Kalvojen kemiallinen koostumus. Kalvot koostuvat lipidi- ja proteiinimolekyyleistä, joiden suhteellinen määrä vaihtelee suuresti eri kalvojen välillä. Hiilihydraatteja on glykoproteiinien, glykolipidien muodossa ja ne muodostavat 0,5–10 % kalvoaineista. Nestemosaiikin mukaan

Kalvon lipidit. Kalvolipidit ovat amfifiilisiä molekyylejä, ts. molekyyli sisältää sekä hydrofiilisiä ryhmiä (polaarisia päitä) että alifaattisia radikaaleja (hydrofobisia pyrstöjä), jotka muodostavat spontaanisti kaksoiskerroksen, jossa lipidien hännät ovat vastakkain. Paksuus

Proteiinit Proteiinin ravintoarvon varmistaa välttämättömien aminohappojen läsnäolo, joiden hiilivetyrungot eivät voi syntetisoitua ihmiskehossa, ja siksi ne on saatava ravinnon mukana. Ne ovat myös tärkeimmät typen lähteet. Päiväraha

Lihaskudosproteiinit Proteiineja on kolme ryhmää: 1. myofibrillaariset proteiinit – 45 %;2. sarkoplasmaproteiinit – 35 %;3. stromaaliset proteiinit – 20 % Myofibrillaariset proteiinit. myosiini; 2. aktiini; 3. aktomyosiini sekä niin sanotut säätelyproteiinit: 4. tropomyosiini; 5.

Luokittelu

Kalvoproteiinit voidaan luokitella topologisten tai biokemiallisten periaatteiden mukaan. Topologinen luokittelu perustuu proteiinin sijaintiin suhteessa lipidikaksoiskerrokseen. Biokemiallinen luokittelu perustuu proteiinin vuorovaikutuksen vahvuuteen kalvon kanssa.

Erilaiset polytooppisten proteiinien luokat. Kalvoon sitoutuminen johtuen (1) yhdestä transmembraanisesta alfakierteestä, (2) useista transmembraanisista alfakierteistä, (3) beetalevyrakenteesta.

Eri luokat integroituja monotooppisia proteiineja. Sitoutuminen kalvoon johtuen (1) amfipaattisesta alfakierteestä, joka on yhdensuuntainen kalvon tason kanssa, (2) hydrofobisesta silmukasta, (3) kovalenttisesti sitoutuneesta rasvahappojäännöksestä, (4) sähköstaattisesta vuorovaikutuksesta (suora tai kalsiumvälitteinen). ).

Topologinen luokitus

Kalvon suhteen kalvoproteiinit jaetaan poly- ja monotooppisiin.

• Polytooppiset eli transmembraaniset proteiinit läpäisevät kokonaan kalvon ja ovat siten vuorovaikutuksessa lipidikaksoiskerroksen molempien puolten kanssa. Tyypillisesti proteiinin transmembraanifragmentti on alfaheliksi, joka koostuu hydrofobisista aminohapoista (mahdollisesti 1 - 20 tällaisesta fragmentista). Vain bakteereissa sekä mitokondrioissa ja kloroplasteissa transmembraaniset fragmentit voidaan järjestää beeta-arkkirakenteeksi (polypeptidiketjun 8 - 22 kierrosta).
• Integraaliset monotooppiset proteiinit pysyvästi upotettuna lipidikaksoiskerrokseen, mutta yhdistetty kalvoon vain toiselta puolelta, läpäisemättä vastakkaista puolia.

Biokemiallinen luokitus

Biokemiallisen luokituksen mukaan kalvoproteiinit jaetaan kiinteä Ja oheislaite.

• Integraaliset kalvoproteiinit lujasti upotettu kalvoon ja voidaan poistaa lipidiympäristöstä vain pesuaineiden tai ei-polaaristen liuottimien avulla. Lipidikaksoiskerroksen suhteen integraaliset proteiinit voivat olla transmembraanisia polytooppisia tai integraalisia monotooppisia.
• Perifeeriset kalvoproteiinit ovat monotooppisia proteiineja. Ne ovat joko heikosti sitoutuneita lipidikalvoon tai liittyvät integraalisiin proteiineihin hydrofobisten, sähköstaattisten tai muiden ei-kovalenttisten voimien vuoksi. Siten, toisin kuin integraaliset proteiinit, ne dissosioituvat kalvosta, kun niitä käsitellään sopivalla vesiliuoksella (esim. matala tai korkea pH, korkea suolapitoisuus tai kaotrooppinen aine). Tämä dissosiaatio ei vaadi kalvon rikkoutumista.

Kalvoproteiinit voivat integroitua kalvoon johtuen rasvahappo- tai prenyylitähteistä tai glykosyylifosfatidyyli-inositolista, jotka ovat kiinnittyneet proteiiniin niiden translaation jälkeisen modifikaation aikana.

Linkit

Wikimedia Foundation. 2010.

: ominaisuudet ja rakenneperiaatteet

1. Kalvoproteiinien rakenne

Lipidien päätehtävä kalvoissa on kaksikerroksisen rakenteen stabilointi, ja proteiinit ovat biokalvojen aktiivisia komponentteja. Keskustelemme joistakin periaatteista, jotka ovat osoittautuneet hyödyllisiksi kalvoproteiinien rakenteellisten piirteiden selvittämisessä. Annamme esimerkkejä näiden periaatteiden havainnollistamiseksi.

