Kombinatorinen synteesi voidaan suorittaa ei vain liuoksessa (nestefaasisynteesi), vaan myös kiinteän kemiallisesti inertin faasin pinnalla. Tässä tapauksessa ensimmäinen lähtöaine "kiinnitetään" kemiallisesti polymeerikantajan pinnalla oleviin funktionaalisiin ryhmiin (useimmiten käytetään esteri- tai amidisidosta) ja käsitellään toisen lähtöaineen liuoksella, joka otetaan merkittävässä ylimäärässä niin, että reaktio menee loppuun. Tässä reaktion muodossa on tietty mukavuus, koska tuotteiden eristystekniikka helpottuu: polymeeri (yleensä rakeiden muodossa) yksinkertaisesti suodatetaan pois, pestään perusteellisesti toisen reagenssin jäännöksistä ja kohdeyhdiste. irrotetaan siitä kemiallisesti.

Orgaanisessa kemiassa ei ole ainuttakaan reaktiota, joka käytännössä tarjoaisi kohdetuotteiden kvantitatiivisia saantoja joka tapauksessa. Ainoa poikkeus on ilmeisesti orgaanisten aineiden täydellinen palaminen hapessa korkeassa lämpötilassa CO 2:ksi ja H 2 O:ksi. Siksi kohdetuotteen puhdistaminen on aina välttämätön ja usein vaikein ja aikaa vievin tehtävä. Erityisen vaikea tehtävä on peptidisynteesituotteiden eristäminen, esimerkiksi polypeptidien monimutkaisen seoksen erottaminen. Siksi peptidisynteesissä R. B. Merifieldin 1960-luvun alussa kehittämä synteesimenetelmä kiinteällä polymeerisubstraatilla on yleistynyt.

Polymeerikantaja Merrifield-menetelmässä on rakeinen silloitettu polystyreeni, joka sisältää bentseenirenkaissa kloorimetyyliryhmiä, jotka ovat linkkereitä, jotka sitovat kantajan polypeptidin ensimmäiseen aminohappotähteeseen. Nämä ryhmät muuttavat polymeerin bentsyylikloridin funktionaaliseksi analogiksi ja antavat sille kyvyn muodostaa helposti esterisidoksia reagoidessaan karboksylaattianionien kanssa. Tällaisen hartsin kondensaatio N-suojattujen aminohappojen kanssa johtaa vastaavien bentsyyliestereiden muodostumiseen. N-suojauksen poistaminen tuottaa C-suojatun johdannaisen ensimmäisestä aminohaposta, joka on kovalenttisesti liitetty polymeeriin. Vapautetun aminoryhmän aminoasylointi toisen aminohapon N-suojatulla johdannaisella, jota seuraa N-suojauksen poistaminen, johtaa samanlaiseen dipeptidijohdannaiseen, joka on myös sitoutunut polymeeriin:

Tällainen kaksivaiheinen sykli (suojauksen poisto - aminoasylointi) voidaan periaatteessa toistaa niin monta kertaa kuin tarvitaan tietynpituisen polypeptidiketjun rakentamiseksi.

Merifieldin ideoiden jatkokehitys kohdistui ensisijaisesti uusien polymeerimateriaalien etsimiseen ja luomiseen substraatteihin, tuotteiden erottelumenetelmien kehittämiseen sekä automatisoitujen tilojen luomiseen koko polypeptidisynteesin sykliä varten.

Merifield-menetelmän tehokkuus on osoitettu useiden luonnollisten polypeptidien, erityisesti insuliinin, onnistuneella synteesillä. Erityisen selvästi sen edut on osoitettu ribonukleaasientsyymin synteesin esimerkillä. Niinpä esimerkiksi Hirschman ja 22 työntekijää suorittivat useiden vuosien aikana huomattavien ponnistelujen kustannuksella ribonukleaasientsyymin (124 aminohappotähdettä) synteesin perinteisillä nestefaasimenetelmillä. Melkein samanaikaisesti sama proteiini saatiin automaattisella kiinteäfaasisynteesillä. Toisessa tapauksessa synteesin, joka sisälsi yhteensä 11 931 erilaista toimenpidettä, mukaan lukien 369 kemiallista reaktiota, suoritti kaksi osallistujaa (Gatte ja Merrifield) vain muutamassa kuukaudessa.

Merrifieldin ideat toimivat perustana erilaisten menetelmien luomiselle eri rakenteiden polypeptidien kirjastojen kombinatoriseen synteesiin.

Joten vuonna 1982 ehdotettiin alkuperäistä strategiaa peptidien monivaiheiselle rinnakkaissynteesille kiinteässä faasissa, joka tunnetaan nimellä "jakomenetelmä". jakaa- halkaisu, erotus) tai "sekoita ja halkaise" -menetelmä (kuva 3). Sen olemus on seuraava. Oletetaan, että kolmesta aminohaposta (A, B ja C) sinun on saatava kaikki mahdolliset tripeptidien yhdistelmät. Tätä varten kiinteän polymeerikantajan (P) rakeet jaetaan kolmeen yhtä suureen osaan ja käsitellään yhden aminohapon liuoksella. Tässä tapauksessa kaikki aminohapot ovat kemiallisesti sitoutuneet polymeerin pintaan yhdellä niiden funktionaalisista ryhmistä. Saadut kolmen luokan polymeerit sekoitetaan perusteellisesti ja seos jaetaan jälleen kolmeen osaan. Sitten jokainen osa, joka sisältää kaikki kolme aminohappoa yhtä paljon, käsitellään jälleen yhdellä samoista kolmesta aminohaposta ja saadaan yhdeksän dipeptidiä (kolme kolmen tuotteen seosta kussakin). Toinen sekoitus, jakaminen kolmeen yhtä suureen osaan ja käsittely aminohapoilla antaa halutut 27 tripeptidiä (kolme yhdeksän tuotteen seosta) vain yhdeksässä vaiheessa, kun taas niiden saaminen erikseen vaatisi 27 × 3 = 81 vaiheen synteesin.

