Chemische Zusammensetzung von Membranen. Membranen bestehen aus Lipid- und Proteinmolekülen, deren relative Mengen je nach Membran stark variieren. Kohlenhydrate sind in Form von Glykoproteinen, Glykolipiden enthalten und machen 0,5–10 % der Membransubstanzen aus. Nach dem fließenden Mosaik

Membranlipide. Membranlipide sind amphiphile Moleküle, d.h. Das Molekül enthält sowohl hydrophile Gruppen (Polköpfe) als auch aliphatische Radikale (hydrophobe Schwänze), die spontan eine Doppelschicht bilden, in der die Schwänze der Lipide einander zugewandt sind. Dicke

Proteine ​​Der Nährwert von Proteinen wird durch das Vorhandensein essentieller Aminosäuren gewährleistet, deren Kohlenwasserstoffgerüste im menschlichen Körper nicht synthetisiert werden können und daher mit der Nahrung zugeführt werden müssen. Sie sind auch die Hauptquellen für Stickstoff. Tagegeld

Muskelgewebeproteine ​​Es gibt drei Gruppen von Proteinen: 1. myofibrilläre Proteine ​​– 45 %;2. Sarkoplasmatische Proteine ​​– 35 %;3. Stromaproteine ​​– 20 %. Zu dieser Gruppe gehören: 1. Myosin 2. Aktin;3. Actomyosin; sowie sogenannte regulatorische Proteine: 4. Tropomyosin;5.

Einstufung

Membranproteine ​​können nach topologischen oder biochemischen Prinzipien klassifiziert werden. Die topologische Klassifizierung basiert auf der Lokalisierung des Proteins relativ zur Lipiddoppelschicht. Die biochemische Klassifizierung basiert auf der Stärke der Protein-Membran-Wechselwirkung.

Verschiedene Kategorien polytoper Proteine. Membranbindung aufgrund (1) einer einzelnen Transmembran-Alpha-Helix, (2) mehrerer Transmembran-Alpha-Helices, (3) einer Beta-Faltblatt-Struktur.

Verschiedene Kategorien integraler monotoper Proteine. Bindung an die Membran durch (1) eine amphipathische Alpha-Helix parallel zur Membranebene, (2) eine hydrophobe Schleife, (3) einen kovalent verknüpften Fettsäurerest, (4) elektrostatische Wechselwirkung (direkt oder durch Kalzium vermittelt). ).

Topologische Klassifizierung

Bezogen auf die Membran werden Membranproteine ​​in poly- und monotope unterteilt.

• Polytope oder Transmembranproteine dringen vollständig in die Membran ein und interagieren so mit beiden Seiten der Lipiddoppelschicht. Typischerweise ist das Transmembranfragment eines Proteins eine Alpha-Helix, die aus hydrophoben Aminosäuren besteht (möglicherweise aus 1 bis 20 solcher Fragmente). Nur in Bakterien sowie in Mitochondrien und Chloroplasten können Transmembranfragmente als Beta-Faltblattstruktur organisiert werden (von 8 bis 22 Windungen der Polypeptidkette).
• Integrale monotope Proteine dauerhaft in der Lipiddoppelschicht eingebettet, aber nur auf einer Seite mit der Membran verbunden, ohne die gegenüberliegende Seite zu durchdringen.

Biochemische Klassifizierung

Nach der biochemischen Klassifikation werden Membranproteine ​​​​eingeteilt in Integral Und peripher.

• Integrale Membranproteine fest in der Membran verankert und kann nur mit Hilfe von Detergenzien oder unpolaren Lösungsmitteln aus der Lipidumgebung entfernt werden. In Bezug auf die Lipiddoppelschicht können integrale Proteine ​​transmembranös polytop oder integral monotop sein.
• Periphere Membranproteine sind monotope Proteine. Sie sind entweder schwach an die Lipidmembran gebunden oder assoziieren aufgrund hydrophober, elektrostatischer oder anderer nichtkovalenter Kräfte mit integralen Proteinen. Daher dissoziieren sie im Gegensatz zu integralen Proteinen von der Membran, wenn sie mit einer geeigneten wässrigen Lösung (z. B. niedrigem oder hohem pH-Wert, hoher Salzkonzentration oder einem chaotropen Mittel) behandelt werden. Diese Dissoziation erfordert keine Membranzerstörung.

Membranproteine ​​können aufgrund von Fettsäure- oder Prenylresten oder Glykosylphosphatidylinositol, die während ihrer posttranslationalen Modifikation an das Protein gebunden werden, in die Membran integriert werden.

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2010.

: Eigenschaften und Strukturprinzipien

1. Struktur von Membranproteinen

Zu Beginn der Entwicklung der Membranologie glaubte man, dass Membranproteine ​​in ihrer Struktur recht homogen seien und in Form von drei Schichten auf der Oberfläche der Doppelschicht angeordnet seien. Jetzt neigen wir eher zu der Annahme, dass zumindest bei Transmembranproteinen die Teile von ihnen, die in die Membran eingetaucht sind, α-Helices enthalten. Natürlich würde ich zu diesem Thema sehr gerne eindeutige Schlussfolgerungen ziehen, aber diese müssen auf Fakten basieren. Angesichts der enormen strukturellen Vielfalt löslicher Proteine ​​kommt man zu dem Schluss, dass integrale Membranproteine ​​möglicherweise viel komplexer sind, als wir uns derzeit vorstellen. Die Klassifizierung löslicher Proteine ​​nach Strukturtyp erfolgte erst, nachdem die Strukturen von mehr als 100 verschiedenen Proteinen mit hoher Auflösung bestimmt wurden. Bei Transmembranproteinen gelang dies nur in einem Fall – beim Protein des photosynthetischen Reaktionszentrums von Bakterien. Zusammen mit niedrigaufgelösten Elektronenmikroskopiedaten zur Struktur von Bakteriorhodopsin ist dies die einzige Quelle, auf der Modelle für die meisten anderen Transmembranproteine ​​basieren können.

