Korkean suorituskyvyn nestekromatografiassa (HPLC) kromatografiapylväässä tapahtuvien prosessien luonne on yleensä identtinen kaasukromatografian prosessien kanssa. Ainoa ero on nesteen käytössä kiinteänä faasina. Nestemäisten liikkuvien faasien suuren tiheyden ja kolonnien suuren resistanssin vuoksi kaasu- ja nestekromatografia eroaa suuresti instrumentoinnin suhteen.

HPLC:ssä liikkuvina faaseina käytetään yleensä puhtaita liuottimia tai niiden seoksia.

Puhtaan liuotinvirran (tai liuotinseosten), jota kutsutaan nestekromatografiassa eluentiksi, luomiseksi käytetään kromatografin hydraulijärjestelmään kuuluvia pumppuja.

Adsorptiokromatografia suoritetaan aineen vuorovaikutuksen seurauksena adsorbenttien, kuten silikageelin tai alumiinioksidin, kanssa, joiden pinnalla on aktiiviset keskukset. Ero kyvyssä olla vuorovaikutuksessa eri näytemolekyylien adsorptiokeskusten kanssa johtaa niiden erottumiseen vyöhykkeiksi liikkuessaan liikkuvan faasin kanssa kolonnia pitkin. Tässä tapauksessa saavutettu komponenttien vyöhykeerotus riippuu vuorovaikutuksesta sekä liuottimen että adsorbentin kanssa.

HPLC:ssä yleisimmin käytettyjä ovat silikageeliadsorbentit, joilla on erilaiset tilavuudet, pinta-alat ja huokoshalkaisijat. Alumiinioksidia ja muita adsorbentteja käytetään paljon harvemmin. Tärkein syy tähän:

Riittämätön mekaaninen lujuus, joka ei salli pakkaamista ja käyttöä HPLC:lle ominaisissa korkeissa paineissa;

silikageelillä on alumiinioksidiin verrattuna laajempi huokoisuus, pinta-ala ja huokoshalkaisija; Alumiinioksidin huomattavasti suurempi katalyyttinen aktiivisuus johtaa analyysitulosten vääristymiseen, joka johtuu näytekomponenttien hajoamisesta tai niiden peruuttamattomasta kemisorptiosta.

Ilmaisimet HPLC:tä varten

Korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) käytetään sellaisten polaaristen haihtumattomien aineiden havaitsemiseen, joita ei jostain syystä voida muuttaa kaasukromatografiaan sopivaan muotoon edes johdannaisina. Tällaisia ​​aineita ovat erityisesti sulfonihapot, vesiliukoiset väriaineet ja eräät tuholaismyrkyt, esimerkiksi fenyyliureajohdannaiset.

Ilmaisimet:

UV-ilmaisin diodimatriisilla. Fotodiodien "matriisi" (yli kaksisataa) rekisteröi jatkuvasti signaaleja spektrin UV- ja näkyvällä alueella, mikä mahdollistaa UV-B-spektrien tallentamisen pyyhkäisytilassa. Tämän avulla voit tallentaa jatkuvasti korkealla herkkyydellä vääristymättömiä spektrejä komponenteista, jotka kulkevat nopeasti erityisen solun läpi.

Verrattuna yhden aallonpituuden ilmaisuun, joka ei anna tietoa huippupuhtaudesta, kyky verrata diodiryhmän kaikkia spektrejä tarjoaa paljon suuremman luotettavuuden tunnistustulokseen.

Fluoresenssidetektori. Fluoresoivien ilmaisimien suuri suosio johtuu niiden erittäin korkeasta selektiivisyydestä ja herkkyydestä sekä siitä, että monet ympäristön epäpuhtaudet fluoresoivat (esim. polyaromaattiset hiilivedyt).

Sähkökemiallista ilmaisinta käytetään helposti hapettuvien tai pelkistyvien aineiden havaitsemiseen: fenolit, merkaptaanit, amiinit, aromaattiset nitro- ja halogeenijohdannaiset, aldehydit, ketonit, bentsidiinit.

Seoksen kromatografinen erottaminen kolonnilla PF:n hitaasta etenemisestä johtuen vie paljon aikaa. Prosessin nopeuttamiseksi kromatografia suoritetaan paineen alaisena. Tätä menetelmää kutsutaan korkean suorituskyvyn nestekromatografiaksi (HPLC).

Klassisessa nestepylväskromatografiassa käytettyjen laitteiden modernisointi on tehnyt siitä yhden lupaavimmista ja nykyaikaisimmista analyysimenetelmistä. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia on kätevä menetelmä haihtumattomien lämpölabiilien yhdisteiden, joilla on sekä pieni että suuri molekyylipaino, erottamiseen, preparatiiviseen eristämiseen sekä kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analyysiin.

Käytetyn sorbentin tyypistä riippuen tässä menetelmässä käytetään kahta kromatografiavaihtoehtoa: polaarisessa sorbentissa, jossa käytetään ei-polaarista eluenttia (suorafaasivaihtoehto) ja ei-polaarisessa sorbentissa, jossa käytetään polaarista eluenttia - niin kutsuttua käänteisfaasikorkeaa eluenttia. - suorituskykyinen nestekromatografia (RPHPLC).

Eluentista eluenttiin siirtymisen aikana tasapaino HPLC-olosuhteissa vakiintuu monta kertaa nopeammin kuin polaaristen sorbenttien ja ei-vesipitoisten PF:iden olosuhteissa. Tämän sekä vesipitoisten ja vesipitoisten alkoholien eluenttien kanssa työskentelyn mukavuuden seurauksena OFVLC on nyt saavuttanut suuren suosion. Useimmat HPLC-analyysit suoritetaan tällä menetelmällä.

Ilmaisimet. Yksittäisen komponentin ulostulo kolonnista tallennetaan ilmaisimen avulla. Rekisteröintiin voit käyttää muutosta missä tahansa liikkuvasta faasista tulevassa analyyttisessä signaalissa, joka liittyy seoskomponentin luonteeseen ja määrään. Nestekromatografiassa käytetään analyyttisiä signaaleja, kuten lähtöliuoksen valon absorptio tai valoemissio (fotometriset ja fluorimetriset ilmaisimet), taitekerroin (refraktometriset ilmaisimet), potentiaali ja sähkönjohtavuus (sähkökemialliset ilmaisimet) jne.

Jatkuvasti havaittu signaali tallennetaan tallentimella. Kromatogrammi on nauhalle tallennettujen detektorisignaalien sarja, joka syntyy, kun seoksen yksittäiset komponentit poistuvat kolonnista. Jos seos erotetaan, yksittäiset piikit näkyvät ulkoisessa kromatogrammissa. Piikin sijaintia kromatogrammissa käytetään aineen tunnistamiseen, piikin korkeus tai pinta-ala - kvantitatiivista määritystä varten.

Sovellus

HPLC:tä käytetään laajimmin seuraavilla kemiallisen analyysin alueilla (korostetaan analyysikohteet, joissa HPLC:llä ei käytännössä ole kilpailua):

· Elintarvikkeiden laadunvalvonta - tonics ja aromilisäaineet, aldehydit, ketonit, vitamiinit, sokerit, väriaineet, säilöntäaineet, hormonaaliset lääkkeet, antibiootit, triatsiini, karbamaatti ja muut torjunta-aineet, mykotoksiinit, nitrosamiinit, polysykliset aromaattiset hiilivedyt jne.

· Ympäristönsuojelu - fenolit, orgaaniset nitroyhdisteet, mono- ja polysykliset aromaattiset hiilivedyt, monet torjunta-aineet, pääanionit ja kationit.

· Oikeuslääketiede – huumeet, orgaaniset räjähteet ja väriaineet, voimakkaat lääkkeet.

· Lääketeollisuus - steroidihormonit, lähes kaikki orgaanisen synteesin tuotteet, antibiootit, polymeerivalmisteet, vitamiinit, proteiinivalmisteet.

· Lääketiede - luetellut biokemialliset ja lääkeaineet ja niiden aineenvaihduntatuotteet biologisissa nesteissä (aminohapot, puriinit ja pyrimidiinit, steroidihormonit, lipidit) sairauksien diagnosoinnissa, lääkkeiden elimistöstä poistumisnopeuden määrittämisessä niiden yksilöllisen annostuksen mukaisesti.

· Maatalous - nitraattien ja fosfaattien määrittäminen maaperässä tarvittavan lannoitemäärän määrittämiseksi, rehun ravintoarvon (aminohapot ja vitamiinit) määritys, torjunta-aineiden analysointi maaperässä, vedessä ja maataloustuotteissa.

· Biokemia, bioorgaaninen kemia, geenitekniikka, bioteknologia - sokerit, lipidit, steroidit, proteiinit, aminohapot, nukleosidit ja niiden johdannaiset, vitamiinit, peptidit, oligonukleotidit, porfyriinit jne.

· Orgaaninen kemia - kaikki vakaat orgaanisen synteesin tuotteet, väriaineet, lämpölabiilit yhdisteet, haihtumattomat yhdisteet; epäorgaaninen kemia (melkein kaikki liukoiset yhdisteet ionien ja kompleksisten yhdisteiden muodossa).

· elintarvikkeiden, alkoholipitoisten ja alkoholittomien juomien, juomaveden, kotitalouskemikaalien, hajuvesien laadun ja turvallisuuden valvonta niiden kaikissa tuotantovaiheissa;

· pilaantumisen luonteen määrittäminen ihmisen aiheuttaman katastrofin tai hätätilanteessa;

· huumausaineiden, voimakkaiden, myrkyllisten ja räjähtävien aineiden havaitseminen ja analysointi;

· haitallisten aineiden (polysykliset ja muut aromaattiset hiilivedyt, fenolit, torjunta-aineet, orgaaniset väriaineet, raskas-, alkali- ja maa-alkalimetalli-ionit) esiintymisen määrittäminen nestemäisistä jätevesistä, ilmapäästöistä ja kiinteistä jätteistä yrityksistä ja elävistä organismeista;

· orgaanisen synteesin, öljyn ja hiilen jalostuksen sekä biokemiallisen ja mikrobiologisen tuotannon prosessien seuranta;

maaperän laadun analyysi lannoitusta varten, torjunta-aineiden ja rikkakasvien torjunta-aineiden esiintyminen maaperässä, vedessä ja tuotteissa sekä rehujen ravintoarvo; monimutkaiset tutkimuksen analyyttiset tehtävät; ultrapuhtaiden aineiden mikromäärien saaminen.



Johdanto.

Nestekromatografian nopea kehitys viimeisen 10 vuoden aikana johtuu pääasiassa teoreettisten perusteiden intensiivisestä kehittämisestä ja sen erittäin tehokkaan version käytännön käytöstä sekä tarvittavien sorbenttien ja laitteiden luomisesta ja teollisesta tuotannosta.

Erityinen korkean erotuskyvyn nestekromatografian (HPLC) piirre on sorbenttien käyttö, joiden raekoko on 3-10 mikronia, mikä varmistaa nopean massansiirron erittäin korkealla erotustehokkuudella.

Tällä hetkellä HPLC on noussut ensimmäiseksi instrumentaalisten menetelmien joukossa kehitysnopeuksilla mitattuna, jopa kaasukromatografian ohittaen. HPLC:n tärkein etu kaasukromatografiaan verrattuna on kyky tutkia lähes mitä tahansa esinettä ilman rajoituksia niiden fysikaalis-kemiallisille ominaisuuksille, esimerkiksi kiehumispisteille tai molekyylipainolle.

Nykyään HPLC on hyvin suunniteltu instrumentaalinen menetelmä, jota käytetään laajasti monilla tieteen ja teknologian aloilla. Sen merkitys on erityisen suuri sellaisilla kriittisillä aloilla kuin biokemia, molekyylibiologia, ympäristön pilaantumisen valvonta sekä kemian-, petrokemian-, elintarvike- ja lääketeollisuudessa.

koska on tarpeen ottaa huomioon useita hyvin erityisiä vaatimuksia menetelmän seuraavista ominaisuuksista johtuen.

A. HPLC-kolonnit on pakattu hyvin pienten hiukkasten halkaisijalla olevilla väliaineilla. Tämän seurauksena kolonniin muodostuu korkea paine sellaisilla liuottimen tilavuusnopeuksilla, jotka ovat tarpeen nopean näytteen erottamisen kannalta.

b. HPLC:ssä käytetyt ilmaisimet ovat herkkiä eluentin virtauksen ja paineen vaihteluille (kohina). Lisäksi pitoisuusilmaisimia käytettäessä vaaditaan vielä suurempaa eluentin tilavuusnopeuden stabiilisuutta.

V. Kromatografiseen erotusprosessiin liittyy useita antagonistisia vaikutuksia, esimerkiksi näytteen dispergoituminen liikkuvaan faasiin johtaa erotettujen komponenttien sekoittumiseen ja vähentää aineen maksimipitoisuutta eluoidussa huipussa (detektorissa). Dispersio havaitaan järjestelmän kaikilla alueilla näytteen injektiopisteestä detektoriin.

d. Liuottimet, jotka toimivat liikkuvana faasina, voivat usein aiheuttaa laitteiden korroosiota. Tämä koskee ensisijaisesti liuottimia, joita käytetään käänteisfaasikromatografiassa, joka on edullinen biokemiallisissa HPLC-sovelluksissa.

HPLC:n erityispiirteet instrumentaalisena tekniikkana on otettava huomioon näiden järjestelmien kehittämisessä, luomisessa ja käytössä. Kesti yli kymmenen vuotta etsintää ja tutkimusta luoda kaupallisia näytteitä kromatografisista järjestelmistä ja niiden komponenteista, jotka ovat riittävän luotettavia, yksinkertaisia ​​ja turvallisia toimiakseen hyväksyttävällä hinnan ja teknisten ominaisuuksien suhteella. Viimeaikaiset suuntaukset pilareiden (sekä pituuden että halkaisijan) pienentämiseen asettavat instrumenteille uusia vaatimuksia.

1.1. TEHOKKUUSJAVALIKOISUUS

Kromatografia on menetelmä seoksen komponenttien erottamiseksi niiden tasapainojakauman eron perusteella kahden "sekoittumattoman faasin välillä, joista toinen on kiinteä ja toinen liikkuva. Näytteen komponentit liikkuvat kolonnia pitkin, kun ne ovat liikkuvassa faasissa, ja pysyvät paikallaan ollessaan paikallaan, mitä suurempi komponentin affiniteetti on kiinteään faasiin ja mitä pienempi liikkuvaan faasiin, sitä hitaammin se liikkuu kolonnin läpi ja sitä kauemmin se pysyy siinä. Seoksen komponenttien affiniteetin eron vuoksi kiinteään ja liikkuvaan faasiin saavutetaan kromatografian päätavoite - seoksen hyväksyttävä aikajakso komponenttien yksittäisiksi vyöhykkeiksi (huippuiksi) niiden liikkuessa pitkin kolonnia liikkuvan faasin kanssa.

Näistä yleisistä käsitteistä on selvää, että kromatografinen erotus on mahdollista vain, jos näytteen komponentit, jotka tulevat kolonniin näytettä syötettäessä, ensinnäkin liukenevat liikkuvaan faasiin ja toiseksi ovat vuorovaikutuksessa (säilyttyvät) stationaarifaasin kanssa. . Jos näytettä vietäessä jotkin komponentit eivät ole liuoksen muodossa, ne suodatetaan, eivätkä ne osallistu kromatografiseen prosessiin. Samoin komponentit, jotka eivät ole vuorovaikutuksessa stationaarifaasin kanssa, kulkevat kolonnin läpi liikkuvan faasin kanssa erottumatta komponenteiksi.

Hyväksytään ehto, että jotkut kaksi komponenttia liukenevat liikkuvaan faasiin ja ovat vuorovaikutuksessa stationaarifaasin kanssa, eli kroiatografinen prosessi voi edetä ilman häiriöitä. Tässä tapauksessa voit saada muodon kromatogrammit sen jälkeen, kun seos on johdettu kolonnin läpi a, b tai V(Kuva 1.1). Nämä kromatogrammit havainnollistavat kromatografisia erotuksia, joiden tehokkuus eroaa (A ja b) samalla selektiivisyydellä ja selektiivisyydellä (b Ja V) yhtä tehokkaasti.

Mitä kapeampi piikki saadaan samalla retentioajalla, sitä suurempi on kolonnin tehokkuus. Kolonnin tehokkuus mitataan teoreettisten levyjen lukumäärällä (NPT) N: sitä suurempi tehokkuus

Riisi. 1.2. Kromatografiset huippuparametrit ja teoreettisten levyjen lukumäärän laskeminen:

t R - huippuretentioaika; h - huipun korkeus; Wj/j - piikin leveys puolessa korkeudesta

Riisi. 1.1. Kromatogrammin tyyppi kolonnin tehokkuudesta ja selektiivisyydestä riippuen:

A- normaali selektiivisyys, alentunut hyötysuhde (vähemmän teoreettisia levyjä); b - tavallinen selektiivisyys ja tehokkuus; V - normaali tehokkuus, lisääntynyt selektiivisyys (korkeampi komponenttien retentioaikojen suhde)

tehokkuus, mitä suurempi FTT, sitä pienempi alun perin kapea kaistan huippu levenee sen kulkiessa kolonnin läpi, ja sitä kapeampi huippu on kolonnin ulostulossa. PTT luonnehtii vaiheiden lukumäärää tasapainon luomisessa liikkuvan ja kiinteän vaiheen välille.

Tietäen teoreettisten levyjen lukumäärä kolonnia kohti ja kolonnin pituus L (µm) sekä sorbentin keskimääräinen rakeiden halkaisija DC (µm), on helppo saada teoreettista levyä vastaavan korkeuden (HETT) arvot sekä teoreettista levyä vastaavan pienennetyn korkeuden arvot (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT = B3TT/d c.

FTT-, HETT- ja PHETT-arvojen avulla voidaan helposti verrata erityyppisten, eripituisten, erityyppisillä ja eri rakeisilla sorbenteilla täytettyjen kolonnien tehokkuutta. Vertaamalla kahden samanpituisen sarakkeen PTT:tä verrataan niiden tehokkuutta. HETP:tä verrattaessa verrataan kolonneja, joissa on saman raekoon ja eripituisia sorbentteja. Lopuksi PVETT-arvo sallii minkä tahansa kahden kolonnin arvioida sorbentin laatua, ensinnäkin, pylväiden täytön laatua, ja toiseksi, kolonnin pituudesta riippumatta, sorbenttien luonteeltaan rakeisuutta.

Kolonnin selektiivisyydellä on suuri merkitys kromatografisen erotuksen saavuttamisessa.

Kolonnin selektiivisyys riippuu monista tekijöistä, ja kokeen tekijän taidot määräytyy suurelta osin kyvystä vaikuttaa erottelun selektiivisyyteen. Tätä varten kromatografin käsissä on kolme erittäin tärkeää tekijää: sorbentin kemiallisen luonteen valinta, liuottimen ja sen modifiointiaineiden koostumuksen valinta sekä erotettujen komponenttien kemiallisen rakenteen ja ominaisuuksien huomioon ottaminen. . Joskus kolonnin lämpötilan muutoksella, joka muuttaa aineiden jakautumiskertoimia liikkuvan ja kiinteän faasin välillä, on huomattava vaikutus selektiivisyyteen.

Kun tarkastellaan ja arvioidaan kahden komponentin erottamista kromatogrammissa, resoluutio on tärkeä parametri. R s, joka liittyy molempien erotettujen komponenttien lähtöaikaan ja huipun leveyteen

Resoluutio piikkien erotusta karakterisoivana parametrina kasvaa selektiivisyyden kasvaessa, mikä näkyy osoittajan kasvuna, ja tehokkuus kasvaa, mikä heijastuu nimittäjäarvon pienenemisenä piikien leveyden pienenemisen vuoksi. Siksi nestekromatografian nopea edistyminen johti muutokseen "korkean paineen nestekromatografian" käsitteessä - se korvattiin "korkean resoluution nestekromatografialla" (samalla kun termin lyhennetty muoto englannin kielellä säilyi HPLC oikein kuvaavana nykyaikaisen nestekromatografian kehityssuuntaa).

Siten kolonnin huuhtoutuminen vähenee ja tehokkuus lisääntyy, kun käytetään hienompaa sorbenttia, joka on koostumukseltaan tasaisempaa (kapea fraktio), tiheämmin ja tasaisemmin pakattuna kolonniin, käyttämällä ohuempia oksasfaasikerroksia, vähemmän viskoosia liuottimia ja optimaalisia virtausnopeuksia.

Kuitenkin kromatografisen vyöhykkeen nauhan hämärtymisen kanssa erotusprosessin aikana kolonnissa se voidaan huuhdella pois myös näytteen sisäänsyöttölaitteessa, yhdistävissä kapillaareissa injektori - kolonni ja kolonni - detektori, detektorisolussa ja joissakin apulaitteissa (mikrosuodattimet mekaanisten hiukkasten vangitsemiseen injektorin jälkeen asennetuista näytteistä, esikolonnit, kelareaktorit jne.) - Mitä suurempi kolonnin ulkopuolinen tilavuus verrattuna piikin säilytettyyn tilavuuteen, sitä suurempi eroosio. Sillä on myös merkitystä, missä kuollut tilavuus sijaitsee: mitä kapeampi kromatografinen signaali on, sitä enemmän kuollut tilavuus hämärtyy. Siksi erityistä huomiota tulee kiinnittää sen kromatografin osan suunnitteluun, jossa kromatografinen vyöhyke on kapein (injektori ja laitteet injektorista kolonniin) - tässä kolonnin ulkopuolinen eroosio on vaarallisinta ja sillä on suurin vaikutus. Vaikka uskotaan, että hyvin suunnitelluissa kromatografeissa lisäkolonnin ulkopuolisen laimentamisen lähteet tulisi vähentää minimiin, jokaisen uuden laitteen, jokaisen kromatografin muunnelman on kuitenkin välttämättä päätyttävä testaukseen kolonnilla ja tuloksena olevan kromatogrammin vertailuun. passin kanssa. Jos havaitaan huippusäröä tai jyrkkää tehokkuuden laskua, kapillaarit ja muut järjestelmään äskettäin lisätyt laitteet on tarkastettava huolellisesti.

