În cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), natura proceselor care au loc în coloana cromatografică este în general identică cu procesele din cromatografia în gaz. Singura diferență este în utilizarea lichidului ca fază staționară. Datorită densității mari a fazelor mobile lichide și rezistenței mari a coloanelor, cromatografia de gaz și lichid diferă foarte mult în instrumentație.

În HPLC, solvenții puri sau amestecurile acestora sunt de obicei utilizați ca faze mobile.

Pentru a crea un flux de solvent pur (sau amestecuri de solvenți), numit eluent în cromatografia lichidă, se folosesc pompe incluse în sistemul hidraulic al cromatografului.

Cromatografia de adsorbție este efectuată ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.

Cele mai utilizate pe scară largă în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu și alți adsorbanți sunt folosiți mult mai puțin frecvent. Motivul principal pentru aceasta:

Rezistenta mecanica insuficienta, care nu permite ambalarea si utilizarea la presiuni mari caracteristice HPLC;

gelul de silice, în comparație cu oxidul de aluminiu, are o gamă mai largă de porozitate, suprafață și diametru al porilor; Activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu duce la denaturarea rezultatelor analizei din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimiosorbției ireversibile a acestora.

Detectoare pentru HPLC

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este utilizată pentru a detecta substanțe polare nevolatile care, din anumite motive, nu pot fi transformate într-o formă adecvată pentru cromatografia în gaz, chiar și sub formă de derivați. Astfel de substanțe, în special, includ acizi sulfonici, coloranți solubili în apă și unele pesticide, de exemplu derivați de fenil-uree.

Detectoare:

Detector UV pe o matrice de diode. O „matrice” de fotodiode (mai mult de două sute dintre ele) înregistrează în mod constant semnale în regiunile UV și vizibile ale spectrului, oferind astfel înregistrarea spectrelor UV-B în modul de scanare. Acest lucru vă permite să înregistrați continuu, la sensibilitate ridicată, spectre nedistorsionate ale componentelor care trec rapid printr-o celulă specială.

În comparație cu detecția cu o singură lungime de undă, care nu oferă informații despre puritatea maximă, capacitatea de a compara spectre complete ale unei rețele de diode oferă un grad mult mai mare de încredere în rezultatul identificării.

Detector de fluorescență. Marea popularitate a detectorilor fluorescenți se datorează selectivității și sensibilității lor foarte ridicate, precum și faptului că mulți poluanți ai mediului fluoresc (ex. hidrocarburi poliaromatice).

Un detector electrochimic este utilizat pentru a detecta substanțe care se oxidează sau se reduc cu ușurință: fenoli, mercaptani, amine, derivați aromatici nitro și halogen, aldehide, cetone, benzidine.

Separarea cromatografică a unui amestec pe o coloană din cauza progresului lent al PF durează mult timp. Pentru a accelera procesul, cromatografia se efectuează sub presiune. Această metodă se numește cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Modernizarea echipamentelor utilizate în cromatografia pe coloană lichidă clasică a făcut din aceasta una dintre cele mai promițătoare și moderne metode de analiză. Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o metodă convenabilă pentru separarea, izolarea preparativă și analiza calitativă și cantitativă a compușilor termolabili nevolatili cu greutate moleculară mică și mare.

În funcție de tipul de sorbent utilizat, această metodă folosește 2 opțiuni de cromatografie: pe un sorbent polar folosind un eluant nepolar (opțiune cu fază directă) și pe un sorbent nepolar cu un eluant polar - așa-numitul înalt cu fază inversă. -cromatografie lichidă de performanţă (RPHPLC).

În timpul tranziției de la eluent la eluent, echilibrul în condiții HPLC este stabilit de multe ori mai repede decât în ​​condițiile de adsorbanți polari și PF-uri neapoase. Ca urmare a acestui fapt, precum și confortul de a lucra cu eluanți apoși și apos-alcool, OFVLC a câștigat acum o mare popularitate. Majoritatea analizelor HPLC sunt efectuate folosind această metodă.

Detectoare. Ieșirea unei componente individuale din coloană este înregistrată cu ajutorul unui detector. Pentru înregistrare, puteți utiliza o modificare a oricărui semnal analitic provenit din faza mobilă și asociată cu natura și cantitatea componentului amestecului. Cromatografia lichidă folosește semnale analitice precum absorbția luminii sau emisia de lumină a soluției de ieșire (detectori fotometrici și fluorimetrici), indicele de refracție (detectori refractometrici), conductivitatea potențială și electrică (detectori electrochimici) etc.

Semnalul detectat continuu este înregistrat de un reportofon. O cromatogramă este o secvență de semnale de detectoare înregistrate pe o bandă de înregistrare, generată atunci când componentele individuale ale unui amestec părăsesc coloana. Dacă amestecul este separat, vârfurile individuale sunt vizibile pe cromatograma externă. Poziția vârfului în cromatogramă este utilizată în scopul identificării substanței, a înălțimii sau a zonei vârfului - în scopul determinării cantitative.

Aplicație

HPLC este utilizat pe scară largă în următoarele domenii de analiză chimică (sunt evidențiate obiectele de analiză în care HPLC practic nu are concurență):

· Controlul calitatii alimentelor - aditivi tonici si aromatizanti, aldehide, cetone, vitamine, zaharuri, coloranti, conservanti, medicamente hormonale, antibiotice, triazine, carbamate si alte pesticide, micotoxine, nitrozamine, hidrocarburi aromatice policiclice etc.

· Protecția mediului - fenoli, compuși organici nitro, hidrocarburi aromatice mono- și policiclice, o serie de pesticide, anioni și cationi principali.

· Criminalistică - droguri, explozivi organici și coloranți, produse farmaceutice puternice.

· Industria farmaceutică - hormoni steroizi, aproape toate produsele de sinteză organică, antibiotice, preparate polimerice, vitamine, preparate proteice.

· Medicină - substanțele biochimice și medicinale enumerate și metaboliții acestora din fluidele biologice (aminoacizi, purine și pirimidine, hormoni steroizi, lipide) în diagnosticarea bolilor, determinarea ratei de eliminare a medicamentelor din organism în scopul dozării lor individuale.

· Agricultura – determinarea nitraților și fosfatului în sol pentru determinarea cantității necesare de îngrășăminte aplicate, determinarea valorii nutritive a furajelor (aminoacizi și vitamine), analiza pesticidelor din sol, apă și produse agricole.

· Biochimie, chimie bioorganică, inginerie genetică, biotehnologie - zaharuri, lipide, steroizi, proteine, aminoacizi, nucleozide și derivații acestora, vitamine, peptide, oligonucleotide, porfirine etc.

· Chimie organică - toți produsele stabile de sinteză organică, coloranți, compuși termolabili, compuși nevolatili; chimie anorganică (aproape toți compușii solubili sub formă de ioni și compuși complecși).

· controlul calității și siguranței alimentelor, băuturilor alcoolice și nealcoolice, apei potabile, substanțelor chimice de uz casnic, parfumurilor în toate etapele producției acestora;

· determinarea naturii poluării la locul unui dezastru provocat de om sau al unei urgențe;

· detectarea și analiza substanțelor narcotice, puternice, otrăvitoare și explozive;

· determinarea prezenței substanțelor nocive (hidrocarburi policiclice și alte aromatice, fenoli, pesticide, coloranți organici, ioni de metale grele, alcaline și alcalino-pământoase) în efluenții lichizi, emisiile atmosferice și deșeurile solide din întreprinderi și în organismele vii;

· monitorizarea proceselor de sinteza organica, rafinarea petrolului si carbunelui, productia biochimica si microbiologica;

analiza calității solului pentru fertilizare, prezența pesticidelor și erbicidelor în sol, apă și produse, precum și valoarea nutritivă a furajelor; sarcini complexe de cercetare analitică; obţinerea de microcantităţi de substanţe ultrapure.



Introducere.

Dezvoltarea rapidă a cromatografiei lichide în ultimii 10 ani se datorează în principal dezvoltării intensive a fundamentelor teoretice și utilizării practice a versiunii sale extrem de eficiente, precum și creării și producției industriale a absorbanților și echipamentelor necesare.

O trăsătură distinctivă a cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) este utilizarea de adsorbanți cu o dimensiune a granulelor de 3-10 microni, care asigură un transfer rapid de masă cu o eficiență de separare foarte mare.

În prezent, HPLC a ocupat primul loc printre metodele instrumentale în ceea ce privește ratele de dezvoltare, depășind chiar și cromatografia de gaze. Cel mai important avantaj al HPLC în comparație cu cromatografia în gaz este capacitatea de a studia aproape orice obiect fără nicio restricție asupra proprietăților lor fizico-chimice, de exemplu, punctele de fierbere sau greutatea moleculară.

Astăzi, HPLC este o metodă instrumentală bine concepută, care este utilizată pe scară largă într-o mare varietate de domenii ale științei și tehnologiei. Importanța sa este deosebit de mare în domenii critice precum biochimia, biologia moleculară, controlul poluării mediului, precum și în industria chimică, petrochimică, alimentară și farmaceutică.

întrucât este necesar să se țină seama de o serie de cerințe foarte specifice datorită următoarelor caracteristici ale metodologiei.

A. Coloanele HPLC sunt împachetate cu medii cu diametru de particule foarte mic. Ca rezultat, la acele viteze volumetrice ale solventului care sunt necesare pentru separarea rapidă a probei, se creează presiune ridicată pe coloană.

b. Detectoarele utilizate în HPLC sunt sensibile la fluctuațiile debitului de eluant și ale presiunii (zgomot). Mai mult, atunci când se utilizează detectoare de concentrație, este necesară o stabilitate și mai mare a vitezei volumetrice a eluantului.

V. Procesul de separare cromatografică este însoțit de o serie de efecte antagoniste, de exemplu, dispersia probei în faza mobilă duce la amestecarea componentelor separate și reduce concentrația maximă a substanței în vârful eluat (în detector). Dispersia este observată în toate zonele sistemului de la punctul de injectare a probei până la detector.

d. Solvenții care acționează ca o fază mobilă pot provoca adesea coroziunea echipamentelor. Acest lucru se aplică în primul rând solvenților utilizați în cromatografia în fază inversă, care este preferată în aplicațiile HPLC biochimice.

Specificul HPLC ca tehnică instrumentală trebuie să fie luate în considerare în timpul dezvoltării, creării și exploatării acestor sisteme. A fost nevoie de mai mult de zece ani de căutare și cercetare pentru a crea mostre comerciale de sisteme cromatografice și componentele acestora care sunt suficient de fiabile, simple și sigure pentru a fi operate, cu un raport acceptabil între preț și caracteristicile tehnice. Tendințele recente de reducere a coloanelor (atât lungimea cât și diametrul) impun noi cerințe asupra instrumentelor.

1.1. EFICIENŢĂȘISELECTIVITATEA

Cromatografia este o metodă de separare a componentelor unui amestec pe baza diferenței în distribuția lor de echilibru între două „faze nemiscibile, dintre care una staționară, iar cealaltă mobilă. Componentele probei se deplasează de-a lungul coloanei atunci când se află în faza mobilă, și rămân pe loc atunci când sunt în faza staționară Cu cât afinitatea componentei pentru faza staționară este mai mică și cu atât este mai mică pentru faza mobilă, cu atât se deplasează mai lent prin coloană și cu atât este reținută mai mult în ea. Datorită diferenței de afinitate a componentelor amestecului pentru fazele staționare și mobile, obiectivul principal al cromatografiei este atins - separarea unei perioade de timp acceptabile a amestecului în benzi individuale (vârfuri) ale componentelor pe măsură ce se deplasează de-a lungul coloanei cu faza mobilă.

Din aceste concepte generale, este clar că separarea cromatografică este posibilă numai dacă componentele probei, care intră în coloană la introducerea probei, în primul rând, sunt dizolvate în faza mobilă și, în al doilea rând, interacționează (reținute) cu faza staționară. . Dacă, la introducerea unei probe, orice componente nu sunt sub formă de soluție, acestea vor fi filtrate și nu vor participa la procesul cromatografic. De asemenea, componentele care nu interacționează cu faza staționară vor trece prin coloana cu faza mobilă fără a se separa în componentele lor.

Să acceptăm condiția ca vreo două componente să fie solubile în faza mobilă și să interacționeze cu faza staționară, adică procesul croiatografic poate decurge fără perturbări. În acest caz, după trecerea amestecului prin coloană, puteți obține cromatograme ale formei a, b sau V(Fig. 1.1). Aceste cromatograme ilustrează separări cromatografice care diferă ca eficiență (Ași b) cu selectivitate și selectivitate egale (bȘi V) cu egala eficienta.

Cu cât vârful obținut în același timp de retenție este mai îngust, cu atât eficiența coloanei este mai mare. Eficiența coloanei este măsurată prin numărul de plăci teoretice (NPT) N: cu atât eficiența este mai mare

Orez. 1.2. Parametrii de vârf cromatografici și calculul numărului de plăci teoretice:

t R - timpul de retenție maxim; h - înălțimea vârfului; Wj/j - lățimea vârfului la jumătatea înălțimii sale

Orez. 1.1. Tip de cromatogramă în funcție de eficiența și selectivitatea coloanei:

A- selectivitate normală, eficiență redusă (mai puține plăci teoretice); b - selectivitatea si eficienta obisnuita; V - eficiență normală, selectivitate crescută (raport mai mare al timpilor de retenție al componentelor)

eficiență, cu cât FTT este mai mare, cu atât este mai mică lărgirea vârfului benzii inițial înguste pe măsură ce trece prin coloană și cu atât vârful este mai îngust la ieșirea din coloană. PTT caracterizează numărul de pași în stabilirea echilibrului între fazele mobile și staționare.

Cunoscând numărul de plăci teoretice pe coloană și lungimea coloanei L (µm), precum și diametrul mediu al granulelor de absorbant DC (µm), este ușor de obținut valorile înălțimii echivalente cu o placă teoretică (HETT), precum și ale înălțimii reduse echivalente cu o placă teoretică (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT =B3TT/d c .

Având valorile FTT, HETT și PHETT, se poate compara cu ușurință eficiența coloanelor de diferite tipuri, lungimi diferite, umplute cu adsorbanți de natură și granularitate diferite. Prin compararea PTT a două coloane de aceeași lungime, se compară eficiența acestora. Când se compară HETP, se compară coloanele cu absorbanți de aceeași dimensiune a granulelor și lungimi diferite. În cele din urmă, valoarea PVETT permite oricăror două coloane să evalueze calitatea sorbantului, în primul rând și calitatea umplerii coloanelor și, în al doilea rând, indiferent de lungimea coloanelor, granularea sorbanților de natura sa.

Selectivitatea coloanei joacă un rol important în realizarea separării cromatografice.

Selectivitatea unei coloane depinde de mulți factori, iar priceperea experimentatorului este în mare măsură determinată de capacitatea de a influența selectivitatea separării. Pentru aceasta, trei factori foarte importanți sunt în mâinile cromatografului: alegerea naturii chimice a sorbantului, alegerea compoziției solventului și a modificatorilor săi și luarea în considerare a structurii chimice și a proprietăților componentelor separate. . Uneori, o modificare a temperaturii coloanei, care modifică coeficienții de distribuție a substanțelor între fazele mobile și staționare, are un efect vizibil asupra selectivității.

Atunci când se analizează și se evaluează separarea a două componente într-o cromatogramă, rezoluția este un parametru important. R s, care raportează timpii de ieșire și lățimile de vârf ale ambelor componente separate

Rezoluția ca parametru care caracterizează separarea vârfurilor crește pe măsură ce selectivitatea crește, reflectată de o creștere a numărătorului, iar eficiența crește, reflectată printr-o scădere a valorii numitorului datorită scăderii lățimii vârfurilor. Prin urmare, progresul rapid al cromatografiei lichide a condus la o schimbare a conceptului de „cromatografie lichidă de înaltă presiune” - a fost înlocuită cu „cromatografie lichidă de înaltă rezoluție” (în timp ce forma prescurtată a termenului în limba engleză a fost păstrată). HPLC ca fiind cel mai corect care caracterizează direcţia de dezvoltare a cromatografiei lichide moderne).

Astfel, spălarea coloanei este redusă și eficiența crește atunci când se folosește un sorbant mai fin, mai uniform în compoziție (fracție îngustă), mai dens și mai uniform împachetat în coloană, folosind straturi mai subțiri de fază de grefă, solvenți mai puțin vâscoși și debite optime.

Cu toate acestea, odată cu estomparea benzii zonei cromatografice în timpul procesului de separare în coloană, aceasta poate fi spălată și în dispozitivul de introducere a probei, în capilarele de legătură injector - coloană și coloană - detector, în celula detector și în unele dispozitive auxiliare (microfiltre pentru captarea particulelor mecanice din probele instalate după injector, precoloane, reactoare cu bobine etc.) - Cu cât volumul extracoloană este mai mare în comparație cu volumul reținut al vârfului, cu atât eroziunea este mai mare. De asemenea, contează unde se află volumul mort: cu cât semnalul cromatografic este mai îngust, cu atât este mai mare estomparea volumului mort. Prin urmare, trebuie acordată o atenție deosebită designului acelei părți a cromatografului în care zona cromatografică este cea mai îngustă (injectorul și dispozitivele de la injector la coloană) - aici eroziunea extra-coloană este cea mai periculoasă și are cel mai mare impact. Deși se crede că în cromatografele bine concepute sursele de diluție suplimentară extra-coloană ar trebui reduse la minimum, cu toate acestea, fiecare dispozitiv nou, fiecare modificare a cromatografului trebuie în mod necesar să se încheie cu testarea pe o coloană și compararea cromatogramei rezultate. cu cel de pașaport. Dacă se observă o distorsiune maximă sau o scădere bruscă a eficienței, capilarele și alte dispozitive nou introduse în sistem trebuie inspectate cu atenție.

Spălarea în afara coloanei și evaluarea greșită a acesteia pot duce la o pierdere semnificativă (peste 50%) a eficienței, în special în cazurile în care se încearcă utilizarea cromatografelor relativ vechi pentru HPLC de mare viteză, HPLC pe microcoloană și alte variante ale HPLC moderne care necesită microinjectoare, capilare de conectare cu interior cu un diametru de 0,05-0,15 mm lungime minimă, coloane cu o capacitate de 10-1000 µl, detectoare cu microcuve cu o capacitate de 0,03-1 µl și cu înregistratoare și integratoare de mare viteză, de mare viteză .

1.2. RETENȚIA SOLVENTULUI ȘI REZISTENTA

Pentru ca analiții să fie separați pe coloană, așa cum sa menționat mai sus, coeficientul de capacitate k" trebuie să fie mai mare decât 0, adică substanțele trebuie reținute de faza staționară, sorbant. Cu toate acestea, factorul de capacitate nu trebuie să fie prea mare pentru a obține un timp de eluție acceptabil. Dacă pentru un anumit amestec de substanțe este selectată o fază staționară care le reține, atunci munca ulterioară pentru dezvoltarea unei tehnici de analiză constă în alegerea unui solvent care ar oferi în mod ideal diferit pentru toate componentele, dar acceptabil nu foarte mare. k". Acest lucru se realizează prin modificarea puterii de eluare a solventului.