Ein weiterer wichtiger Punkt sind die Methoden zur Bindung von Proteinen an die Membran. Sie sind schematisch in Abb. dargestellt. 3.1.

1. Bindung mit Proteinen, die in die Doppelschicht eingetaucht sind. Beispiele hierfür sind der Fi-Teil der H + -ATPase, der an den in der Membran eingebetteten Fo-Teil bindet; Einige Zytoskelettproteine ​​können ebenfalls erwähnt werden.

2. Bindung an die Doppelschichtoberfläche. Diese Wechselwirkung ist hauptsächlich elektrostatischer oder hydrophober Natur. Auf der Oberfläche einiger Membranproteine ​​bilden sich aufgrund von Merkmalen der Sekundär- oder Tertiärstruktur hydrophobe Domänen. Diese Oberflächenwechselwirkungen können zusätzlich zu anderen Wechselwirkungen, wie beispielsweise der Transmembranverankerung, genutzt werden.

3. Bindung mit einem hydrophoben „Anker“; Diese Struktur zeigt sich üblicherweise als Folge unpolarer Aminosäurereste. Einige Membranproteine ​​nutzen kovalent gebundene Fettsäuren oder Phospholipide als Anker.

4. Transmembranproteine. Manche von ihnen passieren die Membran nur einmal, andere mehrmals.

Die Unterschiede zwischen den Proteinen der äußeren und inneren Membran bestimmen nicht eindeutig die Art ihrer Bindung an die Doppelschicht; Diese Unterschiede bestimmen nur die relative Stärke ihrer Bindung.

2. Reinigung von Membranproteinen

Um integrale Membranproteine ​​zu reinigen und in eine biochemisch aktive Form zu bringen, sind Detergenzien erforderlich, die die Proteine ​​solubilisieren und in Lösung halten. Der damit verbundene Waschmittelbedarf und die Handhabung stellen zusätzliche Herausforderungen dar, die über die typischen Herausforderungen bei der Proteinreinigung hinausgehen. Für die Isolierung integraler Membranproteine ​​wurden viele spezifische Methoden entwickelt, die meisten Reinigungsschemata basieren jedoch auf denselben chromatographischen und hydrodynamischen Techniken, die auch für lösliche Proteine ​​verwendet werden. Dabei handelt es sich um Chromatographie auf DEAE-Cellulose, Sepharose oder Hydroxylpatit, Gelfiltration, Zentrifugation im Saccharose-Dichtegradienten usw. Die richtige Wahl des Detergens ist sehr wichtig, da es das Detergens ist, das die Biomembran zerstört und die Lipide ersetzt Es umgibt ein bestimmtes Protein und bestimmt die Stabilität des Proteins in Lösung. Die Wirkmechanismen von Detergenzien werden in der Übersicht besprochen.

2.1. Waschmittel

In den letzten zwei Jahrzehnten ist eine große Anzahl von Detergenzien verfügbar geworden, die für die Reinigung integraler Membranproteine ​​geeignet sind. Grundsätzlich sollte man versuchen, ein Detergens zu finden, das die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Membranproteinen nicht zerstört, sondern nur die meisten oder alle Membranlipide ersetzt, die mit den hydrophoben Bereichen des Proteinmoleküls in Kontakt stehen. Das ultimative Ziel der Solubilisierung besteht darin, das Protein in eine Waschmittelmicelle einzubauen; Die anschließende Reinigungsstrategie besteht darin, solche Protein-Detergens-Komplexe abzutrennen.

Das erste Problem ist die Auswahl optimaler Bedingungen für die Solubilisierung des untersuchten Proteins. Proteindenaturierende Reinigungsmittel sind für diese heikle Aufgabe nicht geeignet. Andererseits zerstören viele Reinigungsmittel Membranen nicht wirksam und bilden proteinhaltige Mischmizellen. Solche Detergenzien können entweder zu hydrophob oder zu hydrophil sein, um sich effektiv mit Membranlipiden zu vermischen und, wenn ihre Konzentration hoch genug ist, die Doppelschicht in kugelförmige gemischte Mizellen umzuwandeln. Zunächst hoffte man, dass die Wahl des benötigten Waschmittels anhand eines einzigen Parameters namens Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht systematisiert werden könnte. Dieser Parameter variiert zwischen 1 und 20 und wird bei der Herstellung von Tensiden als Maß für die relative Hydrophobie verwendet. Tatsächlich wurden einige Korrelationen ermittelt, aus denen hervorgeht, dass der HLB-Wert eines Waschmittels zur Vorhersage seines Verhaltens in biologischen Systemen verwendet werden kann. Generell kann man sagen, dass Detergenzien mit einem HLB-Wert im Bereich von 12,5 bis 14,5 die wirksamsten Lösungsmittel für integrale Membranproteine ​​sind. Allerdings wurde später klar, dass die Suche nach optimalen Detergenzien für ein bestimmtes Membranprotein die Berücksichtigung vieler Faktoren erfordert und immer von empirischen Tests begleitet werden sollte. Folgendes muss berücksichtigt werden.

1. Maximale Solubilisierung des untersuchten Proteins. Das Kriterium ist der Proteintransfer in den Überstand nach der Zentrifugation, bei dem die Membran sedimentiert.