Membranologian kehityksen kynnyksellä uskottiin, että kalvoproteiinit olivat rakenteeltaan melko homogeenisia ja asettuneet 3 kerroksen muodossa kaksoiskerroksen pinnalle. Nyt olemme taipuvaisempia uskomaan, että ainakin transmembraaniproteiineissa ne osat, jotka ovat upotettuina kalvoon, sisältävät α-kierteitä. Tietysti haluaisin kovasti tehdä tästä asiasta joitain yksiselitteisiä johtopäätöksiä, mutta niiden on perustuttava tosiasiatietoihin. Liukoisten proteiinien valtavan rakenteellisen monimuotoisuuden edessä voidaan päätellä, että integraaliset kalvoproteiinit voivat olla paljon monimutkaisempia kuin tällä hetkellä kuvittelemme. Liukoisten proteiinien luokittelu rakennetyypin mukaan suoritettiin vasta sen jälkeen, kun yli 100 eri proteiinin rakenteet oli määritetty korkealla resoluutiolla. Mitä tulee transmembraanisiin proteiineihin, tämä tehtiin vain yhdessä tapauksessa - bakteerien fotosynteettisen reaktiokeskuksen proteiinille. Yhdessä bakteerirodopsiinin rakennetta koskevien matalaresoluutioisten elektronimikroskopiatietojen kanssa tämä on ainoa lähde, johon voidaan perustaa useimpien muiden transmembraaniproteiinien mallit.

Toinen tärkeä seikka on menetelmät proteiinien kiinnittämiseksi kalvoon. Ne on esitetty kaavamaisesti kuvassa. 3.1.

1. Sitoutuminen kaksoiskerrokseen upotettuihin proteiineihin. Esimerkkejä ovat H + -ATPaasin Fi-osa, joka sitoutuu kalvoon upotettuun Fo-osaan; Voidaan myös mainita jotkin sytoskeletaaliset proteiinit.

2. Sitoutuminen kaksikerroksiseen pintaan. Tämä vuorovaikutus on luonteeltaan ensisijaisesti sähköstaattista tai hydrofobista. Joidenkin kalvoproteiinien pinnalla on hydrofobisia domeeneja, jotka muodostuvat sekundaarisen tai tertiaarisen rakenteen ominaisuuksien vuoksi. Näitä pintavuorovaikutuksia voidaan käyttää muiden vuorovaikutusten, kuten transmembraanisen ankkuroinnin, lisäksi.

3.Sidonta käyttämällä hydrofobista "ankkuria"; tämä rakenne paljastetaan tavallisesti ei-polaaristen aminohappotähteiden sekvenssinä. Jotkut kalvoproteiinit käyttävät kovalenttisesti sitoutuneita rasvahappoja tai fosfolipidejä ankkureina.

4. Transmembraaniproteiinit. Jotkut niistä ylittävät kalvon vain kerran, toiset useita kertoja.

Ulko- ja sisäkalvoproteiinien väliset erot eivät yksiselitteisesti määritä menetelmää niiden kiinnittämiseksi kaksoiskerrokseen; nämä erot määräävät vain niiden sitoutumisen suhteellisen lujuuden.

2. Kalvoproteiinien puhdistus

Integraalisten kalvoproteiinien puhdistamiseksi ja niiden saamiseksi biokemiallisesti aktiivisessa muodossa tarvitaan pesuaineita proteiinien liuottamiseksi ja niiden säilyttämiseksi liuoksessa. Siihen liittyvät pesuainevaatimukset ja käsittely aiheuttavat lisähaasteita proteiinien puhdistuksessa tyypillisten kohtaamien lisäksi. Integraalisten kalvoproteiinien eristämiseen on kehitetty monia spesifisiä menetelmiä, mutta useimmat puhdistusmenetelmät perustuvat samoihin kromatografisiin ja hydrodynaamisiin tekniikoihin, joita käytetään liukoisille proteiineille. Tämä on kromatografiaa DEAE-selluloosalla, Sepharosella tai hydroksyylipatiittilla, geelisuodatusta, sentrifugointia sakkaroositiheysgradientissa jne. Pesuaineen oikea valinta on erittäin tärkeää, koska se on pesuaine, joka tuhoaa biokalvon lipidien tilalle. joka ympäröi tiettyä proteiinia, ja määrittää proteiinin stabiilisuuden liuoksessa. Pesuaineiden vaikutusmekanismeja käsitellään katsauksessa.

2.1. PESUAINEET

Kahden viime vuosikymmenen aikana on tullut saataville suuri määrä pesuaineita, jotka soveltuvat integraalisten kalvoproteiinien puhdistamiseen. Periaatteessa pitäisi yrittää löytää detergentti, joka ei häiritsisi kalvoproteiinien sekundaari- ja tertiäärisiä rakenteita, vaan korvaisi vain suurimman osan tai kaikki kalvon lipidit kosketuksissa proteiinimolekyylin hydrofobisten alueiden kanssa. Solubilisoinnin perimmäinen tavoite on sisällyttää proteiini pesuainemiselliin; myöhempi puhdistusstrategia on erottaa sellaiset proteiini-detergenttikompleksit.

Ensimmäinen ongelma on optimaalisten olosuhteiden valinta tutkittavan proteiinin liuottamiseksi. Proteiinia denaturoivat pesuaineet eivät sovellu tähän herkkään tehtävään. Toisaalta monet pesuaineet eivät riko kalvoja tehokkaasti ja muodostavat proteiinia sisältäviä sekamisellejä. Tällaiset pesuaineet voivat olla joko liian hydrofobisia tai liian hydrofiilisiä sekoittumaan tehokkaasti kalvolipidien kanssa ja, jos niiden pitoisuus on riittävän korkea, muuttamaan kaksoiskerroksen pallomaisiksi sekamiselleiksi. Aluksi toivottiin, että tarvittavan pesuaineen valinta voitaisiin systematisoida yhdellä parametrilla, jota kutsutaan hydrofiilis-lipofiiliseksi tasapainoksi. Tätä parametria, joka vaihtelee 1 - 20, käytetään pinta-aktiivisten aineiden valmistuksessa suhteellisen hydrofobisuuden mittana. Todellakin on saatu joitain korrelaatioita, joista seuraa, että pesuaineen HLB-arvoa voidaan käyttää ennustamaan sen käyttäytymistä biologisissa järjestelmissä. Yleisesti ottaen pesuaineiden, joiden HLB-arvo on välillä 12,5 - 14,5, voidaan sanoa olevan tehokkaimpia liuottimia integraalisille kalvoproteiineille. Myöhemmin kuitenkin kävi selväksi, että optimaalisten pesuaineiden etsiminen tietylle kalvoproteiinille vaatii monien tekijöiden huomioon ottamista ja siihen tulisi aina liittää empiirinen testaus. Seuraavat asiat on otettava huomioon.