În cazul cromatografiei de adsorbție pe silicagel sau oxid de aluminiu, de regulă, puterea unui solvent cu două componente (de exemplu, hexan cu adăugarea de izopropanol) este crescută prin creșterea conținutului de componentă polară (izopropanol), sau a scăzut prin scăderea conținutului de izopropanol. Dacă componenta polară care o conține devine prea mică (mai puțin de 0,1%), ar trebui înlocuită cu o forță de eluare mai slabă. La fel se procedează, înlocuind fie componenta polară, fie nepolară cu altele, chiar dacă acest sistem nu asigură selectivitatea dorită în raport cu componentele de interes din amestec. La selectarea sistemelor de solvenți se ține cont atât de solubilitatea componentelor amestecului, cât și de seria eluotropă a solvenților compilați de diferiți autori.

Puterea solventului este selectată aproximativ în același mod atunci când se utilizează faze polare grefate (nitril, amino, diol, nitro etc.), ținând cont de posibilele reacții chimice și excluzând solvenții periculoși pentru fază (de exemplu, cetone pentru faza amino).

În cazul cromatografiei în fază inversă, puterea solventului este crescută prin creșterea conținutului de component organic din eluent (metanol, acetonitril sau THF) și scade prin adăugarea mai multor apă. Dacă nu este posibilă atingerea selectivității dorite, aceștia folosesc o altă componentă organică sau încearcă să o schimbe folosind diverși aditivi (acizi, reactivi perechi de ioni etc.).

În separările prin cromatografia cu schimb ionic, puterea solventului este modificată prin creșterea sau scăderea concentrației soluției tampon sau prin modificarea pH-ului în unele cazuri, se folosește modificarea cu substanțe organice;

Cu toate acestea, în special în cazul amestecurilor naturale și biologice complexe, adesea nu este posibil să se selecteze puterea solventului în așa fel încât toate componentele probei să elueze într-un timp acceptabil. Apoi trebuie să recurgeți la eluția în gradient, adică să utilizați un solvent a cărui putere de eluție se modifică în timpul procesului de analiză, astfel încât să crească în mod constant conform unui program predeterminat. Această tehnică face posibilă eluarea tuturor componentelor amestecurilor complexe într-o perioadă de timp relativ scurtă și separarea lor în componente sub formă de vârfuri înguste.

1.3. DIMENSIUNEA, PERMEABILITATEA ŞI EFICIENŢA PARTICULUI SORBENT

Având în vedere eroziunea din coloană, am indicat că eficiența coloanei (HETT) depinde de dimensiunea particulelor de sorbant. În mare măsură, dezvoltarea rapidă a HPLC în ultimii 10-12 ani s-a datorat, în primul rând, dezvoltării metodelor de producere a absorbanților cu dimensiuni ale particulelor de la 3 până la 10 microni și cu o compoziție fracționată îngustă, oferind eficiență ridicată cu o bună eficiență. permeabilitatea și, în al doilea rând, metodele de dezvoltare pentru umplerea coloanelor cu acești adsorbanți și, în al treilea rând, dezvoltarea și producția în serie de cromatografe lichide cu pompe de înaltă presiune, injectoare și detectoare cu cuve de volum mic capabile să înregistreze vârfuri de volum mic.

Pentru coloanele bine împachetate cu nămol, înălțimea teoretică echivalentă redusă a plăcii (LPHE) poate fi 2, indiferent dacă sunt utilizate particule de 3, 5, 10 sau 20 μm pentru împachetare. În acest caz, vom primi respectiv coloane (cu lungimea standard de 250 mm) cu randamentul de 41670, 25000, 12500 și 6250 t.t. Pare natural să selectați cea mai eficientă coloană plină cu particule de 3 µm. Cu toate acestea, această eficiență va veni cu prețul funcționării la presiune foarte mare și al vitezei de separare relativ scăzute, deoarece pompa existentă va putea, cel mai probabil, să pompeze solventul printr-o astfel de coloană la o viteză volumetrică mare. Aici ne confruntăm cu problema relației dintre dimensiunea particulelor sorbantului, eficiența și permeabilitatea coloanelor.

Dacă exprimăm de aici factorul de rezistență al coloanei - o mărime adimensională, obținem următoarea ecuație:

Factorul de rezistență pentru coloanele împachetate cu microparticule de același tip folosind aceeași metodă variază ușor și are următoarele valori:

Tipul de particule „... Neregulat Sferic

formă de formă

Ambalare uscată. . . . . 1000-2000 800-1200

Ambalaj cu suspensie. . . 700-1500 500-700

Presiunea de intrare a coloanei este proporțională cu viteza de curgere liniară, factorul de rezistență al coloanei, vâscozitatea solventului și lungimea coloanei și invers proporțională cu pătratul diametrului particulei.

Aplicând această relație coloanelor descrise mai sus cu particule cu diametre de 3, 5, 10 și 20 µm și presupunând debitul liniar constant, factorul de rezistență al coloanei și vâscozitatea solventului, obținem un raport al presiunii de intrare de 44:16:4:1. pentru coloane de lungime egală. Astfel, dacă pentru un sorbent în fază inversă cu o dimensiune a particulei de 10 μm atunci când se utilizează sisteme de solvenți cu metanol - . apă (70:30) de obicei pe o coloană standard la un debit de solvent de 1 ml/min, presiunea la intrarea în coloană este de 5 MPa, apoi pentru particule de 5 μm - 20 MPa și pentru 3 μm - 55 MPa . Când se utilizează silicagel și un sistem de solvent mai puțin vâscos, hexan - izopropanol (100:2), valorile vor fi semnificativ mai mici: 1, 4 și, respectiv, 11 MPa. Dacă în cazul unui sorbent cu fază inversă, utilizarea particulelor cu o dimensiune de 3 μm este foarte problematică și 5 μm este posibilă, dar nu pe toate dispozitivele, atunci pentru un sorbent în fază normală nu există probleme cu presiunea. Trebuie remarcat faptul că HPLC modernă de mare viteză utilizează de obicei un debit de solvent mai mare decât în ​​exemplul de mai sus, astfel încât cerințele de presiune cresc și mai mult.

Cu toate acestea, în cazurile în care este necesar un anumit număr de plăci teoretice pentru separare și este de dorit să se efectueze o analiză a vitezei, imaginea se schimbă oarecum. Deoarece lungimile coloanelor cu adsorbanți cu granule de 3, 5, 10 microni, cu eficiență egală, vor fi, respectiv, de 7,5; 12,5 și 25 cm, apoi raportul de presiune la intrarea în coloane se va schimba la 3:2:1. În consecință, durata analizei pe astfel de coloane de eficiență egală va fi în raportul 0,3:0,5:1, adică, atunci când se trece de la 10 la 5 și 3 microni, durata analizei va fi redusă de 2 și 3,3 ori. Această analiză mai rapidă vine cu prețul unei presiuni proporțional mai mari la intrarea în coloană.

Datele prezentate sunt valabile pentru acele cazuri în care adsorbanții de diferite dimensiuni ale granulelor au aceleași curbe de distribuție a dimensiunii particulelor, coloanele sunt împachetate în același mod și au același factor de rezistență al coloanei. Trebuie avut în vedere faptul că dificultatea de a obține fracții înguste ale sorbantului crește pe măsură ce dimensiunea particulelor scade și că. Fracțiile de la diferiți producători au compoziții fracționale diferite. Prin urmare, factorul de rezistență al coloanei va varia în funcție de mărimea granulelor, tipul de absorbant, metoda de împachetare a coloanei etc.

CLASIFICAREA METODELOR HPLC PRIN MECANISM DE SEPARARE

Majoritatea separărilor efectuate prin HPLC se bazează pe un mecanism mixt de interacțiune a substanțelor cu un sorbant, asigurând o retenție mai mare sau mai mică a componentelor în coloană. Mecanismele de separare într-o formă mai mult sau mai puțin pură sunt destul de rare în practică, de exemplu, adsorbția atunci când se utilizează silicagel absolut anhidru și hexan anhidru pentru a separa hidrocarburile aromatice.

Cu un mecanism de retenție mixt pentru substanțe cu diferite structuri și greutăți moleculare, este posibil să se evalueze contribuția la retenția de adsorbție, distribuție, excludere și alte mecanisme. Cu toate acestea, pentru o mai bună înțelegere și înțelegere a mecanismelor de separare în HPLC, este recomandabil să se ia în considerare separările cu o predominanță a unuia sau altuia mecanism ca fiind legate de un anumit tip de cromatografie, de exemplu, cromatografia cu schimb de ioni.

2.1.1 CROMATOGRAFIA ADSORBIEI

Separarea prin cromatografie de adsorbție se realizează ca urmare a interacțiunii unei substanțe cu adsorbanți, cum ar fi silicagel sau oxid de aluminiu, care au centrii activi la suprafață. Diferența în capacitatea de a interacționa cu centrele de adsorbție ale diferitelor molecule de probă duce la separarea acestora în zone în timpul mișcării cu faza mobilă de-a lungul coloanei. Separarea zonei a componentelor realizată în acest caz depinde de interacțiunea atât cu solventul, cât și cu adsorbantul.

Sorpția pe suprafața unui adsorbant care conține grupări hidroxil se bazează pe o interacțiune specifică între suprafața polară a adsorbantului și grupările sau secțiunile polare (sau polarizabile) de molecule. Astfel de interacțiuni includ interacțiunea dipol-dipol între dipoli permanenți sau induși, formarea unei legături de hidrogen, până la formarea de complexe r sau complexe de transfer de sarcină. O posibilă și destul de frecventă apariție în munca practică este manifestarea chimisorbției, care poate duce la o creștere semnificativă a timpului de retenție, o scădere bruscă a eficienței, apariția produselor de descompunere sau sorbția ireversibilă a substanței.

Izotermele de adsorbție ale substanțelor au formă liniară, convexă sau concavă. Cu o izotermă de adsorbție liniară, vârful substanței este simetric și timpul de retenție nu depinde de dimensiunea probei. Cel mai adesea, izotermele de adsorbție ale substanțelor sunt neliniare și au o formă convexă, ceea ce duce la o anumită asimetrie a vârfului cu formarea unei cozi.

Cele mai utilizate pe scară largă în HPLC sunt adsorbanții de silicagel cu diferite volume de pori, suprafețe și diametre ale porilor. Oxidul de aluminiu este folosit mult mai rar, iar alți adsorbanți, utilizați pe scară largă în cromatografia clasică pe coloană și în strat subțire, sunt utilizați extrem de rar. Motivul principal pentru aceasta este rezistența mecanică insuficientă a majorității celorlalți adsorbanți, care nu le permite să fie ambalate sau utilizate la presiuni ridicate caracteristice HPLC.

Grupările polare care provoacă adsorbția și sunt situate pe suprafața gelului de silice și a oxidului de aluminiu sunt similare ca proprietăți. Prin urmare, de obicei, ordinea de eluție a amestecurilor de substanțe și seria eluotropă de solvenți sunt aceleași pentru acestea. Cu toate acestea, diferența în structura chimică a gelului de silice și a oxidului de aluminiu duce uneori la diferențe de selectivitate - apoi se acordă preferință unuia sau altui adsorbant care este mai potrivit pentru o anumită sarcină specifică. De exemplu, alumina oferă o selectivitate mai mare pentru separarea anumitor hidrocarburi aromatice polinucleare.

Preferința acordată de obicei gelului de silice în comparație cu oxidul de aluminiu se explică printr-o gamă mai largă de geluri de silice în ceea ce privește porozitatea, suprafața și diametrul porilor, precum și activitatea catalitică semnificativ mai mare a oxidului de aluminiu, care duce adesea la denaturarea rezultatelor analizei. din cauza descompunerii componentelor probei sau a chimisorbţiei ireversibile a acestora .

2.1.2 Dezavantajele cromatografiei de adsorbție care limitează utilizarea acesteia

Popularitatea cromatografiei de adsorbție a scăzut treptat pe măsură ce s-a dezvoltat metoda HPLC, aceasta a fost din ce în ce mai înlocuită și continuă să fie înlocuită cu alte opțiuni, cum ar fi HPLC în fază inversă și fază normală pe sorbanți cu fază grefată. Care sunt dezavantajele cromatografiei de adsorbție care au condus la aceasta?

În primul rând, aceasta este durata lungă a proceselor de echilibrare a adsorbanților cu solvenți care conțin apă în urme, dificultatea preparării unor astfel de solvenți cu o umiditate certă și reproductibilă. Acest lucru are ca rezultat o reproductibilitate slabă a parametrilor de retenție, rezoluție și selectivitate. Din același motiv, este imposibil să se utilizeze eluția cu gradient - revenirea la starea inițială este atât de lungă încât depășește semnificativ timpul câștigat prin utilizarea unui gradient.

Dezavantaje semnificative ale adsorbanților, în special oxidul de aluminiu, asociate cu cazuri frecvente de rearanjare a compușilor sensibili la cataliză, descompunerea acestora și sorbția ireversibilă, sunt de asemenea bine cunoscute și au fost remarcate în mod repetat în literatură. Substantele absorbite ireversibil, care se acumuleaza la sectiunea initiala a coloanei, schimba natura sorbantului si pot duce la cresterea rezistentei coloanei sau chiar la infundarea sa completa. Ultimul dezavantaj poate fi eliminat folosind o precoloană, care De- Pe măsură ce rezistența și înfundarea crește, acesta este înlocuit cu unul nou* sau reumplut cu un nou sorbant. Cu toate acestea, sorbția ireversibilă, care apare și în acest caz, are ca rezultat o cromatogramă în care componentele probei sensibile la sorbție sau descompunere catalitică sunt complet sau parțial absente.

2.2. CROMATOGRAFIE DE DISTRIBUȚIE

Cromatografia de partiție este o variantă a HPLC în care separarea unui amestec în componente se realizează datorită diferenței dintre coeficienții lor de distribuție între două faze nemiscibile: un solvent (fază mobilă) și o fază pe sorbent (fază staționară). Din punct de vedere istoric, primii au fost adsorbanții de acest tip, care au fost obținuți prin aplicarea de faze lichide (oxidipropionitril, ulei de parafină etc.) pe suporturi poroase, similar modului în care au fost și sunt pregătiți sorbanții pentru cromatografia gaz-lichid (GLC). Cu toate acestea, au fost dezvăluite imediat dezavantajele unor astfel de adsorbanți, principalul dintre acestea fiind clătirea relativ rapidă a fazei din purtător. Din această cauză, cantitatea de fază din coloană a scăzut treptat, timpii de retenție au scăzut și ei, iar în secțiunea inițială a coloanei au apărut centre de adsorbție neacoperite de fază, determinând formarea cozilor de vârf. Acest dezavantaj a fost combatet prin saturarea solventului cu faza aplicată înainte ca acesta să intre în coloană. Antrenarea a fost, de asemenea, redusă atunci când s-au folosit faze polimerice mai vâscoase și mai puțin solubile, dar în acest caz, din cauza dificultății difuzării din peliculele groase de polimer, eficiența coloanei a fost redusă semnificativ.

S-a dovedit a fi logic să grefăm faza lichidă pe purtător prin legături chimice în așa fel încât îndepărtarea ei să devină imposibilă din punct de vedere fizic, adică să transformăm purtătorul și faza într-una singură - în așa-numitul sorbent de fază grefată.

Eforturile ulterioare ale cercetătorilor au vizat căutarea de reactivi a căror altoire să decurgă destul de rapid și complet, iar legăturile formate să fie cât mai stabile. Astfel de reactivi au fost alchilclorosilanii și derivații acestora, care au făcut posibilă, folosind o tehnologie similară, obținerea de adsorbanți în fază grefa de diferite tipuri și cu diferite grupări polare și nepolare la suprafață.

Aplicarea cu succes a celui din urmă tip de adsorbanți pentru HPLC a contribuit la creșterea producției lor de către o mare varietate de producători. Fiecare companie a produs astfel de adsorbanți, de regulă, pe baza propriului tip de silicagel și folosind propria tehnologie, care de obicei constituie „know-how” de producție. Ca urmare, un număr mare de adsorbanți, numiți chimic exact la fel (de exemplu, silicagel grefat cu octadecilsilan), au caracteristici cromatografice foarte diferite. Acest lucru se datorează faptului că silicagelul poate avea pori mai largi sau mai îngusti, o suprafață diferită, porozitate, suprafața sa înainte de altoire poate fi hidroxilată sau nu, pot fi grefați mono-, di- sau triclorosilani, condițiile de altoire pot da monomeri, polimeri. sau faza de strat mixt, diferite metode sunt utilizate pentru a îndepărta reactivii reziduali, dezactivarea suplimentară a silanolului și a altor grupări active poate fi sau nu utilizată.

Complexitatea tehnologiei de altoire a reactivilor și prepararea materiilor prime și materialelor, natura sa în mai multe etape, duce la faptul că chiar și loturile de adsorbanți obținute folosind aceeași tehnologie de la o firmă de producție pot avea caracteristici cromatografice ușor diferite. Acest lucru este valabil mai ales în cazurile în care astfel de adsorbanți sunt utilizați pentru analiza amestecurilor multicomponente care conțin substanțe care diferă semnificativ în ceea ce privește numărul și poziția grupurilor funcționale și tipul de funcționalitate.

Ținând cont de cele de mai sus, ar trebui să se străduiască întotdeauna să se asigure că atunci când se utilizează tehnica de analiză descrisă în literatură, se utilizează același sorbant și aceleași condiții de funcționare. În acest caz, probabilitatea ca opera să nu fie reprodusă este minimă. Dacă acest lucru nu este posibil, dar este luat un sorbent de la o altă companie cu o fază de altoit similară, trebuie să fiți pregătit pentru faptul că va dura mult timp pentru a relua tehnica. În același timp, există posibilitatea (și ar trebui luată în considerare) ca cu acest sorbant, chiar și după o dezvoltare îndelungată, separarea necesară să nu fie realizată. Prezența în literatură a multor tehnici de separare descrise pe adsorbanți vechi care au fost produși de mult timp stimulează producția și utilizarea ulterioară a acestora din acest motiv. Cu toate acestea, în cazurile în care este necesar să se treacă la dezvoltarea metodelor originale, în special în ceea ce privește substanțele predispuse la descompunere, chimisorbție, rearanjare, este indicat să se înceapă lucrul la adsorbanți care au fost dezvoltați recent și produși folosind noi, îmbunătățiți. versiuni ale tehnologiei. Noii adsorbanți au o compoziție fracționată mai uniformă, o acoperire a suprafeței mai uniformă și completă cu faza de altoit și stadii finale mai avansate de prelucrare a sorbantului.

2.3. CROMATOGRAFIE DE SCHIMB DE IONI

În cromatografia cu schimb de ioni, separarea componentelor amestecului se realizează prin interacțiunea reversibilă a substanțelor ionizante cu grupările ionice ale sorbantului. Păstrarea neutralității electrice a sorbantului este asigurată de prezența contraionilor capabili de schimb ionic situat în imediata apropiere a suprafeței. Ionul probei introduse, interacționând cu sarcina fixă ​​a sorbentului, schimbă cu contraionul. Substanțe cu afinități diferite pentru sarcinile fixe sunt separate pe schimbători de anioni sau schimbători de cationi au grupări încărcate pozitiv la suprafață și, în consecință, sorb anionii din faza mobilă conțin grupuri cu o sarcină negativă.

