Dalam kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), sifat proses yang terjadi dalam kolom kromatografi umumnya identik dengan proses dalam kromatografi gas. Perbedaannya hanya pada penggunaan cairan sebagai fase diam. Karena kepadatan fase gerak cair yang tinggi dan resistansi kolom yang tinggi, kromatografi gas dan cair sangat berbeda dalam instrumentasi.

Dalam HPLC, pelarut murni atau campurannya biasanya digunakan sebagai fase gerak.

Untuk membuat aliran pelarut murni (atau campuran pelarut), yang disebut eluen dalam kromatografi cair, digunakan pompa yang termasuk dalam sistem hidrolik kromatografi.

Kromatografi adsorpsi dilakukan sebagai hasil interaksi suatu zat dengan adsorben, seperti silika gel atau aluminium oksida, yang memiliki pusat aktif di permukaannya. Perbedaan kemampuan untuk berinteraksi dengan pusat adsorpsi molekul sampel yang berbeda menyebabkan pemisahannya menjadi zona-zona selama pergerakan dengan fase gerak sepanjang kolom. Pemisahan zona komponen yang dicapai dalam hal ini bergantung pada interaksi dengan pelarut dan adsorben.

Yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah adsorben silika gel dengan volume, luas permukaan, dan diameter pori yang berbeda-beda. Aluminium oksida dan adsorben lainnya lebih jarang digunakan. Alasan utama untuk ini:

Kekuatan mekanik yang tidak memadai, yang tidak memungkinkan pengemasan dan penggunaan pada tekanan tinggi yang merupakan karakteristik HPLC;

silika gel, dibandingkan dengan aluminium oksida, memiliki porositas, luas permukaan, dan diameter pori yang lebih luas; Aktivitas katalitik aluminium oksida yang jauh lebih besar menyebabkan distorsi hasil analisis karena penguraian komponen sampel atau penyerapan kimianya yang ireversibel.

Detektor untuk HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digunakan untuk mendeteksi zat polar non-volatil yang karena alasan tertentu tidak dapat diubah menjadi bentuk yang sesuai untuk kromatografi gas, bahkan dalam bentuk turunannya. Zat-zat tersebut, khususnya, termasuk asam sulfonat, pewarna yang larut dalam air dan beberapa pestisida, misalnya turunan fenil-urea.

Detektor:

Detektor UV pada matriks dioda. Sebuah “matriks” fotodioda (lebih dari dua ratus di antaranya) secara konstan mencatat sinyal di wilayah spektrum UV dan sinar tampak, sehingga menyediakan rekaman spektrum UV-B dalam mode pemindaian. Hal ini memungkinkan Anda untuk terus merekam, pada sensitivitas tinggi, spektrum komponen yang tidak terdistorsi dengan cepat melewati sel khusus.

Dibandingkan dengan deteksi panjang gelombang tunggal, yang tidak memberikan informasi tentang kemurnian puncak, kemampuan untuk membandingkan spektrum penuh dari susunan dioda memberikan tingkat kepercayaan yang jauh lebih tinggi pada hasil identifikasi.

Detektor fluoresensi. Popularitas besar detektor fluoresen disebabkan oleh selektivitas dan sensitivitasnya yang sangat tinggi, dan fakta bahwa banyak polutan lingkungan berfluoresensi (misalnya hidrokarbon poliaromatik).

Detektor elektrokimia digunakan untuk mendeteksi zat yang mudah teroksidasi atau tereduksi: fenol, merkaptan, amina, turunan nitro dan halogen aromatik, aldehida, keton, benzidin.

Pemisahan kromatografi campuran pada kolom karena lambatnya kemajuan PF membutuhkan banyak waktu. Untuk mempercepat proses, kromatografi dilakukan di bawah tekanan. Metode ini disebut kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

Modernisasi peralatan yang digunakan dalam kromatografi kolom cair klasik menjadikannya salah satu metode analisis yang paling menjanjikan dan modern. Kromatografi cair kinerja tinggi adalah metode yang mudah digunakan untuk pemisahan, isolasi preparatif, dan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa termolabil non-volatil dengan berat molekul rendah dan tinggi.

Tergantung pada jenis sorben yang digunakan, metode ini menggunakan 2 pilihan kromatografi: pada sorben polar menggunakan eluen non-polar (pilihan fase langsung) dan pada sorben non-polar menggunakan eluen polar - yang disebut fase terbalik tinggi -kromatografi cair kinerja (RPHPLC).

Selama transisi dari eluen ke eluen, kesetimbangan dalam kondisi HPLC terbentuk berkali-kali lebih cepat dibandingkan dalam kondisi sorben polar dan PF non-air. Sebagai hasilnya, serta kenyamanan bekerja dengan eluen berair dan berair-alkohol, OFVLC kini mendapatkan popularitas yang besar. Kebanyakan analisis HPLC dilakukan dengan menggunakan metode ini.

Detektor. Keluaran masing-masing komponen dari kolom dicatat menggunakan detektor. Untuk registrasi, Anda dapat menggunakan perubahan sinyal analitik apa pun yang berasal dari fase gerak dan terkait dengan sifat dan kuantitas komponen campuran. Kromatografi cair menggunakan sinyal analitik seperti penyerapan cahaya atau emisi cahaya dari larutan keluaran (detektor fotometri dan fluorimetri), indeks bias (detektor refraktometri), potensial dan konduktivitas listrik (detektor elektrokimia), dll.

Sinyal yang terus menerus terdeteksi direkam oleh perekam. Kromatogram adalah rangkaian sinyal detektor yang direkam pada pita perekam, dihasilkan ketika masing-masing komponen campuran meninggalkan kolom. Jika campuran dipisahkan, masing-masing puncak terlihat pada kromatogram eksternal. Posisi puncak dalam kromatogram digunakan untuk tujuan mengidentifikasi zat, tinggi atau luas puncak - untuk tujuan penentuan kuantitatif.

Aplikasi

HPLC paling banyak digunakan dalam bidang analisis kimia berikut (objek analisis yang disoroti adalah HPLC yang hampir tidak memiliki persaingan):

· Kontrol kualitas makanan - tonik dan bahan tambahan penyedap, aldehida, keton, vitamin, gula, pewarna, pengawet, obat hormonal, antibiotik, triazin, karbamat dan pestisida lainnya, mikotoksin, nitrosamin, hidrokarbon aromatik polisiklik, dll.

· Perlindungan lingkungan - fenol, senyawa nitro organik, hidrokarbon aromatik mono dan polisiklik, sejumlah pestisida, anion utama dan kation.

· Forensik - obat-obatan, bahan peledak dan pewarna organik, obat-obatan yang manjur.

· Industri farmasi - hormon steroid, hampir semua produk sintesis organik, antibiotik, sediaan polimer, vitamin, sediaan protein.

· Obat - zat biokimia dan obat yang terdaftar serta metabolitnya dalam cairan biologis (asam amino, purin dan pirimidin, hormon steroid, lipid) dalam mendiagnosis penyakit, menentukan laju eliminasi obat dari tubuh untuk tujuan dosis masing-masing.

· Pertanian - penentuan nitrat dan fosfat dalam tanah untuk menentukan jumlah pupuk yang dibutuhkan, penentuan nilai gizi pakan (asam amino dan vitamin), analisis pestisida dalam tanah, air dan produk pertanian.

· Biokimia, kimia bioorganik, rekayasa genetika, bioteknologi - gula, lipid, steroid, protein, asam amino, nukleosida dan turunannya, vitamin, peptida, oligonukleotida, porfirin, dll.

· Kimia organik - semua produk stabil sintesis organik, pewarna, senyawa termolabil, senyawa non-volatil; kimia anorganik (hampir semua senyawa larut berupa ion dan senyawa kompleks).

· pengendalian mutu dan keamanan pangan, minuman beralkohol dan non-alkohol, air minum, bahan kimia rumah tangga, wewangian pada semua tahap produksinya;

· penentuan sifat pencemaran di lokasi bencana atau keadaan darurat akibat ulah manusia;

· deteksi dan analisis zat narkotika, kuat, beracun dan mudah meledak;

· penentuan keberadaan zat berbahaya (hidrokarbon polisiklik dan hidrokarbon aromatik lainnya, fenol, pestisida, pewarna organik, ion logam berat, alkali dan alkali tanah) dalam limbah cair, emisi udara dan limbah padat dari perusahaan dan organisme hidup;

· pemantauan proses sintesis organik, penyulingan minyak dan batubara, produksi biokimia dan mikrobiologi;

analisis kualitas tanah untuk pemupukan, keberadaan pestisida dan herbisida dalam tanah, air dan produk, serta nilai gizi pakan; tugas analitis penelitian yang kompleks; memperoleh jumlah mikro zat ultra murni.



Perkenalan.

Pesatnya perkembangan kromatografi cair dalam 10 tahun terakhir terutama disebabkan oleh pengembangan intensif landasan teori dan penggunaan praktis dari versi yang sangat efektif, serta penciptaan dan produksi industri dari bahan penyerap dan peralatan yang diperlukan.

Ciri khas kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah penggunaan sorben dengan ukuran butir 3-10 mikron, yang menjamin perpindahan massa yang cepat dengan efisiensi pemisahan yang sangat tinggi.

Saat ini, HPLC menduduki peringkat pertama di antara metode instrumental dalam hal laju pengembangan, bahkan melampaui kromatografi gas. Keuntungan terpenting HPLC dibandingkan kromatografi gas adalah kemampuannya untuk mempelajari hampir semua objek tanpa batasan sifat fisikokimia, misalnya titik didih atau berat molekul.

Saat ini, HPLC adalah metode instrumental yang dirancang dengan baik dan banyak digunakan di berbagai bidang ilmu pengetahuan dan teknologi. Pentingnya hal ini sangat besar dalam bidang-bidang penting seperti biokimia, biologi molekuler, pengendalian pencemaran lingkungan, serta dalam industri kimia, petrokimia, makanan dan farmasi.

karena sejumlah persyaratan yang sangat spesifik perlu diperhitungkan karena fitur metodologi berikut.

A. Kolom HPLC dikemas dengan media berdiameter partikel yang sangat kecil. Akibatnya, pada kecepatan volumetrik pelarut yang diperlukan untuk pemisahan sampel yang cepat, tekanan tinggi tercipta pada kolom.

B. Detektor yang digunakan dalam HPLC sensitif terhadap fluktuasi aliran dan tekanan eluen (noise). Terlebih lagi, ketika menggunakan detektor konsentrasi, diperlukan stabilitas kecepatan volumetrik eluen yang lebih tinggi.

V. Proses pemisahan kromatografi disertai dengan sejumlah efek antagonis, misalnya dispersi sampel dalam fase gerak menyebabkan pencampuran komponen yang dipisahkan dan mengurangi konsentrasi maksimum zat pada puncak yang dielusi (dalam detektor). Dispersi diamati di seluruh area sistem mulai dari titik injeksi sampel hingga detektor.

d.Pelarut yang bertindak sebagai fase gerak seringkali dapat menyebabkan korosi pada peralatan. Hal ini terutama berlaku untuk pelarut yang digunakan dalam kromatografi fase terbalik, yang lebih disukai dalam aplikasi HPLC biokimia.

Kekhususan HPLC sebagai teknik instrumental harus diperhitungkan selama pengembangan, pembuatan dan pengoperasian sistem ini. Butuh lebih dari sepuluh tahun pencarian dan penelitian untuk menciptakan sampel komersial sistem kromatografi dan komponennya yang cukup andal, sederhana dan aman untuk dioperasikan dengan rasio yang dapat diterima antara harga dan karakteristik teknis. Tren terkini yang mengarah pada pengurangan kolom (panjang dan diameter) memaksa adanya permintaan baru terhadap instrumen.

1.1. EFISIENSIDANSELEKTIFITAS

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan komponen-komponen suatu campuran berdasarkan perbedaan distribusi kesetimbangannya antara dua fasa yang tidak dapat bercampur, yang satu diam dan yang lainnya bergerak. Komponen-komponen sampel bergerak sepanjang kolom ketika berada di dalam fase gerak, dan tetap di tempatnya ketika berada dalam fase diam. Semakin besar afinitas suatu komponen terhadap fase diam dan semakin kecil afinitasnya terhadap fase gerak, semakin lambat komponen tersebut bergerak melalui kolom dan semakin lama komponen tersebut tertahan di dalamnya. Karena perbedaan afinitas komponen campuran terhadap fase diam dan fase gerak, tujuan utama kromatografi tercapai - pemisahan untuk jangka waktu yang dapat diterima dari campuran menjadi pita individu (puncak) komponen saat mereka bergerak sepanjang kolom dengan fase gerak.

Dari konsep umum ini, jelas bahwa pemisahan kromatografi hanya mungkin terjadi jika komponen sampel, yang memasuki kolom ketika sampel dimasukkan, pertama, dilarutkan dalam fase gerak dan, kedua, berinteraksi (ditahan) dengan fase diam. . Jika pada saat memasukkan sampel, ada komponen yang tidak berbentuk larutan, maka komponen tersebut akan disaring dan tidak ikut serta dalam proses kromatografi. Demikian pula komponen yang tidak berinteraksi dengan fasa diam akan melewati kolom bersama fasa gerak tanpa terpisah menjadi komponen-komponennya.

Mari kita terima syarat bahwa dua komponen larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam, yaitu proses kroiatografi dapat berlangsung tanpa gangguan. Dalam hal ini, setelah melewatkan campuran melalui kolom, kromatogram bentuk dapat diperoleh a, b atau V(Gbr. 1.1). Kromatogram ini menggambarkan pemisahan kromatografi yang berbeda efisiensinya (A dan b) dengan selektivitas dan selektivitas yang setara (B Dan V) dengan efisiensi yang sama.

Semakin sempit puncak yang diperoleh pada waktu retensi yang sama maka efisiensi kolom semakin tinggi. Efisiensi kolom diukur dengan jumlah pelat teoritis (NPT) N: semakin tinggi efisiensinya

Beras. 1.2. Parameter puncak kromatografi dan perhitungan jumlah pelat teoritis:

t R - waktu retensi puncak; H - tinggi puncak; Wj/j - lebar puncak setengah tingginya

Beras. 1.1. Jenis kromatogram tergantung pada efisiensi dan selektivitas kolom:

A- selektivitas normal, efisiensi berkurang (pelat teoretis lebih sedikit); b - selektivitas dan efisiensi biasa; V - efisiensi normal, peningkatan selektivitas (rasio waktu retensi komponen lebih tinggi)

efisiensi, semakin besar FTT, semakin kecil pelebaran puncak pita awalnya sempit saat melewati kolom, dan semakin sempit puncak pada keluaran kolom. PTT mencirikan jumlah langkah dalam membangun keseimbangan antara fase gerak dan fase diam.

Mengetahui jumlah pelat teoritis per kolom dan panjang kolom L (µm), serta diameter butir rata-rata sorben dc (µm), mudah untuk mendapatkan nilai tinggi yang setara dengan pelat teoritis (HETT), serta nilai pengurangan tinggi yang setara dengan pelat teoritis (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT =B3TT/hari c .

Dengan memiliki nilai FTT, HETT dan PHETT, seseorang dapat dengan mudah membandingkan efisiensi kolom dari berbagai jenis, panjang berbeda, diisi dengan sorben dengan sifat dan granularitas berbeda. Dengan membandingkan PTT dua kolom dengan panjang yang sama, efisiensinya dibandingkan. Saat membandingkan HETP, kolom dengan sorben dengan ukuran butir yang sama dan panjang berbeda dibandingkan. Terakhir, nilai PVETT memungkinkan setiap dua kolom untuk menilai kualitas sorben, pertama, kualitas pengisian kolom, dan kedua, terlepas dari panjang kolom, sifat granulasi sorben.

Selektivitas kolom memainkan peran besar dalam mencapai pemisahan kromatografi.

Selektivitas suatu kolom bergantung pada banyak faktor, dan keterampilan pelaku eksperimen sangat ditentukan oleh kemampuan mempengaruhi selektivitas pemisahan. Untuk ini, tiga faktor yang sangat penting ada di tangan kromatografer: pilihan sifat kimia sorben, pilihan komposisi pelarut dan pengubahnya, dan mempertimbangkan struktur kimia dan sifat komponen yang dipisahkan. . Terkadang perubahan suhu kolom, yang mengubah koefisien distribusi zat antara fase gerak dan fase diam, memiliki pengaruh nyata pada selektivitas.

Ketika mempertimbangkan dan mengevaluasi pemisahan dua komponen dalam kromatogram, resolusi merupakan parameter penting. R s, yang menghubungkan waktu keluaran dan lebar puncak dari kedua komponen yang terpisah

Resolusi sebagai parameter yang mencirikan pemisahan puncak meningkat seiring dengan peningkatan selektivitas, yang tercermin dari peningkatan pembilangnya, dan peningkatan efisiensi, yang tercermin dari penurunan nilai penyebut karena penurunan lebar puncak. Oleh karena itu, kemajuan pesat kromatografi cair menyebabkan perubahan konsep “kromatografi cair tekanan tinggi” - digantikan dengan “kromatografi cair resolusi tinggi” (sementara bentuk singkatan dari istilah tersebut dalam bahasa Inggris tetap dipertahankan. HPLC sebagai yang paling tepat mencirikan arah perkembangan kromatografi cair modern).

Dengan demikian, pencucian kolom berkurang dan efisiensi meningkat ketika digunakan sorben yang lebih halus, komposisi yang lebih seragam (fraksi sempit), pengemasan yang lebih padat dan seragam dalam kolom, menggunakan lapisan fase cangkok yang lebih tipis, pelarut yang kurang kental dan laju aliran yang optimal.

Namun seiring dengan kaburnya pita zona kromatografi selama proses pemisahan di dalam kolom, hal tersebut juga dapat tersapu pada alat pemasukan sampel, pada injektor kapiler penghubung - kolom dan kolom - detektor, pada sel detektor dan di beberapa perangkat bantu (mikrofilter untuk menjebak partikel mekanis dari sampel yang dipasang setelah injektor, pra-kolom, reaktor koil, dll.) - Semakin besar volume ekstra kolom dibandingkan dengan volume puncak yang ditahan, semakin besar erosi. Lokasi volume mati juga penting: semakin sempit sinyal kromatografinya, semakin besar keburaman volume matinya. Oleh karena itu, perhatian khusus harus diberikan pada desain bagian kromatografi yang zona kromatografinya paling sempit (injektor dan perangkat dari injektor ke kolom) - di sini erosi ekstra-kolom paling berbahaya dan memiliki dampak terbesar. Meskipun diyakini bahwa dalam kromatografi yang dirancang dengan baik, sumber pengenceran ekstra kolom tambahan harus diminimalkan, namun setiap perangkat baru, setiap modifikasi kromatografi harus diakhiri dengan pengujian pada kolom dan perbandingan kromatogram yang dihasilkan. dengan paspor satu. Jika terjadi distorsi puncak atau penurunan efisiensi yang tajam, kapiler dan perangkat lain yang baru dimasukkan ke dalam sistem harus diperiksa dengan cermat.

Pencucian di luar kolom dan kesalahan penilaiannya dapat menyebabkan hilangnya efisiensi secara signifikan (lebih dari 50%), terutama dalam kasus di mana kromatografi yang relatif lama dicoba digunakan untuk HPLC kecepatan tinggi, HPLC mikrokolom, dan varian HPLC modern lainnya yang memerlukan mikroinjektor, menghubungkan kapiler dengan internal dengan diameter panjang minimum 0,05-0,15 mm, kolom dengan kapasitas 10-1000 μl, detektor dengan mikrokuvet dengan kapasitas 0,03-1 μl dan dengan perekam dan integrator berkecepatan tinggi dan berkecepatan tinggi .

1.2. RETENSI DAN KEKUATAN PELARUT

Agar analit dapat dipisahkan pada kolom, sebagaimana disebutkan di atas, koefisien kapasitas k" harus lebih besar dari 0, yaitu zat harus ditahan oleh fase diam, yaitu sorben. Namun, faktor kapasitas tidak boleh terlalu tinggi untuk mendapatkan waktu elusi yang dapat diterima. Jika untuk campuran zat tertentu dipilih fase diam yang menahannya, maka upaya lebih lanjut untuk mengembangkan teknik analisis terdiri dari pemilihan pelarut yang idealnya memberikan perbedaan untuk semua komponen, tetapi tidak terlalu besar. k". Hal ini dicapai dengan mengubah kekuatan elusi pelarut.