Kolonnin ulkopuolinen huuhtelu ja sen virhearviointi voivat johtaa merkittävään (yli 50 %) tehokkuuden heikkenemiseen, erityisesti tapauksissa, joissa suhteellisen vanhoja kromatografeja yritetään käyttää nopeaan HPLC:hen, mikrokolonni-HPLC:hen ja muihin nykyaikaisen HPLC:n muunnelmiin, jotka vaativat mikroinjektorit, liitäntäkapillaarit, joiden sisähalkaisija on vähintään 0,05-0,15 mm, kolonnit, joiden tilavuus on 10-1000 µl, detektorit mikrokyvetillä, joiden tilavuus on 0,03-1 µl ja joissa on nopeat, nopeat tallentimet ja integraattorit .

1.2. LIUOTTEEN PITO JA VAHVUUS

Jotta analyytit erottuvat kolonnista, kuten edellä mainittiin, kapasiteettikerroin k" on oltava suurempi kuin 0, eli aineet on pidätettävä stationaarifaasissa, sorbentissa. Kapasiteettikertoimen ei kuitenkaan pitäisi olla liian korkea hyväksyttävän eluointiajan saavuttamiseksi. Jos tietylle aineseokselle valitaan kiinteä faasi, joka säilyttää ne, niin jatkotyö analyysitekniikan kehittämiseksi koostuu sellaisen liuottimen valinnasta, joka olisi ihanteellisesti erilainen kaikille komponenteille, mutta hyväksyttävästi ei kovin suuri. k". Tämä saavutetaan muuttamalla liuottimen eluointivoimakkuutta.

Kun kyseessä on adsorptiokromatografia silikageelillä tai alumiinioksidilla, kaksikomponenttisen liuottimen (esimerkiksi heksaanin, johon on lisätty isopropanolia) vahvuutta lisätään yleensä lisäämällä polaarisen komponentin (isopropanolin) pitoisuutta, tai vähennetään vähentämällä isopropanolipitoisuutta. Jos sisältävä polaarinen komponentti tulee liian pieneksi (alle 0,1 %), se tulee vaihtaa heikompaan eluointivoimaan. Sama tehdään korvaamalla joko polaarinen tai ei-polaarinen komponentti muilla, vaikka tämä järjestelmä ei tarjoa haluttua selektiivisyyttä seoksen kiinnostavien komponenttien suhteen. Liuotinjärjestelmiä valittaessa huomioidaan sekä seoksen komponenttien liukoisuus että eri tekijöiden kokoamat eluotrooppiset liuotinsarjat.

Liuottimen vahvuus valitaan suunnilleen samalla tavalla käytettäessä oksastettuja polaarisia faaseja (nitriili, amino, dioli, nitro jne.) huomioiden mahdolliset kemialliset reaktiot ja jättäen pois faasille vaaralliset liuottimet (esim. aminofaasi).

Käänteisfaasikromatografian tapauksessa liuotinvahvuutta lisätään lisäämällä orgaanisen komponentin pitoisuutta eluentissa (metanoli, asetonitriili tai THF) ja vähennetään lisäämällä vettä. Jos haluttua selektiivisyyttä ei ole mahdollista saavuttaa, käytetään toista orgaanista komponenttia tai yritetään muuttaa sitä erilaisilla lisäaineilla (hapot, ioniparireagenssit jne.).

Erotuksissa ioninvaihtokromatografialla liuottimen vahvuutta muutetaan lisäämällä tai alentamalla puskuriliuoksen pitoisuutta tai muuttamalla pH:ta joissain tapauksissa modifiointia orgaanisilla aineilla.

Etenkin monimutkaisten luonnollisten ja biologisten seosten tapauksessa ei kuitenkaan usein ole mahdollista valita liuottimen vahvuutta siten, että kaikki näytteen komponentit eluoituvat hyväksyttävässä ajassa. Sitten on turvauduttava gradienttieluointiin eli liuottimeen, jonka eluointivoimakkuus muuttuu analyysiprosessin aikana niin, että se kasvaa jatkuvasti ennalta määrätyn ohjelman mukaan. Tämä tekniikka mahdollistaa monimutkaisten seosten kaikkien komponenttien eluoinnin suhteellisen lyhyessä ajassa ja niiden erottamisen komponenteiksi kapeiden piikkien muodossa.

1.3. SORBENTTI HIUKKASKOKO, LÄpäisevyys ja TEHOkkuus

Ottaen huomioon eroosion kolonnissa, osoitimme, että kolonnin tehokkuus (HETT) riippuu sorbenttihiukkasten koosta. HPLC:n nopea kehitys viimeisten 10–12 vuoden aikana johtui suurelta osin ensinnäkin menetelmien kehittämisestä sorbenttien valmistamiseksi, joiden hiukkaskoko on 3–10 mikronia ja joiden fraktiokoostumus on kapea ja jotka tarjoavat korkean hyötysuhteen ja hyvät. läpäisevyys ja toiseksi kehitysmenetelmät kolonnin täyttämiseksi näillä sorbenteilla ja kolmanneksi nestekromatografien kehittäminen ja sarjatuotanto korkeapainepumpuilla, injektoreilla ja detektoreilla, joissa on pienitilavuuksisia kyvettejä, jotka pystyvät tallentamaan pieniä tilavuuksia.

Hyvin pakattuille lietepakatuille kolonneille alennettu ekvivalentti teoreettinen levykorkeus (LPHE) voi olla 2 riippumatta siitä, käytetäänkö pakkaamiseen 3, 5, 10 vai 20 μm:n hiukkasia. Tässä tapauksessa saamme vastaavasti pylväitä (vakiopituus 250 mm), joiden hyötysuhde on 41670, 25000, 12500 ja 6250 t.t. Vaikuttaa luonnolliselta valita tehokkain kolonni, joka on täynnä 3 µm:n hiukkasia. Tämä hyötysuhde tulee kuitenkin erittäin korkean paineen toiminnan ja suhteellisen alhaisen erotusnopeuden kustannuksella, koska olemassa oleva pumppu pystyy mitä todennäköisimmin pumppaamaan liuotinta tällaisen kolonnin läpi suurella tilavuusnopeudella. Tässä on kysymys sorbentin hiukkaskoon, pylväiden tehokkuuden ja läpäisevyyden välisestä suhteesta.

Jos ilmaisemme kolonnin vastuskertoimen tästä - dimensioton suuresta, saamme seuraavan yhtälön:

Resistanssikerroin kolonneille, jotka on pakattu samantyyppisillä mikrohiukkasilla samalla menetelmällä, vaihtelee hieman ja on seuraavat arvot:

Partikkelityyppi "... Epäsäännöllinen pallomainen

lomakkeen muoto

Kuiva pakkaus. . . . . 1000-2000 800-1200

Suspensiopakkaus. . . 700-1500 500-700

Kolonnin tulopaine on verrannollinen lineaariseen virtausnopeuteen, kolonnin vastuskertoimeen, liuottimen viskositeettiin ja kolonnin pituuteen ja kääntäen verrannollinen hiukkasen halkaisijan neliöön.

Soveltamalla tätä suhdetta edellä kuvattuihin kolonniin, joiden hiukkasten halkaisija on 3, 5, 10 ja 20 µm, ja olettamalla vakio lineaarinen virtausnopeus, kolonnin vastustekijä ja liuottimen viskositeetti, saadaan tulopainesuhteeksi 44:16:4:1. samanpituisille sarakkeille. Siten jos käänteisfaasisorbentille, jonka hiukkaskoko on 10 μm käytettäessä metanoliliuotinjärjestelmiä - . vettä (70:30) tavallisesti standardikolonnissa liuottimen virtausnopeudella 1 ml/min, paine kolonnin sisäänkäynnissä on 5 MPa, sitten 5 μm - 20 MPa hiukkasilla ja 3 μm - 55 MPa . Käytettäessä silikageeliä ja vähemmän viskoosia liuotinjärjestelmää, heksaani-isopropanolia (100:2), arvot ovat huomattavasti alhaisemmat: 1, 4 ja 11 MPa, vastaavasti. Jos käänteisfaasisorbentin tapauksessa 3 μm:n hiukkasten käyttö on erittäin ongelmallista, ja 5 μm on mahdollista, mutta ei kaikissa laitteissa, normaalifaasisorbentilla ei ole paineongelmia. On huomattava, että nykyaikainen nopea HPLC käyttää tyypillisesti suurempaa liuottimen virtausnopeutta kuin yllä olevassa esimerkissä, joten painevaatimukset kasvavat entisestään.

Kuitenkin tapauksissa, joissa erotukseen tarvitaan tietty määrä teoreettisia levyjä ja halutaan suorittaa nopeusanalyysi, kuva muuttuu jonkin verran. Koska pylväiden pituudet sorbenteilla, joiden raekoko on 3, 5, 10 mikronia, yhtä tehokkaalla tehokkuudella, ovat vastaavasti 7,5; 12,5 ja 25 cm, jolloin painesuhde kolonnien sisääntulossa muuttuu arvoon 3:2:1. Vastaavasti analyysin kesto tällaisissa samantehoisissa sarakkeissa on suhteessa 0,3:0,5:1, eli siirrettäessä 10:stä 5:een ja 3 mikroniin analyysin kesto lyhenee 2 ja 3,3 kertaa. Tämä nopeampi analyysi maksaa suhteellisesti korkeamman paineen kolonnin sisääntulossa.

Esitetyt tiedot pätevät niihin tapauksiin, joissa eri raekokoisilla sorbenteilla on samat hiukkaskokojakaumakäyrät, kolonnit on pakattu samalla tavalla ja niillä on sama kolonniresistanssi. On pidettävä mielessä, että vaikeus saada sorbentin kapeita fraktioita kasvaa, kun hiukkaskoko pienenee ja se. Eri valmistajien fraktioilla on erilaiset fraktiokoostumukset. Siksi kolonnin vastuskerroin vaihtelee raekoon, sorbenttityypin, kolonnin pakkausmenetelmän jne. mukaan.

HPLC-MENETELMIEN LUOKITUS EROTUSMEKANISMILLA

Suurin osa HPLC:llä suoritettavista erotuksista perustuu aineiden sekoitettuun vuorovaikutusmekanismiin sorbentin kanssa, mikä saa aikaan enemmän tai vähemmän komponenttien pidättymisen kolonnissa. Erotusmekanismit enemmän tai vähemmän puhtaassa muodossa ovat käytännössä melko harvinaisia, esimerkiksi adsorptio käytettäessä täysin vedetöntä silikageeliä ja vedetöntä heksaania aromaattisten hiilivetyjen erottamiseen.

Eri rakenteellisten ja molekyylipainoisten aineiden sekaretentiomekanismin avulla on mahdollista arvioida vaikutus adsorption, jakautumisen, poissulkemisen ja muiden mekanismien säilyttämiseen. HPLC:n erotusmekanismien ymmärtämiseksi ja ymmärtämiseksi on kuitenkin suositeltavaa tarkastella erotuksia, joissa jokin mekanismi on vallitseva, liittyvänä tietyntyyppiseen kromatografiaan, esimerkiksi ioninvaihtokromatografiaan.

2.1.1 ADSORPTIOKROMATOGRAFIA

Erotus adsorptiokromatografialla tapahtuu aineen vuorovaikutuksen seurauksena adsorbenttien, kuten silikageelin tai alumiinioksidin, kanssa, joiden pinnalla on aktiiviset keskukset. Ero kyvyssä olla vuorovaikutuksessa eri näytemolekyylien adsorptiokeskusten kanssa johtaa niiden erottumiseen vyöhykkeiksi liikkuessaan liikkuvan faasin kanssa kolonnia pitkin. Tässä tapauksessa saavutettu komponenttien vyöhykeerotus riippuu vuorovaikutuksesta sekä liuottimen että adsorbentin kanssa.

Sorptio hydroksyyliryhmiä sisältävän adsorbentin pinnalla perustuu spesifiseen vuorovaikutukseen adsorbentin polaarisen pinnan ja polaaristen (tai polarisoituvien) ryhmien tai molekyyliosien välillä. Tällaisia ​​vuorovaikutuksia ovat dipoli-dipoli-vuorovaikutus pysyvien tai indusoitujen dipolien välillä, vetysidoksen muodostuminen r-kompleksien tai varauksensiirtokompleksien muodostumiseen asti. Mahdollinen ja melko yleinen esiintyminen käytännön työssä on kemisorption ilmentymä, joka voi johtaa retentioajan merkittävään pidentymiseen, tehokkuuden jyrkäseen heikkenemiseen, hajoamistuotteiden ilmestymiseen tai aineen palautumattomaan sorptioon.

Aineiden adsorptioisotermeillä on lineaarinen, kupera tai kovera muoto. Lineaarisella adsorptioisotermillä aineen huippu on symmetrinen eikä retentioaika riipu näytteen koosta. Useimmiten aineiden adsorptioisotermit ovat epälineaarisia ja niillä on kupera muoto, mikä johtaa piikin epäsymmetriaan hännän muodostuessa.

HPLC:ssä yleisimmin käytettyjä ovat silikageeliadsorbentit, joilla on erilaiset huokostilavuudet, pinta-alat ja huokoshalkaisijat. Alumiinioksidia käytetään paljon harvemmin ja muita adsorbentteja, joita käytetään laajalti klassisessa kolonni- ja ohutkerroskromatografiassa, käytetään erittäin harvoin. Pääsyynä tähän on useimpien muiden adsorbenttien riittämätön mekaaninen lujuus, mikä ei salli niiden pakkaamista tai käyttöä HPLC:lle ominaisissa korkeissa paineissa.

Adsorptiota aiheuttavat polaariset ryhmät, jotka sijaitsevat silikageelin ja alumiinioksidin pinnalla, ovat ominaisuuksiltaan samanlaisia. Siksi aineseosten eluointijärjestys ja liuottimien eluotrooppinen sarja ovat yleensä niille samat. Silikageelin ja alumiinioksidin kemiallisen rakenteen ero johtaa kuitenkin joskus eroihin selektiivisyydessä - silloin etusija annetaan jollekin toiselle adsorbentille, joka sopii paremmin tiettyyn tehtävään. Esimerkiksi alumiinioksidi tarjoaa suuremman selektiivisyyden tiettyjen polynukleaaristen aromaattisten hiilivetyjen erottamiseen.

Silikageelin tavallinen suosio alumiinioksidiin verrattuna selittyy silikageelien laajemmalla valikoimalla huokoisuuden, pinnan ja huokoshalkaisijan suhteen sekä alumiinioksidin huomattavasti korkeammalla katalyyttisellä aktiivisuudella, mikä usein johtaa analyysitulosten vääristymiseen. johtuen näytekomponenttien hajoamisesta tai niiden palautumattomasta kemisorptiosta.

2.1.2 Adsorptiokromatografian haitat, jotka rajoittavat sen käyttöä

Adsorptiokromatografian suosio laski vähitellen HPLC-menetelmän kehittyessä, ja se korvataan jatkuvasti muilla vaihtoehdoilla, kuten käänteisfaasi- ja normaalifaasi-HPLC oksastetulla faasilla. Mitkä ovat adsorptiokromatografian haitat, jotka johtivat tähän?

Ensinnäkin tämä on adsorbenttien tasapainotusprosessien pitkä kesto liuottimilla, jotka sisältävät pieniä määriä vettä, vaikeus valmistaa tällaisia ​​liuottimia tietyllä ja toistettavalla kosteudella. Tämä johtaa retentio-, resoluutio- ja selektiivisyysparametrien huonoon toistettavuuteen. Samasta syystä on mahdotonta käyttää gradienttieluointia - paluu alkutilaan on niin pitkä, että se ylittää merkittävästi gradientilla saavutetun ajan.

Adsorbenttien, erityisesti alumiinioksidin, merkittävät haitat, jotka liittyvät usein katalyysille herkkien yhdisteiden uudelleenjärjestelyihin, niiden hajoamiseen ja palautumattomaan sorptioon, ovat myös hyvin tunnettuja, ja ne on toistuvasti todettu kirjallisuudessa. Peruuttamattomasti sorboituneet aineet, jotka kerääntyvät kolonnin alkuosaan, muuttavat sorbentin luonnetta ja voivat johtaa kolonnin vastuksen lisääntymiseen tai jopa sen täydelliseen tukkeutumiseen. Viimeinen epäkohta voidaan poistaa käyttämällä esipylvästä, joka Tekijä- Kun vastus ja tukkeutuminen lisääntyvät, se korvataan uudella* tai täytetään uudella sorbentilla. Kuitenkin irreversiibeli sorptio, jota tapahtuu myös tässä tapauksessa, johtaa kromatogrammiin, jossa sorptiolle tai katalyyttiselle hajoamiselle herkät näytekomponentit puuttuvat kokonaan tai osittain.

2.2. JAKELUKROMATOGRAFIA

Partitiokromatografia on HPLC:n muunnos, jossa seoksen erottaminen komponenteiksi tapahtuu niiden jakautumiskertoimien eron vuoksi kahden sekoittumattoman faasin välillä: liuottimen (liikkuva faasi) ja sorbentin päällä olevan faasin (stationaarifaasi) välillä. Historiallisesti ensimmäiset olivat tämän tyyppisiä sorbentteja, jotka saatiin levittämällä nestefaaseja (oksidipropionitriiliä, parafiiniöljyä jne.) huokoisille kantajille samalla tavalla kuin sorbentit valmistettiin ja valmistetaan kaasu-nestekromatografiaa (GLC) varten. Tällaisten sorbenttien haitat paljastuivat kuitenkin välittömästi, joista tärkein oli faasin suhteellisen nopea huuhtelu kantajasta. Tästä johtuen faasin määrä kolonnissa väheni vähitellen, myös retentioajat pienenivät ja faasin ulkopuolisia adsorptiokeskuksia ilmaantui kolonnin alkuosaan, mikä aiheutti piikkihäntojen muodostumista. Tätä haittaa torjuttiin kyllästämällä liuotin käytetyllä faasilla ennen kuin se meni kolonniin. Kuluminen väheni myös, kun käytettiin viskoosisempia ja vähemmän liukenevia polymeerifaaseja, mutta tässä tapauksessa paksuista polymeerikalvoista diffuusion vaikeudesta johtuen kolonnin tehokkuus heikkeni huomattavasti.

Nestefaasi osoittautui loogiselta oksastaa kantajalle kemiallisten sidosten kautta siten, että sen poistaminen tulee fyysisesti mahdottomaksi, eli muuttaa kantoaine ja faasi yhdeksi - ns. oksasfaasisorbentiksi.

Myöhemmin tutkijoiden ponnisteluilla pyrittiin etsimään reagensseja, joiden oksastus etenisi melko nopeasti ja täydellisesti ja muodostuneet sidokset olisivat mahdollisimman stabiileja. Tällaisia ​​reagensseja olivat alkyylikloorisilaanit ja niiden johdannaiset, jotka mahdollistivat samankaltaisella tekniikalla erityyppisten oksastusfaasisorbenttien saamisen, joiden pinnalla oli erilaisia ​​polaarisia ja ei-polaarisia ryhmiä.

Jälkimmäisen tyyppisten sorbenttien menestyksekäs käyttö HPLC:ssä on osaltaan edistänyt niiden tuotannon kasvua useiden eri valmistajien toimesta. Jokainen yritys valmisti tällaisia ​​sorbentteja pääsääntöisesti oman tyyppisensä silikageelin perusteella ja käyttämällä omaa teknologiaansa, joka yleensä on tuotanto-osaamisen. Tämän seurauksena suurella määrällä sorbentteja, joita kutsutaan kemiallisesti täsmälleen samoina (esimerkiksi oktadekyylisilaanioksastettu silikageeli), on hyvin erilaiset kromatografiset ominaisuudet. Tämä johtuu siitä, että silikageelissä voi olla leveämpiä tai kapeampia huokosia, erilainen pinta, huokoisuus, sen pinta ennen oksastusta voi olla hydroksyloitua tai ei, mono-, di- tai trikloorisilaanit voidaan oksastaa, oksastusolosuhteet voivat antaa monomeerisen, polymeerisen tai sekakerrosfaasissa käytetään erilaisia ​​menetelmiä jäännösreagenssien poistamiseen, silanolin ja muiden aktiivisten ryhmien lisädeaktivointia voidaan käyttää tai ei.

Oksastusreagenssien ja raaka-aineiden ja materiaalien valmistustekniikan monimutkaisuus, monivaiheisuus johtaa siihen, että jopa yhdeltä valmistusyritykseltä samalla tekniikalla saaduilla sorbentti-erillä voi olla hieman erilaisia ​​kromatografisia ominaisuuksia. Tämä pätee erityisesti tapauksissa, joissa tällaisia ​​sorbentteja käytetään sellaisten monikomponenttisten seosten analysointiin, jotka sisältävät aineita, jotka eroavat huomattavasti funktionaalisten ryhmien lukumäärän ja sijainnin sekä funktionaalisuuden tyypin osalta.

Edellä mainittu huomioon ottaen tulee aina pyrkiä varmistamaan, että kirjallisuudessa kuvattua analyysitekniikkaa käytettäessä käytetään samaa sorbenttia ja samoja käyttöolosuhteita. Tässä tapauksessa todennäköisyys, että teosta ei toisteta, on minimaalinen. Jos tämä ei ole mahdollista, mutta otetaan sorbentti toiselta yritykseltä, jolla on samanlainen oksastettu vaihe, sinun on varauduttava siihen, että tekniikan uudelleenkäsittely vie kauan. Samalla on mahdollista (ja se on otettava huomioon), että tällä sorbentilla ei edes pitkän kehityksen jälkeen saavuteta vaadittua erotusta. Useiden kuvattujen erotustekniikoiden olemassaolo kirjallisuudessa vanhoilla, pitkään valmistetuilla sorbenteilla stimuloi niiden jatkotuotantoa ja käyttöä tästä syystä. Kuitenkin tapauksissa, joissa on tarpeen siirtyä alkuperäisten menetelmien kehittämiseen, erityisesti hajoamiseen, kemisorptioon, uudelleenjärjestelyihin alttiiden aineiden osalta, on suositeltavaa aloittaa työskentely äskettäin kehitettyjen ja uusilla, parannetuilla menetelmillä valmistettujen sorbenttien parissa. tekniikan versioita. Uusilla sorbenteilla on tasaisempi fraktiokoostumus, tasaisempi ja täydellisempi pintapeitto oksastetulla faasilla ja edistyneemmät sorbenttikäsittelyn loppuvaiheet.