2.Solubilisierung von Protein in der gewünschten Form. Normalerweise geht es um die Erhaltung seiner enzymatischen Aktivität, aber manchmal werden auch bestimmte spektrale Eigenschaften oder das Vorhandensein spezifischer Proteinassoziierte verwendet. Darüber hinaus ist die Stabilität des Proteins nach der Solubilisierung eine Voraussetzung. In einigen Fällen werden dem Detergens exogene Phospholipide zugesetzt, um die biochemische Aktivität aufrechtzuerhalten. Ein Beispiel ist die Produktion von E. coli-Laktosepermease und Natriumkanalprotein. Manchmal wird Glycerin oder ein anderes Polyol hinzugefügt, um das Protein nach der Solubilisierung zu stabilisieren. Es ist sinnvoll, auch Proteaseinhibitoren einzusetzen und die Solubilisierung unter Bedingungen durchzuführen, die die Wahrscheinlichkeit ihres proteolytischen Abbaus minimieren.

3. Möglichkeit der Verwendung von Reinigungsmitteln bei dieser Technik. Zunächst müssen die Ladung des Waschmittels, das Verhalten bei einem bestimmten pH-Wert, die CMC und die Größe der Waschmittelmizellen berücksichtigt werden. Die letztgenannten Eigenschaften sind besonders wichtig. Detergenzien mit niedrigem CMC-Gehalt, die große Mizellen bilden, werden nicht durch Dialyse oder Ultrafiltration entfernt, da die Konzentration der Detergensmonomere zu niedrig ist. In der Praxis bedeutet dies, dass bei der Proteinkonzentration durch Ultrafiltration auch die Konzentration des Detergens mit niedrigem CMC-Gehalt ansteigt, was zur Denaturierung des Proteins führen kann. Aus diesem Grund bevorzugen viele Forscher die Verwendung von Detergenzien mit hohem CMC-Gehalt wie Octylglucosid, Gallensalzen oder moderneren zwitterionischen Detergenzien. Polystyrolharze wie Biobidz SM-2 sind sehr wertvoll. Sie binden selektiv an Reinigungsmittel wie Triton X-100, entfernen diese aus der Lösung und ermöglichen den gänzlichen Verzicht auf eine Dialyse. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Lichtaufnahme des Reinigungsmittels. Einige Reinigungsmittel wie Triton X-100 absorbieren im nahen UV-Bereich, sodass die Proteinkonzentration nicht durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt werden kann.

Unter Berücksichtigung all dieser Faktoren wird deutlich, warum bei der Isolierung integraler Membranproteine ​​in vielen Fällen der Einsatz unterschiedlicher Detergenzien erforderlich ist. Beispielsweise kann Triton X-100 zur Solubilisierung verwendet werden, die Trennung mit DEAE-Cellulose erfolgt jedoch am besten in Gegenwart von Octylglucosid. Detergenzien können im Chromatographiestadium, während der Dichtegradientenzentrifugation und in einigen Fällen durch Dialyse gewechselt werden. Es ist zu bedenken, dass ein Reinigungsmittel, das für die Solubilisierung eines bestimmten Proteins ungeeignet ist, das Protein nach einem Reinigungsmittelwechsel sehr wirksam in Lösung halten kann. Die Reinigung sollte fast immer mit einem Überschuss an gelöstem Detergens durchgeführt werden, da sich sonst das Gleichgewicht in Richtung Aggregation von Membranproteinen und nicht in Richtung der Bildung von Protein-Detergens-Komplexen verschiebt. In einigen Fällen kann eine solche Aggregation sogar wünschenswert sein und der letzte Reinigungsschritt kann die Entfernung des Detergens sein. Bei einem Mangel an Waschmittel kommt es jedoch in der Regel zu irreversiblen Ausfällungen und Proteinverlusten.

Die Notwendigkeit, die Detergenskonzentration auf einem bestimmten Niveau zu halten, führt zu zusätzlichen Schwierigkeiten, die über die typischen Probleme bei der Proteinreinigung hinausgehen. Über einige davon haben wir bereits gesprochen. Auch bei der Verwendung der Standard-Aussalzmethode bei hohen Ammoniumsulfatkonzentrationen treten Probleme auf: In vielen Fällen wird das Protein in Kombination mit dem Detergens und Lipid ausgefällt. Da die Salzlösung eine hohe Dichte aufweist und das Detergens im Aggregat relativ gering ist, bleibt der Niederschlag während der Zentrifugation an der Oberfläche. Es ist wichtig zu bedenken, dass Protein-Detergens-Komplexe einer Reinigung unterliegen, häufig mit einer erheblichen Menge an gebundenem Phospholipid. Dies beeinflusst die Qualität der Trennung während der Chromatographie sowie die Ergebnisse der Charakterisierung der endgültigen prolöslichen Proteine. Es ist notwendig, die Anzahl und das Molekulargewicht der Polypeptid-Untereinheiten, ihre Stöchiometrie, Größe und möglicherweise die Form zu bestimmen Molekül sowie ggf. biochemische Aktivität.