Dalam kasus kromatografi adsorpsi pada silika gel atau aluminium oksida, sebagai suatu peraturan, kekuatan pelarut dua komponen (misalnya heksana dengan penambahan isopropanol) meningkat dengan meningkatnya kandungan komponen polar (isopropanol), atau dikurangi dengan menurunkan kandungan isopropanol. Jika komponen polar yang terkandung menjadi terlalu kecil (kurang dari 0,1%), maka harus diganti dengan gaya elusi yang lebih lemah. Hal yang sama dilakukan dengan mengganti komponen polar atau non-polar dengan komponen lain, meskipun sistem ini tidak memberikan selektivitas yang diinginkan sehubungan dengan komponen yang diinginkan dalam campuran. Saat memilih sistem pelarut, kelarutan komponen campuran dan rangkaian pelarut eluotropik yang disusun oleh penulis berbeda diperhitungkan.

Kekuatan pelarut dipilih dengan cara yang kira-kira sama ketika menggunakan fase polar yang dicangkokkan (nitril, amino, diol, nitro, dll.), dengan mempertimbangkan kemungkinan reaksi kimia dan tidak termasuk pelarut yang berbahaya bagi fase tersebut (misalnya, keton untuk fase tersebut). fase amino).

Dalam kasus kromatografi fase terbalik, kekuatan pelarut ditingkatkan dengan meningkatkan kandungan komponen organik dalam eluen (metanol, asetonitril atau THF) dan menurun dengan penambahan lebih banyak air. Jika selektivitas yang diinginkan tidak dapat dicapai, mereka menggunakan komponen organik lain atau mencoba mengubahnya menggunakan berbagai aditif (asam, reagen pasangan ion, dll.).

Dalam pemisahan menggunakan kromatografi penukar ion, kekuatan pelarut diubah dengan menambah atau mengurangi konsentrasi larutan buffer atau mengubah pH; dalam beberapa kasus, modifikasi dengan zat organik digunakan.

Namun, khususnya dalam kasus campuran alami dan biologis yang kompleks, seringkali tidak mungkin untuk memilih kekuatan pelarut sedemikian rupa sehingga semua komponen sampel terelusi dalam waktu yang dapat diterima. Kemudian Anda harus menggunakan elusi gradien, yaitu menggunakan pelarut yang kekuatan elusinya berubah selama proses analisis sehingga terus meningkat sesuai program yang telah ditentukan. Teknik ini memungkinkan tercapainya elusi seluruh komponen campuran kompleks dalam waktu yang relatif singkat dan pemisahannya menjadi komponen-komponen dalam bentuk puncak yang sempit.

1.3. UKURAN PARTIKEL SORBEN, PERMEABILITAS DAN EFISIENSI

Mengingat erosi pada kolom, kami mengindikasikan bahwa efisiensi kolom (HETT) bergantung pada ukuran partikel sorben. Sebagian besar, pesatnya perkembangan HPLC selama 10-12 tahun terakhir disebabkan, pertama, oleh pengembangan metode untuk memproduksi sorben dengan ukuran partikel dari 3 hingga 10 mikron dan dengan komposisi fraksi yang sempit, memberikan efisiensi tinggi dengan baik. permeabilitas, dan kedua, pengembangan metode pengisian kolom dengan bahan penyerap ini dan, ketiga, pengembangan dan produksi serial kromatografi cair dengan pompa tekanan tinggi, injektor dan detektor dengan kuvet volume kecil yang mampu mencatat puncak volume kecil.

Untuk kolom slurry-packed yang dikemas dengan baik, tinggi pelat teoritis ekuivalen tereduksi (LPHE) bisa menjadi 2 terlepas dari apakah partikel berukuran 3, 5, 10, atau 20 μm digunakan untuk pengemasan. Dalam hal ini, kita akan menerima masing-masing kolom (dengan panjang standar 250 mm) dengan efisiensi 41670, 25000, 12500 dan 6250 t.t. Tampaknya wajar untuk memilih kolom paling efisien yang dikemas dengan partikel 3 µm. Namun, efisiensi ini akan mengorbankan operasi tekanan yang sangat tinggi dan kecepatan pemisahan yang relatif rendah, karena pompa yang ada kemungkinan besar akan mampu memompa pelarut melalui kolom tersebut pada kecepatan volumetrik yang tinggi. Di sini kita dihadapkan pada pertanyaan tentang hubungan antara ukuran partikel sorben, efisiensi dan permeabilitas kolom.

Jika kita menyatakan faktor resistansi kolom dari sini - besaran tak berdimensi, kita memperoleh persamaan berikut:

Faktor resistansi untuk kolom yang dikemas dengan mikropartikel dari jenis yang sama dengan menggunakan metode yang sama sedikit bervariasi dan merupakan nilai berikut:

Jenis partikel "... Bulat Tidak Beraturan

bentuk bentuk

Kemasan kering. . . . . 1000-2000 800-1200

Kemasan suspensi. . . 700-1500 500-700

Tekanan masuk kolom sebanding dengan kecepatan aliran linier, faktor drag kolom, viskositas pelarut, dan panjang kolom dan berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel.

Menerapkan hubungan ini pada kolom yang dijelaskan di atas dengan partikel dengan diameter 3, 5, 10 dan 20 µm dan dengan asumsi laju aliran linier konstan, faktor resistansi kolom dan viskositas pelarut, kita memperoleh rasio tekanan masuk 44:16:4:1 untuk kolom dengan panjang yang sama. Jadi, jika untuk sorben fase terbalik dengan ukuran partikel 10 m bila menggunakan sistem pelarut metanol - . air (70:30) biasanya pada kolom standar dengan laju alir pelarut 1 ml/menit, tekanan masuk kolom adalah 5 MPa, kemudian untuk partikel 5 μm - 20 MPa dan untuk 3 μm - 55 MPa . Bila menggunakan silika gel dan sistem pelarut yang kurang kental, heksana - isopropanol (100:2), nilainya akan jauh lebih rendah: masing-masing 1, 4 dan 11 MPa. Jika dalam kasus sorben fase terbalik penggunaan partikel dengan ukuran 3 μm sangat bermasalah, dan 5 μm dimungkinkan, tetapi tidak pada semua perangkat, maka untuk sorben fase normal tidak ada masalah dengan tekanan. Perlu dicatat bahwa HPLC kecepatan tinggi modern biasanya menggunakan laju aliran pelarut yang lebih tinggi dibandingkan contoh di atas, sehingga kebutuhan tekanan semakin meningkat.

Namun, dalam kasus di mana sejumlah pelat teoritis diperlukan untuk pemisahan dan diinginkan untuk melakukan analisis laju, gambarannya agak berubah. Karena panjang kolom dengan sorben dengan ukuran butir 3, 5, 10 mikron, dengan efisiensi yang sama, masing-masing akan menjadi 7,5; 12,5 dan 25 cm, maka perbandingan tekanan pada saluran masuk ke kolom akan berubah menjadi 3:2:1. Oleh karena itu, durasi analisis pada kolom dengan efisiensi yang sama akan berada pada rasio 0,3:0,5:1, yaitu, ketika berpindah dari 10 ke 5 dan 3 mikron, durasi analisis akan berkurang 2 dan 3,3 kali. Analisis yang lebih cepat ini mengakibatkan tekanan yang lebih tinggi secara proporsional pada saluran masuk kolom.

Data yang disajikan valid untuk kasus-kasus di mana sorben dengan ukuran butir berbeda memiliki kurva distribusi ukuran partikel yang sama, kolom dikemas dengan cara yang sama dan memiliki faktor resistansi kolom yang sama. Perlu diingat bahwa kesulitan memperoleh fraksi sempit dari sorben meningkat seiring dengan berkurangnya ukuran partikel dan sebagainya. Pecahan dari produsen yang berbeda mempunyai komposisi pecahan yang berbeda pula. Oleh karena itu, faktor resistansi kolom akan bervariasi tergantung pada ukuran butir, jenis sorben, metode pengepakan kolom, dan lain-lain.

KLASIFIKASI METODE HPLC BERDASARKAN MEKANISME PEMISAHAN

Sebagian besar pemisahan yang dilakukan dengan HPLC didasarkan pada mekanisme campuran interaksi zat dengan sorben, yang memberikan lebih banyak atau lebih sedikit retensi komponen dalam kolom. Mekanisme pemisahan dalam bentuk yang kurang lebih murni cukup jarang dalam praktiknya, misalnya adsorpsi ketika menggunakan silika gel anhidrat mutlak dan heksana anhidrat untuk memisahkan hidrokarbon aromatik.

Dengan mekanisme retensi campuran untuk zat dengan struktur dan berat molekul berbeda, dimungkinkan untuk mengevaluasi kontribusi retensi adsorpsi, distribusi, eksklusi, dan mekanisme lainnya. Namun, untuk pemahaman dan pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme pemisahan dalam HPLC, disarankan untuk mempertimbangkan pemisahan dengan dominasi mekanisme tertentu yang berkaitan dengan jenis kromatografi tertentu, misalnya kromatografi pertukaran ion.

2.1.1 KROMATOGRAFI ADSORPSI

Pemisahan dengan kromatografi adsorpsi dilakukan sebagai hasil interaksi suatu zat dengan adsorben, seperti silika gel atau aluminium oksida, yang mempunyai pusat aktif di permukaan. Perbedaan kemampuan untuk berinteraksi dengan pusat adsorpsi molekul sampel yang berbeda menyebabkan pemisahannya menjadi zona-zona selama pergerakan dengan fase gerak sepanjang kolom. Pemisahan zona komponen yang dicapai dalam hal ini bergantung pada interaksi dengan pelarut dan adsorben.

Penyerapan pada permukaan adsorben yang mengandung gugus hidroksil didasarkan pada interaksi spesifik antara permukaan polar dari adsorben dan gugus atau bagian molekul yang polar (atau dapat terpolarisasi). Interaksi tersebut antara lain interaksi dipol-dipol antara dipol permanen atau terinduksi, pembentukan ikatan hidrogen, hingga pembentukan kompleks r atau kompleks transfer muatan. Kejadian yang mungkin dan cukup sering terjadi dalam kerja praktek adalah manifestasi kemisorpsi, yang dapat menyebabkan peningkatan waktu retensi yang signifikan, penurunan efisiensi yang tajam, munculnya produk dekomposisi atau penyerapan zat yang tidak dapat diubah.

Isoterm adsorpsi zat berbentuk linier, cembung, atau cekung. Dengan isoterm adsorpsi linier, puncak zat simetris dan waktu retensi tidak bergantung pada ukuran sampel. Paling sering, isoterm adsorpsi zat bersifat nonlinier dan memiliki bentuk cembung, yang menyebabkan beberapa asimetri puncak dengan pembentukan ekor.

Yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah adsorben silika gel dengan volume pori, luas permukaan, dan diameter pori yang berbeda. Aluminium oksida lebih jarang digunakan dan adsorben lain, yang banyak digunakan dalam kromatografi kolom klasik dan kromatografi lapis tipis, sangat jarang digunakan. Alasan utama untuk hal ini adalah kurangnya kekuatan mekanik dari sebagian besar adsorben lainnya, yang tidak memungkinkannya untuk dikemas atau digunakan pada karakteristik tekanan tinggi HPLC.

Gugus polar yang menyebabkan adsorpsi dan terletak pada permukaan silika gel dan aluminium oksida memiliki sifat yang serupa. Oleh karena itu, biasanya urutan elusi campuran zat dan rangkaian pelarut eluotropik adalah sama. Namun, perbedaan struktur kimia silika gel dan aluminium oksida terkadang menyebabkan perbedaan selektivitas - kemudian preferensi diberikan pada satu atau beberapa adsorben yang lebih cocok untuk tugas tertentu. Misalnya, alumina memberikan selektivitas yang lebih besar untuk pemisahan hidrokarbon aromatik polinuklir tertentu.

Preferensi yang biasanya diberikan pada silika gel dibandingkan dengan aluminium oksida disebabkan oleh pilihan gel silika yang lebih luas dalam hal porositas, permukaan dan diameter pori, serta aktivitas katalitik aluminium oksida yang jauh lebih tinggi, yang sering menyebabkan distorsi hasil analisis. karena penguraian komponen sampel atau penyerapan kimianya yang ireversibel.

2.1.2 Kekurangan kromatografi adsorpsi yang membatasi penggunaannya

Popularitas kromatografi adsorpsi secara bertahap menurun seiring berkembangnya metode HPLC; metode ini semakin digantikan dan terus digantikan oleh pilihan lain, seperti HPLC fase terbalik dan fase normal pada sorben dengan fase cangkok. Apa kelemahan kromatografi adsorpsi yang menyebabkan hal ini?

Pertama-tama, ini adalah lamanya proses penyeimbangan adsorben dengan pelarut yang mengandung air dalam jumlah sedikit, sulitnya menyiapkan pelarut tersebut dengan kelembaban tertentu dan dapat direproduksi. Hal ini mengakibatkan buruknya reproduksibilitas parameter retensi, resolusi, dan selektivitas. Untuk alasan yang sama, tidak mungkin menggunakan elusi gradien - pengembalian ke keadaan awal membutuhkan waktu yang sangat lama sehingga secara signifikan melebihi waktu yang diperoleh dengan menggunakan gradien.

Kerugian signifikan dari adsorben, terutama aluminium oksida, terkait dengan seringnya kasus penataan ulang senyawa yang peka terhadap katalisis, penguraiannya, dan penyerapan ireversibel, juga telah diketahui dan telah berulang kali dicatat dalam literatur. Zat yang terserap secara ireversibel, terakumulasi pada bagian awal kolom, mengubah sifat sorben dan dapat menyebabkan peningkatan resistensi kolom atau bahkan penyumbatan total. Kelemahan terakhir dapat dihilangkan dengan menggunakan pra-kolom, yaitu Oleh- Ketika resistensi dan penyumbatan meningkat, produk tersebut diganti dengan yang baru* atau diisi ulang dengan bahan penyerap baru. Namun, penyerapan ireversibel, yang juga terjadi dalam kasus ini, menghasilkan kromatogram di mana komponen sampel yang sensitif terhadap penyerapan atau dekomposisi katalitik tidak ada seluruhnya atau sebagian.

2.2. KROMATOGRAFI DISTRIBUSI

Kromatografi partisi adalah varian HPLC di mana pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dilakukan karena perbedaan koefisien distribusi antara dua fase yang tidak dapat bercampur: pelarut (fasa gerak) dan fase pada sorben (fase diam). Secara historis, yang pertama adalah sorben jenis ini, yang diperoleh dengan mengaplikasikan fase cair (oksidipropionitril, minyak parafin, dll.) ke penyangga berpori, mirip dengan bagaimana sorben dibuat dan disiapkan untuk kromatografi gas-cair (GLC). Namun, kelemahan dari sorben tersebut segera terungkap, yang utama adalah pembilasan fase yang relatif cepat dari pembawa. Oleh karena itu, jumlah fasa dalam kolom berangsur-angsur berkurang, waktu retensi juga berkurang, dan pusat adsorpsi yang tidak tercakup oleh fasa muncul di bagian awal kolom, menyebabkan terbentuknya ekor puncak. Kelemahan ini diatasi dengan menjenuhkan pelarut dengan fase yang diterapkan sebelum memasuki kolom. Entrainment juga berkurang ketika fase polimer yang lebih kental dan kurang larut digunakan, namun dalam kasus ini, karena kesulitan difusi dari film polimer tebal, efisiensi kolom sangat berkurang.

Ternyata masuk akal untuk mencangkokkan fase cair ke pembawa melalui ikatan kimia sedemikian rupa sehingga penghilangannya menjadi tidak mungkin secara fisik, yaitu mengubah pembawa dan fase menjadi satu - menjadi apa yang disebut sorben fase cangkok.

Upaya para peneliti selanjutnya ditujukan untuk mencari reagen yang pencangkokannya akan berlangsung cukup cepat dan sempurna, dan ikatan yang terbentuk akan sestabil mungkin. Reagen tersebut adalah alkilklorosilan dan turunannya, yang memungkinkan, dengan menggunakan teknologi serupa, untuk memperoleh berbagai jenis sorben fase cangkok dan dengan gugus polar dan non-polar yang berbeda di permukaan.

Keberhasilan penerapan jenis sorben yang terakhir untuk HPLC telah berkontribusi pada pertumbuhan produksinya oleh berbagai produsen. Setiap perusahaan memproduksi sorben tersebut, biasanya, berdasarkan jenis silika gelnya sendiri dan menggunakan teknologinya sendiri, yang biasanya merupakan “pengetahuan” produksi. Akibatnya, sejumlah besar sorben, yang secara kimia disebut persis sama (misalnya, gel silika cangkok octadecylsilane), memiliki karakteristik kromatografi yang sangat berbeda. Hal ini disebabkan karena silika gel dapat mempunyai pori-pori yang lebih lebar atau sempit, permukaan yang berbeda, porositas, permukaannya sebelum pencangkokan dapat terhidroksilasi atau tidak, mono-, di- atau triklorosilan dapat dicangkok, kondisi pencangkokan dapat menghasilkan monomer, polimer atau fase lapisan campuran, metode yang berbeda digunakan untuk menghilangkan sisa reagen, penonaktifan tambahan silanol dan gugus aktif lainnya dapat digunakan atau tidak.

Kompleksitas teknologi pencangkokan reagen dan penyiapan bahan baku dan bahan, sifatnya yang multi-tahap, mengarah pada fakta bahwa kumpulan sorben yang diperoleh dengan menggunakan teknologi yang sama dari satu perusahaan manufaktur mungkin memiliki karakteristik kromatografi yang sedikit berbeda. Hal ini terutama berlaku dalam kasus di mana sorben tersebut digunakan untuk analisis campuran multikomponen yang mengandung zat yang sangat berbeda dalam jumlah dan posisi gugus fungsi, serta jenis fungsinya.

Dengan mempertimbangkan hal di atas, kita harus selalu berusaha untuk memastikan bahwa ketika menggunakan teknik analisis yang dijelaskan dalam literatur, sorben yang sama dan kondisi pengoperasian yang sama digunakan. Dalam hal ini, kemungkinan karya tersebut tidak direproduksi adalah minimal. Jika hal ini tidak memungkinkan, tetapi diambil sorben dari perusahaan lain dengan fase cangkok serupa, Anda harus siap menghadapi kenyataan bahwa akan membutuhkan waktu lama untuk mengerjakan ulang teknik tersebut. Pada saat yang sama, ada kemungkinan (dan harus diperhitungkan) bahwa dengan sorben ini, bahkan setelah pengembangan yang lama, pemisahan yang diperlukan mungkin tidak dapat dicapai. Kehadiran dalam literatur dari banyak teknik pemisahan yang dijelaskan pada sorben lama yang telah diproduksi sejak lama merangsang produksi dan penggunaan lebih lanjut karena alasan ini. Namun, dalam kasus di mana perlu untuk beralih ke pengembangan metode asli, terutama yang berkaitan dengan zat yang rentan terhadap dekomposisi, penyerapan kimia, penataan ulang, disarankan untuk mulai mengerjakan sorben yang telah dikembangkan baru-baru ini dan diproduksi dengan menggunakan bahan penyerap baru yang lebih baik. versi teknologinya. Sorben baru memiliki komposisi fraksi yang lebih seragam, cakupan permukaan yang lebih seragam dan lengkap dengan fase cangkok, dan tahap akhir pemrosesan sorben yang lebih maju.

2.3. KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

Dalam kromatografi penukar ion, pemisahan komponen campuran dicapai melalui interaksi reversibel zat pengion dengan gugus ionik sorben. Pelestarian netralitas listrik sorben dipastikan dengan adanya ion lawan yang mampu melakukan pertukaran ion yang terletak di dekat permukaan. Ion sampel yang dimasukkan, berinteraksi dengan muatan tetap sorben, bertukar dengan ion lawan. Zat dengan afinitas berbeda terhadap muatan tetap dipisahkan pada penukar anion atau penukar kation. Penukar anion memiliki gugus bermuatan positif di permukaan dan menyerap anion dari fase gerak. Oleh karena itu, penukar kation mengandung gugus dengan muatan -negatif yang berinteraksi dengan kation.