1. Tutkittavan proteiinin maksimaalinen liukoisuus. Kriteeri on proteiinin siirtyminen supernatanttiin sentrifugoinnin jälkeen, jonka aikana kalvo sedimentoituu.

2. Proteiinin liuottaminen haluttuun muotoon. Yleensä puhutaan sen entsymaattisen aktiivisuuden säilyttämisestä, mutta joskus käytetään tiettyjä spektriominaisuuksia tai spesifisten proteiiniassosiaatioiden läsnäoloa. Lisäksi proteiinin stabiilisuus liuottamisen jälkeen on edellytys. Joissakin tapauksissa eksogeenisiä fosfolipidejä lisätään pesuaineen mukana biokemiallisen aktiivisuuden ylläpitämiseksi. Esimerkki on E. colin laktoosipermeaasin ja natriumkanavaproteiinin tuotanto. Glyserolia tai muuta polyolia lisätään joskus stabiloimaan proteiinia liukenemisen jälkeen. On järkevää käyttää myös proteaasi-inhibiittoreita ja suorittaa solubilisointi olosuhteissa, jotka minimoivat niiden proteolyyttisen hajoamisen todennäköisyyden.

3. Mahdollisuus käyttää pesuainetta tässä tekniikassa. Ensinnäkin on otettava huomioon pesuaineen varaus, käyttäytyminen tietyssä pH-arvossa, CMC ja pesuainemisellien koko. Jälkimmäiset ominaisuudet ovat erityisen tärkeitä. Matala-CMC-pesuaineita, jotka muodostavat suuria misellejä, ei poisteta dialyysillä tai ultrasuodatuksella, koska pesuainemonomeerien pitoisuus on liian alhainen. Käytännössä tämä tarkoittaa, että jos proteiini väkevöidään ultrasuodatuksella, myös alhaisen CMC-detergentin pitoisuus kasvaa, mikä voi johtaa proteiinin denaturoitumiseen. Tästä syystä monet tutkijat käyttävät mieluummin pesuaineita, joissa on korkea CMC-arvo, kuten oktyyliglukosidia, sappisuoloja tai nykyaikaisempia kahtaisionisia pesuaineita. Polystyreenihartsit, kuten Biobidz SM-2, ovat erittäin arvokkaita. Ne sitoutuvat valikoivasti pesuaineisiin, kuten Triton X-100, poistavat ne liuoksesta ja mahdollistavat kokonaan ilman dialyysihoitoa. Toinen huomioon otettava tekijä on pesuaineen valon imeytyminen. Jotkut pesuaineet, kuten Triton X-100, absorboivat lähellä UV-aluetta, mikä tekee mahdottomaksi määrittää proteiinipitoisuutta mittaamalla absorbanssia 280 nm:ssä.

Kaikki nämä tekijät huomioon ottaen tulee selväksi, miksi monissa tapauksissa on tarpeen käyttää erilaisia ​​pesuaineita integraalikalvoproteiineja eristäessä. Esimerkiksi Triton X-100:aa voidaan käyttää liuottamiseen, mutta erottaminen DEAE-selluloosalla on parasta suorittaa oktyyliglukosidin läsnä ollessa. Detergentit voidaan vaihtaa kromatografiavaiheessa, tiheysgradienttisentrifugoinnin aikana ja joissakin tapauksissa dialyysin avulla. On pidettävä mielessä, että pesuaine, joka ei sovellu tietyn proteiinin liuottamiseen, voi olla erittäin tehokas pitämään proteiini liuoksessa pesuaineen vaihdon jälkeen. Puhdistus tulisi lähes aina suorittaa pesuaineen ylimäärällä liuoksessa, muuten tasapaino siirtyy kalvoproteiinien aggregaatioon pikemminkin kuin proteiini-detergenttikompleksien muodostumiseen. Joissakin tapauksissa tällainen aggregaatio voi olla jopa toivottavaa, ja viimeinen puhdistusvaihe voi olla pesuaineen poistaminen. Mutta yleensä pesuaineen puutteessa tapahtuu peruuttamatonta saostumista ja proteiinin menetystä.

Tarve säilyttää pesuainepitoisuus tietyllä tasolla luo lisävaikeuksia proteiinien puhdistuksessa tyypillisesti kohtaamien vaikeuksien lisäksi; Olemme jo puhuneet joistakin niistä. Ongelmia syntyy myös käytettäessä tavanomaista suolausmenetelmää korkeilla ammoniumsulfaattipitoisuuksilla: monissa tapauksissa proteiini saostuu yhdessä pesuaineen ja lipidin kanssa. Koska suolaliuoksella on suuri tiheys ja pesuaine aggregaatissa on suhteellisen alhainen, sentrifugoinnin aikana sakka jää pinnalle. On tärkeää muistaa, että proteiini-detergentti-kompleksit puhdistetaan, ja niissä on usein merkittävä määrä sitoutunutta fosfolipidiä. Tämä vaikuttaa erotuksen laatuun kromatografian aikana sekä lopullisten pro-liukoisten proteiinien karakterisoinnin tuloksiin, on tarpeen määrittää polypeptidialayksiköiden lukumäärä ja molekyylipaino, niiden stoikiometria, koko ja mahdollisesti muoto; molekyyli, sekä tarvittaessa biokemiallinen aktiivisuus.

