Cromatografia de adsorção líquida em uma coluna

A separação de uma mistura de substâncias em uma coluna de adsorção ocorre como resultado de sua diferença na capacidade de absorção em um determinado adsorvente (de acordo com a lei de substituição de adsorção estabelecida por M. S. Tsvet).

Os adsorventes são corpos porosos com uma superfície interna altamente desenvolvida que retêm líquidos com a ajuda de fenômenos intermoleculares e de superfície. Estes podem ser compostos inorgânicos e orgânicos polares e não polares. Os adsorventes polares incluem sílica gel (dióxido de silício gelatinoso seco), óxido de alumínio, carbonato de cálcio, celulose, amido, etc. Sorventes não polares - carvão ativado, pó de borracha e muitos outros obtidos sinteticamente.

Os adsorventes estão sujeitos aos seguintes requisitos: S não devem entrar em reações químicas com a fase móvel e as substâncias a serem separadas; S deve ter resistência mecânica; Os grãos S do adsorvente devem ter o mesmo grau de dispersão.

Ao escolher as condições para o processo cromatográfico, as propriedades do adsorvente e das substâncias adsorvidas são levadas em consideração.

Na versão clássica da cromatografia em coluna líquida (LCC), um eluente (PF) é passado através de uma coluna cromatográfica, que é um tubo de vidro de 0,5 a 5 cm de diâmetro e 20 a 100 cm de comprimento, preenchido com um sorvente (NP). O eluente se move sob a influência da gravidade. A velocidade de seu movimento pode ser ajustada pelo guindaste na parte inferior da coluna. A mistura a ser analisada é colocada no topo da coluna. À medida que a amostra se move pela coluna, os componentes se separam. Em determinados intervalos, são retiradas frações do eluente liberado da coluna, que são analisadas por qualquer método que permita medir as concentrações dos analitos.

A cromatografia de adsorção em coluna é atualmente usada principalmente não como um método independente de análise, mas como um método de separação preliminar (às vezes final) de misturas complexas em misturas mais simples, ou seja, para se preparar para análise por outros métodos (incluindo cromatográficos). Por exemplo, uma mistura de tocoferóis é separada em uma coluna de alumina, o eluente é passado e a fração de α-tocoferol é coletada para posterior determinação fotométrica.

A separação cromatográfica da mistura na coluna devido ao avanço lento do PF leva muito tempo. Para acelerar o processo, a cromatografia é realizada sob pressão. Este método é chamado de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)

A modernização dos equipamentos utilizados na cromatografia em coluna líquida clássica a tornou um dos métodos de análise promissores e modernos. A cromatografia líquida de alta eficiência é um método conveniente para a separação, isolamento preparativo e análise qualitativa e quantitativa de compostos termolábeis não voláteis de baixo e alto peso molecular.

Dependendo do tipo de sorvente usado, este método usa 2 opções de cromatografia: em um sorvente polar usando um eluente não polar (opção de fase direta) e em um sorvente não polar usando um eluente polar - o chamado alta fase reversa cromatografia líquida de desempenho (RP HPLC).

Quando o eluente passa para o eluente, o equilíbrio sob condições de RPHLC é estabelecido muitas vezes mais rápido do que sob condições de sorventes polares e PFs não aquosos. Como resultado disso, além da conveniência de trabalhar com eluentes água e álcool-água, o RPHLC ganhou grande popularidade. A maioria das análises de HPLC são realizadas usando este método.

Instrumentação para HPLC

Um conjunto de equipamentos modernos para HPLC, via de regra, é composto por duas bombas 3,4 (Fig. 7.1.1.1), controladas por um microprocessador 5, e fornecendo eluente conforme programa específico. As bombas criam pressão de até 40 MPa. A amostra é injetada através de um dispositivo especial (injetor) 7 diretamente no fluxo do eluente. Depois de passar pela coluna cromatográfica 8, as substâncias são detectadas por um detector de fluxo 9 altamente sensível, cujo sinal é registrado e processado pelo microcomputador 11. Se necessário, as frações são selecionadas automaticamente no momento do pico de saída.

As colunas para HPLC são feitas de aço inoxidável com diâmetro interno de 2 a 6 mm e comprimento de 10 a 25 cm. As colunas são preenchidas com um sorvente (NF). Sílica gel, alumina ou sorventes modificados são usados ​​como NF. O gel de sílica é geralmente modificado pela introdução química de vários grupos funcionais em sua superfície.

Detectores. O registro da saída da coluna de um componente separado é realizado usando um detector. Para registro, pode-se utilizar a alteração em qualquer sinal analítico proveniente da fase móvel e relacionado à natureza e quantidade do componente da mistura. A cromatografia líquida usa sinais analíticos como absorção de luz ou emissão de luz da solução de saída (detectores fotométricos e fluorimétricos), índice de refração (detectores refratométricos), potencial e condutividade elétrica (detectores eletroquímicos), etc.

O sinal continuamente detectado é gravado pelo gravador. Um cromatograma é uma sequência de sinais detectores gravados em um gravador, que são gerados quando componentes individuais de uma mistura deixam a coluna. No caso de separação da mistura, picos separados são visíveis no cromatograma externo. A posição do pico no cromatograma é usada para fins de identificação da substância, a altura ou área do pico é usada para fins de determinação quantitativa.

Análise qualitativa

As características mais importantes do cromatograma - o tempo de retenção tR e o volume de retenção associado a ele - refletem a natureza das substâncias, sua capacidade de sorção no material da fase estacionária e, portanto, sob condições cromatográficas constantes, são um meio de identificação da substância. Para uma determinada coluna com determinada vazão e temperatura, o tempo de retenção de cada composto é constante (Figura 7.1.1.2), onde t.R(A) é o tempo de retenção do componente A da mistura analisada a partir do momento em que é injetado no a coluna até que o pico máximo apareça na saída da coluna, 1K(ss) - tempo de retenção do padrão interno (substância inicialmente ausente na mistura analisada), h - altura do pico (mm), ab - largura do pico na metade de sua altura, milímetros.

Para identificar uma substância por cromatograma, geralmente são usadas amostras padrão ou substâncias puras. Compare o tempo de retenção do componente IR* desconhecido com o tempo de retenção IRCT das substâncias conhecidas. Mas identificação mais confiável medindo o tempo de retenção relativo

Neste caso, uma substância conhecida (padrão interno) é primeiro introduzida na coluna e seu tempo de retenção tR(Bc) é medido, então a mistura de teste é separada cromatograficamente (cromatografada), à qual o padrão interno é adicionado preliminarmente. O tempo de retenção relativo é determinado pela fórmula (7.1.1.1).

Análise quantitativa

Esta análise é baseada na dependência da altura do pico h ou sua área S da quantidade de substância. Para picos estreitos, a medição h é preferível, para picos amplos e borrados - S. A área do pico é medida de diferentes maneiras: multiplicando a altura do pico (h) pela sua largura (ai / 2), medida na metade de sua altura (Fig. 7.2.3); planejamento; usando um integrador. Os cromatógrafos modernos são equipados com integradores elétricos ou eletrônicos.

Três métodos são usados ​​principalmente para determinar o conteúdo de substâncias em uma amostra: o método de calibração absoluta, o método de normalização interna e o método de padrão interno.

O método de calibração absoluta é baseado em uma determinação preliminar da relação entre a quantidade da substância introduzida e a área ou altura do pico no cromatograma. Uma quantidade conhecida da mistura de calibração é introduzida no cromatograma e as áreas ou alturas dos picos obtidos são determinadas. Construa um gráfico da área ou altura do pico a partir da quantidade de substância injetada. A amostra de teste é analisada, a área ou altura do pico do componente a ser determinado é medida e sua quantidade é calculada com base na curva de calibração.

Este método fornece informações apenas sobre o teor relativo do componente na mistura, mas não permite determinar seu valor absoluto.

O método do padrão interno é baseado na comparação de um parâmetro de pico selecionado de um analito com o mesmo parâmetro de uma substância padrão introduzida na amostra em uma quantidade conhecida. Uma quantidade conhecida de tal substância padrão é introduzida na amostra de teste, cujo pico é suficientemente bem separado dos picos dos componentes da mistura de teste

Os dois últimos métodos requerem a introdução de fatores de correção que caracterizem a sensibilidade dos detectores utilizados às substâncias analisadas. Para diferentes tipos de detectores e diferentes substâncias, o coeficiente de sensibilidade é determinado experimentalmente.

A cromatografia de adsorção líquida também utiliza a análise de frações de soluções coletadas no momento em que a substância sai da coluna. A análise pode ser realizada por vários métodos físico-químicos.

A cromatografia de adsorção líquida é usada principalmente para a separação de substâncias orgânicas. Este método é muito bem sucedido no estudo da composição de óleo, hidrocarbonetos, separando efetivamente isômeros trans e cis, alcalóides, etc. HPLC pode ser usado para determinar corantes, ácidos orgânicos, aminoácidos, açúcares, impurezas de pesticidas e herbicidas, substâncias medicinais e outros contaminantes em produtos alimentícios.