Sebagai fase gerak, larutan berair dari garam asam, basa dan pelarut seperti amonia cair digunakan, yaitu sistem pelarut dengan konstanta dielektrik e yang tinggi dan kecenderungan yang lebih besar untuk mengionisasi senyawa. Sistem ini biasanya bekerja dengan larutan buffer yang memungkinkan pH nilai yang harus disesuaikan.

Selama pemisahan kromatografi, ion-ion analit bersaing dengan ion-ion yang terkandung dalam eluen, cenderung berinteraksi dengan kelompok sorben yang bermuatan berlawanan. Oleh karena itu, kromatografi penukar ion dapat digunakan untuk memisahkan senyawa apa pun yang dapat terionisasi dengan cara tertentu. Bahkan molekul gula netral dapat dianalisis dalam bentuk kompleksnya dengan ion borat:

Gula + VO 3 2 - = Gula -VO 3 2 -.

Kromatografi penukar ion sangat diperlukan untuk pemisahan zat yang sangat polar, yang tidak dapat dianalisis dengan GLC tanpa konversi menjadi turunannya. Senyawa tersebut antara lain asam amino, peptida, dan gula.

Kromatografi penukar ion banyak digunakan dalam bidang kedokteran, biologi, biokimia, untuk pemantauan lingkungan, dalam analisis kandungan obat dan metabolitnya dalam darah dan urin, pestisida dalam bahan baku makanan, serta untuk pemisahan senyawa anorganik. termasuk radioisotop, lantanida, aktinida, dll. Analisis biopolimer (protein, asam nukleat, dll), yang biasanya memakan waktu berjam-jam atau berhari-hari, dilakukan dengan menggunakan kromatografi penukar ion dalam waktu 20-40 menit dengan pemisahan yang lebih baik. Penggunaan kromatografi penukar ion dalam biologi telah memungkinkan pengamatan sampel secara langsung dalam media biologis, mengurangi kemungkinan penataan ulang atau isomerisasi, yang dapat menyebabkan kesalahan interpretasi pada hasil akhir. Menarik untuk menggunakan metode ini untuk memantau perubahan yang terjadi pada cairan biologis. Penggunaan penukar anion lemah berpori berdasarkan gel silika memungkinkan pemisahan peptida. V

Mekanisme pertukaran ion dapat direpresentasikan dalam bentuk persamaan berikut:

untuk pertukaran anion

X-+R+Y- H ->■ Y-+R+X-.

untuk pertukaran kation |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

Dalam kasus pertama, ion sampel X~ bersaing dengan ion fase gerak Y~ untuk mendapatkan pusat ion R+ pada penukar ion, dan dalam kasus kedua, kation sampel X+ bersaing dengan ion Y+ dari fase gerak untuk mendapatkan R. ~ pusat ionik.

Secara alami, ion sampel yang berinteraksi lemah dengan penukar ion akan tertahan lemah di kolom selama kompetisi ini dan akan menjadi yang pertama tersapu darinya, dan sebaliknya, ion yang tertahan lebih kuat akan menjadi yang terakhir terelusi dari kolom. . Biasanya, interaksi BTqpH4Hbie yang bersifat nonionik terjadi karena adsorpsi atau ikatan hidrogen sampel dengan bagian nonionik matriks atau karena terbatasnya kelarutan sampel dalam fase gerak. Sulit untuk mengisolasi kromatografi penukar ion “klasik” dalam bentuk “murni”, dan oleh karena itu beberapa kromatografer melanjutkan dari prinsip empiris daripada prinsip teoritis dalam kromatografi penukar ion.

Pemisahan zat tertentu terutama bergantung pada pilihan sorben dan fase gerak yang paling sesuai. Resin penukar ion dan gel silika dengan gugus ionogenik yang dicangkokkan digunakan sebagai fase diam dalam kromatografi penukar ion.

2.4. KROMATOGRAFI PENGECUALIAN BAGIAN

Kromatografi eksklusi adalah suatu pilihan! kromatografi cair, dimana pemisahan terjadi karena adanya distribusi molekul antara pelarut yang terletak di dalam pori-pori sorben dan pelarut yang mengalir " antar partikelnya.

Berbeda dengan opsi HPLC lainnya, dimana pemisahan yang akan datang Karena perbedaan interaksi komponen dengan permukaan sorben, peran pengisi padat dalam kromatografi eksklusi ukuran hanya untuk membentuk pori-pori dengan ukuran tertentu, dan fase diam adalah pelarut yang mengisi pori-pori tersebut. Oleh karena itu, penggunaan istilah “sorben” pada bahan pengisi ini sampai batas tertentu bersifat sewenang-wenang.

Ciri mendasar dari metode ini adalah kemampuan untuk memisahkan molekul menurut ukurannya dalam larutan dalam kisaran hampir semua berat molekul - dari 10 2 hingga 10 8, sehingga metode ini sangat diperlukan untuk mempelajari sintetik dan biopolimer.

Secara tradisional, proses yang dilakukan dalam pelarut organik masih sering disebut kromatografi permeasi gel, dan dalam sistem berair - kromatografi filtrasi gel. Dalam buku ini, satu istilah diadopsi untuk kedua opsi, yang berasal dari bahasa Inggris “Size Exclusion” - pengecualian berdasarkan ukuran - dan paling mencerminkan mekanisme proses tersebut.

Analisis rinci atas gagasan yang ada tentang teori yang sangat kompleks tentang proses kromatografi eksklusi ukuran dilakukan dalam monografi.

Total volume pelarut dalam kolom Vt (ini sering disebut volume total kolom, karena Vd tidak mengambil bagian dalam proses kromatografi) adalah jumlah volume fase gerak dan fase diam.

Retensi molekul dalam kolom eksklusi ditentukan oleh kemungkinan difusinya ke dalam pori-pori dan bergantung pada rasio ukuran molekul dan pori-pori, yang ditunjukkan secara skematis pada Gambar. 2.15. Koefisien distribusi Ka, seperti pada varian kromatografi lainnya, ini adalah rasio konsentrasi suatu zat dalam fase diam dan fase gerak.

Karena fase gerak dan fase diam mempunyai komposisi yang sama, maka Kd suatu zat yang kedua fasenya dapat diakses sama-sama sama dengan kesatuan. Situasi ini terjadi untuk molekul C dengan ukuran terkecil (termasuk molekul pelarut), yang menembus semua pori-pori (lihat Gambar 2.15) dan oleh karena itu bergerak melalui kolom paling lambat. Volume retensinya sama dengan volume total pelarut Vt-

Beras. 2.15. Model pemisahan molekul dengan ukuran kromatografi eksklusi

Semua molekul yang ukurannya lebih besar dari ukuran pori-pori sorben tidak dapat masuk ke dalamnya (pengecualian total) dan melewati saluran antar partikel. Mereka dielusi dari kolom dengan volume retensi yang sama, sama dengan volume fase gerak V 0 - Koefisien partisi molekul-molekul ini adalah nol.

Molekul berukuran sedang, yang hanya mampu menembus sebagian pori-pori, tertahan di kolom sesuai dengan ukurannya. Koefisien distribusi molekul-molekul ini bervariasi dari nol hingga satu dan mencirikan fraksi volume pori yang dapat diakses oleh molekul dengan ukuran tertentu. Volume yang ditahan ditentukan oleh jumlah V o dan bagian volume pori yang dapat diakses.

ANALISIS KUALITATIF

Seorang kromatografer yang memasuki bidang kromatografi cair kinerja tinggi harus memahami dasar-dasar analisis kualitatif. Analisis kualitatif digunakan untuk mengidentifikasi produk yang diketahui, diperoleh dengan cara baru atau ditemukan dalam campuran dengan produk lain." Hal ini diperlukan ketika mengisolasi berbagai komponen dari campuran biologis dan kimia yang kompleks, yang sangat penting dalam kedokteran, forensik, ekologi, untuk memantau keberadaan beberapa produk kimia obat dan metabolitnya dalam bioml.terial..„ Analisis "Keakraban dengan dasar-dasar kualitatif" akan membantu menghindari kesalahan umum, misalnya/membedakan pengotor dalam sampel dari pengotor dalam sampel pelarut atau memeriksa kemurnian suatu zat pada lebih dari satu panjang gelombang, tetapi pada panjang gelombang yang berbeda, dll.

Sebelum melanjutkan analisis, perlu ditentukan apakah seluruh sampel dielusi dari kolom dengan sistem pelarut tertentu atau tidak. Untuk memastikan elusi sempurna, perlu untuk mengumpulkan semua cairan yang mengalir dari kolom, menguapkan pelarut, menimbang residu dan menentukan derajat perolehan sampel.

Identifikasi komponen dalam HPLC dapat dilakukan dengan tiga cara: 1) menggunakan informasi retensi; 2) memeriksa zona yang diperoleh selama pemisahan dalam kolom kromatografi cair dengan menggunakan metode analisis spektral atau kimia; 3) langsung menghubungkan penganalisis spektrum ke kolom.

Volume retensi digunakan untuk mencatat puncak dalam kromatografi. V R atau waktu retensi t R. Kedua besaran tersebut merupakan karakteristik suatu zat dalam sistem kromatografi tertentu. Karena waktu retensi zat yang dipisahkan terdiri dari waktu interaksi dalam kolom dan waktu lewatnya bagian kosong tabung, maka waktu tersebut bervariasi dari satu instrumen ke instrumen lainnya. Akan lebih mudah jika suatu zat tidak tertahan oleh kolom tertentu, dengan menjadikannya sebagai standar yang waktu dan volume retensinya T 0 , V o. Kromatografi zat dan standar harus dilakukan pada kondisi yang sama (tekanan dan laju aliran). Ketika diidentifikasi dengan data retensi, zat individu yang diketahui yang mungkin ada dalam sampel dipisahkan pada sistem kromatografi yang sama dan nilainya diperoleh. t R. Membandingkan nilai-nilai ini t R dengan waktu retensi dari puncak yang tidak diketahui, dapat ditemukan bahwa keduanya bertepatan, dalam hal ini kemungkinan besar puncak-puncak tersebut berhubungan dengan zat yang sama, atau t R zat yang diketahui tidak sesuai t R zona yang tidak diketahui. Maka perkiraan perkiraan nilainya masih dimungkinkan t R zat yang tidak tersedia untuk pengukuran langsung tingkat retensinya. Mari kita pertimbangkan kedua opsi tersebut.

Dalam kasus pertama, studi pendahuluan terhadap sampel jelas diperlukan untuk mendalilkan keberadaan zat tertentu di dalamnya. Saat bekerja dengan campuran sederhana, mudah untuk menentukan apakah tingkat retensi zona sampel dan zat yang diketahui bertepatan atau tidak, yaitu nilainya TB sama atau berbeda. Dalam kasus campuran kompleks, beberapa zat dapat terelusi dengan nilai yang sama t R, dan zona yang sebenarnya diperoleh selama pemisahan kromatografi tumpang tindih. Hasilnya, diperoleh nilai yang akurat t R menjadi tidak mungkin untuk zona yang berbeda. Keandalan identifikasi meningkat seiring dengan meningkatnya resolusi, kontrol kondisi pemisahan yang lebih cermat, dan pengukuran nilai yang berulang t R dan rata-rata nilai yang ditemukan. Dalam hal ini, pemisahan kromatografi zat yang diketahui dan zat yang tidak diketahui harus bergantian. Saat memisahkan campuran kompleks, nilainya t R zat dapat berubah di bawah pengaruh matriks sampel itu sendiri. Efek ini mungkin terjadi pada awal kromatogram dan ketika puncaknya tumpang tindih; Dimungkinkan juga untuk memperketat zona, seperti yang telah disebutkan.

Dalam kasus seperti ini, standar harus ditambahkan ke sampel dengan perbandingan 1:1. Jika zatnya identik, nilainya t R bahan awal tidak berubah, dan hanya satu puncak yang diperoleh pada kromatogram. Jika Anda memiliki perangkat dengan sistem kromatografi siklik, maka untuk identifikasi yang andal, disarankan untuk melewatkan campuran melalui kolom beberapa kali.

Informasi mengenai tingkat retensi juga dapat ditemukan dalam literatur, namun nilai informasi ini terbatas. Karena kolom-kolom dari kumpulan yang sama memberikan reproduktifitas yang buruk, nilai literatur tidak selalu sesuai dengan nilai sebenarnya t R pada kolom ini. Namun, untuk kromatografi adsorpsi, hal ini dapat diprediksi t R berdasarkan data literatur. Kesulitan lain terkait dengan penggunaan makna sastra t R, - kesulitan menemukannya dalam literatur khusus, meskipun tinjauan bibliografi yang diterbitkan di Jornal of Chromatography memiliki indeks terbaru berdasarkan jenis zat.

Dalam kasus kedua, ketika waktu retensi senyawa yang diketahui dan zona sampel tidak bersamaan, waktu retensi komponen yang tidak diketahui dapat diprediksi. Prediksi retensi relatif berdasarkan data struktur dalam kromatografi eksklusi sterik cukup dapat diandalkan. Mereka kurang akurat dalam kromatografi adsorpsi dan partisi, dan terutama ketika bekerja pada fase yang terikat secara kimia. Untuk kromatografi ion dan pasangan ion zat yang diketahui p Ka Hanya penentuan nilai perkiraan yang mungkin dilakukan tr. Selalu lebih mudah untuk memprediksi retensi relatif atau nilai *x daripada nilai absolut k". Nilai relatif t R lebih mudah untuk menilai senyawa atau turunannya yang terkait, seperti asam alkilkarboksilat tersubstitusi atau turunan benzena.

Ketika memisahkan homolog atau oligomer secara isokratis, pola berikut terkadang diamati:

\ gk" = A + Bn,

Di mana A Dan DI DALAM- konstanta untuk sejumlah sampel yang dipilih dan untuk sistem kromatografi tertentu (pada kolom yang sama, dengan fase gerak dan fase diam yang sama); P- jumlah unit struktural yang identik dalam molekul sampel.

Masuknya suatu gugus fungsi/ke dalam molekul sampel akan menimbulkan suatu perubahan k" dalam persamaan pertama dengan beberapa koefisien konstan a/ dalam sistem kromatografi tertentu. Konstanta golongan a/ dapat diperoleh untuk berbagai gugus substituen/, yang nilainya akan meningkat seiring dengan meningkatnya polaritas gugus fungsi pada semua jenis kromatografi, kecuali fase terbalik, di mana nilai konstanta akan menurun seiring dengan meningkatnya polaritas.

Beberapa konstanta golongan a/ untuk berbagai gugus substituen/ diberikan dalam tabel. 9.1.

Dalam kromatografi adsorpsi, persamaan pertama tidak selalu berlaku, karena persamaan tersebut valid asalkan semua isomer memiliki nilai yang sama k", yang tidak selalu diperhatikan. Namun demikian, dimungkinkan untuk memplot logfe" dari senyawa yang sama pada satu kolom versus logfe" dari senyawa yang sama pada kolom yang berbeda atau versus karakteristik yang sesuai dalam kromatografi lapis tipis, misalnya, log[(l- Rf) IRf].

Nilai koefisien kapasitas dapat digunakan saat membandingkan data retensi k", karena tidak seperti dia t R kecepatan fase gerak dan fitur geometri kolom tidak terpengaruh.

Pemisahan fasa yang terikat secara kimia mirip dengan pemisahan kromatografi partisi dengan fasa yang serupa, dan oleh karena itu data ekstraksi keadaan tunak dapat digunakan untuk memprediksi waktu retensi.

Dalam kromatografi penukar ion, tiga faktor mempengaruhi derajat retensi: derajat ionisasi asam dan basa, muatan molekul yang terionisasi, dan kemampuan zat dari fase gerak berair yang digunakan dalam kromatografi penukar ion untuk bermigrasi ke bahan organik. fase. Yang terakhir ini bergantung pada berat molekul senyawa dan hidrofobisitasnya. Akibatnya, asam atau basa yang lebih kuat akan tertahan lebih kuat selama pemisahan pertukaran anion atau pertukaran kation. Saat menurun pK a dari suatu asam individu yang termasuk dalam sampel, retensi meningkat ketika sejumlah asam dipisahkan karena pertukaran anion, dan dengan peningkatan p/C o, retensi basa meningkat ketika mereka dipisahkan karena pertukaran kation.

Dengan demikian, kebetulan waktu retensi suatu zat yang diketahui dengan zat yang diamati memungkinkan kita untuk mengasumsikan identitasnya. Keandalan identifikasi meningkat jika kromatogram zat yang diketahui dan komponen yang tidak diketahui dibandingkan dalam kondisi berbeda. Jika zat berperilaku identik dalam kromatografi adsorpsi dan fase balik atau pertukaran ion dan eksklusi ukuran, keandalan identifikasi meningkat. Jika reliabilitas identifikasi dengan retensi relatif yang sama adalah 90%, maka ketika mempelajari perilaku zat yang sama dalam kondisi yang berbeda secara signifikan, reliabilitas identifikasi sudah mencapai 99%.

Karakteristik berharga dari suatu zat yang digunakan dalam identifikasi adalah rasio sinyal yang diperoleh suatu zat pada dua detektor berbeda. Zat yang dianalisis, setelah keluar dari kolom, pertama-tama melewati detektor pertama, kemudian melalui detektor kedua, dan sinyal yang berasal dari detektor dicatat secara bersamaan menggunakan perekam multi-pena atau pada dua perekam. Biasanya digunakan sambungan seri detektor ultraviolet (lebih sensitif, tetapi selektif) dengan refraktometer, atau detektor ultraviolet dengan detektor fluoresensi, atau dua detektor ultraviolet yang beroperasi pada panjang gelombang berbeda. Respon relatif, yaitu rasio sinyal refraktometer terhadap sinyal fotometer, merupakan karakteristik suatu zat, asalkan kedua detektor beroperasi dalam rentang liniernya; ini diuji dengan memberikan jumlah zat yang sama dalam jumlah yang berbeda. Informasi kualitatif dapat diperoleh dengan bekerja menggunakan detektor fotometrik yang dilengkapi dengan perangkat penghenti aliran yang memungkinkan spektrum puncak yang muncul dari kolom dicatat saat berada di dalam sel aliran, membandingkannya dengan spektrum senyawa yang diketahui.

Spektrofotometer yang modern dan masih mahal dengan susunan dioda sangat menarik dalam identifikasi.

Zat yang sama sekali tidak diketahui tidak dapat diidentifikasi hanya dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi;

ANALISIS KUANTITATIF

Kromatografi cair kuantitatif adalah metode analisis yang dikembangkan dengan baik yang akurasinya tidak kalah dengan kromatografi gas kuantitatif dan secara signifikan melebihi akurasi KLT atau elektroforesis. Sayangnya, dalam HPLC tidak ada detektor yang memiliki sensitivitas dekat untuk senyawa dengan struktur kimia berbeda (). seperti katharometer di GLC). Oleh karena itu, untuk memperoleh hasil kuantitatif, kalibrasi perangkat wajib dilakukan.

Analisis kuantitatif terdiri dari tahapan sebagai berikut: 1) pemisahan kromatografi; 2) pengukuran luas puncak atau ketinggian; 3) perhitungan komposisi kuantitatif campuran berdasarkan data kromatografi; 4) interpretasi hasil yang diperoleh, yaitu pengolahan statistik. Mari kita pertimbangkan semua tahapan ini.

4.1. PEMISAHAN KHRMATOGRAFIS

Kesalahan mungkin terjadi selama pengumpulan sampel. Hal ini sangat penting untuk menghindari kesalahan dan mendapatkan sampel representatif yang memadai dari padatan heterogen, zat yang mudah menguap atau tidak stabil, serta produk pertanian dan biomaterial. Sampel yang heterogen, misalnya produk makanan, dicampur seluruhnya dan dipotong-potong. Dengan melakukan operasi ini berkali-kali, homogenitas sampel tercapai.

Kesalahan dan kehilangan zat dapat terjadi pada tahap ekstraksi, isolasi, pemurnian, dan lain-lain.