Ca fază mobilă, se folosesc soluții apoase de săruri de acizi, baze și solvenți precum amoniacul lichid, adică sisteme de solvenți cu o constantă dielectrică mare și o tendință mai mare de a ioniza compușii valoare de ajustat.

În timpul separării cromatografice, ionii analitului concurează cu ionii conținuți în eluent, tinzând să interacționeze cu grupurile încărcate opus ale sorbantului. Rezultă că cromatografia cu schimb de ioni poate fi utilizată pentru a separa orice compuși care pot fi ionizați într-un fel. Este posibil să se analizeze chiar și molecule neutre de zahăr sub forma complexelor lor cu ion borat:

Zahăr + VO 3 2 - = Zahăr -VO 3 2 -.

Cromatografia de schimb de ioni este indispensabilă pentru separarea substanțelor extrem de polare, care nu pot fi analizate prin GLC fără conversie în derivați. Acești compuși includ aminoacizi, peptide și zaharuri.

Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pe scară largă în medicină, biologie, biochimie, pentru monitorizarea mediului, în analiza conținutului de medicamente și a metaboliților acestora în sânge și urină, pesticide din materiile prime alimentare, precum și pentru separarea compușilor anorganici, inclusiv radioizotopi, lantanide, actinide etc. Analiza biopolimerilor (proteine, acizi nucleici etc.), care de obicei dura ore sau zile, se realizează prin cromatografie cu schimb ionic în 20-40 minute cu o mai bună separare. Utilizarea cromatografiei cu schimb de ioni în biologie a făcut posibilă observarea probelor direct în medii biologice, reducând posibilitatea de rearanjare sau izomerizare, ceea ce poate duce la interpretarea incorectă a rezultatului final. Este interesant să folosim această metodă pentru a monitoriza modificările care apar în fluidele biologice. Utilizarea schimbătorilor de anioni slabi poroși pe bază de silicagel a permis separarea peptidelor. V

Mecanismul schimbului de ioni poate fi reprezentat sub forma următoarelor ecuații:

pentru schimbul de anioni

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

pentru schimb cationic |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

În primul caz, ionul eșantionului X~ concurează cu ionul de fază mobilă Y~ pentru centrele de ioni R+ ale schimbătorului de ioni, iar în al doilea caz, cationii probei X+ concurează cu ionii Y+ ai fazei mobile pentru R. ~ centri ionici.

Desigur, ionii de probă care interacționează slab cu schimbătorul de ioni vor fi slab reținuți pe coloană în timpul acestei competiții și vor fi primii care vor fi spălați din aceasta și, dimpotrivă, ionii reținuți mai puternic vor fi ultimii care vor elua din coloană. . De obicei, interacțiunile BTqpH4Hbie de natură neionică apar datorită adsorbției sau legăturilor de hidrogen ale probei cu partea neionică a matricei sau datorită solubilității limitate a probei în faza mobilă. Este dificil să izolați cromatografia cu schimb de ioni „clasică” în forma sa „pură” și, prin urmare, unii cromatografi pornesc de la principii mai degrabă empirice decât teoretice în cromatografia cu schimb de ioni.

Separarea substanțelor specifice depinde în primul rând de alegerea celui mai potrivit sorbent și faza mobilă. Rășinile schimbătoare de ioni și silicagelurile cu grupări ionogene grefate sunt utilizate ca faze staționare în cromatografia schimbătoare de ioni.

2.4. CROMATOGRAFIE DE EXCLUDERE DE SECȚIUNE

Cromatografia de excludere este o opțiune! cromatografia lichidă, în care separarea are loc datorită distribuției moleculelor între solventul situat în interiorul porilor sorbentului și solventul care curge " între particulele sale.

Spre deosebire de alte opțiuni HPLC, unde separarea venire Datorită interacțiunilor diferite ale componentelor cu suprafața sorbantului, rolul umpluturii solide în cromatografia de excludere dimensională este doar acela de a forma pori de o anumită dimensiune, iar faza staționară este solventul care umple acești pori. Prin urmare, utilizarea termenului „sorbent” la aceste materiale de umplutură este într-o anumită măsură arbitrară.

O caracteristică fundamentală a metodei este capacitatea de a separa molecule în funcție de dimensiunea lor în soluție în intervalul aproape oricărei greutăți moleculare - de la 10 2 la 10 8, ceea ce o face indispensabilă pentru studiul sintetic și biopolimerilor.

În mod tradițional, procesul desfășurat în solvenți organici este încă adesea numit cromatografia de permeație pe gel, iar în sistemele apoase - cromatografia de filtrare pe gel. În această carte, este adoptat un singur termen pentru ambele opțiuni, care provine din limba engleză „Size Exclusion” - excludere după mărime - și reflectă cel mai pe deplin mecanismul procesului.

O analiză detaliată a ideilor existente despre teoria foarte complexă a procesului de cromatografie de excludere a mărimii este realizată în monografii.

Volumul total de solvent în coloană Vt (acesta este adesea numit volumul total al coloanei, deoarece Vd nu participă la procesul cromatografic) este suma volumelor fazelor mobile și staționare.

Reținerea moleculelor într-o coloană de excludere este determinată de probabilitatea difuzării lor în pori și depinde de raportul dintre dimensiunile moleculelor și porilor, care este prezentat schematic în Fig. 2.15. Coeficientul de distribuție Ka, ca și în alte variante de cromatografie, este raportul dintre concentrațiile unei substanțe în fazele staționare și mobile.

Întrucât fazele mobile și staționare au aceeași compoziție, atunci Kd o substanță pentru care ambele faze sunt la fel de accesibile este egală cu unitatea. Această situație este realizată pentru moleculele C de cele mai mici dimensiuni (inclusiv moleculele de solvent), care pătrund în toți porii (vezi Fig. 2.15) și, prin urmare, se deplasează prin coloană cel mai lent. Volumul lor de retenție este egal cu volumul total al solventului Vt-

Orez. 2.15. Model de separare moleculară prin măsurare în cromatografia de excludere a mărimii

Toate moleculele a căror dimensiune este mai mare decât dimensiunea porilor absorbanților nu pot intra în ele (excluderea completă) și trec prin canalele dintre particule. Eluează din coloană cu același volum de retenție egal cu volumul fazei mobile V 0 - Coeficientul de partiție pentru aceste molecule este zero.

Moleculele de mărime intermediară, capabile să pătrundă doar o parte din pori, sunt reținute în coloană în funcție de dimensiunea lor. Coeficientul de distribuție al acestor molecule variază de la zero la unu și caracterizează fracția din volumul porilor accesibilă moleculelor de o dimensiune dată Volumul reținut al acestora este determinat de suma V o și porțiunea accesibilă a volumului de pori.

ANALIZA CALITATIVA

Un cromatograf care intră în domeniul cromatografiei lichide de înaltă performanță trebuie să se familiarizeze cu fundamentele analizei calitative. Analiza calitativă este folosită pentru a identifica un produs cunoscut, obținut într-un mod nou sau găsit în amestec cu alte produse." Este necesar la izolarea diferitelor componente din amestecuri biologice și chimice complexe, ceea ce este deosebit de important în medicină, criminalistică, ecologie, pentru monitorizarea prezenței unor produse chimice medicinale și a metaboliților acestora în bioml.ter.ials..„ „Familiaritatea cu elementele de bază ale calitative” va ajuta la evitarea greșelilor comune, de exemplu/distingerea impurităților dintr-o probă de impuritățile dintr-o probă. solvent sau verificarea purității unei substanțe la mai mult de o lungime de undă, dar pe altele diferite etc.

Înainte de a continua cu analiza, este necesar să se determine dacă întreaga probă este eluată din coloană printr-un sistem de solvenți dat sau nu. Pentru a fi siguri de eluarea completă, este necesar să colectați tot lichidul care curge din coloană, să evaporați solventul, să cântăriți reziduul și să găsiți gradul de recuperare a probei.

Identificarea componentelor în HPLC se poate face în trei moduri: 1) folosind informațiile de reținere; 2) se examinează zonele obţinute în timpul separării într-o coloană de cromatograf lichid folosind metode de analiză spectrală sau chimică; 3) conectați direct analizorul de spectru la coloană.

Volumul de retenție este utilizat pentru a înregistra vârfurile în cromatografie. V R sau timpul de retenție t R. Ambele cantități sunt caracteristice unei substanțe dintr-un sistem cromatografic dat. Întrucât timpul de retenție al substanței care este separată constă din timpul de interacțiune în coloană și timpul de trecere a secțiunilor goale ale tubului, acesta variază de la instrument la instrument. Este convenabil să existe o substanță nereținută de o coloană dată, luând-o ca standard al cărui timp și volum de retenție t 0 , V o. Cromatografia substanței și a standardului trebuie efectuată în aceleași condiții (presiune și debit). Atunci când sunt identificate prin datele de retenție, substanțele individuale cunoscute care pot fi prezente în probe sunt separate în același sistem cromatografic și se obțin valori pentru acestea. t R. Comparând aceste valori t R cu timpul de retenție al vârfului necunoscut, se poate constata că acestea fie coincid, caz în care este probabil ca vârfurile să corespundă aceleiași substanțe, fie t R substanta cunoscuta nu corespunde t R zona necunoscuta. Atunci o estimare aproximativă a valorilor este încă posibilă t R substanțe care nu sunt disponibile pentru măsurarea directă a gradului de retenție a acestora. Să luăm în considerare ambele opțiuni.

În primul caz, un studiu preliminar al probei este evident necesar pentru a postula prezența unor substanțe specifice în ea. Când se lucrează cu amestecuri simple, nu este dificil să se determine dacă gradul de retenție al zonelor probei și al substanțelor cunoscute coincide sau nu, adică valorile tB la fel sau diferit. În cazul amestecurilor complexe, mai multe substanțe pot elua cu valori similare t R, iar zonele efectiv obţinute în timpul separării cromatografice se suprapun. Ca urmare, obținerea unor valori exacte t R devine imposibil pentru diferite zone. Fiabilitatea identificării crește odată cu creșterea rezoluției, un control mai atent al condițiilor de separare și măsurarea repetată a valorilor t R și realizarea mediei valorilor găsite. În acest caz, separarea cromatografică a substanțelor cunoscute și necunoscute trebuie să alterneze. La separarea amestecurilor complexe, valoarea t R substanțele se pot modifica sub influența matricei probei în sine. Acest efect este posibil la începutul cromatogramei și atunci când vârfurile se suprapun; De asemenea, este posibil să strângeți zonele, așa cum sa menționat deja.

În astfel de cazuri, standardul trebuie adăugat la probă într-un raport de 1:1. Dacă substanțele sunt identice, valoarea t R materia primă nu se modifică și se obține un singur vârf în cromatogramă. Dacă aveți un dispozitiv cu un sistem de cromatografie ciclică, atunci pentru o identificare fiabilă este recomandabil să treceți amestecul prin coloană de mai multe ori.

Informații despre ratele de retenție pot fi găsite și în literatură, dar valoarea acestor informații este limitată. Deoarece coloanele chiar și din același lot oferă o reproductibilitate slabă, valorile din literatură nu corespund întotdeauna cu valoarea adevărată t R pe această coloană. Pentru cromatografia de adsorbție, totuși, este posibil să se prevadă t R pe baza datelor din literatură. O altă dificultate asociată cu utilizarea sensurilor literare t R, - dificultatea de a le găsi în literatura de specialitate, deși recenziile bibliografice publicate în Jurnalul de cromatografie au un index actualizat pe tip de substanță.

În al doilea caz, când timpii de retenție ai compușilor cunoscuți și zonele de probă nu coincid, este posibil să se prezică timpul de retenție al componentei necunoscute. Predicțiile privind retenția relativă bazate pe datele de structură în cromatografia de excludere steric sunt destul de fiabile. Ele sunt mai puțin precise în cromatografia de adsorbție și partiție, și mai ales atunci când se lucrează pe o fază legată chimic. Pentru cromatografia de ioni și perechi de ioni a substanțelor cu p Ka Sunt posibile doar determinări aproximative ale valorilor tR. Este întotdeauna mai ușor să preziceți retenția relativă sau valorile *x decât valorile absolute k". Valori relative t R mai ușor de evaluat pentru compuși sau derivați înrudiți, cum ar fi acizii alchilcarboxilici substituiți sau derivații de benzen.

Când se separă izocratic omologii sau oligomerii, se observă uneori următorul model:

\ gk" = A + Bn,

Unde AȘi ÎN- constante pentru un număr de probe selectate și pentru un sistem cromatografic dat (pe aceeași coloană, cu aceleași faze mobile și staționare); P- numarul de unitati structurale identice din molecula proba.

Introducerea unei grupe funcționale / în molecula probă va duce la o schimbare k" în prima ecuaţie printr-un coeficient constant a/ într-un sistem cromatografic dat. Este posibil să se obțină constante de grup a/ pentru diferite grupări substituente/, ale căror valori vor crește odată cu creșterea polarității grupurilor funcționale în toate tipurile de cromatografie, cu excepția fazei inverse, unde valorile constantelor vor scădea cu polaritatea crescândă.

Unele constante de grup a/ pentru diferite grupări substituente/ sunt date în tabel. 9.1.

În cromatografia de adsorbție, prima ecuație nu este întotdeauna aplicabilă, deoarece este valabilă cu condiția ca toți izomerii să aibă aceeași valoare k", ceea ce nu este întotdeauna respectat. Este posibil, totuși, să se grafice logfe" a acelorași compuși pe o coloană față de logfe" a acelorași compuși pe o coloană diferită sau față de caracteristicile corespunzătoare în cromatografia în strat subțire, de exemplu, log[(l- Rf) IRf].

Valorile coeficientului de capacitate pot fi utilizate la compararea datelor de retenție k", pentru că spre deosebire de el t R viteza fazei mobile și caracteristicile geometrice ale coloanei nu sunt afectate.

Separările de fază legate chimic sunt similare cu separările prin cromatografie de partiție cu faze similare și, prin urmare, datele de extracție la starea de echilibru pot fi utilizate pentru a prezice timpii de retenție.

În cromatografia cu schimb de ioni, trei factori influențează gradul de retenție: gradul de ionizare a acizilor și bazelor, sarcina moleculei ionizate și capacitatea substanței din faza mobilă apoasă utilizată în cromatografia cu schimb de ioni de a migra în substanța organică. fază. Acesta din urmă depinde de greutatea moleculară a compusului și de hidrofobicitatea acestuia. Prin urmare, acizii sau bazele mai puternice sunt reținute mai puternic în timpul separării schimbului de anioni sau schimbului de cationi. Când scade pK a a unui acid individual inclus în probă, retenția crește atunci când un număr de acizi sunt separați datorită schimbului de anioni, iar odată cu creșterea p/C o, retenția bazelor crește atunci când sunt separați datorită schimbului de cationi.

Astfel, coincidența timpilor de retenție ai unei substanțe cunoscute cu cea observată face posibilă asumarea identității acestora. Fiabilitatea identificării crește dacă cromatogramele unei substanțe cunoscute și ale unei componente necunoscute sunt comparate în condiții diferite. Dacă substanțele se comportă identic în cromatografia de adsorbție și fază inversă sau schimb de ioni și excludere prin mărime, fiabilitatea identificării crește. Dacă fiabilitatea identificării cu retenție relativă egală este de 90%, atunci când se studiază comportamentul acelorași substanțe în condiții semnificativ diferite, fiabilitatea identificării este deja de 99%.

O caracteristică valoroasă a unei substanțe utilizate în identificare este raportul dintre semnalele obținute pentru o anumită substanță pe doi detectori diferiți. Substanța analizată, după ce iese din coloană, trece mai întâi prin primul detector, apoi prin al doilea, iar semnalele provenite de la detectoare sunt înregistrate simultan cu ajutorul unui reportofon multipen sau pe două reportofone. În mod obișnuit, se utilizează o conexiune în serie a unui detector de ultraviolete (mai sensibil, dar selectiv) cu un refractometru, sau a unui ultraviolet cu un detector de fluorescență sau a doi detectoare de ultraviolete care funcționează la lungimi de undă diferite. Răspunsul relativ, adică raportul dintre semnalul refractometrului și semnalul fotometrului, este o caracteristică a substanței, cu condiția ca ambii detectoare să funcționeze în domeniul lor liniar; aceasta este testată prin administrarea de cantități diferite din aceeași substanță. Informațiile calitative pot fi obținute lucrând cu detectoare fotometrice echipate cu un dispozitiv de oprire a fluxului care permite înregistrarea spectrului vârfului care iese din coloană în timp ce se află în celula de flux, comparându-l cu spectrul unui compus cunoscut.

Spectrofotometrele moderne, încă scumpe, cu o matrice de diode prezintă un interes semnificativ în identificare.

O substanță complet necunoscută nu poate fi identificată numai prin cromatografie lichidă de înaltă performanță, sunt necesare și alte metode.

ANALIZA CANTITATIVA

Cromatografia lichidă cantitativă este o metodă analitică bine dezvoltată, care nu este inferioară ca precizie față de cromatografia cantitativă de gaze și depășește semnificativ acuratețea TLC sau a electroforezei. Din păcate, în HPLC nu există un detector care ar avea o sensibilitate apropiată pentru compuși cu structuri chimice diferite (. ca un catarometru în GLC). Prin urmare, pentru a obține rezultate cantitative, calibrarea dispozitivului este obligatorie.

Analiza cantitativă constă în următoarele etape: 1) separarea cromatografică; 2) măsurarea zonelor de vârf sau înălțimii; 3) calculul compoziției cantitative a amestecului pe baza datelor cromatografice; 4) interpretarea rezultatelor obținute, adică prelucrarea statistică. Să luăm în considerare toate aceste etape.

4.1. SEPARARE CRMATOGRAFICĂ

Pot fi făcute erori în timpul colectării probelor. Este deosebit de important să se evite erorile și să se obțină un eșantion reprezentativ adecvat de solide eterogene, substanțe volatile sau instabile și produse agricole și biomateriale. Probele eterogene, de exemplu produsele alimentare, sunt bine amestecate și tăiate în sferturi. Efectuând această operație de mai multe ori, se obține omogenitatea probei.

Erorile si pierderile de substante pot fi facute in stadiul de extractie, izolare, purificare etc.

Probele trebuie să fie complet dizolvate și soluțiile lor trebuie preparate cu o precizie de ±0,1%. Se recomandă dizolvarea probei în faza mobilă, ceea ce va elimina posibilitatea precipitării acesteia după introducerea în cromatograf. Dacă dizolvarea în faza mobilă nu este posibilă, atunci trebuie utilizat un solvent miscibil cu acesta și volume de probă (mai puțin de 25 µl) trebuie introduse în cromatograf.

Pot apărea erori semnificative în timpul injectării probei din cauza fracționării probei, a scurgerilor și a decolorării vârfurilor. Încețoșarea vârfurilor determină formarea cozilor, ducând la suprapunerea parțială a vârfurilor și, în consecință, la erori de detectare. Dispozitivele cu supapă cu buclă sunt preferabile seringilor pentru introducerea probelor în analiza cantitativă datorită preciziei mai mari și dependenței mai mici de operator.