"Biologi. -lehteä Armenia, 1 (65), 2013 PIG ATRIUM G.S.STA ERISTETTY SYDÄN-AKTIIVISEN PEPTIDIN KIINTEÄVAIHEEN SYNTEESI. CHAILYAN Biokemian instituutti. Bunyatyan NAS RA..."

Kokeellisia ja teoreettisia artikkeleita

Kokeellisia ja teoreettisia artikkeleita

Biologi. -lehteä Armenia, 1 (65), 2013

SYDÄNPEPTIDIN KIINTEÄVAIHEEN SYNTEESI,

ERISTETTY SIAN ATRIUMISTA

G.S. CHAILYAN

Biokemian instituutti. Bunyatyan NAS RA

[sähköposti suojattu]

Tutkimuksen jatkamiseksi acad. Galoyan, teimme sarjan kokeita eristääksemme, puhdistaaksemme ja määrittääksemme äskettäin eristettyjen peptidiyhdisteiden biologisen orientaation sian sydämen eteis- ja korvaosista. Biomääritysten suorittamiseksi oli tarpeen saada tutkittuja näytteitä preparatiivisia määriä. Tätä varten käytimme kiinteän faasin peptidisynteesin menetelmää sen lisämuokkauksella. Syntetisoitujen valmisteiden puhtaus ja identiteetti tarkastettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla ja massaspektrianalyysillä.

Kiinteäfaasisynteesi - fmoc-aminohapot - HPLC - fenyyli-isotiosyanaatti - massaspektrianalyysi:

fmoc- – – Galoyanin perustamia lisätutkimuksia varten suoritettiin sarja kokeita sikojen eteisestä eristettyjen peptidien eristämisestä, puhdistamisesta ja biologisen suunnan määrittämisestä. Biotestien suorittamiseen vaadittiin valmisteleva näytemäärä. Käytettiin modifioitua kiinteän faasin peptidisynteesin menetelmää. Syntetisoidun peptidin puhtaus ja identtisyys määritettiin HPLC:llä ja massaspektrianalyysillä.

Kiinteäfaasisynteesi – korkean erotuskyvyn nestekromatografia – massaspektrometria – fmoc-aminohapot – kardiopeptidit – eteiset Galoyan ym. tutkivat hypotalamuksen neurohormonien säätelytapoja ja toimintamekanismeja kehon eri prosesseissa.

Endokrinologian käännekohta oli vahvistus ajatukselle sellaisen järjestelmän kuin hypotalamus - aivolisäke - lisämunuaiset toisiinsa kytketystä, toisistaan ​​riippuvaisesta, kiinteästä toiminnasta. Tämän konseptin täydentäminen SIAN ATRIUMISTA ERISTETTYN SYDÄMEN AKTIIVISEN PEPTIDIN KIINTEÄVAIHEEN SYNTEESI Galoyanin esittämästä tuaalikolmiosta hypotalamuksen ja aivolisäkkeen vuorovaikutuksesta

– sydän, on valtava tieteellinen saavutus. Myöhemmin löydettiin uusi kudoskohde-sydän, tämän elimen kyky ohjata tiettyjen peptidien toimintaa sekä hypotalamuksen ja sydämen välinen palautemekanismi näiden peptidien kautta.

Kardioaktiivisten yhdisteiden - neurohormonien K, C, G ja useiden muiden löytö eri eläinten hypotalamuksesta toimi alkuna paitsi näiden neurohormonien molekyylien vaikutusmekanismien tutkimiselle, myös etsimiselle. samankaltaisille yhdisteille sydämessä. Kardioaktiivisten aineiden biokemiallisten ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien kattavan tutkimuksen perustana olivat tiedot kahden kardioaktiivisen yhdisteen läsnäolosta sydänlihaksessa. Neurohormonin "C" osallistuminen glykolyyttisten prosessien ja syklisten nukleotidien tason säätelyyn varmistettiin estämällä PDE cAMP:tä, cAMP-riippuvaista proteiinikinaasia jne. Tämän yhdisteen on osoitettu olevan pieni molekyylipaino ja se kuuluu glykopeptideihin.

Analyyttisen kromatografian ja peptidisynteesin laboratoriossa teimme työtä sian sydämen eteis- ja korva-alueilta olevien peptidiyhdisteiden eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Peptidifraktioiden erottamisen aikana preparatiivisella HPLC:llä eristimme ja puhdistimme homogeeniseen tilaan 20 peptidiluonteista yhdistettä. Biologisen fokuksen määrittämiseksi kaikki valmisteet testattiin EKG-komponenttien muutosten varalta rotilla. Kokeiden tulokset osoittivat, että 7 yhdisteellä on monipuolisia tekijöitä, jotka vaikuttavat tiettyihin EKG:n komponentteihin.

