V zahraničí vyrába množstvo firiem silikagél , kremelina A oxid hlinitý s prídavkom 5% sadry, ktorá sa používa na zabezpečenie vrstvy sorbentu pri samostatnej výrobe platní.

Najbežnejším sorbentom je silikagél - hydratovaná kyselina kremičitá, vzniká pôsobením minerálnych kyselín na Na 2 SiO 3 a sušením vzniknutého solu. Po rozomletí sólu sa použije frakcia určitej veľkosti zrna (uvedená na štítku, zvyčajne 5-20 mikrónov). Silikagél je polárny sorbent s OH skupinami ako aktívnymi centrami. Ľahko adsorbuje vodu na povrchu a vytvára vodíkové väzby.

Alumina je slabo zásaditý adsorbent a používa sa najmä na separáciu slabo zásaditých a neutrálnych zlúčenín. Nevýhodou platní z oxidu hlinitého je povinná aktivácia povrchu pred použitím v peci pri vysokých teplotách (100-150 o C) a nízka adsorpčná kapacita vrstvy v porovnaní so silikagélom.

Kremelina - adsorbent získaný z prírodných minerálov - kremeliny. Sorbent má hydrofilné vlastnosti a nižšiu adsorpčnú kapacitu vrstvy v porovnaní so silikagélom.

Celulóza: tenkovrstvové platne potiahnuté celulózou sú veľmi účinné na separáciu zložitých organických molekúl. Adsorbent pozostáva prevažne z celulózových guľôčok s priemerom do 50 mikrónov, upevnených na nosiči so škrobom. Rovnako ako pri papierovej chromatografii dochádza k vzostupu čela rozpúšťadla veľmi pomaly.

Chromatografická analýza vykonávané na priemyselných platniach vyrobených v Českej republike“ Silufol » (« Silufol ") vyrobené z hliníkovej fólie, niekedy vystuženej lepenkou, a" Siluplast » vyrobené z plastu, potiahnuté vrstvou sorbentov - silikagél LS 5-40 so škrobom alebo sadrou ako spojivom (do 10%), alebo oxid hlinitý s prídavkom alebo bez prídavku fluorescenčných indikátorov. záznamy " Silufol » majú vysokú rýchlosť elúcie, ale vyznačujú sa nízkou separačnou schopnosťou a nízkou citlivosťou. Pri skladovaní sú citlivé na podmienky (vlhkosť, teplota, agresívne prostredie a pod.). Niektoré spoločnosti dodávajú chromatografické platne s vrstvou sorbentu rôznej (zvyčajne do 0,25 mm), ale striktne konštantnej hrúbky (silikagél, celulóza, iónomenič), na skle a substrátoch z hliníkovej fólie, plastu, impregnovaného sklolaminátu.

Taniere « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) sa vyrábajú v Rusku na polymérnej báze (polyetyléntereftalát, trieda P) alebo hliníkovom substráte (trieda AF) s nanesenou pracovnou vrstvou mikrofrakcionovaný silikagélový sorbent triedy STX-1A a STX-1VE (vyrábané v ZSSR ako frakcionovaný silikagél KSKG) s hrúbkou 90-120 mikrónov (do 200 mikrónov), fixované špeciálnym spojivom - oxid kremičitý sol . Pri použití sólu kyseliny kremičitej (silica sol) ako spojiva, ktoré sa po zahriatí zmení na silikagél, sa výsledné TLC platne skladajú z dvoch zložiek: vrstvy silikagélu a substrátu. Rovnomernosť hrúbky vrstvy sorbentu na jednej platni je ±5 µm. Príklad označenia: “Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)” - vysokovýkonné TLC platne na hliníkovom substráte, s fosforom, 10x10 cm.

Ak použijete sklenený substrát (trieda C), potom sú takéto platne opakovane použiteľné a chemicky odolné. Ich chemická odolnosť je určená chemickou odolnosťou silikagélu. Výsledkom je, že TLC platne môžu byť opakovane ošetrené agresívnymi činidlami, napríklad horúcou zmesou chrómu, čo odstraňuje obmedzenia týkajúce sa použitia korelačných činidiel na detekciu škvŕn a modifikáciu sorbentu a umožňuje opakované (až 30-krát alebo viac ) regenerácia platní zmesou chrómu. Sklenené dosky je možné rezať na požadované veľkosti. Mechanickú pevnosť vrstvy sorbentu je možné nastaviť, čím sa zabezpečí na jednej strane transport a opakované spracovanie dosiek a na druhej strane možnosť extrakcie adsorbčných vrstiev s oddelenými látkami pre následné vylúhovanie jednotlivých zlúčenín z sorbentov a ich ďalšie štúdium inštrumentálnymi metódami (IR a UV spektrometria, röntgenové štruktúrne metódy, NMR atď.).