Cromatografia liquida Este é um método para separar e analisar misturas complexas de substâncias nas quais o líquido é a fase móvel. É aplicável à separação de uma gama mais ampla de substâncias do que o método de cromatografia gasosa. Isso se deve ao fato de que a maioria das substâncias não são voláteis, muitas delas são instáveis ​​em altas temperaturas (especialmente compostos de alto teor molecular) e se decompõem quando convertidas em estado gasoso. A separação de substâncias por cromatografia líquida é mais frequentemente realizada à temperatura ambiente.

As características de todos os tipos de cromatografia líquida se devem ao fato de que a fase móvel nela é um líquido e a sorção de componentes de um eluente gasoso e líquido ocorre de maneira diferente. Se na cromatografia gasosa o gás de arraste desempenha apenas uma função de transporte e não é sorvido pela fase estacionária, então a fase móvel líquida na cromatografia líquida é um eluente ativo, suas moléculas podem ser sorvidas pela fase estacionária. Ao passar pela coluna, as moléculas dos componentes da mistura analisada que estão no eluente devem deslocar as moléculas do eluente da camada superficial do sorvente, o que leva a uma diminuição da energia de interação entre as moléculas do sorvente. substância analisada e a superfície do sorvente. Portanto, os valores dos volumes retidos V R, proporcional à mudança na energia livre do sistema, é menor na cromatografia líquida do que na cromatografia gasosa, e a faixa de linearidade da isotérmica de sorção na cromatografia líquida é mais ampla.

Usando vários eluentes, pode-se alterar os parâmetros de retenção e seletividade do sistema cromatográfico. A seletividade na cromatografia líquida, em contraste com a cromatografia gasosa, é determinada não por um, mas por dois fatores - a natureza das fases móvel (eluente) e estacionária.

A fase móvel líquida tem maior densidade e viscosidade do que a fase gasosa, coeficientes de difusão D Nós vamos 3-4 ordens de magnitude menor do que no gás. Isso leva a uma desaceleração na transferência de massa na cromatografia líquida em comparação com a cromatografia gasosa. A equação de Van Deemter devido ao fato de que o termo NO não desempenha um papel na cromatografia líquida ( D Nós vamos  D G), a dependência gráfica da eficiência também muda H na velocidade linear do fluxo da fase móvel tem a forma mostrada na fig. 1.9.

Na versão clássica da cromatografia líquida em coluna, uma coluna de vidro de 1 a 2 m de altura, preenchida com um sorvente com tamanho de partícula de 100 μm e eluente, é injetada com a amostra analisada dissolvida no eluente, e o eluente é passado por , levando porções do eluato na saída da coluna. Esta variante da cromatografia líquida ainda é usada na prática laboratorial, mas como a vazão do eluente sob a ação da gravidade é baixa, a análise é demorada.

Uma versão moderna da cromatografia líquida, a chamada HPLC de cromatografia líquida de alta eficiência, usa sorventes volumétricos e porosos de superfície com tamanho de partícula de 5 a 10 μm, bombas de pressão que fornecem pressão no sistema de até 400 atm e detectores sensíveis. A rápida transferência de massa e a alta eficiência de separação possibilitam o uso de HPLC para a separação de moléculas (cromatografia de adsorção líquido-líquido e de partição líquido-líquido), para a separação de íons (cromatografia de troca iônica, iônica, par iônico), para a separação de macromoléculas (cromatografia de exclusão de tamanho).

1.3. RETENÇÃO E FORÇA DE SOLVENTE

Para que os analitos sejam separados na coluna, conforme mencionado acima, o fator de capacidade k" deve ser maior que 0, ou seja, as substâncias devem ser retidas pela fase estacionária, o sorvente. grande para obter um tempo de eluição aceitável. Se uma fase estacionária for escolhida para uma dada mistura de substâncias, que as contém, então o trabalho adicional no desenvolvimento de um procedimento de análise consiste em escolher um solvente que forneça, no caso ideal, diferentes para todos os componentes, mas aceitável não muito grande k. Isto é conseguido alterando a força de eluição do solvente.

No caso de cromatografia de adsorção em gel de sílica ou alumina, como regra, a força de um solvente de dois componentes (por exemplo, hexano com a adição de isopropanol) é aumentada aumentando o conteúdo do componente polar (isopropanol) nele , ou reduzido pela diminuição do teor de isopropanol. Se o conteúdo do componente polar ficar muito baixo (menos de 0,1%), ele deve ser substituído por uma força de eluição mais fraca. O mesmo é feito substituindo-se o componente polar ou não polar por outros, mesmo que este sistema não proporcione a seletividade desejada em relação aos componentes da mistura de interesse. Ao selecionar sistemas de solventes, tanto as solubilidades dos componentes da mistura quanto as séries eluotrópicas de solventes compiladas por diferentes autores são levadas em consideração.

Aproximadamente da mesma forma, a força do solvente é selecionada no caso de usar fases polares enxertadas (nitrila, amino, diol, nitro, etc.), levando em consideração possíveis reações químicas e excluindo solventes perigosos para a fase (por exemplo, , aldeídos e cetonas para a fase amino).

No caso de cromatografia de fase reversa, a força do solvente é aumentada aumentando o teor do componente orgânico (metanol, acetonitrila ou THF) no eluente e reduzida pela adição de mais água. Se a seletividade desejada não puder ser alcançada, outro componente orgânico é usado ou são feitas tentativas de alterá-lo com a ajuda de vários aditivos (ácidos, reagentes de pares de íons, etc.).

Nas separações por cromatografia de troca iônica, a força do solvente é alterada aumentando ou diminuindo a concentração da solução tampão ou alterando o pH, em alguns casos é usada a modificação com substâncias orgânicas.

No entanto, especialmente no caso de misturas naturais e biológicas complexas, muitas vezes não é possível escolher a força do solvente de tal forma que todos os componentes da amostra sejam eluídos dentro de um tempo aceitável. Em seguida, deve-se recorrer à eluição gradiente, ou seja, use um solvente cuja força de eluição durante a análise mude para que aumente constantemente de acordo com um programa predeterminado. Esta técnica permite obter a eluição de todos os componentes de misturas complexas em um período de tempo relativamente curto e sua separação em componentes na forma de picos estreitos.

1.6.1. Cromatografia líquida de adsorção. A cromatografia líquida de adsorção, dependendo da polaridade das fases estacionária e móvel, é dividida em cromatografia de fase normal (NPC) e fase reversa (RPC). No NPC, são usados ​​um adsorvente polar e fases móveis não polares; no OFC, um adsorvente não polar e fases móveis polares são usados, mas em ambos os casos, a escolha da fase móvel é muitas vezes mais importante do que a escolha da fase móvel. um estacionário. A fase estacionária deve conter as substâncias a serem separadas. A fase móvel, ou seja, o solvente, deve fornecer diferentes capacidades de coluna e separações eficientes em um tempo razoável.

Como fase estacionária na cromatografia líquida de adsorção, são utilizados materiais porosos finamente dispersos polares e não polares com uma área de superfície específica superior a 50 m 2 /g. Os adsorventes polares (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil, etc.) possuem grupos levemente ácidos na superfície, capazes de reter substâncias com propriedades básicas. Esses adsorventes são usados ​​principalmente para a separação de compostos polares não polares e médios. Sua desvantagem é a alta sensibilidade ao teor de água nos eluentes utilizados. Para eliminar esta desvantagem, os sorventes polares são tratados com aminas, dióis e outros reagentes, resultando em enxerto de superfície desses reagentes, modificação de superfície e uma mudança na seletividade em relação aos analitos.

Os adsorventes não polares (fuligem grafitada, diatomita, kieselguhr) são não seletivos para moléculas polares. Para obter adsorventes não polares, grupos não polares são frequentemente enxertados na superfície, por exemplo, de sílica gel, por exemplo, alquilsilil - SiR 3, onde grupos R - alquil são C 2 - C 22.

A fase móvel deve dissolver completamente a amostra analisada, ter uma viscosidade baixa (para que os coeficientes de difusão sejam suficientemente grandes), é desejável que seja possível separar os componentes separados dela. Deve ser inerte aos materiais de todas as partes do cromatógrafo, seguro, barato, adequado para o detector.

As fases móveis utilizadas na cromatografia líquida diferem em sua força de eluição. O poder de eluição de um solvente mostra quantas vezes a energia de sorção de um determinado eluente em um determinado adsorvente é maior que a energia de sorção do eluente escolhido como padrão, por exemplo, n-heptano. Solventes fracos são mal adsorvidos pela fase estacionária, então os coeficientes de distribuição de substâncias sorvidas (sorbato) são altos. Por outro lado, solventes fortes adsorvem bem, então os coeficientes de partição do sorbato são baixos. Quanto mais forte o solvente, maior a solubilidade da amostra analisada nele, mais forte a interação solvente-sorbato.