3. EIGENSCHAFTEN VON GEREINIGTEN INTEGRALEN MEMBRANPROTEINEN

Die Charakterisierung gereinigter Membranproteine, selbst der einfachsten, kann eine Herausforderung sein. Wie im Fall

3.1 Molekulargewicht der Untereinheiten

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat ist eine gängige Technik, bei integralen Membranproteinen wirft sie jedoch besondere Probleme auf. Bei dieser Methode wird Dodecylsulfat an Polypeptidketten gekoppelt und Protein-DNS-Komplexe in einem Polyacrylamidgel anhand ihrer Stokes-Radien getrennt, die in den meisten Fällen vom Molekulargewicht abhängen. Die Molekularmasse wird durch Vergleich der elektrophoretischen Mobilität eines bestimmten Komplexes und eines bekannten Standards bestimmt. Allerdings kann sich die Bindung von SDS an ein unbekanntes Protein qualitativ von der Bindung an Standards unterscheiden und dann ein falsches Ergebnis erhalten. Eine ähnliche Situation wird bei integralen Membranproteinen mit einem hohen Gehalt an unpolaren Aminosäureresten beobachtet. SDS bildet Komplexe mit den meisten löslichen Proteinen in einem Verhältnis von 1,4 g SDS pro 1 g Protein, und mehr Detergens kann an Proteine ​​binden, die einen hohen Prozentsatz an unpolaren Resten enthalten. Die dabei entstehende zusätzliche negative Ladung führt zu einem abnormalen Anstieg der elektrophoretischen Mobilität und das ermittelte Molekulargewicht fällt geringer aus, als es tatsächlich ist. Eine andere Situation ist auch möglich. Das Membranprotein, das an SDS bindet, wird möglicherweise nicht vollständig entfaltet, was aufgrund der Bildung eines kompakteren Protein-SDS-Komplexes auch zu einem abnormalen Anstieg der elektrophoretischen Mobilität führt. Alle diese Effekte sind ziemlich bedeutsam. Beispielsweise hat Laktosepermease eine scheinbare Molzahl. Masse 33.000, gemessen durch PAGE in Gegenwart von SDS; in der Realität, wie die Ergebnisse der Genanalyse zeigen, sagt sie. Die Masse beträgt 46.000. In vielen Fällen ist es möglich, das Molekulargewicht genauer abzuschätzen, indem man ein Ferguson-Diagramm erstellt, das die Abhängigkeit der elektrophoretischen Mobilität vom Acrylamidgehalt sowohl für Standardproteine ​​als auch für das untersuchte Protein darstellt. Dieser Graph hängt vom Stokes-Radius und in geringerem Maße von der Ladung des Komplexes ab. Beispielsweise weist nach den Ergebnissen der Elektrophorese in einem 12 %igen Acrylamidgel eine der Untereinheiten des Cytochrom-O-Komplexes von E. coli ein scheinbares Molekulargewicht auf. Masse 28.000, und aus dem Ferguson-Graphen beträgt der Wert 43.000, was mit der Molmenge übereinstimmt. Masse berechnet aus Sequenzierungsdaten der entsprechenden DNA.

Ein weiteres Problem ist das mögliche Vorhandensein einer Quartärstruktur. Einige Membranproteine ​​aggregieren auch in Gegenwart von SDS. Beispielsweise werden Glycophorin A oder das Hüllprotein des Bakteriophagen M13 bei der Elektrophorese in Polyacrylamidgelen mit SDS hauptsächlich in Form von Dimeren gefunden. Manchmal wird die Aggregation durch Erhitzen der Protein-SDS-Mischung weiter verstärkt. Dieses Bild wird beispielsweise für Untereinheiten sowohl der mitochondrialen als auch der bakteriellen terminalen Oxidasen beobachtet. Um die Fähigkeit eines Proteins zur irreversiblen Aggregation zu beurteilen, sollte eine vergleichende Analyse der Ergebnisse der Elektrophorese im Polyacrylamidgel mit SDS für erhitzte und nicht erhitzte Proben durchgeführt werden. Ein ähnliches Problem entsteht manchmal aufgrund der Anwesenheit von Detergens, das bei der Membranproteinreinigung verwendet wird. Dieses Detergens muss entfernt und durch SDS ersetzt werden, da in manchen Fällen eine deutliche Abhängigkeit der elektrophoretischen Mobilität von der Anwesenheit des Detergens besteht, mit dem das Enzym gelöst wurde.

Daher gibt es Grund zu der Annahme, dass die mittels SDS-PAGE bestimmte Bestimmung des Molekulargewichts der Untereinheiten hochgradig unpolarer integraler Membranproteine ​​​​falsch sein könnte. Leider gibt es keine einfache Alternative zu dieser Methode und der korrekte Wert wird häufig entweder aus vollständigen Primärsequenzdaten oder aus einer genauen hydrodynamischen Analyse ermittelt.

3.2 BESTIMMUNG DES MOLEKULÄREN GEWICHTS VON NATÜRLICHEM PROTEIN MITTELS HYDRODYNAMISCHER METHODEN

Die Anwendung dieser Methoden auf Membranproteine ​​kann aufgrund der Detergensbindung mit Schwierigkeiten verbunden sein. Um dies vollständig zu verstehen, betrachten wir zunächst ein einfaches lösliches Protein, für das das Mol gilt. Mithilfe von SDS-PAGE lässt sich die Masse der Untereinheiten bestimmen und es muss herausgefunden werden, um was es sich in seiner nichtdenaturierten, aktiven Form handelt – ein Monomer, Dimer oder Oligomer höherer Ordnung. Die Gelfiltration, die einen Vergleich mit Standardproteinen beinhaltet, wird häufig zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen eingesetzt; Hier entstehen Probleme aufgrund der Tatsache, dass alle Standardproteine ​​​​eine kugelförmige Form haben und das untersuchte Protein möglicherweise nicht kugelförmig, sondern leicht verlängert ist. Ein solches Protein mit Mol. mit einem Gewicht von 50.000 kann mit einer Geschwindigkeit eluieren, die Mol entspricht. Mai

se 100 LLC. In diesem Zusammenhang muss die Gelfiltrationssäule entsprechend dem Stokes-Radius, also den Abmessungen der „äquivalenten hydrodynamischen Kugel“, kalibriert werden und zusätzlich muss parallel eine andere Methode verwendet werden. Typischerweise werden die Sedimentationsraten entweder mittels analytischer Ultrazentrifugation oder Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gemessen. Der Sedimentationskoeffizient ist gleich

wobei m das Molekulargewicht des Proteins ist,

v ist sein spezifisches Teilvolumen, ij ist die Viskosität der Lösung, b ist die Dichte der Lösung.