Doštičky sa líšia veľkosťou frakcií (distribúciou častíc) silikagélu, ktorý tvorí vrstvu. Na analytických platniach (trieda A) je frakcia 5-17 mikrónov, na vysokovýkonných platniach (trieda B) - 8-12 mikrónov. Užšia distribúcia zvyšuje účinnosť platní, t.j. škvrny oddelených látok sa stávajú kompaktnejšie (menšie veľkosti), a preto sa lepšie oddeľujú, keď čelo eluentu prechádza kratšou vzdialenosťou. Na ruských doštičkách sa analytické a vysokovýkonné vrstvy veľmi nelíšia, na rozdiel od doštičiek od spoločnosti Merck (Nemecko). Ak látky nemožno oddeliť na analytických platniach, mali by sa použiť vysokoúčinné platne. Doštičky všetkých modifikácií sú vyrábané s fosforom (UV grade) s excitáciou 254 nm. Čas použiteľnosti je neobmedzený, taniere “ Sorbfil » široko testované pri analýze derivátov aminokyselín, pesticídov, lipidov, antibiotík.

Uskutoční sa metóda TLC identifikácia kvality komponentov. kvantifikácia pre TLC je tiež možné, to vyžaduje použitie presného množstva látky a ďalšie denzitometrické štúdie s prehľadným záznamom intenzity škvŕn. Najčastejšie je semikvantitatívna metóda . Je založená na vizuálne porovnanie veľkosť a intenzita škvrny komponentu so zodpovedajúcimi charakteristikami série škvŕn tej istej látky rôznych koncentrácií ( štandardné referenčné roztoky ). Pri použití vzorky v množstve 1-5 μg táto jednoduchá metóda zabezpečuje presnosť stanovenia obsahu zložky asi 5-10%. Na stanovenie zložiek vo vzorke je často potrebné vykonať prípravu vzorky, aby sa získala zmes obsahujúca analyzované zlúčeniny. Príprava vzorky je založená na extrakcii liečiv zo vzorky organickými rozpúšťadlami ( n-hexán, petroléter, dietyléter, chloroform), čistenie extraktu a následná chromatografia v tenkej vrstve oxidu hlinitého alebo silikagélu.

Existuje niekoľko možností pre TLC a HD, ktoré sa líšia spôsobom zásobovanie rozpúšťadlami . V závislosti od smeru pohybu mobilnej fázy existujú:

A)vzostupná chromatografia - mobilná fáza sa naleje na dno separačnej komory, papier (doska) sa položí vertikálne;

b)zostupná chromatografia  mobilná fáza sa privádza zhora a pohybuje sa nadol pozdĺž vrstvy sorbentu dosky alebo papiera;

V)radiálna chromatografia  horizontálny posun čela rozpúšťadla: mobilná fáza sa privedie do stredu papierového kotúča (dosky), kde sa nanesie zmes, ktorá sa má oddeliť.

Najčastejšie je vzostupná elúcia (chromatografia). Predné eluent pri pohybe zdola nahor. Výber rozpúšťadla (mobilnej fázy) je určený povahou sorbentu a vlastnosťami separovaných látok.

Chromatografická separácia metódami BCh a TLC sa uskutočňujú v separačná komora s lapovaným vekom. Kvantitatívna miera rýchlosti prenosu látky pri použití konkrétneho adsorbenta a rozpúšťadla je R hodnota f (z angličtiny zadržiavanie faktor – koeficient oneskorenia, tento parameter je obdobou retenčného času). pozícia zóny chromatografovaného komponentu nastaviť podľa veľkosti koeficient R f , ktorá sa rovná pomeru rýchlosti pohybu jeho zóny k rýchlosti pohybu čela rozpúšťadla. Rozsah R f je vždy menšia ako jedna a nezávisí od dĺžky chromatogramu. Podľa množstva R f sú ovplyvnené rôznymi faktormi. Pri nízkych teplotách sa teda látky pohybujú pomalšie; kontaminácia rozpúšťadla, nehomogenita adsorbenta, cudzie ióny v analyzovanom roztoku môžu zmeniť hodnotu R f až 10 %. Vo vybranom systéme musia mať analyty rôzne hodnoty R f a distribuované po celej dĺžke chromatogramu. Je žiaduce, aby hodnoty R f bola v rozmedzí 0,05-0,85.