Para garantir alta eficiência de separação na coluna, é necessário selecionar uma fase móvel que tenha a polaridade ideal para a mistura a ser separada nas condições de separação selecionadas. Normalmente, a fase estacionária é selecionada primeiro, que tem uma polaridade próxima à dos componentes a serem separados. Em seguida, a fase móvel é selecionada, garantindo que o coeficiente de capacitância k" acabou por estar na faixa de 2 a 5. Se a polaridade da fase móvel estiver muito próxima da polaridade da fase estacionária, o tempo de retenção dos componentes será muito curto e se as polaridades da fase móvel e estacionária fases diferem muito, o tempo de retenção torna-se muito longo.

Ao selecionar as fases móveis, elas são guiadas pelas chamadas séries eluotrópicas, baseadas no uso de índices de polaridade Snider R", que subdivide todos os solventes em fortes (polares) e fracos (fracamente polares e apolares). A escala de polaridade é baseada na solubilidade das substâncias utilizadas como fases móveis em dioxano, nitrometano e etanol.

A Tabela 1.2 mostra os valores do índice de polaridade e força de eluição (em relação ao SiO 2 ) de uma série de solventes mais comumente usados ​​em cromatografia líquida como fases móveis. Os limites de transparência de comprimento de onda curto desses solventes também são indicados aqui, o que facilita a seleção de condições para detecção de componentes da mistura.

Tabela 1.2

Características dos solventes usados ​​em cromatografia líquida

Solvente	Índice de polaridade	Poder de eluição (SiO 2)	Limite de transparência de ondas curtas
Fluoralcano
Ciclohexano
n-Hexano
Tetracloreto de carbono
Éter diisopropílico
éter dietílico
diclorometano
Tetrahidrofurano
Clorofórmio
Ácido acético
Acetonitrila
Nitrometano

A cromatografia líquida geralmente não usa solventes individuais, mas suas misturas. Frequentemente, pequenas adições de outro solvente, especialmente água, aumentam muito a força de eluição do eluente.

Ao separar misturas de múltiplos componentes, uma fase móvel como eluente pode não separar todos os componentes da amostra em um tempo razoável. Neste caso, utiliza-se um método de eluição gradual ou gradiente, em que se utilizam sequencialmente eluentes cada vez mais fortes durante a cromatografia, o que possibilita a eluição de substâncias altamente retidas em menos tempo.

Na cromatografia líquida, existem alguns empírico regras que são muito úteis na escolha de um eluente:

 a sorção de um composto, como regra, aumenta com o aumento do número de ligações duplas e grupos OH nele;

 a sorção diminui em vários compostos orgânicos: ácidosálcooisaldeídoscetonaséstereshidrocarbonetos insaturadoshidrocarbonetos saturados;

 para separar substâncias de diferentes polaridades e separar substâncias de diferentes classes, é utilizada a cromatografia de fase normal: a amostra analisada é dissolvida e eluída com um eluente não polar, compostos de diferentes classes saem da coluna com um adsorvente polar por tempos diferentes, enquanto o tempo de retenção de compostos com diferentes grupos funcionais aumenta durante a transição de compostos não polares para compostos fracamente polares. Para moléculas muito polares, os tempos de retenção são tão longos que a análise não é possível quando se utiliza um eluente não polar. Para reduzir o tempo de retenção dos componentes polares, passa-se para eluentes polares;

 na variante de fase reversa, a fase estacionária (adsorvente não polar) adsorve o componente não polar mais fortemente de eluentes polares, por exemplo, de água;

 Reduzindo a polaridade do eluente adicionando um solvente menos polar, a retenção dos componentes pode ser reduzida.

1.6.2. Cromatografia líquida de partição. Na cromatografia de partição ou líquido-líquido, a separação dos componentes da amostra analisada se deve a diferenças nos coeficientes de sua distribuição entre duas fases líquidas que não se misturam entre si, sendo uma delas estacionária e localizada na superfície. ou nos poros de um portador sólido imóvel, e o segundo é móvel.

Em termos da natureza das forças de interação que determinam a distribuição diferente entre as duas fases de substâncias que diferem em sua estrutura química, a cromatografia de partição é semelhante à cromatografia de adsorção, ou seja, aqui a separação também é baseada na diferença das forças de interação intermolecular entre os componentes da amostra analisada com as fases líquidas estacionárias e móveis.

Dependendo da técnica de desempenho, a cromatografia de partição, como a cromatografia de adsorção, pode ser em coluna ou planar (papel ou camada fina).

Como carreadores sólidos, são utilizadas substâncias indiferentes ao solvente móvel e aos componentes da amostra analisada, mas capazes de reter a fase estacionária na superfície e nos poros. Na maioria das vezes, substâncias polares (celulose, gel de sílica, amido) são usadas como transportadores. Eles são aplicados à fase estacionária - um solvente polar, na maioria das vezes água ou álcool. Neste caso, substâncias menos polares ou não polares (álcoois, aminas, cetonas, hidrocarbonetos, etc.) são usadas como fases móveis. Este tipo de cromatografia de partição é chamado fase normal. É usado para separar substâncias polares.

A segunda variante da cromatografia de partição difere em que transportadores não polares (borracha, PTFE, sílica gel hidrofobizada) são usados ​​como a fase sólida estacionária, solventes não polares (hidrocarbonetos) como a fase líquida estacionária e solventes polares (álcoois, aldeídos ) como a fase líquida móvel. , cetonas, etc., muitas vezes água). Esta variante da cromatografia de partição é chamada fase reversa e é usado para separar substâncias apolares.

Para obter a separação ideal dos componentes da amostra analisada, a seleção da fase móvel é muito importante. Os solventes (fases líquidas móveis e estacionárias) devem ser selecionados de modo que os coeficientes de distribuição dos componentes da mistura sejam significativamente diferentes. As fases líquidas estão sujeitas às seguintes requisitos:

1) os solventes utilizados devem dissolver bem as substâncias a serem separadas, e sua solubilidade na fase estacionária deve ser maior que na móvel;

2) os solventes utilizados como fases móvel e estacionária devem ser mutuamente saturados, ou seja, a composição do solvente deve ser constante durante a passagem pela coluna;

3) a interação dos solventes utilizados como fase móvel com a fase estacionária deve ser mínima.

Na maioria das vezes, na cromatografia líquida de partição, não são usadas substâncias individuais como fases líquidas móveis, mas suas misturas em várias proporções. Isso permite regular a polaridade da fase móvel, alterar a proporção das polaridades das fases móvel e estacionária e obter condições ótimas para separar os componentes de uma determinada mistura que está sendo analisada.

Uma desvantagem significativa deste método cromatográfico é a lavagem bastante rápida da fase líquida estacionária aplicada do transportador. Para eliminá-lo, o solvente usado como fase móvel é saturado com a substância usada como fase líquida estacionária, ou a fase líquida estacionária é estabilizada enxertando-a em um transportador.

Uma variação da cromatografia líquida de partição é o método HPLC amplamente utilizado.

Os sistemas cromatográficos mais comuns são sistemas que possuem um princípio de montagem modular. Bombas, desgaseificadores, detectores, dispensadores (autoamostradores), fornos de coluna, coletores de frações, controles do sistema de cromatografia e registradores estão disponíveis como módulos separados. Uma ampla gama de módulos permite que você resolva com flexibilidade vários problemas analíticos, altere rapidamente a configuração do sistema, se necessário, com custos mínimos. Ao mesmo tempo, também são produzidos LCs monomodulares (integrados), cuja principal vantagem é a miniaturização de blocos individuais e a compacidade do dispositivo.

Dependendo do método de eluição, os cromatógrafos líquidos são divididos em isocráticos e gradientes.

Diagrama de um cromatógrafo isocrático

A fase móvel do recipiente (1) através do filtro de entrada (9) é fornecida por uma bomba de precisão de alta pressão (2) para o sistema de entrada de amostra (3) - um injetor manual ou um amostrador automático, onde a amostra também é injetada . Além disso, através do filtro em linha (8), a amostra com a corrente da fase móvel entra no elemento de separação (elementos) (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. Em seguida, o eluato entra no detector (5) e é removido para o tanque de drenagem (7). Quando o eluato flui pelo circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transmitidos para um registrador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema), dos teclados de cada um dos módulos do sistema ou por um programa de controle de um computador pessoal.

No caso da eluição por gradiente, são usados ​​dois tipos fundamentalmente diferentes de cromatógrafos líquidos. Eles diferem no ponto de formação do gradiente de composição da fase móvel.

Esquema de um cromatógrafo de gradiente com a formação de um gradiente da composição da fase móvel na linha de baixa pressão.