Peptidi nro 7 osoitti suurinta aktiivisuutta R-komponentin amplitudin, QRS-kompleksin keston, S-amplitudin ja muiden parametrien muuttamisessa.

Tämän lääkkeen biologisten vaikutusmekanismien tutkimiseksi tuli välttämättömäksi saada suuri määrä testinäytettä. Koska biologisten tuotteiden eristys- ja puhdistusprosessi on äärimmäisen tehoton, työläs, aikaa vievä eikä voi tarjota hyvää toistettavuutta, on tullut erittäin tärkeäksi suorittaa tämän lääkkeen kemiallinen synteesi. Analysoimalla maailmankirjallisuutta peptidien kemiallisen synteesin alalla tulimme siihen tulokseen, että meille optimaalisin on kiinteäfaasisynteesimenetelmä fmoc-suojattuja aminohappoja käyttäen. Vuonna 1984 löydetyllä kiinteän faasin peptidisynteesillä on monia etuja tavanomaiseen synteesiin verrattuna tehokkuuden sekä kätevän prosessoinnin ja puhdistuksen kannalta.

Käyttämällä useita erilaisia ​​menetelmiä: tämän lääkkeen hydrolyysi, aminohappojen modifiointi fenyyli-isotiosyanaatilla, saimme peptidin nro 7 aminohappokoostumuksen. Käyttämällä massaspektri- ja NMR-analyysien, Edmon-hajoamisen tietoja, pystyimme saamaan peptidin nro 7 aminohappokoostumuksen lisäksi myös aminohapposekvenssin.

Phe-Val-Pro-Ala-Met-Gly-Ile-Arg-Pro Tehokas kiinteäfaasisynteesiprosessi riippuu suurelta osin erilaisten olosuhteiden oikeasta valinnasta sen toteuttamiseksi, kuten hartsin, liuottimen ja synteesikinetiikan valinnasta. Nämä muuttujat vaikuttavat hartsin turpoamisasteeseen ja sen assosiaatioon aminohappojen kanssa, sitoutumiskohtien lukumäärään, mikä lopulta vaikuttaa koko peptidin synteesiin. Sovitimme kiinteän faasin synteesin prosessia tutkimiimme peptideihin nähden ottaen huomioon niiden aminohapposekvenssin erityispiirteet.

G.S. CHAILYAN Materiaali ja menetelmät. Kaikki käytetyt reagenssit, liuottimet ja hartsit ovat Advanced Chem Techcompanylta. Käytimme fmoc-ryhmiä suojaamaan aminohappojen N-päätä synteesin aikana ja dimetyyliformamidia (DMF) liuottimena koko synteesin ajan. Käytimme substraattina happolabiilia 2-klooritrityylihartsia. Suojaavien fmoc-ryhmien poisto suoritettiin käyttämällä piperidiinin liuosta DMF:ssä.

Erittäin tärkeä synteesiprosessissa on ensimmäisen aminohapon laskeutuminen hartsiin. Kaksi grammaa 2Cl-Trt-hartsia kaadettiin 10 ml:n ruiskuun. DMF vedettiin ruiskuun, hartsin annettiin turvota 15 minuuttia. Sen jälkeen DMF pestiin pois. Sitten ruiskuun vedettiin ensimmäisen aminohapon (fmoc-Pro) ja reaktion aktivaattorin (DIPEA) liuos suhteessa 1 RESIN/1,2 FMOC-PRO/4DIPEA. Ensimmäisen aminohapon istuttamisen reaktio kesti 3 tuntia. Erittäin tärkeä ehto synteesin kannalta on vapaiden linkkereiden puuttuminen ensimmäisen aminohapon istutuksen jälkeen, joten ensimmäiseen aminohappoon sitoutumisen jälkeen hartsi käsiteltiin seoksella metyleeni, DIPEA (di-isopropyylietyyliamiini) ja DMF suhteessa 80DMF/15MEOH/5DIPEA mahdollisesti jäljellä olevien vapaiden päiden estämiseksi. Tämän jälkeen hartsi pestiin DMF:llä 5 kertaa 5 minuutin ajan. Sitten aminohapot poistettiin 30-prosenttisella piperidiiniliuoksella DMF:ssä 8 kertaa 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen hartsi pestiin DMF:llä 5 kertaa 5 minuutin ajan. Tämä sykli toistettiin koko peptidin synteesin ajan. Jokaisen aminohapon lisäys- ja suojauksen poistovaiheen jälkeen reaktion etenemisen valvonta tarkistettiin Kaiser-testillä, joka on ninhydriinin reaktio vapaan aminoryhmän kanssa tyypillisen tummansinisen värin muodostamiseksi. Tämän testin ansiosta oli mahdollista valvoa vaiheittain aminohappojen lataus- ja deblokkausreaktioita.