La separarea cromatografică a substanțelor pot apărea și complicații care duc la denaturarea datelor: analiză cantitativă. Poate exista descompunere sau conversie a probei în timpul procesului cromatografic sau adsorbție ireversibilă a substanței pe coloană. Este important să se asigure absența acestor fenomene nedorite și, dacă este necesar, să se regenereze coloana sau să o înlocuiască. Suprapunerea vârfurilor și coada pot fi, de asemenea, reduse prin variarea condițiilor de cromatografie.

Vârfuri cu forme false sau neclare, precum și vârfuri al căror timp de eliberare este aproape de la, întrucât separarea lor poate să nu fie suficientă. În mod obișnuit, se folosesc vârfuri cu o valoare d"^0,5. Cea mai mare eficiență a coloanei se realizează prin introducerea a 10~ 5 -10~ 6 g de substanță dizolvată la 1 g de sorbent. La introducerea unor cantități mari de probă, dependența de înălțimea vârfului la sarcină se poate dovedi a fi neliniară și este necesară o evaluare cantitativă a zonelor de vârf.

Erorile asociate cu detectarea sau amplificarea duc la o denaturare semnificativă a rezultatelor separării cromatografice. Fiecare detector se caracterizează prin specificitate, liniaritate și sensibilitate. Testarea selectivității este deosebit de importantă atunci când se analizează urmele de impurități. Răspunsul detectorilor UV poate varia cu un factor de 104 la substanțe cu grupe funcționale similare. Este necesar să se calibreze răspunsul detectorului pentru fiecare analit. Desigur, substanțele care nu se absoarbe în regiunea UV nu vor da un semnal înregistratorului atunci când sunt utilizate ca detector fotometru. Când utilizați un refractometru, pot apărea vârfuri negative. In plus, acest detector trebuie sa fie termostatat, ceea ce nu este necesar pentru detectorul UV.

Linearitatea detectorului determină dimensiunea probei injectate. Este important să ne amintim că debitul coloanei, temperaturile coloanei și detectorului și designul detectorului afectează toate precizia analizei cantitative. Erorile în transmiterea unui semnal electric către un dispozitiv de ieșire (recorder), integrator sau computer pot apărea din cauza inducției de zgomot, lipsă de împământare, fluctuații de tensiune în rețea etc.

4.2. MĂSURAREA AREA SAU A ÎNĂLȚIMII Vârfului

Înălțimea vârfului h (Fig. 10.1) este distanța de la vârful vârfului până la linia de bază, se măsoară liniar sau prin numărarea numărului de diviziuni pe un înregistrator. Unii integratori electronici și calculatoare oferă informații despre înălțimile de vârf. Poziția liniei de bază a vârfurilor deplasate este găsită prin interpolarea valorilor ordonatelor corespunzătoare începutului și sfârșitului vârfului (vârf). 1 și 3 vezi fig. 10.1). Pentru a îmbunătăți acuratețea, este necesar să existe o linie de bază plată și stabilă. În cazul vârfurilor nedivizate, linia de bază este trasată între începutul și sfârșitul vârfului, mai degrabă decât înlocuită cu o linie zero. Deoarece înălțimile vârfurilor sunt mai puțin dependente de influența vârfurilor suprapuse adiacente, estimarea înălțimii vârfurilor este mai precisă și este aproape întotdeauna utilizată în analiza urmelor.

Zona de vârf poate fi determinată în diferite moduri. Să ne uităm la unele dintre ele.

1. Metoda planimetrică implică trasarea vârfului cu un planimetru de mână, care este un dispozitiv care determină mecanic aria vârfului. Metoda este precisă, dar necesită forță de muncă și puțin reproductibilă. Această metodă nu este recomandată.

2. Metoda siluetei de hârtie - vârful este decupat și cântărit. Metoda este foarte reproductibilă, dar necesită multă muncă, iar cromatograma este distrusă. Aplicabilitatea sa depinde de uniformitatea benzii de diagramă. De asemenea, metoda nu poate fi recomandată pe scară largă.

4. Metoda triangulației constă în construirea unui triunghi desenând tangente la laturile vârfului. Vârful triunghiului este mai înalt decât vârful vârfului. Creșterea ariei formate de acest vârf extins va fi consecventă pe tot parcursul cromatogramei și nu va afecta foarte mult precizia. În plus, o anumită zonă pierdută la desenarea tangentelor va fi compensată. Baza triunghiului este determinată de intersecția tangentelor cu linia de bază, iar aria este determinată de produsul dintre 7 g de bază și înălțime. Această metodă este cea mai bună pentru a determina zonele vârfurilor asimetrice. Cu toate acestea, reproductibilitatea la construirea tangentelor de către diferiți operatori este diferită și, prin urmare; scăzut.

5. Metoda de integrare a discurilor se bazează pe un dispozitiv electromecanic atașat la un recorder. Stiloul atașat la integrator se deplasează de-a lungul unei benzi din partea de jos a benzii cu o viteză proporțională cu mișcarea stiloului înregistrator.

Ca și în cazul măsurătorilor manuale, vârful ar trebui să rămână pe scara înregistratorului, dar ajustările pentru a compensa deplasările liniei de bază și separarea incompletă a vârfurilor adiacente reduc fiabilitatea și măresc timpul de analiză.

Metoda este mai precisă decât metodele de măsurare manuală, în special pentru vârfurile asimetrice, și oferă un avantaj de viteză. În plus, oferă o înregistrare cantitativă permanentă a analizei.

6. Metodele care utilizează integratori electronici care determină zona de vârf și imprimă informații despre acea zonă și timpii de retenție pot include corecția deplasării liniei de bază și determină zona vârfurilor doar parțial rezolvate. Principalele avantaje sunt precizia, viteza, independența de acțiune față de funcționarea reportofonului. Integratorii au memorie și pot fi programați pentru o analiză specifică folosind un program preinstalat. Avantajele integratorului includ capacitatea sa de a utiliza factori de corecție pentru răspunsul detectorului atunci când se recalculează datele originale pe zonele de vârf, compensând diferențele de sensibilitate a detectorului la diferite substanțe. Astfel de sisteme economisesc timp, îmbunătățesc acuratețea analitică și sunt utile pentru analiza analitică de rutină.

7. În cromatografia lichidă, calculatoarele sunt utilizate pe scară largă pentru a măsura zonele de vârf. Ei imprimă un mesaj complet, inclusiv numele substanțelor, zonele de vârf, timpii de retenție, factorii de corecție a răspunsului detectorului și abundența (% în greutate) pentru diferitele componente ale probei.

Cromatografia lichidă este o metodă de separare și analiză a amestecurilor complexe de substanțe în care un lichid servește ca fază mobilă. Este aplicabil la separarea unei game mai largi de substanțe decât cromatografia gazoasă. Acest lucru se datorează faptului că majoritatea substanțelor nu sunt volatile, multe dintre ele sunt instabile la temperaturi ridicate (în special compușii cu molecule înalte) și se descompun atunci când sunt transformate în stare gazoasă. Separarea substanțelor prin cromatografie lichidă se realizează cel mai adesea la temperatura camerei.

Caracteristicile tuturor tipurilor de cromatografie lichidă se datorează faptului că faza mobilă din ea este lichidă, iar sorbția componentelor din eluantul gazos și lichid are loc diferit. Dacă în cromatografia în gaze gazul purtător îndeplinește doar o funcție de transport și nu este absorbit de faza staționară, atunci faza mobilă lichidă în cromatografia lichidă este un eluent activ, moleculele sale pot fi absorbite de faza staționară; La trecerea prin coloană, moleculele componentelor amestecului analizat situate în eluent trebuie să deplaseze moleculele eluentului din stratul de suprafață al sorbantului, ceea ce duce la o scădere a energiei de interacțiune a moleculelor analitului. cu suprafaţa sorbentului. Prin urmare, valorile volumelor reținute V R, proporțional cu modificarea energiei libere a sistemului, este mai mic în cromatografia lichidă decât în ​​cromatografia în gaze, iar intervalul de liniaritate a izotermei de sorbție în cromatografia lichidă este mai larg.

Prin utilizarea diferiților eluanți, se pot modifica parametrii de retenție și selectivitatea sistemului cromatografic. Selectivitatea în cromatografia lichidă, spre deosebire de cromatografia în gaz, este determinată nu de unul, ci de doi factori - natura fazelor mobile (eluent) și staționare.

Faza mobilă lichidă are o densitate și vâscozitate mai mari decât faza gazoasă, coeficienți de difuzie D și Cu 3–4 ordine de mărime mai mică decât în ​​gaz. Acest lucru duce la un transfer de masă mai lent în cromatografia lichidă în comparație cu cromatografia în gaz. Ecuația Van Deemter datorită faptului că termenul ÎN nu joacă un rol în cromatografia lichidă ( D și  D G), se modifică și dependența grafică a eficienței N din debitul liniar al fazei mobile are forma prezentată în Fig. 1.9.

În varianta clasică a cromatografiei lichide pe coloană, proba analizată dizolvată în eluent este introdusă într-o coloană de sticlă de 1–2 m înălțime, umplută cu un sorbant cu o dimensiune a particulei de 100 μm și un eluent, iar eluentul este trecut prin , selectând porțiuni de eluat la ieșirea din coloană. Această versiune a cromatografiei lichide este încă utilizată în practica de laborator, dar deoarece viteza de trecere a eluentului sub influența gravitației este scăzută, analiza este lungă.

Versiunea modernă a cromatografiei lichide, așa-numita cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC, utilizează adsorbanți volumetrici și superficial poroși cu o dimensiune a particulelor de 5-10 microni, pompe de injecție care asigură presiunea sistemului de până la 400 atm și detectoare foarte sensibile. Transferul rapid de masă și eficiența ridicată a separării fac posibilă utilizarea HPLC pentru separarea moleculelor (adsorbție lichidă și cromatografie de partiție lichid-lichid), pentru separarea ionilor (schimb de ioni, cromatografia de ioni, perechi de ioni), pentru separarea de macromolecule (cromatografia de excludere a mărimii).

1.3. RETENȚIA SOLVENTULUI ȘI REZISTENTA

Pentru ca substanțele analizate să fie separate pe coloană, așa cum s-a menționat mai sus, coeficientul de capacitate k" trebuie să fie mai mare decât 0, adică substanțele trebuie reținute de faza staționară, sorbent. Totuși, coeficientul de capacitate nu trebuie să fie să fie prea mare pentru a obține un timp de eluție acceptabil Dacă pentru un amestec dat de substanțe este selectată o fază staționară care le reține, atunci lucrările ulterioare privind dezvoltarea unei tehnici de analiză constă în alegerea unui solvent care ar furniza în mod ideal diferit, dar acceptabil. nu foarte mare k". Acest lucru se realizează prin modificarea puterii de eluare a solventului.

În cazul cromatografiei de adsorbție pe silicagel sau oxid de aluminiu, de regulă, puterea unui solvent cu două componente (de exemplu, hexan cu adăugarea de izopropanol) este crescută prin creșterea conținutului de componentă polară (izopropanol), sau a scăzut prin scăderea conținutului de izopropanol. Dacă conținutul de componentă polară devine prea scăzut (mai puțin de 0,1%), acesta trebuie înlocuit cu o forță de eluare mai slabă. La fel se procedează, înlocuind fie o componentă polară, fie o componentă nepolară cu altele, chiar dacă acest sistem nu asigură selectivitatea dorită în raport cu componentele de interes din amestec. La selectarea sistemelor de solvenți se ia în considerare atât solubilitatea componentelor amestecului, cât și seria eluotropă de solvenți compilați de diferiți autori.

Puterea solventului este selectată aproximativ în același mod atunci când se utilizează faze polare grefate (nitril, amino, diol, nitro etc.), ținând cont de posibilele reacții chimice și excluzând solvenții periculoși pentru fază (de exemplu, aldehide și cetone). pentru faza amino).

În cazul cromatografiei în fază inversă, puterea solventului este crescută prin creșterea conținutului de component organic din eluent (metanol, acetonitril sau THF) și scade prin adăugarea mai multor apă. Dacă nu este posibilă atingerea selectivității dorite, aceștia folosesc o altă componentă organică sau încearcă să o schimbe folosind diverși aditivi (acizi, reactivi perechi de ioni etc.).

În separările prin cromatografia cu schimb ionic, puterea solventului este modificată prin creșterea sau scăderea concentrației soluției tampon sau prin modificarea pH-ului în unele cazuri, se folosește modificarea cu substanțe organice;

Cu toate acestea, în special în cazul amestecurilor naturale și biologice complexe, adesea nu este posibil să se selecteze puterea solventului astfel încât toate componentele probei să elueze într-un interval de timp acceptabil. Apoi trebuie să recurgeți la eluția cu gradient, adică. utilizați un solvent a cărui putere de eluție se modifică în timpul procesului de analiză, astfel încât să crească constant conform unui program prestabilit. Această tehnică face posibilă eluarea tuturor componentelor amestecurilor complexe într-o perioadă de timp relativ scurtă și separarea lor în componente sub formă de vârfuri înguste.

1.6.1. Cromatografia lichidă de adsorbție. Cromatografia lichidă de adsorbție, în funcție de polaritatea fazelor staționare și mobile, este împărțită în cromatografia în fază normală (NPC) și cromatografia în fază inversă (RPC). În NPC, se utilizează un adsorbant polar și faze mobile nepolare, în OPC, se utilizează un adsorbant nepolar și faze mobile polare, dar în ambele opțiuni, alegerea fazei mobile este adesea mai importantă decât alegerea fazei mobile. faza stationara. Faza staționară trebuie să rețină substanțele care se separă. Faza mobilă, adică solventul, trebuie să asigure capacități diferite ale coloanei și o separare eficientă într-un timp acceptabil.

Materialele poroase polare și nepolare fin dispersate cu o suprafață specifică mai mare de 50 m 2 /g sunt utilizate ca fază staționară în cromatografia lichidă de adsorbție. Adsorbanții polari (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil etc.) au la suprafață grupări acide slabe care pot reține substanțe cu proprietăți bazice. Acești adsorbanți sunt utilizați în principal pentru separarea compușilor nepolari și moderat polari. Dezavantajul lor este sensibilitatea lor ridicată la conținutul de apă din eluanții utilizați. Pentru a elimina acest dezavantaj, adsorbanții polari sunt tratați cu amine, dioli și alți reactivi, rezultând grefarea suprafeței acestor reactivi, modificarea suprafeței și o schimbare a selectivității față de analiți.

Adsorbanții nepolari (negru de fum grafitizat, pământ de diatomee, kieselguhr) sunt neselectivi față de moleculele polare. Pentru a obține adsorbanți nepolari, grupările nepolare sunt adesea grefate pe suprafața, de exemplu, a gelului de silice, de exemplu, alchilsilil-SiR3, unde grupările R-alchil sunt C2-C22.

Faza mobilă trebuie să dizolve complet proba analizată, să aibă o vâscozitate scăzută (astfel încât coeficienții de difuzie să fie suficient de mari) și este de dorit să fie posibilă izolarea componentelor separate de aceasta. Trebuie să fie inert în ceea ce privește materialele tuturor părților cromatografului, sigur, ieftin și potrivit pentru detector.

Fazele mobile utilizate în cromatografia lichidă variază în ceea ce privește puterea lor de eluție. Forța de eluție a unui solvent arată de câte ori este mai mare energia de sorbție a unui eluent dat pe un adsorbant dat decât energia de sorbție a eluentului ales ca standard, de exemplu n-heptan. Solvenții slabi sunt slab adsorbiți de faza staționară, prin urmare coeficienții de distribuție ai substanțelor sorbite (sorbat) sunt mari. Dimpotrivă, solvenții puternici sunt adsorbiți bine, astfel încât coeficienții de partiție a sorbatului sunt mici. Cu cât solventul este mai puternic, cu atât solubilitatea probei analizate este mai mare în acesta și interacțiunea solvent-sorbat este mai puternică.

Pentru a asigura o eficiență ridicată de separare pe o coloană, este necesar să se selecteze o fază mobilă care să aibă o polaritate optimă pentru ca amestecul să fie separat în condițiile de separare selectate. De obicei, este selectată mai întâi o fază staționară care are o polaritate apropiată de cea a componentelor care sunt separate. Apoi se selectează faza mobilă, asigurându-se că coeficientul de capacitate k" s-a dovedit a fi în intervalul de la 2 la 5. Dacă polaritatea fazei mobile este prea apropiată de polaritatea fazei staționare, timpul de retenție al componentelor va fi prea scurt și dacă polaritățile fazei mobile și staționare fazele sunt foarte diferite, timpul de retenție va deveni prea lung.

La selectarea fazelor mobile, acestea sunt ghidate de așa-numita serie eluotropă, bazată pe utilizarea indicilor de polaritate Snyder R", care împarte toți solvenții în puternici (polari) și slabi (slab polari și nepolari). Scala de polaritate se bazează pe solubilitatea substanțelor utilizate ca faze mobile în dioxan, nitrometan și etanol.

Tabelul 1.2 prezintă valorile indicilor de polaritate și ale forței de eluție (față de SiO 2) pentru o serie de solvenți cei mai des utilizați în cromatografia lichidă ca faze mobile. Aici sunt indicate și limitele de transparență a lungimii de undă scurte ale acestor solvenți, ceea ce facilitează selectarea condițiilor pentru detectarea componentelor amestecului.

Tabelul 1.2

Caracteristicile solvenților utilizați în cromatografia lichidă

Solvent	Indicele de polaritate	Forța de eluție (SiO2)	Limită de transparență pe lungime de undă scurtă
Fluoroalcan
Ciclohexan
n-Hexan
Tetraclorură de carbon
eter diizopropilic
Dietil eter
Diclormetan
tetrahidrofuran
Cloroform
Acid acetic
Acetonitril
Nitrometan

În cromatografia lichidă, se folosesc adesea amestecuri ale acestora, mai degrabă decât solvenți individuali. Adesea, adăugările minore ale unui alt solvent, în special apă, vor crește semnificativ rezistența eluantului.

La separarea amestecurilor multicomponente, este posibil ca o singură fază mobilă ca eluant să nu separe toate componentele probei într-un timp acceptabil. În acest caz, se utilizează o metodă de eluare în trepte sau gradient, în care eluanții din ce în ce mai puternici sunt utilizați secvenţial în timpul procesului de cromatografie, ceea ce face posibilă eluarea substanțelor foarte reținute în mai puțin timp.

În cromatografia lichidă există unele empiric reguli care sunt foarte utile atunci când alegeți un eluent:

- sorbția unui compus, de regulă, crește odată cu creșterea numărului de legături duble și a grupărilor OH din acesta;

 sorbția scade într-un număr de compuși organici: acizi alcoolialdehidecetoneesterihidrocarburi nesaturatehidrocarburi saturate;

 pentru separarea substanțelor cu polaritate diferită și separarea substanțelor din clase diferite se folosește cromatografia în fază normală: proba analizată este dizolvată și eluată cu un eluent nepolar, compușii de clase diferite părăsesc coloana cu un adsorbant polar la momente diferite, în timp ce timpul de retenție al compușilor cu grupe funcționale diferite crește în timpul trecerii de la compușii nepolari la cei slab polari. Pentru moleculele foarte polare, timpii de retenție sunt atât de lungi încât analiza nu este posibilă cu un eluant nepolar. Pentru a reduce timpul de retenție al componentelor polare, treceți la eluanți polari;

 în varianta cu fază inversă, faza staționară (adsorbant nepolar) adsorbe mai puternic componenta nepolară din eluanții polari, de exemplu din apă;

- Prin reducerea polarității eluentului prin adăugarea unui solvent mai puțin polar, reținerea componentelor poate fi redusă.

