KULIAH
TOPIK: “Pengantar Histologi. Membran plasma, struktur dan fungsinya. Struktur yang dibentuk oleh membran plasma"
Histologi, jika diterjemahkan secara harafiah, adalah ilmu tentang jaringan, namun konsep ini tidak mengakomodasi sejumlah besar materi yang dicakup oleh disiplin ilmu kedokteran ini. Mata kuliah histologi diawali dengan kajian sitologi bukan pada tingkat optik cahaya melainkan pada tingkat molekuler, yang dalam pengobatan modern secara logis telah masuk ke dalam etiologi dan patogenesis sejumlah penyakit. Histologi juga mencakup bagian-bagian tersendiri dari mata kuliah embriologi, tentu saja tidak seluruhnya, melainkan bagian yang menyentuh masalah pembentukan dan diferensiasi primordia jaringan. Dan terakhir, histologi adalah bagian besar dari histologi privat, yaitu bagian yang mempelajari struktur dan fungsi berbagai organ. Bagian-bagian kursus histologi yang tercantum tidak meninggalkan keraguan bahwa studi disiplin kita harus dilakukan dalam aspek menjaga kesatuan tingkat organisasi seluler, jaringan, organ dan sistem.
Kita memulai histologi dengan mempelajari sel eukariotik, yang merupakan sistem paling sederhana yang memiliki kehidupan. Saat memeriksa sel di bawah mikroskop cahaya, kita memperoleh informasi tentang ukuran, bentuknya, dan informasi ini dikaitkan dengan adanya batas terikat membran dalam sel. Dengan berkembangnya mikroskop elektron (EM), gagasan kita tentang membran sebagai garis pemisah yang jelas antara sel dan lingkungan telah berubah, karena ternyata pada permukaan sel terdapat struktur kompleks yang terdiri dari berikut ini. 3 komponen:
1. Komponen supramembran (glikokaliks) (5-100 nm)
2. Membran plasma (8-10 nm)
3. Komponen submembran (zona variasi protein sitoskeletal)
Pada saat yang sama, komponen 1 dan 3 bersifat variabel dan bergantung pada jenis sel; struktur yang paling statis tampaknya adalah struktur membran plasma, yang akan kita pertimbangkan.
Studi tentang plasmalemma dalam kondisi EM menghasilkan kesimpulan bahwa organisasi strukturalnya seragam, di mana ia tampak seperti garis trilaminar, di mana lapisan dalam dan luarnya padat elektron, dan lapisan yang lebih luas yang terletak di antara keduanya tampak seperti plasmalemma. menjadi transparan elektron. Jenis organisasi struktural membran ini menunjukkan heterogenitas kimianya. Tanpa menyinggung pembahasan masalah ini, kami akan menetapkan bahwa plasmalemma terdiri dari tiga jenis zat: lipid, protein, dan karbohidrat.
Lemak, yang merupakan bagian dari membran, miliki sifat amfifilik karena adanya komposisi gugus hidrofilik dan hidrofobik.
Sifat amfipatik dari lipid membran mendorong pembentukan lapisan ganda lipid. Dalam hal ini, dua domain dibedakan dalam fosfolipid membran: a) fosfat– kepala molekul, sifat kimia domain ini menentukan kelarutannya dalam air dan disebut hidrofilik
B) rantai asil, yang merupakan asam lemak teresterifikasi – ini adalah domain hidrofobik.
Jenis lipid membran. 1. Kelas utama lipid dalam membran biologis adalah fosfo(gliserida) (fosfolipid), mereka membentuk kerangka
membran biologis (Gbr. 1).
Biomembran- ini adalah lapisan ganda lipid amfifilik(lapisan ganda lipid). Dalam lingkungan berair, molekul amfifilik tersebut secara spontan membentuk bilayer, di mana bagian hidrofobik molekul berorientasi satu sama lain, dan bagian hidrofilik berorientasi pada air (Gbr. 2).
Membran mengandung jenis lipid berikut:
1. Fosfolipid
2. Sphingolipid “kepala” + 2 “ekor” hidrofobik
3.Glikolipid
Kolesterol (CL)– terletak di membran terutama di zona tengah bilayer, bersifat amfifilik dan hidrofobik(kecuali satu gugus hidroksi). Komposisi lipid mempengaruhi sifat membran: rasio protein/lipid mendekati 1:1, namun selubung mielin diperkaya dengan lipid, dan membran internal diperkaya dengan protein.
Metode pengemasan lipid amfifilik: 1. Bilayers (membran lipid), 2. Liposom adalah vesikel dengan dua lapisan lipid, sedangkan permukaan dalam dan luarnya bersifat polar. 3. Misel - varian ketiga dari organisasi lipid amfifilik - vesikel, yang dindingnya dibentuk oleh satu lapisan lipid, sedangkan ujung hidrofobiknya menghadap ke pusat misel dan lingkungan internalnya tidak berair, tetapi hidrofobik.
Bentuk pengemasan molekul lipid yang paling umum adalah pembentukannya datar lapisan ganda membran. Liposom dan misel adalah bentuk transportasi cepat yang memastikan transfer zat masuk dan keluar sel. Dalam pengobatan, liposom digunakan untuk mengangkut zat yang larut dalam air, dan misel digunakan untuk mengangkut zat yang larut dalam lemak.
Protein membran:
1. Integral (termasuk dalam lapisan lipid)
2. Periferal
Integral (protein transmembran):
1. Monotopik- (misalnya, glikoforin. Mereka melintasi membran 1 kali), dan merupakan reseptor, sedangkan bagian luarnya - domain ekstraseluler - termasuk dalam bagian pengenalan molekul.
2. Politopik– berulang kali menembus membran – ini juga merupakan protein reseptor, tetapi mereka mengaktifkan jalur transmisi sinyal ke dalam sel.
Protein membran berhubungan dengan lipid.
4. Protein membran, berhubungan dengan karbohidrat.
Protein perifer – tidak terbenam dalam lapisan ganda lipid dan tidak terikat secara kovalen dengannya. Mereka disatukan oleh interaksi ionik. Protein perifer berikatan dengan protein integral di membran melalui interaksi - protein-protein interaksi.
Contoh protein ini:
1. Spektrin, yang terletak di permukaan bagian dalam sel
2. Fibronektin, terlokalisasi pada permukaan luar membran
Protein – biasanya mencapai 50% massa membran. Di mana
protein integral melakukan fungsi-fungsi berikut:
a) protein saluran ion
b) protein reseptor
2. Protein membran perifer(fibrillar, globular) melakukan fungsi berikut:
a) eksternal (protein reseptor dan adhesi)
b) internal – protein sitoskeleton (spektrin, ankyrin), protein dari sistem pembawa pesan kedua.
saluran ion– ini adalah saluran yang dibentuk oleh protein integral; mereka membentuk pori kecil di mana ion melewati gradien elektrokimia. Saluran yang paling terkenal adalah saluran Na, K, Ca 2, Cl.
Ada juga saluran air - ini dia aquaporin(eritrosit, ginjal, mata).
Komponen supramembran– glikokaliks, ketebalan 50 nm. Ini adalah daerah karbohidrat dari glikoprotein dan glikolipid yang memberikan muatan negatif. Di bawah EM terdapat lapisan longgar dengan kepadatan sedang yang menutupi permukaan luar plasmalemma. Selain komponen karbohidrat, glikokaliks mengandung protein membran perifer (semi integral). Area fungsionalnya terletak di zona supra-membran - ini adalah imunoglobulin (Gbr. 4).
Fungsi glikokaliks: 1. Memainkan peran reseptor.
2. Pengenalan antar sel.
3. Interaksi antar sel(interaksi perekat).
4.R reseptor histokompatibilitas.
5. Zona adsorpsi enzim(pencernaan parietal).
6. Reseptor hormon.
Komponen submembran atau zona terluar sitoplasma, biasanya memiliki kekakuan relatif dan zona ini sangat kaya akan filamen (d 5-10 nm). Diasumsikan bahwa protein integral yang menyusun membran sel secara langsung atau tidak langsung berhubungan dengan filamen aktin yang terletak di zona submembran. Pada saat yang sama, telah dibuktikan secara eksperimental bahwa selama agregasi protein integral, aktin dan miosin yang terletak di zona ini juga beragregasi, yang menunjukkan partisipasi filamen aktin dalam pengaturan bentuk sel.
Struktur yang dibentuk oleh plasmalemma
Kontur sel, bahkan pada tingkat cahaya-optik, tidak tampak rata dan halus, dan mikroskop elektron telah memungkinkan untuk mendeteksi dan mendeskripsikan berbagai struktur dalam sel yang mencerminkan sifat spesialisasi fungsionalnya. Struktur berikut ini dibedakan:
1. Mikrovili – penonjolan sitoplasma yang ditutupi plasmalemma. Sitoskeleton mikrovilus dibentuk oleh seikat mikrofilamen aktin, yang dijalin ke dalam jaringan terminal bagian apikal sel (Gbr. 5). Mikrovili tunggal tidak terlihat pada tingkat optik cahaya. Jika terdapat sejumlah besar (hingga 2000-3000) di bagian apikal sel, bahkan dengan mikroskop cahaya, “batas kuas” dapat dibedakan.
