În cursul unui studiu citologic, structura celulelor este studiată pentru a detecta tumori maligne, benigne și leziuni de natură non-tumorală. Scopul principal al studiului este de a confirma sau infirma faptul de malignitate a celulelor luate pentru analiză.

Metodele de cercetare citologică se bazează pe studiul la microscop a structurii celulelor, a compoziției celulare a fluidelor și țesuturilor.

Există astfel de metode de studii citologice:

• microscopie ușoară;
• microscopie electronică;
• metoda de centrifugare. Se utilizează atunci când este necesară separarea membranelor celulare de structura generală;
• metoda atomului etichetat. Ele sunt folosite pentru studiul proceselor biochimice din celule: pentru aceasta, se introduce în ele un izotop radioactiv marcat;
• studiu pe viață. Această metodă de cercetare face posibilă studierea proceselor dinamice care au loc în celulă.

Concluzia studiului citologic se bazează pe caracteristicile modificărilor citoplasmei, nucleului celular, raportul nuclear-citoplasmatic, formarea de complexe și structuri celulare.

O analiză citologică este utilizată în timpul unei examinări preventive, pentru a clarifica diagnosticul, în timpul intervenției chirurgicale, pentru detectarea în timp util a recăderilor și controlul asupra cursului tratamentului.

Examenul citologic al frotiurilor

Ca materiale pentru analiză se utilizează:

• fluide: urină, secreție de prostată, spută, tampoane obținute în timpul endoscopiei diferitelor organe, scurgeri din mameloane, amprente și răzuire de pe suprafețe ulcerative și erodate, răni și fistule, lichid din cavitățile seroase și articulare;
• punctate: materiale biologice obținute în timpul puncției diagnostice efectuate cu un ac subțire;
• frotiuri din cavitate și col uterin.

Cele mai multe dintre aceste studii citologice ale frotiurilor sunt efectuate dacă este necesar, pentru a stabili și a clarifica diagnosticul. Dar o examinare citologică a unui frotiu de col uterin (test Papanicolau) este recomandată: o dată pe an - pentru femeile de peste 19 ani care sunt active sexual; de două ori pe an - femeile care iau contraceptive hormonale au avut herpes genital; mai mult de două ori pe an - femeile care suferă de infertilitate, sângerări uterine, obezitate, care își schimbă adesea partenerii sexuali, iau estrogeni, care au negi pe organele genitale, au herpes genital.

Examenul citologic al colului uterin

Pentru o examinare citologică a colului uterin, se prelevează un frotiu din părțile exterioare și interioare ale colului uterin și din bolțile vaginului folosind o spatulă specială din lemn. Apoi se transferă pe sticlă și se fixează.

Se efectuează o examinare citologică a colului uterin pentru a detecta modificări ale celulelor canceroase și, în concluzie, medicul indică una dintre cele cinci etape ale stării celulelor:

• stadiul 1. Nu se găsesc celule cu abateri;
• stadiul 2. Există modificări minore în structura celulelor cauzate de inflamarea organelor genitale interne. Această stare a celulelor nu provoacă teamă, dar femeii i se recomandă să se supună examinării și tratamentului suplimentar;
• stadiul 3. S-au găsit un număr mic de celule cu abateri structurale. În acest caz, se recomandă efectuarea unui frotiu din nou sau efectuarea unui examen histologic al țesutului alterat;
• stadiul 4. Se găsesc celule individuale cu modificări maligne. Diagnosticul final nu se pune, se prescrie o examinare suplimentară;
• stadiul 5. Un număr mare de celule canceroase au fost găsite în frotiu.

Fiabilitatea unui astfel de studiu citologic este mare, dar poate oferi doar informații despre zona din care au fost prelevate celulele pentru analiză. Pentru a evalua starea trompelor uterine, a ovarelor, a uterului, ar trebui să fii supus unei examinări cuprinzătoare.

Principala caracteristică a metodei morfo-funcționale de studiere a celulelor este dorința de a înțelege baza structurală a proceselor biochimice care determină o anumită funcție, adică de a asocia aceste procese cu structuri celulare specifice.

Scopul final al acestei metode este identic cu cel urmărit de biologia moleculară și biochimia structurală celulară. Cu toate acestea, metodele folosite de aceste științe pentru a rezolva o problemă comună sunt fundamental diferite. Dacă în biologia moleculară și biochimia structurală o condiție indispensabilă este distrugerea celulei și izolarea structurii studiate sub forma unei fracțiuni mai mult sau mai puțin pure, atunci în studiile citologice, dimpotrivă, păstrarea integrității celula este o condiție prealabilă. În acest caz, este necesar să ne străduim să reducem interferențele externe la minimum și să încercăm să investighem organizarea structurală și biochimică a anumitor componente exact în limitele unui sistem celular integral.

Studiile morfofuncționale s-au dezvoltat rapid în ultimele decenii. În acel moment, au fost dezvoltate un număr mare de metode fundamental noi pentru analiza calitativă și cantitativă a structurilor celulare. Această abordare este strâns legată de noile ramuri ale științelor biologice și, în special, de biologia moleculară, ceea ce determină contribuția foarte semnificativă a unor astfel de studii la progresul cunoștințelor noastre despre modelele generale de organizare celulară.

microscopia electronică

Una dintre cele mai comune, care a devenit o metodă clasică folosită în studiile structurale și biochimice, este metoda microscopiei electronice în diferitele sale modificări. Aceste modificări se datorează atât abordărilor diferite ale analizei structurilor studiate, cât și particularităților pregătirii celulelor pentru studii ultrastructurale. Rezoluțiile înalte ale microscoapelor convenționale de transmisie (transmisie) fac posibilă analizarea nu numai a tuturor organitelor aparatelor nucleare și citoplasmatice, ci și a unor structuri situate la nivel supramolecular de organizare, de exemplu, microfibrile de susținere și contractile, microtubuli și unele multienzime. complexe. În prezent, pentru a studia celulele la nivelurile sistemice și subsistemice ale organizării lor, metoda microscopiei electronice de înaltă tensiune este folosită din ce în ce mai mult cu succes. Datorită energiei mult mai mari a fasciculului de electroni penetranți în comparație cu un microscop electronic cu transmisie, această metodă face posibilă studierea secțiunilor „groase” sau chiar a celulelor întregi răspândite la microscop, ceea ce face posibilă, de exemplu, analiza complexului. sistem de fibrile submembranare ale aparatului de suprafață celulară în ansamblu.

În studiul funcției aparatului de suprafață al celulei, relația dintre subsistemele individuale ale aparatului de suprafață al nucleului și o serie de alte probleme de citologie generală, metoda microscopiei electronice de scanare, care face posibilă studierea suprafața unui obiect în volum, devine esențială.

Metoda de congelare-chipping

Un loc special și fundamental important în studiile citologice ale direcției morfobiochimice îl ocupă metoda congelare-clivare. Este cea mai parțială metodă de pregătire a obiectelor biologice pentru analiza ultrastructurală, adică provoacă modificări minime în structurile celulare în comparație cu starea lor nativă. Esența metodei este următoarea. Obiectul este plasat într-o atmosferă de azot lichid, care oprește imediat toate procesele metabolice. Apoi se fac chipsuri din obiectul înghețat. De la suprafața așchiilor se obțin replici prin aplicarea unei pelicule metalice pe acestea. Aceste filme sunt examinate în continuare la microscop electronic. Avantajul metodei de congelare-clivare este că planul de clivaj trece de obicei prin faza hidrofobă a membranei, iar acest lucru face posibilă studierea cantității, mărimii și aranjamentului proteinelor membranare integrale pe clivaje, adică direct pe partea internă. organizarea morfobiochimică a membranelor. Metoda a dat rezultate foarte valoroase în studiul diferitelor tipuri de structuri membranare și formațiuni speciale, de exemplu, anumite tipuri de contacte celulare.

Metoda citochimică

Pentru sarcina principală a aspectului structural-biochimic al studiilor citologice - elucidarea semnificației funcționale a structurilor prin analiza organizării lor biochimice - metodele citochimice joacă un rol excepțional de important. În prezent, acestea sunt în continuă perfecţionare atât în ​​ceea ce priveşte identificarea calitativă precisă a compuşilor chimici din structurile studiate, cât şi în ceea ce priveşte evaluarea cantitativă a acestora. Cu ajutorul unor instrumente speciale care permit citospectrofotometria cantitativă, este posibil să se determine conținutul unei substanțe date, precum ARN și ADN, nu numai în celulă în ansamblu, ci și la nivelul structurilor nucleare sau citoplasmatice. Datorită microscopiei de interferență, este posibil să se evalueze cantitatea totală de proteine ​​​​din celulă și modificările acesteia pe parcursul vieții sale.

Există o metodă de identificare citochimică a enzimelor, care face posibilă evaluarea nu numai a localizării și cantității unui anumit compus în structurile celulare, ci și a proceselor de sinteză și transport intracelular al acestor compuși.

Citochimia enzimelor se bazează pe principiul interacțiunii substrat-enzimă cu utilizarea compușilor marker care precipită în acest caz. Determinând localizarea și, în unele cazuri, activitatea sistemelor enzimatice, putem judeca localizarea anumitor procese biochimice în structurile celulare.

Autoradiografie

Metoda autoradiografiei, precum și citochimia enzimelor, deschide posibilitatea studierii sintezei și transportului intracelular, dar în același timp are posibilități și mai largi. Metoda autor-diografiei se bazează pe utilizarea precursorilor radioactivi ai sintezei macromoleculelor marcate cu izotopi artificiali (3 H, 14 C, 35 S etc.). Permite nu numai localizarea locurilor de sinteză ale anumitor macromolecule, ci și urmărirea rutelor specifice de transport intracelular al acestor compuși, pentru a oferi o evaluare cantitativă relativă a intensității sintezei și a vitezei de mișcare a macromoleculelor în structurile celulare. În acest fel, în special, a fost demonstrată pentru prima dată mișcarea ARN-ului de la nucleu la citoplasma celulelor, a fost urmărită în detaliu localizarea sintezei și transportul secreției intracelulare în celulele secretoare și multe alte fapte importante pentru citologia generală. au fost dezvăluite. În esență, această metodă este una dintre cele mai tipice metode caracteristice direcției structural-biochimice a cercetării, deoarece vă permite să studiați direct procesele metabolismului în structurile intracelulare într-o celulă integrală, nedistrusă (ca în studiile biochimice). Esența acestei metode se bazează pe detectarea moleculelor marcate cu un izotop artificial folosind o emulsie fotografică, care acoperă secțiuni de celule și țesuturi fixate în momente diferite după introducerea unui precursor marcat.

Metoda imunocitochimică

În prezent, este posibilă și o analiză calitativă foarte precisă a proteinelor individuale ale structurilor celulare în cadrul unui sistem celular integral. O astfel de analiză este efectuată folosind metode imunocitochimice. Esența acestor metode este că o proteină specifică servește ca antigen, față de care anticorpii specifici sunt produși în corpul oricăror mamifere. Acestea din urmă sunt combinate cu un colorant fluorescent sau alt marker. Apoi, celula studiată este tratată cu ser cu anticorpi marcați. În acest caz, anticorpii specifici marcați se leagă strict selectiv de structurile care conțin proteinele studiate. Folosind această metodă, în special, a fost dezvăluită localizarea proteinelor contractile principale și auxiliare ale sistemului actină-miozină în aparatul fibrilar submembranar al celulelor și a fost demonstrată modificarea distribuției lor în timpul formării aparatului mitotic și în timpul citotomiei. . Aceeași metodă a fost folosită cu succes pentru a demonstra validitatea modelului fluid-mozaic de organizare a membranei.

Metode complexe de cercetare celulară

Recent, s-au realizat progrese deosebit de mari în studiul organizării structurale și biochimice a celulelor prin utilizarea complexă a metodelor de analiză ultrastructurală, a metodelor de citochimie și autoradiografie. Aceste succese se datorează în principal dezvoltării unor metode speciale de citochimie și autoradiografie la nivel ultrastructural, care fac posibilă analiza directă a proceselor metabolice la nivelul numit de organizare celulară, „structură” proceselor biochimice și aflarea semnificației specifice a anumite structuri celulare.în legături separate ale proceselor complexe de metabolism intracelular. În acest sens, s-a acumulat material extins privind rolul diferitelor tipuri de faza membranară a citoplasmei în procesele anabolice sintetice și procesele de catabolism intracelular.

S-au obținut succese majore, în special, în studiul organizării și funcționării aparatului lizozomal al celulelor. Fapte noi importante au fost obținute în studiul aparatului nuclear al celulelor. Cu ajutorul metodelor citochimice, este posibil să se identifice ribonucleoproteinele (RNP) și dezoxiribonucleoproteinele (DNP) la nivel ultrastructural și, prin urmare, se realizează progrese semnificative în studierea organizării transcripției, maturării și transportului intranuclear al diferitelor tipuri de RNP în celulele eucariote. , iar utilizarea autoradiografiei electronice a făcut posibilă detalierea rolului structurilor celulare individuale în aceste procese. De exemplu, a fost posibil să se studieze în detaliu funcția nucleolului și să se structureze în mod specific procesele de formare a ARN-ului ribozomal în acesta.