3. PUHDISTETTUJEN KEMBRAANIPROTEIINIEN OMINAISUUDET

Puhdistettujen kalvoproteiinien, jopa yksinkertaisimpien, karakterisointi voi olla haastavaa. Kuten tapauksessa

3.1 ALAYKSIKÖIDEN MOLEKUURIPAINO

Polnatriumdodekyylisulfaatin läsnä ollessa on yleinen tekniikka, mutta integraalisten kalvoproteiinien tapauksessa se aiheuttaa erityisiä ongelmia. Tässä menetelmässä dodekyylisulfaatti kytketään polypeptidiketjuihin ja proteiini-DNS-kompleksit erotetaan polyakryyliamidigeelissä niiden Stokes-säteiden mukaisesti, jotka useimmissa tapauksissa riippuvat molekyylipainosta. Molekyylimassa määritetään vertaamalla tietyn kompleksin ja tunnetun standardin elektroforeettista liikkuvuutta. SDS:n sitoutuminen tuntemattomaan proteiiniin voi kuitenkin olla laadullisesti erilaista kuin standardeihin, jolloin saadaan virheellinen tulos. Samanlainen tilanne havaitaan integraalisilla kalvoproteiineilla, joissa on korkea pitoisuus ei-polaarisia aminohappotähteitä. SDS muodostaa komplekseja useimpien liukoisten proteiinien kanssa suhteessa 1,4 g SDS:ää 1 g proteiinia kohti, ja enemmän pesuainetta voi sitoutua proteiineihin, jotka sisältävät suuren prosenttiosuuden ei-polaarisia jäämiä. Ylimääräinen negatiivinen varaus, joka syntyy tässä tapauksessa, johtaa elektroforeettisen liikkuvuuden epänormaaliin lisääntymiseen, ja määritetty molekyylipaino osoittautuu pienemmäksi kuin se todellisuudessa on. Myös toinen tilanne on mahdollinen. SDS:ään sitoutuva kalvoproteiini ei välttämättä laskostu kokonaan auki, mikä johtaa myös elektroforeettisen liikkuvuuden epänormaaliin lisääntymiseen kompaktimman proteiini-SDS-kompleksin muodostumisen vuoksi. Kaikki nämä vaikutukset ovat varsin merkittäviä. Esimerkiksi laktoosipermeaasilla on näennäinen mol. massa 33 000 mitattuna PAGE:lla SDS:n läsnä ollessa; todellisuudessa, kuten geneettisen analyysin tulokset osoittavat, hän sanoo. massa on 46 000. Monissa tapauksissa on mahdollista arvioida molekyylipaino tarkemmin rakentamalla Fergusonin käyrä, joka edustaa elektroforeettisen liikkuvuuden riippuvuutta akryyliamidipitoisuudesta sekä standardiproteiinien että tutkittavan proteiinin osalta. Tämä kuvaaja riippuu Stokesin säteestä ja vähemmässä määrin kompleksin varauksesta. Esimerkiksi 12-prosenttisessa akryyliamidigeelissä suoritetun elektroforeesin tulosten mukaan yhdellä E. colin sytokromi-o-kompleksin alayksiköistä on näennäinen molekyylipaino. massa 28 000 ja Fergusonin graafista arvo on 43 000, joka on yhtäpitävä molin kanssa. massa laskettu vastaavan DNA:n sekvensointitiedoista.

Toinen ongelma on kvaternaarisen rakenteen mahdollinen läsnäolo. Jotkut kalvoproteiinit aggregoituvat jopa SDS:n läsnä ollessa. Esimerkiksi glykoforiini A tai bakteriofagin M13 vaippaproteiini löytyy pääasiassa dimeerien muodossa elektroforeesin aikana polyakryyliamidigeeleissä, joissa on SDS. Joskus aggregaatiota tehostetaan edelleen kuumentamalla proteiini-SDS-seosta. Tämä kuva havaitaan esimerkiksi sekä mitokondrioiden että bakteerien terminaalisten oksidaasien alayksiköillä. Proteiinin irreversiibelin aggregoitumiskyvyn arvioimiseksi on suoritettava lämmitetyille ja lämmittämättömille näytteille polyakryyliamidigeelissä SDS:llä tehdyn elektroforeesin tulosten vertaileva analyysi. Samanlainen ongelma ilmenee joskus kalvoproteiinien puhdistuksessa käytetyn detergentin läsnäolon vuoksi. Tämä pesuaine on poistettava ja korvattava SDS:llä, koska joissakin tapauksissa elektroforeettinen liikkuvuus on selkeästi riippuvainen detergentin läsnäolosta, jolla entsyymi liuotettiin.

Siten on syytä ajatella, että erittäin polaaristen integraalisten kalvoproteiinien alayksiköiden molekyylipainon arviointi, joka on määritetty SDS-PAGE:lla, voi olla virheellinen. Valitettavasti tälle menetelmälle ei ole yksinkertaista vaihtoehtoa, ja oikea arvo saadaan usein joko täydellisistä primäärisekvenssitiedoista tai tarkasta hydrodynaamisesta analyysistä.

3.2 ALKUPERÄISEN PROTEIININ MOLEKUULIPAINON MÄÄRITTÄMINEN HYDRODYNAMISIA menetelmiä käyttäen

Näiden menetelmien soveltaminen kalvoproteiineihin voi olla täynnä vaikeuksia pesuaineen sitoutumisen vuoksi. Ymmärtääksemme tämän täysin, harkitkaamme ensin yksinkertaista liukoista proteiinia, jolle mol. alayksiköiden massa SDS-PAGE:lla ja on tarpeen selvittää, mikä se on denaturoimattomassa, aktiivisessa muodossaan - monomeeri, dimeeri vai korkeamman asteen oligomeeri. Geelisuodatusta, johon liittyy vertailu standardiproteiineihin, käytetään usein proteiinien molekyylipainon määrittämiseen; Tässä syntyy ongelmia, koska kaikilla standardiproteiineilla on pallomainen muoto ja tutkittava proteiini ei välttämättä ole pallomainen, vaan hieman pitkänomainen. Tällainen proteiini mol. jotka painavat 50 000, voivat eluoitua nopeudella, joka vastaa mol. saattaa

se 100 LLC. Tältä osin geelisuodatuskolonni on kalibroitava Stokes-säteen, eli "ekvivalentin hydrodynaamisen pallon" mittojen mukaan, ja lisäksi rinnakkain on käytettävä jotakin muuta menetelmää. Tyypillisesti sedimentaationopeudet mitataan käyttämällä joko analyyttistä ultrasentrifugointia taifugointia. Sedimentaatiokerroin on yhtä suuri kuin

missä m on proteiinin molekyylipaino,

v on sen osaominaistilavuus, ij on liuoksen viskositeetti, b on liuoksen tiheys.