Syntetisoidun peptidin nro 7 puhdistus ja kontrolli suoritettiin Watersin (USA) 2-komponenttisella preparatiivisella HPLC-järjestelmällä. Näytteen ruiskuttamiseen käytettiin Rheodyne-injektoria, jonka silmukan tilavuus oli 500 ui. Havaitseminen suoritettiin alueella 190-360 nm. Käytimme "Symmetry Si-100 C18" (4,6 x 250 mm) -kolonnia käänteisfaasi-HPLC:hen. Virtausnopeus oli 50 ml/min. Käytettiin gradienttieluenttijärjestelmää H20/ACN/TFA (98/2/0,1)/(0,100,0,1). Analyysiaika 15 min. Uudelleenkromatografia suoritettiin Knauer HPLC -analyyttisellä järjestelmällä. Käytettiin XbridgeC18-kolonnia (2,6 x 150 mm). Havaitseminen suoritettiin aallonpituudella 214 nm.

Saatujen tietojen vahvistamiseksi syntetisoidulle valmisteelle suoritettiin massaspektrianalyysi CSU:lla "Analitycal spectrometry".

Tulokset ja keskustelu. Kromatogrammista saadut tiedot viittaavat siihen, että syntetisoidun peptidin nro 7 puhtaus puhdistuksen jälkeen on yli 99,6 % (kuvio 1).

–  –  –

Suoritimme natiivin peptidin nro 7 vertailevan kromatografisen analyysin X-bridgeC18-kolonnissa samoissa olosuhteissa kuin sen syntetisoitu analogi. Vertailutulokset esitetään (kuva 2).

Sian Atriasta eristetyn kardioaktiivisen peptidin kiinteäfaasisynteesi

–  –  –

Riisi. Kuva 4. Syntetisoitujen (A) ja natiivivalmisteiden (B) spektrogrammit.

G.S. CHAILYAN Kuten kromatogrammien vertailusta voidaan nähdä, syntetisoitu analogi ja natiivi peptidi nro 7 ovat identtisiä massaltaan ja vapautumisajaltaan, mikä osoittaa niiden rakenteiden ja aminohapposekvenssin identiteetin. Siten käyttämällä kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmää ja ottaen huomioon tutkitun peptidin rakenteelliset ominaisuudet, onnistuimme saamaan homogeenisen ja identtisen 9 aminohaposta koostuvan natiivin peptidin kanssa. Tulevaisuudessa, kun lääkettä on riittävästi, aiomme suorittaa sarjan biotestejä tunnistaaksemme paitsi tavat, joilla tämä peptidi säätelee sydämen toimintaa, myös vaikutusmekanismit muihin elimiin ja järjestelmiin.

KIRJALLISUUS

Popova T.V., Srapionyan R.M., Galoyan A.A. Havaitseminen ja tunnistaminen härän sydämessä uusi 1.

kardioaktiiviset proteiinit. Kysymys. hunaja. Chemistry, 37, 2, s. 56-58, 1991.

Srapionyan R.M., Sahakyan S.A., Sahakyan F.M., Galoyan A.A. Eristäminen ja karakterisointi 2.

neurohormoni C -kantajaproteiinin kardioaktiivinen tryptinen fragmentti. Neurochemistry, 2, 3, s. 263-271, 1983.

Srapionyan, R.M. Misiryan, S.S. Pienmolekyylipainoisten koronaaktiivisten yhdisteiden erottaminen 3.

sydänlihakseen geelisuodatuksen ja polyyhdistelmällä. Biologi. -lehteä Armenia, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Srapionyan, R.M. Popova, T.V. Galoyan, A.A. Kardioaktiivisten proteiinikompleksien jakautuminen eri eläinten sydämessä. Biologi. -lehteä Armenia, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. Hypotalamo-neurohypofyysijärjestelmän hermoston erityksen ja hormonien säätely, Neuvostoliitto, 1963.

6. Galoyan A.A. Uusien kardioaktiivisten hormonien ja toiminnallisen järjestelmän immunomodulaattoreiden biokemia. Neurosekretiivinen hypotalamus, endokriininen sydän. Science Publ. s. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3. painos, Springer Publishers, 500 s., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 s., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. Hypotalauksesta eristettyjen koronarodilatoivien proteiinien puhdistus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, s. 210-213, 1966.

10. March J., Smith M. Marchin edistynyt orgaaninen kemia. Julkaisija John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, s. 133, 2007.

–  –  –

Samanlaisia ​​teoksia:

« YHTEISÖJEN KUSTANTAJA "NAUKA" Moskova 1979 UDC 581.55:56.017 Tontti n i k v VV Kasviyhteisöjen rakenteen kehitys. M.: Nauka, s. 1979, 276 Modernista metallista...»

Museorahaston Izvestia. A.A. Brauner №2 I osa 2004 Museorahaston aineistoa. A. A. Brauner Osa I nro 2 2004 Tieteellinen aikakauslehti Perustettu joulukuussa 2003 Julkaistu 4 kertaa vuodessa Valtion rekisteröintitodistus OD nro 913 päivätty 13.12.2003 Perustaja ja julkaisija ... "

Venäjän federaation opetus- ja tiedeministeriö

Liittovaltion autonominen korkea-asteen koulutuslaitos "Uralin liittovaltion yliopisto, joka on nimetty Venäjän ensimmäisen presidentin B. N. Jeltsinin mukaan"

Orgaanisen synteesin teknologian laitos

Tiivistelmä aiheesta: "Kiinteän faasin synteesin periaatteet ja menetelmät. Peptidien synteesi »

Esittäjä: opiskelija gr. Х-300803

Shaikhutdinova A.I.