2. Bulu Mata – terletak di zona apikal sel dan memiliki dua bagian (Gbr. 6): a) bagian luar - aksonema
B) internal - tubuh becal
Aksonema terdiri dari kompleks mikrotubulus (9 + 1 pasang) dan protein terkait. Mikrotubulus dibentuk oleh protein tubulin, dan pegangannya dibentuk oleh protein dynein - protein ini bersama-sama membentuk transduser kemomekanis tubulin-dynein.
Tubuh dasar terdiri dari 9 kembar tiga mikrotubulus yang terletak di dasar silia dan berfungsi sebagai matriks pengorganisasian aksonema.
3. Labirin dasar- Ini adalah invaginasi dalam dari plasmalemma basal dengan mitokondria terletak di antara mereka. Ini adalah mekanisme penyerapan aktif air, serta ion melawan gradien konsentrasi.
1. Transportasi senyawa dengan berat molekul rendah dilakukan dengan tiga cara:
1. Difusi sederhana
2. Difusi yang difasilitasi
3. Transpor aktif
Difusi sederhana– senyawa organik hidrofobik dengan berat molekul rendah (asam lemak, urea) dan molekul netral (H2O, CO, O). Ketika perbedaan konsentrasi antara kompartemen yang dipisahkan oleh membran meningkat, laju difusi juga meningkat.
Difusi yang terfasilitasi– zat melewati membran juga searah dengan gradien konsentrasi, tetapi dengan bantuan protein transpor – translokasi. Ini adalah protein integral yang memiliki kekhususan untuk zat yang diangkut. Misalnya saluran anion (eritrosit), saluran K (plasmolemma sel tereksitasi) dan saluran Ca (retikulum sarkoplasma). Translokasi untuk H O itu adalah aquaporin.
Mekanisme kerja translokase:
1. Adanya saluran hidrofilik terbuka untuk zat dengan ukuran dan muatan tertentu.
2. Saluran terbuka hanya ketika ligan tertentu berikatan.
3. Tidak ada saluran seperti itu, dan molekul translokase itu sendiri, setelah mengikat ligan, berputar 180° pada bidang membran.
Transportasi aktif– ini adalah transpor yang menggunakan protein transpor yang sama (translokasi), tetapi melawan gradien konsentrasi. Gerakan ini memerlukan energi.
Saat ini, pengobatan yang dipersonalisasi dan metode pengaruh yang ditargetkan dan selektif pada molekul individu dan sistem sel yang bertanggung jawab atas perkembangan penyakit tertentu sedang dibahas secara aktif. Protein membran disorot sebagai kelas utama target terapi yang mungkin, karena mereka menyediakan transmisi sinyal langsung ke sel hidup. Dapat dicatat bahwa saat ini lebih dari separuh obat memiliki target pada membran sel, dan di masa depan hanya akan ada lebih banyak senyawa serupa.
Struktur membran plasma
Saya rasa banyak orang mengingat dari pelajaran biologi sekolah mereka bagaimana sel hidup bekerja. Dan tidak diragukan lagi, membran plasma menempati tempat khusus dalam struktur sel. Inilah yang memisahkan ruang intraseluler dari ruang ekstraseluler dan merupakan batas sel. Sesuai dengan gagasan ini, fungsi utama membran biologis adalah menciptakan penghalang antara ruang intraseluler “hidup” dan lingkungan. Yang terakhir ini secara kondisional dapat dianggap “tidak hidup” untuk organisme bersel tunggal, seperti bakteri. Sel-sel bakteri, archaea, jamur dan tumbuhan ditutupi di atas membran dengan cangkang yang lebih tahan lama dan kaku - dinding sel. Ini juga berfungsi untuk melindungi sel dari pengaruh luar. Namun, membran plasma mempunyai banyak fungsi lainnya.
Pada tahun 1925, I. Gorter dan A. Grendel menunjukkan bahwa membran sel merupakan lapisan ganda (bilayer) molekul lipid. Ciri utamanya adalah amfifilisitas, yaitu adanya dua bagian dalam molekul dengan sifat berbeda. Dengan demikian, “kepala” polar hidrofilik (secara harfiah ‘menyukai air’) dan rantai asil lipofilik (secara harfiah ‘menyukai lemak’) diisolasi. Ketika membran terbentuk, daerah lipofilik molekul menghadap ke dalam lapisan ganda, dan daerah hidrofilik menghadap ke luar. Skema organisasi membran ini khas untuk sebagian besar organisme, sehingga ada banyak biomolekul yang “ditargetkan” untuk berinteraksi langsung dengan lapisan ganda lipid. Perlu dicatat bahwa membran organel sel terbentuk menurut prinsip yang sama, tetapi komposisi lipid di dalamnya berbeda dengan membran plasma.
Pada tahun 1935, J. Danielli dan H. Dawson menunjukkan bahwa membran sel, selain lipid, mengandung protein. Inilah bagaimana model “sandwich” muncul, di mana membran plasma direpresentasikan sebagai dua lapisan protein, di antaranya terdapat lapisan ganda lipid. Model ini dikonfirmasi oleh percobaan pertama pada mikroskop elektron membran, sehingga pada tahun 1960 J. Robertson mendalilkan struktur tiga lapisan yang sama untuk semua membran sel hidup.
Namun, model ini tidak dapat menjelaskan akumulasi data eksperimen, dan pada tahun 1972, S. D. Singer dan G. L. Nicholson mengusulkan model mosaik fluida pada membran, di mana protein membran “mengambang” dalam lapisan ganda lipid cair, seperti gunung es di laut terbuka. Diasumsikan bahwa protein tidak tersusun dengan cara apapun dan dapat bergerak bebas di dalam membran. Protein, menurut model ini, dapat berinteraksi dengan permukaan membran dan karena itu terletak di satu sisinya (protein perifer), atau menembus membran melalui (protein membran integral). Dengan demikian, yang terakhir memiliki kemampuan untuk berinteraksi baik dengan lingkungan ekstraseluler dan dengan sitoplasma sel. Kadang-kadang protein semi-integral juga diisolasi, sebagian terbenam dalam membran, tetapi tidak menembusnya.
Namun demikian, model pengorganisasian membran biologis yang sedemikian kompleks memerlukan klarifikasi ketika konsep rakit lipid dikembangkan pada tahun 1980-an. Istilah “rakit lipid” pertama kali diusulkan pada tahun 1988 oleh K. Simons dan G. van Meer untuk menggambarkan area terisolasi dari lipid yang padat. Saat ini, keberadaan domain lipid (yaitu daerah dengan serangkaian sifat tertentu) pada membran plasma telah dikonfirmasi oleh sejumlah besar penelitian. Telah terbukti bahwa pembentukannya antara lain ditentukan oleh protein yang terletak di bagian membran yang bersangkutan. Oleh karena itu, protein membran tidak tersebar secara acak di permukaan sel, namun menempati area tertentu di mana struktur yang sangat teratur dapat dicapai.
Protein membran
Kita harus memahami bahwa sel hidup tidak memiliki organ indera kita yang biasa, yang terdiri dari jenis sel tertentu. Namun, sama seperti Anda dan saya, sel perlu berinteraksi dengan lingkungannya. Namun, untuk beberapa pengaruh, misalnya pada cahaya atau molekul lipofilik kecil, membran plasma tidak menjadi kendala, sehingga dapat berinteraksi langsung dengan protein intraseluler. Perlu diingat di sini bahwa sebagai respons terhadap pengaruh eksternal, rangkaian reaksi kimia terjadi di dalam sel, yang berakhir, misalnya, dengan dimulainya produksi protein tertentu atau peluncuran program kehidupan sel tertentu. Jadi, sebagai respons terhadap pengaruh tertentu, sel dapat melepaskan hormon atau enzim ke lingkungan luar, memulai pembelahan, atau bahkan meluncurkan mekanisme terprogram untuk kematiannya sendiri - apoptosis. Ini tidak semuanya merupakan jawaban yang mungkin, namun semuanya memiliki prinsip umum yang memicu serangkaian transformasi kimia di ruang intraseluler.
Selain itu, untuk mempertahankan kehidupan, diperlukan pengangkutan zat secara konstan melalui membran. Karena terdapat banyak sinyal eksternal berbeda yang harus dapat direspon oleh sel, berbagai macam protein membran berbeda terdapat pada permukaannya. Diantaranya adalah reseptor, saluran ion, porin, transporter, motor molekuler dan protein struktural. Protein reseptor membentuk sinyal di dalam sel sebagai respons terhadap kemunculan hormon dan molekul pemberi sinyal di luar sel. Ini termasuk, misalnya, reseptor insulin, yang bertanggung jawab atas masuknya glukosa ke dalam sel. Saluran ion menyediakan pengangkutan ion dan pemeliharaan gradien (yaitu perbedaan konsentrasi) konsentrasinya antara lingkungan luar dan sitoplasma sel. Saluran natrium dan kalium terlibat langsung dalam transmisi impuls saraf. Porin dan transporter memediasi pengangkutan air dan molekul tertentu melintasi membran. Motor molekuler terdapat pada banyak bakteri dan memberikan motilitas sel. Terakhir, protein struktural mempertahankan struktur membran dan berinteraksi dengan protein lain. Yang tidak kalah rumitnya adalah jaringan jalur pensinyalan intraseluler melalui kaskade reaksi. Bidang ilmiah khusus yang disebut interkomik berkaitan dengan interaksi protein dalam sel dan, karenanya, jalur transmisi sinyal. interaksi- 'interaksi').