Koska e ja H tunnetaan, aRc voidaan määrittää geelisuodatuksella, jäljelle jää vain kaksi tuntematonta määrää - v ja m Vesiliukoisille proteiineille v voidaan laskea aminohappokoostumuksen perusteella tai mitata suoraan tai yksinkertaisesti ottaa yhtä suureksi kuin. 0,72-0,75 ml/G. Siten mittaamalla S 0 voimme löytää m.

Tarkastellaan nyt tilannetta kalvoproteiinin kanssa. Tässä syntyy lisäongelmia, koska hydrodynaaminen partikkeli on proteiini-detergenttikompleksi, joten m ja v ovat tässä tapauksessa kompleksin molekyylipaino ja ominaistilavuus, M k ja K,. Valitettavasti K:tä ei voida arvioida tietämättä mitään kompleksin koostumuksesta. Tässä tapauksessa käytetään kahta menetelmää proteiinin molekyylipainon selvittämiseen.

1. Mittaa suoraan sitoutuneen pesuaineen määrä 1 g proteiinia kohti. Tätä tarkoitusta varten käytetään spektrimenetelmiä tai radioaktiivisesti leimattua pesuainetta ja eri menetelmiä, kuten geelisuodatusta, käytetään kompleksien eristämiseen. Kun proteiinin ja pesuaineen suhteellinen pitoisuus kompleksissa on selvitetty, K-arvo saadaan puhtaan proteiinin ja puhtaan pesuaineen vastaavien arvojen painotettuna keskiarvona. Tämän jälkeen m on helppo löytää, ja koska proteiinin ja detergentin suhde kompleksissa tiedetään, saadaan selville proteiinin molekyylipaino.

2. S0 mitataan väliaineissa, joilla on eri liuostiheydet d. Tällaiset väliaineet valmistetaan yleensä käyttämällä HgO:n ja D2O:n seoksia. Graafista S° vs. q löytyvät sekä L/„ että v t. Oletetaan, että K on puhtaan proteiinin ja puhtaan pesuaineen vastaavien arvojen painotettu keskiarvo.

Arvioimalla Kvelo* ja ottamalla pesuaine taulukoista saadaan proteiinikomponentin m molekyylipaino.

5°:n riippuvuuden kuvaamiseksi q:stä suoritetaan analyyttinen sentrifugointi. Sentrifugointi voidaan suorittaa myös sakkaroositiheysgradientissa käyttämällä H2O:n ja D2O:n seoksia, mutta tulosten analysointi on tässä tapauksessa paljon monimutkaisempaa, vaikka se ei pohjimmiltaan eroa edellisestä tapauksesta.

Vaihtoehtoinen menetelmä kalvoproteiinin natiivimuodon molekyylipainon määrittämiseksi on tasapaino-ultrasentrifugointi. Aineen jakautuminen tasapainotilassa on sellainen, että pitoisuuden logaritmin käyrän kaltevuus suhteessa r 2 on yhtä suuri kuin

missä r on etäisyys roottorin keskustasta tiettyyn pisteeseen sentrifugiputkessa, W on pyörimistaajuus.

Jos Y:n arvo tiedetään tai se on helppo arvioida, kuten useimpien liukoisten proteiinien kohdalla, tämä ongelma ratkeaa yksinkertaisesti. Mitä tulee kalvoproteiineihin, tässä tapauksessa

Taulukko 3. Pesuaineiden sitoutuminen joihinkin kalvoproteiineihin

osoitetun suoran viivan klooni q:n eri arvoilla, jotka on saatu sekoittamalla HgO:ta ja D2O:ta. Kuten edellä, Mk ja K löydetään samanaikaisesti, ja sitten määritetään proteiinin molekyylipaino.

Jos kompleksissa on kolmas komponentti, syntyy lisäongelmia. Joka tapauksessa kaikki kuvatut menettelyt ovat erittäin monimutkaisia ​​ja voivat antaa virheellisiä tuloksia. Puhdistettuihin integraalisiin kalvoproteiineihin liittyvä pesuaineen määrä voi olla varsin merkittävä - 0,3 - 1,5 proteiinin painosta, ja jopa pienet virheet tässä arvossa johtavat proteiinin molekyylipainon merkittävään vääristymiseen. Taulukossa Taulukossa 3.3 on tietoja joidenkin proteiinivalmisteiden sisältämien pesuaineiden määrästä. Huomaa, että liukoiset proteiinit eivät sitoudu näihin pesuaineisiin; tämä osoittaa jälleen, että proteiinin ei-polaarinen osa, joka on tavallisesti kosketuksessa kalvon lipidien kanssa, on vastuussa sitoutumisesta pesuaineeseen.