Tarkastettu Berseneva V.S.

Jekaterinburg 2013

1. Johdanto…………………………………………………………………………3

2. Mitä peptidit ovat? ................................................ ............................................... neljä

2.1. Peptidien rakenne…………………………………………………………….5

2.2. Peptidien synteesi…………………………………………………………….7

3. Peptidien synteesi kiinteässä faasissa………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………

3.1. Merrinfieldin menetelmä…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

3.2. Kiinteä alusta…………………………………………………………….14

3.3. Alustan valinta……………………………………………………………14

3.4. Linkit…………………………………………………………………….16

4. Luonnollisen hormonin - oksitosiinin - ensimmäinen synteesi………………………….22

5. Insuliinin synteesi solussa………………………………………………………..30

6. Johtopäätös……………………………………………………………………..34

7. Kirjallisuus………………………………………………………………………35

Johdanto

Orgaanisessa kemiassa ei ole ainuttakaan reaktiota, joka käytännössä tarjoaisi kohdetuotteiden kvantitatiivisia saantoja joka tapauksessa. Ainoa poikkeus on ilmeisesti orgaanisten aineiden täydellinen palaminen hapessa korkeassa lämpötilassa CO 2:ksi ja H 2 O:ksi. Siksi kohdetuotteen puhdistaminen on monimutkainen ja aikaa vievä tehtävä. Esimerkiksi peptidisynteesituotteiden 100-prosenttinen puhdistaminen on ratkaisematon ongelma. Peptidin, oksitosiinihormonin (1953), joka sisältää vain 8 aminohappotähdettä, ensimmäistä täydellistä synteesiä pidettiin todellakin erinomaisena saavutuksena, joka toi sen kirjoittajalle V. du Vignotille Nobel-palkinnon vuonna 1955. Kuitenkin seuraavassa Kahdenkymmenen vuoden aikana tämän monimutkaisten polypeptidien synteesi muuttui rutiiniksi, joten tällä hetkellä 100 tai useammasta aminohappotähteestä koostuvien polypeptidien synteesiä ei pidetä enää ylitsepääsemättömänä tehtävänä.

Työn tarkoitus: purkaa ja selittää: "Mikä aiheutti niin dramaattisia muutoksia polypeptidisynteesin alalla?"

Mitä peptidit ovat?

Peptidit ovat luonnollisia tai synteettisiä yhdisteitämolekyylejäjotka on rakennettu jäänteistäpeptidi- (amidi)sidoksilla toisiinsa kytketyt alfa-aminohapot C (O) NH. Saattaa sisältäämolekyylimyös ei-aminohappokomponentti (esimerkiksi tähdehiilihydraatti). Mukana olevien aminohappotähteiden lukumäärän mukaanmolekyylejä peptidit, erottaa dipeptidit, tripeptidit, tetrapeptidit jne. Peptidejä, jotka sisältävät jopa 10 aminohappotähdettä, kutsutaan oligopeptideiksi, niitä, jotka sisältävät yli 10 aminohappotähdettä, kutsutaan polypeptideiksi. polypeptiditjoiden molekyylipaino on yli 6 tuhatta, kutsutaanproteiinit.

Ensimmäistä kertaa peptidejä eristettiin entsymaattisista proteiinihydrolysaateista. Termin "peptidit" ehdotti E. Fisher. Ensimmäisen synteettisen peptidin hankki T. Curtius vuonna 1881. E. Fisher kehitti vuoteen 1905 mennessä ensimmäisen yleisen menetelmän peptidien synteesiä varten ja syntetisoi joukon oligopeptidejä, joilla oli erilaisia ​​rakenteita. Nykyisen panoksen peptidikemian kehittämiseen antoivat E. Fischerin opiskelijat E. Abdergalden, G. Leike ja M. Bergman. Vuonna 1932 Bergman ja L. Zervas käyttivät bentsyylioksikarbonyyliryhmää (karbobenoksiryhmää) peptidien synteesissä suojaamaan aminohappojen alfa-aminoryhmiä, mikä merkitsi uutta vaihetta peptidisynteesin kehityksessä. Saatuja N-suojattuja aminohappoja (N-karbobentsoksiaminohappoja) käytettiin laajasti erilaisten peptidien saamiseksi, joita käytettiin menestyksekkäästi useiden näiden aineiden kemian ja biokemian keskeisten ongelmien tutkimiseen, esimerkiksi substraattispesifisyyden tutkimiseen. proteolyyttiset entsyymit. N-karbobenoksiaminohappoja käyttämällä syntetisoitiin ensimmäistä kertaa luonnollisia peptidejä (glutationi, karnosiini jne.). Tärkeä saavutus tällä alalla kehitettiin 50-luvun alussa. P. Vaughan et ai., peptidien synteesi seka-anhydridimenetelmällä.

Vuonna 1953 V. Du Vigno syntetisoi ensimmäisen peptidihormonin, oksitosiinin. P. Merrifieldin vuonna 1963 kehittämän kiinteän faasin peptidisynteesin käsitteen perusteella luotiin automaattisia peptidisyntetisaattoreita. Peptidien kontrolloidun entsymaattisen synteesin menetelmiä on kehitetty intensiivisesti. Uusien menetelmien käyttö mahdollisti hormonin insuliinin syntetisoinnin jne.