Membran sebagai media interaksi protein
Berbagai kelas protein membran dan distribusinya dalam membran plasma telah dijelaskan di atas. Gagasan yang ada tentang struktur membran menunjukkan bahwa domain terpisah terbentuk pada permukaan sel, mengandung sekumpulan protein dan lipid tertentu dan dirancang untuk melakukan fungsi tertentu. Pemisahan spasial seperti itu mungkin diperlukan karena rumitnya organisasi proses interaksi antarmolekul dan pengaturan aktivitas vital sel hidup. Secara alami, protein tidak bekerja sendiri. Banyak dari mereka tidak dapat menjalankan fungsinya tanpa pasangannya. Gangguan pada mekanisme kompleks ini dapat menyebabkan sel mulai memberikan respons yang salah terhadap sinyal eksternal. Hal ini mengarah pada berkembangnya penyakit serius seperti kanker dan diabetes, serta sejumlah penyakit lainnya. Untuk mengobatinya, kita harus memahami cara kerja sistem sinyal sel ini dan bagaimana kita dapat memengaruhinya. Alam sendiri memberi kita banyak alat untuk melakukan tindakan seperti itu: molekul hormon, serta racun dari berbagai racun, mampu secara tepat memilih targetnya di permukaan membran plasma.
Namun, mereka tidak selalu dapat digunakan dalam bentuk aslinya, jadi salah satu tugas biologi molekuler modern adalah pengembangan senyawa termodifikasi baru yang akan selektif bekerja pada target membran dan pada saat yang sama bebas dari kelemahan molekul alami aslinya. . Studi semacam itu memerlukan pemahaman tidak hanya tentang mekanisme pengenalan antara target dan agen terapeutik, tetapi juga semua hal spesifik dari organisasi timbal balik protein membran dan membran secara keseluruhan.
Kita harus memahami bahwa membran bukan hanya sekedar matriks inert yang diperlukan agar protein dapat menetap dan bekerja di dalamnya. Membran merupakan lingkungan yang sangat aktif dan dinamis yang secara signifikan mempengaruhi fungsi protein yang terkandung di dalamnya. Hal ini membuka cara baru untuk mempengaruhi protein membran dengan mengubah sifat lapisan ganda lipid itu sendiri. Yang juga sangat penting adalah interaksi antara domain transmembran protein. Ini menentukan organisasi yang tepat dan berfungsinya sejumlah besar sistem sel vital. Oleh karena itu, kita harus mempunyai pemahaman tidak hanya tentang fungsi protein spesifik, tetapi juga tentang hubungan apa yang ada antara kerja mereka dan sifat-sifat membran. Hasil pertama ke arah ini telah diperoleh, namun pada tahap ini kita belum memiliki gambaran lengkap tentang fungsi membran sel.
Sistem reseptor sel
Di antara semua protein membran yang disebutkan di atas, reseptor menempati posisi khusus. Mereka memastikan transmisi informasi melintasi membran plasma ke dalam sel. Pada organisme multiseluler (dan pada banyak bakteri yang membentuk koloni), informasi ditransfer antar sel menggunakan molekul pemberi sinyal khusus yang dilepaskan ke lingkungan luar. Di antara molekul pemberi sinyal ini terdapat hormon – molekul protein yang disekresikan (dilepaskan) secara khusus di organ khusus. Senyawa non-protein dan bahkan ion yang terbentuk atau dilepaskan, misalnya ketika sel tetangganya rusak, juga dapat bertindak sebagai molekul pemberi sinyal. Beginilah cara transmisi sinyal nyeri diatur, yang melakukan fungsi perlindungan paling penting dalam tubuh. Reseptor secara spesifik mengenali sinyal (molekul ligan) yang muncul di ruang ekstraseluler dan memicu serangkaian reaksi sebagai respons terhadap sinyal tersebut. Dua kelas utama reseptor dapat dibedakan: Reseptor berpasangan protein G (GPCR) dan reseptor tirosin kinase (RTK).
Reseptor tirosin kinase adalah kelas besar protein membran. Ini termasuk reseptor untuk sejumlah faktor pertumbuhan dan hormon. Salah satu protein paling terkenal dari kelas ini adalah reseptor insulin. Tanpanya, pengangkutan glukosa yang terkontrol dalam sel tidak mungkin terjadi, dan gangguan pada fungsi protein ini menyebabkan perkembangan diabetes tipe II. Reseptor faktor pertumbuhan epidermis tampaknya menjadi lebih penting karena mereka mengatur siklus sel. Fungsinya yang tidak tepat sering kali menyebabkan perkembangan kanker. Sebagian besar reseptor ini memiliki struktur yang tampaknya sangat sederhana: satu domain ekstraseluler, satu heliks alfa transmembran, dan satu domain sitoplasma kinase. Namun, tidak semuanya sesederhana itu, dan RTK tidak bekerja sendiri. Untuk mengaktifkannya, mereka perlu membentuk pasangan (atau, dalam istilah ilmiah, dimer). Hormon atau faktor pertumbuhan berinteraksi dengan domain ekstraseluler RTK dan mendorong dimerisasinya, yaitu pembentukan dimer dengan reseptor kedua yang serupa. Setelah ini, dimerisasi terjadi pada domain transmembran dan kinase. Akibatnya, dimer domain kinase menjadi titik awal serangkaian reaksi kimia. Hanya gambaran umum tentang mekanisme kerja RTK yang dijelaskan di sini, karena rincian proses ini cukup rumit dan belum sepenuhnya dipahami bahkan hingga saat ini.
GPCR termasuk rhodopsin visual, reseptor rasa, reseptor bau, dan banyak lainnya. Ini adalah molekul besar yang terintegrasi ke dalam membran plasma. Mereka mengandung tujuh heliks alfa transmembran yang menjangkau membran seperti pilar. Menanggapi pengikatan ligan di luar membran, protein ini mengalami penataan ulang konformasi sedemikian rupa sehingga mulai berinteraksi dengan protein G yang terletak di dekat permukaan bagian dalam membran plasma. Dalam hal ini, sinyal asli dapat diperkuat, karena reseptor yang diaktifkan dapat mengaktifkan beberapa molekul protein G.
Target farmakologis
Pada bagian sebelumnya kita telah membahas tentang sistem reseptor sel. Karena sebagian besar sinyal melewatinya, inilah titik-titik yang dapat kita pengaruhi dengan bantuan agen farmakologis. Memang benar, lebih dari separuh obat yang ada “menargetkan” protein membran. Mereka dapat memblokir pengikatannya pada ligan yang sesuai atau, sebaliknya, menyebabkan aktivasi dan transmisi sinyal yang sesuai. Target tradisional kedua untuk obat-obatan dan racun alami adalah saluran ion.
Masalah utama di sini adalah terciptanya senyawa obat yang memiliki selektivitas sangat tinggi, yaitu selektif mempengaruhi hanya satu jenis reseptor atau bahkan subtipe tertentu. Hal ini memungkinkan, misalnya, untuk mempengaruhi hanya jenis sel tertentu dalam tubuh, karena dalam sel yang berbeda, bergantung pada spesialisasinya, reseptor yang sedikit berbeda mungkin terdapat pada membran. Dan tindakan selektif hanya pada subtipe tertentu saja yang dapat, misalnya, membantu memisahkan sel tumor dari sel sehat.
Properti ini saat ini digunakan dalam konsep pembuatan struktur modular, ketika agen farmakologis terdiri dari beberapa molekul (atau bahkan nanopartikel) yang digabungkan (“berhubungan silang”) satu sama lain. Dalam hal ini, dimungkinkan untuk menggabungkan beberapa bagian dengan fungsi berbeda dalam satu obat. Dengan demikian, dimungkinkan untuk membuat bagian “penargetan” yang mengenali reseptor tertentu pada permukaan sel yang terkait, misalnya dengan perkembangan kanker. Agen litik membran (yaitu, penghancur membran) atau penghambat proses transkripsi atau translasi yang menembus membran ditambahkan ke dalamnya (yaitu, proses produksi protein dalam sel dihentikan). Hasilnya adalah agen farmakologis yang sangat efektif dengan efek samping yang minimal. Obat generasi baru yang pertama sudah menjalani uji klinis dan akan segera digunakan untuk terapi yang sangat efektif.
Kimia biologi Lelevich Vladimir Valeryanovich
Protein membran.
Protein membran.
Protein membran bertanggung jawab atas aktivitas fungsional membran dan menyumbang 30 hingga 70%. Protein membran berbeda dalam posisinya dalam membran. Mereka dapat menembus jauh ke dalam lapisan ganda lipid atau bahkan menembusnya - protein integral, menempel pada membran dengan berbagai cara - protein permukaan, atau melakukan kontak kovalen dengannya - protein berlabuh. Protein permukaan hampir selalu mengalami glikosilasi. Residu oligosakarida melindungi protein dari proteolisis dan terlibat dalam pengenalan dan adhesi ligan.
Protein yang terlokalisasi di membran melakukan fungsi struktural dan spesifik:
1. transportasi;
2. enzimatik;
3. reseptor;
4. antigenik.