3.3 SÄTEILYINAKTIVOINTIMENETELMÄ

Säteilyn inaktivointimenetelmää kohteen koon määrittämiseksi käytetään yhä enemmän kalvoproteiinien tutkimuksessa. Sekä puhdistettuja proteiineja että raakavalmisteita, mukaan lukien ehjät biokalvot, voidaan tutkia. Menetelmän ydin on määrittää säteilytyksen vaurioittamien proteiinimolekyylien osuus. Tätä tarkoitusta varten käytetään entsymaattisia menetelmiä hormonien tai muiden ligandien sitomiseksi tai spektrimenetelmiä. Menettelytapa on seuraava. Näyte, yleensä jäädytetty, altistetaan korkeaenergiselle säteilylle. Eri aikavälein otetaan näytteitä, sulatetaan ja mitataan. Säteilyn vaikutuksesta proteiinin vaurioituminen havaitaan esimerkiksi SDS-PAGE:lla. Kokemus osoittaa, että jotkin alayksiköt menettävät täysin biologisen aktiivisuutensa, kun säteilyvaurioita tuodaan mihin tahansa kohtaan polypeptidiketjussa. Tärkeintä on, että mitä suurempi proteiinimolekyyli on, sitä suurempi on vaurion todennäköisyys ja siten inaktivoitumisen todennäköisyys. Tämä todennäköisyys ei riipu molekyylin muodosta, vaan sen massasta. Tyypillisesti tunnetun molekyylipainon omaavaa proteiinia säteilytetään rinnakkain tulosten tulkinnan helpottamiseksi. Jos tutkittava proteiini sisältää useamman kuin yhden alayksikön, tulee tiettyjä vaikeuksia tulosten analysoinnissa. Yhden alayksikön vaurioitumiseen ei välttämättä liity kovalenttisten sidosten katkeamista muissa alayksiköissä. Siksi entsyymeille, jotka koostuvat erilaisista alayksiköistä, joilla on eri aktiivisuus, voidaan saada eri kohdekokoja riippuen menetelmästä, jolla inaktivaatioaste määritetään.

Menetelmän huomionarvoinen piirre on, että sitä voidaan käyttää integraalisten kalvoproteiinien tutkimiseen in situ. Teoksessa käsitellään esiin tulevia esineitä ja ongelmia. Yksi ilmeinen ongelma on tarve käyttää korkeaenergistä säteilyä. Tältä osin suurin osa työstä on tehtävä yhteistyössä sellaisten laboratorioiden kanssa, joilla on asianmukaiset lähteet ja jotka ovat hallitseneet erityiset analyysimenetelmät.

3.4 SPEKTRALIMENETELMÄT JA TOISIJARAKENNE

Useita menetelmiä käytetään määrittämään α-heliksien ja β-levyjen pitoisuutta kalvoproteiineissa. Kolmiulotteisen organisaation puuttuessa niiden pohjalta voidaan yrittää rakentaa sopivia malleja. Yleisimmin käytetty menetelmä on pyöreä dikroismi. Infrapuna- ja Raman-spektroskopiaa sekä NMR:ää käytetään yhä enemmän.

1. Pyöreädikroismimenetelmä perustuu vasemman ja oikeanpuoleisen polarisoidun valon absorption eron mittaamiseen; tämä optinen aktiivisuus on molekyylien kiraalisuuden mitta tai niiden epäsymmetrian mitta. Kauko-ultraviolettialueella CD määräytyy pääasiassa polypeptidirungon karbonyyliryhmien amidien absorption perusteella. Toissijaisen rakenteen alueiden, esimerkiksi a-heliksien, läsnä ollessa CD-spektrillä on hyvin spesifisiä piirteitä, jotka liittyvät näiden rakenteiden amidoryhmien elektronisen ympäristön ominaisuuksiin. Proteiinien CD-spektriä analysoitaessa se esitetään yleensä komponenttien summana, jotka vastaavat proteiinimolekyylin eri osien absorptiota: α-heliksit, β-kerrokset ja satunnaiset kierteet. Kun näiden rakenteiden spektrit on tavalla tai toisella määritetty, ne summataan ja valitaan sopivat kertoimet siten, että saavutetaan paras sovitus mitattuun spektriin. Valitut painokertoimet edustavat osuutta, joka putoaa molekyyliin kunkin sekundaarirakenteen tyypin osalta.

Nämä menetelmät kehitettiin liukoisille proteiineille, mutta ei ole syytä epäillä, että niitä voidaan soveltaa menestyksekkäästi kalvoproteiineihin. Todennäköisimmin jälkimmäisillä on alueita, joilla on samantyyppinen sekundaarinen rakenne kuin liukoisilla proteiineilla, ja samat vaikeudet tulevat esiin niitä tutkittaessa. Joitakin proteiineja voidaan tutkia in situ käyttämällä kalvosuspensioita. Esimerkkejä tällaisista ovat bakteerirodopsiini Halobacteriumhalobiumin violetista kalvosta ja Ca2+-ATPaasi sarkoplasmisen retikulumin kalvosta. Puhdistettuja kalvoproteiineja voidaan tutkia CD:llä ja detergenttien läsnä ollessa, jos jälkimmäisten imeytyminen kauko-UV-alueella ei ole liian korkea, tai rekonstruoitujen vesikkeleiden koostumuksessa. Tässä syntyy kaksi ongelmaa: 1) differentiaalinen valonsironta, kun kalvohiukkasten koko on paljon suurempi kuin valon aallonpituus; 2) absorption tasaantuminen proteiinin pitoisuudesta kalvoissa tai rakkuloissa, ts. sen jakautumisen epähomogeenisuudesta liuoksessa. Nämä esineet voivat olla varsin merkittäviä, mutta ne voidaan ottaa huomioon sopivilla menetelmillä.