Peptidien synteettisen kemian edistysaskel on saatu aikaan edistymällä sellaisten peptidien erotus-, puhdistus- ja analyysimenetelmien kehittämisessä, kuten ioninvaihtokromatografia, elektroforeesi erilaisilla väliaineilla, geelisuodatus, korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC), immunokemialliset menetelmät. analyysi jne. pääteryhmän analyysimenetelmät ja menetelmät peptidien vaiheittaiseksi pilkkomiseksi. Erityisesti luotiin automaattisia aminohappoanalysaattoreita ja automaattisia laitteita peptidien primäärirakenteen määrittämiseksi, ns. sekvensserit.

Peptidisidoksella on osittain kaksoissidoksen ominaisuuksia. Tämä ilmenee tämän sidoksen pituuden (0,132 nm) pienentymisenä verrattuna yksinkertaisen CN-sidoksen pituuteen (0,147 nm). Peptidisidoksen osittain kaksoissidottu luonne tekee substituenttien mahdottomaksi pyöriä vapaasti sen ympärillä, joten peptidiryhmä on tasomainen ja sillä on yleensä trans-konfiguraatio (muoto I). Siten peptidiketjun selkäranka on sarja jäykkiä tasoja, joissa on liikkuva ("saranoitu") liitos paikassa, jossa epäsymmetriset C-atomit sijaitsevat (merkitty tähdellä I-osassa).

Peptidiliuoksissa havaitaan tiettyjen konformeerien edullista muodostumista. Ketjun pidentyessä sekundaarirakenteen järjestyneet elementit saavat selvemmän stabiiliuden (samanlainen kuin proteiinit). Sekundaarisen rakenteen muodostuminen on erityisen tyypillistä tavallisille peptideille, erityisesti polyaminohapoille.

Ominaisuudet

Oligopeptidit ovat ominaisuuksiltaan samanlaisia ​​kuin aminohapot, polypeptidit ovat samanlaisia ​​​​kuin proteiineja. Oligopeptidit ovat pääsääntöisesti kiteisiä aineita, jotka hajoavat kuumennettaessa 200-300 0 C:een. Ne liukenevat helposti veteen, laimeisiin happoihin ja emäksiin ja lähes liukenemattomia orgaanisiin liuottimiin. Poikkeuksena ovat hydrofobisista aminohappotähteistä rakennetut oligopeptidit.

Oligopeptideillä on amfoteerisia ominaisuuksia, ja väliaineen happamuudesta riippuen ne voivat esiintyä kationien, anionien tai kahtaisionien muodossa. Pääabsorptiokaistat IR-spektrissä NH-ryhmälle ovat 3300 ja 3080 cm-1, C=O-ryhmälle 1660 cm-1. UV-spektrissä peptidiryhmän absorptiovyöhyke on alueella 180-230 nm. Peptidien isoelektrinen piste (pI) vaihtelee suuresti ja riippuu molekyylin aminohappotähteiden koostumuksesta. Peptidien pKa-arvot ovat a-COOH:lle noin. 3, -H 2:lle noin. kahdeksan.

Oligopeptidien kemialliset ominaisuudet määräytyvät niiden sisältämien funktionaalisten ryhmien sekä peptidisidoksen ominaisuuksien perusteella. Niiden kemialliset muutokset ovat suurelta osin samanlaisia ​​kuin vastaavat aminohappojen reaktiot. Ne antavat positiivisen biureettireaktion ja ninhydriinireaktion. Dipeptidit ja niiden johdannaiset (erityisesti esterit) syklisoituvat helposti ja muuttuvat diketopiperatsiineiksi. 5,7 normaalin suolahapon vaikutuksesta peptidit hydrolysoituvat aminohapoiksi 24 tunnin kuluessa 105 0 C:ssa.

Peptidien synteesi

Peptidisynteesissä käytetään orgaanisesta kemiasta tunnettuja reaktioita amidien valmistukseen ja erityisesti kehitettyjä peptidien synteesiin liittyviä menetelmiä. Näiden synteesien onnistuneen toteuttamisen kannalta on välttämätöntä aktivoida karboksyyliryhmä, so. lisäävät karbonyylihiilen elektrofiilisyyttä. Tämä saavutetaan kemiallisesti modifioimalla aminohappojen karboksyyliryhmää. Tällaisen muunnelman tyyppi määrittää tavallisesti peptidisynteesimenetelmän nimen.

1. Kloridimenetelmä.

Menetelmä perustuu amidien saamisen reaktioon happokloridien vuorovaikutuksella vastaavien amiinien kanssa. Tällä tavalla saatiin ensimmäiset peptidit. Tällä hetkellä tätä menetelmää käytetään erittäin harvoin, koska siihen liittyy sivutuotteiden muodostuminen ja peptidien rasemisoituminen.

2. Azidimenetelmä

Tämän menetelmän lähtöaineena on useimmiten N-suojatun aminohapon etyyliesteri, josta saadaan hydratsidia, joka muunnetaan natriumnitriitillä kloorivetyhapon läsnä ollessa happoatsidiksi. Hydratsiinia käytetään yleensä reaktiossa, jossa yksi typestä on suojattu suojaryhmällä (Z-karbobenoksi- tai karbotretbutyylioksiryhmä), mikä mahdollistaa sivudihydratsidien muodostumisen välttämisen. Atsidit ovat vuorovaikutuksessa C-suojattujen aminohappojen kanssa miedoissa olosuhteissa muodostaen peptidejä.