Da e und H bekannt sind, kann aRc mittels Gelfiltration bestimmt werden, es bleiben nur zwei unbekannte Größen übrig – v und m. Für wasserlösliche Proteine ​​kann v auf der Grundlage der Aminosäurezusammensetzung berechnet oder direkt gemessen oder einfach gleichgesetzt werden 0,72–0,75 ml/g. Durch Messung von S 0 können wir also m finden.

Betrachten wir nun die Situation mit einem Membranprotein. Hier treten zusätzliche Probleme auf, da es sich bei dem hydrodynamischen Partikel um einen Protein-Detergens-Komplex handelt. Daher sind m und v in diesem Fall das Molekulargewicht und das spezifische Volumen des Komplexes, M k und K,. Leider kann K nicht beurteilt werden, ohne etwas über die Zusammensetzung des Komplexes zu wissen. In diesem Fall werden zwei Methoden verwendet, um die Molekülmasse des Proteins zu ermitteln.

1. Messen Sie direkt die Menge an gebundenem Waschmittel pro 1 g Protein. Zu diesem Zweck werden spektrale Methoden oder radioaktiv markierte Detergenzien verwendet, und zur Isolierung von Komplexen werden verschiedene Methoden wie die Gelfiltration eingesetzt. Nachdem der relative Gehalt an Protein und Detergens im Komplex ermittelt wurde, wird der K-Wert als gewichteter Durchschnitt der entsprechenden Werte für reines Protein und reines Detergens ermittelt. Danach lässt sich m leicht ermitteln, und da das Verhältnis zwischen dem Protein und dem Detergens im Komplex bekannt ist, lässt sich das Molekulargewicht des Proteins ermitteln.

2. S0 wird in Medien mit unterschiedlichen Lösungsdichten d gemessen. Solche Medien werden normalerweise mit Mischungen aus HgO und D2O hergestellt. Aus der Grafik von S° über q werden sowohl L/„ als auch v t ermittelt. Es wird angenommen, dass K der gewichtete Durchschnitt der entsprechenden Werte für reines Protein und reines Waschmittel ist.

Durch Auswertung von Kvelo* und Entnahme des Waschmittels aus den Tabellen erhält man das Molekulargewicht der Proteinkomponente m.

Um die Abhängigkeit von 5° von q darzustellen, wird eine analytische Zentrifugation durchgeführt. Die Zentrifugation kann auch im Saccharose-Dichtegradienten mit Mischungen aus H2O und D2O durchgeführt werden, allerdings ist die Auswertung der Ergebnisse in diesem Fall deutlich aufwendiger, unterscheidet sich jedoch nicht grundsätzlich vom vorherigen Fall.

Eine alternative Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts der nativen Form eines Membranproteins ist die Gleichgewichts-Ultrazentrifugation. Die Verteilung einer Substanz im Gleichgewicht ist so, dass die Steigung des Diagramms des Logarithmus der Konzentration gegenüber r 2 gleich ist

Dabei ist r der Abstand von der Mitte des Rotors zu einem bestimmten Punkt im Zentrifugenröhrchen und W die Rotationsfrequenz.

Wenn der Wert von Y bekannt oder leicht abzuschätzen ist, wie es bei den meisten löslichen Proteinen der Fall ist, lässt sich dieses Problem ganz einfach lösen. Was Membranproteine ​​betrifft, in diesem Fall die

Tabelle 3. Bindung von Detergenzien an einige Membranproteine

ein Klon der angegebenen geraden Linie bei verschiedenen q-Werten, erhalten durch Mischen von HgO und D2O. Wie zuvor werden Mk und K gleichzeitig gefunden und dann das Molekulargewicht des Proteins bestimmt.

Ist eine dritte Komponente im Komplex vorhanden, entstehen zusätzliche Probleme. In jedem Fall sind alle beschriebenen Verfahren sehr komplex und können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Die Menge an Detergens, die mit gereinigten integralen Membranproteinen verbunden ist, kann ziemlich groß sein – von 0,3 bis 1,5 Gewichtsprozent des Proteins, und selbst kleine Fehler bei diesem Wert führen zu einer erheblichen Verzerrung des Molekulargewichts des Proteins. In der Tabelle Tabelle 3.3 enthält Daten zur Menge an Detergenzien, die in einigen Proteinpräparaten enthalten sind. Beachten Sie, dass sich lösliche Proteine ​​nicht an diese Reinigungsmittel binden; Dies deutet erneut darauf hin, dass es der unpolare Teil des Proteins ist, der normalerweise mit Membranlipiden in Kontakt steht, der für die Bindung an das Detergens verantwortlich ist.