2.3. IONINVAIHTOKROMATOGRAFIA

Ioninvaihtokromatografiassa seoksen komponenttien erotus saadaan aikaan ionisoivien aineiden palautuvalla vuorovaikutuksella sorbentin ioniryhmien kanssa. Sorbentin sähköisen neutraaliuden säilyminen varmistetaan pinnan välittömässä läheisyydessä olevien ioninvaihtokykyisten vastaionien läsnäololla. Lisätyn näytteen ioni, joka on vuorovaikutuksessa sorbentin kiinteän varauksen kanssa, vaihtuu vastaionin kanssa. Aineet, joilla on erilainen affiniteetti kiinteisiin varauksiin, erotetaan anioninvaihtimissa tai kationinvaihtimissa, ja anioninvaihtimissa on positiivisesti varautuneita ryhmiä liikkuvasta faasista.

Liikkuvana faasina käytetään happojen, emästen ja liuottimien, kuten nestemäisen ammoniakin, vesiliuoksia, eli liuotinjärjestelmiä, joilla on korkea dielektrisyysvakio e ja suurempi taipumus ionisoida yhdisteitä. Ne toimivat yleensä pH:n sallivien puskuriliuosten kanssa säädettävä arvo.

Kromatografisen erotuksen aikana analyytin ionit kilpailevat eluentissa olevien ionien kanssa pyrkien vuorovaikutukseen sorbentin vastakkaisesti varautuneiden ryhmien kanssa. Tästä seuraa, että ioninvaihtokromatografiaa voidaan käyttää erottamaan kaikki yhdisteet, jotka voidaan jollain tavalla ionisoida. On mahdollista analysoida jopa neutraaleja sokerimolekyylejä niiden kompleksien muodossa boraatti-ionin kanssa:

Sokeri + VO 3 2 - = Sokeri - VO 3 2 -.

Ioninvaihtokromatografia on välttämätön erittäin polaaristen aineiden erottamiseksi, joita ei voida analysoida GLC:llä ilman muuntamista johdannaisiksi. Näitä yhdisteitä ovat aminohapot, peptidit ja sokerit.

Ioninvaihtokromatografiaa käytetään laajalti lääketieteessä, biologiassa, biokemiassa, ympäristön seurannassa, veren ja virtsan lääkeaineiden ja niiden aineenvaihduntatuotteiden, elintarvikeraaka-aineiden torjunta-aineiden sekä epäorgaanisten yhdisteiden erottamisessa, mukaan lukien radioisotoopit, lantanidit, aktinidit jne. Biopolymeerien (proteiinit, nukleiinihapot jne.) analyysi, joka kesti yleensä tunteja tai päiviä, suoritetaan ioninvaihtokromatografialla 20-40 minuutissa paremmalla erotuksella. Ioninvaihtokromatografian käyttö biologiassa on mahdollistanut näytteiden havainnoinnin suoraan biologisissa väliaineissa, mikä vähentää uudelleenjärjestelyn tai isomeroitumisen mahdollisuutta, mikä voi johtaa lopputuloksen virheelliseen tulkintaan. On mielenkiintoista käyttää tätä menetelmää biologisissa nesteissä tapahtuvien muutosten seuraamiseen. Silikageeliin perustuvien huokoisten heikkojen anioninvaihtimien käyttö mahdollisti peptidien erottamisen. V

Ioninvaihtomekanismi voidaan esittää seuraavien yhtälöiden muodossa:

anioninvaihtoa varten

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

kationinvaihtoon |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

Ensimmäisessä tapauksessa X~ näyteioni kilpailee liikkuvan faasin ionin Y~ kanssa ioninvaihtimen R+ ionikeskuksista, ja toisessa tapauksessa X+ näytekationit kilpailevat liikkuvan faasin Y+ ionien kanssa R:stä. ~ ionikeskukset.

Luonnollisesti näyte-ionit, jotka ovat heikosti vuorovaikutuksessa ioninvaihtimen kanssa, jäävät heikosti pylvääseen tämän kilpailun aikana ja ne huuhtoutuvat siitä ensimmäisinä, ja päinvastoin vahvemmin pidättyneet ionit eluoituvat viimeisinä kolonnista. . Tyypillisesti luonteeltaan ei-ioniset BTqpH4Hbie-vuorovaikutukset johtuvat näytteen adsorptiosta tai vetysidoksesta matriisin ionittoman osan kanssa tai näytteen rajoitetusta liukoisuudesta liikkuvaan faasiin. "Klassista" ioninvaihtokromatografiaa on vaikea eristää sen "puhtaassa" muodossa, ja siksi jotkut kromatografit lähtevät ioninvaihtokromatografiassa empiirisistä eikä teoreettisista periaatteista.

Tiettyjen aineiden erottaminen riippuu ensisijaisesti sopivimman sorbentin ja liikkuvan faasin valinnasta. Ioninvaihtokromatografiassa käytetään kiinteänä faaseina ioninvaihtohartseja ja silikageelejä, joissa on oksastettuja ionogeenisiä ryhmiä.

2.4. OSIAN POISSULKEMINEN KROMATOGRAFIA

Ekskluusiokromatografia on vaihtoehto! nestekromatografia, jossa erottuminen tapahtuu johtuen molekyylien jakautumisesta sorbentin huokosten sisällä olevan liuottimen ja virtaavan liuottimen välillä " sen hiukkasten välillä.

Toisin kuin muut HPLC-vaihtoehdot, joissa erotus tulossa Komponenttien erilaisesta vuorovaikutuksesta sorbentin pinnan kanssa johtuen kiinteän täyteaineen rooli kokoekskluusiokromatografiassa on vain muodostaa tietynkokoisia huokosia, ja stationäärinen faasi on liuotin, joka täyttää nämä huokoset. Siksi termin "sorbentti" käyttö näihin täyteaineisiin on jossain määrin mielivaltaista.

Menetelmän perusominaisuus on kyky erottaa molekyylejä niiden koon mukaan liuoksessa lähes minkä tahansa molekyylipainon alueella - 10 2 - 10 8, mikä tekee siitä välttämättömän synteettisten ja biopolymeerien tutkimuksessa.

Perinteisesti orgaanisissa liuottimissa suoritettavaa prosessia kutsutaan edelleen usein geelipermeaatiokromatografiaksi ja vesijärjestelmissä geelisuodatuskromatografiaksi. Tässä kirjassa molemmille vaihtoehdoille käytetään yhtä termiä, joka tulee englanninkielisestä sanasta "Size Exclusion" - poissulkeminen koon mukaan - ja kuvastaa täydellisesti prosessin mekanismia.

Olemassa olevien ajatusten yksityiskohtainen analyysi kokoerittäin monimutkaisesta teoriasta suoritetaan monografioissa.

Kolonnin liuottimen kokonaistilavuus Vt (tätä kutsutaan usein sarakkeen kokonaistilavuudeksi, koska Vd ei osallistu kromatografiseen prosessiin) on liikkuvan ja kiinteän faasin tilavuuksien summa.

Molekyylien retentio poissulkemiskolonnissa määräytyy niiden diffuusion todennäköisyydestä huokosiin ja riippuu molekyylien ja huokosten kokojen suhteesta, joka on esitetty kaavamaisesti kuvassa 1. 2.15. Jakautumiskerroin Ka, kuten muissakin kromatografian muunnelmissa, se on kiinteässä ja liikkuvassa faasissa olevan aineen pitoisuuksien suhde.

Koska liikkuvalla ja kiinteällä faasilla on sama koostumus, niin Kd aine, jolle molemmat faasit ovat yhtäläisesti saatavilla, on yhtä suuri kuin yksikkö. Tämä tilanne toteutuu pienikokoisille molekyyleille C (mukaan lukien liuotinmolekyylit), jotka tunkeutuvat kaikkiin huokosiin (katso kuva 2.15) ja liikkuvat siten kolonnin läpi hitain. Niiden retentiotilavuus on yhtä suuri kuin liuottimen kokonaistilavuus Vt-

Riisi. 2.15. Molekyylierotuksen malli mitattuna kokoekskluusiokromatografiassa

Kaikki molekyylit, joiden koko on suurempi kuin sorbenttihuokosten koko, eivät voi päästä niihin (täydellinen poissulkeminen) ja kulkea hiukkasten välisten kanavien läpi. Ne eluoituvat kolonnista samalla retentiotilavuudella, joka on yhtä suuri kuin liikkuvan faasin tilavuus V 0 - Näiden molekyylien jakaantumiskerroin on nolla.

Keskikokoiset molekyylit, jotka pystyvät tunkeutumaan vain osan huokosista, jäävät kolonniin koonsa mukaan. Näiden molekyylien jakautumiskerroin vaihtelee nollasta yhteen ja kuvaa tietyn kokoisten molekyylien käytettävissä olevaa huokostilavuuden osuutta V o:n ja huokostilavuuden käytettävissä olevan osan summasta.

LAADULLINEN ANALYYSI

Korkean erotuskyvyn nestekromatografian alalle tulevan kromatografin tulee tutustua kvalitatiivisen analyysin perusteisiin. Kvalitatiivisella analyysillä tunnistetaan tunnettu tuote, joka on saatu uudella tavalla tai löydetty seoksesta muiden tuotteiden kanssa." Se on tarpeen eristäessä eri komponentteja monimutkaisista biologisista ja kemiallisista seoksista, mikä on erityisen tärkeää lääketieteessä, oikeuslääketieteessä, ekologiassa, joidenkin lääkekemiallisten tuotteiden ja niiden aineenvaihduntatuotteiden läsnäolon seurantaan bioml.ter.ials..." "Kvalitatiivisen perusteiden tunteminen" auttaa välttämään yleisiä virheitä, esimerkiksi näytteen epäpuhtauksien erottamista näytteen epäpuhtauksista. liuotin tai aineen puhtauden tarkistaminen useammalla kuin yhdellä spektrofotometrillä, mutta eri aallonpituuksilla jne.

Ennen analyysin jatkamista on tarpeen määrittää, eluoituuko koko näyte pylväästä tietyllä liuotinjärjestelmällä vai ei. Täydellisen eluution varmistamiseksi on tarpeen kerätä kaikki pylväästä virtaava neste, haihduttaa liuotin, punnita jäännös ja selvittää näytteen talteenottoaste.

Komponenttien tunnistaminen HPLC:ssä voidaan tehdä kolmella tavalla: 1) käyttämällä retentioinformaatiota; 2) tutkia erotuksen aikana saatuja vyöhykkeitä nestekromatografikolonnissa käyttäen spektri- tai kemiallisia analyysimenetelmiä; 3) kytke spektrianalysaattori suoraan kolonniin.

Retentiotilavuutta käytetään piikien kirjaamiseen kromatografiassa. V R tai säilytysaika t R. Molemmat suuret ovat ominaisia ​​aineelle tietyssä kromatografisessa järjestelmässä. Koska erotettavan aineen retentioaika koostuu vuorovaikutusajasta kolonnissa ja putken tyhjien osien läpikulkuajasta, se vaihtelee instrumenteittain. On kätevää, että tietty kolonni ei pidä ainetta, kun otetaan se standardiksi, jonka retentioaika ja tilavuus t 0 , V o. Aineen ja standardin kromatografia on suoritettava samoissa olosuhteissa (paine ja virtausnopeus). Retentiotietojen perusteella tunnistettuina näytteissä mahdollisesti esiintyvät tunnetut yksittäiset aineet erotetaan samassa kromatografisessa järjestelmässä ja niille saadaan arvot t R. Vertaa näitä arvoja t R tuntemattoman piikin retentioajan kanssa voidaan havaita, että ne joko osuvat samaan tapaan, jolloin on todennäköistä, että piikit vastaavat samaa ainetta, tai t R tunnettu aine ei vastaa t R tuntematon vyöhyke. Silloin likimääräinen arvio arvoista on vielä mahdollista t R aineet, joita ei voida suoraan mitata niiden retentioastetta. Harkitse molempia vaihtoehtoja.

Ensimmäisessä tapauksessa näytteen alustava tutkimus on ilmeisesti tarpeen tiettyjen aineiden läsnäolon olettamiseksi siinä. Yksinkertaisten seosten kanssa työskennellessä ei ole vaikeaa määrittää, osuuko näytteen ja tunnettujen aineiden vyöhykkeiden retentioaste yhteen vai ei, eli arvot tB sama tai erilainen. Monimutkaisissa seoksissa useat aineet voivat eluoitua samanlaisilla arvoilla t R, ja kromatografisen erotuksen aikana tosiasiallisesti saadut vyöhykkeet menevät päällekkäin. Tuloksena saa tarkat arvot t R tulee mahdottomaksi eri vyöhykkeille. Tunnistuksen luotettavuus kasvaa resoluution kasvaessa, erotteluolosuhteiden huolellisemman valvonnan ja arvojen toistuvan mittauksen myötä t R ja laskemalla löydettyjen arvojen keskiarvo. Tässä tapauksessa tunnettujen ja tuntemattomien aineiden kromatografisen erotuksen on vaihdettava. Kun erotetaan monimutkaisia ​​seoksia, arvo t R aineet voivat muuttua itse näytteen matriisin vaikutuksesta. Tämä vaikutus on mahdollista kromatogrammin alussa ja kun piikit menevät päällekkäin; Vyöhykkeitä on myös mahdollista kiristää, kuten jo mainittiin.

Tällaisissa tapauksissa standardi tulee lisätä näytteeseen suhteessa 1:1. Jos aineet ovat identtisiä, arvo t R lähtöaine ei muutu, ja kromatogrammiin saadaan vain yksi piikki. Jos sinulla on laite, jossa on syklinen kromatografiajärjestelmä, luotettavan tunnistamisen vuoksi on suositeltavaa ohjata seos kolonnin läpi useita kertoja.

Tietoa retentiomääristä löytyy myös kirjallisuudesta, mutta tämän tiedon arvo on rajallinen. Koska jopa saman erän sarakkeet antavat huonon toistettavuuden, kirjallisuusarvot eivät aina vastaa todellista arvoa t R tällä sarakkeella. Adsorptiokromatografiaa varten on kuitenkin mahdollista ennustaa t R kirjallisuustietojen perusteella. Toinen vaikeus, joka liittyy kirjallisten merkityksien käyttöön t R, - niiden löytämisen vaikeus erikoiskirjallisuudesta, vaikka Jornal of chromatography -lehdessä julkaistuissa bibliografisissa katsauksissa on päivitetty indeksi ainetyypeittäin.

Toisessa tapauksessa, kun tunnettujen yhdisteiden ja näytealueiden retentioajat eivät täsmää, on mahdollista ennustaa tuntemattoman komponentin retentioaika. Suhteellisen retention ennusteet, jotka perustuvat steerisen ekskluusiokromatografian rakennetietoihin, ovat melko luotettavia. Ne ovat vähemmän tarkkoja adsorptio- ja partitiokromatografiassa ja erityisesti kemiallisesti sidotun faasin parissa. Aineiden ioni- ja ioniparikromatografiaan, joiden p Ka Vain likimääräiset arvojen määritykset ovat mahdollisia tR. Suhteellisen säilymisen tai *x-arvojen ennustaminen on aina helpompaa kuin absoluuttiset arvot k". Suhteelliset arvot t R helpompi arvioida samankaltaisten yhdisteiden tai johdannaisten, kuten substituoitujen alkyylikarboksyylihappojen tai bentseenijohdannaisten, suhteen.

Kun homologeja tai oligomeerejä erotetaan isokraattisesti, havaitaan joskus seuraava kuvio:

\ gk" = A + Bn,

Missä A Ja SISÄÄN- vakiot useille valituille näytteille ja tietylle kromatografiselle järjestelmälle (samassa kolonnissa, samalla liikkuvalla ja kiinteällä faasilla); P- näytemolekyylissä olevien identtisten rakenneyksiköiden lukumäärä.

Funktionaalisen ryhmän / liittäminen näytemolekyyliin johtaa muutokseen k" ensimmäisessä yhtälössä jollain vakiokertoimella a/ tietyssä kromatografisessa järjestelmässä. On mahdollista saada ryhmävakiot a/ eri substituenttiryhmille/, joiden arvot kasvavat funktionaalisten ryhmien polaarisuuden kasvaessa kaikissa kromatografioissa, paitsi käänteisfaasissa, jossa vakioiden arvot pienenevät lisäämällä napaisuutta.

Jotkut ryhmävakiot a/ eri substituenttiryhmille/ on annettu taulukossa. 9.1.

Adsorptiokromatografiassa ensimmäistä yhtälöä ei aina voida soveltaa, koska se pätee, jos kaikilla isomeereillä on sama arvo k", jota ei aina huomioida. On kuitenkin mahdollista piirtää samojen yhdisteiden logfe" yhdessä sarakkeessa verrattuna samojen yhdisteiden logfe" eri sarakkeeseen tai vastaaviin ohutkerroskromatografian ominaisuuksiin, esimerkiksi log[(l- Rf) IRf].

Kapasiteettikerroinarvoja voidaan käyttää säilytystietojen vertailussa k", koska toisin kuin hän t R liikkuvan vaiheen nopeuteen ja kolonnin geometrisiin ominaisuuksiin ei vaikuteta.

Kemiallisesti sidotut faasien erotukset ovat samanlaisia ​​kuin jakokromatografiset erotukset samanlaisilla faaseilla, ja siksi vakaan tilan uuttotietoja voidaan käyttää retentioaikojen ennustamiseen.

Ioninvaihtokromatografiassa retentioasteeseen vaikuttaa kolme tekijää: happojen ja emästen ionisaatioaste, ionisoidun molekyylin varaus ja ioninvaihtokromatografiassa käytetystä vesipitoisesta liikkuvasta faasista tulevan aineen kyky kulkeutua orgaaniseen aineeseen. vaihe. Jälkimmäinen riippuu yhdisteen molekyylipainosta ja sen hydrofobisuudesta. Siksi vahvemmat hapot tai emäkset säilyvät vahvemmin anioninvaihto- tai kationinvaihtoerotuksen aikana. Kun vähenee pK a näytteessä olevan yksittäisen hapon retentio kasvaa, kun useita happoja erotetaan anioninvaihdon vuoksi, ja p/C o:n kasvaessa emästen retentio kasvaa, kun ne erotetaan kationinvaihdon vuoksi.

Näin ollen tunnetun aineen retentioaikojen yhteensopivuus havaitun kanssa mahdollistaa niiden identiteetin oletuksen. Tunnistuksen luotettavuus kasvaa, jos tunnetun aineen ja tuntemattoman komponentin kromatogrammeja verrataan eri olosuhteissa. Jos aineet käyttäytyvät samalla tavalla adsorptio- ja käänteisfaasi- tai ioninvaihto- ja kokoekskluusiokromatografiassa, tunnistuksen luotettavuus kasvaa. Jos tunnistamisen luotettavuus yhtäläisellä suhteellisella retentiolla on 90 %, niin tutkittaessa samojen aineiden käyttäytymistä merkittävästi erilaisissa olosuhteissa tunnistamisen luotettavuus on jo 99 %.

Tunnistuksessa käytetyn aineen arvokas ominaisuus on tietystä aineesta saatujen signaalien suhde kahdella eri ilmaisimella. Analysoitu aine kulkee kolonnista poistuttuaan ensin ensimmäisen ilmaisimen, sitten toisen läpi, ja ilmaisimista tulevat signaalit tallennetaan samanaikaisesti monikynätallentimella tai kahdella tallentimella. Tyypillisesti käytetään ultraviolettidetektorin (herkemmän, mutta selektiivisen) sarjakytkentää refraktometrillä tai ultraviolettia fluoresenssidetektorilla tai kahta eri aallonpituuksilla toimivaa ultraviolettidetektoria. Suhteellinen vaste eli refraktometrin signaalin suhde fotometrin signaaliin on aineen ominaisuus edellyttäen, että molemmat ilmaisimet toimivat lineaarisella alueellaan; tämä testataan antamalla eri määriä samaa ainetta. Laadullista tietoa voidaan saada työskentelemällä fotometrisillä ilmaisimilla, jotka on varustettu pysäytysvirtauslaitteella, joka mahdollistaa kolonnista tulevan piikin spektrin tallentamisen sen ollessa virtauskennossa, vertaamalla sitä tunnetun yhdisteen spektriin.

Nykyaikaiset, edelleen kalliit, diodiryhmällä varustetut spektrofotometrit ovat erittäin kiinnostavia tunnistamisessa.

Täysin tuntematonta ainetta ei voida tunnistaa pelkällä korkean erotuskyvyn nestekromatografialla. Myös muita menetelmiä tarvitaan.

KVANTITATIIVINEN ANALYYSI

Kvantitatiivinen nestekromatografia on hyvin kehittynyt analyyttinen menetelmä, jonka tarkkuus ei ole huonompi kuin kvantitatiivisen kaasukromatografian ja joka ylittää merkittävästi TLC:n tai elektroforeesin tarkkuuden Valitettavasti HPLC:ssä ei ole detektoria, joka olisi herkkä erilaisten kemiallisten rakenteiden yhdisteille (. kuten katarometri GLC:ssä). Siksi kvantitatiivisten tulosten saamiseksi laitteen kalibrointi on pakollista.

Kvantitatiivinen analyysi koostuu seuraavista vaiheista: 1) kromatografinen erotus; 2) huippujen pinta-alojen tai korkeuksien mittaus; 3) seoksen kvantitatiivisen koostumuksen laskeminen kromatografisten tietojen perusteella; 4) saatujen tulosten tulkinta, eli tilastollinen käsittely. Harkitse kaikkia näitä vaiheita.

4.1. KRMATOGRAAFINEN EROTUS

Näytteenoton aikana saattaa tapahtua virheitä. Erityisen tärkeää on välttää virheitä ja saada riittävä edustava näyte heterogeenisista kiinteistä aineista, haihtuvista tai epästabiileista aineista sekä maataloustuotteista ja biomateriaaleista. Heterogeeniset näytteet, esimerkiksi elintarviketuotteet, sekoitetaan perusteellisesti ja jaetaan neljään osaan. Suorittamalla tämä toimenpide useita kertoja, saavutetaan näytteen homogeenisuus.

Aineiden virheitä ja häviöitä voidaan tehdä uuttamisen, eristämisen, puhdistuksen jne. vaiheessa.