Dari buku Bikin Siapa Saja, Tapi BUKAN BUAYA! oleh Orsag MihaiBagaimana dengan tupai? Pada tahun enam puluhan, saya berulang kali mencoba memelihara tupai di rumah, tetapi setiap upaya tersebut berakhir dengan cara yang paling menyedihkan. Setelah beberapa waktu, tupai-tupai itu melemah, anggota belakang mereka diambil dan hewan-hewan malang itu mati karena kejang-kejang. Pada awalnya saya
Dari buku The Human Genome: An Encyclopedia Ditulis dalam Empat Huruf pengarang Dari buku The Human Genome [Ensiklopedia ditulis dalam empat huruf] pengarang Tarantul Vyacheslav ZalmanovichTidak semua gen mengkode protein Pertama-tama, perlu dicatat bahwa selain gen yang mengkode protein, genom juga mengandung gen yang mensintesis RNA, yang bukan mRNA (yaitu, tidak mengkode protein), tetapi melakukan sejumlah proses independen. fungsi penting dalam sel. DI DALAM
Dari buku Jam Hidup oleh Ward Richie11. Tupai dalam Roda Untuk mengenal pencarian modern untuk memecahkan masalah jam hidup, mari kita beralih ke penelitian yang dilakukan oleh para ahli biologi dalam beberapa tahun terakhir. Di antara yang pertama, mungkin, adalah karya Patricia de Courcy. Pada tahun 1955, de Courcy menerima diploma
Dari buku Biologi [Buku Referensi Lengkap Persiapan Ujian Negara Bersatu] pengarang Lerner Georgy Isaakovich Dari buku Darah: Sungai Kehidupan [Dari legenda kuno hingga penemuan ilmiah] oleh Isaac AsimovBab 11 Protein Bergerak Ini Pada awal bab sebelumnya saya telah menyebutkan bahwa komponen organik makanan dibagi menjadi tiga kelompok. Saya berbicara tentang salah satu kelompok ini: karbohidrat. Selanjutnya, masuk akal untuk beralih ke protein, karena metabolisme mereka di dalam tubuh terjadi secara paralel
Dari buku Logic of Chance [Tentang Hakikat dan Asal Usul Evolusi Biologis] pengarang Kunin Evgeniy ViktorovichBab 12 Asal usul kehidupan. Munculnya translasi, replikasi, metabolisme dan membran: pendekatan biologis, geokimia dan kosmologis Trans. A. Neizvestny Pada bab sebelumnya kita membahas kemungkinan skenario munculnya sel dan (mudah-mudahan) tercapai
Dari buku Gen dan Perkembangan Tubuh pengarang Neyfakh Alexander Alexandrovich2. Protein kromatin Kita telah mengetahui bahwa kromatin terdiri dari DNA dan histon dalam jumlah berat yang sama dan protein non-histon (NGP), yang di daerah kromosom tidak aktif hanya terdapat 0,2 berat DNA, dan di daerah aktif - lebih dari 1,2 (rata-rata NGB lebih kecil dari DNA). Kita juga tahu bahwa histones
Dari buku Dunia Hewan pengarang Sitnikov Vitaly Pavlovich Dari buku Keadaan Biosfer dan Kebijakan Lingkungan Saat Ini penulis Kolesnik Yu.4.1. Pembentukan membran merupakan dasar permulaan kehidupan. Mengingat betapa besarnya keanekaragaman organisme hidup modern, kita dapat sampai pada kesimpulan bahwa ada banyak jalur perkembangan yang berasal dari bentuk kehidupan peninggalan. Faktanya, studi tentang evolusi molekuler
Dari buku Rahasia Keturunan Manusia pengarang Afonkin Sergey YurievichSel, Protein dan Gen Kehidupan adalah cara keberadaan tubuh protein. F. Engels Tubuh kita adalah kerajaan sel, yang masing-masing merupakan pabrik mini untuk produksi protein. Banyak dari makromolekul penting ini dapat dikeluarkan dari tubuh
Dari buku Antropologi dan Konsep Biologi pengarang Kurchanov Nikolay AnatolievichProtein Protein sangat penting dalam kehidupan organisme. Besarnya keanekaragaman makhluk hidup sangat ditentukan oleh perbedaan komposisi protein yang ada dalam tubuhnya. Misalnya, lebih dari 5 juta di antaranya diketahui dalam tubuh manusia. Protein adalah polimer.
Dari buku Kimia Biologi pengarang Lelevich Vladimir ValeryanovichKomposisi kimia membran. Membran terdiri dari molekul lipid dan protein, yang jumlah relatifnya sangat bervariasi antar membran. Karbohidrat terkandung dalam bentuk glikoprotein, glikolipid dan menyusun 0,5%-10% zat membran. Menurut mosaik cair
Dari buku penulisLipid membran. Lipid membran adalah molekul amfifilik, mis. molekulnya mengandung gugus hidrofilik (kepala polar) dan radikal alifatik (ekor hidrofobik), yang secara spontan membentuk lapisan ganda di mana ekor lipid saling berhadapan. Ketebalan
Dari buku penulisProtein Nilai gizi protein dijamin oleh adanya asam amino esensial, yang kerangka hidrokarbonnya tidak dapat disintesis dalam tubuh manusia, dan oleh karena itu harus disuplai dengan makanan. Mereka juga merupakan sumber utama nitrogen. Tunjangan harian
Dari buku penulisProtein jaringan otot Ada tiga kelompok protein: 1. protein miofibrillar – 45%;2. protein sarkoplasma – 35%;3. protein stroma – 20%. Protein miofibrilar. miosin; 2. aktin;3. actomyosin; serta apa yang disebut protein pengatur: 4. tropomiosin;5.
Klasifikasi
Protein membran dapat diklasifikasikan menurut prinsip topologi atau biokimia. Klasifikasi topologi didasarkan pada lokalisasi protein relatif terhadap lapisan ganda lipid. Klasifikasi biokimia didasarkan pada kekuatan interaksi protein dengan membran.
Berbagai kategori protein politopik. Pengikatan membran karena (1) heliks alfa transmembran tunggal, (2) heliks alfa transmembran ganda, (3) struktur lembaran beta.
Berbagai kategori protein monotopik integral. Pengikatan pada membran karena (1) alfa-heliks amfipatik yang sejajar dengan bidang membran, (2) loop hidrofobik, (3) residu asam lemak yang terikat secara kovalen, (4) interaksi elektrostatik (langsung atau dimediasi kalsium) ).
Klasifikasi topologi
Sehubungan dengan membran, protein membran dibagi menjadi poli dan monotopik.
- Protein politopik, atau transmembran sepenuhnya menembus membran dan dengan demikian berinteraksi dengan kedua sisi lapisan ganda lipid. Biasanya, fragmen transmembran suatu protein adalah heliks alfa yang terdiri dari asam amino hidrofobik (mungkin 1 hingga 20 fragmen tersebut). Hanya pada bakteri, serta pada mitokondria dan kloroplas, fragmen transmembran dapat disusun sebagai struktur lembaran beta (dari 8 hingga 22 putaran rantai polipeptida).
- Protein monotopik integral tertanam secara permanen dalam lapisan ganda lipid, tetapi terhubung ke membran hanya pada satu sisi, tanpa menembus sisi yang berlawanan.
Klasifikasi biokimia
Menurut klasifikasi biokimia, protein membran dibagi menjadi integral Dan periferal.
- Protein membran integral tertanam kuat dalam membran dan dapat dihilangkan dari lingkungan lipid hanya dengan bantuan deterjen atau pelarut non-polar. Sehubungan dengan lapisan ganda lipid, protein integral dapat berupa politopik transmembran atau monotopik integral.
- Protein membran perifer adalah protein monotopik. Mereka terikat lemah pada membran lipid atau berasosiasi dengan protein integral karena gaya hidrofobik, elektrostatik, atau non-kovalen lainnya. Jadi, tidak seperti protein integral, mereka berdisosiasi dari membran ketika diolah dengan larutan berair yang sesuai (misalnya, pH rendah atau tinggi, konsentrasi garam tinggi, atau zat chaotropic). Disosiasi ini tidak memerlukan gangguan membran.
Protein membran dapat diintegrasikan ke dalam membran karena residu asam lemak atau prenil atau glikosilfosfatidilinositol yang melekat pada protein selama modifikasi pasca-translasi.
Tautan
Yayasan Wikimedia. 2010.
: karakteristik dan prinsip struktur
1. Struktur protein membran
Peran utama lipid dalam membran adalah menstabilkan struktur bilayer, dan protein adalah komponen aktif biomembran. Kita akan membahas beberapa prinsip yang telah terbukti berguna dalam menjelaskan ciri struktural protein membran. Kami akan memberikan contoh untuk menggambarkan prinsip-prinsip ini.
Pada awal perkembangan membranologi, diyakini bahwa protein membran memiliki struktur yang cukup homogen dan tersusun dalam 3 lapisan pada permukaan bilayer. Sekarang kita lebih cenderung percaya bahwa, setidaknya untuk protein transmembran, bagian-bagiannya yang terbenam dalam membran mengandung heliks α. Tentu saja, saya sangat ingin menarik kesimpulan yang jelas mengenai masalah ini, tetapi kesimpulan tersebut harus didasarkan pada data faktual. Mengingat keragaman struktural yang sangat besar dari protein terlarut, kita sampai pada kesimpulan bahwa protein membran integral mungkin jauh lebih kompleks daripada yang kita bayangkan saat ini. Klasifikasi protein larut berdasarkan jenis struktur dilakukan hanya setelah struktur lebih dari 100 protein berbeda ditentukan pada resolusi tinggi. Sedangkan untuk protein transmembran, ini dilakukan hanya dalam satu kasus - untuk protein dari pusat reaksi fotosintesis bakteri. Bersama dengan data mikroskop elektron resolusi rendah mengenai struktur bakteriorhodopsin, ini adalah satu-satunya sumber yang menjadi dasar model sebagian besar protein transmembran lainnya.