O astfel de sinteză a aspectelor și metodelor molecular-biologice și structural-biochimice este, de asemenea, foarte tipică pentru dezvoltarea multor alte întrebări importante despre organizarea fină a componentelor individuale ale celulelor. În același timp, relația strânsă dintre analiza citologică biologică moleculară și cea morfobiochimică se manifestă nu numai în sinteza rezultatelor finale, ci și în interacțiunea acestora în procesul de studiu în sine. O astfel de interacțiune se realizează fie prin efectuarea de lucrări complexe folosind atât metode biochimice, cât și citologice de către specialiști, biochimiști și citologi, fie prin utilizarea unor metode complexe speciale care se află la granița analizei biochimice și citologice a structurilor celulare.

Un exemplu de primul fel este combinația de metode pentru izolarea biochimică a componentelor celulare cu analiza lor ultrastructurală fină. În acest fel, au fost obținute pentru prima dată fotografii ale genelor de lucru cu identificarea ADN-ului, ARN polimerazelor și a moleculelor de ARN transcrise pe acestea. Îmbunătățirea acestei metode face acum posibilă în unele cazuri luarea în considerare a intensității transcripției prin numărarea directă a numărului de complexe de ARN polimerază. Folosind un microscop electronic, puteți studia direct modelele de replicare a ADN-ului pe molecule de ADN izolate biochimic, circulare sau liniare. Metodele de analiză ultrastructurală sunt, de asemenea, utilizate pe scară largă în studiul imunocitochimic al localizării proteinelor individuale, în subparticulele de ribozom, în studiul diferitelor niveluri de organizare a DNP și în multe alte cazuri.

Un exemplu tipic de metode complexe special dezvoltate este hibridizarea ADN-ului și ARN-ului pe secțiuni. Esența sa este următoarea. ADN-ul, care face parte din DNP-ul unei celule întregi, este denaturat și apoi procesat de fracțiuni de ARN marcate cu izotopi radioactivi. Ca rezultat, ADN-ul dezvăluie autoradiografic regiuni care sunt complementare unor fracțiuni de ARN date, adică locurile de transcripție ale acestora din urmă, cu alte cuvinte, devine posibilă determinarea cu precizie a localizării anumitor gene.

În cadrul metodei experimentale, se studiază organizarea funcțională a celulei în ansamblu sau a componentelor sale individuale, prin schimbarea stării acesteia cu ajutorul influenței externe. Observând apoi modificări ale activității vitale a celulei sau a componentelor acesteia, se pot trage concluzii despre anumite proprietăți ale mecanismelor studiate. Acest tip de metodă este acum foarte răspândit în unele secțiuni ale citologiei, iar în unele dintre domeniile sale, aspectul citofiziologic al analizei structurilor celulare ocupă încă o poziție dominantă.

Aceasta este tocmai starea problemei funcției de transport a aparatului de suprafață al celulei. Pe de o parte, s-au înregistrat progrese semnificative în studiul acestei probleme: pe baza rezultatelor analizei citofiziologice, a fost posibilă identificarea varietăților de transport transmembranar al substanțelor, pentru a caracteriza diferite proprietăți ale sistemelor de transport. Pe de altă parte, soluția finală a problemei mecanismelor de transport transmembranar este posibilă numai dacă este clarificată organizarea specifică a sistemului lipidico-proteic al membranelor și cunoașterea exactă a proprietăților și rolului componentelor rămase ale membranelor. sisteme de transport membranar, adică la nivelul analizei structurale și biochimice a membranei plasmatice și a întregului aparat de suprafață al celulei.

Posibilitățile limitate ale studiului citofiziologic al transportului transmembranar se manifestă în mod clar prin exemplul stării problemei organizării canalelor ionice, care joacă un rol major în multe procese importante, cum ar fi, de exemplu, propagarea unui nerv. impuls. Cu ajutorul unui întreg arsenal de diferite metode citofiziologice, s-a demonstrat că în membrana plasmatică există canale speciale pentru ionii Na, K, Cl, care diferă în proprietățile lor. Cu toate acestea, cunoștințele specifice despre organizarea lor structurală sunt încă limitate de datele indirecte privind natura lor proteică. Astfel, soluția problemei organizării canalelor ionice în special și a sistemelor de transport membranar în general pare să cadă în mâinile oamenilor de știință care sunt pricepuți în metodele biochimice structurale, deoarece, în acest caz, numeroase și foarte valoroase fapte obținute în citofiziologice. studiile sunt doar prima etapă fenomenologică în analiza acestor mecanisme celulare generale. Cu toate acestea, în anumite aspecte ale studiului celulei, abordarea citofiziologică poate da foarte mult.

În prezent, varietatea metodelor de studii citofiziologice este determinată atât de arsenalul din ce în ce mai mare de agenți care apar la citologi, cât și de utilizarea unor metode subtile de analiză a modificărilor care apar ca urmare a acțiunii acestor agenți asupra celulă. Dacă mai devreme, pentru a analiza modificările în celule sub acțiunea agenților externi, astfel de metode familiare fiziologilor cum ar fi înregistrarea potențialelor electrice, evaluarea respirației celulare prin absorbția de oxigen, evaluarea cantitativă a sorbției colorantului, înregistrarea modificărilor calitative în colorarea celulelor etc. s-au folosit, acum în astfel de scopuri sunt din ce în ce mai utilizate metode caracteristice direcției structurale și funcționale: studiul microscopic electronic al modificărilor ultrastructurale, analiza autoradiografică a proceselor sintetice etc.

Dintre agenții utilizați în studiile experimentale, se pot distinge două grupuri principale. Primul grup este format din substanțe al căror „punct de aplicare” în interiorul celulei este mai mult sau mai puțin cunoscut - acestea sunt substanțe care blochează legăturile individuale ale metabolismului intracelular (de exemplu, actinomicina D, care inhibă transcripția, sau puromicina, care blochează sinteza proteinelor, 2,4-dinitrofenolul, care decuplează respirația și fosforilarea oxidativă), substanțe care distrug selectiv anumite structuri celulare (de exemplu, colchicina, care distruge microtubulii, sau citocalazina B, care acționează asupra microfibrilelor). Al doilea grup este format din agenți ai așa-numitei acțiuni complexe care modifică metabolismul celular în general - temperatura, presiunea osmotică, pH-ul etc. Utilizarea unor astfel de agenți, cum ar fi, de exemplu, 2,4-dinitrofenolul, a făcut posibilă clarificarea o serie de întrebări referitoare la conjugarea respirației și fosforilării în lanțul respirator al mitocondriilor; utilizarea inhibitorilor de ARN și sinteza proteinelor a făcut posibilă studierea unor legături ale sintezei proteinelor în ribozomi și procesele de transcripție; folosind colchicina și citocalazina, a fost elucidat rolul microtubulilor și microfilamentelor în procesele de transport intracelular.

Agenții din a doua grupă (acțiune complexă) au avantajul că sunt, parcă, mai naturali pentru celule, deoarece celulele în condiții naturale întâmpină schimbări similare în mediul extern. În același timp, ele afectează aproape toate aspectele metabolismului celular, ceea ce face dificilă analiza modificărilor care apar în acest caz. Cu toate acestea, studiul efectului unor astfel de agenți asupra celulei este de o importanță independentă și este absolut necesar pentru studierea mecanismelor de adaptare a celulelor la factorii de mediu în schimbare, rezolvând problema raportului dintre procesele specifice și nespecifice în răspunsul celulelor la influențe externe și alte sarcini similare, care joacă un rol important în dezvoltarea problemei integrării celulare.

În studiul organizării funcționale a celulelor, analiza mecanismelor de interacțiune a sistemelor celulare individuale este de mare importanță. În multe cazuri, această problemă poate fi rezolvată prin crearea unor modele experimentale speciale. Cele mai tipice exemple de acest fel sunt transplanturile nucleare în diferite obiecte (protozoare, ouă de amfibieni); hibridizarea celulelor somatice; transplantul de părți celulare în protozoare; cercetare folosind o serie de alte tehnici microchirurgicale, efectuate pe obiecte protozoologice și pe celule de mamifere cultivate in vitro.

Cu ajutorul unor astfel de modele au fost studiate cele mai importante probleme citologice generale. De exemplu, rezultatele experimentelor de transplantare a nucleelor ​​celulelor amfibiene diferențiate într-un ovul lipsit de propriul nucleu au fost unul dintre cele mai convingătoare argumente în favoarea teoriei activității diferențiale a genelor. Esența acestuia din urmă este de a afirma identitatea structurală a genomurilor celulelor diferențiate ale unui organism multicelular. Acest lucru implică o poziție fundamental importantă că procesul de diferențiere are loc nu prin modificări ireversibile în aparatul ereditar al celulelor, ci prin reglarea activității unui set de gene care este același pentru toate celulele unui organism dat.

S-au găsit fapte foarte interesante pe un model experimental pentru studierea procesului de dediferențiere a unei celule hibride - un eritrocit de pui și o celulă canceroasă de mamifer. Particularitatea acestui heterocarion constă în faptul că, atunci când un eritrocit de pui se contopește cu o celulă canceroasă, are loc hemoliza hemoglobinei și se găsește un nucleu eritrocitar normal, aproape complet inactivat, în citoplasma celulei canceroase. Astfel, aici se realizează transplantul nucleului diferențiat în condiții neobișnuite ale citoplasmei active. Observarea atentă a modificărilor în organizarea structurală a acestor nuclee a arătat că în condiții noi are loc o creștere semnificativă a volumului lor. Proteinele care provin din citoplasmă joacă un rol semnificativ în umflarea nucleelor. Aceste modificări externe în aparatul nuclear al eritrocitelor reflectă procesele profunde de restructurare a organizării sale interne, având ca rezultat reluarea transcripției ARN-ului mesager „de pui”. Cu toate acestea, implementarea informațiilor conținute în acesta sub forma sintezei proteinelor „de pui” nu are loc până când nu se formează nucleolul în aparatul nuclear al eritrocitelor de pui și începe sinteza ARN-ului ribozomal. Astfel, o analiză amănunțită a modelelor experimentale a arătat prezența unui control citoplasmatic complex asupra activității aparatului nuclear.

Cu ajutorul modelelor experimentale, a fost posibil să se rezolve o serie de alte probleme citologice generale importante. De exemplu, problema mecanismelor de mișcare a cromozomilor anafazici a fost studiată cu succes pe aparatul mitotic nativ izolat din blastomerii de arici de mare zdrobitori și care lucrează în afara celulei. În cea mai mare parte pe modele experimentale, a fost posibil să se stabilească un model general larg răspândit de organizare celulară, și anume, absența unui principiu rigid cauză-efect în relația proceselor intracelulare complexe. S-a dovedit că astfel de procese cu mai multe componente, cum ar fi reproducerea celulară, procesele de sinteză și transport intracelular al compușilor cu polimeri înalți etc., constau în etape separate, relativ autonome, care nu sunt conectate printr-o relație cauzală rigidă. Elucidarea acestui tipar, pe de o parte, creează premisele pentru înțelegerea mecanismelor plasticității uimitoare a organizării celulare. Pe de altă parte, aceeași regularitate stă la baza studierii mecanismelor de integrare a unor astfel de procese într-un sistem celular integral în condiții normale.

În prezent, numărul și varietatea modelelor experimentale concepute pentru a rezolva anumite probleme citologice generale specifice este în creștere. Acest lucru contribuie foarte mult la progresul cunoștințelor noastre într-o zonă relativ slab studiată a citologiei - mecanismele de interacțiune și integrare a activității sistemelor subcelulare.

Trebuie subliniat că specificul cercetării efectuate în cadrul abordării experimentale a analizei tiparelor de organizare celulară este aprofundarea tot mai mare a criteriilor și semnelor prin care analiza mecanismelor integratoare și funcțiilor specifice ale individului. se realizează structuri celulare.Totodată, devine clar că rezolvarea cu succes a sarcinilor cu care se confruntă o astfel de cercetare este posibilă numai cu introducerea pe scară largă în practică a metodelor abordării structural-funcționale.

Esența metodei citologice comparative de cercetare în citologie generală este elucidarea tiparelor generale de organizare a celulelor folosind întreaga varietate a soiurilor lor oferite omului de știință de natura vie. Metoda comparativă are două aspecte. Pe de o parte, este folosit în mod tradițional pentru a identifica relațiile legate între tipurile individuale de celule (în special pentru organismele unicelulare). Pe baza sistematicii filogenetice a celulelor procariote și a celulelor eucariote inferioare și superioare create în acest fel și realizate folosind criterii citologice fine, devine posibilă urmărirea atât a sistemelor individuale de celule individuale, cât și a mecanismelor generale de reglare și integrare a Celula ca sistem integral.De exemplu, acest tip de aplicare a analizei citologice comparative în cercetarea celulară poate oferi date interesante despre organizarea fină a aparatului nuclear în celulele procariote, eucariote inferioare și superioare.

Principalele caracteristici ale organizării aparatului nuclear al celulelor eucariote sunt prezența unui aparat complex de suprafață al nucleului, o cantitate semnificativ mai mare de ADN concentrată în cromozomi în comparație cu celulele procariote și, în sfârșit, un fel de ambalare a ADN-ului folosind principalele proteine ​​– histonele.analiza aparatului nuclear al eucariotelor inferioare a permis identificarea printre ele celule care, din punct de vedere al structurii nucleului, ocupă o poziţie intermediară între celulele pro- şi eucariote. Flagelatii blindați au un aparat de suprafață tipic al nucleului, dar cromozomii lor, ca și în cazul procariotelor, sunt formați din molecule de ADN în formă de inel, care sunt organizate în structuri compacte fără participarea histonelor, caracteristice tuturor eucariotelor.