Sampel harus benar-benar larut dan larutannya disiapkan dengan akurasi ±0,1%. Dianjurkan untuk melarutkan sampel dalam fase gerak, yang akan menghilangkan kemungkinan pengendapan setelah dimasukkan ke dalam kromatografi. Jika pelarutan dalam fase gerak tidak memungkinkan, maka pelarut yang dapat bercampur dengannya harus digunakan dan volume sampel (kurang dari 25 μl) harus dimasukkan ke dalam kromatografi.

Kesalahan yang signifikan dapat terjadi selama injeksi sampel karena fraksinasi sampel, kebocoran, dan olesan puncak. Kekaburan puncak menyebabkan pembentukan ekor, menyebabkan tumpang tindih sebagian puncak dan, sebagai konsekuensinya, kesalahan dalam pendeteksian. Perangkat katup loop lebih disukai daripada jarum suntik untuk memasukkan sampel dalam analisis kuantitatif karena akurasi yang lebih tinggi dan ketergantungan operator yang lebih sedikit.

Ketika pemisahan zat secara kromatografi, komplikasi juga dapat timbul yang menyebabkan distorsi data: analisis kuantitatif. Mungkin terjadi dekomposisi atau konversi sampel selama proses kromatografi atau adsorpsi zat yang tidak dapat diubah ke dalam kolom. Penting untuk memastikan tidak adanya fenomena yang tidak diinginkan ini dan, jika perlu, membuat ulang kolom atau menggantinya. Tumpang tindih puncak dan tailing juga dapat dikurangi dengan memvariasikan kondisi kromatografi.

Puncak dengan bentuk yang salah atau tidak jelas, serta puncak yang waktu pelepasannya dekat ke, karena pemisahan mereka mungkin tidak cukup. Biasanya, puncak dengan nilai d"^0,5 digunakan. Efisiensi kolom tertinggi dicapai dengan memasukkan 10~ 5 -10~ 6 g zat terlarut per 1 g sorben. Saat memasukkan sampel dalam jumlah besar, ketergantungan ketinggian puncak pada beban mungkin berubah menjadi nonlinier dan penilaian kuantitatif berdasarkan luas puncak diperlukan.

Kesalahan yang terkait dengan deteksi atau amplifikasi menyebabkan distorsi yang signifikan pada hasil pemisahan kromatografi. Setiap detektor dicirikan oleh spesifisitas, linearitas, dan sensitivitas. Pengujian selektivitas sangat penting ketika menganalisis jejak pengotor. Respons detektor UV dapat bervariasi hingga 104 kali lipat terhadap zat dengan gugus fungsi serupa. Respon detektor untuk setiap analit perlu dikalibrasi. Secara alami, zat yang tidak menyerap pada daerah UV tidak akan memberikan sinyal pada perekam bila digunakan sebagai pendeteksi fotometer. Saat menggunakan refraktometer, puncak negatif mungkin muncul. Selain itu, detektor ini harus termostat, yang tidak diperlukan untuk detektor UV.

Linearitas detektor menentukan ukuran sampel yang disuntikkan. Penting untuk diingat bahwa laju aliran kolom, suhu kolom dan detektor, serta desain detektor semuanya mempengaruhi keakuratan analisis kuantitatif. Kesalahan dalam transmisi sinyal listrik ke perangkat keluaran (perekam), integrator atau komputer dapat timbul karena induksi kebisingan, kurangnya grounding, fluktuasi tegangan pada jaringan, dll.

4.2. PENGUKURAN WILAYAH PUNCAK ATAU TINGGI

Ketinggian puncak H (Gbr. 10.1) adalah jarak dari puncak puncak ke garis dasar; diukur secara linier atau dengan menghitung jumlah pembagian pada alat perekam. Beberapa integrator elektronik dan komputer memberikan informasi tentang ketinggian puncak. Posisi garis pangkal puncak yang bergeser diketahui dengan menginterpolasi nilai ordinat yang sesuai dengan awal dan akhir puncak (puncak 1 dan 3 lihat gambar. 10.1). Untuk meningkatkan akurasi, diperlukan garis dasar yang datar dan stabil. Dalam kasus puncak yang tidak terbagi, garis dasar ditarik antara awal dan akhir puncak, bukan diganti dengan garis nol. Karena ketinggian puncak tidak terlalu bergantung pada pengaruh puncak-puncak yang berdekatan, estimasi ketinggian puncak lebih akurat dan hampir selalu digunakan dalam analisis jejak.

Area puncak dapat ditentukan dengan berbagai cara. Mari kita lihat beberapa di antaranya.

1. Metode planimetri melibatkan penelusuran puncak dengan planimeter genggam, yaitu alat yang secara mekanis menentukan luas puncak. Metode ini akurat, namun memakan banyak tenaga dan sulit direproduksi. Cara ini tidak disarankan.

2. Metode siluet kertas - bagian atasnya dipotong dan ditimbang. Metode ini sangat mudah direproduksi, namun membutuhkan banyak tenaga kerja, dan kromatogramnya rusak. Penerapannya bergantung pada keseragaman strip grafik. Metode ini juga tidak dapat direkomendasikan secara luas.

4. Metode triangulasi terdiri dari pembuatan segitiga dengan menggambar garis singgung pada sisi-sisi puncaknya. Puncak segitiga lebih tinggi dari puncak puncaknya. Peningkatan luas yang dibentuk oleh titik yang diperluas ini akan konsisten di seluruh kromatogram dan tidak akan terlalu mempengaruhi keakuratan. Selain itu, beberapa area yang hilang saat menggambar garis singgung akan dikompensasi. Alas segitiga ditentukan oleh perpotongan garis singgung dengan garis alas, dan luasnya ditentukan oleh hasil kali 7 g alas dan tinggi. Metode ini adalah yang terbaik untuk menentukan luas puncak asimetris. Namun, reproduktifitas ketika membuat garis singgung oleh operator yang berbeda berbeda-beda dan oleh karena itu; rendah.

5. Metode integrator disk didasarkan pada perangkat elektromekanis yang terpasang pada perekam. Pena yang terpasang pada integrator bergerak sepanjang strip di bagian bawah pita dengan kecepatan yang sebanding dengan pergerakan pena perekam.

Seperti halnya pengukuran manual, puncak harus tetap berada pada skala perekam, namun penyesuaian untuk mengimbangi pergeseran garis dasar dan pemisahan yang tidak lengkap dari puncak yang berdekatan mengurangi keandalan dan meningkatkan waktu analisis.

Metode ini lebih akurat dibandingkan metode pengukuran manual, terutama untuk puncak asimetris, dan menawarkan keunggulan kecepatan. Selain itu, ini memberikan catatan analisis kuantitatif yang permanen.

6. Metode yang menggunakan integrator elektronik yang menentukan area puncak dan mencetak informasi tentang area tersebut serta waktu retensi dapat mencakup koreksi pergeseran garis dasar dan menentukan area puncak yang hanya terselesaikan sebagian. Keuntungan utamanya adalah akurasi, kecepatan, kemandirian tindakan dari pengoperasian perekam. Integrator memiliki memori dan dapat diprogram untuk analisis tertentu menggunakan program yang sudah diinstal sebelumnya. Keuntungan dari integrator termasuk kemampuannya untuk menggunakan faktor koreksi respons detektor ketika menghitung ulang data asli pada area puncak, mengkompensasi perbedaan sensitivitas detektor terhadap zat yang berbeda. Sistem seperti ini menghemat waktu, meningkatkan akurasi analitis, dan berguna untuk analisis analitis rutin.

7. Dalam kromatografi cair, komputer banyak digunakan untuk mengukur luas puncak. Mereka mencetak pesan lengkap, termasuk nama zat, area puncak, waktu retensi, faktor koreksi respons detektor, dan kelimpahan (% berat) untuk berbagai komponen sampel.

Kromatografi cair adalah metode untuk memisahkan dan menganalisis campuran kompleks zat yang fase geraknya berupa cairan. Ini berlaku untuk pemisahan zat yang lebih luas daripada kromatografi gas. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa sebagian besar zat tidak mudah menguap, banyak di antaranya tidak stabil pada suhu tinggi (terutama senyawa bermolekul tinggi) dan terurai ketika diubah menjadi gas. Pemisahan zat dengan kromatografi cair paling sering dilakukan pada suhu kamar.

Keunikan semua jenis kromatografi cair disebabkan oleh fakta bahwa fase gerak di dalamnya adalah cair, dan penyerapan komponen dari eluen gas dan cair berlangsung secara berbeda. Jika dalam kromatografi gas gas pembawa hanya melakukan fungsi transpor dan tidak diserap oleh fasa diam, maka fasa gerak cair dalam kromatografi cair merupakan eluen aktif; molekulnya dapat diserap oleh fasa diam. Ketika melewati kolom, molekul komponen campuran yang dianalisis yang terletak di eluen harus menggantikan molekul eluen dari lapisan permukaan sorben, yang menyebabkan penurunan energi interaksi molekul analit. dengan permukaan sorben. Oleh karena itu, nilai volume ditahan V R, sebanding dengan perubahan energi bebas sistem, pada kromatografi cair lebih kecil dibandingkan pada kromatografi gas, dan kisaran linearitas isoterm serapan dalam kromatografi cair lebih luas.

Dengan menggunakan eluen yang berbeda, parameter retensi dan selektivitas sistem kromatografi dapat diubah. Selektivitas dalam kromatografi cair, tidak seperti kromatografi gas, ditentukan bukan oleh satu, tetapi oleh dua faktor - sifat fase gerak (eluen) dan fase diam.

Fase gerak cair memiliki kepadatan dan viskositas yang lebih tinggi dibandingkan fase gas, koefisien difusi D Dan 3–4 kali lipat lebih rendah dibandingkan gas. Hal ini menyebabkan perpindahan massa dalam kromatografi cair lebih lambat dibandingkan dengan kromatografi gas. Persamaan Van Deemter disebabkan oleh fakta bahwa istilah tersebut DI DALAM tidak berperan dalam kromatografi cair ( D Dan  D G), ketergantungan grafis dari efisiensi juga berubah N dari laju aliran linier fase gerak memiliki bentuk yang ditunjukkan pada Gambar. 1.9.

Dalam versi klasik kromatografi cair kolom, sampel yang dianalisis, dilarutkan dalam eluen, dimasukkan ke dalam kolom kaca setinggi 1-2 m, diisi dengan sorben dengan ukuran partikel 100 μm dan eluen, dan eluen dilewatkan melalui , memilih bagian eluat di pintu keluar kolom. Versi kromatografi cair ini masih digunakan dalam praktik laboratorium, tetapi karena laju aliran eluen di bawah pengaruh gravitasi rendah, analisisnya memakan waktu lama.

Versi modern dari kromatografi cair, yang disebut kromatografi cair kinerja tinggi HPLC, menggunakan sorben volumetrik dan berpori permukaan dengan ukuran partikel 5–10 mikron, pompa injeksi yang memberikan tekanan sistem hingga 400 atm, dan detektor yang sangat sensitif. Perpindahan massa yang cepat dan efisiensi pemisahan yang tinggi memungkinkan penggunaan HPLC untuk pemisahan molekul (adsorpsi cair dan kromatografi partisi cair-cair), untuk pemisahan ion (penukar ion, ion, kromatografi pasangan ion), untuk pemisahan makromolekul (kromatografi eksklusi ukuran).

1.3. RETENSI DAN KEKUATAN PELARUT

Agar zat yang dianalisis dapat dipisahkan pada kolom, seperti disebutkan di atas, koefisien kapasitas k" harus lebih besar dari 0, yaitu zat harus ditahan oleh fase diam, yaitu sorben. Namun, koefisien kapasitas tidak boleh terlalu besar untuk mendapatkan waktu elusi yang dapat diterima. Jika untuk campuran zat tertentu dipilih fase diam yang menahannya, maka pengembangan teknik analisis lebih lanjut terdiri dari pemilihan pelarut yang idealnya menghasilkan pelarut yang berbeda tetapi dapat diterima. tidak terlalu besar k". Hal ini dicapai dengan mengubah kekuatan elusi pelarut.

Dalam kasus kromatografi adsorpsi pada silika gel atau aluminium oksida, sebagai suatu peraturan, kekuatan pelarut dua komponen (misalnya heksana dengan penambahan isopropanol) meningkat dengan meningkatnya kandungan komponen polar (isopropanol), atau dikurangi dengan menurunkan kandungan isopropanol. Jika kandungan komponen polar menjadi terlalu rendah (kurang dari 0,1%), maka harus diganti dengan gaya elusi yang lebih lemah. Hal yang sama dilakukan dengan mengganti komponen polar atau non-polar dengan komponen lain, meskipun sistem ini tidak memberikan selektivitas yang diinginkan sehubungan dengan komponen yang diinginkan dalam campuran. Saat memilih sistem pelarut, kelarutan komponen campuran dan rangkaian pelarut eluotropik yang disusun oleh penulis berbeda diperhitungkan.

Kekuatan pelarut dipilih dengan cara yang kira-kira sama ketika menggunakan fase polar yang dicangkokkan (nitril, amino, diol, nitro, dll.), dengan mempertimbangkan kemungkinan reaksi kimia dan tidak termasuk pelarut yang berbahaya bagi fase tersebut (misalnya, aldehida dan keton). untuk fase amino).

Dalam kasus kromatografi fase terbalik, kekuatan pelarut ditingkatkan dengan meningkatkan kandungan komponen organik dalam eluen (metanol, asetonitril atau THF) dan menurun dengan penambahan lebih banyak air. Jika selektivitas yang diinginkan tidak dapat dicapai, mereka menggunakan komponen organik lain atau mencoba mengubahnya menggunakan berbagai aditif (asam, reagen pasangan ion, dll.).

Dalam pemisahan menggunakan kromatografi penukar ion, kekuatan pelarut diubah dengan menambah atau mengurangi konsentrasi larutan buffer atau mengubah pH; dalam beberapa kasus, modifikasi dengan zat organik digunakan.

Namun, khususnya dalam kasus campuran alami dan biologis yang kompleks, seringkali tidak mungkin untuk memilih kekuatan pelarut sehingga semua komponen sampel terelusi dalam jangka waktu yang dapat diterima. Maka Anda harus menggunakan elusi gradien, mis. menggunakan pelarut yang kekuatan elusinya berubah selama proses analisis sehingga terus meningkat sesuai program yang telah ditentukan. Teknik ini memungkinkan tercapainya elusi seluruh komponen campuran kompleks dalam waktu yang relatif singkat dan pemisahannya menjadi komponen-komponen dalam bentuk puncak yang sempit.

1.6.1. Kromatografi cair adsorpsi. Kromatografi cair adsorpsi, tergantung pada polaritas fase diam dan fase gerak, dibagi menjadi kromatografi fase normal (NPC) dan fase balik (RPC). Pada NPC, digunakan adsorben polar dan fase gerak non-polar, pada OPC, digunakan adsorben non-polar dan fase gerak polar, namun pada kedua opsi, pilihan fase gerak seringkali lebih penting daripada pilihan fase gerak. fase diam. Fase diam harus menahan zat-zat yang dipisahkan. Fase gerak, yaitu pelarut, harus menyediakan kapasitas kolom yang bervariasi dan pemisahan yang efisien dalam waktu yang dapat diterima.

Bahan berpori halus polar dan non-polar dengan luas permukaan spesifik lebih dari 50 m 2 /g digunakan sebagai fase diam dalam kromatografi cair adsorpsi. Adsorben polar (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil, dll) mempunyai gugus asam lemah pada permukaannya yang dapat menahan zat yang bersifat basa. Adsorben ini digunakan terutama untuk pemisahan senyawa non-polar dan agak polar. Kerugiannya adalah sensitivitasnya yang tinggi terhadap kandungan air dalam eluen yang digunakan. Untuk menghilangkan kelemahan ini, sorben polar diolah dengan amina, diol dan reagen lainnya, sehingga terjadi pencangkokan permukaan reagen ini, modifikasi permukaan dan perubahan selektivitas terhadap analit.

Adsorben non-polar (karbon hitam grafit, tanah diatom, kieselguhr) tidak selektif terhadap molekul polar. Untuk mendapatkan adsorben non-polar, gugus non-polar sering dicangkokkan ke permukaan, misalnya silika gel, misalnya alkilsilil -SiR 3, di mana gugus R -alkil adalah C 2 -C 22.

Fase gerak harus benar-benar melarutkan sampel yang dianalisis, mempunyai viskositas yang rendah (sehingga koefisien difusi cukup besar), dan diinginkan agar komponen yang terpisah dapat diisolasi dari sampel tersebut. Itu harus inert terhadap bahan seluruh bagian kromatografi, aman, murah, dan cocok untuk detektor.

Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi cair bervariasi dalam kekuatan elusinya. Gaya elusi suatu pelarut menunjukkan berapa kali energi serapan suatu eluen tertentu pada adsorben tertentu lebih besar daripada energi serapan eluen yang dipilih sebagai standar, misalnya n-heptana. Pelarut yang lemah teradsorpsi dengan buruk oleh fase diam, sehingga koefisien distribusi zat yang diserap (sorbat) tinggi. Sebaliknya, pelarut kuat teradsorpsi dengan baik, sehingga koefisien partisi sorbatnya rendah. Semakin kuat pelarutnya, semakin tinggi kelarutan sampel yang dianalisis di dalamnya, dan semakin kuat interaksi pelarut-sorbatnya.

Untuk memastikan efisiensi pemisahan yang tinggi pada kolom, penting untuk memilih fase gerak yang memiliki polaritas yang optimal agar campuran dapat dipisahkan pada kondisi pemisahan yang dipilih. Biasanya, fase diam pertama kali dipilih yang memiliki polaritas dekat dengan komponen yang dipisahkan. Kemudian fase gerak dipilih, memastikan bahwa koefisien kapasitas k" ternyata berada pada kisaran 2 sampai 5. Jika polaritas fase gerak terlalu dekat dengan polaritas fase diam, maka waktu retensi komponen akan terlalu pendek, dan jika polaritas fase gerak dan stasioner fasenya sangat berbeda, waktu retensi akan menjadi terlalu lama.

Saat memilih fase gerak, mereka dipandu oleh apa yang disebut deret eluotropik, berdasarkan penggunaan indeks polaritas Snyder R", yang membagi semua pelarut menjadi kuat (polar) dan lemah (polar lemah dan non-polar). Skala polaritas didasarkan pada kelarutan zat yang digunakan sebagai fase gerak dalam dioksan, nitrometana, dan etanol.

Tabel 1.2 menunjukkan nilai indeks polaritas dan gaya elusi (relatif terhadap SiO 2) untuk sejumlah pelarut yang paling sering digunakan dalam kromatografi cair sebagai fase gerak. Batas transparansi panjang gelombang pendek dari pelarut ini juga ditunjukkan di sini, yang memfasilitasi pemilihan kondisi untuk mendeteksi komponen campuran.

Tabel 1.2

Karakteristik pelarut yang digunakan dalam kromatografi cair

Pelarut	Indeks polaritas	Kekuatan elusi (SiO 2)	Batas transparansi panjang gelombang pendek
Fluoroalkan
sikloheksana
N-Heksana
Karbon tetraklorida
Diisopropil eter
Dietil eter
Diklorometana
Tetrahidrofuran
Khloroform
Asam asetat
Asetonitril
Nitrometana

Dalam kromatografi cair, campuran keduanya sering digunakan dibandingkan pelarut individual. Seringkali penambahan sedikit pelarut lain, terutama air, akan meningkatkan kekuatan eluen secara signifikan.

Saat memisahkan campuran multikomponen, satu fase gerak sebagai eluen mungkin tidak dapat memisahkan semua komponen sampel dalam waktu yang dapat diterima. Dalam hal ini, metode elusi bertahap atau gradien digunakan, di mana eluen yang semakin kuat digunakan secara berurutan selama proses kromatografi, yang memungkinkan untuk mengelusi zat yang sangat tertahan dalam waktu yang lebih singkat.