A fase móvel dos tanques (1) através dos filtros de entrada (9) e do programador de gradiente (10) é fornecida por uma bomba de precisão de alta pressão (2) ao sistema de injeção de amostra (3) - um injetor manual ou um amostrador automático , onde a amostra também é injetada. A operação das válvulas programadoras de gradiente é controlada pelo módulo de controle do sistema (bomba ou controlador) ou por um programa de controle de PC. Sistemas deste tipo formam um gradiente binário, tridimensional e quadridimensional. A forma da função de processamento de gradiente depende do módulo de controle ou programa de controle específico, bem como da funcionalidade dos módulos controlados e de controle. Além disso, através do filtro em linha (8), a amostra com a corrente da fase móvel entra no elemento de separação (elementos) (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. Em seguida, o eluato entra no detector (5) e é removido para o tanque de drenagem (7). Quando o eluato flui pelo circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transmitidos para um registrador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema) ou por um programa de controle de um computador pessoal. No caso de controlar o módulo de controle, é possível controlar independentemente o detector a partir de seu próprio teclado.

Apesar da aparente atratividade de tais sistemas (eles usam apenas uma bomba de precisão de alta pressão), esses sistemas têm uma série de desvantagens, entre as quais a principal, talvez, seja a severa necessidade de desgaseificação completa dos componentes da fase móvel antes mesmo da misturador de baixa pressão (câmara do programador de gradiente). É realizado com a ajuda de desgaseificadores de fluxo especiais. Devido a este fato, seu custo torna-se comparável a outro tipo de sistemas gradientes - sistemas com a formação de uma composição gradiente da fase móvel na linha de alta pressão.

A diferença fundamental entre sistemas com a formação de uma composição de gradiente de fase móvel na linha de alta pressão é a mistura de componentes na linha de alta pressão, naturalmente, com esta abordagem, o número de bombas de precisão é determinado pelo número de tanques para mistura a fase móvel. Com esta abordagem, os requisitos para a desgaseificação dos componentes são significativamente reduzidos.

Esquema de um cromatógrafo de gradiente com a formação de um gradiente da composição da fase móvel na linha de alta pressão.

A fase móvel dos tanques (1) através dos filtros de entrada (9) é fornecida por bombas de alta pressão de precisão (2 e 11) através de um misturador de fluxo estático ou dinâmico (10) para o sistema de injeção de amostra (3) - um manual injetor ou um amostrador automático, onde a amostra também é injetada. A operação de bombas controladas é controlada pelo módulo de controle do sistema (bomba mestre ou controlador) ou por um programa de controle de PC. Neste caso, todas as bombas são controladas. Sistemas deste tipo formam um gradiente binário ou tridimensional. A forma da função de processamento de gradiente depende do módulo de controle ou programa de controle específico, bem como da funcionalidade dos módulos controlados e de controle. Além disso, através do filtro em linha (8), a amostra com a corrente da fase móvel entra no elemento de separação (elementos) (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. Em seguida, o eluato entra no detector (5) e é removido para o tanque de drenagem (7). Quando o eluato flui pelo circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transmitidos para um registrador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema) ou por um programa de controle de um computador pessoal. No caso de controlar o módulo de controle, é possível controlar independentemente o detector a partir de seu próprio teclado.

Os esquemas propostos são bastante simplificados. Dispositivos adicionais podem ser incluídos nos sistemas - um termostato de coluna, sistemas de derivatização pós-coluna, sistemas de preparação e concentração de amostras, um reciclador de solvente, sistemas de membrana para suprimir a condutividade elétrica de fundo (para cromatografia de íons), sistemas de proteção adicionais (filtros, colunas) , etc Nos diagramas, os módulos manométricos também não são mostrados separadamente. Como regra, esses dispositivos são incorporados em unidades de bomba. Essas unidades podem combinar várias bombas, uma bomba com um programador de gradiente e um controlador de sistema comum. A estrutura do sistema depende de sua configuração e de cada fabricante específico.

Tal complicação radical do suporte técnico do processo cromatográfico leva ao surgimento de uma série de requisitos para as propriedades da fase móvel, que estão ausentes na coluna clássica e na cromatografia planar. A fase líquida deve ser adequada para detecção (ser transparente em uma determinada região do espectro ou ter um baixo índice de refração, uma certa condutividade elétrica ou permissividade, etc.), inerte aos materiais das partes do trato cromatográfico, não formar bolhas de gás nas válvulas da bomba e na célula do detector, não possuem impurezas mecânicas.

Em cromatografia líquida muitos tipos de bombas são usados. O LC de baixa pressão geralmente usa bombas peristálticas (Figura 1).

Fig.1 Bomba peristáltica programável MasterFlex.

Em HPLC, bombas de alta pressão são usadas para garantir o fluxo da fase móvel através da coluna com os parâmetros especificados.

As características técnicas mais importantes das bombas HPLC são: faixa de vazão; pressão máxima de trabalho; reprodutibilidade do fluxo; faixa de pulsação de fornecimento de solvente.

Pela natureza do fornecimento de solvente, as bombas podem ser de fornecimento constante (vazão) e pressão constante. Basicamente, no trabalho analítico, é usado um modo de fluxo constante, ao encher colunas, é usado um modo de pressão constante.

De acordo com o princípio de operação, as bombas HPLC são divididas em seringa e em desentupidor recíproco .

Bombas de seringa

A principal característica distintiva dessas bombas é sua operação cíclica e, portanto, os cromatógrafos nos quais essas bombas são usadas também diferem na operação cíclica.

Arroz. 2. Arranjo principal de uma bomba de seringa para HPLC.

Arroz. 2A. Bomba de seringa.

A unidade de controle BU fornece tensão ao motor D, que determina a velocidade e o sentido de sua rotação. A rotação do motor com a ajuda da caixa de velocidades P é convertida no movimento do pistão P dentro do cilindro D. A bomba é operada em 2 ciclos. No ciclo de enchimento, a válvula K2 é fechada, K1 é aberta, o solvente flui do tanque para o cilindro C. No modo de abastecimento, a válvula K1 é fechada e através da válvula K2 a fase móvel entra no dispositivo de dosagem.

Bombas deste tipo são caracterizadas pela quase completa ausência de pulsações no fluxo da fase móvel durante a operação.

Desvantagens da bomba:

a) alto consumo de tempo e solvente para lavagem na troca de solvente;

b) o volume de PF limitado pelo volume da seringa e, portanto, o tempo de separação limitado;

c) suspensão da separação durante o enchimento da bomba;

d) grandes dimensões e peso, proporcionando alta vazão e pressão (você precisa de um motor potente e uma grande força de pistão com sua grande área).

Bombas alternativas de pistão.

Arroz. 3. Dispositivo principal de uma bomba de pistão.

Princípio de funcionamento.

O motor D através da caixa de engrenagens R alterna o êmbolo P, movendo-se na cabeça de trabalho da bomba. As válvulas K1 e K2 abrem quando a bomba está na fase de sucção e entrega, respectivamente. A quantidade de alimentação volumétrica é determinada por três parâmetros: diâmetro do pistão (geralmente 3,13; 5,0; 7,0 mm), sua amplitude (12-18 mm) e frequência (que depende da velocidade de rotação do motor e da caixa de câmbio).

Bombas deste tipo fornecem um fluxo volumétrico constante da fase móvel por um longo tempo. Pressão máxima de trabalho 300-500 atm, vazão 0,01-10 ml/min. Repetibilidade de alimentação de volume -0,5%. A principal desvantagem é que o solvente é alimentado no sistema na forma de uma série de pulsos sucessivos, de modo que há pulsações de pressão e fluxo (Fig. 4). Esta é a principal razão para o aumento de ruído e dessensibilização de quase todos os detectores usados ​​em LC, principalmente os eletroquímicos.

Fig.4. Pulsação da bomba do êmbolo.

Maneiras de lidar com pulsações.

1. Aplicação de dispositivos de amortecimento.

São tubos espirais de perfil especial em aço inoxidável, incluídos em série ou em paralelo no sistema entre a bomba e o dispensador.

Arroz. 5. Amortecedor espiral.

O amortecedor é destorcido com um aumento de pressão nele (aceleração da bomba). Quando a pressão cai, ela se torce, seu volume diminui, espreme parte do solvente, mantendo uma vazão constante e reduzindo as pulsações. Esse amortecedor funciona bem a uma pressão de 50 atm e acima.

A uma pressão de 5-30 atm, suaviza melhor as pulsações amortecedor de ar, feito a partir de uma coluna (Fig. 6.). O ar na coluna obstruída (6x200 mm) é comprimido e as pulsações são extintas. O ar nele se dissolve em 24 horas.

Arroz. 6. Amortecedor de ar.