Poin penting lainnya adalah metode pelekatan protein pada membran. Mereka ditunjukkan secara skematis pada Gambar. 3.1.
1. Mengikat dengan protein yang direndam dalam bilayer. Contohnya termasuk bagian Fi dari H + -ATPase, yang berikatan dengan bagian Fo yang tertanam dalam membran; Beberapa protein sitoskeletal juga dapat disebutkan.
2. Mengikat permukaan bilayer. Interaksi ini terutama bersifat elektrostatik atau hidrofobik. Pada permukaan beberapa protein membran terdapat domain hidrofobik yang terbentuk karena ciri struktur sekunder atau tersier. Interaksi permukaan ini dapat digunakan sebagai tambahan pada interaksi lainnya, seperti penahan transmembran.
3. Mengikat menggunakan “jangkar” hidrofobik; struktur ini biasanya terungkap sebagai rangkaian residu asam amino non-polar. Beberapa protein membran menggunakan asam lemak atau fosfolipid yang terikat secara kovalen sebagai jangkar.
4. Protein transmembran. Beberapa dari mereka melintasi membran hanya sekali, yang lain beberapa kali.
Perbedaan antara protein membran luar dan dalam tidak secara unik menentukan metode perlekatannya pada bilayer; perbedaan-perbedaan ini hanya menentukan kekuatan relatif dari ikatannya.
2. Pemurnian protein membran
Untuk memurnikan protein membran integral dan memperolehnya dalam bentuk yang aktif secara biokimia, diperlukan deterjen untuk melarutkan protein dan mengawetkannya dalam larutan. Persyaratan dan penanganan deterjen yang terkait menimbulkan tantangan tambahan di luar tantangan yang biasanya dihadapi dalam pemurnian protein. Banyak metode spesifik telah dikembangkan untuk isolasi protein membran integral, namun sebagian besar skema pemurnian didasarkan pada teknik kromatografi dan hidrodinamik yang sama dengan yang digunakan untuk protein larut. Ini adalah kromatografi pada DEAE-selulosa, Sepharose atau hidroksilpatit, filtrasi gel, sentrifugasi dalam gradien kepadatan sukrosa, dll. Pilihan deterjen yang tepat sangat penting, karena deterjenlah yang menghancurkan biomembran, menggantikan lipid. mengelilingi protein tertentu, dan menentukan stabilitas protein dalam larutan. Mekanisme kerja deterjen dibahas dalam ulasan ini.
2.1. DETERJEN
Selama dua dekade terakhir, sejumlah besar deterjen yang cocok untuk pemurnian protein membran integral telah tersedia. Pada prinsipnya, seseorang harus mencoba menemukan deterjen yang tidak akan mengganggu struktur sekunder dan tersier protein membran, namun hanya akan menggantikan sebagian besar atau seluruh lipid membran yang bersentuhan dengan daerah hidrofobik molekul protein. Tujuan akhir dari pelarutan adalah untuk memasukkan protein ke dalam misel deterjen; strategi pemurnian selanjutnya adalah memisahkan kompleks protein-deterjen tersebut.
Masalah pertama adalah pemilihan kondisi optimal untuk pelarutan protein yang diteliti. Deterjen yang mendenaturasi protein tidak cocok untuk tugas rumit ini. Di sisi lain, banyak deterjen tidak secara efektif merusak membran dan membentuk misel campuran yang mengandung protein. Deterjen tersebut mungkin terlalu hidrofobik atau terlalu hidrofilik untuk bercampur secara efektif dengan lipid membran dan, jika konsentrasinya cukup tinggi, mengubah lapisan ganda menjadi misel campuran globular. Pada awalnya, pemilihan deterjen yang dibutuhkan diharapkan dapat disistematisasikan dengan menggunakan parameter tunggal yang disebut keseimbangan hidrofilik-lipofilik. Parameter ini, bervariasi dari 1 hingga 20, digunakan dalam pembuatan surfaktan sebagai ukuran hidrofobisitas relatif. Memang benar, beberapa korelasi telah diperoleh, sehingga nilai HLB suatu deterjen dapat digunakan untuk memprediksi perilakunya dalam sistem biologis. Secara umum deterjen dengan nilai HLB pada kisaran 12,5 hingga 14,5 dapat dikatakan sebagai pelarut paling efektif untuk protein membran integral. Namun, kemudian menjadi jelas bahwa pencarian deterjen optimal untuk protein membran tertentu memerlukan pertimbangan banyak faktor dan harus selalu disertai dengan pengujian empiris. Hal-hal berikut ini harus diperhatikan.
1. Kelarutan maksimum protein yang diteliti. Kriterianya adalah transfer protein ke supernatan setelah sentrifugasi, di mana membran mengendap.
2.Solubilisasi protein dalam bentuk yang diinginkan. Biasanya kita berbicara tentang mempertahankan aktivitas enzimatiknya, tetapi kadang-kadang karakteristik spektral tertentu atau keberadaan protein tertentu digunakan. Selain itu, stabilitas protein setelah pelarutan merupakan prasyarat. Dalam beberapa kasus, fosfolipid eksogen ditambahkan bersama dengan deterjen untuk mempertahankan aktivitas biokimia. Contohnya adalah produksi E. coli laktosa permease dan protein saluran natrium. Gliserol atau poliol lain kadang-kadang ditambahkan untuk menstabilkan protein setelah pelarutan. Masuk akal juga untuk menggunakan inhibitor protease dan melakukan pelarutan dalam kondisi yang meminimalkan kemungkinan degradasi proteolitiknya.
3. Kemungkinan penggunaan deterjen dalam teknik ini. Pertama-tama perlu memperhitungkan muatan deterjen, perilaku pada nilai pH tertentu, CMC dan ukuran misel deterjen. Properti yang terakhir ini sangat penting. Deterjen CMC rendah yang membentuk misel besar tidak dihilangkan dengan dialisis atau ultrafiltrasi karena konsentrasi monomer deterjen terlalu rendah. Secara praktis, ini berarti bahwa jika suatu protein dipekatkan dengan ultrafiltrasi, konsentrasi deterjen CMC rendah juga akan meningkat, yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Oleh karena itu, banyak peneliti lebih memilih menggunakan deterjen dengan CMC tinggi, seperti oktil glukosida, garam empedu, atau deterjen zwitterionic yang lebih modern. Resin polistiren, seperti Biobidz SM-2, sangat berharga. Mereka secara selektif mengikat deterjen seperti Triton X-100, menghilangkannya dari larutan dan memungkinkan untuk dilakukan tanpa dialisis sama sekali. Faktor lain yang perlu dipertimbangkan adalah penyerapan cahaya deterjen. Beberapa deterjen, seperti Triton X-100, menyerap di wilayah dekat UV, sehingga tidak mungkin menentukan konsentrasi protein dengan mengukur serapan pada 280 nm.
Dengan mempertimbangkan semua faktor ini, menjadi jelas mengapa dalam banyak kasus perlu menggunakan deterjen yang berbeda ketika mengisolasi protein membran integral. Misalnya, Triton X-100 dapat digunakan untuk pelarutan, namun pemisahan dengan DEAE-selulosa paling baik dilakukan dengan adanya oktil glukosida. Deterjen dapat diubah pada tahap kromatografi, selama sentrifugasi gradien densitas, dan dalam beberapa kasus melalui dialisis. Perlu diingat bahwa deterjen yang tidak cocok untuk melarutkan protein tertentu mungkin sangat efektif dalam mempertahankan protein dalam larutan setelah penggantian deterjen. Pemurnian hampir selalu harus dilakukan dengan deterjen berlebih dalam larutan, jika tidak, keseimbangan akan bergeser ke arah agregasi protein membran daripada pembentukan kompleks protein-deterjen. Dalam beberapa kasus, agregasi seperti itu mungkin diinginkan, dan langkah pemurnian terakhir mungkin adalah menghilangkan deterjen. Namun, sebagai suatu peraturan, dengan kurangnya deterjen, terjadi pengendapan yang tidak dapat diubah dan hilangnya protein.
Kebutuhan untuk mempertahankan konsentrasi deterjen pada tingkat tertentu menciptakan kesulitan tambahan di luar kesulitan yang biasa dihadapi dalam pemurnian protein; Kami telah membicarakan beberapa di antaranya. Masalah juga muncul ketika menggunakan metode penggaraman standar pada konsentrasi amonium sulfat yang tinggi: dalam banyak kasus, protein diendapkan dalam kombinasi dengan deterjen dan lipid. Karena larutan garam memiliki kepadatan yang tinggi, dan deterjen dalam agregat relatif rendah, selama sentrifugasi, endapan akan tetap berada di permukaan. Penting untuk diingat bahwa kompleks protein-deterjen harus dimurnikan, seringkali dengan sejumlah besar fosfolipid terikat. Hal ini mempengaruhi kualitas pemisahan selama kromatografi, serta hasil karakterisasi protein akhir yang larut; perlu untuk menentukan jumlah dan berat molekul subunit polipeptida, stoikiometrinya, ukuran dan, mungkin, bentuk subunitnya; molekul, serta, jika perlu, aktivitas biokimia.