Näytteiden tulee olla täysin liuenneita ja niiden liuokset valmistettava ±0,1 %:n tarkkuudella. On suositeltavaa liuottaa näyte liikkuvaan faasiin, mikä eliminoi sen saostumisen mahdollisuuden kromatografiin viemisen jälkeen. Jos liukeneminen liikkuvaan faasiin ei ole mahdollista, tulee käyttää sen kanssa sekoittuvaa liuotinta ja näytetilavuuksia (alle 25 µl) tulee syöttää kromatografiin.

Näytteen injektoinnin aikana voi tapahtua merkittäviä virheitä, jotka johtuvat näytteen fraktioinnista, vuodosta ja piikin levittämisestä. Huippujen hämärtyminen aiheuttaa pyrstöjen muodostumista, mikä johtaa piikkien osittaiseen päällekkäisyyteen ja sen seurauksena havaitsemisvirheisiin. Silmukkaventtiililaitteet ovat parempia kuin ruiskut näytteenottoa varten kvantitatiivisessa analyysissä paremman tarkkuuden ja pienemmän käyttäjäriippuvuuden vuoksi.

Aineiden kromatografisessa erottelussa voi myös syntyä komplikaatioita, jotka johtavat tietojen vääristymiseen: kvantitatiivinen analyysi. Näyte voi hajota tai muuttua kromatografisen prosessin aikana tai aineen peruuttamaton adsorptio kolonniin. On tärkeää varmistaa, että näitä ei-toivottuja ilmiöitä ei esiinny, ja tarvittaessa regeneroida kolonni tai vaihtaa se. Piikkien päällekkäisyyttä ja pyrstöä voidaan myös vähentää muuttamalla kromatografiaolosuhteita.

Huiput, joissa on vääriä tai epäselviä muotoja, sekä piikit, joiden vapautumisaika on lähellä to, koska niiden erottaminen ei välttämättä riitä. Tyypillisesti käytetään huippuja, joiden arvo on d"^0,5. Kolonnin suurin hyötysuhde saavutetaan syöttämällä 10~ 5 -10~ 6 g liuennutta ainetta 1 g sorbenttia kohden. Kun syötetään suuria näytemääriä, riippuvuus kuorman huipun korkeus voi osoittautua epälineaariseksi, ja huippualueiden osalta vaaditaan kvantitatiivinen arviointi.

Havaitsemiseen tai amplifiointiin liittyvät virheet johtavat kromatografisen erotuksen tulosten merkittävään vääristymiseen. Jokaiselle detektorille on ominaista spesifisyys, lineaarisuus ja herkkyys. Selektiivisyystestaus on erityisen tärkeää analysoitaessa epäpuhtauksia. UV-ilmaisimien vaste voi vaihdella kertoimella 104 aineille, joissa on samanlaisia ​​funktionaalisia ryhmiä. Ilmaisimen vaste on kalibroitava jokaiselle analyytille. Luonnollisesti aineet, jotka eivät absorboi UV-alueella, eivät anna tallentimelle signaalia, kun niitä käytetään fotometrin ilmaisimena. Käytettäessä refraktometriä negatiivisia piikkejä voi ilmaantua. Lisäksi tämä ilmaisin on termostoitu, jota ei vaadita UV-ilmaisimelta.

Ilmaisimen lineaarisuus määrittää injektoidun näytteen koon. On tärkeää muistaa, että kolonnin virtausnopeus, kolonnin ja detektorin lämpötilat sekä anturin suunnittelu vaikuttavat kaikki kvantitatiivisen analyysin tarkkuuteen. Virheet sähköisen signaalin siirtämisessä lähtölaitteeseen (tallennin), integraattoriin tai tietokoneeseen voivat johtua kohinan induktiosta, maadoituksen puutteesta, verkon jännitevaihteluista jne.

4.2. HUIPPUpinta-alan TAI KORKEuden MITTAUS

Huipun korkeus h (Kuva 10.1) on etäisyys huipun huipusta perusviivaan, joka mitataan lineaarisesti tai laskemalla jakojen lukumäärä tallentimella. Jotkut elektroniset integraattorit ja tietokoneet tarjoavat tietoa huippujen korkeuksista. Siirrettyjen huippujen perusviivan sijainti löydetään interpoloimalla piikin alkua ja loppua vastaavat ordinaatta-arvot (huippu 1 ja 3 katso kuva. 10.1). Tarkkuuden parantamiseksi on oltava tasainen, vakaa perusviiva. Jakamattomien huippujen tapauksessa perusviiva piirretään huipun alun ja lopun väliin sen sijaan, että se korvataan nollaviivalla. Koska piikkien korkeudet ovat vähemmän riippuvaisia ​​vierekkäisten päällekkäisten piikkien vaikutuksesta, piikin korkeuden estimointi on tarkempi ja sitä käytetään melkein aina jäljitysanalyysissä.

Huippupinta-ala voidaan määrittää eri tavoin. Katsotaanpa joitain niistä.

1. Planimetrinen menetelmä sisältää piikin jäljittämisen kädessä pidettävällä planimetrillä, joka on laite, joka määrittää mekaanisesti huipun alueen. Menetelmä on tarkka, mutta työvoimavaltainen ja huonosti toistettavissa. Tätä menetelmää ei suositella.

2. Paperin siluettimenetelmä - piikki leikataan ja punnitaan. Menetelmä on erittäin toistettava, mutta työvaltainen, ja kromatogrammi tuhoutuu. Sen soveltuvuus riippuu karttaliuskan yhtenäisyydestä. Menetelmää ei myöskään voi suositella laajalti.

4. Kolmiomittausmenetelmä koostuu kolmion muodostamisesta piirtämällä tangentit piikin sivuille. Kolmion yläosa on korkeammalla kuin huipun yläosa. Tämän laajennetun kärjen muodostaman alueen kasvattaminen on johdonmukaista koko kromatogrammin ajan eikä vaikuta suuresti tarkkuuteen. Lisäksi osa tangenttien piirtämisen yhteydessä menetetystä alueesta kompensoidaan. Kolmion kanta määräytyy tangenttien ja perusviivan leikkauspisteen perusteella, ja pinta-ala määräytyy kannan 7 g:n ja korkeuden tulolla. Tämä menetelmä on paras epäsymmetristen piikkien alueiden määrittämiseen. Toistettavuus on kuitenkin erilainen konstruoitaessa tangentteja eri operaattoreiden toimesta ja siksi; matala.

5. Levyintegraattorimenetelmä perustuu tallentimeen kiinnitettyyn sähkömekaaniseen laitteeseen. Integraattoriin kiinnitetty kynä liikkuu nauhan pohjassa olevaa nauhaa pitkin nopeudella, joka on verrannollinen tallentimen kynän liikkeeseen.

Kuten manuaalisissa mittauksissa, huipun tulisi pysyä tallentimen asteikolla, mutta perusviivan siirtymiä ja vierekkäisten huippujen epätäydellistä erottamista kompensoivat säädöt heikentävät luotettavuutta ja pidentävät analyysiaikaa.

Menetelmä on manuaalisia mittausmenetelmiä tarkempi erityisesti epäsymmetrisille huipeille ja tarjoaa nopeusedun. Lisäksi se tarjoaa pysyvän kvantitatiivisen tallenteen analyysistä.

6. Menetelmät, joissa käytetään elektronisia integraattoreita, jotka määrittävät piikin alueen ja tulostavat tietoa kyseisestä alueesta ja retentioajoista, voivat sisältää perusviivan siirtymän korjauksen ja määrittää vain osittain erottuneiden huippujen alueen. Tärkeimmät edut ovat tarkkuus, nopeus, toiminnan riippumattomuus tallentimen toiminnasta. Integraattoreissa on muisti, ja ne voidaan ohjelmoida tiettyä analyysiä varten esiasennetun ohjelman avulla. Integraattorin etuja ovat kyky käyttää ilmaisimen vasteen korjauskertoimia laskettaessa uudelleen alkuperäisiä tietoja huippualueista, mikä kompensoi ilmaisimen herkkyyden eroja eri aineille. Tällaiset järjestelmät säästävät aikaa, parantavat analyyttistä tarkkuutta ja ovat hyödyllisiä rutiinianalyysissä.

7. Nestekromatografiassa tietokoneita käytetään laajalti piikkialueiden mittaamiseen. Ne tulostavat täydellisen viestin, joka sisältää aineiden nimet, huippualueet, retentioajat, ilmaisimen vasteen korjauskertoimet ja runsauden (paino-%) eri näytekomponenteille.

Nestekromatografia on menetelmä monimutkaisten aineseosten erottamiseksi ja analysoimiseksi, joissa neste toimii liikkuvana faasina. Sitä voidaan soveltaa laajemman aineiden erottamiseen kuin kaasukromatografia. Tämä johtuu siitä, että useimmat aineet eivät ole haihtuvia, monet niistä ovat epävakaita korkeissa lämpötiloissa (erityisesti korkeamolekyyliset yhdisteet) ja hajoavat muuttuessaan kaasumaiseen tilaan. Aineiden erotus nestekromatografialla suoritetaan useimmiten huoneenlämpötilassa.

Kaikentyyppisten nestekromatografian ominaisuudet johtuvat siitä, että liikkuva faasi siinä on nestemäistä ja komponenttien sorptio kaasumaisesta ja nestemäisestä eluentista etenee eri tavalla. Jos kaasukromatografiassa kantajakaasu suorittaa vain kuljetusfunktiota, eikä sitä sorboi stationäärifaasi, niin nestekromatografiassa liikkuva nestefaasi on aktiivinen eluentti, jonka molekyylit voivat sorboitua stationäärifaasiin. Kolonnin läpi kulkiessaan eluentissa sijaitsevien analysoitavan seoksen komponenttien molekyylien on syrjäytettävä eluentin molekyylit sorbentin pintakerroksesta, mikä johtaa analyytin molekyylien vuorovaikutusenergian vähenemiseen. sorbentin pinnan kanssa. Siksi säilytettyjen volyymien arvot V R, joka on verrannollinen järjestelmän vapaan energian muutokseen, on nestekromatografiassa pienempi kuin kaasukromatografiassa ja sorptioisotermin lineaarisuusalue nestekromatografiassa on laajempi.

Eri eluentteja käyttämällä voidaan muuttaa kromatografisen järjestelmän retentioparametreja ja selektiivisyyttä. Selektiivisyyttä nestekromatografiassa, toisin kuin kaasukromatografiassa, määrää ei yksi, vaan kaksi tekijää - liikkuvan (eluentin) ja stationäärisen faasin luonne.

Nestemäisellä liikkuvalla faasilla on korkeampi tiheys ja viskositeetti kuin kaasufaasilla, diffuusiokertoimet D ja 3–4 suuruusluokkaa pienempi kuin kaasussa. Tämä johtaa hitaampaan massansiirtoon nestekromatografiassa verrattuna kaasukromatografiaan. Van Deemterin yhtälö johtuu siitä, että termi SISÄÄN ei näytä roolia nestekromatografiassa ( D ja  D G), myös tehokkuuden graafinen riippuvuus muuttuu N liikkuvan faasin lineaarisesta virtausnopeudesta on kuvan 1 mukainen muoto. 1.9.

Kolonninestekromatografian klassisessa versiossa eluenttiin liuennut analysoitu näyte viedään 1–2 m korkeaan lasikolonniin, täytetään sorbentilla, jonka hiukkaskoko on 100 μm ja eluentilla, ja eluentti johdetaan sen läpi. valitsemalla osia eluaatista kolonnin ulostulossa. Tätä nestekromatografian versiota käytetään edelleen laboratoriokäytännössä, mutta koska eluentin läpikulkunopeus painovoiman vaikutuksesta on alhainen, analyysi on pitkä.

Nestekromatografian nykyaikainen versio, ns. korkean suorituskyvyn nestekromatografia HPLC, käyttää tilavuus- ja pintahuokoisia sorbentteja, joiden hiukkaskoko on 5–10 mikronia, ruiskutuspumppuja, jotka tuottavat järjestelmäpaineen jopa 400 atm, sekä erittäin herkkiä ilmaisimia. Nopea massansiirto ja korkea erotustehokkuus mahdollistavat HPLC:n käytön molekyylien erottamiseen (nesteadsorptio ja neste-neste-partitiokromatografia), ionien erottamiseen (ioninvaihto, ioni, ioni-parikromatografia), molekyylien erottamiseen. makromolekyylit (kokoekskluusiokromatografia).

1.3. LIUOTTEEN PITO JA VAHVUUS

Jotta analysoitavat aineet erottuisivat kolonnilla, kuten edellä mainittiin, kapasiteettikertoimen k" on oltava suurempi kuin 0, eli aineet on säilytettävä stationaarifaasissa, sorbentissa. Kapasiteettikerroin ei kuitenkaan saisi olla liian suuri hyväksyttävän eluointiajan saavuttamiseksi. Jos tietylle aineseokselle valitaan kiinteä faasi, joka säilyttää ne, niin jatkotyö analyysitekniikan kehittämiseksi koostuu sellaisen liuottimen valitsemisesta, joka tarjoaa ihanteellisesti erilaisen mutta hyväksyttävän liuottimen. ei kovin suuri k ". Tämä saavutetaan muuttamalla liuottimen eluointivoimakkuutta.

Kun kyseessä on adsorptiokromatografia silikageelillä tai alumiinioksidilla, kaksikomponenttisen liuottimen (esimerkiksi heksaanin, johon on lisätty isopropanolia) vahvuutta lisätään yleensä lisäämällä polaarisen komponentin (isopropanolin) pitoisuutta, tai vähennetään vähentämällä isopropanolipitoisuutta. Jos polaarisen komponentin pitoisuus laskee liian pieneksi (alle 0,1 %), se tulee korvata heikompaan eluointivoimaan. Sama tehdään korvaamalla joko polaarinen tai ei-polaarinen komponentti muilla, vaikka tämä järjestelmä ei tarjoa haluttua selektiivisyyttä seoksen kiinnostavien komponenttien suhteen. Liuotinjärjestelmiä valittaessa huomioidaan sekä seoksen komponenttien liukoisuus että eri tekijöiden kokoamat eluotrooppiset liuotinsarjat.

Liuottimen vahvuus valitaan suunnilleen samalla tavalla käytettäessä oksastettuja polaarisia faaseja (nitriili, amino, dioli, nitro jne.) ottaen huomioon mahdolliset kemialliset reaktiot ja jättäen pois faasille vaaralliset liuottimet (esim. aldehydit ja ketonit). aminofaasille).

Käänteisfaasikromatografian tapauksessa liuotinvahvuutta lisätään lisäämällä orgaanisen komponentin pitoisuutta eluentissa (metanoli, asetonitriili tai THF) ja vähennetään lisäämällä vettä. Jos haluttua selektiivisyyttä ei ole mahdollista saavuttaa, käytetään toista orgaanista komponenttia tai yritetään muuttaa sitä erilaisilla lisäaineilla (hapot, ioniparireagenssit jne.).

Erotuksissa ioninvaihtokromatografialla liuottimen vahvuutta muutetaan lisäämällä tai alentamalla puskuriliuoksen pitoisuutta tai muuttamalla pH:ta joissain tapauksissa modifiointia orgaanisilla aineilla.

Etenkin monimutkaisten luonnollisten ja biologisten seosten tapauksessa ei kuitenkaan usein ole mahdollista valita liuottimen vahvuutta siten, että kaikki näytteen komponentit eluoituvat hyväksyttävän ajan sisällä. Sitten on turvauduttava gradienttieluointiin, ts. käytä liuotinta, jonka eluointivoimakkuus muuttuu analyysiprosessin aikana siten, että se kasvaa jatkuvasti ennalta määrätyn ohjelman mukaisesti. Tämä tekniikka mahdollistaa monimutkaisten seosten kaikkien komponenttien eluoinnin suhteellisen lyhyessä ajassa ja niiden erottamisen komponenteiksi kapeiden piikkien muodossa.

1.6.1. Adsorptionestekromatografia. Adsorptionestekromatografia jaetaan kiinteän ja liikkuvan faasin polaarisuudesta riippuen normaalifaasi- (NPC) ja käänteisfaasikromatografiaan (RPC). NPC:ssä käytetään polaarista adsorbenttia ja ei-polaarisia liikkuvia faaseja, OPC:ssä käytetään ei-polaarista adsorbenttia ja polaarisia liikkuvia faaseja, mutta molemmissa vaihtoehdoissa liikkuvan vaiheen valinta on usein tärkeämpää kuin sen valinta. paikallaan oleva vaihe. Stationaarifaasissa on säilytettävä erotettavat aineet. Liikkuvan faasin, ts. liuottimen, on saatava aikaan vaihteleva kolonnikapasiteetti ja tehokas erotus hyväksyttävässä ajassa.

Polaarisia ja ei-polaarisia hienojakoisia huokoisia materiaaleja, joiden ominaispinta-ala on yli 50 m 2 /g, käytetään kiinteänä faasina adsorptionestekromatografiassa. Polaarisissa adsorbenteissa (SiO 2 , Al 2 O 3, florisil jne.) on pinnalla heikkoja happoryhmiä, jotka voivat pidättää emäksisiä ominaisuuksia omaavia aineita. Näitä adsorbentteja käytetään pääasiassa ei-polaaristen ja kohtalaisen polaaristen yhdisteiden erottamiseen. Niiden haittana on niiden korkea herkkyys käytettyjen eluenttien vesipitoisuudelle. Tämän haitan poistamiseksi polaarisia sorbentteja käsitellään amiineilla, dioleilla ja muilla reagensseilla, mikä johtaa näiden reagenssien pintaoksastumiseen, pinnan modifikaatioon ja muutokseen selektiivisyydessä suhteessa analyytteihin.

Ei-polaariset adsorbentit (grafitoitu hiilimusta, piimaa, piimaa) eivät ole selektiivisiä polaarisille molekyyleille. Polaarittomien adsorbenttien saamiseksi esimerkiksi silikageelin pintaan oksastetaan usein ei-polaarisia ryhmiä, esimerkiksi alkyylisilyyli SiR3, jossa Ralkyyliryhmät ovat C2C22.

Liikkuvan faasin tulee liuottaa analysoitava näyte kokonaan, sen viskositeetin on oltava alhainen (jotta diffuusiokertoimet ovat riittävän suuria), ja on toivottavaa, että siitä on mahdollista eristää erotetut komponentit. Sen on oltava inertti kromatografin kaikkien osien materiaalien suhteen, turvallinen, halpa ja sopiva ilmaisimelle.

Nestekromatografiassa käytettävien liikkuvien faasien eluointivoimakkuus vaihtelee. Liuottimen eluointivoima osoittaa, kuinka monta kertaa tietyn eluentin sorptioenergia tietyllä adsorbentilla on suurempi kuin standardiksi valitun eluentin, esimerkiksi n-heptaanin, sorptioenergia. Heikkoja liuottimia adsorboituu huonosti stationäärifaasiin, joten sorboituneiden aineiden (sorbaatti) jakautumiskertoimet ovat korkeat. Päinvastoin, vahvat liuottimet adsorboituvat hyvin, joten sorbaattijakaantumiskertoimet ovat alhaiset. Mitä vahvempi liuotin on, sitä suurempi on analysoitavan näytteen liukoisuus siihen ja sitä voimakkaampi on liuotin-sorbaatti-vuorovaikutus.

Korkean erotustehokkuuden varmistamiseksi kolonnissa on tarpeen valita liikkuva faasi, jonka polaarisuus on optimaalinen seoksen erottamiselle valituissa erotusolosuhteissa. Tyypillisesti ensin valitaan kiinteä vaihe, jonka polariteetti on lähellä erotettavien komponenttien napaisuutta. Sitten valitaan liikkuva vaihe varmistaen, että kapasiteettikerroin k" osoittautui olevan alueella 2-5. Jos liikkuvan vaiheen polariteetti on liian lähellä kiinteän vaiheen polariteettia, komponenttien retentioaika on liian lyhyt, ja jos liikkuvan ja paikallaan olevan polariteetit vaiheet ovat hyvin erilaisia, säilytysajasta tulee liian pitkä.

Liikkuvia faaseja valittaessa niitä ohjaa ns. eluotrooppinen sarja, joka perustuu napaisuusindeksien käyttöön. Snyder R", joka jakaa kaikki liuottimet vahvoihin (polaarisiin) ja heikkoihin (heikosti polaarisiin ja ei-polaarisiin). Polaarisuusasteikko perustuu liikkuvina faaseina käytettävien aineiden liukoisuuteen dioksaaniin, nitrometaaniin ja etanoliin.

Taulukossa 1.2 on esitetty polariteettiindeksien ja eluutiovoiman arvot (suhteessa SiO 2:een) useille liuottimille, joita nestekromatografiassa useimmiten käytetään liikkuvina faaseina. Tässä on myös esitetty näiden liuottimien läpinäkyvyyden lyhytaallonpituusrajat, mikä helpottaa olosuhteiden valintaa seoksen komponenttien havaitsemiseksi.

Taulukko 1.2

Nestekromatografiassa käytettyjen liuottimien ominaisuudet

Liuotin	Napaisuusindeksi	Eluointivoima (SiO 2)	Lyhyen aallonpituuden läpinäkyvyysraja
Fluorialkaani
Sykloheksaani
n-Heksaani
Hiilitetrakloridi
Di-isopropyylieetteri
Dietyylieetteri
dikloorimetaani
Tetrahydrofuraani
Kloroformi
Etikkahappo
Asetonitriili
Nitrometaani

Nestekromatografiassa käytetään usein niiden seoksia yksittäisten liuottimien sijaan. Usein pienet lisäykset toista liuotinta, erityisesti vettä, lisäävät merkittävästi eluentin eluenttivahvuutta.

Monikomponenttiseoksia erotettaessa yksittäinen liikkuva faasi eluenttina ei välttämättä erota kaikkia näytteen komponentteja hyväksyttävässä ajassa. Tällöin käytetään vaiheittaista tai gradienttieluointimenetelmää, jossa kromatografiaprosessin aikana käytetään peräkkäin yhä vahvempia eluentteja, mikä mahdollistaa erittäin pidättyneiden aineiden eluoinnin lyhyemmässä ajassa.