V praxi hodnota R f vypočítané ako pomer vzdialenosti l prešiel látkou do diaľky L prešiel cez rozpúšťadlo:

R f = l/L (6.1 )

Zvyčajne pre výpočet vyberte spot centrum (obr. 1). Rozsah R f závisí od mnohých faktorov: typ chromatografický papier (jej pórovitosť, hustota, hrúbka, stupeň hydratácie) a sorbent (veľkosť zŕn, charakter skupín na povrchu, hrúbka vrstvy, jej vlhkosť, povaha látky, zloženie mobilnej fázy), experimentálne podmienky (teplota, čas chromatografie a pod.). Ak sú všetky chromatografické parametre konštantné, hodnota R f určené iba individuálnymi vlastnosťami každého komponentu.

Ryža. 1. Stanovenie hodnôt na chromatograme Rf pre komponenty A A IN,

stupeň ich oddelenia Rs a počet teoretických etáp N .

Účinnosť HD a TLC závisí aj od selektivita a citlivosť reakcie používané na detekciu zložiek analyzovanej zmesi. Typicky sa používajú činidlá, ktoré tvoria farebné zlúčeniny - vývojky - so zložkami, ktoré sa stanovujú. Pre spoľahlivejšie identifikáciu zdieľaných komponentov uplatniť " svedkov »  riešenia štandardné látky (v rovnakom rozpúšťadle ako vzorka), ktorej prítomnosť sa vo vzorke očakáva. Štandardná látka aplikovaný na štartovaciu čiaru vedľa analyzovanej vzorky a chromatografovaný za rovnakých podmienok. V praxi sa často používa relatívna hodnota:

R f rel = R f X / R f stáť (6.2)

Kde R f stáť vypočítané aj pomocou vzorca (6.1). Efektívnosť chromatografická separácia charakterizovať počet ekvivalentných teoretických etáp a oni výška . V metóde TLC teda počet ekvivalentných teoretických poschodí N A pre komponent A zmes, ktorá sa má oddeliť, sa vypočíta podľa vzorca:

N A = 16 (l O.A. / a (A )) 2 (6.3)

hodnoty l O.A. A A (A ) určené, ako je znázornené na obr. 6.1. Potom výška ekvivalentnej teoretickej dosky N A je:

H A = l O.A. /N = a (A ) 2 / 16 l O.A. . (6.4)

Oddelenie je prakticky možné, ak R f (A)  R f (IN)  0,1 .

Charakterizovať oddelenie dvoch zložiek A A IN použitie stupeň (kritérium) oddelenia Rs :

Rs =  l/ (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l/ (a (A) + a (B)) (6.5)

Kde  l  vzdialenosť medzi stredmi bodov komponentov A A IN;

A (A) A A (IN)  bodové priemery A A IN na chromatograme (obr. 6.1). Viac Rs tým jasnejšie sú jednotlivé škvrny oddelené A A IN na chromatograme. Podmienky chromatografia vybrané tak, že hodnota Rs sa líšila od nuly a jednotky, čo je optimálna hodnota Rs je 0,3  0,7. Pre sadzbu separačná selektivita dve zložky A A IN použitie separačný faktor α :

α = l B / l A (6.6)

Ak α = 1, potom zložky A A IN nie sú oddelené.

9801 0

HPLC je kvapalinová stĺpcová chromatografia, pri ktorej možno použiť rôzne sorpčné mechanizmy. HPLC je v podstate moderná forma klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografie. Niektoré z najvýznamnejších kvalitatívnych charakteristík HPLC sú uvedené nižšie:
- vysoká rýchlosť procesu, ktorá umožnila skrátiť dobu separácie z niekoľkých hodín a dní na minúty;
- minimálny stupeň rozmazania chromatografických zón, čo umožňuje oddeliť zlúčeniny, ktoré sa len málo líšia v sorpčných konštantách;
- vysoký stupeň mechanizácie a automatizácie separácie a spracovania informácií, vďaka čomu kolónová kvapalinová chromatografia dosiahla novú úroveň reprodukovateľnosti a presnosti.