2. O uso de dispositivos eletrônicos.

Ao usar um transdutor de pressão eletrônico, as leituras do transdutor podem ser usadas para controlar a operação da bomba. Quando a pressão cai, a rotação do motor aumenta e compensa a diminuição da pressão. Também é possível compensar vazamentos nas válvulas e parcialmente nos balonetes. O uso de um amortecedor eletrônico (BPZh-80, KhPZh-1, etc.) permite reduzir as pulsações de pressão para 1 atm a uma pressão de 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Cromatografia de troca iônica, iônica, de par iônico. Os métodos de troca iônica, cromatografia de íons e pares de íons são baseados no processo dinâmico de substituição de íons associados à fase estacionária por íons eluentes que entram na coluna. O principal objetivo do processo cromatográfico é a separação de íons inorgânicos ou orgânicos do mesmo signo. A retenção nestes tipos de cromatografia é determinada pela mudança na energia livre da reação de troca iônica. A razão das concentrações de íons trocantes na solução e na fase sorvente é caracterizada pelo equilíbrio de troca iônica. A troca iônica consiste no fato de que algumas substâncias (trocadores de íons), quando imersas em uma solução eletrolítica, absorvem cátions ou ânions desta, liberando uma quantidade equivalente de outros íons com carga de mesmo sinal na solução. Entre o trocador de cátions e a solução há uma troca de cátions, entre o trocador de ânions e a solução há uma troca de ânions.

Os trocadores de cátions são, na maioria das vezes, substâncias poliméricas insolúveis especialmente sintetizadas contendo grupos ionogênicos ácidos em sua estrutura: -SO 3 H; –COOH; -OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

As fórmulas químicas dos permutadores catiónicos podem ser representadas esquematicamente como R-SO 3 H; R-SO3Na. No primeiro caso, o trocador de cátions está na forma H, no segundo, na forma Na. R é uma matriz polimérica.

As reações de troca catiônica são escritas como reações químicas heterogêneas comuns:

RN + Na + RNa + H +

Os trocadores aniônicos contêm grupos ionogênicos básicos em sua estrutura: –N(CH 3) 3 + ; =NH2+; =NH + etc. Suas fórmulas químicas podem ser representadas como RNH 3 OH e RNH 3 Cl ou ROH, RCl. No primeiro caso, o trocador aniônico está na forma OH, no segundo, na forma Cl. A reação de troca aniônica pode ser escrita da seguinte forma:

R–OH+Cl – RCl+OH –

São conhecidos trocadores iônicos anfotéricos que contêm grupos ácidos e básicos em sua estrutura. Os trocadores iônicos que possuem em sua composição grupos do mesmo tipo (por exemplo, SO 3 H) ácidos (básicos) são chamados de monofuncionais; trocadores iônicos contendo grupos ácidos (básicos) heterogêneos (por exemplo, -SO3H, -OH) - polifuncionais.

Trocadores de íons monofuncionais são obtidos por uma reação de polimerização. A reação de policondensação permite obter trocadores de íons polifuncionais. Para que os trocadores iônicos resultantes tenham características de desempenho suficientemente altas, eles devem ser insolúveis, mas intumescíveis no solvente apropriado e ter um número suficientemente grande de grupos ionogênicos capazes de trocar com os grupos ionogênicos da amostra analisada. Isso pode ser alcançado se as cadeias de polímero resultantes forem suficientemente ramificadas e conectadas umas às outras por "pontes de reticulação". Por exemplo, na preparação de trocadores de cátions do tipo polimerização à base de estireno, o divinilbenzeno é mais frequentemente usado como agente de reticulação, cuja introdução em uma quantidade de até 16% garante a produção de trocadores de íons com vários graus de intumescimento e, portanto, permite controlar a porosidade do trocador de íons. O grau de dilatação do permutador de iões, expresso em mililitros/grama, é o volume de 1 g de permutador de iões seco ao ar empacotado na coluna.

O trocador de íons absorve, via de regra, um dos contra-íons - íons na fase móvel, ou seja, apresenta uma certa seletividade. Séries de afinidade, ou seletividade, de íons em relação a trocadores de íons de vários tipos foram estabelecidas experimentalmente. Por exemplo, em baixas concentrações de solução em trocadores de cátions fortemente ácidos, íons com a mesma carga são sorvidos na seguinte sequência:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Para íons com cargas diferentes, a capacidade de absorção aumenta com o aumento da carga:

Na+Ca2+

No entanto, alterar as condições para realizar a reação de troca iônica pode levar à inversão em série. As séries de afinidade também foram estabelecidas para trocadores de ânions. Por exemplo, a capacidade de absorção de ânions em trocadores de ânions fortemente básicos aumenta na série:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 - .

Trocadores de íons contendo grupos fortemente ácidos ou fortemente básicos em sua estrutura entram em reações de troca iônica com quaisquer íons em solução que tenham cargas do mesmo sinal que o sinal do contra-íon. Esses trocadores de íons são chamados de universais.

O processo de troca iônica entre o analito e o trocador iônico pode ser realizado de três maneiras: estática, dinâmica (método do filtro de troca iônica) e cromatográfica.

Método estático troca iônica é que uma amostra do trocador iônico é colocada em contato com um certo volume de solução e agitada ou agitada por um certo tempo até que o equilíbrio seja estabelecido. Este é um método rápido e simples de troca iônica, utilizado para concentrar íons de soluções diluídas, remover impurezas indesejadas, mas não proporciona absorção completa dos íons, pois a troca iônica é um processo fora do equilíbrio e, portanto, não garante a separação completa de íons.

Ao realizar a troca iônica de forma dinâmica uma solução é passada através da coluna com um trocador de íons, que, à medida que se move ao longo da coluna, entra em contato com novos grânulos do trocador de íons. Esse processo proporciona uma troca mais completa do que o método estático, pois os produtos de troca são removidos pelo fluxo da solução. Eles podem concentrar íons de soluções diluídas e separar íons que diferem muito em propriedades, por exemplo, íons de carga diferente (cátions separados de ânions), mas a separação de íons de mesmo sinal de carga é quase impossível. A separação quantitativa de tais íons só é possível com a repetição repetida de atos elementares de sorção-dessorção sob condições dinâmicas, isto é. método cromatográfico . Ao trabalhar com este método, são usadas camadas altas de trocador de íons, e a mistura a ser separada é introduzida nessa camada em uma quantidade muito menor que a capacidade da coluna, devido ao qual é assegurada a repetição repetida de atos elementares de troca de íons .

De acordo com a técnica de análise, a cromatografia de troca iônica é semelhante à cromatografia molecular e pode ser realizada de acordo com as opções de eluente (revelação), frontal e deslocamento. A diferença entre cromatografia molecular e de troca iônica é que na cromatografia molecular, os componentes separados da mistura são eluídos da coluna com um eluente puro, enquanto na cromatografia de troca iônica, uma solução eletrolítica é usada como eluente. Neste caso, o íon trocado do eluente deve ser sorvido menos seletivamente do que qualquer um dos íons da mistura que está sendo separada.

Ao realizar a cromatografia de troca iônica em desenvolvimento, que é usada com mais frequência, uma coluna preenchida com um trocador de íons é primeiro lavada com uma solução eletrolítica até que o trocador de íons substitua completamente todos os seus íons pelos íons contidos no eluente. Em seguida, um pequeno volume da solução de analito contendo íons separáveis ​​em uma quantidade de cerca de 1% da capacidade do trocador de íons é injetado na coluna. Em seguida, a coluna é lavada com uma solução eluente, retirando frações do eluato e analisando-as.

Uma mistura de íons Cl - , Br - , J - pode ser separada em uma resina de troca aniônica altamente básica (poliestireno reticulado contendo grupos de bases de amônio quaternário N (CH 3) 3 +), por exemplo, AB-17, que tem uma faixa de seletividade (seletividade): NO 3 - Cl – Br – J – . Como resultado, uma solução de NaNO 3 é usada como eluente. Primeiro, esta solução é passada pelo trocador de íons até que esteja completamente saturada com íons NO 3 -. Quando a mistura a ser separada é introduzida na coluna, os íons Cl – , Br – , J – são absorvidos pelo trocador aniônico, deslocando os íons NO 3 –. Durante a lavagem subsequente da coluna com solução de NaNO 3 , os íons Cl – , Br – , J – nas camadas superiores do trocador aniônico são gradualmente novamente substituídos por íons NO 3 –. Os íons Cl - serão deslocados mais rapidamente, os íons J - permanecerão na coluna por mais tempo. A diferença na seletividade do trocador de íons para os íons da mistura leva ao fato de que zonas separadas de íons adsorvidos Cl–, Br– e J– são formadas na coluna, movendo-se através da coluna em diferentes velocidades. Conforme você se move ao longo da coluna, a distância entre as zonas aumenta. Em cada zona há apenas um dos ânions da mistura sendo separado e o ânion do eluente, no intervalo entre as zonas há apenas um ânion do eluente. Assim, frações contendo componentes individuais da mistura a ser separada aparecerão no eluente na saída da coluna.