Recent, în legătură cu descoperirea unor trăsături fundamentale în organizarea genomului celulelor pro- și eucariote, compararea proceselor de transcripție și maturare a ARN-ului la aceste organisme, precum și la mezocariote și celulele eucariote inferioare, a avut Ca urmare a unor astfel de comparații, pot exista schimbări semnificative în ideile noastre tradiționale despre relațiile de rudenie în principalele grupuri de organisme și, în special, relația dintre celulele pro și eucariote.

Al doilea exemplu de aplicare tradițională a abordării evoluționiste la problemele citologice pot fi încercările de a propune o ipoteză a complicației mecanismelor de distribuție la fel de ereditară a cromozomilor între celulele fiice în procesul de evoluție, dezvoltată pe baza unei comparații. analiza a numeroase variante ale divergenței cromozomiale la protozoare și la plantele inferioare. În aceste cazuri, membranele învelișului nuclear participă activ la procesele de segregare a cromozomilor, ceea ce permite o anumită omologie cu celulele procariote, în care membrana celulară joacă un rol principal în distribuția uniformă a cromozomilor surori între celulele fiice. .

În cele din urmă, ipoteza simbiotică larg acceptată a originii mitocondriilor și a cloroplastelor poate servi ca un al treilea exemplu al abordării evolutive tradiționale a problemelor citologice generale. Esența sa constă în presupunerea că aceste organele importante ale metabolismului energetic au apărut din organisme procariote care au invadat celulele eucariote într-un stadiu relativ timpuriu al evoluției eucariote.

În ciuda importanței acestui tip de construcții biologice generale pentru dezvoltarea citologiei generale, abordarea istorică tradițională a dezvoltării problemelor citologice generale este acum încă de o utilizare destul de limitată. Unul dintre principalele motive pentru această situație este prezența unor trăsături specifice și încă insuficient studiate ale procesului evolutiv la nivelurile celulare și subcelulare de organizare, ceea ce face extrem de dificilă determinarea relației dintre grupurile individuale de organisme unicelulare și, în consecință, , construirea unor ipoteze evolutive rezonabile în domeniul citologiei generale.

În prezent, un alt aspect al utilizării metodei citologice comparative este mai răspândit, ne urmărind scopul clarificării directe a condiționalității istorice a unei anumite structuri sau proces celular. În citologia generală modernă, acest aspect al aplicării metodei comparative a suferit mai multe modificări.

În prima etapă, în timpul introducerii unor metode morfobiochimice fundamental noi în practica analizei citologice, alegerea obiectului de studiu a fost determinată de următoarele considerații. În primul rând, a contat comoditatea acestui sau aceluia obiect pentru aplicarea metodei utilizate. În al doilea rând, gradul de exprimare a acestei trăsături în celula studiată a jucat un rol important. Deci, pentru a studia modelele generale de organizare a celulelor eucariote, celulele hepatice de mamifere cu sistemul lor armonios dezvoltat de organele membranare au fost un obiect preferat.

Pentru studii citologice complexe și biologice moleculare ale organizării celulelor procariote, Escherichia coli a fost utilizată pe scară largă; Modelele pentru studierea organizării eucariotelor inferioare au fost drojdiile și mucegaiurile. În același timp, s-a dovedit că regularitățile stabilite pe aceste obiecte au o semnificație universală, deoarece în multe cazuri sunt fundamental similare în toate celulele eucariote sau procariote. Mai mult, o serie de modele de organizare subcelulară, în special la nivel molecular și supramolecular, s-au dovedit a fi universale pentru celulele de tip pro- și eucariote (organizarea membranelor, principiul structurii ribozomilor etc.), în ciuda faptul că aceste tipuri de celule sunt fundamental diferite unele de altele în anumite privințe. Această împrejurare a dat naștere ideii că este posibil să se dezvolte principalele probleme citologice generale pe o gamă limitată de obiecte care sunt convenabile din punct de vedere metodologic și apoi să se extindă tiparele stabilite la alte celule datorită organizării lor fundamental similare.

Cu toate acestea, în ultimii ani, o astfel de utilizare simplificată a abordării comparative a început să fie criticată pe măsură ce metodele citologice moderne sunt introduse în științele biologice speciale ale celulei - citologie în special, protozoologie, botanica plantelor inferioare. Analiza morfobiochimică aplicată în aceste domenii ale științei a făcut posibilă stabilirea unor fapte care mărturisesc enorma diversitate a implementării specifice a uneia sau alteia caracteristici comune de organizare celulară, diversitatea fiind mult mai mare decât reiese din rezultatele obținute anterior pe „model”. " obiecte. Această diversitate este deosebit de mare la cel mai înalt subsistem și niveluri sistemice de organizare celulară. De asemenea, este tipic pentru procese complexe și multicomponente precum procesele de metabolism și transport intracelular sau distribuția ereditară egală a materialului genetic în timpul diviziunii celulare.

Generalizarea unui mare material citologic comparativ, obținut la nivelul capacităților metodologice moderne, ne-a obligat să renunțăm la ideea simplificată menționată mai sus a rolului metodei comparative. În acest sens, în citologia generală (în special în ceea ce privește celulele eucariote), poziția dominantă este dobândită prin ideea necesității de a utiliza o metodă comparativă pentru analiza sistemelor celulare individuale sau a proceselor similare ca activitate funcțională în toate varietatea manifestărilor lor în celule specifice RES este cauzată nu de celule „tipice”, „medie”, ci, dimpotrivă, de celule care se abat brusc de la tipul mediu de organizare, celule în care anumite semne sunt hipertrofiate.

Cel mai mare număr de astfel de variante „evade” se găsește printre celulele organismelor multicelulare superioare, unde este dezvoltată specializarea de anvergură a celulelor ca parte a sistemelor individuale de țesut. Cazurile de „abatere” de la tipul mijlociu sunt larg răspândite și în rândul protozoarelor superioare, care au suferit evoluție, menținând în același timp nivelul unicelular de organizare. În timpul studiului acestui tip de celule atipice a fost posibil să se dezvăluie un număr mare de noi fapte interesante care ne aprofundează în mod semnificativ înțelegerea atât a legilor generale ale organizării celulare, cât și a plasticității sale evolutive, care determină diversitatea observată a sistemelor celulare. . În același timp, așa cum sa menționat deja mai sus, în cazul științelor speciale, manifestarea specifică a trăsăturilor comune caracteristice tuturor celulelor din diferite obiecte prezintă cel mai mare interes.

Spre deosebire de științele speciale, cu o abordare citologică generală, această întrebare este pusă într-un plan ușor diferit, deoarece cercetătorul caută să afle cât de răspândite sunt manifestările specifice ale acestei trăsături în diferite celule, ce combinație de mecanisme generale și ce exact se datorează. Deci, de exemplu, protozoologii au reușit să descopere o dinamică foarte interesantă a formării macronucleului după conjugare în ciliați gastrociliari. În macronucleul în curs de dezvoltare, are loc o creștere semnificativă a cantității de ADN și apoi se observă o reducere bruscă a materialului ereditar (până la 93%). Un astfel de proces de reducere a materialului genetic are loc și în celulele somatice ale unui număr de grupuri de animale multicelulare (unele insecte, nematode). ADN-ul rămas, mic în cantitate totală, dar care conține toate informațiile necesare funcționării macronucleului, este replicat de multe ori. Ca urmare, se creează un macronucleu definitiv, care diferă de micronucleu nu numai prin cantitatea de ADN, ci și prin compoziția sa calitativă. Marea majoritate a genelor nefuncționale sunt absente aici, în timp ce locii funcționali sunt reprezentați de un număr semnificativ de copii.

Aceste fapte prezintă un mare interes citologic general tocmai pentru că, de regulă, fenomenele observate aici nu sunt doar trăsături paradoxale caracteristice doar organismelor unicelulare superioare. Astfel, procesele de politenizare, replicarea selectivă a secțiunilor individuale ale ADN-ului cromozomului și, în cele din urmă, reducerea selectivă a secțiunilor semnificative ale genomului - toate aceste fenomene au loc și în celulele specializate ale organismelor multicelulare. Ele sunt realizate, probabil, pe baza unor mecanisme elementare comune. Și specificul procesului complex de modificări ale aparatului nuclear în timpul formării macronucleului în ciliați gastrociliați se datorează în principal unei combinații deosebite de mecanisme elementare generale, universale pentru celulele eucariote. Ideile de acest fel sunt acum utilizate pe scară largă în citologia generală. Sunt studii citologice comparative extrem de stimulatoare, orientate, dedicate elucidării unor probleme citologice generale importante. material de pe site

Un exemplu de studiu citologic comparativ țintit este studiul mecanismului de distribuție ereditară egală a cromozomilor în timpul mitozei la eucariote prin analiza mitozei diferitelor tipuri de diatomee: pe aceste obiecte, spre deosebire de mitozele tipice ale celulelor metazoare, este este posibil să se urmărească în mod clar morfologic modificări complexe în centrele de organizare a microtubulilor, formarea și divergența reciprocă a semi-fusurilor microtubulare, divergența cromozomilor către polii celulei cu ajutorul formării în metafaza unei structuri specifice - un guler.

În lumina datelor recente cu privire la rolul principal al sistemului mecanochimic tubulină-dineină în mișcarea anafazică a cromozomilor în celulele metazoare, este foarte probabil ca acest sistem să fie prezent și în diatomee, adică și aici există doar o particularitate. combinație de mecanisme elementare comune tuturor celulelor și care provoacă procese mecanochimice în timpul mitozei.

Evident, pentru analiza acestor mecanisme, a căror elucidare este una dintre problemele cele mai urgente ale citologiei generale, ar fi promițător să existe un astfel de obiect unde ele sunt clar diferențiate și exprimate morfologic.

Numărul de astfel de exemple este în continuă creștere. Acest lucru se datorează, pe de o parte, introducerii în continuă expansiune a unor metode moderne complexe în practica anumitor studii citologice, protozoologice și botanice, pe de altă parte, acumulării în studiile citologice comparative înseși a unor fapte care devin din ce în ce mai mari. importante pentru citologia generală și sunt în centrul atenției sale. Și toate acestea, la rândul lor, conduc la faptul că analiza citologică comparativă începe să ocupe un loc excepțional de important în citologie.

O scurtă descriere a principalelor direcții și aspecte ale cercetării citologice generale moderne arată că în acest stadiu al dezvoltării citologiei, există atât o distincție destul de clară între zonele individuale și sinteza lor. Există o distincție atât în ​​termeni metodologici, cât și în ceea ce privește logica rezolvării problemelor specifice stabilite în cadrul fiecărei direcții și abordări. În aspectul morfofuncțional al studiilor citologice, domină o abordare discretă a analizei structurilor celulare. Una dintre cele mai importante trăsături ale abordării experimentale a studiului tiparelor de organizare celulară este concentrarea acesteia pe analiza mecanismelor integratoare generale de organizare a sistemelor celulare și a întregii celule. În același timp, așa cum sa subliniat deja mai sus, soluția problemelor cu care se confruntă astfel de studii este imposibilă fără utilizarea pe scară largă a metodelor inerente abordării morfofuncționale. Analiza experimentală oferă o caracterizare fenomenologică a proprietăților anumitor mecanisme celulare și procese intracelulare, creând astfel baza necesară pentru aplicarea unui arsenal bogat de metode structurale și biochimice.

Astfel, în stadiul actual de dezvoltare a citologiei generale, există premise pentru o combinație foarte strânsă a acestor două aspecte ale studiilor citologice. Acest lucru este firesc, deoarece în cele din urmă ambele abordări urmăresc același scop - elucidarea organizării funcționale a structurilor celulare și a mecanismelor de reglare a proceselor într-un sistem celular integral.

Abordarea citologică comparativă a analizei problemelor citologice generale ocupă o poziţie specială în citologia generală modernă. Analiza citologică comparativă se realizează pe baza datelor obținute pe baza abordărilor morfofuncționale și experimentale, adică metodic, toate aspectele principale ale studiilor citologice sunt strâns legate între ele.

Specificul abordării citologice comparative, specificul care determină poziția sa specială, este utilizarea intenționată a diferitelor obiecte ale vieții sălbatice pentru a studia modelele generale de organizare a structurilor celulare individuale, procesele intracelulare și mecanismele de integrare în toată varietatea manifestărilor lor în diferite tipuri de celule.

Deci, după cum se poate observa din cele de mai sus, direcțiile principale ale cercetării citologice determină în mare măsură specificul stadiului actual de dezvoltare a citologiei generale și determină relația sa strânsă cu științele biologice conexe. Una dintre cele mai caracteristice trăsături ale acestei etape este interconectarea strânsă a tuturor celor mai importante domenii ale cercetării citologice în sens metodologic. Mai mult, o astfel de integrare metodică depășește adesea sfera citologiei generale.