Valitettavasti kalvon sisäisistä proteiineista ei ole saatavilla korkearesoluutioisia rakennetietoja, joten CD-spektrien tarkka tulkinta ei ole mahdollista. Muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta saman proteiinin tutkimiseen ei ole käytetty erilaisia ​​spektrimenetelmiä, eikä tuloksia ole vertailtu kvantitatiivisesti. On mielenkiintoista, että bakteerirodopsiinista, jota tutkittiin CD-, IR- ja NMR-menetelmillä, saatiin kaikissa kolmessa tapauksessa samat tulokset, mikä osoittaa merkittävän 3-kerroksen pitoisuuden tässä proteiinissa. Jokaisella menetelmällä on kuitenkin merkittäviä haittoja. Näin ollen tiedot D-kerrosten korkeasta pitoisuudesta bakteerirodopsiinissa riippuvat suurelta osin optisten artefaktien laskentamenetelmästä. Elektronimikroskooppisten rekonstruktiotietojen perusteella, joille on ominaista suhteellisen alhainen resoluutio, 80 % bakteerirodopsiinista koostuu α-kierteistä ja 0-kerrokset puuttuvat kokonaan. Näiden erojen syyn ymmärtämiseksi on välttämätöntä suorittaa proteiinin rakenneanalyysi atomiresoluutiolla. On olemassa kaksi muuta runsaasti kalvoa kattavaa proteiinia ja Staphylococcus aureus a-toksiinia. Molemmat proteiinit osallistuvat huokosten muodostumiseen kaksoiskerroksessa.

2. Infrapunaspektroskopia ja Raman-spektroskopia. Nämä menetelmät eivät ainoastaan ​​anna tietoa kalvolipidien konformaatiosta, vaan niitä voidaan käyttää myös proteiinien sekundaarirakenteen tutkimiseen. Polypeptidirungon värähtelyspektri riippuu sekundaarirakenteen tyypistä ja antaa tietoa a- ja /3-rakenteiden sisällöstä molekyylissä. Näillä menetelmillä voidaan tutkia ilmakuivattuja kalvoja, kalvojen vesisuspensioita sekä puhdistettuja proteiineja sekä detergentin läsnä ollessa että osana rekonstruoituja vesikkelejä. Esimerkiksi Fourier-muunnos IR-spektroskopian mukaan kalvossa oleva Ca 2+ -ATPaasi-kompleksi koostuu pääasiassa α-kierteisistä alueista ja alueista, joilla on tilastollinen kierukkakonformaatio, ja rekonstruoiduissa vesikkeleissä oleva hydrofobinen proteiinimyeliini sisältää sekä α- että/ 3-tontti.

3. NMR-spektroskopiaa voidaan käyttää myös kalvoproteiinien tutkimiseen. Menetelmän mahdollisuudet ovat kuitenkin tässä tapauksessa rajalliset, mikä johtuu pääasiassa integraalisten kalvoproteiinien suhteellisen hitaista liikkeistä in situ ja komplekseissa pesuaineen kanssa. Siksi niin tehokas menetelmä kuin kaksiulotteinen NMR, joka voi antaa yksityiskohtaisen kuvan suhteellisen pienten proteiinien konformaatiotilasta liuoksessa, ei vielä sovellu kalvoproteiinien tutkimiseen. Kiinteiden näytteiden NMR-menetelmä on hyväksyttävämpi. 2H- ja 3C-NMR-menetelmillä on suuri potentiaali, vaikka niitä ei ole toistaiseksi käytetty kovin laajasti. Tietoja saatiin ytimen keskimääräisestä konformaatiosta ja sivuketjujen dynamiikasta. On huomattava, että kiinteän olomuodon NMR-menetelmiä ei vain käytetä laajalti, mutta useimmissa tapauksissa niitä ei voida käyttää. Niissä harvinaisissa tilanteissa, joissa niiden käyttö on mahdollista, ne ovat kuitenkin erittäin arvokkaita.

3.5 ENTSYYMIAKTIIVITEETTI

Yksi tärkeimmistä menetelmistä puhdistettujen kalvoproteiinien karakterisoimiseksi on epäilemättä biokemiallisen aktiivisuuden määritys. Tässä tapauksessa käytetään pohjimmiltaan samoja kriteerejä kuin liukoisille proteiineille, mutta omia vaikeuksia saattaa ilmetä. Ensimmäinen näistä johtuu siitä, että kalvoproteiinien biokemiallinen aktiivisuus on usein hyvin riippuvainen lipidien ja pesuaineiden sitoutumisesta proteiiniin. Aktiivisuuden menetys voi olla joko palautuva tai peruuttamaton. On suositeltavaa saada jokin arvio tutkittavan proteiinin spesifisestä aktiivisuudesta in vivo tai osana kalvoja ennen solubilisaatiota. Liiallisella pesuaineella voi olla estävä vaikutus, esimerkiksi laimentamalla ei-polaarisia substraatteja misellipopulaatiossa ja vähentämällä entsymaattista aktiivisuutta. Minkä tahansa kalvoproteiinin aktiivisuutta mitattaessa on pidettävä mielessä, että in situ sitä ympäröivät lipidit, jotka varmistavat optimaalisen aktiivisuuden. Toinen ongelma koskee proteiineja, joilla on "transkaksoiskerrosaktiivisuutta"; esimerkkejä ovat kanavaa muodostavat proteiinit ja kuljetusproteiinit. Näissä tapauksissa on otettava huomioon liuenneiden aineiden liikkuminen osastosta toiseen.

3.6 KVARTERNAARINEN RAKENNE JA KEMIALLISET RISTIVERHOITUKSET

Monet kalvoentsyymit ovat komplekseja, jotka koostuvat useista alayksiköistä. Esimerkkejä ovat H + -ATPaasi, Na + /K + -ATPaasi, mitokondrioiden elektronien kuljetuskompleksit ja fotosynteettiset reaktiokeskukset. Jotkut integraaliset kalvoproteiinit liittyvät tiiviisti liukoisiin proteiineihin ei-kovalenttisten vuorovaikutusten kautta. E. colissa Fo-komponentti, joka SDS-PAGE-elektroforeesin mukaan sisältää kolmen tyyppisiä alayksiköitä, muodostaa protonikanavan, joka koostuu viidestä alayksiköstä, sisältää aktiivisen keskuksen, joka osallistuu ATP:n hydrolyysiin. Tällaisten proteiinien kohdalla on erittäin tärkeää määrittää alayksiköiden luonne, kompleksin stoikiometria ja sen komponenttien välittömät vuorovaikutukset. Tämä on erittäin vaikea tehtävä, vaikka proteiinikompleksi on jo eristetty. Tässä ilmenevät ongelmat eivät pohjimmiltaan eroa liukoisten proteiinikomplekseja koskevista ongelmista, mutta niihin liittyy lisävaikeuksia.