3.3 STRAHLUNGSINAKTIVIERUNGSMETHODE

Die Methode der Strahleninaktivierung zur Bestimmung der Zielgröße wird zunehmend bei der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Es können sowohl gereinigte Proteine ​​als auch Rohpräparate, einschließlich intakter Biomembranen, untersucht werden. Der Kern der Methode besteht darin, den Anteil der Proteinmoleküle zu bestimmen, die durch Strahlung geschädigt werden. Zu diesem Zweck werden enzymatische Methoden zur Bindung von Hormonen oder anderen Liganden oder spektrale Methoden eingesetzt. Das Verfahren ist wie folgt. Die meist gefrorene Probe wird energiereicher Strahlung ausgesetzt. In unterschiedlichen Zeitabständen werden Proben entnommen, aufgetaut und Messungen durchgeführt. Eine Schädigung eines Proteins unter Strahlungseinfluss wird beispielsweise mittels SDS-PAGE nachgewiesen. Die Erfahrung zeigt, dass einige Untereinheiten ihre biologische Aktivität vollständig verlieren, wenn an irgendeiner Stelle der Polypeptidkette Strahlenschäden auftreten. Der entscheidende Punkt ist, dass die Wahrscheinlichkeit einer Schädigung und damit die Wahrscheinlichkeit einer Inaktivierung umso größer ist, je größer das Proteinmolekül ist. Diese Wahrscheinlichkeit hängt nicht von der Form des Moleküls ab, sondern von seiner Masse. Typischerweise wird parallel ein Protein mit bekanntem Molekulargewicht bestrahlt, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. Wenn das untersuchte Protein mehr als eine Untereinheit enthält, treten bei der Analyse der Ergebnisse gewisse Schwierigkeiten auf. Die Schädigung einer Untereinheit geht nicht zwangsläufig mit dem Aufbrechen kovalenter Bindungen in anderen Untereinheiten einher. Daher können für Enzyme, die aus verschiedenen Untereinheiten mit unterschiedlichen Aktivitäten bestehen, je nach Methode zur Bestimmung des Inaktivierungsgrads unterschiedliche Zielgrößen erhalten werden.

Ein bemerkenswertes Merkmal der Methode ist, dass sie zur Untersuchung integraler Membranproteine ​​in situ verwendet werden kann. Die hierbei auftretenden Artefakte und Probleme werden in der Arbeit thematisiert. Ein offensichtliches Problem ist die Notwendigkeit, energiereiche Strahlung einzusetzen. Dabei müssen die meisten Arbeiten in Zusammenarbeit mit Laboren durchgeführt werden, die über entsprechende Quellen verfügen und spezielle Analysemethoden beherrschen.

3.4 SPEKTRALE METHODEN UND SEKUNDÄRSTRUKTUR

Zur Bestimmung des Gehalts an α-Helices und β-Faltblättern in Membranproteinen werden verschiedene Methoden eingesetzt. In Ermangelung einer dreidimensionalen Organisation kann man versuchen, entsprechende Modelle darauf aufzubauen. Die am häufigsten verwendete Methode ist der Zirkulardichroismus. Zunehmend werden Infrarot- und Raman-Spektroskopie sowie NMR eingesetzt.

1. Die Zirkulardichroismus-Methode basiert auf der Messung des Absorptionsunterschieds von links- und rechtspolarisiertem Licht; Diese optische Aktivität ist ein Maß für die Chiralität von Molekülen oder ein Maß für ihre Asymmetrie. Im fernen Ultraviolettbereich wird CD hauptsächlich durch die Absorption von Amiden von Carbonylgruppen des Polypeptidrückgrats bestimmt. Bei Vorhandensein von Bereichen mit Sekundärstruktur, beispielsweise α-Helices, weist das CD-Spektrum sehr spezifische Merkmale auf, die mit den Eigenschaften der elektronischen Umgebung der Amidogruppen in diesen Strukturen zusammenhängen. Bei der Analyse des CD-Spektrums von Proteinen wird es normalerweise als Summe von Komponenten dargestellt, die der Absorption verschiedener Teile des Proteinmoleküls entsprechen: α-Helices, β-Schichten und Random Coils. Nachdem die Spektren jeder dieser Strukturen auf die eine oder andere Weise bestimmt wurden, werden sie zusammengefasst und die entsprechenden Koeffizienten so ausgewählt, dass die beste Übereinstimmung mit dem gemessenen Spektrum erreicht wird. Die ausgewählten Gewichtungskoeffizienten stellen den Anteil dar, der im Molekül für jede Art von Sekundärstruktur anfällt.

Diese Methoden wurden für lösliche Proteine ​​entwickelt, es besteht jedoch kein Grund, daran zu zweifeln, dass sie erfolgreich auf Membranproteine ​​angewendet werden können. Letztere verfügen höchstwahrscheinlich über Regionen mit der gleichen Art von Sekundärstruktur wie lösliche Proteine, und bei ihrer Untersuchung werden die gleichen Schwierigkeiten auftreten. Einige Proteine ​​können in situ mithilfe von Membransuspensionen untersucht werden. Beispiele hierfür sind Bakteriorhodopsin aus der Purpurmembran von Halobacteriumhalobium und Ca 2 + -ATPase aus der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums. Gereinigte Membranproteine ​​können mit CD und in Gegenwart von Detergenzien untersucht werden, wenn deren Absorption im fernen UV-Bereich nicht zu hoch ist, oder in der Zusammensetzung rekonstruierter Vesikel. Hier treten zwei Probleme auf: 1) differenzielle Lichtstreuung, wenn die Größe der Membranpartikel viel größer ist als die Wellenlänge des Lichts; 2) Ausgleich der Absorption aufgrund der Konzentration des Proteins in Membranen oder Vesikeln, d. h. aufgrund der Inhomogenität seiner Verteilung in Lösung. Diese Artefakte können sehr erheblich sein, können aber mit geeigneten Methoden berücksichtigt werden.