Intenzívny výskum v posledných desaťročiach a obrovské množstvo nahromadených experimentálnych údajov dnes umožňujú hovoriť o klasifikácii variantov v rámci metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Samozrejme, klasifikácia podľa vyššie uvedeného sorpčného mechanizmu zostáva v platnosti.

Spoločná klasifikácia je založená na porovnávacej polarite mobilnej a stacionárnej fázy. V tomto prípade sa rozlišuje medzi normálnou a reverznou fázovou chromatografiou.

Chromatografia na normálnej fáze (NPC) je variantom HPLC, keď je mobilná fáza menej polárna ako stacionárna fáza, a existuje dôvod domnievať sa, že hlavným faktorom určujúcim retenciu je interakcia sorbátov priamo s povrchom alebo objemom sorbentu.

Chromatografia na reverznej fáze (RPC) je variant HPLC, kde je mobilná fáza polárnejšia ako stacionárna fáza a retencia sa určuje priamym kontaktom molekúl sorbátu s povrchom alebo objemom sorbentu; v tomto prípade sa ionizované sorbáty nevymieňajú za ióny mobilnej fázy sorbované na povrchu.

Iónová výmenná chromatografia je možnosť, pri ktorej sa sorpcia uskutočňuje výmenou sorbovaných iónov mobilnej fázy za ióny látok, ktoré sa chromatografujú; Ligandová výmenná chromatografia môže byť definovaná úplne analogickým spôsobom.

Chromatografia na dynamicky modifikovaných sorbentoch je variantom HPLC, pri ktorej sorbát neinteraguje priamo s povrchom sorbentu, ale vstupuje do asociácie s molekulami povrchových vrstiev eluentu.
Iónová párová chromatografia je variant reverznej fázovej chromatografie ionizovaných zlúčenín, pri ktorej sa do mobilnej fázy pridáva hydrofóbny protiión, ktorý kvalitatívne mení sorpčné charakteristiky systému.

Vylučovacia chromatografia je metóda separácie zlúčenín podľa ich molekulových hmotností, založená na rozdiele v rýchlosti difúzie molekúl rôznych veľkostí v póroch stacionárnej fázy.

Pre HPLC je veľmi dôležitou charakteristikou veľkosť sorbentov, zvyčajne 3-5 mikrónov, teraz až 1,8 mikrónov. To umožňuje rýchle a úplné oddelenie zložitých zmesí látok (priemerný čas analýzy od 3 do 30 minút).

Separačný problém sa rieši pomocou chromatografickej kolóny, čo je trubica naplnená sorbentom. Pri vykonávaní analýzy sa kvapalina (eluent) určitého zloženia privádza cez chromatografickú kolónu konštantnou rýchlosťou. Do tohto prúdu sa vstrekuje presne odmeraná dávka vzorky. Zložky vzorky zavedené do chromatografickej kolóny sa v dôsledku ich rôznych afinit k kolónovému sorbentu pohybujú pozdĺž nej rôznymi rýchlosťami a dostávajú sa k detektoru postupne v rôznych časoch.

Chromatografická kolóna je teda zodpovedná za selektivitu a účinnosť separácie zložiek. Výberom rôznych typov kolón je možné kontrolovať stupeň separácie analytov. Zlúčeniny sú identifikované podľa ich retenčného času. Kvantitatívne stanovenie každej zo zložiek sa vypočíta na základe veľkosti analytického signálu nameraného pomocou detektora pripojeného k výstupu chromatografickej kolóny.

Sorbenty. Rozvoj HPLC je vo veľkej miere spojený s vytvorením nových generácií sorbentov s dobrými kinetickými vlastnosťami a rôznorodými termodynamickými vlastnosťami. Hlavným materiálom pre sorbenty v HPLC je silikagél. Je mechanicky pevný a má výraznú pórovitosť, čo dáva veľkú výmennú kapacitu pri malých veľkostiach kolón. Najbežnejšia veľkosť častíc je 5-10 mikrónov. Čím bližšie ku guľovitému tvaru častíc, tým nižší je prietokový odpor, tým vyššia je účinnosť, najmä ak sa preosieva veľmi úzka frakcia (napríklad 7 + 1 mikrónov).