Para resolver problemas práticos, as condições para separação de íons são variadas selecionando uma fase móvel adequada (composição, concentração, pH, força iônica) ou alterando a porosidade da matriz polimérica do trocador de íons, ou seja, o número de ligações intercadeias em a matriz, e criando peneiras de troca iônica que são permeáveis ​​a alguns íons e capazes de sua troca e impenetráveis ​​a outros. Também é possível alterar a natureza e o arranjo mútuo dos grupos ionogênicos, bem como obter sorventes capazes de reações químicas seletivas devido à formação de complexos. A alta seletividade é obtida, por exemplo, pela complexação de trocadores de íons contendo em sua estrutura grupos quelantes de reagentes orgânicos dimetilglioxima, ditizona, 8-hidroxiquinolina, etc., bem como éteres de coroa.

A maior aplicação em cromatografia de troca iônica, iônica e de pares iônicos é encontrada em trocadores iônicos orgânicos macro e micronet sintéticos com uma grande capacidade de troca (3-7 mmol/g), bem como em materiais inorgânicos de troca iônica. Trocadores de íons de micromalha são capazes de trocar íons apenas no estado inchado, enquanto os de macromalha são capazes de trocar íons nos estados inchado e não inchado. Outro tipo estrutural de trocadores iônicos são os trocadores iônicos de filme de superfície, cujo núcleo sólido é feito de um copolímero não poroso de estireno e divinilbenzeno, vidro ou gel de sílica e é envolvido por um filme fino do trocador iônico. O diâmetro total de tal partícula é de cerca de 40 µm e a espessura do filme do trocador de íons é de 1 µm. A desvantagem de tais trocadores iônicos é o diâmetro de partícula relativamente grande e a baixa capacidade de troca devido à baixa área de superfície específica, pelo que é necessário trabalhar com amostras pequenas e, portanto, usar detectores altamente sensíveis. Além disso, esses trocadores de íons são rapidamente envenenados e não são capazes de regeneração.

Em troca iônica de alto desempenho e cromatografia iônica, trocadores iônicos de poliestireno espaço-poroso, sílicas de volume poroso com um diâmetro de grânulo de cerca de 10 μm e copolímeros de superfície porosa e modificados de superfície praticamente não incháveis ​​de estireno e divinilbenzeno com são usados ​​grupos ionogênicos sulfo e amino.

Na cromatografia de pares de íons, são usados ​​sorventes "pincel" - gel de sílica com fases reversas enxertadas C 2, C 8, C 18, que são facilmente convertidas em um trocador de cátions após a absorção de tensoativos iônicos da fase móvel, por exemplo, alquil sulfatos ou sais de bases de amónio quaternário.

Ao realizar a separação cromatográfica usando trocadores de íons, as soluções aquosas de sais são mais frequentemente usadas como fase móvel. Isso se deve ao fato de que a água possui excelentes propriedades de dissolução e ionização, devido às quais as moléculas da amostra analisada se dissociam instantaneamente em íons, os grupos de troca iônica do trocador iônico são hidratados e também passam para uma forma total ou parcialmente dissociada. Isso garante uma troca rápida de contra-íons. A força de eluição da fase móvel é influenciada principalmente pelo pH, força iônica, natureza da solução tampão, conteúdo do solvente orgânico ou surfactante (cromatografia de pares de íons).

O valor de pH é escolhido dependendo da natureza dos grupos ionogênicos, dos íons a serem separados e da matriz. É possível trabalhar com trocadores iônicos fortemente ácidos e fortemente básicos em pH = 2-12, com fracamente ácidos em pH = 5-12 e com fracamente básicos em pH = 2-6. Os sorventes à base de sílica não podem ser usados ​​em pH 9. A força iônica da fase móvel afeta a capacidade do trocador de íons. Com o aumento da força iônica, a sorção de íons geralmente diminui, uma vez que a força de eluição da fase móvel aumenta. Portanto, no início da separação, a fase móvel deve ter uma força iônica baixa (0,05–0,1), e o valor final dessa característica não deve exceder 2. Na eluição em gradiente, são frequentemente utilizados tampões com força iônica crescente.

Para a eluição seletiva dos íons absorvidos pelo trocador de íons, pode-se usar água, soluções tampão (fosfato, acetato, borato, hidrocarbonato, etc.) fosfórico) e orgânicos (fenol, cítrico, láctico, tartárico, oxálico, EDTA). A escolha do eluente é facilitada pelo fato de que os coeficientes limitantes de distribuição da maioria dos elementos entre soluções aquosas (água-orgânicas) de muitos complexantes e trocadores iônicos do tipo padrão são determinados e apresentados em tabelas.

1.6.4. Cromatografia de exclusão de tamanho. A cromatografia de exclusão de tamanho é um tipo de cromatografia líquida em que a separação de componentes é baseada na distribuição de moléculas de acordo com seu tamanho entre o solvente nos poros do sorvente e o solvente que flui entre suas partículas. Durante a separação, pequenas moléculas entram na rede polimérica, nos poros dos quais o solvente serve como fase estacionária, e são retidas ali. Moléculas grandes não podem penetrar na rede polimérica e são lavadas da coluna pela fase móvel. As moléculas maiores são eluídas primeiro, depois as médias e finalmente as pequenas.

A cromatografia de exclusão de tamanho é subdividida em permeação em gel e filtração em gel. Na cromatografia de permeação em gel, a separação ocorre em polímeros que incham em solventes orgânicos. A versão de filtração em gel da cromatografia de exclusão de tamanho envolve o uso de polímeros expansíveis em água como fases estacionárias.

O tempo de retenção dos componentes da amostra analisada na coluna de exclusão de tamanho depende do tamanho de suas moléculas e difusão nos poros do sorvente, bem como do tamanho dos poros da fase estacionária.

Neste tipo de cromatografia líquida, o coeficiente de partição D para as menores moléculas da amostra analisada, que se movem na coluna cromatográfica na menor velocidade, penetrando na grade da fase estacionária, é igual a 1, pois a fase móvel e o solvente nos poros da fase estacionária têm a mesma composição. Neste caso, a equação principal da cromatografia em coluna assume a forma

Moléculas grandes que não entram nos poros da fase estacionária são eluídas da coluna junto com a fase móvel. Para eles D= 0, um V R =V m. Essa faixa de valores de coeficiente de distribuição (de 0 a 1) é típica apenas para cromatografia de exclusão de tamanho.

Todas as moléculas da substância multicomponente analisada devem ser lavadas da coluna passando um pequeno volume de solvente do V m antes V m +V s e a separação é completada antes da saída do pico do solvente. Portanto, neste tipo de cromatografia, é necessário utilizar colunas suficientemente longas e com grande volume livre. V m e um grande número de poros no sorvente.

A resolução de picos cromatográficos em separações por exclusão de tamanho pode ser melhorada usando eluição em gradiente com solventes mistos.

Cada sorvente usado na cromatografia de exclusão de tamanho é caracterizado por um determinado volume de poros e, portanto, possui uma certa área de pesos moleculares separáveis ​​e uma determinada curva de calibração. Neste caso, a curva de calibração que caracteriza a dependência do volume retido no peso molecular ou tamanho das moléculas, via de regra, tem uma forma complexa.

As fases estacionárias na cromatografia de exclusão de tamanho são selecionadas com base em tarefas analíticas específicas. Inicialmente, é estabelecido qual sistema solvente pode ser utilizado para análise (aquoso ou água-orgânico). Dependendo disso, o tipo de sorvente é determinado. Se as amostras solúveis em água devem ser separadas, por exemplo, dextranos reticulados expansíveis em água (Sephadex) ou poliacrilamidas (Biogel P) são usados ​​como fases estacionárias. A separação de substâncias solúveis em solventes orgânicos pode ser realizada em poliestirenos com vários graus de reticulação, que incham em solventes orgânicos (styrogel, poragel, biobid C). Esses géis inchados geralmente não são estáveis ​​à pressão e permitem taxas de fluxo de fase móvel muito baixas, o que aumenta o tempo de análise. Para implementar uma versão altamente eficiente da cromatografia de exclusão de tamanho, é necessário usar fases estacionárias com matrizes rígidas - gel de sílica, cuja desvantagem - alta atividade de adsorção - é eliminada pela silanização da superfície ou seleção de um eluente de polaridade adequada .

As substâncias que podem ser usadas como fases móveis na cromatografia de exclusão de tamanho são:

 dissolver completamente a amostra analisada;

 molhar bem o sorvente;

 neutralizar a adsorção dos componentes da amostra no sorvente;

 têm baixa viscosidade e toxicidade.

1.6.5. Cromatografia planar. A cromatografia planar inclui cromatografia em camada fina e em papel. Esses tipos de cromatografia líquida são de técnica simples, expressos, não requerem equipamentos caros, o que é sua vantagem inegável.

A separação de uma mistura de substâncias por esses métodos pode ser realizada usando vários sistemas cromatográficos. Portanto, a adsorção, distribuição, fase normal e reversa, troca iônica, etc., papel e cromatografia em camada fina são distinguidos. Atualmente, a cromatografia em camada fina é a mais utilizada.