Dalam kromatografi cair ada beberapa empiris aturan yang sangat berguna ketika memilih eluen:

- penyerapan suatu senyawa, sebagai suatu peraturan, meningkat dengan peningkatan jumlah ikatan rangkap dan gugus OH di dalamnya;

 penyerapan menurun pada sejumlah senyawa organik: asam alkoholaldehidaketonesterhidrokarbon tak jenuhhidrokarbon jenuh;

 untuk memisahkan zat dengan polaritas berbeda dan memisahkan zat dari kelas berbeda, digunakan kromatografi fase normal: sampel yang dianalisis dilarutkan dan dielusi dengan eluen non-polar, senyawa dari kelas berbeda meninggalkan kolom dengan adsorben polar pada waktu yang berbeda, sedangkan waktu retensi senyawa dengan gugus fungsi berbeda meningkat selama transisi dari senyawa non-polar ke senyawa polar lemah. Untuk molekul yang sangat polar, waktu retensinya sangat lama sehingga analisis tidak mungkin dilakukan dengan eluen non-polar. Untuk mengurangi waktu retensi komponen polar, beralihlah ke eluen polar;

 pada versi fase terbalik, fase diam (adsorben non-polar) lebih kuat mengadsorpsi komponen non-polar dari eluen polar, misalnya dari air;

- Dengan mengurangi polaritas eluen dengan menambahkan pelarut yang kurang polar, retensi komponen dapat dikurangi.

1.6.2. Kromatografi cair partisi. Dalam kromatografi partisi atau cair-cair, pemisahan komponen-komponen sampel yang dianalisis disebabkan oleh perbedaan koefisien distribusinya antara dua fasa cair yang tidak dapat bercampur, salah satunya diam dan terletak pada permukaan atau pori-pori suatu padatan. pembawa stasioner, dan yang kedua adalah pembawa bergerak.

Dilihat dari sifat gaya interaksi yang menentukan perbedaan distribusi antara dua fasa zat yang berbeda struktur kimianya, kromatografi partisi mirip dengan kromatografi adsorpsi, yaitu di sini juga pemisahannya didasarkan pada perbedaan. kekuatan interaksi antarmolekul antara komponen sampel yang dianalisis dan fase cair diam dan bergerak.

Tergantung pada tekniknya, kromatografi partisi, seperti kromatografi adsorpsi, dapat berbentuk kolom atau planar (kertas atau lapis tipis).

Zat yang tidak terpengaruh oleh pelarut bergerak dan komponen sampel yang dianalisis, namun mampu mempertahankan fase diam di permukaan dan pori-pori, digunakan sebagai pembawa padat. Paling sering, zat polar (selulosa, silika gel, pati) digunakan sebagai pembawa. Fase diam—pelarut polar, paling sering air atau alkohol—diberikan padanya. Dalam hal ini, zat yang kurang polar atau non-polar (alkohol, amina, keton, hidrokarbon, dll.) digunakan sebagai fase gerak. Kromatografi partisi jenis ini disebut fase normal. Ini digunakan untuk memisahkan zat polar.

Versi kedua dari kromatografi partisi berbeda karena pembawa non-polar (karet, fluoroplastik, gel silika terhidrofob) digunakan sebagai fase padat stasioner, pelarut non-polar (hidrokarbon) digunakan sebagai fase cair stasioner, dan pelarut polar (alkohol) digunakan sebagai fase diam. , aldehida) digunakan sebagai fase cair gerak , keton, dll., sering kali air). Versi kromatografi partisi ini disebut fase terbalik dan digunakan untuk memisahkan zat non-polar.

Untuk mencapai pemisahan komponen sampel yang dianalisis secara optimal, pemilihan fase gerak sangatlah penting. Pelarut (fasa cair bergerak dan diam) harus dipilih sedemikian rupa sehingga koefisien distribusi komponen campuran berbeda cukup signifikan. Persyaratan berikut berlaku untuk fase cair: persyaratan:

1) pelarut yang digunakan harus melarutkan zat yang dipisahkan dengan baik, dan kelarutannya dalam fase diam harus lebih besar daripada fase gerak;

2) pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dan fase diam harus saling jenuh, yaitu komposisi pelarut harus konstan selama melewati kolom;

3) interaksi pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dengan fase diam harus minimal.

Paling sering, dalam kromatografi cair partisi, bukan zat individu, tetapi campurannya dalam berbagai rasio digunakan sebagai fase cair bergerak. Hal ini memungkinkan untuk mengatur polaritas fase gerak, mengubah rasio polaritas fase gerak dan fase diam, dan mencapai kondisi optimal untuk pemisahan komponen campuran tertentu yang dianalisis.

Kerugian yang signifikan dari metode kromatografi ini adalah bahwa fase cair diam yang diterapkan dengan cepat tersapu dari pembawa. Untuk menghilangkannya, pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dijenuhkan dengan zat yang digunakan sebagai fase cair diam, atau fase cair diam distabilkan dengan mencangkokkannya ke pembawa.

Variasi kromatografi cair partisi adalah metode HPLC yang banyak digunakan.

Sistem kromatografi yang paling umum adalah sistem yang memiliki prinsip perakitan modular. Pompa, perangkat degassing, detektor, dispenser (autosampler), termostat kolom, pengumpul fraksi, unit kontrol sistem kromatografi, dan perangkat perekam tersedia sebagai modul terpisah. Berbagai pilihan modul memungkinkan Anda menyelesaikan berbagai masalah analitis secara fleksibel dan dengan cepat mengubah konfigurasi sistem jika perlu dengan biaya minimal. Pada saat yang sama, LC monomodular (terintegrasi) juga diproduksi, keunggulan utamanya adalah miniaturisasi masing-masing unit dan kekompakan perangkat.

Tergantung pada metode elusinya, kromatografi cair dibagi menjadi isokratik dan gradien.

Skema kromatografi isokratik

Fase gerak dari wadah (1) melalui filter saluran masuk (9) disuplai oleh pompa bertekanan tinggi presisi (2) ke sistem injeksi sampel (3) - injektor manual atau autosampler, dan sampel juga dimasukkan ke sana. . Selanjutnya, melalui filter in-line (8), sampel dengan arus fase gerak memasuki elemen pemisah (elemen) (4) - melalui pra-kolom ke dalam kolom pemisah. Kemudian, eluat memasuki detektor (5) dan dibuang ke wadah pembuangan (7). Ketika eluat mengalir melalui rangkaian pengukuran detektor, kromatogram dicatat dan data ditransfer ke perekam analog (perekam) (6) atau sistem lain untuk mengumpulkan dan memproses data kromatografi (integrator atau komputer). Tergantung pada desain modul fungsional, sistem dapat dikontrol dari keyboard modul kontrol (biasanya pompa atau pengontrol sistem), dari keyboard masing-masing modul sistem, atau dengan program kontrol dari komputer pribadi.

Dalam kasus elusi gradien, digunakan dua jenis kromatografi cair yang berbeda secara mendasar. Mereka berbeda pada titik di mana gradien komposisi fase gerak terbentuk.

Skema kromatografi gradien dengan pembentukan gradien komposisi fase gerak pada garis tekanan rendah.

Fase gerak dari wadah (1) melalui filter masukan (9) dan pemrogram gradien (10) disuplai oleh pompa bertekanan tinggi presisi (2) ke sistem injeksi sampel (3) - injektor manual atau autosampler, dan sampel juga diperkenalkan di sana. Pengoperasian katup pemrogram gradien dikendalikan baik oleh modul kontrol sistem (pompa atau pengontrol) atau oleh program kontrol PC. Sistem jenis ini membentuk gradien biner, tiga dimensi, dan empat dimensi. Bentuk fungsi pemrosesan gradien bergantung pada modul kontrol atau program kontrol tertentu, serta fungsionalitas modul yang dikontrol dan dikontrol. Selanjutnya, melalui filter in-line (8), sampel dengan arus fase gerak memasuki elemen pemisah (elemen) (4) - melalui pra-kolom ke dalam kolom pemisah. Kemudian, eluat memasuki detektor (5) dan dibuang ke wadah pembuangan (7). Ketika eluat mengalir melalui rangkaian pengukuran detektor, kromatogram dicatat dan data ditransfer ke perekam analog (perekam) (6) atau sistem lain untuk mengumpulkan dan memproses data kromatografi (integrator atau komputer). Tergantung pada desain modul fungsional, sistem dapat dikontrol dari keyboard modul kontrol (biasanya pompa atau pengontrol sistem), atau dilakukan oleh program kontrol dari komputer pribadi. Dalam hal kontrol dengan modul kontrol, detektor dapat dikontrol secara mandiri dari keyboardnya sendiri.

Walaupun sistem seperti itu terlihat menarik (hanya menggunakan satu pompa bertekanan tinggi yang presisi), sistem ini mempunyai sejumlah kelemahan, di antaranya yang utama, barangkali, adalah perlunya degassing menyeluruh pada komponen fase gerak bahkan sebelum proses degassing. mixer bertekanan rendah (ruang pemrogram gradien). Itu dilakukan dengan menggunakan degasser aliran khusus. Karena fakta ini, biayanya menjadi sebanding dengan jenis sistem gradien lainnya - sistem dengan pembentukan komposisi gradien fase gerak pada saluran bertekanan tinggi.

Perbedaan mendasar antara sistem dengan pembentukan komposisi gradien fase gerak pada saluran bertekanan tinggi adalah pencampuran komponen dalam saluran bertekanan tinggi secara alami, dengan pendekatan ini, jumlah pompa presisi ditentukan oleh jumlah tangki; untuk mencampur fase gerak. Dengan pendekatan ini, persyaratan untuk degassing komponen secara menyeluruh berkurang secara signifikan.

Skema kromatografi gradien dengan pembentukan gradien komposisi fase gerak pada garis tekanan tinggi.

Fase gerak dari wadah (1) melalui filter masukan (9) disuplai oleh pompa bertekanan tinggi presisi (2 dan 11) melalui pencampur aliran statis atau dinamis (10) ke dalam sistem masukan sampel (3) - injektor manual atau autosampler, dan sampel juga diperkenalkan di sana. Pengoperasian pompa yang dikontrol dikendalikan baik oleh modul kontrol sistem (pompa induk atau pengontrol) atau oleh program kontrol PC. Dalam hal ini, semua pompa dapat dikontrol. Sistem jenis ini membentuk gradien biner atau tiga dimensi. Bentuk fungsi pemrosesan gradien bergantung pada modul kontrol atau program kontrol tertentu, serta fungsionalitas modul yang dikontrol dan dikontrol. Selanjutnya, melalui filter in-line (8), sampel dengan arus fase gerak memasuki elemen pemisah (elemen) (4) - melalui pra-kolom ke dalam kolom pemisah. Eluat kemudian memasuki detektor (5) dan dibuang ke dalam wadah pembuangan (7). Ketika eluat mengalir melalui rangkaian pengukuran detektor, kromatogram dicatat dan data ditransfer ke perekam analog (perekam) (6) atau sistem lain untuk mengumpulkan dan memproses data kromatografi (integrator atau komputer). Tergantung pada desain modul fungsional, sistem dapat dikontrol dari keyboard modul kontrol (biasanya pompa atau pengontrol sistem), atau dilakukan oleh program kontrol dari komputer pribadi. Dalam hal kontrol dengan modul kontrol, detektor dapat dikontrol secara mandiri dari keyboardnya sendiri.

Skema yang diusulkan cukup disederhanakan. Sistem tersebut dapat mencakup perangkat tambahan - termostat kolom, sistem derivatisasi pasca kolom, sistem preparasi sampel dan konsentrasi sampel, pendaur ulang pelarut, sistem membran untuk menekan konduktivitas listrik latar belakang (untuk kromatografi ion), sistem pelindung tambahan (filter, kolom), dll. Diagram juga tidak menunjukkan modul manometrik secara terpisah. Biasanya, perangkat ini dibangun ke dalam unit pompa. Unit-unit ini dapat menggabungkan beberapa pompa, satu pompa dengan pemrogram gradien, dan pengontrol sistem umum. Struktur sistem bergantung pada konfigurasinya dan masing-masing pabrikan tertentu.

Komplikasi radikal dari dukungan teknis proses kromatografi menyebabkan munculnya sejumlah persyaratan untuk sifat-sifat fase gerak yang tidak ada dalam kromatografi kolom dan bidang klasik. Fase cair harus sesuai untuk dideteksi (transparan di wilayah spektrum tertentu atau memiliki indeks bias rendah, konduktivitas listrik atau konstanta dielektrik tertentu, dll.), inert terhadap bahan bagian saluran kromatografi, bukan berbentuk gas gelembung di katup pompa dan sel detektor, tidak memiliki kotoran mekanis.

Dalam kromatografi cair Banyak jenis pompa yang digunakan. Untuk LC bertekanan rendah, pompa peristaltik sering digunakan (Gbr. 1).

Gambar 1 Pompa peristaltik MasterFlex yang dapat diprogram.

Dalam HPLC, pompa bertekanan tinggi digunakan untuk memastikan aliran fase gerak melalui kolom dengan parameter yang ditentukan.

Karakteristik teknis yang paling penting dari pompa HPLC meliputi: rentang aliran; tekanan kerja maksimum; reproduktifitas aliran; rentang pulsasi pasokan pelarut.

Tergantung pada sifat pasokan pelarut, pompa dapat memiliki pasokan (aliran) konstan dan tekanan konstan. Pada dasarnya, selama pekerjaan analitis, mode laju aliran konstan digunakan, dan saat mengisi kolom, mode tekanan konstan digunakan.

Berdasarkan prinsip pengoperasiannya, pompa HPLC dibagi menjadi: jarum suntik dan seterusnya penyelam Bergerak maju mundur .

Pompa jarum suntik

Ciri pembeda utama dari pompa ini adalah sifat siklus operasinya, dan oleh karena itu kromatografi yang menggunakan pompa ini juga dibedakan berdasarkan operasi siklusnya.

Beras. 2. Desain dasar pompa suntik untuk HPLC.

Beras. 2A. Pompa jarum suntik.

Unit kendali BU mensuplai tegangan ke motor D, yang menentukan kecepatan dan arah putarannya. Putaran mesin menggunakan gearbox P diubah menjadi pergerakan piston P di dalam silinder D. Pompa beroperasi dalam 2 siklus. Selama siklus pengisian, katup K2 tertutup, K1 terbuka, pelarut mengalir dari reservoir ke silinder C. Dalam mode suplai, katup K1 ditutup, dan melalui katup K2 fase gerak memasuki perangkat takaran.

Pompa jenis ini dicirikan oleh hampir tidak adanya denyut dalam aliran fase gerak selama operasi.

Kekurangan pompa:

a) tingginya konsumsi waktu dan pelarut untuk mencuci saat mengganti pelarut;

b) volume PF dibatasi oleh volume alat suntik, sehingga waktu pemisahannya terbatas;

c) penangguhan pemisahan selama pengisian pompa;

d) dimensi dan bobot yang besar dengan tetap memastikan aliran dan tekanan yang tinggi (diperlukan mesin yang bertenaga dan gaya piston yang besar dengan area yang luas).

Pompa pendorong bolak-balik.

Beras. 3. Desain dasar pompa pendorong.

Prinsip operasi.

Motor D, melalui gearbox P, menggerakkan pendorong P ke gerakan bolak-balik, bergerak dalam kepala kerja pompa. Katup K1 dan K2 terbuka masing-masing saat pompa berada pada fase hisap dan hantaran. Jumlah umpan volumetrik ditentukan oleh tiga parameter: diameter pendorong (biasanya 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudonya (12-18 mm) dan frekuensi (yang bergantung pada kecepatan putaran mesin dan girboks).

Pompa jenis ini memberikan pasokan volumetrik fase gerak yang konstan untuk waktu yang lama. Tekanan operasi maksimum 300-500 atm, laju aliran 0,01-10 ml/menit. Pengulangan umpan volumetrik -0,5%. Kerugian utama adalah pelarut disuplai ke sistem dalam bentuk serangkaian pulsa yang berurutan, sehingga terdapat pulsasi tekanan dan aliran (Gbr. 4). Inilah alasan utama meningkatnya kebisingan dan berkurangnya sensitivitas hampir semua detektor yang digunakan di LC, terutama detektor elektrokimia.

Gambar.4. Pulsasi pompa pendorong.

Cara mengatasi denyut.

1. Penerapan perangkat redaman.

Ini adalah tabung spiral dengan profil khusus yang terbuat dari baja tahan karat, dihubungkan secara seri atau paralel dengan sistem antara pompa dan dispenser.

Beras. 5. Peredam spiral.

Peredam terlepas seiring dengan meningkatnya tekanan di dalamnya (percepatan pompa). Ketika tekanan turun, ia menggulung, volumenya mengecil, ia memeras sebagian pelarut, mempertahankan laju aliran konstan dan mengurangi denyut. Peredam ini bekerja dengan baik pada tekanan 50 atm ke atas.

Pada tekanan 5-30 atm, denyutannya lebih halus peredam udara, terbuat dari kolom (Gbr. 6.). Udara di kolom teredam (6x200 mm) dikompresi dan denyutnya teredam. Udara larut di dalamnya dalam waktu 24 jam.

Beras. 6. Peredam udara.

2. Penerapan perangkat elektronik.

Saat menggunakan sensor tekanan elektronik, Anda dapat menggunakan pembacaan sensor untuk mengontrol pengoperasian pompa. Ketika tekanan turun, kecepatan mesin meningkat dan mengkompensasi penurunan tekanan. Dimungkinkan juga untuk mengkompensasi kebocoran pada katup dan sebagian pada manset. Penggunaan peredam elektronik (BPZh-80, KhPZh-1, dll.) memungkinkan Anda mengurangi denyut tekanan hingga 1 atm pada tekanan 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Pertukaran ion, ion, kromatografi pasangan ion. Metode pertukaran ion, kromatografi ion dan pasangan ion didasarkan pada proses dinamis penggantian ion yang terikat pada fase diam dengan ion eluen yang memasuki kolom. Tujuan utama dari proses kromatografi adalah pemisahan ion anorganik atau organik dengan tanda yang sama. Retensi pada jenis kromatografi ini ditentukan oleh perubahan energi bebas reaksi pertukaran ion. Rasio konsentrasi ion yang ditukar dalam larutan dan dalam fase sorben dicirikan oleh kesetimbangan pertukaran ion. Pertukaran ion adalah bahwa beberapa zat (penukar ion), ketika direndam dalam larutan elektrolit, menyerap kation atau anion darinya, melepaskan ion lain dalam jumlah yang setara dengan muatan bertanda yang sama ke dalam larutan. Pertukaran kation terjadi antara penukar kation dan larutan, dan pertukaran anion terjadi antara penukar anion dan larutan.

Penukar kation paling sering merupakan zat polimer tidak larut yang disintesis secara khusus yang mengandung gugus ionogenik yang bersifat asam dalam strukturnya: –SO 3 H; –COOH; -OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Rumus kimia penukar kation secara skematis dapat digambarkan sebagai R-SO 3 H; R-JADI 3 Na. Dalam kasus pertama, penukar kation berbentuk H, dalam kasus kedua, dalam bentuk Na. R – matriks polimer.

Reaksi pertukaran kation ditulis sebagai reaksi kimia heterogen biasa:

RNa +Na + RNa+H +

Penukar anion mengandung gugus ionogenik dasar dalam strukturnya: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + dst. Rumus kimianya dapat digambarkan sebagai RNH 3 OH dan RNH 3 Cl atau ROH, RCl. Dalam kasus pertama, penukar anion berbentuk OH, dalam kasus kedua, dalam bentuk Cl. Reaksi pertukaran anion dapat dituliskan sebagai berikut:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Penukar ion amfoter diketahui mengandung gugus asam dan basa dalam strukturnya. Penukar ion yang mengandung gugus asam (basa) dari jenis yang sama (misalnya, SO 3 H) disebut monofungsional; penukar ion yang mengandung berbagai jenis gugus asam (basa) (misalnya, SO 3 H, OH) bersifat polifungsional.