Leider sind für intrinsische Membranproteine ​​keine hochauflösenden Strukturdaten verfügbar, sodass eine genaue Interpretation der CD-Spektren nicht möglich ist. Mit wenigen Ausnahmen wurden keine unterschiedlichen Spektralmethoden zur Untersuchung desselben Proteins verwendet und es wurde kein quantitativer Vergleich der Ergebnisse durchgeführt. Interessant ist, dass für Bakteriorhodopsin, das mit CD-, IR- und NMR-Methoden untersucht wurde, in allen drei Fällen die gleichen Ergebnisse erzielt wurden, was auf einen signifikanten Gehalt an 3-Schichten in diesem Protein hinweist. Allerdings weist jede Methode erhebliche Nachteile auf. Daher hängen Daten über den hohen Gehalt an D-Schichten in Bakteriorhodopsin weitgehend von der Methode zur Berücksichtigung optischer Artefakte ab. Den elektronenmikroskopischen Rekonstruktionsdaten zufolge, die sich durch eine relativ geringe Auflösung auszeichnen, besteht Bakteriorhodopsin zu 80 % aus α-Helices und 0-Schichten fehlen vollständig. Um den Grund für diese Diskrepanzen zu verstehen, ist es notwendig, eine Strukturanalyse des Proteins mit atomarer Auflösung durchzuführen. Es gibt zwei weitere membrandurchspannende Proteine ​​mit hoher Häufigkeit und Staphylococcus aureus a-Toxin. Beide Proteine ​​sind an der Bildung von Poren in der Doppelschicht beteiligt.

2. Infrarotspektroskopie und Raman-Spektroskopie. Diese Methoden liefern nicht nur Informationen über die Konformation von Membranlipiden, sondern können auch zur Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen eingesetzt werden. Das Schwingungsspektrum des Polypeptidrückgrats hängt von der Art der Sekundärstruktur ab und gibt Aufschluss über den Gehalt an a- und /3-Strukturen im Molekül. Mit diesen Methoden können luftgetrocknete Filme, wässrige Membransuspensionen sowie gereinigte Proteine ​​sowohl in Gegenwart eines Detergens als auch als Teil rekonstruierter Vesikel untersucht werden. Laut Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie besteht der Ca 2+ -ATPase-Komplex in der Membran beispielsweise hauptsächlich aus α-helikalen Regionen und Regionen mit einer statistischen Knäuelkonformation, und das hydrophobe Protein Myelin in den rekonstruierten Vesikeln weist sowohl α- als auch / 3 Grundstücke.

3. Mit der NMR-Spektroskopie können auch Membranproteine ​​untersucht werden. Allerdings sind die Möglichkeiten der Methode in diesem Fall begrenzt, was vor allem auf die relativ langsamen Bewegungen integraler Membranproteine ​​in situ und in Komplexen mit Detergens zurückzuführen ist. Daher ist eine so leistungsstarke Methode wie die zweidimensionale NMR, die ein detailliertes Bild des Konformationszustands relativ kleiner Proteine ​​in Lösung liefern kann, noch nicht für die Untersuchung von Membranproteinen geeignet. Die NMR-Methode fester Proben ist akzeptabler. Die 2H- und 3C-NMR-Methoden haben ein großes Potenzial, obwohl sie bisher noch nicht sehr weit verbreitet sind. Es wurden Daten zur durchschnittlichen Konformation des Kerns und zur Dynamik der Seitenketten erhalten. Es ist zu beachten, dass Festkörper-NMR-Methoden nicht nur nicht weit verbreitet sind, sondern in den meisten Fällen auch nicht angewendet werden können. In den seltenen Situationen, in denen ihr Einsatz möglich ist, sind sie jedoch sehr wertvoll.

3.5 ENZYMAKTIVITÄT

Eine der wichtigsten Methoden zur Charakterisierung gereinigter Membranproteine ​​ist zweifellos die Bestimmung der biochemischen Aktivität. Dabei kommen grundsätzlich die gleichen Kriterien wie bei löslichen Proteinen zur Anwendung, es können jedoch eigene Schwierigkeiten auftreten. Der erste Grund liegt darin, dass die biochemische Aktivität von Membranproteinen häufig stark von der Bindung von Lipiden und Detergenzien an das Protein abhängt. Der Aktivitätsverlust kann entweder reversibel oder irreversibel sein. Es ist ratsam, die spezifische Aktivität des untersuchten Proteins in vivo oder als Teil von Membranen vor der Solubilisierung abzuschätzen. Überschüssiges Waschmittel kann eine hemmende Wirkung haben, indem es beispielsweise unpolare Substrate in der Mizellenpopulation verdünnt und die enzymatische Aktivität verringert. Bei der Messung der Aktivität eines Membranproteins muss berücksichtigt werden, dass es in situ von Lipiden umgeben ist, die eine optimale Aktivität gewährleisten. Das zweite Problem betrifft Proteine ​​mit „Transbilayer“-Aktivität; Beispiele hierfür sind kanalbildende Proteine ​​und Transportproteine. In diesen Fällen muss die Bewegung gelöster Stoffe von einem Kompartiment in ein anderes berücksichtigt werden.

3.6 Quartärstruktur und chemische Quervernetzung

Viele Membranenzyme sind Komplexe, die aus mehreren Untereinheiten bestehen. Beispiele hierfür sind H + -ATPase, Na + /K + -ATPase, mitochondriale Elektronentransportkomplexe und photosynthetische Reaktionszentren. Einige integrale Membranproteine ​​sind durch nichtkovalente Wechselwirkungen eng mit löslichen Proteinen verbunden. In E. coli bildet die Fo-Komponente, die laut SDS-PAGE-Elektrophorese drei Arten von Untereinheiten enthält, einen Protonenkanal, der aus fünf Arten von Untereinheiten besteht und ein aktives Zentrum enthält, das an der Hydrolyse von ATP beteiligt ist. Bei solchen Proteinen ist es sehr wichtig, die Art der Untereinheiten, die Stöchiometrie des Komplexes und die unmittelbaren Wechselwirkungen seiner Komponenten zu bestimmen. Dies ist eine sehr schwierige Aufgabe, selbst wenn der Proteinkomplex bereits isoliert ist. Die hier auftretenden Probleme unterscheiden sich im Wesentlichen nicht von denen bei löslichen Proteinkomplexen, es treten jedoch zusätzliche Schwierigkeiten auf.