Špecifický povrch silikagélu je 10-600 m/g. Silikagél môže byť modifikovaný rôznymi chemickými skupinami naočkovanými na povrch (C-18, CN, NH2, SO3H), čo umožňuje použitie sorbentov na jeho báze na separáciu širokej škály tried zlúčenín. Hlavnou nevýhodou silikagélu je jeho nízka chemická odolnosť pri pH< 2 и рН >9 (oxid kremičitý sa rozpúšťa v zásadách a kyselinách). Preto sa v súčasnosti intenzívne hľadajú sorbenty na báze polymérov, ktoré sú stabilné pri pH od 1 do 14, napríklad na báze polymetylmetakrylátu, polystyrénu atď.

Sorbenty pre iónomeničovú chromatografiu. Vzhľadom na zvláštnosti separácie (v kyslom alebo alkalickom prostredí) je hlavným materiálom sorbent do polystyrénu s divinylbenzénom rôzneho stupňa zosieťovania s SO3 -H+ (silne kyslé katexy) alebo -COO-Naf (slabo kyslý katión výmenníky), -H2N+ (CH3) skupiny navrúbľované na ich povrch 3Cl- (silne zásadité aniónomeniče) alebo -N+HR2Cl- (slabo zásadité aniónomeniče).

Sorbenty pre gélovú permeačnú chromatografiu. Hlavným typom je styrén-DVB. Používajú sa aj makroporézne sklá, metylmetakrylát a silikagél. Rovnaké sorbenty sa používajú na vylučovaciu chromatografiu.
Čerpadlá. Na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy (MP) kolónou so stanovenými parametrami sa používajú vysokotlakové čerpadlá. Medzi najdôležitejšie technické charakteristiky čerpadiel LC patria: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácie dodávky rozpúšťadla.

V závislosti od povahy prívodu rozpúšťadla môžu mať čerpadlá konštantný prívod (prietok) a konštantný tlak. V zásade sa pri analytických prácach používa režim konštantného prietoku a pri plnení kolón sa používa režim konštantného tlaku. Na základe princípu činnosti sa čerpadlá delia na injekčné čerpadlá a piestové čerpadlá.

Injekčné pumpy. Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií v toku mobilnej fázy počas prevádzky. Nevýhody čerpadla: a) veľká spotreba času a rozpúšťadla na umývanie pri výmene rozpúšťadla; b) pozastavenie separácie pri plnení čerpadla; c) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebný je výkonný motor a veľká sila piesta s jeho veľkou plochou).

Piestové čerpadlá s vratným pohybom. Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prísun mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny prevádzkový tlak 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml/min. Reprodukovateľnosť objemového toku je 0,5 %. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo je dodávané do systému vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, takže dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku.

To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a zníženej citlivosti takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických. Spôsoby boja proti pulzáciám: pomocou dvojitých čerpadiel alebo dvojpiestového čerpadla Bag-Lai, pomocou tlmiacich zariadení a elektronických zariadení.

Množstvo objemového posuvu je určené tromi parametrami: priemerom piesta (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúdou (12-18 mm) a frekvenciou (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Dávkovače. Účelom dávkovača je preniesť vzorku pri atmosférickom tlaku na vstup do kolóny pri tlaku až niekoľkých atmosfér. Je dôležité, aby sa v dávkovači nenachádzali žiadne „mŕtve“ objemy, ktoré by mobilná fáza nemohla umyť a aby počas dávkovania nedochádzalo k erózii vzorky. Najprv boli LC dávkovače podobné plynovým dávkovačom s prepichnutím membrány. Membrány však nevydržia viac ako 50-100 atm, ich chemická odolnosť je nedostatočná;

Kvapalná fáza má oveľa nižšiu rýchlosť difúzie ako plynná fáza. Dávkovať teda môžete zastavením prietoku – vzorka nestihne v dávkovači erodovať. Počas zavádzania vzorky do dávkovača špeciálny ventil uzatvára prietok rozpúšťadla. Tlak na vstupe do kolóny sa po niekoľkých sekundách rýchlo zníži, vzorka sa môže vstreknúť do komory dávkovača pomocou bežnej mikrostriekačky. Potom sa dávkovač uzamkne, zapne sa prietok rozpúšťadla a dôjde k oddeleniu.