Penukar ion monofungsional diperoleh melalui reaksi polimerisasi. Reaksi polikondensasi memungkinkan diperolehnya penukar ion multifungsi. Agar penukar ion yang dihasilkan memiliki karakteristik kinerja yang cukup tinggi, penukar ion tersebut harus tidak larut, tetapi membengkak dalam pelarut yang sesuai dan memiliki sejumlah gugus ionogenik yang cukup besar yang mampu bertukar dengan gugus ionogenik dari sampel yang dianalisis. Hal ini dapat dicapai jika rantai polimer yang dihasilkan cukup bercabang dan dihubungkan satu sama lain melalui jembatan penghubung silang. Misalnya, ketika menyiapkan penukar kation tipe polimerisasi berdasarkan stirena, divinilbenzena paling sering digunakan sebagai zat pengikat silang, yang pengenalannya dalam jumlah hingga 16% memastikan produksi penukar ion dengan berbagai tingkat pembengkakan dan Oleh karena itu, memungkinkan untuk mengatur porositas penukar ion. Derajat pembengkakan penukar ion, dinyatakan dalam mililiter/gram, adalah volume 1 g penukar ion kering udara yang dikemas dalam kolom.

Penukar ion biasanya menyerap salah satu ion lawan - ion yang ada dalam fase gerak, yaitu. ia menunjukkan selektivitas tertentu. Rangkaian afinitas, atau selektivitas, ion terhadap berbagai jenis penukar ion telah ditetapkan secara eksperimental. Misalnya, pada konsentrasi larutan rendah pada penukar kation asam kuat, ion dengan muatan yang sama diserap dengan urutan berikut:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Untuk ion dengan muatan berbeda, penyerapan meningkat seiring dengan meningkatnya muatan:

Na+ Ca 2+

Namun, perubahan kondisi reaksi pertukaran ion dapat menyebabkan pembalikan rangkaian. Seri afinitas juga telah dibuat untuk penukar anion. Misalnya, daya serap anion pada penukar anion basa kuat meningkat dengan urutan sebagai berikut:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Penukar ion yang mengandung gugus asam kuat atau basa kuat dalam strukturnya melakukan reaksi pertukaran ion dengan ion apa pun dalam larutan dengan muatan yang bertanda sama dengan tanda ion lawan. Penukar ion seperti itu disebut universal.

Proses pertukaran ion antara analit dan penukar ion dapat dilakukan dengan salah satu dari tiga cara: statis, dinamis (metode filter pertukaran ion) dan kromatografi.

Metode statis pertukaran ion adalah sampel penukar ion dikontakkan dengan larutan dengan volume tertentu dan dicampur atau dikocok selama waktu tertentu hingga tercapai kesetimbangan. Ini adalah metode pertukaran ion yang cepat dan sederhana, digunakan untuk memekatkan ion dari larutan encer, menghilangkan pengotor yang tidak diperlukan, namun tidak menjamin penyerapan ion secara sempurna, karena pertukaran ion merupakan proses yang tidak seimbang, dan sebagai hasilnya tidak menjamin pemisahan yang sempurna. ion.

Saat melakukan pertukaran ion secara dinamis suatu larutan dilewatkan melalui kolom dengan penukar ion, yang ketika bergerak sepanjang kolom, bersentuhan dengan butiran penukar ion baru. Proses ini memberikan pertukaran yang lebih lengkap daripada metode statis, karena produk pertukaran dihilangkan oleh aliran larutan. Mereka dapat mengkonsentrasikan ion dari larutan encer dan memisahkan ion yang sifatnya sangat berbeda, misalnya ion dengan muatan berbeda (memisahkan kation dari anion), tetapi memisahkan ion dengan tanda muatan yang sama hampir tidak mungkin. Pemisahan kuantitatif ion-ion tersebut hanya mungkin terjadi dengan pengulangan berulang tindakan dasar sorpsi-desorpsi dalam kondisi dinamis, yaitu. metode kromatografi . Saat bekerja dengan metode ini, penukar ion lapisan tinggi digunakan dan campuran yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam lapisan ini dalam jumlah yang jauh lebih kecil daripada kapasitas kolom, sehingga beberapa tindakan dasar pertukaran ion dapat diulang.

Dari segi teknik analisis, kromatografi penukar ion mirip dengan kromatografi molekuler dan dapat dilakukan dengan menggunakan opsi eluen (pengembangan), frontal, dan perpindahan. Perbedaan antara kromatografi molekuler dan kromatografi penukar ion adalah bahwa dalam kromatografi molekuler, komponen campuran yang dipisahkan dielusi dari kolom dengan eluen murni, sedangkan dalam kromatografi penukar ion larutan elektrolit digunakan sebagai eluen. Dalam hal ini, ion yang ditukar dari eluen harus diserap kurang selektif dibandingkan ion mana pun dalam campuran yang dipisahkan.

Saat melakukan kromatografi penukar ion pengembangan, yang paling sering digunakan, kolom yang diisi dengan penukar ion terlebih dahulu dicuci dengan larutan elektrolit sampai semua ionnya tergantikan seluruhnya dalam penukar ion oleh ion-ion yang terkandung dalam eluen. Kemudian sejumlah kecil larutan analit, yang mengandung ion-ion yang terpisah dalam jumlah sekitar 1% dari kapasitas penukar ion, dimasukkan ke dalam kolom. Selanjutnya, kolom dicuci dengan larutan eluen, memilih fraksi eluat dan menganalisisnya.

Campuran ion Cl – , Br – , J – dapat dipisahkan pada penukar anion yang sangat basa (polistiren berikatan silang yang mengandung gugus basa amonium kuaterner – N (CH 3) 3 +), misalnya AB-17, yang mempunyai bilangan selektivitas (selektivitas) : NO 3 – Cl – Br – J – . Akibatnya, larutan NaNO 3 digunakan sebagai eluen. Pertama, larutan ini dilewatkan melalui penukar ion sampai jenuh sempurna dengan ion NO 3 –. Ketika campuran yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom, ion Cl – , Br – , J – diserap oleh penukar anion, menggantikan ion NO 3 –. Ketika kolom selanjutnya dicuci dengan larutan NaNO 3, ion Cl – , Br – , J – di lapisan atas penukar anion secara bertahap digantikan lagi oleh ion NO 3 –. Ion Cl – akan berpindah paling cepat, dan ion J – akan bertahan paling lama di kolom. Perbedaan selektivitas penukar ion terhadap ion-ion campuran menyebabkan terbentuknya zona terpisah dari ion Cl – , Br – dan J – yang terlarut dalam kolom, bergerak sepanjang kolom dengan kecepatan berbeda. Saat Anda bergerak di sepanjang kolom, jarak antar zona bertambah. Pada setiap zona hanya terdapat satu anion dari campuran yang dipisahkan dan anion eluen; pada interval antar zona hanya terdapat anion eluen. Dengan demikian, fraksi akan muncul dalam eluen di outlet kolom, yang berisi masing-masing komponen campuran yang dipisahkan.

Untuk memecahkan masalah praktis, kondisi pemisahan ion divariasikan dengan memilih fase gerak yang sesuai (komposisi, konsentrasi, pH, kekuatan ionik) atau mengubah porositas matriks polimer penukar ion, yaitu jumlah ikatan antar rantai dalam ion. matriks, dan membuat saringan penukar ion yang permeabel terhadap beberapa ion dan mampu menukarkannya serta tidak dapat ditembus oleh ion lain. Dimungkinkan juga untuk mengubah sifat dan susunan relatif gugus ionogenik, serta memperoleh sorben yang mampu melakukan reaksi kimia selektif karena pembentukan kompleks. Misalnya, penukar ion pembentuk kompleks yang dalam strukturnya mengandung gugus pengkelat reagen organik dimetilglioksim, ditizon, 8-hidroksikuinolin, dll., serta eter mahkota, memiliki selektivitas tinggi.

Penggunaan terbesar dalam pertukaran ion, kromatografi ion dan pasangan ion ditemukan pada penukar ion organik makro dan mikromesh sintetik dengan kapasitas pertukaran besar (3–7 mmol/g), serta bahan penukar ion anorganik. Penukar ion mikromesh mampu menukar ion hanya dalam keadaan bengkak, sedangkan penukar ion makromesh mampu menukar ion hanya dalam keadaan bengkak dan tidak bengkak. Jenis struktural penukar ion lainnya adalah penukar ion film permukaan, inti padatnya terbuat dari kopolimer stirena dan divinilbenzena yang tidak berpori, kaca atau gel silika dan dikelilingi oleh lapisan tipis penukar ion. Diameter total partikel tersebut adalah sekitar 40 mikron, ketebalan film penukar ion adalah 1 mikron. Kerugian dari penukar ion tersebut adalah diameter partikel yang relatif besar dan kapasitas pertukaran yang rendah karena luas permukaan spesifik yang rendah, sehingga perlu bekerja dengan sampel yang kecil dan, oleh karena itu, menggunakan detektor yang sangat sensitif. Selain itu, penukar ion tersebut cepat keracunan dan tidak mampu beregenerasi.

Dalam pertukaran ion dan kromatografi ion kinerja tinggi, penukar ion polistiren berpori volumetrik, silika berpori volumetrik dengan diameter butiran sekitar 10 mikron, serta kopolimer stirena dan divinilbenzena berpori permukaan dan termodifikasi permukaan yang praktis tidak membengkak dengan sulfo ionogenik - dan gugus amino digunakan.

Dalam kromatografi pasangan ion, sorben "sikat" digunakan - gel silika dengan fase balik C 2, C 8, C 18 yang dicangkokkan, yang mudah diubah menjadi penukar kation ketika menyerap surfaktan ionik dari fase gerak, misalnya alkil sulfat atau garam basa amonium kuaterner.

Saat melakukan pemisahan kromatografi menggunakan penukar ion, larutan garam berair paling sering digunakan sebagai fase gerak. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa air memiliki sifat pelarutan dan pengion yang sangat baik, sehingga molekul sampel yang dianalisis langsung terdisosiasi menjadi ion, gugus penukar ion penukar ion terhidrasi dan juga berubah menjadi bentuk terdisosiasi seluruhnya atau sebagian. Hal ini memastikan pertukaran counterion yang cepat. Kekuatan elusi fase gerak terutama dipengaruhi oleh pH, ​​kekuatan ion, sifat larutan buffer, dan kandungan pelarut organik atau surfaktan (kromatografi pasangan ion).

Nilai pH dipilih tergantung pada sifat gugus ionogenik, ion yang dipisahkan, dan matriks. Anda dapat menggunakan penukar ion yang bersifat asam kuat dan basa kuat pada pH = 2–12, penukar ion yang bersifat asam lemah pada pH = 5–12, dan penukar ion yang bersifat basa lemah pada pH = 2–6. Sorben berbahan dasar silika tidak dapat digunakan pada pH 9. Kekuatan ionik fase gerak mempengaruhi kapasitas penukar ion. Ketika kekuatan ionik meningkat, penyerapan ion biasanya menurun, seiring dengan meningkatnya kekuatan elusi fase gerak. Oleh karena itu, pada awal pemisahan, fase gerak harus memiliki kekuatan ionik yang rendah (0,05-0,1), dan nilai akhir dari karakteristik ini tidak boleh melebihi 2. Dalam elusi gradien, buffer dengan kekuatan ionik yang meningkat sering digunakan.

Untuk elusi selektif ion yang diserap oleh penukar ion, Anda dapat menggunakan air, larutan buffer (fosfat, asetat, borat, hidrokarbonat, dll.) dengan nilai pH dan kekuatan ion tertentu, larutan mineral (hidroklorik, nitrogen, belerang, fosfor) dan asam organik (fenol, sitrat, laktat, tartarat, oksalat, EDTA). Pilihan eluen difasilitasi oleh fakta bahwa koefisien distribusi pembatas sebagian besar unsur antara larutan berair (berair-organik) dari banyak kompleksan dan penukar ion tipe standar ditentukan dan disajikan dalam tabel.

1.6.4. Kromatografi eksklusi ukuran. Kromatografi eksklusi ukuran adalah salah satu jenis kromatografi cair yang pemisahan komponennya didasarkan pada distribusi molekul menurut ukurannya antara pelarut yang terletak di pori-pori sorben dan pelarut yang mengalir di antara partikel-partikelnya. Selama proses pemisahan, molekul-molekul kecil memasuki jaringan polimer, di pori-pori dimana pelarut berfungsi sebagai fase diam, dan tertahan di sana. Molekul besar tidak dapat menembus jaringan polimer dan tersapu keluar kolom oleh fase gerak. Molekul terbesar dielusi terlebih dahulu, kemudian molekul berukuran sedang, dan terakhir molekul kecil.

Kromatografi eksklusi ukuran dibagi menjadi permeasi gel dan filtrasi gel. Dalam kromatografi permeasi gel, pemisahan terjadi pada polimer yang mengembang dalam pelarut organik. Versi filtrasi gel dari kromatografi eksklusi ukuran melibatkan penggunaan polimer yang mengembang dalam air sebagai fase diam.

Durasi retensi komponen sampel yang dianalisis dalam kolom eksklusi ukuran bergantung pada ukuran molekulnya dan difusi ke dalam pori-pori sorben, serta pada ukuran pori fase diam.

Pada kromatografi cair jenis ini, koefisien distribusinya D untuk molekul terkecil dari sampel yang dianalisis, yang bergerak dalam kolom kromatografi dengan kecepatan paling rendah, menembus ke dalam jaringan fase diam, sama dengan 1, karena fase gerak dan pelarut yang terletak di pori-pori fase diam memiliki komposisi yang sama. Dalam hal ini persamaan dasar kromatografi kolom berbentuk

Molekul besar yang tidak masuk ke dalam pori-pori fase diam terelusi dari kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mereka D= 0, sebuah V R =V M. Kisaran nilai koefisien distribusi ini (dari 0 hingga 1) hanya tipikal untuk kromatografi eksklusi ukuran.

Semua molekul zat multikomponen yang dianalisis harus dikeluarkan dari kolom dengan melewatkan sejumlah kecil pelarut V M sebelum V M +V S dan pemisahan berakhir sebelum puncak pelarut dilepaskan. Oleh karena itu, pada kromatografi jenis ini perlu digunakan kolom yang cukup panjang dengan volume bebas yang besar V M dan sejumlah besar pori-pori di sorben.

Resolusi puncak kromatografi dalam pemisahan eksklusi ukuran dapat ditingkatkan dengan menggunakan elusi gradien dengan pelarut campuran.

Setiap sorben yang digunakan dalam kromatografi eksklusi ukuran dicirikan oleh volume pori tertentu dan, oleh karena itu, memiliki wilayah tertentu dengan berat molekul yang dapat dipisahkan dan kurva kalibrasi tertentu. Dalam hal ini, grafik kalibrasi, yang mencirikan ketergantungan volume tertahan pada berat molekul atau ukuran molekul, biasanya memiliki tampilan yang kompleks.

Fase diam dalam kromatografi eksklusi ukuran dipilih berdasarkan tugas analitis tertentu. Awalnya, ditetapkan sistem pelarut mana yang dapat digunakan untuk analisis (berair atau berair-organik). Tergantung pada ini, jenis sorben ditentukan. Jika perlu untuk memisahkan sampel yang larut dalam air, misalnya, dekstrans ikatan silang (Sephadex) atau poliakrilamida (Biogel R) yang dapat mengembang dalam air digunakan sebagai fase diam. Pemisahan zat yang larut dalam pelarut organik dapat dilakukan pada polistiren dengan berbagai tingkat ikatan silang, pembengkakan dalam pelarut organik (styrogel, poragel, biobid C). Gel yang membengkak seperti itu biasanya tidak stabil dalam tekanan dan memungkinkan laju aliran fase gerak yang sangat rendah, sehingga meningkatkan waktu analisis. Untuk menerapkan versi kromatografi eksklusi ukuran yang sangat efisien, perlu menggunakan fase diam dengan matriks kaku—gel silika, yang kelemahannya—aktivitas adsorpsi yang tinggi—dihilangkan dengan silanisasi permukaan atau pemilihan eluen yang sesuai dalam polaritas.

Zat yang dapat digunakan sebagai fase gerak dalam kromatografi eksklusi ukuran adalah:

- melarutkan sampel yang dianalisis sepenuhnya;

- basahi sorben dengan baik;

- menangkal adsorpsi komponen sampel pada sorben;

 memiliki viskositas dan toksisitas rendah.

1.6.5. Kromatografi bidang. Kromatografi bidang meliputi kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Kromatografi cair jenis ini memiliki teknik yang sederhana, cepat, dan tidak memerlukan peralatan yang mahal, yang merupakan keunggulannya yang tidak dapat disangkal.

Pemisahan campuran zat dengan metode ini dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai sistem kromatografi. Oleh karena itu, adsorpsi, distribusi, fase normal dan fase balik, pertukaran ion, dll. kertas dan kromatografi lapis tipis dibedakan. Saat ini, kromatografi lapis tipis paling banyak digunakan.

Kromatografi kertas dan lapis tipis memiliki teknik yang serupa. Serat selulosa kertas digunakan sebagai fase diam dalam kromatografi kertas; dalam kromatografi lapis tipis, berbagai sorben (Al 2 O 3, silika gel, dll.) diaplikasikan dalam lapisan tipis yang seragam (100–300 m) pada kaca, substrat logam atau plastik (pembawa). Lapisan adsorben pada pembawa mungkin melekat atau tidak.

Pemisahan kromatografi dalam metode planar, maupun pada kolom, terjadi karena perpindahan komponen analit oleh fase gerak sepanjang lapisan fase diam dengan laju yang berbeda-beda sesuai dengan koefisien distribusi zat yang dipisahkan. Dalam kedua kasus tersebut, sistem kromatografi digunakan: sorben cair - padat (mekanisme pemisahan adsorpsi), pembawa cair - cair - padat (distribusi, pertukaran ion, dan mekanisme lainnya).

Berbagai pelarut atau campurannya, asam organik atau anorganik digunakan sebagai fase gerak.

Pembuatan praktis kromatogram planar adalah sebagai berikut.

Pada selembar kertas kromatografi atau pada lapisan tipis sorben, tandai garis awal dengan pensil pada jarak 1 cm dari tepi bawah strip atau pelat. Dengan menggunakan mikropipet, tempelkan sampel pada garis awal berupa titik dengan diameter tidak lebih dari 2–3 mm. Tepi strip atau pelat kemudian diturunkan ke dalam bejana berisi fase gerak yang terletak di ruang tertutup. Ketika fase gerak naik di sepanjang strip atau pelat dan beberapa tindakan dasar sorpsi-desorpsi, distribusi antara dua fase cair, pertukaran ion, dll., yang umum terjadi dalam kromatografi, terjadi, komponen campuran yang dianalisis dipisahkan. Proses ini biasanya dilanjutkan sampai pelarut keluar dari garis awal 10 cm. Setelah itu, strip atau pelat dikeluarkan dari wadah dan dikeringkan. Jika komponen analit diwarnai, maka akan timbul bintik-bintik warna yang sesuai pada kromatogram. Untuk mendeteksi komponen analit yang tidak berwarna, kromatogram harus dikembangkan. Pengembangan kromatogram dan pendeteksian komponen sampel dapat dilakukan dengan berbagai metode dan bergantung pada komposisi campuran yang dianalisis. Manifestasinya dapat dilakukan:

- menggunakan pencahayaan UV. Metode ini dapat diterapkan untuk mendeteksi zat yang mampu memancarkan radiasinya sendiri (luminesce) dalam rentang panjang gelombang tampak di bawah pengaruh radiasi UV;

- melalui pengembangan reagen. Misalnya, keberadaan asam amino dalam campuran yang dianalisis dapat dideteksi menggunakan ninhidrin. Kromatogram kering direndam dalam larutan ninhidrin 0,2% dalam aseton, kemudian dikeringkan. Bintik-bintik yang sesuai dengan berbagai komponen campuran memperoleh visual dan, biasanya, warna khusus untuk setiap zat;

- menggunakan yodium. Dalam hal ini, kromatogram yang terdeteksi dimasukkan ke dalam bejana yang bagian bawahnya terdapat kristal yodium. Uap yodium lebih kuat terserap pada bercak sehingga membuat bercak terlihat. Yodium adalah reagen pengembang nonspesifik. Dengan menggunakan reagen tertentu, dimungkinkan tidak hanya untuk menentukan jumlah komponen campuran, tetapi juga untuk mengidentifikasi zat yang dipisahkan berdasarkan warna bintik.