Zunächst ist zu bedenken, dass die Wechselwirkung zwischen Untereinheiten stark von der Art der Lipide und Detergenzien abhängt, mit denen die Proteine ​​verbunden sind. Beispielsweise scheint die Succinatdehydrogenase von E. coli, wenn sie mit Lubrol PX solubilisiert wird, aus vier Untereinheiten zu bestehen, wenn sie jedoch mit den meisten anderen Detergenzien, einschließlich Triton X-100, solubilisiert wird, nur aus zwei. Es ist bekannt, dass das sdh-Operon alle vier Polypeptide kodiert, und die Form mit zwei Untereinheiten weist ein abnormales ER-Spektrum auf. Somit ist klar, dass das Enzym in vivo aus vier Untereinheiten besteht. Da jedoch beide Formen Succinat-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen, sind die verwendeten biochemischen Kriterien wichtig für die Schlussfolgerung, ob die richtige Form solubilisiert wurde.

Ein weiteres Problem besteht darin, dass Membranproteine ​​aufgrund ihrer hohen lokalen Konzentration Komplexe in der Doppelschicht bilden können. Bei der Solubilisierung kann es unabhängig vom verwendeten Detergens zu einer Verdünnung der Membranproteine ​​und deren Abtrennung kommen. Nach dem Massenwirkungsgesetz führt dies zur Dissoziation von Komplexen, bei denen die Wechselwirkung zwischen den Komponenten nicht sehr stark ist. Es ist oft schwierig zu bestimmen, welcher Komplex in situ gebildet wird und welcher nach Solubilisierung und Reinigung. Ähnliche Probleme treten bei der Untersuchung vieler komplexer Systeme auf, beispielsweise des /3-adrenergen Rezeptor-Adeylacylcyclase-Systems, der Elektronentransportketten in Mitochondrien und der mikrosomalen Cytochrom-P450- und b$-Systeme.

Um die Stöchiometrie von Untereinheiten und ihre Assoziation in einem gereinigten Komplex zu untersuchen, werden nur wenige Methoden verwendet: 1) chemische Vernetzung; 2) quantitative Analyse N-terminaler Aminosäuren; 3) Bestimmung des Massenverhältnisses von Untereinheiten in SDS-Polyacrylamidgelen durch Bestimmung der Intensität der Färbung mittels Autoradiographie oder Immunblotting. Jede Methode hat ihre Grenzen, aber alle haben sich in der Praxis bewährt. Beispielsweise wurde die Stöchiometrie von fünf Untereinheiten des nikotinischen Acetylcholierezeptors durch quantitative Analyse von N-Coic-Aminosäuren und von drei Untereinheiten der Fo-Komponente der H + -ATPase von E. coli durch Trennung in SDS-Polyacrylamidgelen bestimmt. Beachten Sie, dass Coomassie-Brilliantblau, das üblicherweise zum Färben von Proteinen nach der SDS-PAGE-Trennung verwendet wird, bevorzugt an Proteine ​​bindet, die basische Aminosäurereste enthalten, und dass es Beispiele für stark unpolare Innenmembranproteine ​​gibt, die nur kaum gefärbt werden.

Chemische Vernetzung wurde verwendet, um Wechselwirkungen im Nahbereich sowohl in gereinigten Proteinkomplexen als auch in situ-Komplexen zu bestimmen. Mehrere spezifische hydrophobe Vernetzer wurden verwendet, um Wechselwirkungen im Nahbereich in Membranproteinen zu analysieren. Einige davon sind in der Tabelle dargestellt. 3.4. Die verwendeten Methoden unterscheiden sich nicht von denen für lösliche Systeme. Vernetzungsprodukte werden typischerweise durch PAGE analysiert, wobei oft spaltbare Vernetzungsmittel verwendet werden, was die Analyse von Polypeptiden ermöglicht. Antikörper gegen einzelne Polypeptide werden auch für das Immunblotting nach SDS-PAGE verwendet, um die Komponenten jedes der resultierenden Produkte zu identifizieren. Man könnte annehmen, dass bei einer relativ langen Lebensdauer der Reagenzien Proteine ​​in Biomembranen durch einfache Diffusion in der Doppelschicht vernetzt würden. Laut mehreren Studien ist dies jedoch nicht der Fall: Bei den Vernetzungsprodukten handelt es sich um spezifische Proteinassoziierte und nicht um zufällige Formationen. So werden in der Photosynthesemembran von Rhodobacter capsulata Vernetzungen nur zwischen den Untereinheiten der Komponenten des Reaktionszentrums sowie zwischen dem Reaktionszentrum und dem „Antennen“-Komplex B870 gebildet, der an der Energieübertragung beteiligt ist zum Reaktionszentrum.

Abschließend stellen wir fest, dass chemische Vernetzung häufig verwendet wurde, um integrale Membranproteine ​​zu identifizieren, die an bekannte lösliche Komponenten binden. Ein Beispiel ist die Vernetzung von 1) den a- und b-Untereinheiten der Fo-kom-Komponente der H + -ATPase mit der /3-Untereinheit der löslichen Komponente Fi; 2) Cytochrom-c-Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom-c-Oxidase; 3) Peptidhormone mit Hormonrezeptoren.

Tabelle 4. Einige Vernetzungsreagenzien zur Bestimmung der Quartärstruktur von Membranproteinen.