1.6.2. Cromatografia lichidă de partiție.În cromatografia de partiție sau lichid-lichid, separarea componentelor probei analizate se datorează diferențelor de coeficienți de distribuție a acestora între două faze lichide nemiscibile, dintre care una staționară și situată la suprafața sau în porii unui solid. purtător staționar, iar al doilea este mobil.

În ceea ce privește natura forțelor de interacțiune care determină distribuția diferită între cele două faze ale substanțelor care diferă în structura lor chimică, cromatografia de partiție este similară cu cromatografia de adsorbție, adică, și aici, separarea se bazează pe diferența dintre forțe de interacțiune intermoleculară între componentele probei analizate și fazele lichide staționare și mobile.

În funcție de tehnică, cromatografia de partiție, ca și cromatografia de adsorbție, poate fi pe coloană sau plană (hârtie sau în strat subțire).

Substanțe care sunt indiferente față de solventul mobil și componentele probei analizate, dar capabile să rețină faza staționară la suprafață și în pori, sunt utilizate ca purtători solizi. Cel mai adesea, substanțele polare (celuloză, silicagel, amidon) sunt folosite ca purtători. Li se aplică o fază staționară - un solvent polar, cel mai adesea apă sau alcool. În acest caz, ca faze mobile se folosesc substanțe mai puțin polare sau nepolare (alcooli, amine, cetone, hidrocarburi etc.). Acest tip de cromatografie de partiție se numește fază normală. Este folosit pentru a separa substanțele polare.

A doua versiune a cromatografiei de partiție diferă prin aceea că purtătorii nepolari (cauciuc, fluoroplastic, silicagel hidrofobizat) sunt utilizați ca fază solidă staționară, solvenții nepolari (hidrocarburi) sunt utilizați ca fază lichidă staționară și solvenți polari (alcooli). , aldehide) sunt utilizate ca fază lichidă mobilă, cetone etc., adesea apă). Această versiune a cromatografiei de partiție se numește faza inversatași este folosit pentru separarea substanțelor nepolare.

Pentru a realiza separarea optimă a componentelor probei analizate, selecția fazei mobile este foarte importantă. Solvenții (fazele lichide mobile și staționare) trebuie selectați astfel încât coeficienții de distribuție ai componentelor amestecului să difere destul de semnificativ. Următoarele cerințe se aplică fazelor lichide: cerințe:

1) solvenții folosiți trebuie să dizolve bine substanțele care se separă, iar solubilitatea lor în faza staționară trebuie să fie mai mare decât în ​​faza mobilă;

2) solvenții utilizați ca faze mobile și staționare trebuie să fie reciproc saturați, adică compoziția solventului trebuie să fie constantă în timpul trecerii prin coloană;

3) interacțiunea solvenților utilizați ca fază mobilă cu faza staționară ar trebui să fie minimă.

Cel mai adesea, în cromatografia lichidă de partiție, nu substanțele individuale, ci amestecurile lor în diferite rapoarte sunt utilizate ca faze lichide mobile. Acest lucru face posibilă reglarea polarității fazei mobile, modificarea raportului dintre polaritățile fazelor mobile și staționare și obținerea unor condiții optime pentru separarea componentelor unui anumit amestec analizat.

Un dezavantaj semnificativ al acestei metode cromatografice este că faza lichidă staționară aplicată este rapid spălată de pe purtător. Pentru a o elimina, solventul utilizat ca fază mobilă este saturat cu o substanță utilizată ca fază lichidă staționară, sau faza lichidă staționară este stabilizată prin grefarea acesteia pe purtător.

O variație a cromatografiei lichide de partiție este metoda HPLC utilizată pe scară largă.

Cele mai comune sisteme cromatografice sunt sistemele care au un principiu de asamblare modular. Pompele, dispozitivele de degazare, detectoarele, dozatoarele (autosamplere), termostate pe coloană, colectoare de fracții, unități de control al sistemului cromatografic și dispozitive de înregistrare sunt disponibile ca module separate. O selecție largă de module vă permite să rezolvați în mod flexibil diverse probleme analitice și să modificați rapid configurația sistemului, dacă este necesar, cu costuri minime. În același timp, sunt produse și LC-uri monomodulare (integrate), al căror avantaj principal este miniaturizarea unităților individuale și compactitatea dispozitivului.

În funcție de metoda de eluare, cromatografele lichide sunt împărțite în izocratice și gradient.

Schema unui cromatograf izocratic

Faza mobilă din recipient (1) prin filtrul de admisie (9) este alimentată de o pompă de înaltă presiune de precizie (2) către sistemul de injectare a probei (3) - un injector manual sau autosampler, iar proba este de asemenea introdusă acolo . În continuare, printr-un filtru în linie (8), proba cu un curent al fazei mobile intră în elementul (elementele) de separare (4) - prin precoloană în coloana de separare. Apoi, eluatul intră în detector (5) și este îndepărtat în recipientul de scurgere (7). Atunci când eluatul curge prin circuitul de măsurare al detectorului, se înregistrează cromatograma și se transferă datele către un înregistrator analog (recorder) (6) sau alt sistem de colectare și prelucrare a datelor cromatografice (integrator sau computer). În funcție de designul modulelor funcționale, sistemul poate fi controlat de la tastatura modulului de control (de obicei o pompă sau un controler de sistem), de la tastaturile fiecăruia dintre modulele de sistem sau printr-un program de control de la un computer personal.

În cazul eluției cu gradient, se folosesc două tipuri fundamental diferite de cromatografe lichide. Ele diferă în punctul în care se formează gradientul compoziției fazei mobile.

Schema unui cromatograf cu gradient cu formarea unui gradient al compoziției fazei mobile pe o linie de joasă presiune.

Faza mobilă de la containere (1) prin filtrele de intrare (9) și un programator de gradient (10) este alimentată de o pompă de înaltă presiune de precizie (2) către sistemul de injectare a probei (3) - un injector manual sau autosampler, și acolo este introdus și eșantion. Funcționarea supapelor de programare a gradientului este controlată fie de modulul de control al sistemului (pompă sau controler), fie de un program de control PC. Sistemele de acest tip formează un gradient binar, tridimensional și cu patru dimensiuni. Forma funcției de procesare a gradientului depinde de modulul de control sau programul de control specific, precum și de funcționalitatea modulelor controlate și de control. În continuare, printr-un filtru în linie (8), proba cu un curent al fazei mobile intră în elementul (elementele) de separare (4) - prin precoloană în coloana de separare. Apoi, eluatul intră în detector (5) și este îndepărtat în recipientul de scurgere (7). Atunci când eluatul curge prin circuitul de măsurare al detectorului, se înregistrează cromatograma și se transferă datele către un înregistrator analog (recorder) (6) sau alt sistem de colectare și prelucrare a datelor cromatografice (integrator sau computer). În funcție de proiectarea modulelor funcționale, sistemul poate fi controlat de la tastatura modulului de control (de obicei o pompă sau un controler de sistem) sau realizat printr-un program de control de la un computer personal. În cazul controlului printr-un modul de control, este posibil să se controleze independent detectorul de la propria tastatură.

În ciuda atractivității aparente a unor astfel de sisteme (folosesc o singură pompă de înaltă presiune de precizie), aceste sisteme au o serie de dezavantaje, printre care principalul, probabil, este nevoia strictă de degazare minuțioasă a componentelor fazei mobile chiar înainte de mixer de joasă presiune (camera programatorului de gradient). Se realizează folosind degazoare speciale cu flux continu. Din acest motiv, costul lor devine comparabil cu un alt tip de sisteme de gradient - sisteme cu formarea unei compoziții de gradient de fază mobilă pe o linie de înaltă presiune.

Diferența fundamentală între sistemele cu formarea unei compoziții de gradient de fază mobilă pe o linie de înaltă presiune este amestecarea componentelor în linia de înaltă presiune, în mod natural, cu această abordare, numărul de pompe de precizie este determinat de numărul de rezervoare; pentru amestecarea fazei mobile. Cu această abordare, cerințele pentru degazarea completă a componentelor sunt reduse semnificativ.

Schema unui cromatograf cu gradient cu formarea unui gradient al compoziției fazei mobile pe o linie de înaltă presiune.

Faza mobilă din containere (1) prin filtrele de intrare (9) este alimentată de pompe de înaltă presiune de precizie (2 și 11) printr-un amestecător cu debit static sau dinamic (10) în sistemul de intrare a probei (3) - un injector manual sau autosampler, iar eșantionul este de asemenea introdus acolo. Funcționarea pompelor controlate este controlată fie de modulul de control al sistemului (pompă principală sau controler), fie de un program de control PC. În acest caz, toate pompele sunt controlabile. Sistemele de acest tip formează un gradient binar sau tridimensional. Forma funcției de procesare a gradientului depinde de modulul de control sau programul de control specific, precum și de funcționalitatea modulelor controlate și de control. În continuare, printr-un filtru în linie (8), proba cu un curent al fazei mobile intră în elementul (elementele) de separare (4) - prin precoloană în coloana de separare. Eluatul intră apoi în detector (5) și este îndepărtat în recipientul de scurgere (7). Atunci când eluatul curge prin circuitul de măsurare al detectorului, se înregistrează cromatograma și se transferă datele către un înregistrator analog (recorder) (6) sau alt sistem de colectare și prelucrare a datelor cromatografice (integrator sau computer). În funcție de proiectarea modulelor funcționale, sistemul poate fi controlat de la tastatura modulului de control (de obicei o pompă sau un controler de sistem) sau realizat printr-un program de control de la un computer personal. În cazul controlului printr-un modul de control, este posibil să se controleze independent detectorul de la propria tastatură.

Schemele propuse sunt destul de simplificate. Sistemele pot include dispozitive suplimentare - un termostat de coloană, sisteme de derivatizare post-coloană, sisteme de preparare și concentrare a probelor, un reciclator de solvenți, sisteme de membrană pentru suprimarea conductivității electrice de fond (pentru cromatografia ionică), sisteme de protecție suplimentare (filtre, coloane), etc. De asemenea, diagramele nu prezintă module manometrice separat. De regulă, aceste dispozitive sunt încorporate în unități de pompare. Aceste unități pot combina mai multe pompe, o pompă cu un programator de gradient și un controler de sistem comun. Structura sistemului depinde de configurația sa și de fiecare producător specific.

O astfel de complicație radicală a suportului tehnic al procesului cromatografic duce la apariția unui număr de cerințe pentru proprietățile fazei mobile care sunt absente în cromatografia clasică pe coloană și plană. Faza lichidă trebuie să fie adecvată pentru detecție (să fie transparentă într-o anumită regiune a spectrului sau să aibă un indice de refracție scăzut, o anumită conductivitate electrică sau constantă dielectrică etc.), inertă față de materialele părților tractului cromatografic, să nu formeze gaz. bule în supapele pompei și celula detectorului, nu au impurități mecanice.

În cromatografia lichidă Sunt utilizate multe tipuri de pompe. Pentru LC de joasă presiune, se folosesc adesea pompe peristaltice (Fig. 1).

Fig. 1 Pompă peristaltică programabilă MasterFlex.

In HPLC se folosesc pompe de inalta presiune pentru a asigura debitul fazei mobile prin coloana cu parametrii specificati.

Cele mai importante caracteristici tehnice ale pompelor HPLC includ: intervalul de debit; presiune maximă de lucru; reproductibilitatea fluxului; intervalul de pulsații de alimentare cu solvent.

În funcție de natura alimentării cu solvent, pompele pot fi de alimentare (debit) și presiune constantă. Practic, în timpul lucrului analitic, se utilizează un mod de debit constant, iar la umplerea coloanelor, se utilizează un mod de presiune constantă.

Pe baza principiului lor de funcționare, pompele HPLC sunt împărțite în: seringă și pe pompă de WC reciproc .

Pompe cu seringi

Principala caracteristică distinctivă a acestor pompe este natura ciclică a funcționării lor și, prin urmare, cromatografele în care sunt utilizate aceste pompe se disting și prin funcționarea lor ciclică.

Orez. 2. Proiectarea de bază a unei pompe cu seringă pentru HPLC.

Orez. 2A. Pompă de seringă.

Unitatea de control BU furnizează tensiune motorului D, care determină viteza și direcția de rotație a acestuia. Rotația motorului cu ajutorul cutiei de viteze P este transformată în mișcarea pistonului P în interiorul cilindrului D. Pompa funcționează în 2 cicluri. În timpul ciclului de umplere, supapa K2 este închisă, K1 este deschisă, solventul curge din rezervor în cilindrul C. În modul de alimentare, supapa K1 este închisă, iar prin supapa K2 faza mobilă intră în dispozitivul de dozare.

Pompele de acest tip se caracterizează printr-o absență aproape completă a pulsațiilor în fluxul fazei mobile în timpul funcționării.

Dezavantajele pompei:

a) consum mare de timp și solvent pentru spălare la schimbarea solventului;

b) volumul PF este limitat de volumul seringii și, prin urmare, timpul de separare este limitat;

c) suspendarea separării în timpul umplerii pompei;

d) dimensiuni și greutate mari, asigurând în același timp debit și presiune ridicate (este nevoie de un motor puternic și de o forță mare a pistonului cu suprafața sa mare).

Pompe cu piston alternativ.

Orez. 3. Proiectarea de bază a unei pompe cu piston.

Principiul de funcționare.

Motorul D, prin cutia de viteze P, pune pistonul P în mișcare alternativă, mișcându-se în capul de lucru al pompei. Supapele K1 și K2 se deschid atunci când pompa este în faza de aspirație și respectiv de livrare. Cantitatea de alimentare volumetrică este determinată de trei parametri: diametrul pistonului (de obicei 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudinea acestuia (12-18 mm) și frecvența (care depinde de viteza de rotație a motorului și a cutiei de viteze).

Pompele de acest tip asigură o alimentare volumetrică constantă a fazei mobile pentru o perioadă lungă de timp. Presiune maximă de lucru 300-500 atm, debit 0,01-10 ml/min. Repetabilitate de alimentare volumetrică -0,5%. Principalul dezavantaj este că solventul este furnizat sistemului sub forma unei serii de impulsuri succesive, deci există pulsații de presiune și debit (Fig. 4). Acesta este motivul principal pentru zgomotul crescut și sensibilitatea redusă a aproape tuturor detectorilor utilizați în LC, în special a celor electrochimici.

Fig.4. Pulsațiile pompei cu piston.

Modalități de a face față pulsațiilor.

1. Aplicarea dispozitivelor de amortizare.

Acestea sunt tuburi spiralate cu profil special din otel inoxidabil, conectate in serie sau paralel cu sistemul dintre pompa si dozator.

Orez. 5. Amortizor spiralat.

Amortizorul se desfășoară pe măsură ce presiunea din el crește (accelerația pompei). Când presiunea scade, se ondula, volumul scade, stoarce o parte din solvent, menținând un debit constant și reducând pulsațiile. Acest amortizor funcționează bine la presiuni de 50 atm și peste.

La o presiune de 5-30 atm netezeste mai bine pulsatiile clapeta de aer, realizat dintr-o coloană (Fig. 6.). Aerul din coloana amortizată (6x200 mm) este comprimat și pulsațiile sunt amortizate. Aerul se dizolvă în el în 24 de ore.

Orez. 6. Clapeta de aer.

2. Aplicarea dispozitivelor electronice.

Când utilizați un senzor electronic de presiune, puteți utiliza citirile senzorului pentru a controla funcționarea pompei. Când presiunea scade, turația motorului crește și compensează scăderea presiunii. De asemenea, este posibil să se compenseze scurgerile din supape și parțial din manșete. Utilizarea unui amortizor electronic (BPZh-80, KhPZh-1 etc.) face posibilă reducerea pulsațiilor de presiune la 1 atm la o presiune de 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Schimb de ioni, ioni, cromatografia perechi de ioni. Metodele de schimb de ioni, cromatografia de ioni și perechi de ioni se bazează pe procesul dinamic de înlocuire a ionilor asociați cu faza staționară cu ioni de eluent care intră în coloană. Scopul principal al procesului cromatografic este separarea ionilor anorganici sau organici de același semn. Retenția în aceste tipuri de cromatografie este determinată de modificarea energiei libere a reacției de schimb ionic. Raportul dintre concentrațiile ionilor schimbați în soluție și în faza de absorbție este caracterizat de echilibrul schimbului de ioni. Schimbul de ioni este ca unele substante (schimbatoare de ioni), atunci cand sunt scufundate intr-o solutie de electrolit, absorb cationi sau anioni din aceasta, eliberand in solutie o cantitate echivalenta de alti ioni cu sarcina de acelasi semn. Are loc un schimb de cationi între schimbătorul de cationi și soluție, iar un schimb de anioni are loc între schimbătorul de anioni și soluție.

Schimbătoarele de cationi sunt cel mai adesea substanţe polimerice insolubile special sintetizate care conţin în structura lor grupări ionogene de natură acidă: –SO 3 H; –COOH; -OH; –P03H2; –AsO3H2.

Formulele chimice ale schimbătorilor de cationi pot fi descrise schematic ca R-SO3H; R-S03Na. În primul caz, schimbătorul de cationi este în formă H, în al doilea, în formă Na. R – matrice polimerică.

Reacțiile de schimb cationic sunt scrise ca reacții chimice eterogene obișnuite:

RNa +Na + RNa+H+

Schimbătoarele de anioni conţin în structura lor grupări ionogene bazice: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + etc. Formulele lor chimice pot fi descrise ca RNH 3 OH și RNH 3 Cl sau ROH, RCl. În primul caz, schimbătorul de anioni este în formă OH, în al doilea caz, în formă Cl. Reacția de schimb anionic poate fi scrisă după cum urmează:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Se cunosc schimbătoare de ioni amfoteri care conțin atât grupări acide, cât și bazice în structura lor. Schimbătoarele de ioni care conțin grupări acide (bazice) de același tip (de exemplu, SO 3 H) se numesc monofuncționale; schimbătoarele de ioni care conțin diferite tipuri (de exemplu, SO3H, OH) grupări acide (bazice) sunt polifuncționale.

Schimbătoarele de ioni monofuncționale se obțin prin reacție de polimerizare. Reacția de policondensare face posibilă obținerea unor schimbătoare de ioni multifuncționale. Pentru ca schimbătoarele de ioni rezultate să aibă caracteristici de performanță suficient de înalte, acestea trebuie să fie insolubile, dar să se umfle în solventul adecvat și să aibă un număr suficient de mare de grupări ionogene capabile să se schimbe cu grupările ionogene ale probei analizate. Acest lucru poate fi realizat dacă lanțurile polimerice rezultate sunt suficient de ramificate și legate între ele prin punți de reticulare. De exemplu, la prepararea schimbătoarelor de cationi de tip polimerizare pe bază de stiren, divinilbenzenul este cel mai adesea folosit ca agent de reticulare, a cărui introducere într-o cantitate de până la 16% asigură producerea de schimbătoare de ioni cu diferite grade de umflare și , prin urmare, face posibilă reglarea porozității schimbătorului de ioni. Gradul de umflare al schimbătorului de ioni, exprimat în mililitru/gram, este volumul a 1 g de schimbător de ioni uscat la aer ambalat într-o coloană.