Tlak, ktorý tento kohútik drží, je až 500-800 atm. Ale keď sa tok zastaví, rovnováha v kolóne je narušená, čo môže viesť k objaveniu sa „prázdnych“ ďalších píkov.

Slučkové dávkovače sú najpoužívanejšie. Keď je dávkovač naplnený, vstupy 1, 2 a kanál medzi nimi sú pod vysokým tlakom. Vstupy 3-6, kanály medzi nimi a dávkovacia slučka sú pod atmosférickým tlakom, čo umožňuje naplniť slučku pomocou injekčnej striekačky alebo pumpy. Keď sa dávkovač otočí, prúd mobilnej fázy vytlačí vzorku do kolóny. Na zníženie chyby sa slučka premyje 5-10-násobkom objemu vzorky. Ak je vzorka malá, môže sa vstreknúť do slučky pomocou mikrostriekačky. Objem slučky je zvyčajne 5-50 µl.

NA. Voinov, T.G. Volova

(hlavne intermolekulárne) na fázovom rozhraní. Ako analytická metóda je HPLC súčasťou skupiny metód, ktoré vzhľadom na zložitosť skúmaných objektov zahŕňajú predbežnú separáciu pôvodnej komplexnej zmesi na relatívne jednoduché. Výsledné jednoduché zmesi sa potom analyzujú konvenčnými fyzikálno-chemickými metódami alebo špeciálnymi metódami vyvinutými pre chromatografiu.

Metóda HPLC je široko používaná v takých oblastiach ako chémia, petrochémia, biológia, biotechnológia, medicína, potravinárstvo, ochrana životného prostredia, farmaceutická výroba a mnoho ďalších.

Podľa mechanizmu separácie analyzovaných alebo separovaných látok sa HPLC delí na adsorpciu, distribúciu, iónovú výmenu, exklúziu, výmenu ligandov a iné.

Treba mať na pamäti, že v praktickej práci k separácii často dochádza nie cez jeden, ale cez niekoľko mechanizmov súčasne. Vylučovacia separácia teda môže byť komplikovaná adsorpčnými účinkami, adsorpčná separácia distribučnými účinkami a naopak. Navyše, čím väčší je rozdiel medzi látkami vo vzorke, pokiaľ ide o stupeň ionizácie, zásaditosť alebo kyslosť, molekulovú hmotnosť, polarizáciu a iné parametre, tým väčšia je pravdepodobnosť odlišného separačného mechanizmu pre takéto látky.

Normálna fáza HPLC

Stacionárna fáza je polárnejšia ako mobilná fáza, preto v eluente prevláda nepolárne rozpúšťadlo:

• Hexán:izopropanol = 95:5 (pre látky s nízkou polaritou)
• Chloroform:metanol = 95:5 (pre strednopolárne látky)
• Chloroform:metanol = 80:20 (pre vysoko polárne látky)

HPLC na reverznej fáze

Stacionárna fáza je menej polárna ako mobilná fáza, takže eluent takmer vždy obsahuje vodu. V tomto prípade je vždy možné zabezpečiť úplné rozpustenie BAS v mobilnej fáze, takmer vždy je možné použiť UV detekciu, takmer všetky mobilné fázy sú vzájomne miešateľné, možno použiť gradientovú elúciu, kolónu je možné rýchlo znovu - ekvilibrovaný, kolónu možno regenerovať.

Bežné eluenty pre HPLC s reverznou fázou sú:

• Acetonitril:voda
• Metanol:voda
• Izopropanol:voda

Matrice pre HPLC

Matricami používanými pri HPLC sú anorganické zlúčeniny, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, alebo organické polyméry, ako je polystyrén (zosieťovaný divinylbenzénom) alebo polymetakrylát. Silikagél je, samozrejme, teraz všeobecne akceptovaný.

Hlavné vlastnosti matrice:

• veľkosť častíc (um);
• Vnútorná veľkosť pórov (Å, nm).