În lucrările citologice, metodele pur biochimice și biologice moleculare sunt utilizate pe scară largă și invers, în studiile biochimice și biologice moleculare, metodele morfologice citologice sunt utilizate pe scară largă. Integrarea metodică a științelor conexe și unitatea scopurilor lor finale au condus la formarea unei noi științe sintetice a biologiei celulare. Combină citologia, biochimia structurală, biologia moleculară, genetica moleculară și științe biologice private despre nivelul de organizare celulară. O astfel de unire a științelor conexe este, fără îndoială, un fenomen progresiv. Cu toate acestea, în ciuda unei astfel de sinteze, fiecare dintre științe își păstrează atât specificul metodologic, cât și specificul în formularea și metodele de dezvoltare a problemelor de organizare celulară. În prezent, poziția dominantă în această știință sintetică aparține cercetării în domeniile biologice moleculare și genetice moleculare. Această situație se datorează progresului rapid al cunoștințelor noastre cu privire la nivelurile inferioare de organizare celulară, dar este doar un fenomen temporar.

De fapt, locul principal în noua știință sintetică a celulei ar trebui să fie ocupat de citologia generală - știința modelelor generale ale nivelului celular de organizare a materiei vii. Dintre științele biologice moderne care se ocupă cu acest nivel de organizare a materiei vii, citologia generală, extinzând abordarea citologică comparativă intenționată bazată pe metode biochimice structurale, este cea mai pregătită pentru o generalizare biologică generală profundă a unei cantități uriașe de material factual pe analiza discretă a individuale -ny structuri celulare în numeroase varietăți de celule. Poziția de lider ar trebui să fie luată de citologia generală în analiza mecanismelor generale de integrare celulară. O condiție prealabilă importantă pentru aceasta este dezvoltarea rapidă de noi modele experimentale. Analiza lor în profunzime prin metode moderne și introducerea pe scară largă a modelelor experimentale în studii citologice comparative țintite ar trebui să asigure progrese în rezolvarea uneia dintre principalele probleme ale organizării celulare - problema integrării celulare.

Odată cu acumularea de material factual privind mecanismele universale elementare de integrare celulară și domeniul de aplicare al modificărilor acestora, citologia generală se confruntă cu sarcina de a efectua o analiză profundă a condiționalității istorice a organizării anumitor sisteme celulare și a organizării celulare. în ansamblu, precum și specificul procesului evolutiv pe nivelurile celulare și subcelulare de organizare a materiei vii. Rezolvarea acestei probleme este facilitată de tendința care apare acum în mod clar în studiile citologice generale de a combina analiza discretă a componentelor individuale ale unei celule cu studiul kg ei. la un sistem complet.

Pe această pagină, material pe teme:

Plan:

1. Ce studiază citologia.

2. Ideea că organismele sunt formate din celule.

3. Metode de cercetare utilizate în citologie.

4. Fracționarea celulelor.

5. Radio-autografie.

6. Determinarea duratei unor etape ale ciclului celular prin autoradiografie.

Citologia este știința celulei. S-a remarcat de mediul altor științe biologice acum aproape 100 de ani. Pentru prima dată, informații generalizate despre structura celulelor au fost colectate în cartea lui J.-B. Biologia celulei de Carnoy, publicată în 1884. Citologia modernă studiază structura celulelor, funcționarea lor ca sisteme vii elementare: funcțiile componentelor celulare individuale, procesele de reproducere celulară, repararea lor, adaptarea la condițiile de mediu și multe alte procese sunt studiate, care fac posibilă judecarea proprietăți și funcții comune tuturor celulelor. Citologia ia în considerare și caracteristicile structurale ale celulelor specializate. Cu alte cuvinte, citologia modernă este fiziologia celulară. Citologia este strâns asociată cu realizările științifice și metodologice ale biochimiei, biofizicii, biologiei moleculare și geneticii. Aceasta a servit drept bază pentru un studiu aprofundat al celulei deja din punctul de vedere al acestor științe și apariția unei anumite științe sintetice a celulei - biologia celulară, sau biologia celulară. În prezent, termenii citologie și biologie celulară coincid, întrucât subiectul lor de studiu este celula cu propriile modele de organizare și funcționare. Disciplina „Biologie celulară” se referă la secțiunile fundamentale ale biologiei, deoarece explorează și descrie singura unitate a întregii vieți de pe Pământ - celula.

Un studiu îndelungat și atent al celulei ca atare a condus la formularea unei importante generalizări teoretice de semnificație biologică generală și anume apariția teoriei celulare. În secolul al XVII-lea Robert Hooke, un fizician și biolog de mare ingeniozitate, a creat microscopul. Examinând o secțiune subțire de plută la microscop, Hooke a descoperit că era alcătuită din celule goale mici separate de pereți subțiri, care, după cum știm acum, sunt compuse din celuloză. El a numit aceste celule mici celule. Mai târziu, când alți biologi au început să examineze țesuturile plantelor la microscop, s-a dovedit că celulele mici găsite de Hooke într-un dop uscat mort se găsesc și în țesuturile vegetale vii, dar nu sunt goale, ci fiecare conține un mic corp gelatinos. . După examinarea microscopică a țesuturilor animale, s-a constatat că acestea constau și din corpuri gelatinose mici, dar că aceste corpuri sunt doar rareori separate între ele prin pereți. Ca rezultat al tuturor acestor studii, în 1939, Schleiden și Schwann au formulat independent teoria celulară, care afirmă că celulele sunt unitățile elementare din care sunt construite în cele din urmă toate plantele și toate animalele. De ceva timp, sensul dublu al cuvântului celulă a provocat încă unele neînțelegeri, dar apoi a fost ferm înrădăcinat în aceste mici corpuri asemănătoare jeleuului.

Înțelegerea modernă a celulei este strâns legată de progresele tehnice și de îmbunătățirea metodelor de cercetare. Pe lângă microscopia luminoasă convențională, care nu și-a pierdut rolul, microscopia de polarizare, ultravioletă, fluorescență și contrast de fază au căpătat o mare importanță în ultimele decenii. Printre acestea, un loc special îl ocupă microscopia electronică, a cărei rezoluție a făcut posibilă pătrunderea și studierea structurii submicroscopice și moleculare a celulei. Metodele moderne de cercetare au făcut posibilă dezvăluirea unei imagini detaliate a organizării celulare.

Fiecare celulă este formată dintr-un nucleu și citoplasmă, separate între ele și de mediul extern prin membrane. Componentele citoplasmei sunt: ​​membrana, hialoplasma, reticulul endoplasmatic si ribozomii, aparatul Golgi, lizozomii, mitocondriile, incluziunile, centrul celular, organitele specializate.

O parte a unui organism care îndeplinește o anumită funcție se numește organ. Orice organ - plămân, ficat, rinichi, de exemplu - fiecare are propria sa structură specială, datorită căreia joacă un anumit rol în organism. În același mod, există structuri speciale în citoplasmă, a căror structură particulară le permite să îndeplinească anumite funcții necesare metabolismului celular; aceste structuri se numesc organele („organe mici”).

Elucidarea naturii, funcției și distribuției organitelor citoplasmatice a devenit posibilă numai după dezvoltarea metodelor de biologie celulară modernă. Cele mai utile în acest sens au fost: 1) microscopia electronică; 2) fracționarea celulară, cu ajutorul căreia biochimiștii pot izola fracții relativ pure de celule care conțin anumite organite și, astfel, pot studia reacțiile metabolice individuale de interes pentru acestea; 3) autoradiografia, care a făcut posibil studiul direct al reacțiilor metabolice individuale care apar în organele.

Metoda prin care organelele sunt izolate din celule se numește fracționare. Această metodă s-a dovedit a fi foarte fructuoasă, dând biochimiștilor capacitatea de a izola diferite organele celulare într-o formă relativ pură. De asemenea, face posibilă determinarea compoziției chimice a organitelor și a enzimelor conținute în acestea și, pe baza datelor obținute, să se tragă concluzii despre funcțiile lor în celulă. Ca o primă etapă, celulele sunt distruse prin omogenizare într-un mediu adecvat care păstrează organelele și împiedică agregarea acestora. Foarte des, o soluție de zaharoză este utilizată pentru aceasta. Deși mitocondriile și multe alte organele celulare rămân intacte, încurcăturile membranelor, cum ar fi reticulul endoplasmatic și membrana plasmatică, sunt fragmentate. Cu toate acestea, fragmentele de membrană rezultate se închid adesea pe ele însele, rezultând bule rotunjite de diferite dimensiuni.

În etapa următoare, omogenatul celular este supus unei serii de centrifugări, a căror viteză și durata crește de fiecare dată; acest proces se numește centrifugare diferențială. Pe fundul tuburilor de centrifugare sunt depuse diferite organele celulare la viteze diferite de centrifugare, în funcție de mărimea, densitatea și forma organelelor. Precipitatul rezultat poate fi prelevat și examinat. Structurile mai mari, mai dense, cum ar fi nucleii, precipită cel mai repede, în timp ce structurile mai mici, mai puțin dense, cum ar fi veziculele reticulului endoplasmatic, necesită viteze mai mari și timpi mai lungi. Prin urmare, la viteze mici de centrifugare, nucleele sunt precipitate, în timp ce alte organite celulare rămân în suspensie. La viteze mai mari, mitocondriile și lizozomii sunt precipitate, iar la centrifugare lungă și viteze foarte mari, chiar și particule mici precum ribozomii precipită. Precipitatele pot fi examinate folosind un microscop electronic pentru a determina puritatea fracțiilor rezultate. Toate fracțiile sunt contaminate într-o oarecare măsură cu alte organite. Dacă, totuși, este posibil să se obțină o puritate suficientă a fracțiilor, atunci acestea sunt apoi supuse analizei biochimice pentru a determina compoziția chimică și activitatea enzimatică a organitelor izolate.

Pentru progresul histologiei, citologiei și embriologiei, este de mare importanță introducerea realizărilor fizicii și chimiei, noi metode ale științelor conexe - biochimie, biologie moleculară, inginerie genetică.

Metodele moderne de cercetare fac posibilă studierea țesuturilor nu numai ca întreg, ci și izolarea tipurilor individuale de celule din ele pentru a studia activitatea lor vitală pentru o lungă perioadă de timp, pentru a izola organele celulare individuale și macromoleculele lor (de exemplu, ADN) și pentru a studia caracteristicile lor funcționale.

Astfel de oportunități s-au deschis în legătură cu crearea de noi instrumente și tehnologii - diverse tipuri de microscoape, tehnologie computerizată, analiză de difracție cu raze X, utilizarea rezonanței magnetice nucleare (RMN), izotopi radioactivi și autoradiografie, electroforeză și cromatografie, fracționare a continutului celular folosind ultracentrifugarea, separarea si cultivarea celulelor, obtinerea de hibrizi; utilizarea metodelor biotehnologice - obtinerea de hibridoame si anticorpi monoclonali, ADN recombinant etc.

Astfel, obiectele biologice pot fi studiate la nivel de țesut, celular, subcelular și molecular. În ciuda introducerii în științele naturii a diferitelor metode biochimice, biofizice, fizice și tehnologice necesare pentru rezolvarea multor probleme legate de activitatea vitală a celulelor și țesuturilor, histologia rămâne practic o știință morfologică cu un set propriu de metode. Acestea din urmă fac posibilă caracterizarea proceselor care au loc în celule și țesuturi, caracteristicile lor structurale.

Principalele etape ale analizei citologice și histologice sunt alegerea obiectului de studiu, pregătirea acestuia pentru examinare la microscop, utilizarea metodelor de microscopie și analiza calitativă și cantitativă a imaginilor.

Obiectele de studiu sunt celulele și țesuturile vii și fixe, imaginile acestora obținute la microscoape luminoase și electronice sau pe un ecran de televiziune. Există o serie de metode care permit analiza acestor obiecte.

Metode de microscopie a preparatelor histologice

Principalele metode de studiere a microobiectelor biologice sunt microscopia luminoasă și electronică, care sunt utilizate pe scară largă în practica experimentală și clinică.

Microscopia este principala metodă de studiu a micro-obiectelor utilizate în biologie de peste 300 de ani. De la crearea și utilizarea primelor microscoape, acestea au fost îmbunătățite constant. Microscoapele moderne sunt o varietate de sisteme optice complexe cu rezoluție înaltă. Dimensiunea celei mai mici structuri care poate fi văzută la microscop este determinată de cea mai mică distanță rezolvabilă (d o ), care depinde în principal de lungimea de undă a luminii. (\) și lungimile de undă ale oscilațiilor electromagnetice ale fluxului de electroni etc. Această dependență este determinată aproximativ de formula d 0 = 1 / 2 \. Astfel, cu cât lungimea de undă este mai mică, cu atât distanța rezolvabilă este mai mică și microstructurile care pot fi văzute în preparat sunt mai mici. Pentru studiul preparatelor histologice sunt folosite diferite tipuri de microscoape ușoare și microscoape electronice.

Orez. 1. Microscoape pentru cercetare biologică.

A - microscop biologic luminos "Biolam-S": 1 - baza; 2 - suport tub; 3 - tub înclinat; 4 - ocular, 5 - revolver; 6 - lentile; 7 - masa; 8 - condensator cu diafragma iris; 9 - șurub condensator; 10 - oglinda; 11 - surub micrometric; 12 - șurub macrometric. B - microscop electronic EMV-100AK cu sistem automat de procesare a imaginii: 1 - coloana microscop (cu sistem electron-optic si camera pentru probe); 2 - panou de control; 3 - camera cu ecran luminiscent; 4 - bloc analiza imaginii; 5 - senzor de semnal video.