Rasemisoituminen tässä menetelmässä on minimoitu, mutta sivureaktioita voi tapahtua, nimittäin: atsidit voivat järjestyä uudelleen isosyanaateiksi, jotka vuorostaan ​​muodostavat uretaaneja vuorovaikutuksessa liuottimena käytetyn alkoholin kanssa.

3. Sekahappoanhydridit

Sekoitettuja aminohappoanhydridejä hiilihappojohdannaisten kanssa, jotka on saatu esimerkiksi käyttämällä isobutyylikloorikarbonaattia, on löydetty laaja käyttö peptidisynteesissä:

Reaktio tässä synteesissä suoritetaan alhaisessa lämpötilassa (-10...-20 C), melko nopeasti, mikä vähentää merkittävästi sivutuotteiden muodostumisen ja rasemisoitumisen mahdollisuutta. Peptidien nopeaa vaiheittaista synteesiä sekaanhydrideillä kutsutaan REMA-synteesiksi. Sekaanhydridejä käyttäviä muodostusmenetelmiä käytetään laajalti peptidien kiinteäfaasisynteesissä.

Siten peptidisynteesin suorittaminen vaatii tiettyjen tekijöiden huomioon ottamista ja tiukkaa noudattamista. Joten sivutuotteiden muodostumisen ja rasemisoitumisen vähentämiseksi suositellaan seuraavia tyypillisiä olosuhteita peptidisidoksen muodostumisen reaktiolle:

1) prosessi on suoritettava matalissa lämpötiloissa, reaktioajan on oltava minimaalinen;

2) reaktiomassan pH:n tulee olla lähellä neutraalia;

3) orgaanisia emäksiä, kuten piperidiiniä, morfoliinia jne. käytetään happoa sitovina reagensseina;

4) reaktion suorittaminen on toivottavaa vedettömässä väliaineessa.

Kiinteän faasin synteesi

Kiinteäfaasisynteesi - menetelmällinen lähestymistapa oligomeerien (polymeerien) synteesiin käyttämällä kiinteää liukenematonta harjoittaja, joka on orgaaninen tai epäorgaaninen polymeeri.

1960-luvun alussa ehdotettiin uutta lähestymistapaa peptidisynteesin eristys- ja puhdistusongelmien ratkaisemiseksi. Myöhemmin tämän lähestymistavan keksijä R.B. Merrifield kuvaili Nobel-luentossaan, kuinka tämä tapahtui: ”Eräänä päivänä minulla oli ajatus siitä, kuinka tehokkaamman peptidisynteesin tavoite voitaisiin saavuttaa. Suunnitelmana oli koota peptidiketju vaiheittain siten, että ketjun toinen pää oli kiinnitetty kiinteään kantajaan synteesin aikana. Tämän seurauksena välituote- ja kohdepeptidijohdannaisten eristäminen ja puhdistaminen väheni yksinkertaiseksi suodatukseksi ja kiinteän polymeerin perusteelliseen pesuun kaikkien liuokseen jääneiden ylimääräisten reagenssien ja sivutuotteiden poistamiseksi. Tällainen mekaaninen toimenpide voidaan suorittaa kvantitatiivisesti, helposti standardisoida ja jopa automatisoida. Tarkastellaan tätä menettelyä yksityiskohtaisemmin.

KIINTEÄVAIHEEN SYNTEESI,

menetelmällinen lähestymistapa oligo(polymeeri)meerien synteesiin käyttämällä kiinteää liukenematonta kantajaa (N.), joka on org. tai inorg. polymeeri. Toisin sanoen se perustuu siihen tosiasiaan, että tulevan oligomeerin ensimmäinen lenkki on kovalenttisesti kiinnittynyt "ankkuri"ryhmään H., ketjun pidennys suoritetaan standardisuojatuilla monomeereilla liuoksissa synteesiin käytettyjen tavallisten kaavioiden mukaisesti. Lopuksi. synteesivaihe. oligomeeri lohkaistaan ​​N:sta ja puhdistetaan sopivilla menetelmillä. T. s. käytetään pääasiassa polypeptidien, oligonukleotidien ja oligosakkaridien saamiseksi.

Polypeptidien synteesin aikana N. naib. styreenin ja 1-2 % divinyylibentseenin kopolymeeriä käytetään laajalti, modifioituna lisäämällä dimetoksibentsyylikloridi-ankkuriryhmä ensimmäisen (suojatun NH2-ryhmän kanssa) kiinnittämiseksi C-päähän, esimerkiksi:

N-suojaryhmän poistamisen jälkeen polypeptidiketjun pidentäminen suoritetaan tavanomaisilla peptidisynteesin menetelmillä liuoksessa (katso. peptidit). Kondensointiaineina Naib. usein käyttää tai esimuuntaa aminohappoja aktivaattoriksi. eetterit.