Ensinnäkin on pidettävä mielessä, että alayksiköiden välinen vuorovaikutus riippuu suuresti lipidien ja detergenttien tyypistä, joihin proteiinit liittyvät. Esimerkiksi E. colin sukkinaattidehydrogenaasi, kun se on liuotettu Lubrol PX:llä, näyttää koostuvan neljästä alayksiköstä, mutta kun se liuotetaan useimpiin muihin pesuaineisiin, mukaan lukien Triton X-100, vain kahdesta alayksiköstä. Sdh-operonin tiedetään koodaavan kaikkia neljää polypeptidiä, ja kahden alayksikön muodolla on epänormaali ER-spektri. Siten on selvää, että in vivo entsyymi koostuu neljästä alayksiköstä. Molemmilla muodoilla on kuitenkinsuutta, joten käytetyt biokemialliset kriteerit ovat tärkeitä päätettäessä, onko oikea muoto liuennut.

Toinen ongelma on, että kalvoproteiinit voivat muodostaa komplekseja kaksoiskerroksessa niiden korkean paikallisen pitoisuuden vuoksi. Solubilisoinnin aikana, käytetystä pesuaineesta riippumatta, kalvoproteiinien laimentumista ja niiden erottumista voi tapahtua. Massatoiminnan lain mukaan tämä johtaa sellaisten kompleksien dissosioitumiseen, joissa komponenttien välinen vuorovaikutus ei ole kovin vahvaa. Usein on vaikea määrittää, mikä kompleksi muodostuu in situ ja mikä liukenemisen ja puhdistuksen jälkeen. Samanlaisia ​​ongelmia syntyy monien monimutkaisten järjestelmien, esimerkiksi /3-adrenergisen reseptori-adeyyliasyylisyklaasijärjestelmän, mitokondrioiden elektroninkuljetusketjujen ja mikrosomaalisen sytokromi P450- ja b$-järjestelmän tutkimuksessa.

Alayksiköiden stoikiometrian ja niiden assosioitumisen tutkimiseksi puhdistetussa kompleksissa käytetään vain muutamia menetelmiä: 1) kemiallinen silloitus; 2) N-terminaalisten aminohappojen kvantitatiivinen analyysi; 3) alayksiköiden massasuhteen määritys SDS-polyakryyliamidigeeleissä määrittämällä värjäytymisen intensiteetti autoradiografiaa tai immunoblottausta käyttäen. Jokaisella menetelmällä on rajoituksensa, mutta niitä kaikkia on käytetty käytännössä. Esimerkiksi nikotiiniasetyylikolireseptorin viiden alayksikön stoikiometria määritettiin N-koiiniaminohappojen kvantitatiivisella analyysillä ja E. colin H+-ATPaasin Fo-komponentin kolmen alayksikön stoikiometria erottamalla SDS-polyakryyliamidigeeleissä. Huomaa, että Coomassie briljanttisininen, jota käytetään yleisesti proteiinien värjäämiseen SDS-PAGE-erotuksen jälkeen, sitoutuu ensisijaisesti proteiineihin, jotka sisältävät emäksisiä aminohappotähteitä, ja on esimerkkejä erittäin polaarisista sisäkalvoproteiineista, jotka värjäytyvät vain tuskin.

Kemiallista ristisilloitusta on käytetty määrittämään lyhyen kantaman vuorovaikutuksia sekä puhdistetuissa proteiinikomplekseissa että in situ -komplekseissa. Useita spesifisiä hydrofobisia silloittajia on käytetty analysoimaan lyhyen kantaman vuorovaikutuksia kalvoproteiineissa. Jotkut niistä on esitetty taulukossa. 3.4. Käytetyt menetelmät eivät eroa liukoisten järjestelmien menetelmistä. Silloittuvia tuotteita analysoidaan tyypillisesti PAGE:lla, usein käyttämällä pilkottavia silloitusaineita, mikä mahdollistaa polypeptidien analysoinnin. Yksittäisten polypeptidien vasta-aineita käytetään myös immunoblottaukseen SDS-PAGE:n jälkeen kunkin tuloksena olevan tuotteen komponenttien tunnistamiseksi. Voidaan olettaa, että reagenssien suhteellisen pitkällä käyttöiällä biomembraanien proteiinit silloittuisivat yksinkertaisen diffuusion seurauksena kaksoiskerroksessa. Useiden tutkimusten mukaan näin ei kuitenkaan ole: silloittuvat tuotteet ovat spesifisiä proteiiniyhdisteitä eivätkä satunnaisia ​​muodostelmia. Siten Rhodobacter capsulatan fotosynteettisessä kalvossa ristisidoksia muodostuu vain reaktiokeskuksen komponenttien alayksiköiden välillä sekä reaktiokeskuksen ja "antenni"-kompleksin B870 välillä, joka osallistuu energian siirtoon. reaktiokeskukseen.

Lopuksi panemme merkille, että kemiallista silloittamista on usein käytetty tunnistamaan integraalisia kalvoproteiineja, jotka sitoutuvat tunnettuihin liukoisiin komponentteihin. Esimerkki on 1) H+-ATPaasin Fo-kom-komponentin a- ja b-alayksiköiden silloittaminen liukoisen komponentin Fi /3-alayksikön kanssa; 2) mitokondrion sytokromi c-oksidaasin sytokromi c -alayksiköt; 3) peptidihormonit hormonireseptoreiden kanssa.

Taulukko 4. Jotkut kalvoproteiinien kvaternaarisen rakenteen määrittämiseen käytetyt silloitusreagenssit"