Deterjen 1 Di meja Tabel 1 dan 2 mencantumkan deterjen yang paling banyak digunakan dan menunjukkan sifat-sifatnya yang penting bagi permasalahan yang sedang kita diskusikan. Secara empiris yang paling efektif adalah: 1) deterjen nonionik (Triton X-100, oktil glukosida); 2) garam empedu (kolat, deoksikolat); 3) deterjen zwitterionic (CHAPS, zvnttergent). Namun pemilihan deterjen yang paling cocok untuk melarutkan dan memurnikan enzim membran tertentu masih merupakan masalah trial and error. |
CMC, mm | berat mol | 1 Ukuran A mncella | .gregasi adalah nomor | x Volume spesifik, ml/g | Tautan |
| Dolesil sulfat | 1,33 | 288 | 24 500 | 85 | 0,864 | |
| sodium | ||||||
| natrium kolat" | 3 | 408 | 2100 | 5 | 0,778 | (612, 1383] |
| Deoksikolat | 0,91 | 392 | 23 000 | 55 | 0,771 | |
| sodium" | ||||||
| 0,11 | 538 | 68 000 | 12 | 0,973 | ||
| Tritoi X-100 2) | 0,24 | 628 | 90 000 | 140 | 0,908 | |
| Kembar 80 2) | 0,012 | 1300 | 76 000 | 60 | 0,8% | |
| Lauryldimetil- | 2,2 | 229 | 17 000 | 75 | 1,112 | |612] |
| oksida amina | ||||||
| ^-D-Oktil- | 25 | 293 | 8000 | 27 | 0,820 | |
| ^-D-Lauryl- | 0,16 | 510 | 50 000 | 98 | 0,820 | |
| maltosida | ||||||
| BAB | 8 | 615 | 6150 | 10 | 0,802 | |
| Zwittergeit | 3,6 | 335 | - | - | 0,957 |
3. KARAKTERISTIK PROTEIN MEMBRAN INTEGRAL YANG DIMURNIKAN
Karakterisasi protein membran yang dimurnikan, bahkan yang paling sederhana sekalipun, dapat menjadi tantangan. Seperti dalam kasus ini
3.1 BERAT MOLEKULER SUBUNIT
Elektroforesis gel poliakrilamida dengan adanya natrium dodesil sulfat adalah teknik yang umum, tetapi dalam kasus protein membran integral, hal ini menimbulkan masalah khusus. Dalam metode ini, dodesil sulfat digabungkan dengan rantai polipeptida dan kompleks protein-DNS dipisahkan dalam gel poliakrilamida menurut jari-jari Stokesnya, yang dalam banyak kasus bergantung pada berat molekul. Massa molekul ditentukan dengan membandingkan mobilitas elektroforesis suatu kompleks tertentu dan standar yang diketahui. Namun, pengikatan SDS ke protein yang tidak diketahui mungkin berbeda secara kualitatif dari pengikatan pada protein standar, dan kemudian akan diperoleh hasil yang salah. Situasi serupa diamati untuk protein membran integral dengan kandungan residu asam amino nonpolar yang tinggi. SDS membentuk kompleks dengan sebagian besar protein terlarut dengan perbandingan 1,4 g SDS per 1 g protein, dan lebih banyak deterjen dapat mengikat protein yang mengandung sebagian besar residu non-polar. Muatan negatif tambahan yang timbul dalam hal ini menyebabkan peningkatan mobilitas elektroforesis yang tidak normal, dan berat molekul yang ditentukan ternyata lebih kecil dari yang sebenarnya. Situasi lain juga mungkin terjadi. Protein membran yang berikatan dengan SDS mungkin tidak terbuka sepenuhnya, yang juga akan menyebabkan peningkatan mobilitas elektroforesis yang tidak normal karena pembentukan kompleks protein-SDS yang lebih kompak. Semua dampak ini cukup signifikan. Misalnya, laktosa permease mempunyai mol yang tampak. massa 33.000 bila diukur dengan PAGE dengan adanya SDS; kenyataannya, seperti yang ditunjukkan oleh hasil analisis genetik, katanya. massanya adalah 46.000. Dalam banyak kasus, berat molekul dapat diperkirakan secara lebih akurat dengan membuat plot Ferguson, yang mewakili ketergantungan mobilitas elektroforesis pada kandungan akrilamida untuk protein standar dan protein yang sedang dipelajari. Grafik ini bergantung pada jari-jari Stokes dan, pada tingkat lebih rendah, pada muatan kompleks. Misalnya, menurut hasil elektroforesis pada gel akrilamida 12%, salah satu subunit kompleks sitokrom o E. coli memiliki berat molekul yang jelas. massa 28.000, dan dari grafik Ferguson nilainya adalah 43.000, yang bertepatan dengan mol. massa dihitung dari data pengurutan DNA yang sesuai.
Masalah lainnya adalah kemungkinan adanya struktur kuaterner. Beberapa protein membran beragregasi bahkan dengan adanya SDS. Misalnya, glikoforin A atau protein selubung bakteriofag M13 ditemukan terutama dalam bentuk dimer selama elektroforesis pada gel poliakrilamida dengan SDS. Terkadang agregasi semakin ditingkatkan dengan memanaskan campuran protein-SDS. Gambaran ini diamati, misalnya, untuk subunit oksidase terminal mitokondria dan bakteri. Untuk menilai kemampuan suatu protein untuk beragregasi secara ireversibel, perlu dilakukan analisis perbandingan hasil elektroforesis gel poliakrilamida dengan SDS untuk sampel yang dipanaskan dan tidak dipanaskan. Masalah serupa terkadang muncul karena adanya deterjen yang digunakan dalam pemurnian protein membran. Deterjen ini harus dihilangkan dan diganti dengan SDS, karena dalam beberapa kasus terdapat ketergantungan yang jelas dari mobilitas elektroforesis pada keberadaan deterjen yang digunakan untuk melarutkan enzim.
Dengan demikian, ada alasan untuk berpikir bahwa penilaian berat molekul subunit protein membran integral yang sangat nonpolar, yang ditentukan menggunakan SDS-PAGE, mungkin salah. Sayangnya, tidak ada alternatif sederhana untuk metode ini, dan nilai yang benar sering kali diperoleh dari data deret primer yang lengkap atau dari analisis hidrodinamik yang akurat.
3.2 PENENTUAN BERAT MOLEKULER PROTEIN ASLI MENGGUNAKAN METODE HIDRODINAMIK
Penerapan metode ini pada protein membran dapat menimbulkan kesulitan karena pengikatan deterjen. Untuk memahami hal ini sepenuhnya, pertama-tama mari kita perhatikan protein sederhana yang dapat larut, yaitu mol. massa subunit menggunakan SDS-PAGE dan perlu untuk mengetahui bentuk aktifnya yang tidak terdenaturasi - monomer, dimer, atau oligomer orde tinggi. Filtrasi gel, yang melibatkan perbandingan dengan protein standar, sering digunakan untuk menentukan berat molekul protein; Di sini masalah muncul karena semua protein standar berbentuk globular, dan protein yang diteliti mungkin tidak berbentuk globular, tetapi agak memanjang. Protein seperti itu dengan mol. dengan berat 50.000 dapat terelusi dengan kecepatan yang sesuai dengan mol. Mungkin
se 100 LLC. Dalam hal ini, kolom filtrasi gel harus dikalibrasi sesuai dengan jari-jari Stokes, yaitu dimensi “bola hidrodinamik ekuivalen”, dan sebagai tambahan, beberapa metode lain harus digunakan secara paralel. Biasanya, laju sedimentasi diukur menggunakan ultrasentrifugasi analitik atau sentrifugasi gradien kepadatan sukrosa. Koefisien sedimentasi sama dengan
di mana m adalah berat molekul protein,
v adalah volume spesifik parsialnya, ij adalah viskositas larutan, b adalah massa jenis larutan.
Karena e dan H diketahui, aRc dapat ditentukan dengan menggunakan filtrasi gel, hanya tersisa dua besaran yang tidak diketahui - v dan m. Untuk protein yang larut dalam air, v dapat dihitung berdasarkan komposisi asam amino atau diukur secara langsung, atau diambil sama dengan 0,72-0,75 ml/G. Jadi, dengan mengukur S 0, kita dapat mencari m.
Sekarang mari kita perhatikan situasi dengan protein membran. Masalah tambahan muncul di sini, karena partikel hidrodinamik adalah kompleks deterjen protein, oleh karena itu m dan v dalam hal ini adalah berat molekul dan volume spesifik kompleks, M k dan K,. Sayangnya, K tidak dapat dinilai tanpa mengetahui apapun tentang komposisi kompleksnya. Dalam hal ini, dua metode digunakan untuk mencari massa molekul protein.