Nestekromatografiassa on joitain empiirinen säännöt, jotka ovat erittäin hyödyllisiä valittaessa eluenttia:

- yhdisteen sorptio yleensä lisääntyy kaksoissidosten ja OH-ryhmien määrän lisääntyessä siinä;

 useiden orgaanisten yhdisteiden sorptio vähenee: hapot alkoholitaldehyditketonitesterittyydyttymättömät hiilivedyttyydyttyneet hiilivedyt;

 eri polaaristen aineiden ja eri luokkien aineiden erottamiseen käytetään normaalifaasikromatografiaa: analysoitu näyte liuotetaan ja eluoidaan ei-polaarisella eluentilla, eri luokkien yhdisteet poistuvat kolonnista polaarisen adsorbentin kanssa eri aikoina, kun taas eri funktionaalisia ryhmiä sisältävien yhdisteiden retentioaika kasvaa siirtyessä ei-polaarisista yhdisteistä heikosti polaarisiin. Erittäin polaaristen molekyylien retentioajat ovat niin pitkiä, että analyysi ei ole mahdollista ei-polaarisella eluentilla. Polaaristen komponenttien retentioajan lyhentämiseksi vaihda polaarisiin eluentteihin;

 käänteisfaasiversiossa stationäärinen faasi (ei-polaarinen adsorbentti) adsorboi vahvemmin ei-polaarista komponenttia polaarisista eluenteista, esimerkiksi vedestä;

- Vähentämällä eluentin polaarisuutta lisäämällä vähemmän polaarista liuotinta voidaan vähentää komponenttien retentiota.

1.6.2. Partitionestekromatografia. Partitio- tai neste-nestekromatografiassa analysoitavan näytteen komponenttien erottuminen johtuu eroista niiden jakautumiskertoimissa kahden sekoittumattoman nestefaasin välillä, joista toinen on kiinteä ja sijaitsee kiinteän aineen pinnalla tai huokosissa. kiinteä kantoaalto, ja toinen on mobiili.

Vuorovaikutusvoimien luonteeltaan, jotka määräävät erilaisen jakautumisen aineen kahden faasin välillä, jotka eroavat kemiallisesta rakenteestaan, partitiokromatografia on samanlainen kuin adsorptiokromatografia, eli tässäkin erottelu perustuu eroon molekyylien välisen vuorovaikutuksen voimat analysoidun näytteen komponenttien ja kiinteän ja liikkuvan nestefaasin välillä.

Tekniikasta riippuen jakokromatografia, kuten adsorptiokromatografia, voi olla pylväs- tai tasomaista (paperi- tai ohutkerros).

Kiinteinä kantajina käytetään aineita, jotka ovat välinpitämättömiä analysoitavan näytteen liikkuvalle liuottimelle ja komponenteille, mutta jotka pystyvät pitämään paikallaan pysyvän faasin pinnalla ja huokosissa. Useimmiten kantajina käytetään polaarisia aineita (selluloosaa, silikageeliä, tärkkelystä). Niihin levitetään kiinteää faasia - polaarista liuotinta, useimmiten vettä tai alkoholia. Tällöin liikkuvina faaseina käytetään vähemmän polaarisia tai ei-polaarisia aineita (alkoholeja, amiineja, ketoneja, hiilivetyjä jne.). Tämän tyyppistä partitiokromatografiaa kutsutaan normaalivaiheinen. Sitä käytetään polaaristen aineiden erottamiseen.

Partitiokromatografian toinen versio eroaa siinä, että paikallaan pysyvänä kiinteänä faasina käytetään ei-polaarisia kantoaineita (kumia, fluoroplastia, hydrofobisoitua silikageeliä), ei-polaarisia liuottimia (hiilivetyjä) käytetään kiinteänä nestefaasina ja polaarisia liuottimia (alkoholeja) aldehydit) käytetään liikkuvana nestefaasina, ketoneina jne., usein vesi). Tätä partitiokromatografian versiota kutsutaan käänteinen vaihe ja sitä käytetään ei-polaaristen aineiden erottamiseen.

Analysoidun näytteen komponenttien optimaalisen erottelun saavuttamiseksi liikkuvan faasin valinta on erittäin tärkeää. Liuottimet (liikkuvat ja kiinteät nestefaasit) on valittava siten, että seoksen komponenttien jakautumiskertoimet eroavat melko merkittävästi. Seuraavat vaatimukset koskevat nestefaaseja: vaatimukset:

1) käytettävien liuottimien tulee liuottaa erotettavat aineet hyvin ja niiden liukoisuuden kiinteässä faasissa on oltava suurempi kuin liikkuvassa faasissa;

2) liikkuvana ja kiinteänä faasina käytettävien liuottimien tulee olla keskenään kyllästyneitä, ts. liuottimen koostumuksen tulee olla vakio kulkiessaan kolonnin läpi;

3) liikkuvana faasina käytettävien liuottimien vuorovaikutuksen kiinteän faasin kanssa tulee olla minimaalista.

Useimmiten partitionestekromatografiassa liikkuvina nestefaaseina ei käytetä yksittäisiä aineita, vaan niiden seoksia eri suhteissa. Tämä mahdollistaa liikkuvan faasin polariteetin säätelyn, liikkuvan ja kiinteän faasin polariteettisuhteen muuttamisen ja optimaalisen olosuhteiden saavuttamisen tietyn analysoitavan seoksen komponenttien erottamiselle.

Tämän kromatografisen menetelmän merkittävä haittapuoli on, että käytetty kiinteä nestefaasi huuhtoutuu nopeasti pois kantajasta. Sen eliminoimiseksi liikkuvana faasina käytetty liuotin kyllästetään kiinteänä nestefaasina käytetyllä aineella tai kiinteä nestefaasi stabiloidaan oksastamalla se kantajaan.

Eräs erotusnestekromatografian muunnelma on laajalti käytetty HPLC-menetelmä.

Yleisimmät kromatografiset järjestelmät ovat järjestelmiä, joissa on modulaarinen kokoonpanoperiaate. Pumput, kaasunpoistolaitteet, ilmaisimet, annostelijat (automaattiset näytteenottimet), kolonnitermostaatit, fraktionkerääjät, kromatografisen järjestelmän ohjausyksiköt ja tallennuslaitteet ovat saatavilla erillisinä moduuleina. Laajan moduulivalikoiman avulla voit joustavasti ratkaista erilaisia ​​analyyttisiä ongelmia ja muuttaa tarvittaessa nopeasti järjestelmäkokoonpanoa minimaalisilla kustannuksilla. Samaan aikaan valmistetaan myös monomodulaarisia (integroituja) LC:itä, joiden tärkein etu on yksittäisten yksiköiden miniatyrisointi ja laitteen kompakti.

Eluointimenetelmästä riippuen nestekromatografit jaetaan isokraattisiin ja gradienttikromatografeihin.

Isokraattisen kromatografin kaavio

Liikkuva faasi säiliöstä (1) tulosuodattimen (9) läpi syötetään tarkkuuskorkeapainepumpulla (2) näytteen injektiojärjestelmään (3) - manuaaliseen injektoriin tai automaattiseen näytteenottimeen, ja näyte viedään myös sinne. . Seuraavaksi näyte liikkuvan vaiheen virralla kulkevan suodattimen (8) läpi menee erotuselementtiin (elementteihin) (4) - esikolonnin kautta erotuskolonniin. Sitten eluaatti menee detektoriin (5) ja poistetaan tyhjennyssäiliöön (7). Kun eluaatti virtaa ilmaisimen mittauspiirin läpi, kromatogrammi tallennetaan ja tiedot siirretään analogiseen tallentimeen (tallennin) (6) tai muuhun kromatografisen tiedon keräämis- ja käsittelyjärjestelmään (integraattori tai tietokone). Toiminnallisten moduulien suunnittelusta riippuen järjestelmää voidaan ohjata ohjausmoduulin näppäimistöltä (yleensä pumppu tai järjestelmäohjain), kunkin järjestelmämoduulin näppäimistöltä tai ohjausohjelmalla henkilökohtaisesta tietokoneesta.

Gradienttieluutiossa käytetään kahta olennaisesti erilaista nestekromatografia. Ne eroavat pisteestä, jossa liikkuvan faasin koostumuksen gradientti muodostuu.

Gradienttikromatografin kaavio, jossa muodostuu liikkuvan faasin koostumuksen gradientti matalapainelinjalla.

Liikkuva faasi säiliöistä (1) syöttösuodattimien (9) ja gradienttiohjelmoijan (10) kautta syötetään tarkkuuskorkeapainepumpulla (2) näytteen injektiojärjestelmään (3) - manuaaliseen injektoriin tai automaattiseen näytteenottimeen, ja siellä esitellään myös näyte. Gradienttiohjelmointiventtiilien toimintaa ohjataan joko järjestelmän ohjausmoduulilla (pumppu tai säädin) tai PC-ohjausohjelmalla. Tämän tyyppiset järjestelmät muodostavat binäärisen, kolmiulotteisen ja neliulotteisen gradientin. Gradienttikäsittelytoiminnon muoto riippuu tietystä ohjausmoduulista tai ohjausohjelmasta sekä ohjatun ja ohjausmoduulin toimivuudesta. Seuraavaksi näyte liikkuvan vaiheen virralla kulkevan suodattimen (8) läpi menee erotuselementtiin (elementteihin) (4) - esikolonnin kautta erotuskolonniin. Sitten eluaatti menee detektoriin (5) ja poistetaan tyhjennyssäiliöön (7). Kun eluaatti virtaa ilmaisimen mittauspiirin läpi, kromatogrammi tallennetaan ja tiedot siirretään analogiseen tallentimeen (tallennin) (6) tai muuhun kromatografisen tiedon keräämis- ja käsittelyjärjestelmään (integraattori tai tietokone). Toiminnallisten moduulien rakenteesta riippuen järjestelmää voidaan ohjata ohjausmoduulin näppäimistöltä (yleensä pumppu tai järjestelmäohjain) tai ohjausohjelmalla henkilökohtaisesta tietokoneesta. Ohjausmoduulin ohjauksessa on mahdollista ohjata ilmaisinta itsenäisesti omasta näppäimistöstään.

Huolimatta tällaisten järjestelmien näennäisestä houkuttelevuudesta (ne käyttävät vain yhtä tarkkuuskorkeapainepumppua), näillä järjestelmillä on useita haittoja, joista tärkein on kenties tiukka tarve suorittaa perusteellinen kaasunpoisto liikkuvan vaiheen komponenteista jo ennen matalapainesekoitin (gradienttiohjelmointikammio). Se suoritetaan erityisillä läpivirtauskaasunpoistajilla. Tämän tosiasian vuoksi niiden kustannuksista tulee verrattavissa muun tyyppisiin gradienttijärjestelmiin - järjestelmiin, joissa muodostetaan liikkuvan faasin gradienttikoostumus korkeapainelinjalla.

Perimmäinen ero järjestelmien välillä, joissa muodostuu liikkuvan faasin gradienttikoostumus korkeapainelinjalla, on komponenttien sekoittuminen korkeapainelinjassa. Tässä lähestymistavassa tarkkuuspumppujen lukumäärä määräytyy luonnollisesti säiliöiden lukumäärän mukaan liikkuvan faasin sekoittamiseen. Tällä lähestymistavalla komponenttien perusteellisen kaasunpoiston vaatimukset vähenevät merkittävästi.

Gradienttikromatografin kaavio, jossa muodostuu liikkuvan faasin koostumuksen gradientti korkeapainelinjalla.

Liikkuva faasi säiliöistä (1) syöttösuodattimien (9) kautta syötetään tarkkuuskorkeapainepumpuilla (2 ja 11) staattisen tai dynaamisen virtaussekoittimen (10) kautta näytteensyöttöjärjestelmään (3) - manuaaliseen injektoriin tai autosampler, ja näyte esitellään myös siellä. Ohjattujen pumppujen toimintaa ohjataan joko järjestelmän ohjausmoduulilla (pääpumppu tai ohjain) tai PC-ohjausohjelmalla. Tässä tapauksessa kaikki pumput ovat ohjattavissa. Tämän tyyppiset järjestelmät muodostavat binääri- tai kolmiulotteisen gradientin. Gradienttikäsittelytoiminnon muoto riippuu tietystä ohjausmoduulista tai ohjausohjelmasta sekä ohjatun ja ohjausmoduulin toimivuudesta. Seuraavaksi näyte liikkuvan vaiheen virralla kulkevan suodattimen (8) läpi menee erotuselementtiin (elementteihin) (4) - esikolonnin kautta erotuskolonniin. Eluaatti menee sitten detektoriin (5) ja poistetaan tyhjennyssäiliöön (7). Kun eluaatti virtaa ilmaisimen mittauspiirin läpi, kromatogrammi tallennetaan ja tiedot siirretään analogiseen tallentimeen (tallennin) (6) tai muuhun kromatografisen tiedon keräämis- ja käsittelyjärjestelmään (integraattori tai tietokone). Toiminnallisten moduulien rakenteesta riippuen järjestelmää voidaan ohjata ohjausmoduulin näppäimistöltä (yleensä pumppu tai järjestelmäohjain) tai ohjausohjelmalla henkilökohtaisesta tietokoneesta. Ohjausmoduulilla ohjattaessa ilmaisinta on mahdollista ohjata itsenäisesti omasta näppäimistöstään.

Ehdotetut suunnitelmat ovat melko yksinkertaisia. Järjestelmät voivat sisältää lisälaitteita - kolonnin termostaatti, kolonnin jälkeiset derivatisointijärjestelmät, näytteenkäsittely- ja näytteen väkevöintijärjestelmät, liuottimen kierrätysjärjestelmä, kalvojärjestelmät taustasähkönjohtavuuden vaimentamiseen (ionikromatografiaa varten), lisäsuojajärjestelmiä (suodattimet, kolonnit), jne. Kaavioissa ei myöskään näytetä manometrisia moduuleja erikseen. Yleensä nämä laitteet on rakennettu pumppuyksiköihin. Näissä yksiköissä voidaan yhdistää useita pumppuja, pumppu gradienttiohjelmoijalla ja yhteinen järjestelmäohjain. Järjestelmän rakenne riippuu sen kokoonpanosta ja jokaisesta valmistajasta.

Tällainen kromatografisen prosessin teknisen tuen radikaali monimutkaisuus johtaa useiden sellaisten liikkuvan faasin ominaisuuksien vaatimuksiin, jotka puuttuvat klassisessa kolonni- ja tasokromatografiassa. Nestefaasin tulee olla havaitsemiseen sopiva (oltava läpinäkyvä tietyllä spektrin alueella tai sillä on oltava alhainen taitekerroin, tietty sähkönjohtavuus tai dielektrisyysvakio jne.), inertti kromatografisten osien materiaaleille, ei muodosta kaasua kuplia pumpun venttiileissä ja ilmaisinkennossa, ei mekaanisia epäpuhtauksia.

Nestekromatografiassa Käytössä on monenlaisia ​​pumppuja. Matalapaineisessa LC:ssä käytetään usein peristalttisia pumppuja (kuva 1).

Kuva 1 MasterFlex ohjelmoitava peristalttinen pumppu.

HPLC:ssä käytetään korkeapainepumppuja varmistamaan liikkuvan faasin virtaus kolonnin läpi määritetyillä parametreilla.

HPLC-pumppujen tärkeimpiä teknisiä ominaisuuksia ovat: virtausalue; suurin työpaine; virtauksen toistettavuus; liuottimen syötön pulsaatioalue.

Liuotinsyötön luonteesta riippuen pumput voivat olla jatkuvatoimisia (virtaus) ja vakiopaineisia. Pohjimmiltaan analyyttisen työn aikana käytetään vakiovirtaustilaa ja kolonneja täytettäessä käytetään vakiopainetilaa.

Toimintaperiaatteensa perusteella HPLC-pumput jaetaan: ruisku ja edelleen mäntä vastavuoroisesti .

Ruiskupumput

Näiden pumppujen tärkein erottuva piirre on niiden toiminnan syklinen luonne, ja siksi kromatografit, joissa näitä pumppuja käytetään, eroavat myös syklisestä toiminnastaan.

Riisi. 2. HPLC-ruiskupumpun perusrakenne.

Riisi. 2A. Ruiskupumppu.

Ohjausyksikkö BU syöttää jännitteen moottorille D, joka määrittää sen pyörimisnopeuden ja -suunnan. Moottorin pyöriminen vaihdelaatikolla P muunnetaan männän P liikkeeksi sylinterin D sisällä. Pumppu toimii 2 jaksossa. Täyttöjakson aikana venttiili K2 on kiinni, K1 auki, liuotin virtaa säiliöstä sylinteriin C. Syöttötilassa venttiili K1 on kiinni ja venttiilin K2 kautta liikkuva faasi tulee annostuslaitteeseen.

Tämän tyyppisille pumpuille on ominaista lähes täydellinen pulsaatioiden puuttuminen liikkuvan vaiheen virtauksesta käytön aikana.

Pumpun huonot puolet:

a) suuri ajan ja liuottimen kulutus pesuun liuotinta vaihdettaessa;

b) PF:n tilavuutta rajoittaa ruiskun tilavuus, ja siksi erotusaika on rajoitettu;

c) erotuksen keskeytyminen pumppua täytettäessä;

d) suuret mitat ja paino varmistaen samalla suuren virtauksen ja paineen (tarvitaan tehokas moottori ja suuri mäntävoima sen suurella alueella).

Mäntäpumput.

Riisi. 3. Mäntäpumpun perusrakenne.

Toimintaperiaate.

Moottori D asettaa vaihteiston P kautta männän P edestakaisin liikkeen liikkuen pumpun työpäässä. Venttiilit K1 ja K2 avautuvat, kun pumppu on imu- ja syöttövaiheessa. Tilavuussyötön määrä määräytyy kolmella parametrilla: männän halkaisija (yleensä 3,13; 5,0; 7,0 mm), sen amplitudi (12-18 mm) ja taajuus (joka riippuu moottorin ja vaihteiston pyörimisnopeudesta).

Tämän tyyppiset pumput tarjoavat liikkuvan vaiheen jatkuvan tilavuussyötön pitkän ajan. Maksimi käyttöpaine 300-500 atm, virtausnopeus 0,01-10 ml/min. Tilavuussyötön toistettavuus -0,5 %. Suurin haittapuoli on, että liuotin syötetään järjestelmään peräkkäisten pulssien sarjana, jolloin esiintyy paine- ja virtauspulsaatioita (kuva 4). Tämä on tärkein syy lähes kaikkien LC:ssä käytettävien ilmaisimien, erityisesti sähkökemiallisten, lisääntyneeseen kohinaan ja heikentyneeseen herkkyyteen.

Kuva 4. Mäntäpumpun sykkiminen.

Tapoja käsitellä pulsaatiota.

1. Vaimennuslaitteiden käyttö.

Nämä ovat ruostumattomasta teräksestä valmistettuja erityisprofiilisia kierreputkia, jotka on kytketty sarjaan tai rinnan pumpun ja annostelijan väliseen järjestelmään.

Riisi. 5. Spiraalivaimennin.

Pelti vapautuu paineen noustessa (pumpun kiihtyvyys). Kun paine laskee, se käpristyy, sen tilavuus pienenee, se puristaa pois osan liuottimesta, ylläpitäen tasaisen virtausnopeuden ja vähentäen pulsaatiota. Tämä vaimennin toimii hyvin paineissa 50 atm ja yli.

5-30 atm:n paineessa se tasoittaa pulsaatioita paremmin ilmanpelti, valmistettu pylväästä (kuva 6.). Vaimennetussa kolonnissa (6x200 mm) ilma puristetaan ja pulsaatiot vaimentuvat. Ilma liukenee siihen 24 tunnin kuluessa.

Riisi. 6. Ilmanpelti.

2. Elektronisten laitteiden sovellus.

Kun käytät elektronista paineanturia, voit käyttää anturin lukemia pumpun toiminnan ohjaamiseen. Kun paine laskee, moottorin nopeus kasvaa ja kompensoi paineen laskua. On myös mahdollista kompensoida vuodot venttiileissä ja osittain hihansuissa. Elektronisen vaimentimen (BPZh-80, KhPZh-1 jne.) käyttö mahdollistaa painepulsaatioiden vähentämisen 1 atm:iin paineessa 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Ioninvaihto, ioni, ioniparikromatografia. Ioninvaihto-, ioni- ja ioniparikromatografiamenetelmät perustuvat dynaamiseen prosessiin, jossa stationaarifaasiin liittyvät ionit korvataan kolonniin tulevilla eluentti-ioneilla. Kromatografisen prosessin päätavoitteena on erotella samanmerkkisiä epäorgaanisia tai orgaanisia ioneja. Retentio tämän tyyppisissä kromatografioissa määräytyy ioninvaihtoreaktion vapaan energian muutoksen perusteella. Vaihtuneiden ionien pitoisuuksien suhteelle liuoksessa ja sorbenttifaasissa on ominaista ioninvaihtotasapaino. Ioninvaihto tarkoittaa sitä, että jotkin aineet (ioninvaihtimet) elektrolyyttiliuokseen upotettuina absorboivat siitä kationeja tai anioneja vapauttaen liuokseen vastaavan määrän muita ioneja samanmerkkisellä varauksella. Kationien vaihto tapahtuu kationinvaihtimen ja liuoksen välillä ja anionien vaihto tapahtuu anioninvaihtimen ja liuoksen välillä.

Kationinvaihtimet ovat useimmiten erityisesti syntetisoituja liukenemattomia polymeeriaineita, jotka sisältävät rakenteessa happamia ionogeenisiä ryhmiä: –SO 3 H; -COOH; -VAI NIIN; -PO3H2; –As03H2.

Kationinvaihtimien kemialliset kaavat voidaan kuvata kaavamaisesti R-S03H:na; R-S03Na. Ensimmäisessä tapauksessa kationinvaihdin on H-muodossa, toisessa Na-muodossa. R – polymeerimatriisi.

Kationinvaihtoreaktiot on kirjoitettu tavallisiksi heterogeenisiksi kemiallisiksi reaktioiksi:

RNa + Na + RNa + H+

Anioninvaihtajat sisältävät rakenteessa emäksisiä ionogeenisiä ryhmiä: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + jne. Niiden kemialliset kaavat voidaan kuvata muotoina RNH 3 OH ja RNH 3 Cl tai ROH, RCl. Ensimmäisessä tapauksessa anioninvaihdin on OH-muodossa, toisessa tapauksessa Cl-muodossa. Anioninvaihtoreaktio voidaan kirjoittaa seuraavasti:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Tunnetaan amfoteerisia ioninvaihtimia, jotka sisältävät rakenteessa sekä happamia että emäksisiä ryhmiä. Ioninvaihtimia, jotka sisältävät samantyyppisiä (esimerkiksi SO 3 H) happamia (emäksisiä) ryhmiä, kutsutaan monofunktionaalisiksi; erityyppisiä (esim. SO 3 H, OH) happamia (emäksisiä) ryhmiä sisältävät ioninvaihtimet ovat polyfunktionaalisia.