Microscopie cu lumină. Pentru studiul micro-obiectelor histologice se folosesc microscoape ușoare obișnuite și varietățile acestora, care folosesc surse de lumină cu lungimi de undă diferite. În microscoapele ușoare convenționale, sursa de iluminare este lumina naturală sau artificială (Fig. 1, A). Lungimea de undă minimă a părții vizibile a spectrului este de aproximativ 0,4 µm. Prin urmare, pentru un microscop cu lumină convențional, cel mai mic distanța de rezoluție este de aproximativ 0,2 µm ( d o = "/, - 0,4 μm = 0,2 μm), iar mărirea totală (produsul măririi lentilei și mărirea ocularului) poate fi 1500-2500.

Astfel, într-un microscop cu lumină, se pot vedea nu numai celulele individuale cu dimensiuni cuprinse între 4 și 150 de microni, ci și structurile lor intracelulare - organite, incluziuni. Pentru a spori contrastul micro-obiectelor, se folosește colorarea acestora.

microscopie ultravioletă. Acesta este un tip de microscopie ușoară. Microscopul cu ultraviolete folosește raze ultraviolete mai scurte, cu o lungime de undă de aproximativ 0,2 µm. Distanța rezolvată aici este de 2 ori mai mică decât în ​​microscoapele ușoare convenționale și este de aproximativ 0,1 μm (d o = V 2 - 0,2 μm = 0,1 μm). Imaginea obtinuta in raze ultraviolete, invizibile pentru ochi, este transformata in una vizibila prin inregistrare pe o placa fotografica sau prin folosirea unor dispozitive speciale (ecran luminescent, convertor electron-optic).

Microscopie fluorescentă (luminiscentă). Fenomenul de fluorescență constă în faptul că atomii și moleculele unui număr de substanțe, absorbind razele cu lungime de undă scurtă, intră într-o stare excitată. Tranziția inversă de la starea excitată la starea normală are loc odată cu emisia de lumină, dar cu o lungime de undă mai mare. Într-un microscop fluorescent, lămpile cu mercur sau xenon de ultraînaltă presiune sunt folosite ca surse de lumină pentru excitarea fluorescenței, care au luminozitate mare în regiunea spectrală de 0,25-0,4 μm (aproape razele ultraviolete) și 0,4-0,5 μm (raze albastru-violete). ). Lungimea de undă a undei luminii de fluorescență este întotdeauna mai mare decât lungimea de undă a luminii excitante, astfel încât acestea sunt separate folosind filtre de lumină și imaginea obiectului este studiată numai în lumina fluorescenței. Distingeți între fluorescența proprie sau primară și indusă sau secundară. Orice celulă a unui organism viu are propria sa fluorescență, dar este adesea extrem de slabă.

Serotonina, catecolaminele (adrenalina, noradrenalina) continute in celulele nervoase, mastocite si alte celule au fluorescenta primara dupa fixarea tesuturilor in vapori de formaldehida la 60-80 °C (metoda Falk).

Fluorescența secundară apare atunci când preparatele sunt tratate cu coloranți speciali - fluorocromi.

Există diferiți fluorocromi care se leagă în mod specific la anumite macromolecule (acridină portocalie, rodamină, fluoresceină etc.). De exemplu, atunci când se prelucrează preparatele, cel mai des se utilizează portocalul de acridină fluorocrom. În acest caz, ADN-ul și compușii săi din celule sunt de culoare verde strălucitor și ARNși derivații săi - o strălucire roșie strălucitoare. Astfel, compoziția spectrală a radiației poartă informații despre structura internă a obiectului și compoziția chimică a acestuia. O variantă a metodei de microscopie cu fluorescență, în care atât excitația, cât și emisia fluorescenței au loc în regiunea ultravioletă a spectrului, se numește metoda microscopie cu fluorescență ultravioletă.

Microscopie cu contrast de fază. Această metodă este utilizată pentru a obține imagini cu contrast ridicat ale obiectelor vii transparente și incolore care sunt invizibile cu metodele convenționale de microscopie. După cum sa menționat deja, într-un microscop cu lumină convențional, contrastul necesar al structurilor este obținut prin colorare. Metoda contrastului de fază asigură contrastul structurilor necolorate studiate datorită unei diafragme inelare speciale plasate în condensator și a așa-numitei plăci de fază situată în obiectiv. Acest design al opticii microscopului face posibilă convertirea schimbărilor de fază ale luminii care trece prin specimenul nepătat, care nu sunt percepute de ochi, într-o modificare a amplitudinii acestuia, adică luminozitatea imaginii rezultate. Creșterea contrastului vă permite să vedeți toate structurile care diferă în indicele de refracție. O variație a metodei contrastului de fază este metoda contrast fază-câmp întunecat, oferind o imagine de contrast de fază negativă versus pozitivă.

Microscopie în câmp întunecat.Într-un microscop cu câmp întunecat, doar lumina care difractează structurile din preparat ajunge la obiectiv. Acest lucru se întâmplă din cauza prezenței unui condensator special în microscop, care luminează preparatul cu lumină strict oblică; razele de la iluminator sunt direcționate din lateral. Astfel, câmpul pare întunecat, iar particulele mici din preparat reflectă lumina, care apoi intră în lentilă. Rezoluția acestui microscop nu poate fi mai bună decât cea a unui microscop cu câmp luminos, deoarece este utilizată aceeași lungime de undă. Dar aici este mai mult contrast. Este folosit pentru a studia obiecte vii, obiecte autoradiografice precum boabele de argint care apar strălucitoare într-un câmp întunecat. În clinică, este folosit pentru a studia cristalele din urină (acid uric, oxalați), pentru a demonstra spirochetele, în special treponema pallidum, care provoacă sifilis etc.

microscopie de interferență. Varietățile microscopului cu contrast de fază sunt microscopul de interferență, care este conceput pentru a cuantifica masa țesutului, și microscopul de interferență diferențială (cu optica Nomarsky), care este utilizat în mod special pentru a studia relieful de suprafață a celulelor și a altor obiecte biologice.

Într-un microscop de interferență, fasciculul de lumină de la iluminator este împărțit în două fluxuri: unul trece prin obiect și schimbă faza oscilației, al doilea trece ocolind obiectul. În prismele obiectivului, ambele fascicule sunt conectate și interferează între ele. Ca rezultat, se construiește o imagine în care secțiunile unui micro-obiect de diferite grosimi și densități diferă în contrast. După cuantificarea modificărilor, se determină concentrația și masa substanței uscate.

Microscoapele cu contrast de fază și interferență fac posibilă studierea celulelor vii. Ei folosesc efectul de interferență care apare atunci când două seturi de unde sunt combinate pentru a crea o imagine a microstructurilor. Avantajul microscopiei cu contrast de fază, interferență și câmp întunecat este capacitatea de a observa celulele în procesul de mișcare și mitoză. În acest caz, mișcarea celulei poate fi înregistrată utilizând microfilmare time-lapse (cadru cu cadru).

microscopia polarizante. Un microscop polarizant este o modificare a unui microscop cu lumină în care sunt instalate două filtre polarizante - primul (polarizator) între fascicul de lumină și obiect, iar al doilea (analizator) între lentila obiectiv și ochi. Lumina trece prin primul filtru într-o singură direcție, al doilea filtru are o axă principală care este perpendiculară pe primul filtru și nu transmite lumină. Acest lucru creează un efect de câmp întunecat. Ambele filtre pot fi rotite pentru a schimba direcția fasciculului de lumină. Dacă analizorul este rotit cu 90° față de polarizator, nicio lumină nu va trece prin ele. Structurile care conțin molecule orientate longitudinal (colagen, microtubuli, microfilamente) și structuri cristaline (în celulele Leydig 1) apar ca luminoase atunci când axa de rotație se modifică. Capacitatea cristalelor sau a formațiunilor paracristaline de a împărți o undă luminoasă într-o undă obișnuită și o undă perpendiculară pe aceasta se numește birefringență. Această capacitate este deținută de fibrilele mușchilor striați.

Microscopia electronică. Un mare pas înainte în dezvoltarea tehnologiei de microscopie a fost crearea și utilizarea unui microscop electronic (vezi Fig. 1, B). Microscopul electronic folosește un flux de electroni cu lungimi de undă mai scurte decât microscopul cu lumină. La o tensiune de 50.000 V, lungimea de undă a oscilațiilor electromagnetice care decurg din mișcarea unui flux de electroni în vid este de 0,0056 nm. Se calculează teoretic că distanța rezolvabilă în aceste condiții poate fi de aproximativ 0,002 nm, sau 0,000002 um, adică de 100.000 de ori mai puțin; decât într-un microscop cu lumină. În practică, în microscoapele electronice moderne, distanța rezolvabilă este de aproximativ 0,1-0,7 nm.

În prezent, microscoapele electronice cu transmisie (transmisie) (TEM) și microscoapele electronice cu scanare (scanare) (SEM) sunt utilizate pe scară largă. Cu ajutorul TEM se poate obține doar o imagine plană a microobiectului studiat. Pentru a obține o reprezentare spațială a structurilor, se folosesc SEM-uri care pot crea o imagine tridimensională. Un microscop electronic de scanare funcționează pe principiul scanării unui obiect studiat cu o microsondă electronică, adică „simte” secvenţial puncte individuale ale suprafeţei cu un fascicul de electroni puternic focalizat. Pentru a studia zona selectată, microsonda se deplasează de-a lungul suprafeței sale sub acțiunea bobinelor de deviere (principiul scanării televizoare). O astfel de examinare a unui obiect se numește scanare (citire), iar modelul de-a lungul căruia se mișcă microsonda se numește raster. Imaginea rezultată este afișată pe un ecran de televiziune, al cărui fascicul de electroni se mișcă sincron cu microsonda.

Principalele avantaje ale microscopiei electronice cu scanare sunt o adâncime mare de câmp, o gamă largă de modificări continue ale măririi (de la zeci la zeci de mii de ori) și rezoluție ridicată.

Microscopia electronică înghețată- ciobirea folosit pentru studierea detaliilor structurii membranelor și a conexiunilor intercelulare. Celulele sunt înghețate la o temperatură scăzută (-160°C) pentru a face chipsuri. La examinarea membranei, planul de clivaj trece prin mijlocul stratului dublu lipidic. Mai departe, metalele (platină, paladiu, uraniu) sunt depuse pe suprafețele interioare ale jumătăților obținute ale membranelor, ele sunt studiate folosind TEM și microfotografie.

Metoda criomicroscopiei electronice. Un strat subțire înghețat rapid (aproximativ 100 nm) de probă de țesut este plasat pe o rețea microscopică și examinat sub vid de microscop la -160°C.

Metoda microscopiei electronice „înghețare- gravare" folosit pentru a studia suprafața exterioară a membranelor celulare. După congelarea rapidă a celulelor la o temperatură foarte scăzută, blocul este desfăcut cu o lamă de cuțit. Cristalele de gheață rezultate sunt îndepărtate prin sublimarea apei în vid. Apoi zonele celulelor sunt umbrite prin pulverizarea unei pelicule subțiri de metal greu (de exemplu, platină). Metoda face posibilă dezvăluirea organizării tridimensionale a structurilor.

Astfel, metodele de congelare-clivaj și congelare-gravare fac posibilă studierea celulelor nefixate fără formarea de artefacte induse de fixare în ele.

Metodele de contrast cu sărurile metalelor grele fac posibilă studierea macromoleculelor individuale - ADN, proteine ​​mari (de exemplu, miozina) într-un microscop electronic. Cu contrast negativ, sunt studiate agregatele de macromolecule (ribozomi, virusuri) sau filamente proteice (filamente de actină).

Microscopia electronică a secțiunilor ultrasubțiri obținute prin crioultra-microtomie. Cu această metodă, bucățile de țesut fără fixare și turnare în medii solide sunt răcite rapid în azot lichid la o temperatură de -196 °C. Aceasta asigură inhibarea proceselor metabolice ale celulelor și tranziția apei de la faza lichidă la cea solidă. În continuare, blocurile sunt tăiate pe un ultramicrotom la temperatură scăzută. Această metodă de secționare este de obicei utilizată pentru a determina activitatea enzimelor, precum și pentru efectuarea reacțiilor imunochimice. Pentru detectarea antigenelor, se folosesc anticorpi asociați cu particule de aur coloidal, a căror localizare este ușor de identificat pe preparate.

Metode de microscopie de ultraînaltă tensiune. Se folosesc microscoape electronice cu o tensiune de accelerare de până la 3.000.000 V. Avantajul acestor microscoape este că vă permit să studiați obiecte de grosimi mari (1-10 microni), deoarece la energie electronică mare sunt mai puțin absorbite de obiect. Imagistica stereoscopică permite obținerea de informații despre organizarea tridimensională a structurilor intracelulare cu rezoluție mare (aproximativ 0,5 nm).

Analiza difracției cu raze X. Pentru a studia structura macromoleculelor la nivel atomic se folosesc metode care folosesc raze X cu o lungime de undă de aproximativ 0,1 nm (diametrul atomului de hidrogen). Moleculele care formează o rețea cristalină sunt studiate folosind modele de difracție, care sunt înregistrate pe o placă fotografică sub formă de multe puncte de intensitate diferită. Intensitatea petelor depinde de capacitatea diferitelor obiecte din matrice de a împrăștia radiația. Poziția petelor în modelul de difracție depinde de poziția obiectului în sistem, iar intensitatea lor indică structura atomică internă a acestuia.