Schimbătorul de ioni absoarbe, de regulă, unul dintre contraionii - ioni prezenți în faza mobilă, adică prezintă o anumită selectivitate. Seria de afinitate sau selectivitatea ionilor față de diferite tipuri de schimbătoare de ioni a fost stabilită experimental. De exemplu, la concentrații scăzute ale soluției pe schimbătoarele de cationi puternic acide, ionii cu aceeași sarcină sunt absorbiți în următoarea secvență:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Pentru ionii cu sarcini diferite, sorbția crește odată cu creșterea sarcinii:

Na+ Ca 2+

Cu toate acestea, modificarea condițiilor reacției de schimb ionic poate duce la inversarea seriei. Serii de afinitate au fost stabilite și pentru schimbătoarele de anioni. De exemplu, absorbabilitatea anionilor pe schimbătorii de anioni puternici de bază crește în următoarea ordine:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Schimbătoarele de ioni care conțin grupări puternic acide sau puternic bazice în structura lor intră în reacții de schimb ionic cu orice ioni în soluție cu sarcini de același semn ca semnul contraionului. Astfel de schimbătoare de ioni sunt numite universale.

Procesul de schimb de ioni dintre analit și schimbătorul de ioni poate fi realizat într-unul din trei moduri: static, dinamic (metoda filtrului schimbător de ioni) și cromatografic.

Metoda statica schimbul de ioni este că o probă din schimbătorul de ioni este adusă în contact cu un anumit volum de soluție și amestecată sau agitată pentru un anumit timp până la stabilirea echilibrului. Aceasta este o metodă rapidă și simplă de schimb ionic, folosită pentru a concentra ionii din soluții diluate, îndepărtând impuritățile inutile, dar nu asigură absorbția completă a ionilor, deoarece schimbul ionic este un proces de neechilibru și, ca urmare, nu garantează separarea completă. de ioni.

La efectuarea schimbului de ioni într-un mod dinamic o soluție este trecută prin coloană cu schimbătorul de ioni, care, pe măsură ce se deplasează de-a lungul coloanei, intră în contact cu granule noi de schimbător de ioni. Acest proces asigură un schimb mai complet decât metoda statică, deoarece produsele de schimb sunt îndepărtate de fluxul de soluție. Ei pot concentra ionii din soluții diluate și pot separa ionii care diferă foarte mult în proprietăți, de exemplu, ionii cu sarcini diferite (separați cationii de anioni), dar separarea ionilor cu același semn de sarcină este aproape imposibilă. Separarea cantitativă a unor astfel de ioni este posibilă numai cu repetarea repetată a actelor elementare de sorbție-desorbție în condiții dinamice, adică. metoda cromatografica . Când se lucrează cu această metodă, se folosesc straturi înalte de schimbător de ioni și amestecul de separat este introdus în acest strat într-o cantitate semnificativ mai mică decât capacitatea coloanei, datorită căreia se asigură repetarea multiple a actelor elementare de schimb ionic.

În ceea ce privește tehnicile de analiză, cromatografia cu schimb de ioni este similară cu cromatografia moleculară și poate fi efectuată folosind opțiuni de eluent (dezvoltare), frontal și de deplasare. Diferența dintre cromatografia moleculară și cea cu schimb de ioni este că în cromatografia moleculară componentele separate ale amestecului sunt eluate din coloană cu un eluent pur, în timp ce în cromatografia cu schimb de ioni se folosește ca eluant o soluție de electrolit. În acest caz, ionul schimbat al eluentului ar trebui să fie absorbit mai puțin selectiv decât oricare dintre ionii amestecului care se separa.

Când se efectuează cromatografia de schimb de ioni de dezvoltare, care este utilizată cel mai des, o coloană umplută cu un schimbător de ioni este mai întâi spălată cu o soluție de electrolit până când toți ionii săi sunt înlocuiți complet în schimbătorul de ioni de ionii conținuti în eluant. Apoi, în coloană este introdus un volum mic dintr-o soluție de analit, care conține ionii separați într-o cantitate de aproximativ 1% din capacitatea schimbătorului de ioni. Apoi, coloana este spălată cu soluția de eluent, selectând fracțiunile de eluat și analizându-le.

Un amestec de ioni Cl – , Br – , J – poate fi separat pe un schimbător de anioni foarte bazic (polistiren reticulat care conține grupe de baze de amoniu cuaternar – N (CH 3) 3 +), de exemplu, AB-17, care are un număr de selectivitate (selectivitate): NO 3 – Cl – Br – J – . Ca rezultat, o soluție de NaN03 este utilizată ca eluent. În primul rând, această soluție este trecută prin schimbătorul de ioni până când este complet saturată cu ioni NO 3 –. Când amestecul de separat este introdus în coloană, ionii Cl – , Br – , J – sunt absorbiți de schimbătorul de anioni, înlocuind ionii NO 3 –. Atunci când coloana este spălată ulterior cu o soluție de NaNO 3, ionii Cl – , Br – , J – din straturile superioare ale schimbătorului de anioni sunt înlocuiți treptat din nou cu ioni de NO 3 –. Ionii Cl – vor fi deplasați cel mai repede, iar ionii J – vor rămâne în coloană cel mai mult. Diferența de selectivitate a schimbătorului de ioni față de ionii amestecului duce la formarea de zone separate de ioni Cl – , Br – și J – absorbiți în coloană, deplasându-se de-a lungul coloanei cu viteze diferite. Pe măsură ce vă deplasați de-a lungul coloanei, distanța dintre zone crește. În fiecare zonă există doar unul dintre anionii amestecului care se separă și anionul eluant în intervalul dintre zone există doar anionul eluant. Astfel, vor apărea fracții în eluant la ieșirea coloanei, care conțin componente individuale ale amestecului care se separă.

Pentru a rezolva probleme practice, condițiile pentru separarea ionilor sunt variate prin selectarea unei faze mobile adecvate (compoziție, concentrație, pH, tărie ionică) sau prin modificarea porozității matricei polimerice a schimbătorului de ioni, adică a numărului de legături intercatenare din matrice, și creând site schimbătoare de ioni care sunt permeabile la unii ioni și capabile să-i schimbe și impenetrabile pentru alții. De asemenea, este posibil să se schimbe natura și dispunerea relativă a grupărilor ionogene, precum și să se obțină adsorbanți capabili de reacții chimice selective datorită formării complexelor. De exemplu, schimbătoarele de ioni care formează complexe care conțin în structura lor grupări chelatoare de reactivi organici dimetilglioximă, ditizonă, 8-hidroxichinolină etc., precum și eteri coroană, au o selectivitate ridicată.

Cea mai mare utilizare în cromatografia de schimb de ioni, de ioni și de perechi de ioni se găsește în schimbătoarele de ioni organice cu macro și microplasă sintetice cu o capacitate mare de schimb (3–7 mmol/g), precum și în materialele schimbătoare de ioni anorganice. Schimbătoarele de ioni cu microplasă sunt capabile să schimbe ioni numai în starea umflată, în timp ce schimbătoarele de ioni cu macroplasă sunt capabile să schimbe ioni numai în starea umflată și neumflată. Un alt tip structural de schimbătoare de ioni sunt schimbătoarele de ioni cu peliculă de suprafață, al căror miez solid este format dintr-un copolimer neporos de stiren și divinilbenzen, sticlă sau silicagel și este înconjurat de o peliculă subțire de schimbător de ioni. Diametrul total al unei astfel de particule este de aproximativ 40 µm, grosimea peliculei schimbătoare de ioni este de 1 µm. Dezavantajul unor astfel de schimbătoare de ioni este diametrul relativ mare al particulelor și capacitatea de schimb scăzută din cauza suprafeței specifice scăzute, drept urmare este necesar să se lucreze cu eșantioane mici și, în consecință, să se utilizeze detectoare foarte sensibile. În plus, astfel de schimbătoare de ioni sunt otrăvite rapid și nu sunt capabile de regenerare.

În schimbător de ioni de înaltă performanță și cromatografie ionică, schimbătoare de ioni de polistiren poros volumetric, silice poroase volumetrice cu un diametru de granule de aproximativ 10 microni, precum și copolimeri practic neumflați porosi la suprafață și modificați la suprafață ai stirenului și divinilbenzenului cu sulfo ionogene - se folosesc grupări amino.

În cromatografia cu perechi de ioni se folosesc adsorbanți „perie” - silicageluri cu faze inverse grefate C 2, C 8, C 18, care sunt ușor transformate într-un schimbător de cationi atunci când absorb agenții tensioactivi ionici din faza mobilă, de exemplu alchil sulfați sau săruri ale bazelor cuaternare de amoniu.

Când se efectuează separarea cromatografică folosind schimbătoare de ioni, soluțiile apoase de săruri sunt cel mai adesea utilizate ca fază mobilă. Acest lucru se datorează faptului că apa are proprietăți excelente de dizolvare și ionizare, datorită cărora moleculele probei analizate se disociază instantaneu în ioni, grupele schimbătoare de ioni ale schimbătorului de ioni sunt hidratate și, de asemenea, se transformă într-o formă complet sau parțial disociată. Acest lucru asigură un schimb rapid de contraioni. Rezistența de eluare a fazei mobile este influențată în principal de pH, tăria ionică, natura soluției tampon și conținutul de solvent organic sau surfactant (cromatografia cu perechi de ioni).

Valoarea pH-ului este selectată în funcție de natura grupărilor ionogene, a ionilor separați și a matricei. Puteți lucra cu schimbătoare de ioni puternic acide și puternic bazice la pH = 2–12, cu cele slab acide la pH = 5–12, cu cele slab bazice la pH = 2–6. Sorbanții pe bază de silice nu pot fi utilizați la pH 9. Forța ionică a fazei mobile afectează capacitatea schimbătorului de ioni. Pe măsură ce puterea ionică crește, sorbția ionilor scade de obicei, pe măsură ce forța de eluție a fazei mobile crește. Prin urmare, la începutul separării, faza mobilă ar trebui să aibă o tărie ionică scăzută (0,05–0,1), iar valoarea finală a acestei caracteristici nu trebuie să depășească 2. În eluția cu gradient, se folosesc adesea tampoane cu tărie ionică în creștere.

Pentru eluarea selectivă a ionilor absorbiți de un schimbător de ioni, puteți utiliza apă, soluții tampon (fosfat, acetat, borat, hidrocarbonat etc.) cu o anumită valoare a pH-ului și tărie ionică, soluții minerale (clorhidric, azot, sulf, fosfor) și acizi organici (fenol, citric, lactic, tartric, oxalic, EDTA). Alegerea eluentului este facilitată de faptul că coeficienții de distribuție limitanți ai majorității elementelor între soluțiile apoase (apoase-organice) ale multor complexanți și schimbătoarele de ioni de tip standard sunt determinate și prezentate în tabele.

1.6.4. Cromatografia de excludere a mărimii. Cromatografia de excludere dimensională este un tip de cromatografie lichidă în care separarea componentelor se bazează pe distribuția moleculelor în funcție de dimensiunea lor între solventul situat în porii sorbentului și solventul care curge între particulele acestuia. În timpul procesului de separare, moleculele mici intră în rețeaua polimerică, în porii cărora solventul servește ca fază staționară și sunt reținute acolo. Moleculele mari nu pot pătrunde în rețeaua polimerică și sunt spălate din coloană de faza mobilă. Se eluează mai întâi cele mai mari molecule, apoi cele de dimensiuni medii și, în final, cele mici.

Cromatografia de excludere a mărimii este împărțită în permeație pe gel și filtrare pe gel. În cromatografia cu permeație pe gel, separarea are loc pe polimeri care se umflă în solvenți organici. Versiunea de filtrare pe gel a cromatografiei cu excludere dimensională implică utilizarea polimerilor care se umflă în apă ca faze staționare.

Durata de retenție a componentelor probei analizate în coloana de excludere a mărimii depinde de dimensiunea moleculelor acestora și de difuzia în porii sorbantului, precum și de dimensiunea porilor fazei staționare.

În acest tip de cromatografie lichidă, coeficientul de distribuție D pentru cele mai mici molecule ale probei analizate, care se deplasează în coloana cromatografică cu cea mai mică viteză, pătrunzând în rețeaua fazei staționare, este egal cu 1, deoarece faza mobilă și solventul situat în porii fazei staționare au aceeași compoziție. În acest caz, ecuația de bază a cromatografiei pe coloană ia forma

Moleculele mari care nu se potrivesc în porii fazei staționare eluează din coloană împreună cu faza mobilă. Pentru ei D= 0, a V R =V m. Acest interval de valori ale coeficientului de distribuție (de la 0 la 1) este tipic numai pentru cromatografia de excludere a dimensiunii.

Toate moleculele substanței multicomponente analizate trebuie spălate din coloană prin trecerea unui volum mic de solvent din V m inainte de V m +V s iar separarea se termină înainte ca vârful de solvent să fie eliberat. Prin urmare, în acest tip de cromatografie este necesar să se utilizeze coloane destul de lungi, cu un volum liber mare V mși un număr mare de pori în sorbent.

Rezoluția vârfurilor cromatografice în separările de excludere a mărimii poate fi îmbunătățită prin utilizarea gradientului de eluare cu solvenți amestecați.

Fiecare sorbent utilizat în cromatografia de excludere a mărimii este caracterizat de un anumit volum al porilor și, prin urmare, are o anumită regiune de greutăți moleculare separabile și o anumită curbă de calibrare. În acest caz, graficul de calibrare care caracterizează dependența volumului reținut de greutatea moleculară sau dimensiunea moleculară, de regulă, are un aspect complex.

Fazele staționare în cromatografia de excludere dimensională sunt selectate pe baza sarcinilor analitice specifice. Inițial, se stabilește ce sistem de solvenți poate fi utilizat pentru analiză (apos sau apos-organic). În funcție de aceasta, se determină tipul de sorbant. Dacă este necesar să se separe probele solubile în apă, de exemplu, ca faze staționare se folosesc dextrani reticulati umflați în apă (Sephadex) sau poliacrilamide (Biogel R). Separarea substanțelor solubile în solvenți organici poate fi efectuată pe polistirenuri cu diferite grade de reticulare, umflare în solvenți organici (styrogel, poragel, biobid C). Astfel de geluri umflate sunt de obicei instabile la presiune și permit debite foarte scăzute ale fazei mobile, ceea ce mărește timpul de analiză. Pentru a implementa o versiune foarte eficientă a cromatografiei de excludere a mărimii, este necesar să se utilizeze faze staționare cu matrici rigide — silicageluri, al căror dezavantaj — activitate mare de adsorbție — este eliminat prin silanizarea suprafeței sau selectarea unui eluant adecvat în polaritate.

Substanțele care pot fi utilizate ca faze mobile în cromatografia de excludere dimensională sunt:

- se dizolvă complet proba analizată;

 umeziți bine sorbantul;

- contracarează adsorbția componentelor probei pe sorbent;

 au vâscozitate şi toxicitate scăzute.

1.6.5. Cromatografia plană. Cromatografia plană include cromatografia în strat subțire și cromatografia pe hârtie. Aceste tipuri de cromatografie lichidă sunt simple ca tehnică, rapide și nu necesită echipamente scumpe, ceea ce este avantajul lor incontestabil.

Separarea unui amestec de substante prin aceste metode poate fi realizata folosind diverse sisteme cromatografice. Prin urmare, se disting hârtia de adsorbție, distribuție, fază normală și inversă, schimb de ioni etc. și cromatografia în strat subțire. În prezent, cromatografia în strat subțire este cea mai utilizată.

Cromatografia pe hârtie și în strat subțire sunt similare ca tehnică. Fibra de celuloză a hârtiei este utilizată ca fază staționară în cromatografia pe hârtie în cromatografia în strat subțire, diverși adsorbanți (Al 2 O 3, gel de silice etc.) sunt aplicați într-un strat subțire uniform (100–300 μm), pe o sticlă, substrat metalic sau plastic (suport) . Stratul adsorbant de pe purtător poate fi atașat sau nu.

Separarea cromatografică în metode plane, precum și pe o coloană, se datorează transferului componentelor analitului de către faza mobilă de-a lungul stratului de fază staționară la viteze diferite în conformitate cu coeficienții de distribuție ai substanțelor care sunt separate. În ambele cazuri se folosesc sisteme cromatografice: lichid - solid sorbent (mecanism de separare prin adsorbție), lichid - lichid - purtător solid (distribuție, schimb ionic și alte mecanisme).

Ca faze mobile se folosesc diferiți solvenți sau amestecuri ale acestora, acizi organici sau anorganici.

Producerea practică a cromatogramelor plane este următoarea.

Pe o bandă de hârtie cromatografică sau pe un strat subțire de sorbant, marcați o linie de pornire cu un creion la o distanță de 1 cm de marginea inferioară a benzii sau a plăcii. Folosind o micropipetă, aplicați proba pe linia de pornire sub forma unui punct cu un diametru de cel mult 2-3 mm. Marginea benzii sau a plăcii este apoi coborâtă într-un vas care conține faza mobilă situată într-o cameră etanșă. Pe măsură ce faza mobilă se ridică de-a lungul benzii sau plăcii și apar multiple acte elementare de sorbție-desorbție, distribuție între două faze lichide, schimb de ioni etc., care sunt comune în cromatografie, componentele amestecului analizat sunt separate. Procesul este de obicei continuat până când solventul trece de la linia de pornire 10 cm După aceasta, banda sau placa este îndepărtată din cameră și uscată. Dacă componentele analitului sunt colorate, ele dau pete colorate corespunzătoare pe cromatogramă. Pentru a detecta componentele necolorate ale analitului, trebuie dezvoltată cromatograma. Elaborarea unei cromatograme și detectarea componentelor probei pot fi efectuate prin diferite metode și depind de compoziția amestecurilor analizate. Manifestarea poate fi efectuată:

- utilizarea luminii UV. Metoda este aplicabilă pentru detectarea substanțelor capabile să emită propria radiație (luminiscență) în domeniul lungimii de undă vizibile sub influența radiației UV;

- prin reactivi de dezvoltare. De exemplu, prezența aminoacizilor în amestecul analizat poate fi detectată folosind ninhidrina. Cromatograma uscată este scufundată într-o soluție 0,2% de ninhidrin în acetonă, apoi uscată. Petele corespunzătoare diverselor componente ale amestecului capătă o culoare vizuală și, de regulă, specifică fiecărei substanțe;

- folosind iod. În acest caz, cromatograma detectată este introdusă într-un vas în fundul căruia se află cristale de iod. Vaporii de iod sunt absorbiți mai puternic pe pete, făcând petele vizibile. Iodul este un reactiv de dezvoltare nespecific. Folosind reactivi specifici, este posibil nu numai să se determine numărul de componente ale amestecului, ci și să se identifice substanțele separate după culoarea petelor.