Monofunktionaalisia ioninvaihtimia saadaan polymerointireaktiolla. Polykondensaatioreaktio mahdollistaa monitoimisten ioninvaihtimien valmistamisen. Jotta syntyvillä ioninvaihtimilla olisi riittävän korkeat suorituskykyominaisuudet, niiden on oltava liukenemattomia, mutta sopivassa liuottimessa turpoavia ja niissä on oltava riittävän suuri määrä ionogeenisiä ryhmiä, jotka voivat vaihtua analysoitavan näytteen ionogeenisten ryhmien kanssa. Tämä voidaan saavuttaa, jos tuloksena olevat polymeeriketjut ovat riittävän haaroittuneita ja kytketty toisiinsa silloitussiltojen avulla. Esimerkiksi valmistettaessa styreeniin perustuvia polymerointityyppisiä kationinvaihtimia, silloitusaineena käytetään useimmiten divinyylibentseeniä, jonka lisääminen jopa 16 %:n määränä varmistaa eriasteisten turpoamis- ja turpoamisasteisten ioninvaihtimien valmistuksen. Näin ollen mahdollistaa ioninvaihtimen huokoisuuden säätelyn. Ioninvaihtimen turpoamisaste, ilmaistuna millilitraa/grammaa, on 1 g:n tilavuus ilmakuivaa ioninvaihdinta, joka on pakattu kolonniin.

Ioninvaihdin absorboi pääsääntöisesti yhtä liikkuvassa faasissa olevista vastaioneista - ioneista, eli sillä on tietty selektiivisyys. Ionien affiniteettisarja tai selektiivisyys erityyppisiin ioninvaihtimiin nähden on kokeellisesti määritetty. Esimerkiksi alhaisilla liuoskonsentraatioilla vahvasti happamissa kationinvaihtimissa ionit, joilla on sama varaus, sorboituvat seuraavassa järjestyksessä:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Erivaraisilla ioneilla sorptio kasvaa varauksen kasvaessa:

Na+ Ca 2+

Ioninvaihtoreaktion olosuhteiden muuttaminen voi kuitenkin johtaa sarjan kääntymiseen. Affiniteettisarjat on perustettu myös anioninvaihtimia varten. Esimerkiksi anionien sorboituvuus vahvoilla perusanioninvaihtimilla kasvaa seuraavassa järjestyksessä:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Ioninvaihtajat, jotka sisältävät rakenteeltaan vahvasti happamia tai vahvasti emäksisiä ryhmiä, tulevat ioninvaihtoreaktioihin minkä tahansa liuoksessa olevien ionien kanssa, joiden varaukset ovat samanmerkkisiä kuin vastaionin etumerkki. Tällaisia ​​ioninvaihtimia kutsutaan universaaleiksi.

Analyytin ja ioninvaihtimen välinen ioninvaihtoprosessi voidaan suorittaa jollakin kolmesta tavasta: staattinen, dynaaminen (ioninvaihtosuodatinmenetelmä) ja kromatografinen.

Staattinen menetelmä ioninvaihto tarkoittaa sitä, että ioninvaihtimen näyte saatetaan kosketuksiin tietyn tilavuuden kanssa ja sitä sekoitetaan tai ravistellaan tietyn ajan, kunnes tasapaino saavutetaan. Tämä on nopea ja yksinkertainen ioninvaihtomenetelmä, jota käytetään ionien konsentroimiseen laimeista liuoksista poistaen tarpeettomat epäpuhtaudet, mutta se ei takaa ionien täydellistä imeytymistä, koska ioninvaihto on epätasapainoinen prosessi, eikä sen seurauksena taata täydellistä erotusta. ioneista.

Ioninvaihtoa suoritettaessa dynaamisella tavalla ioninvaihtimella johdetaan kolonnin läpi liuos, joka liikkuessaan kolonnia pitkin joutuu kosketuksiin uusien ioninvaihdinrakeiden kanssa. Tämä prosessi tarjoaa täydellisemmän vaihdon kuin staattinen menetelmä, koska vaihtotuotteet poistetaan liuosvirtauksella. Ne pystyvät konsentroimaan ioneja laimeista liuoksista ja erottamaan ominaisuuksiltaan suuresti erilaisia ​​ioneja, esimerkiksi erivaraisia ​​ioneja (erottelevat kationit anioneista), mutta saman varausmerkin ionien erottaminen on lähes mahdotonta. Tällaisten ionien kvantitatiivinen erottaminen on mahdollista vain toistumalla sorptio-desorptio-alkuainetoimia dynaamisissa olosuhteissa, ts. kromatografinen menetelmä . Tällä menetelmällä työskennellessä käytetään korkeita ioninvaihtimen kerroksia ja erotettavaa seosta syötetään tähän kerrokseen huomattavasti vähemmän kuin kolonnin kapasiteetti, minkä ansiosta varmistetaan ioninvaihtoelementtien useat toistot.

Analyysitekniikoiden kannalta ioninvaihtokromatografia on samanlainen kuin molekyylikromatografia, ja se voidaan suorittaa käyttämällä eluenttia (kehitys), frontaalia ja syrjäytysvaihtoehtoja. Erona molekyyli- ja ioninvaihtokromatografian välillä on se, että molekyylikromatografiassa seoksen erotetut komponentit eluoidaan pylväästä puhtaalla eluentilla, kun taas ioninvaihtokromatografiassa käytetään elektrolyyttiliuosta eluenttina. Tässä tapauksessa eluentin vaihtunut ioni tulisi sorboida vähemmän selektiivisesti kuin mikään erotettavan seoksen ioneista.

Yleisimmin käytettyä kehitys-ioninvaihtokromatografiaa suoritettaessa ioninvaihtimella täytetty kolonni pestään ensin elektrolyyttiliuoksella, kunnes kaikki sen ionit on korvattu kokonaan ioninvaihtimessa eluentin sisältämillä ioneilla. Sitten kolonniin syötetään pieni tilavuus analyytin liuosta, joka sisältää erotettuja ioneja noin 1 % ioninvaihtokapasiteetista. Seuraavaksi pylväs pestään eluenttiliuoksella, valitaan eluaattifraktiot ja analysoidaan ne.

Cl – , Br – , J – ionien seos voidaan erottaa erittäin emäksisellä anioninvaihtimella (silloitettu polystyreeni, joka sisältää kvaternaarisia ammoniumemäsryhmiä – N (CH 3) 3 +), esimerkiksi AB-17, joka sillä on useita selektiivisyyttä (selektiivisyyttä): NO 3 – Cl – Br – J – . Tämän seurauksena NaNO 3 -liuosta käytetään eluenttina. Ensin tämä liuos johdetaan ioninvaihtimen läpi, kunnes se on täysin kyllästetty NO 3 -ioneilla. Kun erotettava seos viedään kolonniin, anioninvaihtaja absorboi Cl – , Br – , J – ionit ja syrjäyttää NO 3 – ionit. Kun kolonni pestään sen jälkeen NaNO 3 -liuoksella, anioninvaihtimen ylemmissä kerroksissa olevat Cl – , Br – , J – ionit korvataan vähitellen jälleen NO 3 – ioneilla. Cl – ionit syrjäytyvät nopeimmin ja J – ionit pysyvät kolonnissa pisimpään. Ero ioninvaihtimen selektiivisyydessä seoksen ioneihin nähden johtaa siihen, että kolonnissa muodostuu erillisiä sorboituneiden Cl – , Br – ja J – ionien vyöhykkeitä, jotka liikkuvat kolonnia pitkin eri nopeuksilla. Kun liikut saraketta pitkin, vyöhykkeiden välinen etäisyys kasvaa. Kullakin vyöhykkeellä on vain yksi erotettavan seoksen anioneista ja vyöhykkeiden välissä on vain eluenttianioni. Siten kolonnin ulostulossa olevaan eluenttiin ilmaantuu fraktioita, jotka sisältävät erotettavan seoksen yksittäisiä komponentteja.

Käytännön ongelmien ratkaisemiseksi ionien erotuksen olosuhteita muutetaan valitsemalla sopiva liikkuva faasi (koostumus, pitoisuus, pH, ionivahvuus) tai muuttamalla ioninvaihtimen polymeerimatriisin huokoisuutta eli ketjujen välisten sidosten määrää matriisia ja luoda ioninvaihtoseuloja, jotka ovat läpäiseviä joillekin ioneille ja pystyvät vaihtamaan niitä ja läpäisemättömiä toisille. On myös mahdollista muuttaa ionogeenisten ryhmien luonnetta ja suhteellista järjestystä sekä saada sorbentteja, jotka kykenevät selektiivisiin kemiallisiin reaktioihin kompleksin muodostumisen vuoksi. Esimerkiksi komplekseja muodostavilla ioninvaihtimilla, jotka sisältävät rakenteessa kelatoivia ryhmiä orgaanisia reagensseja dimetyyliglyoksiimia, dititsonia, 8-hydroksikinoliinia jne. sekä kruunueettereitä, on korkea selektiivisyys.

Eniten ioninvaihdossa, ioni- ja ioniparikromatografiassa käytetään synteettisiä makro- ja mikroverkko-orgaanisia ioninvaihtimia, joilla on suuri vaihtokapasiteetti (3–7 mmol/g), sekä epäorgaanisia ioninvaihtomateriaaleja. Mikroverkko-ioninvaihtimet pystyvät vaihtamaan ioneja vain turvonneessa tilassa, kun taas makroverkko-ioninvaihtimet pystyvät vaihtamaan ioneja vain turvonneissa ja turvotuksissa. Toinen ioninvaihtimien rakenteellinen tyyppi ovat pintakalvo-ioninvaihtimet, joiden kiinteä ydin on valmistettu ei-huokoisesta styreenin ja divinyylibentseenin kopolymeeristä, lasista tai silikageelistä ja jota ympäröi ohut ioninvaihdinkalvo. Tällaisen hiukkasen kokonaishalkaisija on noin 40 um, ioninvaihtokalvon paksuus on 1 um. Tällaisten ioninvaihtimien haittana on suhteellisen suuri hiukkashalkaisija ja alhainen vaihtokapasiteetti pienestä ominaispinta-alasta johtuen, minkä seurauksena on tarpeen työskennellä pienillä näytteillä ja vastaavasti käyttää erittäin herkkiä ilmaisimia. Lisäksi tällaiset ioninvaihtimet myrkytetään nopeasti eivätkä pysty uusiutumaan.

Suorituskykyisessä ioninvaihdossa ja ionikromatografiassa tilavuushuokoisissa polystyreeni-ioninvaihtimissa, tilavuushuokoisissa piidioksidissa, joiden rakeiden halkaisija on noin 10 mikronia, sekä käytännöllisesti katsoen turpoamattomia pintahuokoisia ja pintamodifioituja styreenin ja divinyylibentseenin kopolymeerejä ionogeenisen sulfon kanssa - ja aminoryhmiä käytetään.

Ioniparikromatografiassa käytetään "harja" sorbentteja - silikageelejä, joissa on oksastettu käänteisfaasi C 2, C 8, C 18, jotka muuttuvat helposti kationinvaihtajaksi, kun ne absorboivat liikkuvasta faasista ionisia pinta-aktiivisia aineita, esimerkiksi alkyylisulfaatteja tai kvaternääristen ammoniumemästen suolat.

Kun kromatografinen erotus suoritetaan ioninvaihtimia käyttäen, liikkuvana faasina käytetään useimmiten suolojen vesiliuoksia. Tämä johtuu siitä, että vedellä on erinomaiset liukenemis- ja ionisointiominaisuudet, joiden ansiosta analysoitavan näytteen molekyylit dissosioituvat välittömästi ioneiksi, ioninvaihtimen ioninvaihtoryhmät hydratoituvat ja myös muuttuvat täysin tai osittain dissosioituneeseen muotoon. Tämä varmistaa nopean vastaionien vaihdon. Liikkuvan faasin eluointivoimakkuuteen vaikuttavat pääasiassa pH, ionivahvuus, puskuriliuoksen luonne ja orgaanisen liuottimen tai pinta-aktiivisen aineen pitoisuus (ioniparikromatografia).

pH-arvo valitaan ionogeenisten ryhmien, erotettujen ionien ja matriisin luonteen mukaan. Voimakkaasti happamilla ja vahvasti emäksisillä ioninvaihtimilla voi työskennellä pH = 2-12, heikosti happamilla pH = 5-12, heikosti emäksisten ioninvaihtimien kanssa pH = 2-6. Piidioksidipohjaisia ​​sorbentteja ei saa käyttää pH:ssa 9. Liikkuvan faasin ionivahvuus vaikuttaa ioninvaihtimen kapasiteettiin. Ionivahvuuden kasvaessa ionien sorptio yleensä vähenee liikkuvan faasin eluutiovoiman kasvaessa. Siksi liikkuvan faasin ionivahvuuden tulisi erotuksen alussa olla alhainen (0,05–0,1), eikä tämän ominaisuuden lopullinen arvo saa ylittää 2:ta. Gradienttieluutiossa käytetään usein puskureita, joiden ionivahvuus kasvaa.

Ioninvaihtimen absorboimien ionien selektiiviseen eluointiin voit käyttää vettä, puskuriliuoksia (fosfaatti, asetaatti, boraatti, hiilikarbonaatti jne.), joilla on tietty pH-arvo ja ionivahvuus, mineraaliliuoksia (kloorivety, typpi, rikki, fosfori) ja orgaaniset (fenoli-, sitruuna-, maito-, viini-, oksaali-, EDTA) hapot. Eluentin valintaa helpottaa se, että useimpien alkuaineiden rajoittavat jakautumiskertoimet monien kompleksanttien vesipitoisten (vesi-orgaanisten) liuosten ja standardityyppisten ioninvaihtimien välillä on määritetty ja esitetty taulukoissa.

1.6.4. Kokoekskluusiokromatografia. Kokoekskluusiokromatografia on nestekromatografian tyyppi, jossa komponenttien erottelu perustuu molekyylien jakautumiseen niiden koon mukaan sorbentin huokosissa sijaitsevan liuottimen ja sen hiukkasten välillä virtaavan liuottimen välillä. Erotusprosessin aikana pienet molekyylit pääsevät polymeeriverkostoon, jonka huokosissa liuotin toimii kiinteänä faasina ja pysyy siellä. Suuret molekyylit eivät pääse tunkeutumaan polymeeriverkostoon, ja liikkuva faasi huuhtoutuu pois kolonnista. Ensin eluoituvat suurimmat molekyylit, sitten keskikokoiset ja lopuksi pienet.

Kokoekskluusiokromatografia jaetaan geelipermeaatioon ja geelisuodatukseen. Geelipermeaatiokromatografiassa erottuminen tapahtuu polymeereissä, jotka turpoavat orgaanisissa liuottimissa. Kokoekskluusiokromatografian geelisuodatusversio sisältää vedessä turpoavien polymeerien käytön kiinteänä faasina.

Analysoidun näytteen komponenttien retention kesto kokoekskluusiokolonnissa riippuu niiden molekyylien koosta ja diffuusiosta sorbentin huokosiin sekä stationaarifaasin huokoskoosta.

Tämän tyyppisessä nestekromatografiassa jakautumiskerroin D analysoitavan näytteen pienimmille molekyyleille, jotka liikkuvat kromatografisessa kolonnissa pienimmällä nopeudella tunkeutuen kiinteän faasin verkkoon, se on yhtä suuri kuin 1, koska liikkuvalla faasilla ja kiinteän faasin huokosissa sijaitsevalla liuottimella on sama koostumus. Tässä tapauksessa pylväskromatografian perusyhtälö saa muodon

Suuret molekyylit, jotka eivät sovi kiinteän faasin huokosiin, eluoituvat kolonnista liikkuvan faasin mukana. Heille D= 0, a V R =V m. Tämä jakautumiskerroinarvojen alue (0 - 1) on tyypillinen vain kokoekskluusiokromatografialle.

Kaikki analysoitavan monikomponenttiaineen molekyylit tulee pestä pois kolonnista johtamalla pieni tilavuus liuotinta V m ennen V m +V s ja erotus päättyy ennen kuin liuotinpiikki vapautuu. Siksi tämän tyyppisessä kromatografiassa on välttämätöntä käyttää melko pitkiä kolonneja, joissa on suuri vapaa tilavuus V m ja suuri määrä huokosia sorbentissa.

Kromatografisten piikkien erottelukykyä kokoekskluusioerotteluissa voidaan parantaa käyttämällä gradienttieluointia liuottimien seoksella.

Jokaiselle kokoekskluusiokromatografiassa käytettävälle sorbentille on tunnusomaista tietty huokostilavuus, ja siksi sillä on tietty alue erotettavissa olevia molekyylipainoja ja tietty kalibrointikäyrä. Tässä tapauksessa säilytetyn tilavuuden riippuvuutta molekyylipainosta tai molekyylikoosta kuvaavalla kalibrointikäyrällä on pääsääntöisesti monimutkainen ulkonäkö.

Kokoekskluusiokromatografiassa kiinteät faasit valitaan erityisten analyyttisten tehtävien perusteella. Aluksi selvitetään, mitä liuotinjärjestelmää voidaan käyttää analysointiin (vesipitoinen vai vesipitoinen-orgaaninen). Tästä riippuen määritetään sorbentin tyyppi. Jos vesiliukoisia näytteitä on tarpeen erottaa, esim. vedessä turpoavia silloitettuja dekstraaneja (Sephadex) tai polyakryyliamideja (Biogel R) käytetään kiinteänä faasina. Orgaanisiin liuottimiin liukenevien aineiden erotus voidaan suorittaa polystyreeneille, joilla on vaihteleva silloitusaste, turpoaminen orgaanisissa liuottimissa (styrogeeli, porageeli, biobid C). Tällaiset turvonneet geelit ovat tyypillisesti paineepävakaita ja mahdollistavat erittäin alhaiset liikkuvan faasin virtausnopeudet, mikä lisää analyysiaikaa. Kokoekskluusiokromatografian erittäin tehokkaan version toteuttamiseksi on tarpeen käyttää stationäärisiä faaseja jäykillä matriiseilla – silikageeleillä, joiden haittapuoli – korkea adsorptioaktiivisuus – eliminoidaan silanoimalla pinta tai valitsemalla sopiva eluentti. vastakkaisuus.

Aineita, joita voidaan käyttää liikkuvina faaseina kokoekskluusiokromatografiassa, ovat:

- liuottaa analysoitu näyte kokonaan;

 kostuta sorbentti hyvin;

- ehkäisee näytekomponenttien adsorptiota sorbenttiin;

 niillä on alhainen viskositeetti ja myrkyllisyys.

1.6.5. Tasokromatografia. Tasokromatografia sisältää ohutkerroskromatografian ja paperikromatografian. Tämäntyyppiset nestekromatografiat ovat tekniikaltaan yksinkertaisia, nopeita eivätkä vaadi kalliita laitteita, mikä on niiden kiistaton etu.

Aineseoksen erottaminen näillä menetelmillä voidaan suorittaa käyttämällä erilaisia ​​kromatografisia järjestelmiä. Siksi erotetaan adsorptio-, jakautumis-, normaali- ja käänteisfaasi-, ioninvaihto- jne. paperi- ja ohutkerroskromatografia. Tällä hetkellä ohutkerroskromatografiaa käytetään laajimmin.

Paperi- ja ohutkerroskromatografia ovat tekniikaltaan samanlaisia. Paperin selluloosakuitua käytetään kiinteänä faasina paperikromatografiassa, erilaisia ​​sorbentteja (Al 2 O 3, silikageeli jne.) levitetään tasaisena ohuena (100–300 μm) kerroksena lasille, metalli- tai muovisubstraatti (kantoaine) . Telineessä oleva adsorbenttikerros voi olla kiinnitetty tai ei.

Kromatografinen erotus tasomaisissa menetelmissä sekä kolonnissa johtuu siitä, että liikkuva faasi siirtää analyytin komponentteja pitkin stationaarifaasikerrosta eri nopeuksilla erotettavien aineiden jakautumiskertoimien mukaisesti. Molemmissa tapauksissa käytetään kromatografisia järjestelmiä: neste - kiinteä sorbentti (adsorptioerotusmekanismi), neste - neste - kiinteä kantaja (jakauma, ioninvaihto ja muut mekanismit).

Liikkuvina faaseina käytetään erilaisia ​​liuottimia tai niiden seoksia, orgaanisia tai epäorgaanisia happoja.

Tasomaisten kromatogrammien käytännön tuotanto on seuraava.

Merkitse kromatografiapaperinauhalle tai ohuelle sorbenttikerrokselle aloitusviiva lyijykynällä 1 cm:n etäisyydelle nauhan tai levyn alareunasta. Levitä näyte mikropipetillä lähtöviivalle täplän muodossa, jonka halkaisija on enintään 2–3 mm. Nauhan tai levyn reuna lasketaan sitten astiaan, joka sisältää liikkuvan faasin, joka sijaitsee suljetussa kammiossa. Liikkuvan faasin noustessa nauhaa tai levyä pitkin ja kromatografiassa yleisiä sorptio-desorptio, jakautuminen kahden nestefaasin välillä, ioninvaihto jne. tapahtuu useita elementaarisia elementtejä, analysoidun seoksen komponentit erottuvat. Prosessia jatketaan yleensä, kunnes liuotin kulkee lähtöviivalta 10 cm. Tämän jälkeen liuska tai levy poistetaan kammiosta ja kuivataan. Jos analyytin komponentit ovat värillisiä, ne antavat vastaavat värilliset täplät kromatogrammiin. Kromatogrammi on kehitettävä analyytin värittömien komponenttien havaitsemiseksi. Kromatogrammin kehittäminen ja näytteen komponenttien havaitseminen voidaan suorittaa eri menetelmillä, ja ne riippuvat analysoitavien seosten koostumuksesta. Manifestaatio voidaan suorittaa:

- UV-valon käyttö. Menetelmä soveltuu sellaisten aineiden havaitsemiseen, jotka pystyvät lähettämään omaa säteilyään (luminesenssia) näkyvällä aallonpituusalueella UV-säteilyn vaikutuksesta;

- kehittämällä reagensseja. Esimerkiksi aminohappojen läsnäolo analysoitavassa seoksessa voidaan havaita käyttämällä ninhydriiniä. Kuivattu kromatogrammi upotetaan 0,2-prosenttiseen ninhydriinin asetoniliuokseen ja kuivataan sitten. Seoksen eri komponentteja vastaavat täplät saavat kullekin aineelle ominaisen visuaalisen ja yleensä värin;

- käyttää jodia. Tässä tapauksessa havaittu kromatogrammi viedään astiaan, jonka pohjassa on jodikiteitä. Jodihöyry adsorboituu voimakkaammin pisteisiin, jolloin täplät näkyvät. Jodi on epäspesifinen kehitereagenssi. Tiettyjä reagensseja käyttämällä on mahdollista paitsi määrittää seoksen komponenttien lukumäärää, myös tunnistaa erotetut aineet täplien värin perusteella.