Metode pentru studiul celulelor și țesuturilor fixe

Studiul celulelor și țesuturilor fixe. Obiectul principal de cercetare sunt preparate histologice, realizate din structuri fixe. Medicamentul poate fi un frotiu (de exemplu, un frotiu de sânge, măduvă osoasă, salivă, lichid cefalorahidian etc.), o amprentă (de exemplu, a splinei, timusului, ficatului), o peliculă de țesut (de exemplu, conjunctiv sau peritoneal, pleura, pia mater) , tăietură subțire. Cel mai adesea, o secțiune a unui țesut sau organ este folosită pentru studiu. Preparatele histologice pot fi studiate fără prelucrare specială. De exemplu, un frotiu de sânge pregătit, o imprimare, un film sau o secțiune a unui organ poate fi vizualizat imediat la microscop. Dar datorită faptului că structurile au un „contrast slab”, acestea sunt slab detectate într-un microscop cu lumină convențională și este necesară utilizarea unor microscoape speciale (contrast de fază etc.), De aceea, preparatele special prelucrate sunt mai des folosite.

Procesul de fabricare a unui preparat histologic pentru microscopia luminoasă și electronică include următoarele etape principale: 1) luarea materialului și fixarea acestuia, 2) compactarea materialului, 3) pregătirea secțiunilor, 4) colorarea sau contrastarea secțiunilor. Pentru microscopia cu lumină, este necesar încă un pas - încheierea secțiunilor într-un balsam sau alte medii transparente (5). Fixare asigură prevenirea proceselor de descompunere, ceea ce ajută la păstrarea integrității structurilor. Acest lucru se realizează prin faptul că o mică probă prelevată dintr-un organ este fie scufundată într-un fixativ (alcool, formol, soluții de săruri de metale grele, acid osmic, amestecuri speciale de fixare), fie supusă unui tratament termic. Sub acțiunea fixativului, în țesuturi și organe apar modificări fizico-chimice complexe. Cel mai semnificativ dintre ele este procesul de coagulare ireversibilă a proteinelor, în urma căruia activitatea vitală încetează, iar structurile devin moarte, fixate. Fixarea conduce la compactarea și reducerea volumului pieselor, precum și la o îmbunătățire a colorării ulterioare a celulelor și țesuturilor.

piese de etanșare, necesara la pregatirea sectiunilor, se realizeaza prin impregnarea materialului deshidratat anterior cu parafina, celoidina, rasini organice. Compactarea mai rapidă se realizează prin utilizarea metodei de congelare a pieselor, de exemplu în acid carbonic lichid.

Pregatirea sectiunii produs pe dispozitive speciale - microtome(pentru microscopie ușoară) și ultramicrotoame(pentru microscopia electronică).

Colorarea secțiunii(în microscopie cu lumină) sau stropindu-le cu saruri metalice(în microscopia electronică) este utilizat pentru a crește contrastul imaginii structurilor individuale atunci când sunt privite la microscop. Metodele de colorare a structurilor histologice sunt foarte diverse și sunt selectate în funcție de obiectivele studiului. Petele histologice sunt împărțite în acide, bazice și neutre. Exemplele includ cel mai cunoscut colorant de bază, azur II, care colorează nucleele violet, și colorantul acid, eozina, care colorează citoplasma roz-portocaliu. Afinitatea selectivă a structurilor pentru anumiți coloranți se datorează compoziției lor chimice și proprietăților fizice. Se numesc structuri care se colorează bine cu coloranți acizi oxifil(acidofil, eozinofil) și colorare bazică - bazofilă. Structurile care acceptă atât coloranți acizi cât și bazici sunt neutrofil(heterofil). Preparatele colorate sunt de obicei deshidratate în alcooli cu putere crescândă și curățate în xilen, benzen, toluen sau unele uleiuri. Pentru conservarea pe termen lung, o secțiune histologică deshidratată este închisă între o lamă și lamelă cu balsam canadian sau alte substanțe. Preparatul histologic finit poate fi utilizat pentru examinarea microscopică timp de mulți ani. Pentru microscopia electronică, secțiunile obținute pe ultramicrotom sunt așezate pe grile speciale, contrastate cu sărurile de mangan, cobalt etc., după care sunt privite la microscop și fotografiate. Microfotografiile obținute servesc ca obiect de studiu împreună cu preparatele histologice.

Metode pentru studiul celulelor și țesuturilor vii

Studiul celulelor și țesuturilor vii vă permite să obțineți cele mai complete informații despre viața lor - pentru a urmări mișcarea, procesele de diviziune, distrugere, creștere, diferențiere și interacțiune a celulelor, durata ciclului lor de viață, modificări reactive ca răspuns la acţiunea diverşilor factori.

Studii in vivo ale celulelor din organism (învivo). Una dintre metodele vitale de cercetare este observarea structurilor dintr-un organism viu. Cu ajutorul unor microscoape-iluminatoare translucide speciale, de exemplu, este posibil să se studieze dinamica circulației sângelui în microvase. După anestezie la animal, obiectul de studiu (de exemplu, mezenterul intestinului) este scos și examinat la microscop, în timp ce țesuturile trebuie umezite constant cu soluție izotonică de clorură de sodiu. Cu toate acestea, durata unei astfel de observații este limitată. Cele mai bune rezultate se obțin prin implantarea unor camere transparente în corpul unui animal.

Cel mai convenabil organ pentru implantarea unor astfel de camere și observarea ulterioară este urechea unui animal (de exemplu, un iepure). Pe scena microscopului este plasată o secțiune a urechii cu o cameră transparentă și în aceste condiții se studiază dinamica modificărilor în celule și țesuturi pe o perioadă lungă de timp. Astfel, pot fi studiate procesele de evacuare a leucocitelor din vasele de sânge, diferitele etape ale formării țesutului conjunctiv, capilarelor, nervilor și alte procese. Ochiul animalelor de experiment poate fi folosit ca o cameră naturală transparentă. Celulele, țesuturile sau probele de organe sunt plasate în fluidul camerei anterioare a ochiului la unghiul format de cornee și iris și pot fi observate prin corneea transparentă. În acest fel, a fost transplantat un ou fertilizat și au fost urmărite etapele incipiente ale dezvoltării embrionare. Maimuțelor li s-au transplantat bucăți mici de uter și au studiat modificările în mucoasa uterului în diferite faze ale ciclului menstrual.

Metoda de transplant de celule de sânge și măduvă osoasă de la animale donatoare sănătoase la animalele primitoare supuse radiațiilor letale și-a găsit o aplicare largă. Animalele primitoare după transplant au rămas în viață datorită grefei celulelor donatoare care formează colonii de celule hematopoietice în splină. Studiul numărului de colonii și al compoziției lor celulare face posibilă identificarea numărului de celule hematopoietice parentale și a diferitelor etape ale diferențierii acestora. Folosind metoda de formare a coloniilor, au fost stabilite sursele de dezvoltare pentru toate celulele sanguine.

Colorație vitală și supravitală.În timpul colorării vitale (pe durata de viață) a celulelor și țesuturilor, colorantul este introdus în corpul animalului, în timp ce colorează selectiv anumite celule, organitele lor sau substanța intercelulară. De exemplu, folosind albastru tripan sau carmin de litiu, sunt detectate fagocitele și folosind alizarina, o matrice osoasă nou formată.

Colorarea supravitală se referă la colorarea celulelor vii izolate din organism. În acest fel, sunt detectate forme tinere de eritrocite - reticulocite sanguine (colorant albastru cresyl strălucitor), mitocondrii în celule (colorant verde Janus), lizozomi (colorant roșu neutru).

Studii ale celulelor și țesuturilor vii în cultură (învitro). Această metodă este una dintre cele mai comune. Celulele izolate din corpul uman sau animal, mostre mici de țesuturi sau organe sunt plasate în vase de sticlă sau plastic care conțin un mediu nutritiv special - plasmă sanguină, extract embrionar, precum și medii artificiale. Există culturi în suspensie (celule suspendate în mediu), culturi de țesuturi, organe și monostrat (celulele explantate formează un strat continuu pe sticlă). Se asigura sterilitatea mediului si temperatura corespunzatoare temperaturii corpului. În aceste condiții, celulele păstrează pentru o lungă perioadă de timp principalii indicatori ai activității vitale - capacitatea de a crește, reproduce, diferențiere și mișcare. Astfel de culturi pot exista multe zile, luni și chiar ani dacă mediul de cultură este reînnoit și celulele viabile sunt transplantate în alte vase. Unele tipuri de celule, din cauza modificărilor genomului lor, pot persista și se pot multiplica în cultură, formând linii celulare continue. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky și F. M. Lazarenko au avut o mare contribuție la dezvoltarea metodelor de cultivare a celulelor și țesuturilor. În prezent s-au obținut linii celulare de fibroblaste, miocite, epiteliocite, macrofage etc., care există de mulți ani.

Utilizarea metodei de cultivare a făcut posibilă dezvăluirea unui număr de modele de diferențiere, transformare malignă a celulelor, interacțiuni celulare, interacțiuni ale celulelor cu viruși și microbi. Au fost demonstrate capacitatea celulelor cartilajului de a forma o substanță intercelulară în cultură și capacitatea celulelor suprarenale de a produce hormoni. Cultivarea țesuturilor și organelor embrionare a făcut posibilă urmărirea dezvoltării oaselor, pielii și a altor organe. A fost dezvoltată o tehnică de cultivare a celulelor nervoase.

Metoda culturii de țesuturi este de o importanță deosebită pentru efectuarea de observații experimentale asupra celulelor și țesuturilor umane. Celulele prelevate din corpul uman în timpul puncției sau biopsiei pot fi folosite în cultura de țesut pentru a determina sexul, bolile ereditare, degenerescența malignă și pentru a identifica efectele unui număr de substanțe toxice.

În ultimii ani, culturile celulare au fost utilizate pe scară largă pentru hibridizarea celulară.

Au fost dezvoltate metode pentru separarea țesuturilor în celule, izolarea tipurilor individuale de celule și cultivarea acestora.

În primul rând, țesutul este transformat într-o suspensie celulară prin distrugerea contactelor intercelulare și a matricei intercelulare cu ajutorul enzimelor proteolitice (tripsină, colagenaza) și compușilor care leagă Ca 2+ (folosind EDTA - acid etilendiaminotetraacetic). În plus, suspensia rezultată este separată în fracții de celule de diferite tipuri prin centrifugare, ceea ce permite separarea celulelor mai grele de cele mai ușoare, mari de cele mici, sau prin lipirea celulelor de sticlă sau plastic, a căror capacitate este diferită pentru diferite tipuri de celule. Pentru a asigura aderența specifică a celulelor la suprafața de sticlă, sunt utilizați anticorpi care se leagă în mod specific la celulele de același tip. Celulele aderente sunt apoi separate prin descompunerea matricei cu enzime, obținându-se astfel o suspensie de celule omogene. O metodă mai subtilă de separare a celulelor este marcarea cu anticorpi asociați cu coloranți fluorescenți. Celulele marcate sunt separate de celulele nemarcate folosind un sortator (analizor de celule activat prin fluorescență electronică). Analizorul de celule sortează în 1 cu aproximativ 5000 de celule. Celulele izolate pot fi studiate în condiții de cultură.

Metoda de cultivare a celulelor face posibilă studierea activității lor vitale, reproducere, diferențiere, interacțiune cu alte celule, influența hormonilor, factorilor de creștere etc.

Culturile sunt de obicei preparate dintr-o suspensie celulară preparată prin metoda de disociere a țesuturilor descrisă mai sus. Majoritatea celulelor nu pot crește în suspensie, au nevoie de o suprafață solidă, care este suprafața unui vas de cultură din plastic, uneori cu componente ale matricei extracelulare, cum ar fi colagenul. Culturi primare se numesc culturi preparate imediat după prima etapă de fracţionare celulară, secundar- culturi celulare transplantate din culturi primare într-un mediu nou. Celulele pot fi transplantate secvenţial pe parcursul săptămânilor şi lunilor, în timp ce celulele îşi păstrează semnele caracteristice de diferenţiere (de exemplu, celulele epiteliale formează straturi). Materialul de pornire pentru culturile celulare este de obicei țesuturi fetale și neonatale.

Ca medii nutritive se folosesc amestecuri de saruri, aminoacizi, vitamine, ser de cal, extract de embrion de gaina, ser embrionar etc.. Au fost dezvoltate medii speciale pentru cultivarea diferitelor tipuri de celule. Acestea conțin unul sau mai mulți factori de creștere proteici necesari pentru ca celulele să trăiască și să se reproducă. De exemplu, factorul de creștere a nervilor (NGF) este necesar pentru creșterea celulelor nervoase.