Cromatografia pe hârtie și în strat subțire se realizează cel mai adesea în așa-numita versiune ascendentă descrisă mai sus. Destul de des, pentru a îmbunătăți calitatea cromatogramelor, este necesar să se utilizeze variante mai complexe de cromatografie plană, de exemplu, descendentă, circulară, bidimensională. Când se efectuează cromatografie descendentă pe hârtie sau în strat subțire, analitul este aplicat pe linia de pornire a unei plăci sau a unei benzi de hârtie situată deasupra, iar eluentul este furnizat nu de jos, ci de sus. Efectul pozitiv al îmbunătățirii separării se datorează contribuției gravitației componentelor la procesul de separare.

Atât cromatografia ascendentă, cât și cromatografia descendentă poate fi efectuată în versiuni una și bidimensionale. Spre deosebire de procesul de separare unidimensional pe pat plat descris mai sus, în separarea cromatografică bidimensională proba de analizat este mai întâi separată într-un solvent, apoi separată într-o direcție perpendiculară pe primul folosind un alt solvent, rotind prima cromatogramă. cu 90 o C.

Când se efectuează cromatografia circulară, analitul este aplicat sub formă de picătură în mijlocul unei plăci sau unei foi de hârtie pentru cromatografie. Aici se adaugă, de asemenea, în picătură unul sau mai mulți solvenți. Astfel, cromatograma rezultată este un set de pete radiale.

Poziția petelor (zonelor) care formează componentele separate ale analitului pe o cromatogramă plată este caracterizată de viteza relativă de mișcare a componentelor într-un strat subțire R fi. Experimental valoarea R fi definită ca raportul distanței L i a trecut i-a componenta, la distanta L parcurs de solvent de la linia de plecare la linia frontului (Fig. 1.10):

Magnitudinea R fi depinde de natura componentei corespunzătoare a probei analizate, natura fazei staționare, grosimea acesteia, natura și calitatea fazei mobile, metoda de aplicare a probei și alți factori, dar întotdeauna R fi 1.

Magnitudinea R fi este de fapt identic cu timpul de retenție al unei substanțe sau cu volumul de retenție al acesteia, care caracterizează viteza de trecere a unei substanțe printr-o coloană cromatografică și poate fi utilizat pentru identificarea calitativă a componentelor probei analizate și a diametrului spotului. este identică cu înălțimea sau aria vârfului cromatografic și, prin urmare, reflectă într-o oarecare măsură conținutul cantitativ al substanței.

În cel mai simplu caz, determinarea cantitativă a compoziției probei analizate poate fi evaluată vizual prin intensitatea culorii proprii a petelor sau intensitatea strălucirii fluorescente a petelor rezultate în timpul detectării UV. În aceste scopuri, eluarea petelor cromatografice este utilizată pe scară largă. În acest caz, pata obținută pe cromatogramă este tăiată sau răzuită cu grijă, tratată cu un solvent adecvat, iar soluția rezultată este examinată folosind metoda fizico-chimică adecvată. De asemenea, puteți utiliza metoda greutății, în care locul corespunzător este tăiat din cromatogramă și cântărit. Cantitatea de substanță este determinată de diferența dintre greutățile hârtiei curate din aceeași zonă și ale hârtiei cu substanța.

Hârtie (BH ) Și cromatografia în strat subțire (TLC ) conform mecanismului de separare îi aparțin cromatografia de partiție . În metoda BH, purtătorul este un special hârtie de cromatografie cu anumite proprietăți. Faza stationara apa este adsorbita pe suprafata si porii hartiei (pana la 20%), mobila este un solvent organic, miscibil sau nemiscibil cu apa, apa sau solutii electrolitice.

Mecanism Pe hârtie este destul de complicat. În faza staționară, o substanță poate fi reținută nu numai datorită dizolvării în apă adsorbită de hârtie, ci și adsorbi direct din celuloză. Imprimat pe hârtie componente partajate trec în faza mobilă și se deplasează prin capilarele hârtiei cu viteze diferite în conformitate cu coeficientul de distributie interfaciala fiecare dintre ei. La început cromatografia o parte din substanța din hârtie intră în Faza mobila si mergi mai departe. Când solventul organic ajunge la o secțiune a hârtiei care nu conține substanța dizolvată, aceasta apare din nou. redistribuire : din faza organica substanta trece in faza apoasa, sorbita pe hartie. Deoarece componentele au diferite afinitate pentru sorbent , când eluentul se mișcă, are loc separarea: unele substanțe sunt reținute la începutul traseului, altele se deplasează mai departe. Aici se combină termodinamic (stabilirea unei distribuții de echilibru a substanțelor între faze) și cinetică (deplasarea componentelor la viteze diferite) aspecte ale separării. Ca rezultat, fiecare componentă este concentrată pe o anumită zonă a foii de hârtie: zone ale componentelor individuale pe cromatograma . Utilizarea cromatografiei pe hârtie are o serie de dezavantaje semnificative: dependența procesului de separare de compoziția și proprietățile hârtiei, modificări ale conținutului de apă din porii hârtiei atunci când condițiile de depozitare se schimbă, o viteză de cromatografie foarte mică ( până la câteva zile) și reproductibilitatea scăzută a rezultatelor. Aceste neajunsuri afectează grav răspândirea cromatografiei pe hârtie ca metodă cromatografică.

ÎN Metoda TLC procesul de separare a unui amestec de substanțe se realizează într-un strat subțire sorbent , depus pe un substrat solid inert, și este asigurat prin mișcare Faza mobila (solvent) prin sorbent sub influență forțe capilare . Demecanism de separare diferenţiaţi cromatografia de partiție, adsorbție și schimb ionic . Separarea componentelor are loc în aceste cazuri fie ca urmare a coeficientului lor de distribuție diferit între cele două faze lichide ( cromatografia de partiție ), sau datorită capacității diferite de absorbție a compușilor de către sorbant ( cromatografia de adsorbție ). Metoda de adsorbție se bazează pe diferite grade de sorbție-desorbție a componentelor separate pe faza staționară. Adsorbţie efectuate pe cheltuiala forțele van der Waals , care este baza adsorbție fizică , polimoleculară (formarea mai multor straturi de adsorbat pe suprafața adsorbantului) și chimisorbtie (interacțiunea chimică dintre adsorbant și adsorbat).

În cazul utilizării unor astfel de adsorbanţi pentru TLC ca alumină sau gel de silice joacă un rol în separare distributie , asa de adsorbţie pe suprafaţa activă dezvoltată a sorbantului (150–750 m 2 /g). Distributie componentele amestecului se găsesc între apa de pe suprafața purtătorului (cum ar fi adsorbanți , Cum alumină , amidon , celuloză , kiselgur - Și apă formă faza stationara ), iar solventul care se deplasează prin această fază staționară ( Faza mobila ). Componenta amestecului care este mai solubilă în apă se mișcă mai lent decât cea mai solubilă în faza mobilă.

Adsorbţie se manifestă prin faptul că între purtător , de exemplu, oxidul de aluminiu, și componentele amestecului sunt stabilite echilibre de adsorbție – fiecare componentă are propriile sale, al căror rezultat este diferite viteze de deplasare componente ale amestecului. Se pot distinge două cazuri extreme:

a) concentrația substanței pe adsorbant este zero. Substanța se dizolvă complet în faza mobilă și este purtată de ea (se mișcă împreună cu frontul solventului ).

b) substanța este complet adsorbită, nu interacționează cu solventul și rămâne la început.

În practică, cu o selecție pricepută a solventului și adsorbantului distributie compușii sunt localizați între aceste cazuri extreme, iar substanța treptat transferat de la un strat sorbant la altul datorită proceselor care au loc simultan sorbția Și desorbtie .

Solventul care trece prin sorbent se numește eluent , procesul de deplasare a unei substanțe împreună cu eluentul  eluare . Pe măsură ce lichidul se mișcă de-a lungul plăcii, amestecul de substanțe se separă datorită acțiunii forțelor adsorbţie , distributie , schimb de ioni sau combinarea tuturor acestor factori. Ca urmare, separat zone cromatografice componentele amestecului, de ex. se dovedește cromatograma .

Selectare corectă sorbent Și eluent determină eficienţa separării amestecului. Mobilitatea substanței de testat depinde de afinitatea acesteia pentru sorbant și forta de elutie (polaritatea) eluentului. Pe măsură ce polaritatea unui compus crește, crește și afinitatea acestuia pentru sorbantul polar. Prin creșterea gradului de adsorbție gel de silice compuşii organici sunt aranjaţi pe rând: hidrocarburi<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь pentru silicagel eluanții pot fi aranjați în ordinea creșterii „polarității” ( capacitatea de eluare ) și formează o serie de solvenți ( serie eluotropă ) conform datelor experimentale: alcani>benzen>cloroform>dietil eter>acetat de etil>alcooli C2-C4>apă>acetonă>acid acetic>metanol. Astfel, compusul polar, alcoolul, este destul de puternic adsorbit pe silicagel și, prin urmare, se mișcă slab sub influența unui solvent nepolar, cum ar fi hexanul, și rămâne aproape de linia de pornire. La rândul său, bifenilul hidrocarbură aromatică nepolară este vizibil mai mobil în hexan, dar chiar și aici pentru a obține R f aproximativ 0,5, este necesar un eluent aprotic mai polar - clorură de metilen. Puterea eluantului reglați folosind amestecuri de solvenți care sunt învecinați serie eluotropă cu polaritate diferită.

În prezent, următoarele sunt utilizate în principal în TLC: adsorbanţi : pentru împărțire substanțe lipofile  gel de silice , alumină , celuloza acetilata , poliamide ; pentru separare substanțe hidrofile  celuloză , schimbătoare de ioni de celuloză , kiselgur , poliamide . Cea mai importantă caracteristică a sorbantului este sa activitate , adică abilitate sorb (ține) componentele amestecului de separat. În străinătate, o serie de companii produc gel de silice , kiselgur Și alumină cu adaos de 5% gips, care este folosit pentru a asigura stratul de absorbant la realizarea plăcilor în mod independent.

Cel mai comun sorbent este gel de silice - acid silicic hidratat, format prin actiunea acizilor minerali asupra Na 2 SiO 3 si uscarea solului rezultat. După măcinarea solului, se folosește o fracțiune dintr-o anumită dimensiune a granulelor (indicată pe placă, de obicei 5-20 microni). Gel de silice este sorbent polar cu grupe OH ca centri activi. Absoarbe cu ușurință apa la suprafață și formează legături de hidrogen.

Alumină este un adsorbant slab bazic și este utilizat în principal pentru separarea compușilor slab bazici și neutri. Dezavantajul plăcilor de oxid de aluminiu este activarea obligatorie a suprafeței înainte de utilizare într-un cuptor la temperaturi ridicate (100-150 o C) și capacitatea scăzută de adsorbție a stratului față de silicagel.

Pământ de diatomee - adsorbant obtinut din minerale naturale - pamanturi de diatomee. Sorbantul are proprietăți hidrofile și o capacitate de adsorbție mai mică a stratului în comparație cu silicagel.

Celuloză: plăcile în strat subțire acoperite cu celuloză sunt foarte eficiente pentru separarea moleculelor organice complexe. Adsorbantul constă în principal din perle de celuloză cu un diametru de până la 50 de microni, fixate pe un suport cu amidon. Ca și în cromatografia pe hârtie, creșterea frontului de solvent are loc foarte lent.

Analiza cromatografică realizat pe plăci industriale fabricate în Republica Cehă " Silufol » (« Silufol ") din folie de aluminiu, uneori întărită cu carton și " Siluplast » din plastic, acoperit cu un strat de sorbenti - silicagel LS 5-40 cu amidon sau gips ca liant (pana la 10%), sau oxid de aluminiu cu si fara adaos de indicatori fluorescenti. Înregistrări " Silufol » au o rată de eluare mare, dar se caracterizează printr-o capacitate scăzută de separare și sensibilitate scăzută. În timpul depozitării, acestea sunt sensibile la condiții (umiditate, temperatură, medii agresive etc.). Unele companii furnizează plăci de cromatografie cu un strat absorbant de grosime variabilă (de obicei până la 0,25 mm) dar strict constantă (silicagel, celuloză, rășină schimbătoare de ioni), pe sticlă și substraturi din folie de aluminiu, plastic, fibră de sticlă impregnată.

Farfurii " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) sunt produse în Rusia pe o bază de polimer (tereftalat de polietilen, grad P) sau un substrat de aluminiu (grad AF) cu un strat de lucru aplicat sorbent de silicagel microfracționat clasele STX-1A și STX-1VE (produs în URSS ca silicagel fracționat KSKG) cu o grosime de 90-120 microni (până la 200 microni), fixat cu un liant special - silice sol . Când se utilizează ca liant sol de acid silicic (sol de silice), care după încălzire se transformă în gel de silice, plăcile TLC rezultate constau din două componente: un strat de gel de silice și un substrat. Uniformitatea grosimii stratului absorbant pe o placă este de ±5 µm. Exemplu de denumire: „Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)” - plăci TLC de înaltă performanță pe un substrat de aluminiu, cu fosfor, 10x10 cm.

Dacă utilizați un substrat de sticlă (grad C), atunci astfel de plăci sunt reutilizabile și rezistente chimic. Rezistența lor chimică este determinată de rezistența chimică a gelului de silice. Ca urmare, plăcile TLC pot fi tratate în mod repetat cu reactivi agresivi, de exemplu, un amestec de crom fierbinte, care elimină restricțiile privind utilizarea reactivilor de corelare pentru detectarea petelor și modificarea sorbantului și permite repetarea (de până la 30 de ori sau mai mult). ) regenerarea plăcilor cu amestec de crom. Plăcile de sticlă pot fi tăiate la dimensiunile necesare. Rezistența mecanică a stratului absorbant poate fi ajustată, asigurând, pe de o parte, transportul și prelucrarea repetată a plăcilor și, pe de altă parte, posibilitatea extracției straturilor adsorbante cu substanțe separate pentru leșierea ulterioară a compușilor individuali din sorbent și studiul lor ulterioar prin metode instrumentale (spectrometrie IR și UV, metode structurale cu raze X, RMN etc.).

Plăcile diferă prin dimensiunea fracțiilor (distribuția particulelor) de silicagel care alcătuiește stratul. Pe plăcile analitice (gradul A) fracția este de 5-17 microni, pe plăcile performante (gradul B) - 8-12 microni. O distribuție mai îngustă crește eficiența plăcilor, adică petele substanţelor separate devin mai compacte (mai mici ca mărime) şi de aceea sunt mai bine separate când frontul de eluent trece pe o distanţă mai mică. La napolitanele rusești, straturile analitice și performante nu diferă foarte mult, spre deosebire de napolitanele de la Merck (Germania). Plăcile de înaltă eficiență trebuie utilizate dacă substanțele nu pot fi separate pe plăcile analitice. Plăcile cu toate modificările sunt produse cu fosfor (grad UV) cu excitație 254 nm. Perioada de valabilitate este nelimitată, farfurii " Sorbfil » testat pe scară largă în analiza derivaților de aminoacizi, pesticide, lipide, antibiotice.

Se efectuează metoda TLC identificarea calitatii componente. cuantificarea pentru TLC este de asemenea posibil, acest lucru necesită aplicarea cantității exacte de substanță și suplimentar studii densitometrice cu o înregistrare clară a intensității petelor. Cel mai comun este metoda semi-cantitativa . Se bazeaza pe comparație vizuală dimensiunea și intensitatea unei pete a unei componente cu caracteristicile corespunzătoare unei serii de pete din aceeași substanță de concentrații diferite ( soluții standard de referință ). Când se utilizează o probă în cantitate de 1-5 μg, această metodă simplă asigură o precizie de determinare a conținutului de componente de aproximativ 5-10%. Adesea, pentru a determina componentele dintr-o probă, este necesar să se efectueze pregătirea probei pentru a obține un amestec care conține compușii analizați. Pregătirea probei se bazează pe extragerea medicamentelor din probă cu solvenți organici ( n-hexan, eter de petrol, dietil eter, cloroform), purificarea extractului și cromatografia ulterioară în strat subțire de oxid de aluminiu sau silicagel.

Există mai multe opțiuni pentru TLC și HD, care diferă în mod alimentare cu solvent . În funcție de direcția de mișcare a fazei mobile, există:

A)cromatografia ascendentă - se toarnă faza mobilă pe fundul camerei de separare, hârtia (farfuria) se așează vertical;

b)cromatografia descendentă  faza mobilă este alimentată de sus și se deplasează în jos de-a lungul stratului absorbant al plăcii sau hârtiei;

V)cromatografia radiala  avans orizontal al frontului de solvent: faza mobilă este adusă în centrul discului (plăcii) de hârtie, unde se aplică amestecul de separat.

Cel mai comun este eluare ascendentă (cromatografie). Față eluent în timp ce se deplasează de jos în sus. Alegerea solventului (faza mobilă) este determinată de natura sorbantului și de proprietățile substanțelor care sunt separate.

Separarea cromatografică prin metodele BCh și TLC sunt efectuate în camera de separare cu un capac lipit. O măsură cantitativă a vitezei de transfer a unei substanțe atunci când se utilizează un anumit adsorbant și solvent este Valoarea R f (din engleza retenţie factor – coeficient de întârziere, acest parametru este analog timpului de retenție). Poziţie zone ale componentei cromatografiate stabilite după mărime coeficient R f , egal cu raportul dintre viteza de mișcare a zonei sale și viteza de mișcare a frontului de solvent. Magnitudinea R f este întotdeauna mai mică de unu și nu depinde de lungimea cromatogramei. După sumă R f sunt influențate de diverși factori. Astfel, la temperaturi scăzute, substanțele se mișcă mai încet; contaminarea cu solvent, neomogenitatea adsorbantului, ionii străini din soluția analizată pot modifica valoarea R f până la 10%. În sistemul ales, analiții trebuie să aibă valori diferite R f și distribuite pe toată lungimea cromatogramei. Este de dorit ca valorile R f a fost în intervalul 0,05-0,85.

În practică, valoarea R f calculată ca raport al distanței l străbătută de substanţă până la distanţă L trecut prin solvent:

R f = ll (6.1 )

De obicei, pentru calcul alegeți centru spot (Fig. 1). Magnitudinea R f depinde de mulți factori: tip hârtie de cromatografie (porozitatea sa, densitatea, grosimea, gradul de hidratare) și sorbent (mărimea granulelor, natura grupelor de la suprafață, grosimea stratului, umiditatea acestuia, natura substanței, compoziția fazei mobile), condiții experimentale (temperatura, timpul de cromatografie etc.). Dacă toți parametrii cromatografici sunt constanți, valoarea R f determinată numai de proprietățile individuale ale fiecărei componente.

Orez. 1. Determinarea valorilor pe cromatogramă Rf pentru componente AȘi ÎN,

gradul de separare a acestora Rs și numărul de plăci teoretice N .