Oligonukleotidien synteesissä makrohuokoisia laseja tai niitä käytetään N.. Ankkuriryhmä on karboksyyliryhmä, joka on erotettu N. spec. "jalka", esimerkiksi:

B-puriini- tai pyrimidiemäs

Ensimmäisessä vaiheessa nukleosidi kiinnittyy kantajaan deoksiriboosin 3"-hydroksyyliryhmästä, jossa asemassa 5 oleva hydroksyyliryhmä on suojattu dimetoksitrityyliryhmällä (CH3OS6H4)2(C6H). 5) C (DMTr); jälkimmäisen määrä sen halkeamisen jälkeen on helppo mitata spektrofotometrisesti, mikä toimii suurena. kantajan kuormitukselle ominaista ja antaa sinun arvioida saantoja oligonukleotidiketjun rakentamisen myöhemmissä vaiheissa. DMTr-ryhmän poistamisen jälkeen ketju kootaan käyttämällä fosfitamideja (muoto I; M. Kaposers, 1980) tai fosfonaatteja (hydrofosfonaatteja) (II; R. Stremberg, 1986):

T:n toteuttamiseen. korkeita saantoja (tasolla 96-99 %) tarvitaan piirin jokaisessa vaiheessa, samoin kuin tehokkaita menetelmiä syntetisaattoreiden puhdistamiseen ja eristämiseen. yhteyksiä.

Kiinteän faasin käyttö mahdollistaa oligomeerin ketjun kasvun kutakin vaihetta merkittävästi yksinkertaistamisen ja nopeuttamisen, koska ylimääräisten komponenttien, kondensaatioaineiden ja sivutuotteiden erottaminen liuoksessa saadaan aikaan suodattamalla reaktiot. seokset ja pesu N. sopivalla liuossarjalla. Siten oligomeeriketjun kokoamisprosessi jakautuu useisiin vakiotoimintoihin: ketjun kasvavan pään poistaminen, seuraavan suojatun monomeerin ja kondensointiaineen annostelu, tämän seoksen syöttäminen N.-kolonniin lasketun ajan ja pesu. ulos N. sopivalla liuottimella. Monomeerisen linkin rakentamisen sykli m. b. automatisoitu.

Automaattien ytimessä tanssiaiset. syntetisaattorit on yleinen piirikaavio (katso kuva). Lukuisia Syntetisaattorimallit eroavat pylväiden suunnittelusta ja lukumäärästä, reagenssien ja liuottimien syöttötavoista jne. Ohjaus ja ohjelmointi suoritetaan sisäänrakennetulla tai etätietokoneella.

Automaattisen laitteen kaavio. tanssiaiset. syntetisaattorit (sähköinen ohjausviiva on merkitty katkoviivalla): 1 - monomeerin syöttöjohto (M 1, M n) ja kondensointiaine (CA); 2-linjainen reagenssien (esim. hapettimet, asylointiaineet, to-t jne.) ja p-liuottimien (P 1, P) syöttämiseen n); 3 - kytkentäventtiilit; 4-kolonni, jossa on media, varustettu jakelulla. venttiili; 5-fotometrinen solu; 6 metriä; 7-ohjaus- ja ohjelmointiyksikkö; 8-näyttö.

T.e.:n potentiaaliset mahdollisuudet osoitettiin A:n (R. Merrifield, 1969) ja ihmisen kasvuhormonin (D. Yamashiro, 1970) synteesillä, joiden pituus on vastaavasti 124 ja 183 aminohappoa. Kuitenkin johtuen pienestä mutta jatkuvasta rasemisaatiosta, joka tapahtuu peptidisidoksen muodostumisen aikana, syntetisaattori. niillä on alhainen biol. toimintaa, niin automaattista. syntetisaattoreita käyttää Ch. arr. lyhyiden polypeptidien (10-30 linkkiä) saamiseksi, mukaan lukien preparatiivista proteiinisynteesiä varten (1 g).

Toisin sanoen Merrifield (1962) ehdotti ja toteutti käytännössä polypeptidien synteesiä ja laajennettiin sitten oligonukleotidien (R. Letzinger, 1964) ja oligosakkaridien (A. Patchornik, 1973) synteesiin.

On toinen tärkeä näkökohta N:n käytössä pl. org. p-tiot (, halogenointi jne.). Tässä tapauksessa muokattu N. toimii polymeerisenä reagenssina tai katalyyttinä, ja kaikki substraatin muutokset tapahtuvat liuoksessa. Esimerkiksi ROP(O)(OH)2-fosfaattien p-tio alkoholeilla suoritetaan käyttämällä kondensointiaineena silloitettua polystyreeniä, joka on modifioitu sulfokloridiryhmällä.

Lit.: Polypeptidien kemia, trans. Englannista, M., 1977; Polynerin tukemat reaktiot orgaanisessa synteesissä, toim. Kirjailija: P. Hodge, D.C. Sherrington, Chichester, 1980; Oligonukleotidisynteesi, käytännön lähestymistapa. Pesu, 1984. B.K. Potapov.

Kemiallinen tietosanakirja. - M.: Neuvostoliiton tietosanakirja. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .

Katso, mitä "SOLID-PHASE SYNTHESIS" on muissa sanakirjoissa:

kiinteäfaasisynteesi- Kombinatorinen kemiallinen tekniikka erilaisten yhdisteiden synteesiin, jossa käytetään kiinteitä kantajia yhdisteiden erottamiseen synteesin aikana, mikä yksinkertaistaa tuloksena olevien yhdisteiden tunnistamista)