Majoritatea celulelor din cultură au un anumit număr de diviziuni (50-100) și apoi mor. Uneori în cultură apar celule mutante, care se înmulțesc la nesfârșit și formează o linie celulară (fibroblaste, epiteliocite, mioblaste etc.). Celulele mutante sunt diferite de celulele canceroase, care sunt, de asemenea, capabile de diviziune continuă, dar pot crește fără a fi atașate de o suprafață solidă. Celulele canceroase din vasele de cultură formează o populație mai densă decât populațiile de celule normale. O proprietate similară poate fi indusă experimental în celulele normale prin transformarea lor cu virusuri asemănătoare tumorilor sau compuși chimici, ceea ce are ca rezultat formarea de linii celulare transformate neoplazic. Liniile celulare ale celulelor netransformate și transformate pot fi stocate pentru o lungă perioadă de timp la temperaturi scăzute (-70 °C). Omogenitatea genetică a celulelor este îmbunătățită prin clonare, atunci când dintr-o celulă se obține o colonie mare de celule omogene în timpul diviziunii sale succesive. O clonă este o populație de celule derivate dintr-o singură celulă progenitoare.

hibrizi celulari. Când două celule de tipuri diferite se îmbină, se formează un heterocarion - o celulă cu doi nuclei. Pentru a obține un heterocarion, o suspensie celulară este tratată cu polietilen glicol sau viruși inactivați pentru a deteriora plasmoleculele celulare, după care celulele sunt capabile de fuziune. De exemplu, nucleul inactiv al unui eritrocit de pui devine activ (sinteza ARN, replicarea ADN-ului) atunci când celulele fuzionează și sunt transferate în citoplasma unei alte celule care crește în cultura de țesut. Heterocarionul este capabil de mitoză, ducând la formarea de celulă hibridă.Învelișurile nucleelor ​​heterocarionului sunt distruse, iar cromozomii lor sunt combinați într-un singur nucleu mare.

Clonarea celulelor hibride duce la formarea liniilor celulare hibride care sunt utilizate pentru studiul genomului. De exemplu, într-o linie celulară hibridă șoarece-om, a fost stabilit rolul cromozomului 11 uman în sinteza insulinei.

Hibridoame. Liniile celulare de hibridom sunt folosite pentru a obține anticorpi monoclonali. Anticorpii sunt produși de celulele plasmatice, care sunt formate din limfocitele B în timpul imunizării. Un tip specific de anticorp este obținut prin imunizarea șoarecilor cu antigeni specifici. Dacă astfel de limfocite imunizate sunt donate, se poate obține o cantitate mare de anticorpi omogene. Cu toate acestea, durata de viață a limfocitelor B în cultură este limitată. Prin urmare, ele fuzionează cu celulele tumorale „nemuritoare” (limfoame B). Ca rezultat, se formează hibrizi. (celula hibrida, cu un genom din două celule diferite; ohm - care se termină cu denumiri tumorale). Astfel de hibridoame sunt capabile să se înmulțească pentru o lungă perioadă de timp în cultură și să sintetizeze anticorpi de un anumit tip. Fiecare clonă de hibridom este o sursă de anticorpi monoclonali. Toate moleculele de anticorpi ale unei anumite specii au aceeași specificitate de legare a antigenului. Este posibil să se genereze anticorpi monoclonali împotriva oricărei proteine ​​​​conținute într-o celulă și să le folosească pentru a localiza proteinele într-o celulă, precum și pentru a izola o proteină dintr-un amestec (purificarea proteinelor), ceea ce permite studierea structurii și funcției proteinelor. . Anticorpii monoclonali sunt utilizați și în tehnologia de clonare a genelor.

Anticorpii pot fi utilizați pentru a studia funcția diferitelor molecule prin introducerea lor prin plasmalemă direct în citoplasma celulelor cu o pipetă de sticlă subțire. De exemplu, introducerea de anticorpi la miozină în citoplasma unui ou fecundat de arici de mare oprește diviziunea citoplasmei.

Tehnologia ADN recombinant. Metodele genetice clasice fac posibilă studierea funcției genelor prin analiza fenotipurilor organismelor mutante și a descendenților acestora. Tehnologia ADN-ului recombinant completează aceste metode, permițând analiza chimică detaliată a materialului genetic și obținerea unor cantități mari de proteine ​​celulare.

Metodele de hibridizare sunt utilizate pe scară largă în biologia modernă pentru a studia structura genelor și expresia lor.

Metode de studiere a compoziției chimice și a metabolismului celulelor și țesuturilor

Pentru a studia compoziția chimică a structurilor biologice - localizarea substanțelor, concentrația și dinamica acestora în procesele metabolice, se folosesc metode speciale de cercetare.

cito-și metode histochimice. Aceste metode fac posibilă detectarea localizării diferitelor substanțe chimice în structurile celulelor, țesuturilor și organelor - ADN, ARN, proteine, carbohidrați, lipide, aminoacizi, minerale, vitamine, activitate enzimatică. Aceste metode se bazează pe specificitatea reacției dintre un reactiv chimic și un substrat care face parte din structurile celulare și tisulare și pe colorarea produselor de reacție chimică. Controlul enzimatic este adesea folosit pentru a crește specificitatea reacției. De exemplu, pentru a detecta acidul ribonucleic (ARN) în celule, este adesea folosită gallocianina - un colorant cu proprietăți de bază și prezența ARN confirmată prin tratamentul de control cu ​​ribonuclează, care scindează ARN-ul. Pete de galocianina ARNîn albastru-violet. Dacă secțiunea este pretratată cu ribonuclează și apoi colorată cu galocianină, atunci absența colorării confirmă prezența acidului ribonucleic în structură. Numeroase metode cito- și histochimice sunt descrise în manuale specifice.

În ultimii ani, combinarea metodelor histochimice cu metoda microscopiei electronice a condus la dezvoltarea unui nou domeniu promițător - histochimia electronică. Această metodă face posibilă studierea localizării diferitelor substanțe chimice nu numai la nivel celular, ci și la nivel subcelular și molecular.

Pentru a studia macromoleculele celulare, se folosesc metode foarte sensibile folosind izotopi și anticorpi radioactivi, care fac posibilă detectarea chiar și a unui conținut mic de molecule (mai puțin de 1000).

izotopi radioactiviîn timpul dezintegrarii nucleului, ele emit particule încărcate (electroni) sau radiații (de exemplu, raze gamma), care pot fi înregistrate în dispozitive speciale. Izotopii radioactivi sunt utilizați în radioautografie. De exemplu, cu ajutorul radioizotopilor de 3 H-timidină se examinează ADN-ul nuclear, cu ajutorul 3H-uridinei - ARN.

metoda radioautografica. Această metodă face posibilă studierea cât mai completă a metabolismului în diferite structuri. Metoda se bazează pe utilizarea elementelor radioactive (de exemplu, fosfor - 32 P, carbon - 14 C, sulf - 35 S, hidrogen - 3 H) sau compuși marcați de aceștia. Substanțele radioactive din secțiuni histologice sunt detectate folosind o emulsie fotografică, care este aplicată pe preparat și apoi dezvoltată. În zonele medicamentului, unde emulsia fotografică intră în contact cu o substanță radioactivă, are loc o fotoreacție, în urma căreia se formează zone iluminate (urme). Această metodă poate fi utilizată pentru a determina, de exemplu, viteza de încorporare a aminoacizilor marcați în proteine, formarea acizilor nucleici, metabolismul iodului în celulele tiroidiene etc.

Metode de analiză imunofluorescentă. Utilizarea anticorpilor. Anticorpii sunt proteine ​​protectoare produse de celulele plasmatice (derivați ai limfocitelor B) ca răspuns la acțiunea unor substanțe străine (antigene). Numărul de diferite forme de anticorpi ajunge la un milion. Fiecare anticorp are locuri pentru „recunoașterea” moleculelor care au determinat sinteza acestui anticorp. Datorită specificității ridicate a anticorpilor pentru antigene, aceștia pot fi utilizați pentru a detecta orice proteine ​​celulare. Pentru a identifica localizarea proteinelor, anticorpii sunt colorați cu coloranți fluorescenți, iar apoi celulele sunt examinate folosind microscopie cu fluorescență. Anticorpii pot fi utilizați și pentru a studia antigenele la nivel ultrastructural folosind un microscop electronic. Pentru aceasta, anticorpii sunt marcați cu particule dense de electroni (microsfere de aur coloidal). Pentru a spori specificitatea reacției, se folosesc anticorpi monoclonali, formați dintr-o linie celulară - clone obținute prin metoda hibridomului dintr-o celulă. Metoda hibridomului face posibilă obținerea de anticorpi monoclonali cu aceeași specificitate și în cantități nelimitate.

Metodele de analiză imunofluorescentă sunt utilizate pe scară largă și eficient în histologia modernă. Aceste metode sunt folosite pentru a studia procesele de diferențiere celulară, pentru a identifica compuși chimici specifici și structurile din acestea. Ele se bazează pe reacții antigen-anticorp. Fiecare celulă a corpului are o compoziție antigenică specifică, care este determinată în principal de proteine. Produșii de reacție pot fi colorați și detectați într-un microscop fluorescent, de exemplu, detectarea actinei și tubulinei într-o celulă folosind metoda de analiză imunofluorescentă (vezi capitolul IV).

Metodele moderne de cercetare fac posibilă analiza compoziției chimice a diferitelor componente structurale ale celulelor, atât fixe, cât și vii. Studiul structurilor intracelulare individuale a devenit posibil după dezvoltarea tehnologiilor de fracționare a conținutului celular.

Fracționarea conținutului celular

Structurile celulare și macromoleculele pot fi fracţionate prin diferite metode - ultracentrifugare, cromatografie, electroforeză. Aceste metode sunt descrise mai detaliat în manualele de biochimie.

Ultracentrifugarea. Folosind această metodă, celulele pot fi împărțite în organite și macromolecule. În primul rând, celulele sunt distruse de șoc osmotic, ultrasunete sau acțiune mecanică. În acest caz, membranele (plasmolema, reticulul endoplasmatic) se rup în fragmente, din care se formează cele mai mici bule, iar nucleii și organitele (mitocondrii, aparatul Golgi, lizozomi și peroxizomi) rămân intacte și se află în suspensia formată.

O centrifugă de mare viteză (80.000-150.000 rpm) este utilizată pentru a separa componentele celulei de mai sus. În primul rând, părți mai mari (nuclei, citoschelet) se depun (sedimentul) în partea de jos a tubului. Odată cu o creștere suplimentară a vitezei de centrifugare a fracțiilor supernatante, particulele mai mici se stabilesc secvenţial - mai întâi mitocondriile, lizozomii și peroxizomii, apoi microzomii și cele mai mici vezicule și, în final, ribozomii și macromoleculele mari. În timpul centrifugării, diferite fracțiuni se depun la viteze diferite, formând benzi separate în eprubetă, care pot fi izolate și examinate. Extractele celulare fracționate (sisteme fără celule) sunt utilizate pe scară largă pentru a studia procesele intracelulare, de exemplu, pentru a studia biosinteza proteinelor, a descifra codul genetic etc.

Cromatografia este utilizată pe scară largă pentru fracţionarea proteinelor.

Electroforeza face posibilă separarea moleculelor de proteine ​​cu sarcini diferite prin plasarea soluțiilor lor apoase (sau într-o matrice poroasă solidă) într-un câmp electric.

Metodele de cromatografie și electroforeză sunt utilizate pentru a analiza peptidele obținute prin divizarea unei molecule de proteine ​​și pentru a obține așa-numitele hărți peptidice ale proteinelor. Aceste metode sunt descrise în detaliu în manualele de biochimie.

Studiul compoziției chimice a celulelor vii. Pentru a studia distribuția substanțelor și metabolismul lor în celulele vii, se folosesc tehnici de rezonanță magnetică nucleară și microelectrozi.

Rezonanța magnetică nucleară (RMN) face posibilă studiul moleculelor mici de substanțe cu greutate moleculară mică. O probă de țesut conține atomi în diferite molecule și în diferite medii, astfel încât va absorbi energie la frecvențe de rezonanță diferite. Diagrama de absorbție la frecvențele de rezonanță pentru o probă dată va fi spectrul acesteia RMN.În biologie, semnalul RMN de la protoni (nuclei de hidrogen) este utilizat pe scară largă pentru a studia proteinele, acizii nucleici etc. Pentru a studia macromoleculele din interiorul unei celule vii, izotopii 3 H, 13 C, 35 K, 31 P sunt adesea utilizați pentru a obține un Semnalează RMN și monitorizează schimbarea acesteia în timpul vieții celulei. Deci, 3| P este folosit pentru a studia contracția musculară - modificări ale conținutului de ATP și fosfat anorganic din țesuturi. Izotopul 13 C face posibilă studierea multor procese în care este implicată glucoza folosind RMN. Utilizarea RMN este limitată de sensibilitatea sa scăzută: 1 g de țesut viu trebuie să conțină cel puțin 0,2 mm din substanța de testat. Avantajul metodei este inofensivă pentru celulele vii.

Tehnologia cu microelectrozi. Microelectrozii sunt tuburi de sticlă umplute cu o soluție conductoare de electricitate (de obicei o soluție KC1 în apă), al cărui diametru final este măsurat în fracțiuni de micron. Vârful unui astfel de tub poate fi introdus în citoplasma celulei prin plasmalemă și se poate determina concentrația ionilor de H + , Na + , K + , C1", Ca 2+ , Mg 2+, diferența de potențial pe membrana plasmatică, și, de asemenea, injectați molecule în celulă.Pentru determinarea concentrației unui anumit ion, se folosesc electrozi ion-selectivi, care sunt umpluți cu o rășină schimbătoare de ioni care este permeabilă numai la acest ion.În ultimii ani, tehnologia microelectrodului a fost utilizată. folosit pentru a studia transportul ionilor prin canale ionice speciale (canale proteice specializate) în membrana plasmatică. În acest caz, un microelectrod cu vârful mai gros, care este apăsat strâns pe partea corespunzătoare a plasmalemei. Această metodă vă permite să studiază funcția unei singure molecule de proteine. Schimbarea concentrației de ioni din interiorul celulei poate fi determinată folosind indicatori luminiscenți. De exemplu, pentru a studia concentrația intracelulară de Ca 2+, se folosește acvarina proteică luminiscentă (izolata din meduze), care radiază lumină t în prezența ionilor de Ca 2+ și reacționează la modificări ale concentrației acestuia din urmă în intervalul 0,5-10 μM. Au fost sintetizați și indicatori fluorescenți care se leagă puternic de Ca2+. Crearea diferitelor tipuri noi de indicatori intracelulari și a metodelor moderne de analiză a imaginii face posibilă determinarea cu precizie și rapiditate a concentrației intracelulare a multor substanțe cu greutate moleculară mică.