Paperi- ja ohutkerroskromatografia suoritetaan useimmiten edellä kuvatussa ns. nousevassa versiossa. Melko usein kromatogrammien laadun parantamiseksi on tarpeen käyttää tasomaisen kromatografian monimutkaisempia variantteja, esimerkiksi laskevaa, pyöreää, kaksiulotteista. Laskevaa paperi- tai ohutkerroskromatografiaa suoritettaessa analyytti levitetään päällä olevan levyn tai paperiliuskan aloitusviivalle ja eluenttia ei syötetä alhaalta, vaan ylhäältä. Erotuksen parantamisen positiivinen vaikutus johtuu komponenttien painovoiman vaikutuksesta erotusprosessiin.

Sekä nouseva että laskeva kromatografia voidaan suorittaa yksi- ja kaksiulotteisina versioina. Toisin kuin edellä kuvatussa yksiulotteisessa tasokerroserotuksessa, kaksiulotteisessa kromatografisessa erotuksessa analysoitava näyte erotetaan ensin yhdessä liuottimessa, sitten erotetaan ensimmäiseen nähden kohtisuoraan toiseen liuottimeen nähden, ensimmäistä kromatogrammia kiertäen. 90 o C asti.

Pyöreäkromatografiaa suoritettaessa analyyttiä levitetään pisarana levyn tai kromatografiapaperiarkin keskelle. Tähän lisätään myös tipoittain yksi tai useampi liuotin. Tämä johtaa siihen, että tuloksena oleva kromatogrammi on joukko säteittäisiä pisteitä.

Analyytin erotetut komponentit muodostavien pisteiden (vyöhykkeiden) sijainti litteässä kromatogrammissa on ominaista komponenttien suhteellisella liikenopeudella ohuessa kerroksessa. R fi. Kokeellinen arvo R fi määritellään etäisyyden suhteeksi L i läpäissyt i-. komponentti, etäisyyteen L liuotin kulkee lähtöviivasta etulinjaan (kuva 1.10):

Suuruus R fi riippuu analysoitavan näytteen vastaavan komponentin laadusta, stationaarifaasin luonteesta, sen paksuudesta, liikkuvan faasin laadusta ja laadusta, näytteen levitysmenetelmästä ja muista tekijöistä, mutta aina R fi 1.

Suuruus R fi on itse asiassa identtinen aineen retentioajan tai sen retentiotilavuuden kanssa, joka kuvaa aineen kulkunopeutta kromatografisen kolonnin läpi ja jota voidaan käyttää analysoitavan näytteen komponenttien ja täplän halkaisijan kvalitatiiviseen tunnistamiseen. on identtinen kromatografisen piikin korkeuden tai alueen kanssa ja heijastaa siksi jossain määrin aineen kvantitatiivista sisältöä.

Yksinkertaisimmassa tapauksessa analysoitavan näytteen koostumuksen kvantitatiivinen määritys voidaan arvioida visuaalisesti pilkkujen oman värin intensiteetillä tai syntyneiden täplien fluoresoivan hehkun voimakkuudella UV-detektiossa. Näihin tarkoituksiin käytetään laajalti kromatografisten pisteiden eluointia. Tässä tapauksessa kromatogrammista saatu täplä leikataan varovasti pois tai raavitaan pois, käsitellään sopivalla liuottimella ja saatu liuos tutkitaan sopivalla fysikaalis-kemiallisella menetelmällä. Voit myös käyttää painomenetelmää, jossa vastaava piste leikataan kromatogrammista ja punnitaan. Aineen määrä määräytyy saman alueen puhtaan paperin ja ainetta sisältävän paperin painojen eron perusteella.

Paperi (BH ) Ja ohutkerroskromatografia (TLC ) erotusmekanismin mukaan kuuluvat partitiokromatografia . BH-menetelmässä kantaja on erityinen kromatografiapaperia tietyillä ominaisuuksilla. Kiinteä vaihe vettä adsorboituu paperin pintaan ja huokosiin (jopa 20 %), liikkuva on orgaaninen liuotin, sekoittuva tai sekoittumaton veteen, veteen tai elektrolyyttiliuoksiin.

Mekanismi Paperilla se on melko monimutkaista. Kiinteässä faasissa aine voi jäädä paitsi paperiin adsorboimaan veteen liukenemisen vuoksi myös adsorboitua suoraan selluloosasta. Painettu paperille jaetut komponentit siirtyvät liikkuvaan faasiin ja kulkevat paperin kapillaarien läpi eri nopeuksilla rajapinnan jakautumiskerroin jokainen heistä. Ensiksi kromatografia osa paperin aineesta menee sisään liikkuva vaihe ja jatka eteenpäin. Kun orgaaninen liuotin saavuttaa paperin osan, joka ei sisällä liuennutta ainetta, se tapahtuu uudelleen. uudelleenjako : orgaanisesta faasista aine siirtyy vesifaasiin, sorboituna paperille. Koska komponentit ovat erilaisia affiniteetti sorbentille , kun eluentti liikkuu, tapahtuu erottuminen: jotkut aineet jäävät polun alkuun, toiset liikkuvat kauemmas. Tässä ne yhdistyvät termodynaaminen (aineiden tasapainojakauman luominen faasien välillä) ja kineettinen (komponenttien liikkuminen eri nopeuksilla) erottamisen näkökohdat. Tämän seurauksena jokainen komponentti keskittyy tietylle paperiarkin alueelle: yksittäisten komponenttien vyöhykkeet päällä kromatogrammi . Kromatografian käytöllä paperilla on useita merkittäviä haittoja: erotusprosessin riippuvuus paperin koostumuksesta ja ominaisuuksista, paperin huokosten vesipitoisuuden muutokset varastointiolosuhteiden muuttuessa, erittäin alhainen kromatografianopeus ( jopa useita päiviä) ja tulosten alhainen toistettavuus. Nämä puutteet vaikuttavat vakavasti paperikromatografian leviämiseen kromatografisena menetelmänä.

SISÄÄN TLC-menetelmä aineseoksen erotusprosessi suoritetaan ohuella kerroksella sorbentti , kerrostetaan inertille kiinteälle alustalle ja saadaan aikaan liikkeellä liikkuva vaihe (liuotin) sorbentin läpi vaikutuksen alaisena kapillaarivoimat . Tekijä:erotusmekanismi erottaa partitio-, adsorptio- ja ioninvaihtokromatografia . Komponenttien erottuminen tapahtuu näissä tapauksissa joko niiden erilaisen jakautumiskertoimen seurauksena kahden nestefaasin välillä ( partitiokromatografia ), tai johtuen yhdisteiden erilaisesta adsorboitumisesta sorbentin toimesta ( adsorptiokromatografia ). Adsorptiomenetelmä perustuu eriasteisiin erottuneiden komponenttien sorptio-desorptio-asteisiin stationaarifaasissa. Adsorptio suoritetaan kustannuksella van der Waalsin joukot , joka on perusta fyysinen adsorptio , polymolekyylinen (useiden adsorbaattikerrosten muodostuminen adsorbentin pinnalle) ja kemisorptio (adsorbentin ja adsorbaatin kemiallinen vuorovaikutus).

Käytettäessä TLC:hen sellaisia ​​sorbentteja kuin alumiinioksidi tai silikageeli näyttelevät roolia erottamisessa jakelu , niin adsorptio sorbentin kehittyneelle aktiiviselle pinnalle (150–750 m 2 /g). Jakelu seoksen komponentteja esiintyy kantoaineen pinnalla olevan veden välillä (esim adsorbentit , Miten alumiinioksidi , tärkkelys , selluloosa , kieselguhr - Ja vettä muodossa paikallaan oleva vaihe ), ja liuotin liikkuu tämän stationaarifaasin läpi ( liikkuva vaihe ). Seoksen veteen liukeneempi komponentti liikkuu hitaammin kuin se, joka liukenee liikkuvaan faasiin.

Adsorptio ilmenee siinä, että välillä harjoittaja esim. alumiinioksidi, ja seoksen komponentit saadaan selville adsorptiotasapainot – jokaisella komponentilla on omansa, jonka tulos on erilaisia ​​liikkumisnopeuksia seoksen komponentit. Voidaan erottaa kaksi ääritapausta:

a) aineen pitoisuus adsorbentissa on nolla. Aine liukenee täysin liikkuvaan faasiin ja kulkeutuu sen mukana (liikkuu mukana liuotinrintama ).

b) aine on täysin adsorboitunut, ei ole vuorovaikutuksessa liuottimen kanssa ja pysyy alussa.

Käytännössä liuottimen ja adsorptioaineen taitavalla valinnalla jakelu yhdisteet sijaitsevat näiden ääritapausten ja aineen välillä vähitellen siirretty sorbenttikerroksesta toiseen samanaikaisesti tapahtuvien prosessien vuoksi sorptio Ja desorptio .

Sorbentin läpi kulkevaa liuotinta kutsutaan eluentti , prosessi, jossa aine liikkuu yhdessä eluentin kanssa  eluoimalla . Kun neste liikkuu levyä pitkin, aineseos erottuu voimien vaikutuksesta adsorptio , jakelu , ioninvaihto tai kaikkien näiden tekijöiden yhdistelmä. Tämän seurauksena erillään kromatografiset vyöhykkeet seoksen komponentit, ts. se käy ilmi kromatogrammi .

Oikea valinta sorbentti Ja eluentti määrittää seoksen erotuksen tehokkuuden. Testiaineen liikkuvuus riippuu sen affiniteetista sorbentille ja eluointivoima eluentin (polariteetti). Kun yhdisteen polariteetti kasvaa, myös sen affiniteetti polaariseen sorbenttiin kasvaa. Lisäämällä adsorptioastetta silikageeli orgaaniset yhdisteet on järjestetty riviin: hiilivedyt<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь silikageelille eluentit voidaan järjestää kasvavaan "polariteettiin" ( eluointikapasiteetti ) ja muodostaa sarja liuottimia ( eluotrooppinen sarja ) kokeellisten tietojen mukaan: alkaanit>bentseeni>kloroformi>dietyylieetteri>etyyliasetaatti>C2-C4-alkoholit>vesi>asetoni>etikkahappo>metanoli. Siten polaarinen yhdiste, alkoholi, adsorboituu melko voimakkaasti silikageeliin ja liikkuu siksi heikosti ei-polaarisen liuottimen, kuten heksaanin, vaikutuksesta ja pysyy lähellä lähtöviivaa. Polaariton aromaattinen hiilivetybifenyyli puolestaan ​​on huomattavasti liikkuvampi heksaanissa, mutta jopa täällä saavuttaakseen R f noin 0,5, tarvitaan polaarisempi aproottinen eluentti - metyleenikloridi. Eluentin vahvuus säätele käyttämällä viereisten liuottimien seoksia eluotrooppinen sarja eri polariteetilla.

Tällä hetkellä TLC:ssä käytetään pääasiassa seuraavia: sorbentit : jakoon lipofiiliset aineet  silikageeli , alumiinioksidi , asetyloitu selluloosa , polyamidit ; erottamista varten hydrofiiliset aineet  selluloosa , selluloosan ioninvaihtimia , kieselguhr , polyamidit . Sorbentin tärkein ominaisuus on sen toiminta , eli kyky sorb (pidä) erotettavan seoksen komponentit. Ulkomailla useat yritykset valmistavat silikageeli , kieselguhr Ja alumiinioksidi lisättynä 5 % kipsiä, jota käytetään sorbenttikerroksen kiinnittämiseen levyjen itsenäisessä valmistuksessa.

Yleisin sorbentti on silikageeli - hydratoitu piihappo, joka muodostuu mineraalihappojen vaikutuksesta Na 2SiO 3:een ja kuivaamalla saatu sooli. Soolin jauhamisen jälkeen käytetään tietyn raekoon fraktiota (merkitty levylle, yleensä 5-20 mikronia). Silikageeli On polaarinen sorbentti OH-ryhmät aktiivisina keskuksina. Se imee helposti vettä pinnalle ja muodostaa vetysidoksia.

Alumiinioksidi on heikosti emäksinen adsorbentti ja sitä käytetään pääasiassa heikosti emäksisten ja neutraalien yhdisteiden erottamiseen. Alumiinioksidilevyjen haittana on pinnan pakollinen aktivointi ennen käyttöä uunissa korkeissa lämpötiloissa (100-150 o C) ja kerroksen alhainen adsorptiokyky silikageeliin verrattuna.

Piimaa - luonnollisista mineraaleista saatu adsorbentti - piimaa. Sorbentilla on hydrofiilisiä ominaisuuksia ja kerroksen pienempi adsorptiokyky verrattuna silikageeliin.

Selluloosa: selluloosalla päällystetyt ohutlevyt ovat erittäin tehokkaita monimutkaisten orgaanisten molekyylien erottamisessa. Adsorbentti koostuu pääasiassa selluloosahelmistä, joiden halkaisija on enintään 50 mikronia ja jotka on kiinnitetty tärkkelyksellä olevaan kantajaan. Kuten paperikromatografiassa, liuotinrintaman nousu tapahtuu hyvin hitaasti.

Kromatografinen analyysi suoritetaan Tšekin tasavallassa valmistetuilla teollisuuslevyillä" Silufol » (« Silufol ") valmistettu alumiinifoliosta, joskus vahvistettu pahvilla, ja " Siluplast » valmistettu muovista, päällystetty sorbenttikerroksella - silikageeli LS 5-40, jossa on tärkkelystä tai kipsiä sideaineena (enintään 10 %), tai alumiinioksidia fluoresoivien indikaattoreiden kanssa tai ilman. Levyt « Silufol » niillä on korkea eluutionopeus, mutta niille on ominaista alhainen erotuskyky ja alhainen herkkyys. Säilytyksen aikana ne ovat herkkiä olosuhteille (kosteus, lämpötila, aggressiiviset ympäristöt jne.). Jotkut yritykset toimittavat kromatografialevyt sorbenttikerroksella, jonka paksuus vaihtelee (yleensä jopa 0,25 mm), mutta täysin vakio (silikageeli, selluloosa, ioninvaihtohartsi), lasille ja alustoille, jotka on valmistettu alumiinifoliosta, muovista, kyllästetystä lasikuidusta.

Lautaset « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) valmistetaan Venäjällä polymeeripohjalle (polyeteenitereftalaatti, luokka P) tai alumiinisubstraatille (laatu AF), jossa on levitetty työkerros mikrofraktioitu silikageelisorbentti laatuluokat STX-1A ja STX-1VE (tuotettu Neuvostoliitossa fraktioituna silikageelinä KSKG), paksuus 90-120 mikronia (jopa 200 mikronia), kiinnitetty erityisellä sideaineella - piidioksidisooli . Käytettäessä sideaineena piihapposoolia (silikasoolia), joka kuumennuksen jälkeen muuttuu silikageeliksi, muodostuvat TLC-levyt koostuvat kahdesta komponentista: silikageelikerroksesta ja substraatista. Sorbenttikerroksen paksuuden tasaisuus yhdellä levyllä on ±5 µm. Esimerkki merkinnästä: "Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)" - korkean suorituskyvyn TLC-levyt alumiinisubstraatilla, fosforilla, 10x10 cm.

Jos käytät lasialustaa (luokka C), tällaiset levyt ovat uudelleenkäytettäviä ja kemiallisesti kestäviä. Niiden kemiallinen kestävyys määräytyy silikageelin kemiallisen kestävyyden mukaan. Tämän seurauksena TLC-levyjä voidaan käsitellä toistuvasti aggressiivisilla reagensseilla, esimerkiksi kuumalla kromiseoksella, mikä poistaa rajoitukset korreloivien reagenssien käytöltä täplien havaitsemiseen ja sorbentin muokkaamiseen ja mahdollistaa toistuvan (jopa 30 kertaa tai enemmän). ) levyjen regenerointi kromiseoksella. Lasilevyt voidaan leikata haluttuun kokoon. Sorbenttikerroksen mekaanista lujuutta voidaan säätää, mikä mahdollistaa toisaalta levyjen kuljetuksen ja toistuvan käsittelyn ja toisaalta mahdollisuuden uuttaa adsorbenttikerrokset erotetuilla aineilla yksittäisten yhdisteiden myöhempää liuottamista varten. sorbentti ja niiden jatkotutkimus instrumentaalisilla menetelmillä (IR- ja UV-spektrometria, röntgenrakennemenetelmät, NMR jne.).

Levyt eroavat kerroksen muodostavan silikageelin fraktioiden koosta (hiukkasjakauma). Analyyttisillä levyillä (luokka A) fraktio on 5-17 mikronia, korkean suorituskyvyn levyillä (luokka B) - 8-12 mikronia. Kapeampi jakautuminen lisää levyjen tehokkuutta, ts. erottuneiden aineiden täplät tiivistyvät (pienimpiä) ja erottuvat siksi paremmin, kun eluenttirintama kulkee lyhyemmän matkan. Venäläisten kiekkojen analyyttiset ja korkean suorituskyvyn kerrokset eivät eroa kovin paljon, toisin kuin Merckin (Saksa) kiekoissa. Korkeatehoisia levyjä tulee käyttää, jos aineita ei voida erottaa analyysilevyiltä. Kaikkien modifikaatioiden levyt valmistetaan fosforilla (UV-laatu), jonka viritys on 254 nm. Säilyvyys on rajoittamaton, lautaset" Sorbfil » testattu laajasti aminohappojohdannaisten, torjunta-aineiden, lipidien ja antibioottien analysoinnissa.

TLC-menetelmä suoritetaan laadun tunnistaminen komponentit. kvantifiointi TLC on myös mahdollista, tämä edellyttää tarkan aineen ja lisämäärän lisäämistä densitometriset tutkimukset selkeällä tallennuksella täplien intensiteetistä. Yleisin on puolikvantitatiivinen menetelmä . Se perustuu visuaalinen vertailu komponentin täplän koko ja intensiteetti, jolla on saman aineen eri pitoisuuksilla olevien täplien sarjan vastaavat ominaisuudet ( standardi vertailuratkaisut ). Käytettäessä näytettä 1-5 μg, tämä yksinkertainen menetelmä varmistaa noin 5-10 %:n komponenttipitoisuuden määritystarkkuuden. Usein näytteen komponenttien määrittämiseksi on suoritettava näytteen valmistelu, jotta saadaan analysoituja yhdisteitä sisältävä seos. Näytteen valmistelu perustuu lääkkeiden uuttamiseen näytteestä orgaanisilla liuottimilla ( n-heksaani, petrolieetteri, dietyylieetteri, kloroformi), uutteen puhdistus ja seuraava kromatografia ohuessa alumiinioksidi- tai silikageelikerroksessa.

TLC:lle ja HD:lle on useita vaihtoehtoja, jotka eroavat toisistaan liuottimen tarjonta . Liikkuvan vaiheen liikesuunnasta riippuen on:

A)nouseva kromatografia - liikkuva faasi kaadetaan erotuskammion pohjalle, paperi (levy) asetetaan pystysuoraan;

b)laskeva kromatografia  liikkuva faasi syötetään ylhäältä ja liikkuu alas levyn tai paperin sorbenttikerrosta pitkin;

V)säteittäinen kromatografia  liuotinrintaman vaakasuora eteneminen: liikkuva faasi tuodaan paperikiekon (levyn) keskelle, jonne levitetään erotettava seos.

Yleisin on ylöspäin suuntautuva eluointi (kromatografia). Edessä eluentti liikuttaessa alhaalta ylös. Liuottimen (liikkuva faasi) valinta määräytyy sorbentin luonteen ja erotettavien aineiden ominaisuuksien mukaan.

Kromatografinen erotus BCh- ja TLC-menetelmillä suoritetaan vuonna erotuskammio läpäisevällä kannella. Kvantitatiivinen mitta aineen siirtymisnopeudesta käytettäessä tiettyä adsorbenttia ja liuotinta on R-arvo f (englannista säilyttäminen tekijä – viivekerroin, tämä parametri on analoginen retentioajan kanssa). asema kromatografoidun komponentin vyöhykkeet asetettu koon mukaan kerroin R f , joka on yhtä suuri kuin sen vyöhykkeen liikenopeuden suhde liuotinrintaman liikenopeuteen. Suuruus R f on aina pienempi kuin yksi eikä se riipu kromatogrammin pituudesta. Summalla R f vaikuttavat useat tekijät. Näin ollen alhaisissa lämpötiloissa aineet liikkuvat hitaammin; liuotinkontaminaatio, adsorbentin epähomogeenisuus, vieraat ionit analysoitavassa liuoksessa voivat muuttaa arvoa R f jopa 10 %. Valitussa järjestelmässä analyyteillä on oltava eri arvot R f ja jakautuvat kromatogrammin koko pituudelle. On toivottavaa, että arvot R f oli välillä 0,05-0,85.

Käytännössä arvo R f lasketaan etäisyyden suhteena l jonka aine kulkee etäisyyteen L kulkenut liuottimen läpi:

R f = l/l (6.1 )

Yleensä laskemiseen valitaan pisteen keskusta (Kuva 1). Suuruus R f riippuu monista tekijöistä: tyyppi kromatografiapaperia (sen huokoisuus, tiheys, paksuus, hydrataatioaste) ja sorbentti (raekoko, pinnalla olevien ryhmien luonne, kerroksen paksuus, sen kosteus, aineen luonne, liikkuvan faasin koostumus), koeolosuhteet (lämpötila, kromatografia-aika jne.). Jos kaikki kromatografiset parametrit ovat vakioita, arvo R f määräytyy vain kunkin komponentin yksittäisten ominaisuuksien perusteella.

Riisi. 1. Arvojen määrittäminen kromatogrammista Rf komponentteja varten A Ja SISÄÄN,

niiden erotteluaste Rs ja teoreettisten levyjen lukumäärä N .