1. Ukur langsung jumlah deterjen terikat per 1 g protein. Untuk tujuan ini, metode spektral atau deterjen berlabel radioaktif digunakan, dan berbagai metode, seperti filtrasi gel, digunakan untuk mengisolasi kompleks. Setelah menetapkan kandungan relatif protein dan deterjen dalam kompleks, nilai K diperoleh sebagai rata-rata tertimbang dari nilai yang sesuai untuk protein murni dan deterjen murni. Setelah itu, m mudah ditemukan, dan karena rasio antara protein dan deterjen dalam kompleks diketahui, maka berat molekul protein dapat ditemukan.
2. S0 diukur dalam media dengan massa jenis larutan yang berbeda d. Media tersebut biasanya dibuat dengan menggunakan campuran HgO dan D2O. Dari grafik S° versus q, ditemukan L/„ dan v t. Diasumsikan bahwa K adalah rata-rata tertimbang dari nilai protein murni dan deterjen murni.
Mengevaluasi Kvelo* dan mengambil deterjen dari tabel, diperoleh berat molekul komponen protein m.
Untuk memplot ketergantungan 5° pada q, dilakukan sentrifugasi analitik. Sentrifugasi juga dapat dilakukan dalam gradien densitas sukrosa dengan menggunakan campuran H2O dan D2O, namun analisis hasil dalam kasus ini jauh lebih rumit, meskipun tidak berbeda secara mendasar dari kasus sebelumnya.
Metode alternatif untuk menentukan berat molekul bentuk asli protein membran adalah dengan ultrasentrifugasi kesetimbangan. Distribusi suatu zat pada kesetimbangan sedemikian rupa sehingga kemiringan grafik logaritma konsentrasi versus r 2 adalah
di mana r adalah jarak dari pusat rotor ke titik tertentu dalam tabung centrifuge, W adalah frekuensi putaran.
Jika nilai Y diketahui atau mudah diperkirakan, seperti pada kebanyakan protein terlarut, masalah ini diselesaikan dengan cukup sederhana. Sedangkan untuk protein membran, dalam hal ini adalah
Tabel 3. Pengikatan deterjen pada beberapa protein membran
tiruan dari garis lurus yang ditunjukkan pada nilai q berbeda yang diperoleh dengan mencampurkan HgO dan D2O. Seperti sebelumnya, Mk dan K ditemukan secara bersamaan, dan kemudian berat molekul protein ditentukan.
Jika komponen ketiga hadir dalam kompleks, masalah tambahan akan muncul. Bagaimanapun, semua prosedur yang dijelaskan sangat rumit dan dapat memberikan hasil yang salah. Jumlah deterjen yang terikat pada protein membran integral yang dimurnikan bisa sangat signifikan - dari 0,3 hingga 1,5 berat protein, dan bahkan kesalahan kecil dalam nilai ini akan menyebabkan distorsi yang signifikan pada berat molekul protein. Di meja Tabel 3.3 memberikan data tentang jumlah deterjen yang ada dalam beberapa sediaan protein. Perhatikan bahwa protein yang larut tidak mengikat deterjen ini; Hal ini sekali lagi menunjukkan bahwa bagian nonpolar dari protein, biasanya bersentuhan dengan lipid membran, yang bertanggung jawab untuk mengikat deterjen.
3.3 METODE INAKTIVASI RADIASI
Metode inaktivasi radiasi untuk menentukan ukuran target semakin banyak digunakan dalam studi protein membran. Baik protein murni maupun sediaan kasar, termasuk biomembran utuh, dapat dipelajari. Inti dari metode ini adalah menentukan proporsi molekul protein yang rusak akibat iradiasi. Untuk tujuan ini, metode enzimatik untuk mengikat hormon atau ligan lain atau metode spektral digunakan. Prosedurnya adalah sebagai berikut. Sampel, biasanya dibekukan, terkena radiasi berenergi tinggi. Pada interval yang berbeda, sampel diambil, dicairkan, dan pengukuran dilakukan. Kerusakan protein di bawah pengaruh radiasi dideteksi, misalnya menggunakan SDS-PAGE. Pengalaman menunjukkan bahwa beberapa subunit benar-benar kehilangan aktivitas biologisnya ketika kerusakan radiasi terjadi di bagian mana pun dalam rantai polipeptida. Poin kuncinya adalah semakin besar molekul protein, semakin besar kemungkinan kerusakan dan kemungkinan inaktivasi. Kemungkinan ini tidak bergantung pada bentuk molekul, namun pada massanya. Biasanya, protein dengan berat molekul yang diketahui diiradiasi secara paralel untuk memfasilitasi interpretasi hasil. Jika protein yang diteliti mengandung lebih dari satu subunit, timbul kesulitan tertentu dalam menganalisis hasilnya. Rusaknya salah satu subunit belum tentu disertai dengan putusnya ikatan kovalen pada subunit lainnya. Oleh karena itu, untuk enzim yang terdiri dari subunit berbeda dengan aktivitas berbeda, ukuran target berbeda dapat diperoleh tergantung pada metode penentuan derajat inaktivasi.
Fitur penting dari metode ini adalah dapat digunakan untuk mempelajari protein membran integral in situ. Artefak dan permasalahan yang muncul dalam hal ini dibahas dalam karya. Salah satu masalah yang jelas adalah kebutuhan untuk menggunakan radiasi berenergi tinggi. Dalam hal ini, sebagian besar pekerjaan harus dilakukan bekerjasama dengan laboratorium yang memiliki sumber yang sesuai dan telah menguasai metode analisis khusus.
3.4 METODE SPEKRAL DAN STRUKTUR SEKUNDER
Beberapa metode digunakan untuk menentukan kandungan α-heliks dan β-sheet dalam protein membran. Dengan tidak adanya organisasi tiga dimensi, seseorang dapat mencoba membangun model yang sesuai berdasarkan organisasi tersebut. Metode yang paling umum digunakan adalah dikroisme melingkar. Spektroskopi inframerah dan Raman, serta NMR, semakin banyak digunakan.
1. Metode dikroisme melingkar didasarkan pada pengukuran perbedaan serapan cahaya terpolarisasi kiri dan kanan; aktivitas optik ini adalah ukuran kiralitas molekul, atau ukuran asimetrinya. Di wilayah ultraviolet jauh, CD ditentukan terutama oleh penyerapan gugus karbonil dari tulang punggung polipeptida. Dengan adanya area struktur sekunder, misalnya heliks α, spektrum CD memiliki ciri yang sangat spesifik terkait dengan karakteristik lingkungan elektronik gugus tengaho dalam struktur ini. Saat menganalisis spektrum CD protein, biasanya direpresentasikan sebagai jumlah komponen yang sesuai dengan penyerapan berbagai bagian molekul protein: heliks α, lapisan β, dan kumparan acak. Setelah menentukan spektrum masing-masing struktur ini dengan satu atau lain cara, mereka dijumlahkan, memilih koefisien yang sesuai sedemikian rupa sehingga korespondensi terbaik dengan spektrum yang diukur tercapai. Koefisien bobot yang dipilih mewakili proporsi yang ada dalam molekul untuk setiap jenis struktur sekunder.
Metode ini dikembangkan untuk protein larut, namun tidak ada alasan untuk meragukan bahwa metode ini dapat berhasil diterapkan pada protein membran. Kemungkinan besar, yang terakhir memiliki daerah dengan jenis struktur sekunder yang sama dengan protein larut, dan kesulitan yang sama akan muncul ketika mempelajarinya. Beberapa protein dapat dipelajari secara in situ menggunakan suspensi membran. Contoh jenis ini adalah bakteriorhodopsin dari membran ungu Halobacteriumhalobium dan Ca2+ -ATPase dari membran retikulum sarkoplasma. Protein membran yang dimurnikan dapat diperiksa menggunakan CD dan dengan adanya deterjen, jika penyerapan deterjen di daerah sinar UV jauh tidak terlalu tinggi, atau dalam komposisi vesikel yang direkonstruksi. Dua masalah muncul di sini: 1) hamburan cahaya diferensial, ketika ukuran partikel membran jauh lebih besar daripada panjang gelombang cahaya; 2) pemerataan penyerapan karena konsentrasi protein dalam membran atau vesikel, yaitu karena ketidakhomogenan distribusinya dalam larutan. Artefak ini mungkin cukup signifikan, namun dapat dipertanggungjawabkan dengan menggunakan metode yang tepat.
Sayangnya, data struktur resolusi tinggi tidak tersedia untuk protein membran intrinsik, sehingga interpretasi spektrum CD secara akurat tidak mungkin dilakukan. Dengan beberapa pengecualian, metode spektral yang berbeda belum digunakan untuk mempelajari protein yang sama, dan tidak ada perbandingan hasil kuantitatif yang dibuat. Menariknya, untuk bakteriorhodopsin, yang dipelajari dengan metode CD, IR dan NMR, dalam ketiga kasus diperoleh hasil yang sama, menunjukkan adanya kandungan 3 lapisan yang signifikan dalam protein ini. Namun, masing-masing metode mempunyai kelemahan yang signifikan. Dengan demikian, data tentang tingginya kandungan lapisan D dalam bakteriorhodopsin sangat bergantung pada metode penghitungan artefak optik. Dilihat dari data rekonstruksi mikroskopis elektron, ditandai dengan resolusi yang relatif rendah, 80% bakteriorhodopsin terdiri dari heliks α, dan lapisan 0 sama sekali tidak ada. Untuk memahami alasan perbedaan ini, perlu dilakukan analisis struktur protein pada resolusi atom. Ada dua protein rentang membran kelimpahan tinggi lainnya dan toksin Staphylococcus aureus. Kedua protein ini terlibat dalam pembentukan pori-pori di lapisan ganda.