A cromatografia em papel e em camada fina são semelhantes na técnica. A fibra de papel de celulose é usada como uma fase estacionária na cromatografia em papel, na cromatografia em camada fina - vários sorventes (Al 2 O 3 , sílica gel, etc.) depositados em uma camada fina uniforme (100-300 μm) sobre um vidro, metal ou substrato plástico (transportador). A camada adsorvente sobre o suporte pode ou não ser fixa.

A separação cromatográfica em métodos planares, assim como em coluna, é devido à transferência dos componentes do analito pela fase móvel ao longo da camada da fase estacionária em taxas diferentes de acordo com os coeficientes de distribuição das substâncias a serem separadas . Em ambos os casos, são utilizados sistemas cromatográficos sorventes líquido-sólido (mecanismo de separação por adsorção), carreador líquido-líquido-sólido (distribuição, troca iônica e outros mecanismos).

Vários solventes ou suas misturas, ácidos orgânicos ou inorgânicos são usados ​​como fases móveis.

A obtenção prática de cromatogramas planares consiste no seguinte.

Em uma tira de papel cromatográfico ou em uma fina camada de sorvente, uma linha de partida é marcada com um lápis a uma distância de 1 cm da borda inferior da tira ou placa. Uma micropipeta é usada para aplicar uma amostra na linha de partida na forma de um ponto com um diâmetro não superior a 2-3 mm. Em seguida, a borda da tira ou placa é abaixada no recipiente com a fase móvel, localizada em uma câmara selada. À medida que a fase móvel sobe ao longo da tira ou placa e ocorrem os múltiplos atos elementares de sorção-dessorção, distribuição entre duas fases líquidas, troca iônica, etc., comuns em cromatografia, os componentes da mistura analisada são separados. O processo é geralmente continuado até que o solvente tenha passado da linha inicial 10 cm. Depois disso, a tira ou placa é removida da câmara e seca. Se os componentes do analito são coloridos, eles dão as manchas de cor correspondentes no cromatograma. Para detectar componentes não corados do analito, o cromatograma deve ser desenvolvido. O desenvolvimento de um cromatograma e a detecção de componentes da amostra podem ser realizados por vários métodos e dependem da composição das misturas analisadas. A manifestação pode ser feita:

-Usando luz UV. O método é aplicável para a detecção de substâncias capazes de emitir sua própria radiação (luminescência) na faixa de comprimento de onda visível sob a ação da radiação UV;

 por meio de reagentes-reveladores. Por exemplo, a presença de aminoácidos na mistura analisada pode ser detectada usando ninidrina. O cromatograma seco é imerso em uma solução de 0,2% de ninidrina em acetona, depois seco. As manchas correspondentes aos vários componentes da mistura adquirem uma cor visual e, em regra, específica para cada substância;

- usando iodo. Neste caso, o cromatograma detectado é introduzido em um recipiente, no fundo do qual existem cristais de iodo. Os vapores de iodo são adsorvidos mais fortemente nas manchas, devido aos quais as manchas são visualizadas. O iodo é um reagente revelador não específico. Utilizando reagentes específicos, é possível não só determinar o número de componentes de uma mistura, mas também identificar as substâncias separadas pela cor das manchas.

A cromatografia em papel e em camada fina é mais frequentemente realizada na chamada variante ascendente descrita acima. Muitas vezes, para melhorar a qualidade dos cromatogramas, é necessário usar variantes mais complexas de cromatografia planar, por exemplo, de cima para baixo, circular, bidimensional. Na cromatografia descendente de papel ou camada fina, o analito é aplicado na linha de partida da placa ou tira de papel no topo e o eluente é alimentado pelo topo em vez do fundo. O efeito positivo da separação melhorada é devido à contribuição das forças de gravidade dos componentes para o processo de separação.

Tanto a cromatografia a montante como a jusante podem ser realizadas em versões unidimensionais e bidimensionais. Ao contrário do processo de separação em leito plano unidimensional descrito acima, na separação cromatográfica bidimensional, a separação da amostra analisada é realizada primeiro em um solvente, depois a separação é realizada na direção perpendicular ao primeiro, usando outro solvente, girando o primeiro cromatograma em 90°C.

Na cromatografia circular, o analito é aplicado como uma gota no meio de uma placa ou folha de papel cromatográfico. Um ou mais solventes também são adicionados gota a gota aqui. Isso leva ao fato de que o cromatograma resultante é um conjunto de pontos radiais.

A posição dos pontos (zonas) que formam os componentes separados do analito em um cromatograma plano é caracterizada pelos valores da velocidade relativa de movimento dos componentes em uma camada fina R fi. Valor experimental R fi definida como a razão da distância eu eu, passado eu-ésima componente, à distância eu passado pelo solvente da linha de partida para a linha de frente (Fig. 1.10):

Valor R fi depende da natureza do componente relevante da amostra analisada, da natureza da fase estacionária, da sua espessura, da natureza e qualidade da fase móvel, do método de aplicação da amostra e de outros fatores, mas sempre R fi 1.

Valor R fié, na verdade, idêntico ao tempo de retenção de uma substância ou seu volume de retenção, que caracteriza a taxa de passagem de uma substância através de uma coluna cromatográfica, podendo ser utilizado para identificação qualitativa dos componentes da amostra analisada, e o diâmetro do ponto é idêntico à altura ou área do pico cromatográfico e, portanto, reflete em certa medida o conteúdo quantitativo da substância.

A determinação quantitativa da composição da amostra analisada no caso mais simples pode ser avaliada visualmente pela intensidade da cor intrínseca das manchas ou pela intensidade do brilho fluorescente das manchas obtidas durante a detecção UV. Para estes fins, a eluição de manchas cromatográficas é amplamente utilizada. Neste caso, a mancha obtida no cromatograma é cuidadosamente cortada ou raspada, tratada com um solvente adequado e a solução resultante é examinada pelo método físico-químico apropriado. Você também pode usar o método gravimétrico, no qual o ponto correspondente é cortado do cromatograma e pesado. A quantidade de substância é determinada pela diferença das gramaturas do papel limpo da mesma área e do papel com a substância.

Papel (BH ) e cromatografia em camada fina (TLC ) de acordo com o mecanismo de separação pertencem a cromatografia de partição . No método HD, a portadora é uma papel cromatográfico com certas propriedades. Fase estacionária é água adsorvida na superfície e poros do papel (até 20%), móvel - solvente orgânico, miscível ou imiscível com água, água ou soluções eletrolíticas.

Mecanismo bastante complicado no papel. Na fase estacionária, a substância pode ficar retida não apenas por dissolução na água adsorvida pelo papel, mas também ser adsorvido celulose diretamente. Desenhado em papel componentes compartilhados passam para a fase móvel e se movem pelos capilares do papel em diferentes velocidades de acordo com coeficiente de distribuição interfacial cada um deles. No inicio cromatografia parte da substância do papel passa para na fase móvel e seguir em frente. Quando o solvente orgânico atinge a área do papel que não contém o soluto, redistribuição : da fase orgânica, a substância passa para a fase aquosa, sorvida no papel. Como os componentes têm diferentes afinidade pelo sorvente , quando o eluente se move, ocorre a separação: algumas substâncias são atrasadas no início do caminho, outras avançam mais. Aqui estão combinados termodinâmico (estabelecimento de uma distribuição de equilíbrio de substâncias entre as fases) e cinético (componentes móveis em diferentes velocidades) aspectos de separação. Como resultado, cada componente está concentrado em uma área específica da folha de papel: zonas de componentes individuais no cromatograma . O uso de cromatografia em papel tem várias desvantagens significativas: o processo de separação depende da composição e propriedades do papel, alterações no teor de água nos poros do papel com alterações nas condições de armazenamento, velocidade de cromatografia muito baixa (até vários dias), baixa reprodutibilidade dos resultados. Essas deficiências afetam seriamente a disseminação da cromatografia em papel como método cromatográfico.

NO Método TLC o processo de separação de uma mistura de substâncias é realizado em uma camada fina absorvente depositado sobre um substrato sólido inerte, e proporcionado pelo movimento na fase móvel (solvente) através do sorvente sob a ação de forças capilares . Demecanismo de separação distinguir cromatografia de partição, adsorção e troca iônica . A separação dos componentes ocorre nestes casos quer pelo seu coeficiente de distribuição diferente entre as duas fases líquidas ( cromatografia de partição ), ou devido à adsorção diferente dos compostos pelo sorvente ( cromatografia de adsorção ). O método de adsorção é baseado em diferentes graus de sorção-dessorção dos componentes separados na fase estacionária. Adsorção realizado a expensas forças de van der Waals , que é a base adsorção física , polimolecular (formação de várias camadas de adsorvente na superfície do adsorvente) e quimissorção (interação química de adsorvente e adsorbato).