HD:n ja TLC:n tehokkuus riippuu myös selektiivisyys ja herkkyys reaktiot, joita käytetään analysoitavan seoksen komponenttien havaitsemiseen. Tyypillisesti käytetään reagensseja, jotka muodostavat värillisiä yhdisteitä - kehitteitä - komponenttien määrittämisen yhteydessä. Luotettavammaksi jaettujen komponenttien tunnistaminen Käytä " todistajia » ratkaisut standardiaineet (samassa liuottimessa kuin näyte), jonka oletetaan olevan näytteessä. Vakioaine levitetään aloitusviivalle analysoidun näytteen viereen ja kromatografoidaan samoissa olosuhteissa. Käytännössä käytetään usein suhteellista arvoa:

R f rel = R f x / R f seisomaan (6.2)

Missä R f seisomaan lasketaan myös kaavalla (6.1). Tehokkuus kromatografinen erotus luonnehtia vastaavien teoreettisten levyjen määrä ja heidät korkeus . Siten TLC-menetelmässä ekvivalenttien teoreettisten levyjen lukumäärä N A komponentille A erotettava seos lasketaan kaavalla:

N A = 16 (l O.A. / a (A )) 2 (6.3)

Arvot l O.A. Ja A (A ) määritetty kuvan mukaisesti. 6.1. Sitten vastaavan teoreettisen levyn korkeus N A On:

H A = l O.A. /N = a (A ) 2 / 16 l O.A. . (6.4)

Ero on käytännössä mahdollista, jos R f (A)  R f (SISÄÄN)  0,1 .

Luonnehditaan kahden komponentin erottamista A Ja SISÄÄN käyttää erotusaste (kriteeri) Rs :

Rs =  l/ (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l/ (a (A) + a (B)) (6.5)

Missä  l  komponenttien keskipisteiden välinen etäisyys A Ja SISÄÄN;

A (A) Ja A (SISÄÄN)  pisteen halkaisijat A Ja SISÄÄN kromatogrammissa (kuva 6.1). Sitä enemmän Rs , sitä selvemmin komponenttipisteet erottuvat toisistaan A Ja SISÄÄN kromatogrammissa. ehdot kromatografia valittu siten, että arvo Rs erosi nollasta ja yhdestä, optimaalisesta arvosta Rs on 0,3  0.7. Hintaa varten erotteluselektiivisyys kaksi komponenttia A Ja SISÄÄN käyttää erotuskerroin α :

α = l B / l A (6.6)

Jos α = 1, niin komponentit A Ja SISÄÄN eivät ole erotettuja.

9801 0

HPLC on nestepylväskromatografia, jossa voidaan käyttää erilaisia ​​sorptiomekanismeja. Pohjimmiltaan HPLC on klassisen nestepylväskromatografian moderni muoto. Jotkut HPLC:n tärkeimmistä laatuominaisuuksista on lueteltu alla:
- prosessin suuri nopeus, joka mahdollisti erottamisen keston lyhentämisen useista tunneista ja päivistä minuutteihin;
- kromatografisten vyöhykkeiden minimaalinen hämärtymisaste, mikä mahdollistaa yhdisteiden erottamisen, jotka eroavat vain vähän sorptiovakioissa;
- Tiedon erottelun ja käsittelyn korkea koneistus ja automatisointi, jonka ansiosta pylväsnestekromatografia on saavuttanut toistettavuuden ja tarkkuuden uudelle tasolle.

Viime vuosikymmenien intensiivinen tutkimus ja valtava määrä kertynyttä kokeellista tietoa mahdollistavat nykyään puhumisen muunnelmien luokittelusta korkean suorituskyvyn nestekromatografiamenetelmän puitteissa. Tietenkin edellä annettu sorptiomekanismin mukainen luokitus pysyy voimassa.

Yleinen luokitus perustuu liikkuvan ja kiinteän vaiheen polariteettien vertailuun. Tässä tapauksessa erotetaan normaali- ja käänteisfaasikromatografia.

Normaalifaasikromatografia (NPC) on HPLC:n muunnelma, kun liikkuva faasi on vähemmän polaarinen kuin stationaarifaasi, ja on syytä uskoa, että tärkein retentiota määräävä tekijä on sorbaattien vuorovaikutus suoraan sorbentin pinnan tai tilavuuden kanssa.

Käänteisfaasikromatografia (RPC) on HPLC:n muunnos, jossa liikkuva faasi on polaarisempi kuin stationaarifaasi, ja retentio määräytyy sorbaattimolekyylien suoralla kosketuksella sorbentin pinnan tai tilavuuden kanssa; tässä tapauksessa ionisoituja sorbaatteja ei vaihdeta pinnalle sorboituneisiin liikkuvan faasin ioneihin.

Ioninvaihtokromatografia on vaihtoehto, jossa sorptio suoritetaan vaihtamalla liikkuvan faasin sorboituneet ionit kromatografioitavien aineiden ioneihin; Ligandinvaihtokromatografia voidaan määritellä täysin analogisella tavalla.

Kromatografia dynaamisesti muunnetuilla sorbenteilla on HPLC:n muunnelma, jossa sorbaatti ei ole suoraan vuorovaikutuksessa sorbentin pinnan kanssa, vaan yhdistyy eluentin pintakerrosten molekyylien kanssa.
Ioniparikromatografia on muunnos ionisoitujen yhdisteiden käänteisfaasikromatografiasta, jossa liikkuvaan faasiin lisätään hydrofobista vastaionia, joka muuttaa kvalitatiivisesti järjestelmän sorptio-ominaisuuksia.

Kokoekskluusiokromatografia on menetelmä yhdisteiden erottamiseksi niiden molekyylipainon perusteella, joka perustuu erikokoisten molekyylien diffuusionopeuden eroon stationaarifaasin huokosissa.

HPLC:ssä erittäin tärkeä ominaisuus on sorbenttien koko, yleensä 3-5 mikronia, nyt jopa 1,8 mikronia. Tämä mahdollistaa monimutkaisten aineseosten erottamisen nopeasti ja täydellisesti (keskimääräinen analyysiaika 3-30 minuuttia).

Erotusongelma ratkaistaan ​​käyttämällä kromatografiakolonnia, joka on sorbentilla täytetty putki. Analyysiä suoritettaessa tietyn koostumuksen omaavaa nestettä (eluenttia) syötetään kromatografiakolonnin läpi vakionopeudella. Tähän virtaan ruiskutetaan tarkasti mitattu annos näytettä. Kromatografiapylvääseen syötetyn näytteen komponentit liikkuvat eri affiniteeteistaan ​​johtuen pylvässorbenttia pitkin eri nopeuksilla ja saavuttavat detektoriin peräkkäin eri aikoina.

Siten kromatografinen kolonni on vastuussa komponenttien erottelun selektiivisyydestä ja tehokkuudesta. Valitsemalla erityyppisiä pylväitä voidaan hallita analyyttien erotusastetta. Yhdisteet tunnistetaan niiden retentioajan perusteella. Kunkin komponentin kvantitatiivinen määritys lasketaan analyyttisen signaalin suuruuden perusteella, joka on mitattu käyttämällä kromatografiakolonnin lähtöön kytkettyä detektoria.

Sorbentit. HPLC:n kehittäminen liittyy suurelta osin uusien sorbenttien sukupolvien luomiseen, joilla on hyvät kineettiset ominaisuudet ja monipuoliset termodynaamiset ominaisuudet. Pääasiallinen sorbenttien materiaali HPLC:ssä on silikageeli. Se on mekaanisesti vahva ja huokoinen, mikä antaa suuren vaihtokapasiteetin pienillä kolonnikooilla. Yleisin hiukkaskoko on 5-10 mikronia. Mitä lähempänä hiukkasten pallomaista muotoa, sitä pienempi virtausvastus, sitä suurempi hyötysuhde, varsinkin jos seulotaan hyvin kapea jae (esim. 7 +1 mikronia).

Silikageelin ominaispinta on 10-600 m/g. Silikageeliä voidaan modifioida erilaisilla pintaan oksastetuilla kemiallisilla ryhmillä (C-18, CN, NH2, SO3H), mikä mahdollistaa siihen perustuvien sorbenttien käytön monenlaisten yhdisteluokkien erottamiseen. Silikageelin suurin haittapuoli on sen alhainen kemiallinen kestävyys pH:ssa< 2 и рН >9 (piidioksidi liukenee emäksiin ja happoihin). Siksi tällä hetkellä etsitään intensiivisesti sorbentteja, jotka perustuvat polymeereihin, jotka ovat stabiileja pH:ssa 1-14, esimerkiksi polymetyylimetakrylaattiin, polystyreeniin jne.

Sorbentit ioninvaihtokromatografiaan. Erottamisen erityispiirteistä johtuen (happamassa tai emäksisessä ympäristössä) päämateriaali sorbentoidaan polystyreeniksi divinyylibentseenillä, jolla on eriasteinen silloitus SO3 -H+:n (vahvasti happamat kationinvaihtajat) tai -COO-Naf:n (heikosti hapan kationi) kanssa. -H2N+ (CH3) -ryhmät, jotka on oksastettu niiden pintaan 3Cl- (vahvat emäksiset anioninvaihtajat) tai -N+HR2Cl- (heikko emäksinen anioninvaihtaja).

Sorbentit geelipermeaatiokromatografiaan. Päätyyppi on styreeni-DVB. Makrohuokoisia laseja, metyylimetakrylaattia ja silikageeliä käytetään myös. Samoja sorbentteja käytetään ioniskluusiokromatografiassa.
Pumput. Liikkuvan faasin (MP) virtauksen varmistamiseksi kolonnin läpi määritetyillä parametreilla käytetään korkeapainepumppuja. LC-pumppujen tärkeimpiä teknisiä ominaisuuksia ovat: virtausalue; suurin työpaine; virtauksen toistettavuus; liuottimen syötön pulsaatioalue.

Liuotinsyötön luonteesta riippuen pumput voivat olla jatkuvatoimisia (virtaus) ja vakiopaineisia. Pohjimmiltaan analyyttisen työn aikana käytetään vakiovirtaustilaa ja kolonneja täytettäessä käytetään vakiopainetilaa. Toimintaperiaatteensa perusteella pumput jaetaan ruiskupumppuihin ja edestakaisin mäntäpumppuihin.

Ruiskupumput. Tämän tyyppisille pumpuille on ominaista lähes täydellinen pulsaatioiden puuttuminen liikkuvan vaiheen virtauksesta käytön aikana. Pumpun haitat: a) suuri ajan ja liuottimen kulutus pesuun liuotinta vaihdettaessa; b) erotuksen keskeytyminen pumppua täytettäessä; c) suuret mitat ja paino varmistaen samalla korkean virtauksen ja paineen (tarvitaan tehokas moottori ja suuri mäntävoima sen suurella alueella).

Mäntäpumput. Tämän tyyppiset pumput tarjoavat liikkuvan vaiheen jatkuvan tilavuussyötön pitkän ajan. Maksimi käyttöpaine 300-500 atm, virtausnopeus 0,01-10 ml/min. Tilavuusvirtauksen toistettavuus on 0,5 %. Suurin haittapuoli on, että liuotin syötetään järjestelmään peräkkäisten pulssien sarjana, joten paine- ja virtauspulsaatioita esiintyy.

Tämä on tärkein syy lähes kaikkien LC:ssä käytettävien ilmaisimien, erityisesti sähkökemiallisten, lisääntyneeseen kohinaan ja heikentyneeseen herkkyyteen. Tapoja pulsaatioiden torjumiseksi: käyttämällä kaksoispumppuja tai kaksimäntäistä Bag-Lai-pumppua, käyttämällä vaimennuslaitteita ja elektronisia laitteita.

Tilavuussyötön määrä määräytyy kolmella parametrilla: männän halkaisija (yleensä 3,13; 5,0; 7,0 mm), sen amplitudi (12-18 mm) ja taajuus (joka riippuu moottorin ja vaihteiston pyörimisnopeudesta).

Annostelijat. Annostelijan tarkoitus on siirtää ilmakehän paineessa oleva näyte kolonnin tuloaukkoon jopa useiden ilmakehkien paineessa. On tärkeää, että annostelijassa ei ole "kuolleita" tilavuuksia, joita liikkuva faasi ei voi pestä, ja ettei näyte eroosio annostelun aikana. Aluksi LC-annostelijat olivat samanlaisia ​​​​kuin kaasuannostelijat, joissa oli kalvon reikä. Kalvot eivät kuitenkaan kestä enempää kuin 50-100 atm, niiden osat saastuttavat kolonnisuodattimet ja kapillaarit.

Nestefaasilla on paljon pienempi diffuusionopeus kuin kaasufaasilla. Siksi voit annostella pysäyttämällä virtauksen - näytteellä ei ole aikaa kulua annostelijassa. Kun näytettä viedään annostelijaan, erityinen venttiili sulkee liuotinvirtauksen. Paine kolonnin sisääntulossa laskee nopeasti muutaman sekunnin kuluttua, näyte voidaan ruiskuttaa annostelijakammioon tavanomaisella mikroruiskulla. Seuraavaksi annostelija lukitaan, liuotinvirtaus käynnistetään ja tapahtuu erottelu.

Tämän hanan paine on jopa 500-800 atm. Mutta kun virtaus pysähtyy, kolonnin tasapaino häiriintyy, mikä voi johtaa "vapaiden" lisähuippujen ilmestymiseen.

Loop-annostelijat ovat yleisimmin käytettyjä. Kun annostelija on täytetty, tuloaukot 1, 2 ja niiden välinen kanava ovat korkean paineen alaisia. Tulot 3-6, niiden väliset kanavat ja annostelusilmukka ovat ilmakehän paineen alaisia, mikä mahdollistaa silmukan täyttämisen ruiskulla tai pumpulla. Kun annostelijaa käännetään, liikkuvan faasin virtaus syrjäyttää näytteen kolonniin. Virheen vähentämiseksi silmukka pestään 5-10-kertaisella näytemäärällä. Jos näyte on pieni, se voidaan injektoida silmukkaan mikroruiskulla. Silmukan tilavuus on yleensä 5-50 µl.

PÄÄLLÄ. Voinov, T.G. Volova

(pääasiassa molekyylien välinen) faasirajapinnassa. Analyysimenetelmänä HPLC on osa menetelmäryhmää, joka sisältää tutkittavien kohteiden monimutkaisuuden vuoksi alkuperäisen kompleksiseoksen alustavan erottamisen suhteellisen yksinkertaisiksi. Tuloksena saadut yksinkertaiset seokset analysoidaan sitten käyttämällä tavanomaisia ​​fysikaalis-kemiallisia menetelmiä tai erityisiä kromatografiaa varten kehitettyjä menetelmiä.

HPLC-menetelmää käytetään laajalti sellaisilla aloilla kuin kemia, petrokemia, biologia, biotekniikka, lääketiede, elintarviketeollisuus, ympäristönsuojelu, lääketuotanto ja monet muut.

Analysoitujen tai erotettujen aineiden erotusmekanismin mukaan HPLC jaetaan adsorptioon, jakautumiseen, ioninvaihtoon, poissulkemiseen, ligandien vaihtoon ja muihin.

On syytä muistaa, että käytännön työssä erottelu ei usein tapahdu yhden, vaan usean mekanismin kautta samanaikaisesti. Siten poissulkemiserottelua voivat monimutkaistaa adsorptiovaikutukset, adsorptioerottelut jakautumisvaikutukset ja päinvastoin. Lisäksi mitä suurempi ero näytteessä olevien aineiden välillä on ionisaatioasteen, emäksisyyden tai happamuuden, molekyylipainon, polarisoituvuuden ja muiden parametrien suhteen, sitä suurempi on erilaisten erotusmekanismien todennäköisyys tällaisille aineille.

Normaalifaasi HPLC

Kiinteä faasi on polaarisempi kuin liikkuva faasi, joten ei-polaarinen liuotin vallitsee eluentissa:

• Heksaani:isopropanoli = 95:5 (vähäpolaarisille aineille)
• Kloroformi:metanoli = 95:5 (keskipolaarisille aineille)
• Kloroformi:metanoli = 80:20 (erittäin polaarisille aineille)

Käänteisfaasi-HPLC

Kiinteä faasi on vähemmän polaarinen kuin liikkuva faasi, joten eluentti sisältää lähes aina vettä. Tässä tapauksessa on aina mahdollista varmistaa BAS:n täydellinen liukeneminen liikkuvaan faasiin, lähes aina on mahdollista käyttää UV-detektiota, lähes kaikki liikkuvat faasit ovat keskenään sekoittuvia, voidaan käyttää gradienttieluointia, kolonni voidaan nopeasti palauttaa -tasapainotettu, kolonni voidaan regeneroida.

Yleiset eluentit käänteisfaasi-HPLC:lle ovat:

• Asetonitriili: vesi
• Metanoli: vesi
• Isopropanoli: vesi

Matriisit HPLC:tä varten

HPLC käyttää matriiseina epäorgaanisia yhdisteitä, kuten piioksidia (silikageeli) tai alumiinioksidia, tai orgaanisia polymeerejä, kuten polystyreeniä (silloitettu divinyylibentseenillä) tai polymetakrylaattia. Silikageeli on tietysti nykyään yleisesti hyväksytty.

Matriisin tärkeimmät ominaisuudet:

• Partikkelikoko (µm);
• Sisäinen huokoskoko (Å, nm).

Silikageelin valmistus HPLC:tä varten:

1. Polypiihappomikropallojen muovaus;
2. Kuivaus silikageeli hiukkasia;
3. Ilman erotus.

Sorbenttihiukkaset:

• Tavallinen (pallomainen): korkeampi paineenkestävyys, korkeammat kustannukset;
• Ei-pallomainen: pienempi paineenkestävyys.

Huokoskoko HPLC:ssä on yksi tärkeimmistä parametreista. Mitä pienempi huokoskoko on, sitä huonompi niiden läpäisevyys eluoituneiden aineiden molekyyleille. Ja siksi, mitä huonompi on sorbenttien sorptiokyky. Mitä suuremmat huokoset ovat, sitä pienempi on ensinnäkin sorbenttihiukkasten mekaaninen stabiilisuus, ja toiseksi, mitä pienempi on sorptiopinta, joten sitä huonompi on tehokkuus.

Stationaarivaiheen rokotukset

Normaalifaasi HPLC:

• Stationaarifaasi propyylinitriilioksastuksella (nitriili);
• Stationaarifaasi propyyliamiinioksastuksella (amiini).

Käänteisfaasi-HPLC:

• Stationaarifaasi alkyylioksastuksella;
• Stationaarifaasi alkyylisilyylioksastuksella.

Päättymissuoja on sorbentin oksastamattomien alueiden suojaaminen "pienillä" molekyyleillä. Hydrofobinen päätypinnoite (C1, C2): suurempi selektiivisyys, huonompi kostuvuus; hydrofiilinen päätepäällyste (dioli): pienempi selektiivisyys, parempi kostuvuus.

Ilmaisimet HPLC:tä varten

• UV
• Diodi matriisi
• Fluoresoiva
• Sähkökemiallinen
• Refraktometrinen
• Massavalikoiva

Linkit

Wikimedia Foundation. 2010.

Katso, mitä "High Performance Liquid Chromatography" on muissa sanakirjoissa:

korkean suorituskyvyn nestekromatografia- [A.S. Goldberg. Englanti-venäläinen energiasanakirja. 2006] Aiheet: energia yleisesti EN korkean suorituskyvyn nestekromatografia HPLC ... Teknisen kääntäjän opas

Termi korkean erotuskyvyn nestekromatografia Termi englanniksi korkean erotuskyvyn nestekromatografia Synonyymit Lyhenteet HPLC, HPLC Aiheeseen liittyvät termit adsorptio, oligopeptidi, proteomiikka, sorbentti, fullereeni, endoedri, kromatografia... ...

Nestekromatografia, jossa erotuksen tehokkuuden lisäämiseksi paineistettu liuotin (eluentti) (yli 3x107 Pa) pumpataan pylväiden läpi, jotka on täytetty halkaisijaltaan pienillä hiukkasilla (enintään 1 μm) olevilla hiukkasilla täytettyjen pylväiden läpi, ja myös perfuusiosuodattimet käytetty......

Kromatografian tyyppi, jossa neste (eluentti) toimii liikkuvana faasina ja kiinteänä faasina. sorbentti, TV kantaja, jonka pinnalle on levitetty nestettä tai geeliä. Suorita sorbentilla täytetty pylväs (kolonnikromatografia) tasaisella... ... Luonnontiede. tietosanakirja

- [κρώμα (υrum) väri] prosessi, joka perustuu seoksen yksittäisten komponenttien (nestemäisten tai kaasumaisten) epätasa-arvoiseen kykyyn jäädä adsorbentin pinnalle sekä imeessään niitä kantajavirrasta että kun ... ... Geologinen tietosanakirja

- (muusta kreikkalaisesta ... Wikipediasta

Termi kromatografia Termi englanninkielisessä kromatografiassa Synonyymit Lyhenteet Aiheeseen liittyvät termit korkean suorituskyvyn nestekromatografia, klatraatti, laboratorio sirulla, porometria, proteomi, proteomiikka, sorbentti, entsyymi, fullereeni, endoedraalinen... ... Ensyklopedinen nanoteknologian sanakirja

Nestekromatografia, joka perustuu hajoamiseen. erotettujen ionien kyky ioninvaihtoon kiinteän kanssa. sorbentti-ionit, jotka muodostuvat jälkimmäisen ionogeenisten ryhmien dissosioitumisen seurauksena. Kationinvaihtimia käytetään kationien erottamiseen... ... Kemiallinen tietosanakirja

HPLC- korkean suorituskyvyn nestekromatografia… Venäjän lyhenteiden sanakirja

Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) on yksi tehokkaista menetelmistä monimutkaisten aineseosten erottamiseen, ja sitä käytetään laajalti sekä analyyttisessä kemiassa että kemiantekniikassa. Kromatografisen erotuksen perusta on osallistuminen ... Wikipedia

Kirjat

• Käytännön korkean suorituskyvyn nestekromatografia, Veronica R. Mayer. Esittelemme lukijalle kirjan 5. painoksen, jota on laajennettu nykyaikaisilla menetelmillä ja laitteilla. Kirjaa on paranneltu paljon ja siihen on lisätty paljon viittauksia. Ne kohdat tekstissä, joissa...