2. Spektroskopi inframerah dan spektroskopi Raman. Metode ini tidak hanya memberikan informasi tentang konformasi lipid membran, tetapi juga dapat digunakan untuk mempelajari struktur sekunder protein. Spektrum getaran tulang punggung polipeptida bergantung pada jenis struktur sekunder dan memberikan informasi tentang kandungan struktur a dan /3 dalam molekul. Metode ini dapat digunakan untuk mempelajari film yang dikeringkan dengan udara, suspensi membran berair, serta protein yang dimurnikan, baik dengan adanya deterjen maupun sebagai bagian dari vesikel yang direkonstruksi. Misalnya, menurut spektroskopi IR transformasi Fourier, kompleks Ca 2+ -ATPase dalam membran terutama terdiri dari daerah heliks α dan daerah dengan konformasi kumparan statistik, dan protein mielin hidrofobik dalam vesikel yang direkonstruksi memiliki α- dan / 3-plot.
3. Spektroskopi NMR juga dapat digunakan untuk mempelajari protein membran. Namun, kemampuan metode dalam hal ini terbatas, yang terutama disebabkan oleh pergerakan protein membran integral yang relatif lambat di tempat dan dalam kompleks dengan deterjen. Oleh karena itu, metode canggih seperti NMR dua dimensi, yang dapat memberikan gambaran rinci tentang keadaan konformasi protein yang relatif kecil dalam larutan, belum cocok untuk mempelajari protein membran. Metode NMR pada sampel padat lebih dapat diterima. Metode 2H- dan 3C-NMR mempunyai potensi yang besar walaupun sampai saat ini belum digunakan secara luas. Data diperoleh tentang rata-rata konformasi inti dan dinamika rantai samping. Perlu dicatat bahwa metode NMR solid state tidak hanya digunakan secara luas, tetapi dalam banyak kasus metode tersebut tidak dapat digunakan. Namun, dalam situasi yang jarang terjadi di mana penggunaannya memungkinkan, mereka sangat berharga.
3.5 AKTIVITAS ENZIM
Salah satu metode terpenting untuk mengkarakterisasi protein membran yang dimurnikan tidak diragukan lagi adalah penentuan aktivitas biokimia. Dalam hal ini, pada dasarnya kriteria yang sama digunakan untuk protein larut, namun kesulitannya sendiri mungkin timbul. Yang pertama disebabkan oleh fakta bahwa aktivitas biokimia protein membran seringkali sangat bergantung pada pengikatan lipid dan deterjen ke protein. Hilangnya aktivitas dapat bersifat reversibel atau ireversibel. Dianjurkan untuk mempunyai semacam perkiraan aktivitas spesifik protein yang diteliti secara in vivo atau sebagai bagian dari membran sebelum pelarutan. Deterjen yang berlebihan dapat menimbulkan efek penghambatan, misalnya dengan mengencerkan substrat non-polar pada populasi misel dan mengurangi aktivitas enzimatik. Saat mengukur aktivitas protein membran apa pun, harus diingat bahwa di tempatnya dikelilingi oleh lipid yang menjamin aktivitas optimal. Masalah kedua menyangkut protein yang memiliki aktivitas “transbilayer”; contohnya termasuk protein pembentuk saluran dan protein transpor. Dalam kasus ini, pergerakan zat terlarut dari satu kompartemen ke kompartemen lainnya harus diperhitungkan.
3.6 STRUKTUR KUATERNER DAN LINTAS KIMIA
Banyak enzim membran merupakan kompleks yang terdiri dari beberapa subunit. Contohnya termasuk H + -ATPase, Na + /K + -ATPase, kompleks transpor elektron mitokondria dan pusat reaksi fotosintesis. Beberapa protein membran integral berikatan erat dengan protein terlarut melalui interaksi nonkovalen. Pada E. coli, komponen Fo, yang menurut elektroforesis SDS-PAGE mengandung tiga jenis subunit, membentuk saluran proton; aFi, terdiri dari lima jenis subunit, mengandung pusat aktif yang terlibat dalam hidrolisis ATP. Untuk protein seperti itu, sangat penting untuk menentukan sifat subunit, stoikiometri kompleks, dan interaksi langsung komponen-komponennya. Ini adalah tugas yang sangat sulit bahkan ketika kompleks protein sudah diisolasi. Masalah yang muncul di sini pada dasarnya tidak berbeda dengan masalah kompleks protein terlarut, tetapi ada kesulitan tambahan.
Pertama-tama, harus diingat bahwa interaksi antar subunit sangat bergantung pada jenis lipid dan deterjen yang terkait dengan protein. Misalnya, suksinat dehidrogenase E. coli, bila dilarutkan dengan Lubrol PX, tampaknya terdiri dari empat subunit, namun bila dilarutkan dengan sebagian besar deterjen lain, termasuk Triton X-100, hanya dua. Operon sdh diketahui mengkode keempat polipeptida, dan bentuk dua subunit memiliki spektrum ER yang abnormal. Dengan demikian, jelas bahwa secara in vivo enzim terdiri dari empat subunit. Namun, kedua bentuk tersebut mempunyai aktivitas suksinat dehidrogenase, sehingga kriteria biokimia yang digunakan penting dalam menyimpulkan apakah bentuk yang benar telah terlarut.
Masalah lainnya adalah protein membran dapat membentuk kompleks pada lapisan ganda karena konsentrasi lokalnya yang tinggi. Selama pelarutan, apapun deterjen yang digunakan, pengenceran protein membran dan pemisahannya dapat terjadi. Menurut hukum aksi massa, hal ini akan menyebabkan disosiasi kompleks yang interaksi antar komponennya tidak terlalu kuat. Seringkali sulit untuk menentukan kompleks mana yang terbentuk in situ dan mana setelah pelarutan dan pemurnian. Masalah serupa muncul dalam studi banyak sistem kompleks, misalnya, sistem reseptor /3-adrenergik-adeylacyl cyclase, rantai transpor elektron di mitokondria, dan sistem sitokrom P450 dan b$ mikrosomal.
Untuk mempelajari stoikiometri subunit dan hubungannya dalam kompleks yang dimurnikan, hanya beberapa metode yang digunakan: 1) ikatan silang kimia; 2) analisis kuantitatif asam amino terminal-N; 3) penentuan rasio massa subunit pada gel SDS-poliakrilamida dengan menentukan intensitas pewarnaan menggunakan autoradiografi atau immunoblotting. Setiap metode mempunyai keterbatasannya masing-masing, namun semuanya telah digunakan dalam praktik. Misalnya, stoikiometri lima subunit reseptor asetilkolat nikotinat ditentukan dengan analisis kuantitatif asam amino N-coic, dan tiga subunit komponen Fo E. coli H + -ATPase dengan pemisahan dalam gel SDS-poliakrilamida. Perhatikan bahwa Coomassie brilian biru, yang biasa digunakan untuk mewarnai protein setelah pemisahan SDS-PAGE, lebih disukai berikatan dengan protein yang mengandung residu asam amino basa, dan terdapat contoh protein membran dalam yang sangat nonpolar yang hanya sedikit diwarnai.
Ikatan silang kimia telah digunakan untuk menentukan interaksi jangka pendek baik pada kompleks protein murni maupun kompleks in situ. Beberapa pengikat silang hidrofobik spesifik telah digunakan untuk menganalisis interaksi jarak pendek pada protein membran. Beberapa di antaranya disajikan dalam tabel. 3.4. Metode yang digunakan tidak berbeda dengan metode untuk sistem terlarut. Produk ikatan silang biasanya dianalisis dengan PAGE, sering kali menggunakan zat pengikat silang yang dapat dibelah, sehingga memungkinkan analisis polipeptida. Antibodi terhadap polipeptida individu juga digunakan untuk imunoblotting setelah SDS-PAGE untuk mengidentifikasi komponen dari setiap produk yang dihasilkan. Orang mungkin berasumsi bahwa dengan umur reagen yang relatif lama, protein dalam biomembran akan berikatan silang sebagai hasil difusi sederhana pada lapisan ganda. Namun, menurut beberapa penelitian, hal ini tidak terjadi: produk ikatan silang adalah asosiasi protein spesifik, dan bukan formasi acak. Jadi, dalam membran fotosintesis Rhodobacter capsulata, ikatan silang hanya terbentuk antara subunit komponen pusat reaksi, serta antara pusat reaksi dan kompleks “antena” B870, yang terlibat dalam transfer energi. ke pusat reaksi.
Akhirnya, kami mencatat bahwa ikatan silang kimia sering digunakan untuk mengidentifikasi protein membran integral yang berikatan dengan komponen larut yang diketahui. Contohnya adalah ikatan silang 1) subunit a dan b komponen Fo-kom H + -ATPase dengan subunit /3 komponen larut Fi; 2) subunit sitokrom c c dari sitokrom c oksidase mitokondria; 3) hormon peptida dengan reseptor hormon.
Tabel 4. Beberapa reagen ikatan silang yang digunakan untuk menentukan struktur kuaterner protein membran"