Kromatografi kertas dan lapis tipis paling sering dilakukan dalam versi menaik yang dijelaskan di atas. Seringkali, untuk meningkatkan kualitas kromatogram, perlu menggunakan varian kromatografi planar yang lebih kompleks, misalnya descending, sirkular, dua dimensi. Saat melakukan kromatografi kertas atau lapis tipis menurun, analit diterapkan pada garis awal pelat atau strip kertas yang terletak di atas, dan eluen disuplai bukan dari bawah, tetapi dari atas. Efek positif dari peningkatan pemisahan disebabkan oleh kontribusi gravitasi komponen terhadap proses pemisahan.

Kromatografi naik dan turun dapat dilakukan dalam versi satu dan dua dimensi. Berbeda dengan proses pemisahan flat-bed satu dimensi yang telah dijelaskan di atas, pada pemisahan kromatografi dua dimensi sampel yang akan dianalisis terlebih dahulu dipisahkan dalam satu pelarut, kemudian dipisahkan dengan arah tegak lurus pertama menggunakan pelarut lain, memutar kromatogram pertama. pada suhu 90 o C.

Saat melakukan kromatografi sirkular, analit diteteskan ke tengah pelat atau lembaran kertas kromatografi. Satu atau lebih pelarut juga ditambahkan tetes demi tetes di sini. Hal ini menyebabkan kromatogram yang dihasilkan menjadi sekumpulan titik radial.

Letak bintik (zona) yang membentuk komponen analit yang terpisah pada kromatogram datar dicirikan oleh kecepatan relatif pergerakan komponen dalam lapisan tipis. R fi. Secara eksperimental nilainya R fi didefinisikan sebagai rasio jarak L Saya lulus Saya komponen -th, dengan jarak L dilalui pelarut dari garis awal ke garis depan (Gbr. 1.10):

Besarnya R fi tergantung pada sifat komponen yang sesuai dari sampel yang dianalisis, sifat fase diam, ketebalannya, sifat dan kualitas fase gerak, metode penerapan sampel dan faktor lainnya, tetapi selalu R fi 1.

Besarnya R fi sebenarnya identik dengan waktu retensi suatu zat atau volume retensinya, yang mencirikan laju aliran suatu zat melalui kolom kromatografi, dan dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif komponen sampel yang dianalisis, dan diameter titik. identik dengan tinggi atau luas puncak kromatografi dan, oleh karena itu, sampai batas tertentu mencerminkan kandungan kuantitatif zat tersebut.

Dalam kasus yang paling sederhana, penentuan kuantitatif komposisi sampel yang dianalisis dapat dinilai secara visual berdasarkan intensitas warna bintik itu sendiri atau intensitas cahaya fluoresen dari bintik yang dihasilkan selama deteksi UV. Untuk tujuan ini, elusi bintik kromatografi banyak digunakan. Dalam hal ini, titik yang diperoleh pada kromatogram dipotong atau dikikis dengan hati-hati, diolah dengan pelarut yang sesuai, dan larutan yang dihasilkan diperiksa menggunakan metode fisikokimia yang sesuai. Anda juga dapat menggunakan metode penimbangan, di mana titik yang sesuai dipotong dari kromatogram dan ditimbang. Banyaknya suatu zat ditentukan oleh perbedaan berat kertas bersih yang luasnya sama dan kertas yang mempunyai zat tersebut.

Kertas (BH ) Dan kromatografi lapis tipis (TLC ) menurut mekanisme pemisahannya kromatografi partisi . Pada metode BH, pembawanya bersifat khusus kertas kromatografi dengan properti tertentu. Fase stasioner air teradsorpsi pada permukaan dan pori-pori kertas (hingga 20%), mobile adalah pelarut organik, dapat bercampur atau tidak dapat bercampur dengan air, air atau larutan elektrolit.

Mekanisme Di atas kertas, ini cukup rumit. Dalam fase diam, suatu zat dapat tertahan tidak hanya karena pelarutan dalam air yang diserap oleh kertas, tetapi juga menyerap langsung dari selulosa. Dicetak di atas kertas komponen bersama masuk ke fase gerak dan bergerak melalui kapiler kertas dengan kecepatan berbeda sesuai dengan koefisien distribusi antarmuka masing-masing dari mereka. Pertama kromatografi sebagian zat dari kertas masuk ke dalamnya fase gerak dan melanjutkan. Ketika pelarut organik mencapai bagian kertas yang tidak mengandung zat terlarut, hal ini terjadi lagi. redistribusi : dari fase organik zat berpindah ke fase air, diserap di atas kertas. Karena komponennya berbeda-beda afinitas terhadap sorben , ketika eluen bergerak, terjadi pemisahan: beberapa zat tertahan di awal jalur, yang lain bergerak lebih jauh. Di sini mereka bergabung termodinamika (menetapkan distribusi keseimbangan zat antar fase) dan kinetis (pergerakan komponen dengan kecepatan berbeda) aspek pemisahan. Akibatnya, setiap komponen terkonsentrasi pada area tertentu pada lembaran kertas: zona komponen individu pada kromatogram . Penggunaan kromatografi pada kertas memiliki sejumlah kelemahan yang signifikan: ketergantungan proses pemisahan pada komposisi dan sifat kertas, perubahan kadar air pada pori-pori kertas ketika kondisi penyimpanan berubah, kecepatan kromatografi yang sangat rendah ( hingga beberapa hari), dan reproduktifitas hasil yang rendah. Kekurangan ini sangat mempengaruhi penyebaran kromatografi kertas sebagai metode kromatografi.

DI DALAM metode TLC proses pemisahan suatu campuran zat dilakukan secara tipis-tipis penyerap , diendapkan pada substrat padat inert, dan disediakan oleh gerakan fase gerak (pelarut) melalui sorben di bawah pengaruh kekuatan kapiler . Olehmekanisme pemisahan membedakan kromatografi partisi, adsorpsi dan pertukaran ion . Pemisahan komponen terjadi dalam kasus ini karena perbedaan koefisien distribusi antara dua fase cair ( kromatografi partisi ), atau karena perbedaan daya serap senyawa oleh sorben ( kromatografi adsorpsi ). Metode adsorpsi didasarkan pada berbagai tingkat penyerapan-desorpsi komponen yang dipisahkan pada fase diam. Adsorpsi dilakukan atas biaya pasukan van der Waals , yang merupakan dasarnya adsorpsi fisik , polimolekul (terbentuknya beberapa lapisan adsorbat pada permukaan adsorben) dan penyerapan kimia (interaksi kimia adsorben dan adsorbat).

Dalam hal penggunaan sorben untuk TLC seperti alumina atau gel silika berperan dalam pemisahan distribusi , Jadi adsorpsi pada permukaan aktif sorben yang dikembangkan (150–750 m 2 /g). Distribusi komponen campuran terjadi antara air pada permukaan pembawa (seperti adsorben , Bagaimana alumina , pati , selulosa , kieselguhr - Dan air membentuk fase diam ), dan pelarut bergerak melalui fase diam ini ( fase gerak ). Komponen campuran yang lebih larut dalam air bergerak lebih lambat dibandingkan komponen yang lebih larut dalam fase gerak.

Adsorpsi memanifestasikan dirinya dalam kenyataan bahwa antara pembawa , misalnya aluminium oksida, dan komponen campurannya terbentuk kesetimbangan adsorpsi – setiap komponen memiliki sendiri-sendiri, yang hasilnya adalah kecepatan gerak yang berbeda komponen campuran. Dua kasus ekstrem dapat dibedakan:

a) konsentrasi zat pada adsorben adalah nol. Zat tersebut larut sempurna dalam fase gerak dan terbawa olehnya (bergerak bersama bagian depan pelarut ).

b) zat teradsorpsi sempurna, tidak berinteraksi dengan pelarut dan tetap pada awalnya.

Dalam praktiknya, dengan pemilihan pelarut dan adsorben yang terampil distribusi senyawa terletak di antara kasus ekstrim ini, dan substansinya bertahap ditransfer dari satu lapisan sorben ke lapisan lainnya karena proses yang terjadi secara bersamaan penyerapan Dan desorpsi .

Pelarut yang melewati sorben disebut eluen , proses perpindahan suatu zat bersama dengan eluen  elusi . Saat cairan bergerak di sepanjang pelat, campuran zat terpisah karena aksi gaya adsorpsi , distribusi , pertukaran ion atau kombinasi dari semua faktor ini. Alhasil, terpisah zona kromatografi komponen campuran, yaitu ternyata kromatogram .

Pilihan yang benar penyerap Dan eluen menentukan efisiensi pemisahan campuran. Mobilitas zat uji bergantung pada afinitasnya terhadap sorben dan kekuatan elusi (polaritas) eluen. Ketika polaritas suatu senyawa meningkat, afinitasnya terhadap sorben polar juga meningkat. Dengan meningkatkan derajat adsorpsi gel silika senyawa organik tersusun berjajar: hidrokarbon<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь untuk silika gel eluen dapat diatur dalam urutan peningkatan “polaritas” ( kapasitas elusi ) dan membentuk serangkaian pelarut ( seri eluotropik ) sesuai dengan data percobaan: alkana>benzena>kloroform>dietil eter>etil asetat>C 2 -C 4 alkohol>air>aseton>asam asetat>metanol. Jadi, senyawa polar, alkohol, teradsorpsi cukup kuat pada silika gel dan oleh karena itu bergerak lemah di bawah pengaruh pelarut non-polar seperti heksana, dan tetap berada di dekat garis awal. Pada gilirannya, bifenil hidrokarbon aromatik nonpolar terasa lebih mobile dalam heksana, tetapi bahkan di sini pun dapat dicapai R F sekitar 0,5, diperlukan eluen aprotik yang lebih polar - metilen klorida. Kekuatan eluen mengaturnya dengan menggunakan campuran pelarut yang bertetangga seri eluotropik dengan polaritas yang berbeda.

Saat ini, berikut ini yang paling banyak digunakan di TLC: sorben : untuk pembagian zat lipofilik  gel silika , alumina , selulosa asetat , poliamida ; untuk pemisahan zat hidrofilik  selulosa , penukar ion selulosa , kieselguhr , poliamida . Karakteristik terpenting dari sorben adalah sifatnya aktivitas , yaitu kemampuan menyerap (menahan) komponen campuran yang akan dipisahkan. Di luar negeri, sejumlah perusahaan memproduksi gel silika , kieselguhr Dan alumina dengan penambahan 5% gipsum, yang digunakan untuk mengamankan lapisan sorben dalam pembuatan pelat secara mandiri.

Sorben yang paling umum adalah gel silika - asam silikat terhidrasi, dibentuk oleh aksi asam mineral pada Na 2 SiO 3 dan mengeringkan sol yang dihasilkan. Setelah sol digiling, digunakan sebagian kecil dengan ukuran butir tertentu (ditunjukkan pada pelat, biasanya 5-20 mikron). gel silika adalah sorben polar dengan gugus OH sebagai pusat aktif. Ia dengan mudah menyerap air di permukaan dan membentuk ikatan hidrogen.

Alumina adalah adsorben basa lemah dan digunakan terutama untuk pemisahan senyawa basa lemah dan netral. Kerugian dari pelat aluminium oksida adalah aktivasi wajib pada permukaan sebelum digunakan dalam oven pada suhu tinggi (100-150 o C) dan kapasitas adsorpsi lapisan yang rendah dibandingkan dengan silika gel.

Tanah diatom - adsorben diperoleh dari mineral alami - tanah diatom. Sorben memiliki sifat hidrofilik dan kapasitas adsorpsi lapisan yang lebih rendah dibandingkan silika gel.

Selulosa: pelat lapis tipis yang dilapisi selulosa sangat efektif untuk memisahkan molekul organik kompleks. Adsorben terutama terdiri dari butiran selulosa dengan diameter hingga 50 mikron, difiksasi pada pembawa dengan pati. Seperti pada kromatografi kertas, kenaikan bagian depan pelarut terjadi sangat lambat.

Analisis kromatografi dilakukan pada pelat industri buatan Republik Ceko " Silufol » (« Silufol ") terbuat dari aluminium foil, terkadang diperkuat dengan karton, dan " Siluplast » terbuat dari plastik, dilapisi dengan lapisan sorben - silika gel LS 5-40 dengan pati atau gipsum sebagai pengikat (sampai 10%), atau aluminium oksida dengan dan tanpa penambahan indikator fluoresen. Catatan « Silufol » memiliki tingkat elusi yang tinggi, tetapi dicirikan oleh kemampuan pemisahan yang rendah dan sensitivitas yang rendah. Selama penyimpanan, mereka sensitif terhadap kondisi (kelembaban, suhu, lingkungan agresif, dll.). Beberapa perusahaan memasok pelat kromatografi dengan lapisan sorben yang bervariasi (biasanya hingga 0,25 mm), tetapi ketebalannya sangat konstan (gel silika, selulosa, resin penukar ion), pada kaca dan substrat yang terbuat dari aluminium foil, plastik, fiberglass yang diresapi.

Piring « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) diproduksi di Rusia dengan bahan dasar polimer (polietilen tereftalat, kelas P) atau substrat aluminium (kelas AF) dengan lapisan kerja yang diterapkan sorben gel silika mikrofraksionasi nilai STX-1A dan STX-1VE (diproduksi di Uni Soviet sebagai silika gel fraksinasi KSKG) dengan ketebalan 90-120 mikron (hingga 200 mikron), difiksasi dengan pengikat khusus - sol silika . Bila menggunakan sol asam silikat (silica sol) sebagai pengikat, yang setelah dipanaskan berubah menjadi silika gel, pelat KLT yang dihasilkan terdiri dari dua komponen: lapisan silika gel dan substrat. Keseragaman ketebalan lapisan sorben pada satu pelat adalah ±5 µm. Contoh penunjukan: “Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)” - pelat TLC berkinerja tinggi pada substrat aluminium, dengan fosfor, 10x10 cm.

Jika Anda menggunakan substrat kaca (kelas C), pelat tersebut dapat digunakan kembali dan tahan bahan kimia. Ketahanan kimianya ditentukan oleh ketahanan kimia silika gel. Hasilnya, pelat TLC dapat diolah berulang kali dengan reagen agresif, misalnya campuran kromium panas, yang menghilangkan batasan penggunaan reagen berkorelasi untuk mendeteksi noda dan memodifikasi sorben, dan memungkinkan pengulangan (hingga 30 kali atau lebih). ) regenerasi pelat dengan campuran kromium. Pelat kaca dapat dipotong sesuai ukuran yang dibutuhkan. Kekuatan mekanik lapisan sorben dapat disesuaikan, di satu sisi menyediakan pengangkutan dan pemrosesan berulang pelat dan, di sisi lain, kemungkinan ekstraksi lapisan adsorben dengan zat terpisah untuk pencucian selanjutnya senyawa individu dari lapisan. sorben dan studi lebih lanjutnya dengan metode instrumental (spektrometri IR dan UV , metode struktur sinar-X, NMR, dll.).

Pelat tersebut berbeda dalam ukuran fraksi (distribusi partikel) silika gel yang membentuk lapisan tersebut. Pada pelat analitik (kelas A) fraksinya adalah 5-17 mikron, pada pelat berkinerja tinggi (kelas B) - 8-12 mikron. Distribusi yang lebih sempit meningkatkan efisiensi pelat, yaitu. bintik-bintik zat yang dipisahkan menjadi lebih padat (ukurannya lebih kecil) dan oleh karena itu terpisah lebih baik ketika bagian depan eluen melewati jarak yang lebih pendek. Pada wafer Rusia, lapisan analitis dan kinerja tinggi tidak jauh berbeda, tidak seperti wafer dari Merck (Jerman). Pelat dengan efisiensi tinggi harus digunakan jika zat tidak dapat dipisahkan pada pelat analitik. Pelat dari semua modifikasi diproduksi dengan fosfor (tingkat UV) dengan eksitasi 254 nm. Umur simpan tidak terbatas, piring " Sorbfil » diuji secara luas dalam analisis turunan asam amino, pestisida, lipid, antibiotik.

Metode TLC dilakukan identifikasi kualitas komponen. kuantisasi untuk TLC juga dimungkinkan, hal ini memerlukan penerapan jumlah zat yang tepat dan tambahan studi densitometri dengan rekaman intensitas bintik yang jelas. Yang paling umum adalah metode semikuantitatif . Hal ini didasarkan pada perbandingan visual ukuran dan intensitas titik suatu komponen dengan karakteristik yang sesuai dari serangkaian titik dari zat yang sama dengan konsentrasi yang berbeda-beda ( solusi referensi standar ). Bila menggunakan sampel dalam jumlah 1-5 μg, metode sederhana ini menjamin keakuratan penentuan kandungan komponen sekitar 5-10%. Seringkali untuk menentukan komponen-komponen dalam suatu sampel, perlu dilakukan preparasi sampel untuk memperoleh campuran yang mengandung senyawa yang dianalisis. Persiapan sampel didasarkan pada ekstraksi obat dari sampel dengan pelarut organik ( N-heksana, petroleum eter, dietil eter, kloroform), pemurnian ekstrak dan kromatografi selanjutnya dalam lapisan tipis aluminium oksida atau gel silika.

Ada beberapa opsi untuk TLC dan HD, berbeda dalam caranya pasokan pelarut . Tergantung pada arah pergerakan fase gerak, ada:

A)kromatografi naik - fase gerak dituangkan ke bagian bawah ruang pemisahan, kertas (pelat) ditempatkan secara vertikal;

B)kromatografi menurun  fase gerak diumpankan dari atas dan bergerak ke bawah sepanjang lapisan sorben pelat atau kertas;

V)kromatografi radial  gerak maju horizontal bagian depan pelarut: fase gerak dibawa ke tengah cakram kertas (pelat), tempat campuran yang akan dipisahkan diaplikasikan.

Yang paling umum adalah elusi ke atas (kromatografi). Depan eluen sambil bergerak dari bawah ke atas. Pemilihan pelarut (fasa gerak) ditentukan oleh sifat sorben dan sifat zat yang dipisahkan.

Pemisahan kromatografi dengan metode BCh dan TLC dilakukan di ruang pemisahan dengan penutup yang melingkar. Ukuran kuantitatif dari laju perpindahan suatu zat ketika menggunakan adsorben dan pelarut tertentu adalah nilai R F (dari bahasa Inggris penyimpanan faktor – koefisien penundaan, parameter ini analog dengan waktu retensi). Posisi zona komponen yang dikromatografi atur sesuai ukuran koefisien R F , sama dengan rasio kecepatan pergerakan zonanya dengan kecepatan pergerakan bagian depan pelarut. Besarnya R F selalu kurang dari satu dan tidak bergantung pada panjang kromatogram. Berdasarkan jumlah R F dipengaruhi oleh berbagai faktor. Jadi, pada suhu rendah, zat bergerak lebih lambat; kontaminasi pelarut, ketidakhomogenan adsorben, ion asing dalam larutan yang dianalisis dapat mengubah nilainya R F hingga 10%. Dalam sistem yang dipilih, analit harus memiliki nilai yang berbeda R F dan didistribusikan ke seluruh panjang kromatogram. Diinginkan bahwa nilai-nilainya R F berada pada kisaran 0,05-0,85.

Dalam praktiknya, nilainya R F dihitung sebagai rasio jarak aku dilalui oleh zat tersebut hingga jarak tertentu L melewati pelarut:

R F = II (6.1 )

Biasanya untuk perhitungan pilih pusat tempat (Gbr. 1). Besarnya R F tergantung pada banyak faktor: jenis kertas kromatografi (porositasnya, kepadatannya, ketebalannya, derajat hidrasinya) dan penyerap (ukuran butir, sifat gugus pada permukaan, ketebalan lapisan, kadar airnya, sifat zat, komposisi fase gerak), kondisi percobaan (suhu, waktu kromatografi, dll.). Jika semua parameter kromatografi konstan, nilainya R F hanya ditentukan oleh sifat individual masing-masing komponen.

Beras. 1. Penentuan nilai pada kromatogram Rf untuk komponen A Dan DI DALAM,

tingkat pemisahan mereka Rp dan jumlah pelat teoritis N .