Metode cantitative

În prezent, împreună cu metodele calitative, au fost dezvoltate și utilizate metode histochimice cantitative pentru determinarea conținutului de diferite substanțe în celule și țesuturi. O caracteristică a metodelor de cercetare cantitativ-histochimice (spre deosebire de biochimice) este posibilitatea de a studia concentrația și conținutul componentelor chimice în structuri specifice celulelor și țesuturilor.

Citospectrofotometrie- metoda de studiu cantitativ al substantelor intracelulare prin spectrele lor de absorbtie.

Citospectrofluorometrie- o metodă pentru studiul cantitativ al substanțelor intracelulare prin spectrele lor de fluorescență sau prin intensitatea fluorescenței la o lungime de undă preselectată (citofluorometrie).

Microscoape moderne - citofluormetre fac posibilă detectarea unor cantități mici de substanță în diverse structuri (până la 10-14 -10-16 g) și estimarea localizării substanțelor studiate în microstructuri.

Metode pentru analiza imaginilor structurilor celulare și tisulare

Imaginile obţinute ale microobiectelor la microscop, pe un ecran de televiziune, pe microfotografii electronice pot fi supuse unor analize speciale - identificarea parametrilor morfometrici, densitometrici şi prelucrarea lor statistică.

Metode morfometrice fac posibilă determinarea cu ajutorul unor grile speciale (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) a numărului oricăror structuri, ariile acestora, diametrele, etc. În special, în celule, zonele nucleelor, citoplasmei, diametrele acestora , raporturi nuclear-citoplasmatice etc. Există morfometrie manuală și morfometrie automată, în care toți parametrii sunt măsurați și înregistrați automat în aparat.

În ultimii ani, din ce în ce mai răspândit automatizaresisteme integrate de procesare a imaginii (ASOIS), permițând implementarea cât mai eficientă a metodelor cantitative de mai sus pentru studiul celulelor și țesuturilor. În același timp, capacitățile analitice ale microscopiei cantitative sunt completate de metode de analiză și recunoaștere a probelor bazate pe prelucrarea prin intermediul calculatoarelor electronice (calculatoare) a informațiilor extrase din imagini ale celulelor și țesuturilor. În esență, putem vorbi despre dispozitive care nu numai că îmbunătățesc capacitățile optice ale analizorului vizual uman, dar și își extind foarte mult capacitățile analitice. Se exprimă o opinie că ASOIz face aceeași revoluție în morfologie, care s-a întâmplat cu aproximativ 300 de ani în urmă, datorită invenției microscopului luminos, și cu aproximativ 50 de ani în urmă - microscopul electronic, deoarece nu numai că măresc nemăsurat productivitatea cercetătorului și nu doar obiectivează observațiile, ci permit și obținerea de noi informații despre procese anterior nedetectabile, modelează numeric și prezice dezvoltarea lor în celule și țesuturi.

În același timp, participarea la un experiment pe calculator necesită ca cercetătorul să aibă o nouă abordare a conducerii acestuia, să aibă abilitățile de a compune algoritmi pentru procesul de cercetare, acuratețea raționamentului și, în cele din urmă, să crească nivelul științific și metodologic. de cercetare.

Una dintre metodele care a extins semnificativ numărul de probleme morfologice de rezolvat este analiza mașinii opto-structurale (OSMA), propusă în 1965 de K.M.Bogdanov. În 1978, autorul metodei a fost distins cu Premiul de Stat al URSS. Odată cu apariția OSMA, a fost făcut un pas calitativ nou în dezvoltarea unei metodologii unificate pentru analiza cantitativă a microstructurilor bazată pe caracteristici statistice. Recent, OSMA a găsit o aplicare eficientă în practica cercetării și în economia națională.

Pe fig. 2 prezintă sistemul automat de procesare a imaginilor Protva-MP creat în țara noastră de către LOMO. Sistemul este conceput pentru studii complexe ale celulelor și țesuturilor folosind absorbție, microscopie fluorescentă și autoradiografie.

Un microscop optic sau electronic cu scanare special, care face parte din sistem, scanează secvențial imaginea preparatului în două coordonate, o transformă într-o formă digitală și o introduce într-un computer, care, la rândul său, procesează digital imaginea și oferă informații despre caracteristicile geometrice și alte caracteristici ale obiectului analizat.

Folosind un display color, cercetătorul poate „diseca” imaginea, evidențiind doar acele componente structurale care îl interesează. Dispozitivele de stocare a informațiilor încăpătoare incluse în computer pe discuri sau benzi magnetice fac posibilă stocarea atât a imaginilor în sine, cât și a rezultatelor prelucrării lor pentru stocarea și documentarea ulterioară.

Vom lua în considerare utilizarea metodelor de analiză automată a micro-obiectelor folosind exemplul de procesare a unei imagini a unui leucocite din sânge (Fig. 3) Un microscop-fotometru de scanare vă permite să „vizualizați” valorile densității optice linie cu linie cu o etapă specificată de cercetător Ca urmare, semnalul optic corespunzător densității optice a obiectului este convertit în formă digitală Matricea digitală rezultată supusă pregătirii cu ajutorul unui aparat matematic special

Mai întâi, fundalul este îndepărtat și un obiect „curat” este izolat - imaginea celulei (1a), apoi orice detaliu de interes pentru cercetător este selectat din imaginea celulei, de exemplu, citoplasma (16) și nucleul (Ordonez valoarea medie și integrală a densității optice, dispersie, asimetrie, kurtoză etc. Pe baza imaginii obiectului se obțin parametrii morfometrici: aria, perimetrul, diametrul, raportul nuclear-citoplasmatic, factorul de formă etc.

Următoarea etapă a procesării imaginii este construirea de diagrame bidimensionale de interdependență a densității optice pentru întreaga celulă (vezi Fig. 3), citoplasma (Wb) și nucleul (Nm) ei (Nm) și nuclee. Aceste diagrame vă permit să calculați parametrii histogramei de ordinul doi - omogenitate, contrast local, entropie etc.

Orez. 3. Procesarea automată a imaginii celulare (diagrama).

Imaginea unui leucocite (a), a citoplasmei sale (b) și a nucleului (c). I - imagine digitală; II - histograme de densitate optică; III - histograme bidimensionale ale dependenței valorilor densității optice.

Parametrii obținuți în acest fel reprezintă un „portret” multidimensional al celulei și au o expresie numerică specifică. Ele pot fi supuse diferitelor metode de prelucrare statistică, permit clasificarea extrem de precisă a micro-obiectelor, dezvăluie caracteristici ale structurii lor care nu sunt detectabile vizual.

Astfel, aplicarea unor noi metode de cercetare în histologie, citologie și embriologie face posibilă elucidarea tiparelor generale de organizare a țesuturilor și celulelor, fundamentele structurale ale proceselor biochimice care determină funcția componentelor structurale specifice ale celulei.

Structura, ultrastructura și funcționarea organelelor celulare sunt în prezent studiate folosind următoarele metode principale: lumină și electroni, câmp întunecat, contrast de fază, polarizare, microscopie de luminiscență, utilizate pentru studiul structurii, ultrastructura celulelor fixe și centrifugare diferențială. , ceea ce face posibilă izolarea organelor individuale și analizarea lor prin metode citochimice, biochimice, biofizice și alte metode.

Microscopie cu lumină.

Principiul metodei este că un fascicul de lumină, care trece printr-un obiect, pătrunde în sistemul de lentile al obiectivului și construiește o imagine primară, care este mărită cu ajutorul lentilelor ocularului. Partea optică principală a microscopului, care determină principalele sale capacități, este lentila.

În microscoapele moderne, lentilele sunt interschimbabile, ceea ce vă permite să studiați celulele la diferite măriri. Principala caracteristică a unui microscop ca sistem optic este rezoluția sa, adică. capacitatea de a oferi o imagine separată a două obiecte apropiate unul de celălalt.

Imaginile oferite de obiectiv pot fi mărite de multe ori folosind un ocular puternic sau, de exemplu, proiecții pe un ecran (de până la 10 5 ori). Rezoluția unui microscop cu lumină este limitată de lungimea de undă a luminii: cu cât lungimea de undă este mai mică, cu atât rezoluția este mai mare. De obicei, microscoapele ușoare folosesc surse de lumină în regiunea vizibilă a spectrului (400-700 nm), astfel încât rezoluția maximă a microscopului în acest caz nu poate fi mai mare de 200-350 nm (0,2-0,35 microni). Dacă utilizați lumină violetă (260-280 nm), atunci puteți crește rezoluția la 130 - 140 nm (0,13-0,14 microni). Aceasta va fi limita rezoluției teoretice a microscopului luminos, determinată de natura ondulatorie a luminii.

Astfel, tot ce poate oferi un microscop cu lumină ca dispozitiv auxiliar ochiului nostru este să-i mărească rezoluția de aproximativ 1000 de ori (ochiul liber uman are o rezoluție de aproximativ 0,1 mm, ceea ce este egal cu 100 de microni). Aceasta este mărirea „utilă” a microscopului, deasupra căreia nu vom face decât să mărim contururile imaginii fără a dezvălui noi detalii în ea. Prin urmare, atunci când se utilizează regiunea vizibilă a luminii, 0,2-0,3 µm este limita finală de rezoluție a microscopului luminos.

Microscopia electronică.

Pentru un microscop electronic cu scanare, materialul este adesea înghețat pentru a produce o suprafață acoperită cu gheață. În acest caz, pierderea de apă a substanțelor solubile în apă este exclusă, iar modificările chimice în structuri sunt, de asemenea, mai mici. Atunci când se analizează datele obținute cu ajutorul unui microscop electronic, trebuie amintit că această metodă examinează stările statice ale celulei în momentul unei opriri rapide a mișcării citoplasmei cauzată de acțiunea de fixare a substanțelor chimice.

Microscopie în câmp întunecat.

Esența sa este că, la fel ca particulele de praf dintr-un fascicul de lumină (efectul Tyndall), particulele minuscule (mai puțin de 0,2 microni) strălucesc într-o celulă sub iluminare laterală, a cărei lumină reflectată intră în lentila microscopului. Această metodă a fost folosită cu succes în studiul celulelor vii.

Pentru a determina localizarea site-urilor pentru sinteza biopolimerilor, pentru a determina transferul de substanțe într-o celulă, pentru a monitoriza migrarea sau proprietățile celulelor individuale, acestea sunt utilizate pe scară largă metoda autoradiografiei- înregistrarea substanţelor etichetate cu izotopi. De exemplu, folosind această metodă, folosind precursori de ARN marcați, s-a demonstrat că tot ARN-ul este sintetizat doar în nucleul de interfază, iar prezența ARN-ului citoplasmatic este rezultatul migrării moleculelor sintetizate din nucleu.

În citologie, diverse metode analitice și pregătitoare biochimie. În acest din urmă caz, diferite componente celulare pot fi obținute sub formă de fracții separate și pot fi studiate chimia, ultrastructura și proprietățile acestora. În prezent, aproape orice organele și structurile celulare sunt obținute sub formă de fracții pure.

Una dintre principalele moduri de a izola structurile celulare este centrifugare diferenţială (separatoare). Principiul aplicării sale este că timpul de depunere a particulelor în omogenat depinde de dimensiunea și densitatea lor: cu cât particulele sunt mai mari sau mai grele, cu atât se va depune mai repede pe fundul eprubetei. Pentru a accelera acest proces de decantare se folosesc accelerațiile create de centrifugă.

Prin centrifugarea fracționată repetată a subfracțiilor mixte se pot obține fracții pure. În cazurile de separare mai fină a fracțiilor, se utilizează centrifugarea într-un gradient de densitate a zaharozei, ceea ce face posibilă separarea bine a componentelor, chiar și ușor diferite unele de altele în greutate specifică. Fracțiile obținute, înainte de a fi analizate prin metode biochimice, trebuie verificate pentru puritatea utilizând un microscop electronic.

Întrebări de test:

1. Niveluri de organizare a materiei vii

2. Teoria celulară a organizării organismelor

3. Metode de cercetare în citologie

4. Sarcini și subiect de citologie

5. Dispozitivul unui microscop cu lumină

6. Dispozitiv cu microscop electronic

7. Măsuri de siguranță pentru lucrări citologice

8. Cerințe pentru pregătirea materialului biologic pentru examen citologic

9. Agenți de fixare, mecanism de acțiune

10. Citochimie, cerințe materiale și capacități

11. Analiza cantitativă (morfometrie), cerințe și posibilități

12. Artefacte în citologie, modalități de obiectivare a rezultatelor

1. Zavarzin A.A., Kharazova A.D. Fundamentele citologiei generale. - L., 1982.

2. Chentsov Yu.S. Fundamentele citologiei. - M., 1984.

3. Shubnikova E.A. Morfologia funcțională a țesuturilor. - M., Editura Universității de Stat din Moscova, 1981.