Eficiența HD și TLC depinde și de selectivitate și sensibilitate reacţii utilizate pentru detectarea componentelor amestecului analizat. În mod obișnuit, se folosesc reactivi care formează compuși colorați - dezvoltatori - cu componentele fiind determinate. Pentru mai fiabil identificarea componentelor partajate aplica " martori » soluţii substanțe standard (în același solvent cu proba), a cărui prezență este de așteptat în eșantion. Substanță standard aplicat pe linia de plecare de lângă proba analizată și cromatografiat în aceleași condiții. În practică, o valoare relativă este adesea folosită:

R f rel = R f X / R f stand (6.2)

Unde R f stand calculată și folosind formula (6.1). Eficienţă separare cromatografică caracteriza numărul de plăci teoretice echivalente și ei înălţime . Astfel, în metoda TLC numărul de plăci teoretice echivalente N A pentru componentă A amestecul de separat se calculează folosind formula:

N A = 16 (l O.A. / A (A )) 2 (6.3)

Valori l O.A. Și A (A ) determinată așa cum se arată în fig. 6.1. Apoi înălțimea plăcii teoretice echivalente N A este:

H A = l O.A. /N = A (A ) 2 / 16 l O.A. . (6.4)

Separarea este practic posibilă dacă R f (A)  R f (ÎN)  0,1 .

Pentru a caracteriza separarea a două componente AȘi ÎN utilizare gradul (criteriul) de separare Rs :

Rs =  l/ (A (A) / 2 + A (B) / 2)= 2  l/ (A (A) + A (B)) (6.5)

Unde  l  distanța dintre centrele punctelor componente AȘi ÎN;

A (A) Și A (ÎN)  diametrele spotului AȘi ÎN pe cromatogramă (Fig. 6.1). Cu atât mai mult Rs , cu atât petele componente sunt mai clar separate AȘi ÎN pe cromatogramă. Condiții cromatografia selectat astfel încât valoarea Rs diferă de zero și unu, valoarea optimă Rs este 0,3  0,7. Pentru rata selectivitatea de separare două componente AȘi ÎN utilizare factor de separare α :

α = l B / l A (6.6)

Dacă α = 1, atunci componentele AȘi ÎN nu sunt separate.

9801 0

HPLC este o cromatografie pe coloană lichidă în care pot fi utilizate o varietate de mecanisme de sorbție. În esență, HPLC este o formă modernă de cromatografie clasică pe coloană lichidă. Unele dintre cele mai semnificative caracteristici de calitate ale HPLC sunt enumerate mai jos:
- viteza mare a procesului, care a făcut posibilă reducerea duratei de separare de la câteva ore și zile la minute;
- grad minim de estompare a zonelor cromatografice, ceea ce face posibilă separarea compușilor care diferă doar puțin în constantele de sorbție;
- un grad ridicat de mecanizare și automatizare a separării și procesării informațiilor, datorită căruia cromatografia lichidă pe coloană a atins un nou nivel de reproductibilitate și acuratețe.

Cercetările intense din ultimele decenii și o cantitate imensă de date experimentale acumulate permit astăzi să vorbim despre clasificarea variantelor în cadrul metodei cromatografiei lichide de înaltă performanță. Desigur, clasificarea după mecanismul de sorbție dat mai sus rămâne valabilă.

O clasificare comună se bazează pe polaritatea comparativă a fazelor mobile și staționare. În acest caz, se face o distincție între cromatografia în fază normală și cea inversă.

Cromatografia în fază normală (NPC) este o variantă a HPLC atunci când faza mobilă este mai puțin polară decât faza staționară și există motive de a crede că principalul factor care determină retenția este interacțiunea sorbaților direct cu suprafața sau volumul sorbantului.

Cromatografia în fază inversă (RPC) este o variantă a HPLC în care faza mobilă este mai polară decât faza staționară, iar retenția este determinată de contactul direct al moleculelor de sorbat cu suprafața sau volumul sorbantului; în acest caz, sorbații ionizați nu sunt schimbați cu ioni de fază mobilă absorbiți la suprafață.

Cromatografia cu schimb de ioni este o opțiune în care sorbția se realizează prin schimbul ionilor sorbiți ai fazei mobile cu ionii substanțelor care sunt cromatografiate; Cromatografia de schimb de ligand poate fi definită într-un mod complet analog.

Cromatografia pe adsorbanți modificați dinamic este o variantă a HPLC în care sorbatul nu interacționează direct cu suprafața sorbantului, ci intră în asociere cu moleculele straturilor de suprafață ale eluentului.
Cromatografia cu perechi de ioni este o variantă a cromatografiei în fază inversă a compușilor ionizați în care se adaugă un contraion hidrofob la faza mobilă, care modifică calitativ caracteristicile de sorbție ale sistemului.

Cromatografia de excludere a mărimii este o metodă de separare a compușilor după greutățile lor moleculare, bazată pe diferența în viteza de difuzie a moleculelor de diferite dimensiuni în porii fazei staționare.

Pentru HPLC, o caracteristică foarte importantă este dimensiunea absorbanților, de obicei 3-5 microni, acum până la 1,8 microni. Acest lucru permite ca amestecurile complexe de substanțe să fie separate rapid și complet (timp mediu de analiză de la 3 la 30 de minute).

Problema separării este rezolvată folosind o coloană cromatografică, care este un tub umplut cu un sorbant. La efectuarea unei analize, un lichid (eluent) cu o anumită compoziție este alimentat printr-o coloană cromatografică cu o viteză constantă. O doză de probă măsurată cu precizie este injectată în acest flux. Componentele unei probe introduse într-o coloană cromatografică, datorită afinităților diferite pentru sorbentul coloanei, se deplasează de-a lungul acesteia cu viteze diferite și ajung la detector secvenţial în momente diferite.

Astfel, coloana cromatografică este responsabilă de selectivitatea și eficiența separării componentelor. Prin selectarea diferitelor tipuri de coloane, se poate controla gradul de separare al analiților. Compușii sunt identificați după timpul lor de retenție. Determinarea cantitativă a fiecăreia dintre componente este calculată pe baza mărimii semnalului analitic măsurat cu ajutorul unui detector conectat la ieșirea coloanei cromatografice.

Sorbenți. Dezvoltarea HPLC este în mare parte asociată cu crearea de noi generații de adsorbanți cu proprietăți cinetice bune și proprietăți termodinamice diverse. Principalul material pentru absorbanții în HPLC este silicagel. Este puternic mecanic și are o porozitate semnificativă, ceea ce conferă o capacitate mare de schimb cu coloane de dimensiuni mici. Cea mai comună dimensiune a particulelor este de 5-10 microni. Cu cât este mai aproape de forma sferică a particulelor, cu atât rezistența la curgere este mai mică, cu atât eficiența este mai mare, mai ales dacă o fracțiune foarte îngustă este ecranată (de exemplu, 7 +1 microni).

Suprafața specifică a gelului de silice este de 10-600 m/g. Silicagelul poate fi modificat cu diferite grupări chimice grefate la suprafață (C-18, CN, NH2, SO3H), ceea ce permite utilizarea sorbanților pe baza acestuia pentru a separa o mare varietate de clase de compuși. Principalul dezavantaj al gelului de silice este rezistența chimică scăzută la pH< 2 и рН >9 (siliciul se dizolvă în alcalii și acizi). Prin urmare, în prezent există o căutare intensă de adsorbanți pe bază de polimeri stabili la pH de la 1 la 14, de exemplu, pe baza de metacrilat de polimetil, polistiren etc.

Sorbenți pentru cromatografie cu schimb de ioni. Datorită particularităților separării (în mediu acid sau alcalin), materialul principal este sorbant în polistiren cu divinilbenzen de diferite grade de reticulare cu SO3 -H+ (schimbătoare de cationi puternic acide) sau -COO-Naf (cation slab acid). schimbători), grupări -H2N+ (CH3) grefate pe suprafața lor 3Cl- (schimbătoare de anioni bazici puternici) sau -N+HR2Cl- (schimbătoare de anioni de bază slabe).

Absorbanți pentru cromatografia de permeație cu gel. Tipul principal este stirenul-DVB. De asemenea, se folosesc sticle macroporoase, metacrilat de metil și silicagel. Aceiași adsorbanți sunt utilizați pentru cromatografia de excludere ionică.
Pompe. Pentru a asigura debitul fazei mobile (MP) prin coloana cu parametrii specificați, se folosesc pompe de înaltă presiune. Cele mai importante caracteristici tehnice ale pompelor LC includ: intervalul de debit; presiune maximă de lucru; reproductibilitatea fluxului; intervalul de pulsații de alimentare cu solvent.

În funcție de natura alimentării cu solvent, pompele pot fi de alimentare (debit) și presiune constantă. Practic, în timpul lucrului analitic, se utilizează un mod de debit constant, iar la umplerea coloanelor, se utilizează un mod de presiune constantă. Pe baza principiului lor de funcționare, pompele sunt împărțite în pompe cu seringi și pompe cu piston alternativ.

Pompe cu seringi. Pompele de acest tip se caracterizează printr-o absență aproape completă a pulsațiilor în fluxul fazei mobile în timpul funcționării. Dezavantaje ale pompei: a) consum mare de timp si solvent pentru spalare la schimbarea solventului; b) suspendarea separării în timpul umplerii pompei; c) dimensiuni și greutate mari, asigurând în același timp debit și presiune ridicate (este nevoie de un motor puternic și de o forță mare a pistonului cu suprafața sa mare).

Pompe cu piston alternativ. Pompele de acest tip asigură o alimentare volumetrică constantă a fazei mobile pentru o perioadă lungă de timp. Presiune maximă de lucru 300-500 atm, debit 0,01-10 ml/min. Reproductibilitatea debitului volumic este de 0,5%. Principalul dezavantaj este că solventul este furnizat sistemului sub forma unei serii de impulsuri succesive, deci există pulsații de presiune și debit.

Acesta este motivul principal pentru zgomotul crescut și sensibilitatea redusă a aproape tuturor detectorilor utilizați în LC, în special a celor electrochimici. Modalități de combatere a pulsațiilor: folosind pompe duble sau o pompă Bag-Lai cu piston dublu, folosind dispozitive de amortizare și dispozitive electronice.

Cantitatea de alimentare volumetrică este determinată de trei parametri: diametrul pistonului (de obicei 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudinea acestuia (12-18 mm) și frecvența (care depinde de viteza de rotație a motorului și a cutiei de viteze).

Dozatoare. Scopul dozatorului este de a transfera o probă la presiunea atmosferică la intrarea unei coloane la o presiune de până la câteva atmosfere. Este important ca în dozator să nu existe volume „mort” care să nu poată fi spălate de faza mobilă și să nu existe erodare a probei în timpul dozării. La început, dozatoarele LC erau similare cu dozatoarele de gaz cu o perforare a membranei. Cu toate acestea, membranele nu rezistă la mai mult de 50-100 atm rezistența lor chimică este insuficientă;

Faza lichidă are o viteză de difuzie mult mai mică decât faza gazoasă. Prin urmare, puteți doza prin oprirea fluxului - proba nu are timp să se erodeze în dozator. În timp ce proba este introdusă în dozator, o supapă specială oprește fluxul de solvent. Presiunea la intrarea în coloană scade rapid după câteva secunde, proba poate fi injectată în camera dozatorului cu o microseringă convențională. Apoi, dozatorul este blocat, fluxul de solvent este pornit și are loc separarea.

Presiunea pe care o deține acest robinet este de până la 500-800 atm. Dar atunci când fluxul se oprește, echilibrul în coloană este perturbat, ceea ce poate duce la apariția unor vârfuri suplimentare „vacante”.

Dozatoarele cu buclă sunt cele mai utilizate. Când dozatorul este umplut, orificiile de admisie 1, 2 și canalul dintre ele sunt sub presiune ridicată. Intrările 3-6, canalele dintre ele și bucla de dozare sunt sub presiune atmosferică, ceea ce vă permite să umpleți bucla folosind o seringă sau o pompă. Când distribuitorul este rotit, fluxul fazei mobile deplasează proba în coloană. Pentru a reduce eroarea, bucla este spălată cu de 5-10 ori volumul probei. Dacă proba este mică, poate fi injectată în buclă cu o microseringă. Volumul buclei este de obicei 5-50 µl.

PE. Voinov, T.G. Volova

(în principal intermoleculară) la interfața de fază. Ca metodă de analiză, HPLC face parte dintr-un grup de metode care, datorită complexității obiectelor studiate, include separarea preliminară a amestecului complex original în unele relativ simple. Amestecuri simple rezultate sunt apoi analizate folosind metode fizico-chimice convenționale sau metode speciale dezvoltate pentru cromatografie.

Metoda HPLC este utilizată pe scară largă în domenii precum chimie, petrochimie, biologie, biotehnologie, medicină, industria alimentară, protecția mediului, producția farmaceutică și multe altele.

Conform mecanismului de separare a substanțelor analizate sau separate, HPLC se împarte în adsorbție, distribuție, schimb ionic, excludere, schimb ligand și altele.

Trebuie avut în vedere că în munca practică, separarea are loc adesea nu printr-unul, ci prin mai multe mecanisme simultan. Astfel, separarea prin excludere poate fi complicată de efectele de adsorbție, separarea prin adsorbție prin efecte de distribuție și invers. Mai mult, cu cât diferența dintre substanțele dintr-o probă este mai mare în ceea ce privește gradul de ionizare, bazicitate sau aciditate, greutate moleculară, polarizabilitate și alți parametri, cu atât este mai mare probabilitatea unui mecanism de separare diferit pentru astfel de substanțe.

HPLC în fază normală

Faza staționară este mai polară decât faza mobilă, prin urmare solventul nepolar predomină în eluant:

• Hexan: izopropanol = 95:5 (pentru substanțe cu polaritate scăzută)
• Cloroform:metanol = 95:5 (pentru substanțe cu polar mediu)
• Cloroform:metanol = 80:20 (pentru substanțe foarte polare)

HPLC cu fază inversă

Faza staționară este mai puțin polară decât faza mobilă, astfel încât eluentul conține aproape întotdeauna apă. În acest caz, este întotdeauna posibil să se asigure dizolvarea completă a BAS în faza mobilă, este aproape întotdeauna posibil să se utilizeze detecția UV, aproape toate fazele mobile sunt miscibile între ele, se poate folosi eluția cu gradient, coloana poate fi restabilită rapid. -echilibrata, coloana poate fi regenerata.

Eluanții comuni pentru HPLC cu fază inversă sunt:

• Acetonitril: apă
• Metanol: apă
• Izopropanol: apă

Matrici pentru HPLC

HPLC folosește compuși anorganici ca matrici, cum ar fi oxidul de siliciu (silicagel) sau alumina, sau polimeri organici, cum ar fi polistirenul (reticulat cu divinilbenzen) sau polimetacrilatul. Silicagelul este, desigur, acum general acceptat.

Principalele caracteristici ale matricei:

• Dimensiunea particulelor (µm);
• Dimensiunea porilor interni (Å, nm).

Prepararea gelului de silice pentru HPLC:

1. Turnarea microsferelor de acid polisilicic;
2. Uscarea particulelor de silicagel;
3. Separarea aerului.

Particule absorbante:

• Regular (sferic): rezistență la presiune mai mare, cost mai mare;
• Nesferic: rezistență la presiune mai mică.

Dimensiunea porilor în HPLC este unul dintre cei mai importanți parametri. Cu cât dimensiunea porilor este mai mică, cu atât permeabilitatea lor pentru moleculele de substanțe eluate este mai slabă. Și, prin urmare, cu atât capacitatea de sorbție a absorbanților este mai slabă. Cu cât porii sunt mai mari, cu atât este mai mică, în primul rând, stabilitatea mecanică a particulelor de sorbant și, în al doilea rând, cu cât suprafața de sorbție este mai mică, prin urmare, cu atât eficiența este mai slabă.

Vaccinări în fază staționară

HPLC în fază normală:

• Faza staționară cu altoire de propilnitril (nitril);
• Faza staționară cu grefare de propilamină (amină).

HPLC cu fază inversă:

• Faza staționară cu grefare cu alchil;
• Faza staționară cu grefare de alchilsilil.

End-capping este protecția zonelor negrefate ale sorbentului prin grefare suplimentară cu molecule „mici”. Capacul hidrofob (C1, C2): selectivitate mai mare, umectabilitate mai slabă; capsare hidrofilă (diol): selectivitate mai mică, umectabilitate mai mare.

Detectoare pentru HPLC

• UV
• Matricea diodelor
• Fluorescent
• Electrochimic
• Refractometric
• Selectiv în masă

Legături

Fundația Wikimedia. 2010.

Vedeți ce este „Cromatografie lichidă de înaltă performanță” în alte dicționare:

cromatografie lichidă de înaltă performanță- - [A.S. Goldberg. Dicționar energetic englez-rus. 2006] Subiecte: energie în general EN cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC... Ghidul tehnic al traducătorului

Termenul cromatografie lichidă de înaltă performanță Termenul în engleză cromatografie lichidă de înaltă performanță Sinonime Abrevieri HPLC, HPLC Termeni înrudiți adsorbție, oligopeptidă, proteomică, sorbent, fullerene, endoedral, cromatografie... ...

Cromatografia lichidă, în care, pentru a crește eficiența separării, solventul (eluentul) sub presiune (mai mult de 3x107 Pa) este pompat prin coloane umplute cu sorbant cu particule de diametru mic (până la 1 μm), iar filtrele de perfuzie sunt de asemenea folosit... ...

Un tip de cromatografie în care lichidul (eluentul) servește ca fază mobilă, iar cea staționară. sorbent, TV un purtător cu un lichid sau gel aplicat pe suprafața sa. Se efectuează într-o coloană umplută cu sorbent (cromatografie pe coloană) pe un plan... ... Științele naturii. Dicţionar enciclopedic

- [κρώμα (υrum) culoare] un proces bazat pe capacitatea inegală a componentelor individuale ale amestecului (lichid sau gazos) de a rămâne pe suprafața adsorbantului atât la absorbția lor din fluxul purtătorului, cât și atunci când ... ... Enciclopedie geologică

- (din altă greacă ... Wikipedia

Termenul cromatografie Termenul în engleză cromatografie Sinonime Abrevieri Termeni înrudiți cromatografie lichidă de înaltă performanță, clatrat, laborator pe cip, porometrie, proteom, proteomică, sorbent, enzimă, fuleren, endoedric... ... Dicţionar Enciclopedic de Nanotehnologie

Cromatografie lichidă pe bază de decomp. capacitatea ionilor separați de a face schimb de ioni cu fix. ionii de absorbție formați ca urmare a disocierii grupărilor ionogene ale acestuia din urmă. Schimbătoarele de cationi sunt folosite pentru a separa cationii, pentru... ... Enciclopedie chimică

HPLC- cromatografie lichidă de înaltă performanță… Dicționar de abrevieri rusești

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) este una dintre metodele eficiente de separare a amestecurilor complexe de substanțe, utilizată pe scară largă atât în ​​chimia analitică, cât și în tehnologia chimică. Baza separării cromatografice este participarea... Wikipedia

Cărți

• Cromatografie lichidă practică de înaltă performanță, Veronica R. Mayer. Prezentăm cititorului ediția a V-a a cărții, care a fost extinsă cu metode și echipamente moderne. S-au îmbunătățit multe în carte și au fost adăugate un număr mare de referințe. Acele locuri din text în care...