Príprava silikagélu pre HPLC:

1. Lisovanie mikrosfér kyseliny polykremičitej;
2. Sušenie častíc silikagélu;
3. Oddelenie vzduchu.

Sorpčné častice:

• Pravidelné (sférické): vyššia odolnosť voči tlaku, vyššie náklady;
• Nesférické: nižšia odolnosť voči tlaku.

Veľkosť pórov pri HPLC je jedným z najdôležitejších parametrov. Čím menšia je veľkosť pórov, tým horšia je ich priepustnosť pre molekuly eluovaných látok. A teda tým horšia je sorpčná schopnosť sorbentov. Čím väčšie sú póry, tým je po prvé mechanická stabilita častíc sorbentu a po druhé, čím menší je sorpčný povrch, tým horšia je účinnosť.

Očkovanie v stacionárnej fáze

Normálna fáza HPLC:

• Stacionárna fáza s propylnitrilovým očkovaním (nitril);
• Stacionárna fáza s propylamínovým štepením (amín).

HPLC na reverznej fáze:

• Stacionárna fáza s alkylovým očkovaním;
• Stacionárna fáza s alkylsilylovým očkovaním.

End-capping je ochrana nenavrúbľovaných oblastí sorbentu dodatočným štepením „malými“ molekulami. Hydrofóbna koncovka (C1, C2): vyššia selektivita, horšia zmáčavosť; hydrofilný end-capping (diol): nižšia selektivita, vyššia zmáčavosť.

Detektory pre HPLC

• UV
• Diódová matica
• Fluorescenčné
• Elektrochemické
• Refraktometrické
• Hromadne selektívne

Odkazy

Nadácia Wikimedia. 2010.

Pozrite si, čo je „Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia“ v iných slovníkoch:

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia-- [A.S. Anglicko-ruský energetický slovník. 2006] Témy: energia vo všeobecnosti EN vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPLC ... Technická príručka prekladateľa

Pojem vysokoúčinná kvapalinová chromatografia Pojem v angličtine vysokoúčinná kvapalinová chromatografia Synonymá Skratky HPLC, HPLC Súvisiace pojmy adsorpcia, oligopeptid, proteomika, sorbent, fullerén, endohedrická, chromatografia... ...

Kvapalinová chromatografia, pri ktorej sa pre zvýšenie účinnosti separácie čerpá rozpúšťadlo (eluent) pod tlakom (viac ako 3x107 Pa) cez kolóny naplnené sorbentom s časticami malého priemeru (do 1 μm) a tiež perfúzne filtre. použitý......

Typ chromatografie, v ktorom kvapalina (eluent) slúži ako mobilná fáza a ako stacionárna fáza. sorbent, TV nosič s kvapalinou alebo gélom aplikovaným na jeho povrch. Preveďte v kolóne naplnenej sorbentom (stĺpcová chromatografia) na plochom... ... Prírodná veda. encyklopedický slovník

- [κρώμα (υrum) color] proces založený na nerovnakej schopnosti jednotlivých zložiek zmesi (kvapalnej alebo plynnej) zostať na povrchu adsorbenta tak pri ich absorbovaní z prúdu nosiča, ako aj pri ... ... Geologická encyklopédia

- (z inej gréčtiny ... Wikipedia

Pojem chromatografia Pojem v angličtine chromatografia Synonymá Skratky Súvisiace pojmy vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, klatrát, laboratórium na čipe, porometria, proteóm, proteomika, sorbent, enzým, fullerén, endohedrický... ... Encyklopedický slovník nanotechnológie

Kvapalinová chromatografia založená na rozklade. schopnosť oddelených iónov k iónovej výmene s fix. sorbentové ióny vznikajúce v dôsledku disociácie ich ionogénnych skupín. Katiónové výmenníky sa používajú na oddelenie katiónov, pre... ... Chemická encyklopédia

HPLC- vysokoúčinná kvapalinová chromatografia… Slovník ruských skratiek

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je jednou z účinných metód separácie zložitých zmesí látok, ktorá je široko používaná ako v analytickej chémii, tak aj v chemickej technológii. Základom chromatografickej separácie je účasť ... Wikipedia

knihy

• Praktická vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, Veronica R. Mayer. Čitateľovi predstavujeme 5. vydanie knihy, ktorá je rozšírená o moderné metódy a zariadenia. V knihe sa veľa zlepšilo a pridalo sa veľké množstvo odkazov. Tie miesta v texte, kde...