Efisiensi HD dan TLC juga bergantung pada selektivitas dan sensitivitas reaksi yang digunakan untuk mendeteksi komponen campuran yang dianalisis. Biasanya, reagen digunakan untuk membentuk senyawa berwarna—pengembang—dengan komponen yang ditentukan. Untuk lebih dapat diandalkan identifikasi komponen bersama menerapkan " saksi » solusi zat standar (dalam pelarut yang sama dengan sampel), yang diharapkan keberadaannya dalam sampel. Bahan standar diterapkan pada garis awal di sebelah sampel yang dianalisis dan dikromatografi dalam kondisi yang sama. Dalam praktiknya, nilai relatif sering digunakan:

R F rel = R F X / R F berdiri (6.2)

Di mana R F berdiri juga dihitung menggunakan rumus (6.1). Efisiensi pemisahan kromatografi mencirikan jumlah pelat teoretis yang setara dan mereka tinggi . Jadi, pada metode TLC jumlah pelat teoritis yang ekuivalen N A untuk komponen A campuran yang akan dipisahkan dihitung dengan rumus:

N A = 16 (aku O.A. / A (A )) 2 (6.3)

Nilai-nilai aku O.A. Dan A (A ) ditentukan seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6.1. Maka tinggi pelat teori yang ekuivalen N A adalah:

H A = aku O.A. /N = A (A ) 2 / 16 aku O.A. . (6.4)

Pemisahan secara praktis mungkin terjadi jika R F (A)  R F (DI DALAM)  0,1 .

Untuk mengkarakterisasi pemisahan dua komponen A Dan DI DALAM menggunakan derajat (kriteria) pemisahan Rs :

Rp =  aku/ (A (A) / 2 + A (B) / 2)= 2  aku/ (A (A) + A (B)) (6.5)

Di mana  aku  jarak antara pusat titik komponen A Dan DI DALAM;

A (A) Dan A (DI DALAM)  diameter titik A Dan DI DALAM pada kromatogram (Gbr. 6.1). Lebih Rp , semakin jelas titik-titik komponennya dipisahkan A Dan DI DALAM pada kromatogram. Kondisi kromatografi dipilih sehingga nilainya Rp berbeda dari nol dan satu, nilai optimal Rp adalah 0,3  0,7. Untuk tarif selektivitas pemisahan dua komponen A Dan DI DALAM menggunakan faktor pemisahan α :

α = aku B / aku A (6.6)

Jika α = 1, maka komponennya A Dan DI DALAM tidak dipisahkan.

9801 0

HPLC adalah kromatografi kolom cair dimana berbagai mekanisme penyerapan dapat digunakan. Pada dasarnya, HPLC adalah bentuk modern dari kromatografi kolom cair klasik. Beberapa karakteristik kualitas HPLC yang paling signifikan tercantum di bawah ini:
- proses berkecepatan tinggi, yang memungkinkan pengurangan durasi pemisahan dari beberapa jam dan hari menjadi menit;
- tingkat keburaman minimal pada zona kromatografi, yang memungkinkan pemisahan senyawa yang hanya sedikit berbeda dalam konstanta serapan;
- mekanisasi dan otomatisasi pemisahan dan pemrosesan informasi tingkat tinggi, berkat kromatografi cair kolom yang telah mencapai tingkat reproduktifitas dan akurasi baru.

Penelitian intensif dalam beberapa dekade terakhir dan sejumlah besar akumulasi data eksperimen kini memungkinkan kita berbicara tentang klasifikasi varian dalam kerangka metode kromatografi cair kinerja tinggi. Tentu saja klasifikasi menurut mekanisme penyerapan yang diberikan di atas tetap berlaku.

Klasifikasi umum didasarkan pada perbandingan polaritas fase gerak dan fase diam. Dalam hal ini, perbedaan dibuat antara kromatografi fase normal dan fase terbalik.

Kromatografi fase normal (NPC) adalah varian HPLC ketika fase gerak kurang polar dibandingkan fase diam, dan ada alasan untuk percaya bahwa faktor utama yang menentukan retensi adalah interaksi sorbat secara langsung dengan permukaan atau volume sorben.

Kromatografi fase terbalik (RPC) adalah varian HPLC di mana fase gerak lebih polar daripada fase diam, dan retensi ditentukan oleh kontak langsung molekul sorbat dengan permukaan atau volume sorben; dalam hal ini, sorbat terionisasi tidak ditukar dengan ion fase gerak yang diserap di permukaan.

Kromatografi penukar ion adalah suatu pilihan di mana penyerapan dilakukan dengan menukar ion tersorpsi dari fase gerak dengan ion zat yang dikromatografi; Kromatografi pertukaran ligan dapat didefinisikan dengan cara yang sepenuhnya analog.

Kromatografi pada sorben yang dimodifikasi secara dinamis merupakan varian dari HPLC di mana sorbat tidak berinteraksi langsung dengan permukaan sorben, tetapi berasosiasi dengan molekul lapisan permukaan eluen.
Kromatografi pasangan ion adalah varian kromatografi fase terbalik dari senyawa terionisasi di mana ion lawan hidrofobik ditambahkan ke fase gerak, yang secara kualitatif mengubah karakteristik penyerapan sistem.

Kromatografi eksklusi ukuran adalah metode pemisahan senyawa berdasarkan berat molekulnya, berdasarkan perbedaan laju difusi molekul dengan ukuran berbeda dalam pori-pori fase diam.

Untuk HPLC, karakteristik yang sangat penting adalah ukuran sorben, biasanya 3-5 mikron, kini mencapai 1,8 mikron. Hal ini memungkinkan campuran zat yang kompleks dipisahkan dengan cepat dan sempurna (waktu analisis rata-rata adalah 3 hingga 30 menit).

Masalah pemisahan diselesaikan dengan menggunakan kolom kromatografi, yaitu tabung yang diisi dengan sorben. Saat melakukan analisis, cairan (eluen) dengan komposisi tertentu dimasukkan melalui kolom kromatografi dengan kecepatan konstan. Dosis sampel yang diukur secara tepat disuntikkan ke aliran ini. Komponen sampel yang dimasukkan ke dalam kolom kromatografi, karena afinitasnya yang berbeda terhadap sorben kolom, bergerak sepanjang kolom tersebut dengan kecepatan yang berbeda dan mencapai detektor secara berurutan pada waktu yang berbeda.

Dengan demikian, kolom kromatografi bertanggung jawab atas selektivitas dan efisiensi pemisahan komponen. Dengan memilih tipe kolom yang berbeda, derajat pemisahan analit dapat dikontrol. Senyawa diidentifikasi berdasarkan waktu retensinya. Penentuan kuantitatif masing-masing komponen dihitung berdasarkan besaran sinyal analitik yang diukur menggunakan detektor yang dihubungkan dengan keluaran kolom kromatografi.

Sorben. Perkembangan HPLC sebagian besar terkait dengan penciptaan sorben generasi baru dengan sifat kinetik yang baik dan sifat termodinamika yang beragam. Bahan utama sorben pada HPLC adalah silika gel. Ini kuat secara mekanis dan memiliki porositas yang signifikan, yang memberikan kapasitas pertukaran yang besar dengan ukuran kolom yang kecil. Ukuran partikel yang paling umum adalah 5-10 mikron. Semakin mendekati bentuk bola partikel, semakin rendah hambatan alirannya, semakin tinggi efisiensinya, terutama jika fraksi yang sangat sempit disaring (misalnya, 7 +1 mikron).

Permukaan spesifik silika gel adalah 10-600 m3/g. Silika gel dapat dimodifikasi dengan berbagai kelompok kimia yang dicangkokkan ke permukaan (C-18, CN, NH2, SO3H), yang memungkinkan penggunaan sorben berdasarkan silika tersebut untuk memisahkan berbagai kelas senyawa. Kerugian utama silika gel adalah ketahanan kimianya yang rendah pada pH< 2 и рН >9 (silika larut dalam basa dan asam). Oleh karena itu, saat ini sedang dilakukan pencarian intensif untuk sorben berbahan dasar polimer yang stabil pada pH 1 hingga 14, misalnya berbahan dasar polimetil metakrilat, polistiren, dll.

Sorben untuk kromatografi pertukaran ion. Karena kekhasan pemisahan (dalam lingkungan asam atau basa), bahan utamanya adalah sorben menjadi polistiren dengan divinilbenzena dengan berbagai tingkat ikatan silang dengan SO3 -H+ (penukar kation asam kuat) atau -COO-Naf (kation asam lemah) penukar), gugus -H2N+ (CH3) dicangkokkan ke permukaannya 3Cl- (penukar anion basa kuat) atau -N+HR2Cl- (penukar anion basa lemah).

Sorben untuk kromatografi permeasi gel. Tipe utamanya adalah styrene-DVB. Gelas makropori, metil metakrilat, dan gel silika juga digunakan. Sorben yang sama digunakan untuk kromatografi eksklusi ion.
Pompa. Untuk menjamin aliran fase gerak (MP) melalui kolom dengan parameter yang ditentukan, digunakan pompa bertekanan tinggi. Karakteristik teknis terpenting dari pompa LC meliputi: rentang aliran; tekanan kerja maksimum; reproduktifitas aliran; rentang pulsasi pasokan pelarut.

Tergantung pada sifat pasokan pelarut, pompa dapat memiliki pasokan (aliran) konstan dan tekanan konstan. Pada dasarnya, selama pekerjaan analitis, mode laju aliran konstan digunakan, dan saat mengisi kolom, mode tekanan konstan digunakan. Berdasarkan prinsip pengoperasiannya, pompa dibedakan menjadi pompa suntik dan pompa pendorong reciprocating.

Pompa jarum suntik. Pompa jenis ini dicirikan oleh hampir tidak adanya denyut dalam aliran fase gerak selama operasi. Kekurangan pompa: a) konsumsi waktu dan pelarut yang tinggi untuk mencuci saat mengganti pelarut; b) penangguhan pemisahan selama pengisian pompa; c) dimensi dan bobot yang besar dengan tetap memastikan aliran dan tekanan yang tinggi (diperlukan mesin yang bertenaga dan gaya piston yang besar dengan area yang luas).

Pompa pendorong bolak-balik. Pompa jenis ini memberikan pasokan volumetrik fase gerak yang konstan untuk waktu yang lama. Tekanan operasi maksimum 300-500 atm, laju aliran 0,01-10 ml/menit. Reproduksibilitas aliran volume adalah 0,5%. Kerugian utamanya adalah pelarut disuplai ke sistem dalam bentuk rangkaian pulsa yang berurutan, sehingga terdapat denyut tekanan dan aliran.

Inilah alasan utama meningkatnya kebisingan dan berkurangnya sensitivitas hampir semua detektor yang digunakan di LC, terutama detektor elektrokimia. Cara mengatasi denyut: menggunakan pompa ganda atau pompa Bag-Lai pendorong ganda, menggunakan alat peredam dan alat elektronik.

Jumlah umpan volumetrik ditentukan oleh tiga parameter: diameter pendorong (biasanya 3,13; 5,0; 7,0 mm), amplitudonya (12-18 mm) dan frekuensi (yang bergantung pada kecepatan putaran motor dan girboks).

Dispenser. Tujuan dari dispenser adalah untuk memindahkan sampel pada tekanan atmosfer ke saluran masuk kolom pada tekanan hingga beberapa atmosfer. Penting agar tidak ada volume “mati” di dalam dispenser yang tidak dapat dicuci oleh fase gerak dan tidak ada erosi pada sampel selama pemberian dosis. Pada awalnya dispenser LC mirip dengan dispenser gas yang membrannya berlubang. Namun, membran tidak tahan terhadap tekanan lebih dari 50-100 atm; ketahanan kimianya tidak mencukupi; potongannya mencemari filter kolom dan kapiler.

Fase cair memiliki laju difusi yang jauh lebih rendah dibandingkan fase gas. Oleh karena itu, Anda dapat memberi dosis dengan menghentikan aliran - sampel tidak punya waktu untuk terkikis di dalam dispenser. Saat sampel dimasukkan ke dalam dispenser, katup khusus mematikan aliran pelarut. Tekanan pada saluran masuk ke kolom berkurang dengan cepat; setelah beberapa detik, sampel dapat disuntikkan ke dalam ruang dispenser dengan jarum suntik mikro konvensional. Selanjutnya dispenser dikunci, aliran pelarut dihidupkan, dan terjadi pemisahan.

Tekanan yang ditahan oleh kran ini mencapai 500-800 atm. Namun ketika aliran berhenti, keseimbangan kolom terganggu, yang dapat menyebabkan munculnya puncak tambahan yang “kosong”.

Dispenser loop adalah yang paling banyak digunakan. Ketika dispenser terisi, saluran masuk 1, 2 dan saluran di antara keduanya berada di bawah tekanan tinggi. Input 3-6, saluran antara mereka dan loop dosis berada di bawah tekanan atmosfer, yang memungkinkan Anda untuk mengisi loop menggunakan jarum suntik atau pompa. Ketika dispenser diputar, aliran fase gerak memindahkan sampel ke dalam kolom. Untuk mengurangi kesalahan, loop dicuci dengan 5-10 kali volume sampel. Jika sampelnya kecil, maka dapat disuntikkan ke dalam loop dengan jarum suntik mikro. Volume loop biasanya 5-50 μl.

DI ATAS. Voinov, T.G. volova

(terutama antarmolekul) pada antarmuka fase. Sebagai suatu metode analisis, HPLC merupakan bagian dari sekelompok metode yang karena rumitnya objek yang diteliti, meliputi pemisahan awal campuran kompleks asli menjadi campuran yang relatif sederhana. Campuran sederhana yang dihasilkan kemudian dianalisis menggunakan metode fisikokimia konvensional atau metode khusus yang dikembangkan untuk kromatografi.

Metode HPLC banyak digunakan di berbagai bidang seperti kimia, petrokimia, biologi, bioteknologi, kedokteran, industri makanan, perlindungan lingkungan, produksi farmasi dan banyak lainnya.

Menurut mekanisme pemisahan zat yang dianalisis atau dipisahkan, HPLC dibagi menjadi adsorpsi, distribusi, pertukaran ion, eksklusi, pertukaran ligan dan lain-lain.

Perlu diingat bahwa dalam kerja praktek, pemisahan seringkali terjadi tidak melalui satu mekanisme, melainkan melalui beberapa mekanisme secara bersamaan. Dengan demikian, pemisahan eksklusi dapat menjadi rumit karena efek adsorpsi, pemisahan adsorpsi karena efek distribusi, dan sebaliknya. Selain itu, semakin besar perbedaan antara zat dalam sampel dalam hal derajat ionisasi, kebasaan atau keasaman, berat molekul, polarisasi, dan parameter lainnya, semakin besar kemungkinan adanya perbedaan mekanisme pemisahan zat tersebut.

HPLC fase normal

Fase diam lebih polar daripada fase gerak, oleh karena itu pelarut nonpolar mendominasi eluen:

• Heksana:isopropanol = 95:5 (untuk zat dengan polaritas rendah)
• Kloroform:metanol = 95:5 (untuk zat yang berada di kutub tengah)
• Kloroform:metanol = 80:20 (untuk zat yang sangat polar)

HPLC fase terbalik

Fase diam kurang polar dibandingkan fase gerak, sehingga eluen hampir selalu mengandung air. Dalam hal ini, selalu mungkin untuk memastikan pembubaran lengkap BAS dalam fase gerak, hampir selalu memungkinkan untuk menggunakan deteksi UV, hampir semua fase gerak saling bercampur, elusi gradien dapat digunakan, kolom dapat dengan cepat kembali -diseimbangkan, dan kolom dapat dibuat ulang.

Eluen umum untuk HPLC fase terbalik adalah:

• Asetonitril: air
• Metanol: air
• Isopropanol: air

Matriks untuk HPLC

HPLC menggunakan senyawa anorganik sebagai matriks, seperti silikon oksida (gel silika) atau alumina, atau polimer organik, seperti polistirena (ikatan silang dengan divinilbenzena) atau polimetakrilat. Tentu saja, silika gel kini diterima secara umum.

Karakteristik utama dari matriks:

• Ukuran partikel (µm);
• Ukuran pori internal (Å, nm).

Persiapan silika gel untuk HPLC:

1. Pencetakan mikrosfer asam polisilat;
2. Mengeringkan partikel silika gel;
3. Pemisahan udara.

Partikel penyerap:

• Reguler (bola): ketahanan tekanan lebih tinggi, biaya lebih tinggi;
• Non-bola: ketahanan tekanan lebih rendah.

Ukuran pori pada HPLC adalah salah satu parameter terpenting. Semakin kecil ukuran pori, semakin buruk permeabilitasnya terhadap molekul zat yang dielusi. Artinya, semakin buruk kapasitas penyerapan sorben. Semakin besar pori-pori, semakin kecil, pertama, stabilitas mekanik partikel sorben, dan kedua, semakin kecil permukaan serapan, sehingga efisiensinya semakin buruk.

Vaksinasi fase stasioner

HPLC fase normal:

• Fase diam dengan pencangkokan propilnitril (nitril);
• Fase diam dengan pencangkokan propilamina (amina).

HPLC fase terbalik:

• Fase diam dengan pencangkokan alkil;
• Fase diam dengan pencangkokan alkilsilil.

Penutup ujung adalah perlindungan area sorben yang tidak dicangkok dengan pencangkokan tambahan dengan molekul “kecil”. Penutup ujung hidrofobik (C1, C2): selektivitas lebih tinggi, keterbasahan lebih buruk; penutup ujung hidrofilik (diol): selektivitas lebih rendah, keterbasahan lebih tinggi.

Detektor untuk HPLC

• UV
• Matriks dioda
• Berpendar
• Elektrokimia
• Refraktometri
• Selektif massal

Tautan

Yayasan Wikimedia. 2010.

Lihat apa itu “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” di kamus lain:

kromatografi cair kinerja tinggi- - [SEBAGAI.Goldberg. Kamus energi Inggris-Rusia. 2006] Topik: energi secara umum EN kromatografi cair kinerja tinggi HPLC ... Panduan Penerjemah Teknis

Istilah kromatografi cair kinerja tinggi Istilah dalam bahasa Inggris kromatografi cair kinerja tinggi Sinonim Singkatan HPLC, HPLC Istilah terkait adsorpsi, oligopeptida, proteomik, sorben, fullerene, endohedral, kromatografi... ...

Kromatografi cair, di mana, untuk meningkatkan efisiensi pemisahan, pelarut (eluen) di bawah tekanan (lebih dari 3x107 Pa) dipompa melalui kolom yang diisi dengan sorben dengan partikel berdiameter kecil (hingga 1 m), dan filter perfusi juga digunakan. digunakan... ...

Suatu jenis kromatografi di mana cairan (eluen) berfungsi sebagai fase gerak dan fase diam. penyerap, TV pembawa dengan cairan atau gel yang dioleskan ke permukaannya. Dilakukan dalam kolom yang diisi sorben (kromatografi kolom) di atas permukaan datar... ... Ilmu pengetahuan Alam. kamus ensiklopedis

- [κρώμα (υrum) color] suatu proses yang didasarkan pada ketidaksetaraan kemampuan masing-masing komponen campuran (cair atau gas) untuk tetap berada di permukaan adsorben baik ketika menyerapnya dari aliran pembawa maupun ketika ... ... Ensiklopedia Geologi

- (dari bahasa Yunani lainnya ... Wikipedia

Istilah kromatografi Istilah dalam bahasa Inggris kromatografi Sinonim Singkatan Istilah terkait kromatografi cair kinerja tinggi, klatrat, laboratorium pada chip, porometri, proteom, proteomik, sorben, enzim, fullerene, endohedral... ... Kamus Ensiklopedis Nanoteknologi

Kromatografi cair berdasarkan dekomp. kemampuan ion yang dipisahkan untuk bertukar ion dengan ion tetap. ion sorben terbentuk sebagai hasil disosiasi gugus ionogenik yang terakhir. Penukar kation digunakan untuk memisahkan kation, untuk... ... Ensiklopedia kimia

HPLC- kromatografi cair kinerja tinggi… Kamus singkatan Rusia

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah salah satu metode efektif untuk memisahkan campuran zat kompleks, banyak digunakan baik dalam kimia analitik maupun teknologi kimia. Dasar pemisahan kromatografi adalah partisipasi ... Wikipedia

Buku

• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Praktis, Veronica R. Mayer. Kami mempersembahkan kepada pembaca buku edisi ke-5, yang telah diperluas dengan metode dan peralatan modern. Banyak yang telah diperbaiki dalam buku ini dan sejumlah besar referensi telah ditambahkan. Tempat-tempat dalam teks di mana...