No caso de usar tais sorventes para TLC como alumina ou gel de sílica desempenhar um papel na separação distribuição , e adsorção na superfície ativa desenvolvida do sorvente (150–750 m2/g). Distribuição componentes da mistura ocorre entre a água na superfície do transportador (como adsorventes , como alumina , amido , celulose , terra de diatomáceas - e agua Formato fase estacionária ), e o solvente movendo-se através desta fase estacionária ( na fase móvel ). O componente da mistura que é mais facilmente solúvel em água move-se mais lentamente do que aquele que é mais facilmente solúvel na fase móvel.

Adsorção manifestado no fato de que entre operadora , por exemplo, óxido de alumínio, e os componentes da mistura são definidos equilíbrio de adsorção - para cada componente seu, cujo resultado é velocidade de viagem diferente componentes da mistura. Dois casos extremos podem ser distinguidos:

a) a concentração da substância no adsorvente é zero. A substância se dissolve completamente na fase móvel e é levada por ela (se move junto com frente solvente ).

b) a substância é totalmente adsorvida, não interage com o solvente e permanece no início.

Na prática, com a seleção hábil de solvente e adsorvente distribuição compostos estão localizados entre esses casos extremos, e a substância gradualmente transitadas de uma camada sorvente para outra devido a processos que ocorrem simultaneamente sorção e dessorção .

O solvente que passa pelo sorvente é chamado de eluente , o processo de mover uma substância junto com um eluente  eluição . À medida que o líquido se move na placa, a mistura de substâncias se separa devido à ação de forças adsorção , distribuição , troca iônica ou uma combinação de todos esses fatores. Como resultado, separar zonas cromatográficas componentes da mistura, i.e. acontece que cromatograma .

Seleção correta absorvente e eluente determina a eficiência da separação da mistura. A mobilidade da substância em estudo depende da sua afinidade pelo sorvente e força de eluição (polaridade) do eluente. À medida que a polaridade do composto aumenta, também aumenta sua afinidade pelo sorvente polar. Ao aumentar o grau de absorção gel de sílica compostos orgânicos são organizados em uma fileira: hidrocarbonetos<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь para gel de sílica eluentes podem ser organizados em ordem crescente de "polaridade" ( poder de eluição ) e formam uma série de solventes ( série eluotrópica ) de acordo com os dados experimentais: alcanos> benzeno> clorofórmio> éter dietílico> acetato de etilo> álcoois С 2 -С 4> água> acetona> ácido acético> metanol. Assim, um composto polar, o álcool, é adsorvido bastante fortemente no gel de sílica e, portanto, se move fracamente sob a ação de um solvente apolar como o hexano, e permanece próximo à linha de partida. Por sua vez, o hidrocarboneto aromático não polar bifenilo é visivelmente mais móvel em hexano, mas mesmo aqui, para alcançar R f cerca de 0,5, é necessário um eluente aprótico mais polar, cloreto de metileno. força do eluente regular usando misturas de solventes - vizinhos em série eluotrópica com polaridade diferente.

Atualmente, o TLC usa principalmente os seguintes sorventes : para separação substâncias lipofílicas  gel de sílica , alumina , celulose acetilada , poliamidas ; separar substâncias hidrofílicas  celulose , trocadores de íons de celulose , terra de diatomáceas , poliamidas . A característica mais importante de um sorvente é sua atividade , ou seja habilidade absorver (segurar) os componentes da mistura a serem separados. No exterior, várias empresas produzem gel de sílica , terra de diatomáceas e alumina com a adição de 5% de gesso, que é utilizado para fixar a camada sorvente na autofabricação de placas.

O sorvente mais comum é gel de sílica - ácido silícico hidratado, formado pela ação de ácidos minerais sobre Na 2 SiO 3 e secagem do sol resultante. Depois de moer o sol, é usada uma fração de um determinado tamanho de grão (indicado na placa, geralmente 5-20 mícrons). gel de sílica é um sorvente polar com grupos OH como centros ativos. Ele absorve facilmente a água na superfície e forma ligações de hidrogênio.

Alumina é um adsorvente fracamente básico e é usado principalmente para a separação de compostos fracamente básicos e neutros. A desvantagem das placas em óxido de alumínio é a obrigatoriedade da ativação da superfície antes do uso em uma câmara de secagem em alta temperatura (100-150 o C) e a baixa capacidade de adsorção da camada em relação à sílica gel.

terra de diatomáceas - adsorvente obtido a partir de minerais naturais - terras diatomáceas. O sorvente possui propriedades hidrofílicas e menor capacidade de adsorção da camada em relação à sílica gel.

Celulose: placas de camada fina revestidas de celulose são muito eficazes na separação de moléculas orgânicas complexas. O adsorvente é principalmente bolas de celulose com diâmetro de até 50 mícrons, fixadas no transportador com amido. Como na cromatografia em papel, a ascensão da frente do solvente é muito lenta.

Análise cromatográfica é realizado em placas industriais de produção checa " Silufo » (« Silufo "") de papel alumínio, às vezes reforçado com papelão, e " Siluplast » feito de plástico revestido com uma camada de sorventes - gel de sílica LS 5-40 com amido ou gesso como aglutinante (até 10%) ou óxido de alumínio com ou sem indicadores fluorescentes. Registros " Silufo » têm uma alta taxa de eluição, no entanto, são caracterizadas por baixo poder de separação e baixa sensibilidade. Durante o armazenamento, são sensíveis às condições (umidade, temperatura, meios agressivos, etc.). Fornecimento de empresas individuais placas cromatográficas com uma camada de sorvente de espessura diferente (geralmente até 0,25 mm), mas estritamente constante (gel de sílica, celulose, resina de troca iônica), em vidro e substratos feitos de folha de alumínio, plástico, fibra de vidro impregnada.

Pratos " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) são produzidos na Rússia em uma base de polímero (tereftalato de polietileno, grau P) ou substrato de alumínio (grau AF) com uma camada de trabalho aplicada Sorvente de sílica gel microfracionada graus STX-1A e STX-1VE (produzido na URSS como sílica gel fracionada KSKG) com uma espessura de 90-120 mícrons (até 200 mícrons), fixado com um aglutinante especial - sílicasol . Ao usar o sol de ácido silícico (silicazol) como aglutinante, que se transforma em sílica gel após o aquecimento, as placas de TLC resultantes consistem em dois componentes: uma camada de sílica gel e um substrato. A uniformidade da espessura da camada sorvente em uma placa é de ±5 µm. Exemplo de designação: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UF (10x10)" - placas TLC de alto desempenho em um substrato de alumínio, com fósforo, 10x10 cm.

Se for usado um substrato de vidro (grau C), essas placas são reutilizáveis ​​e quimicamente resistentes. Sua resistência química é determinada pela resistência química do gel de sílica. Como resultado, as placas de TLC podem ser tratadas repetidamente com reagentes agressivos, por exemplo, com uma mistura de cromo quente, que remove as restrições ao uso de reagentes correlacionados para detecção de manchas e modificação de sorvente e permite múltiplas (até 30 vezes ou mais) regeneração das placas com uma mistura de cromo. Placas de vidro podem ser cortadas no tamanho desejado. A resistência mecânica da camada adsorvente pode ser controlada, proporcionando, por um lado, o transporte e processamento múltiplo das placas e, por outro, a possibilidade de extrair camadas adsorventes com substâncias separadas para posterior lavagem de compostos individuais do sorvente e seu posterior estudo por métodos instrumentais (espectrometria de IV e UV), métodos de difração de raios X, RMN, etc.).

As placas diferem no tamanho das frações (distribuição de partículas) da sílica gel que compõe a camada. Em placas analíticas (grau A) a fração é de 5-17 mícrons, em altamente eficiente (grau B) - 8-12 mícrons. Uma distribuição mais estreita aumenta a eficiência das placas, ou seja, as manchas das substâncias a serem separadas tornam-se mais compactas (menores em tamanho) e, portanto, são mais bem separadas quando a frente do eluente passa por uma distância menor. Nos wafers russos, as camadas analíticas e de alto desempenho não diferem muito, em contraste com os wafers da Merck (Alemanha). Placas de alto desempenho devem ser usadas se as substâncias não puderem ser separadas em placas analíticas. As placas de todas as modificações são produzidas com um fósforo (grau UV) com excitação de 254 nm. A vida útil não é limitada, as placas " Sorbfil » amplamente testado na análise de derivados de aminoácidos, pesticidas, lipídios, antibióticos.

O método TLC é realizado identificação qualitativa componentes. quantificação para TLC também é possível, isso requer a aplicação da quantidade exata de substância e estudos densitométricos com uma clara fixação da intensidade das manchas. O mais comum é método semiquantitativo . É baseado em comparação visual o tamanho e a intensidade da mancha de um componente com as características correspondentes de uma série de manchas da mesma substância de diferentes concentrações ( soluções de referência padrão ). Ao usar uma amostra na quantidade de 1–5 μg, um método tão simples fornece uma precisão na determinação do conteúdo do componente de cerca de 5–10%. Muitas vezes, para determinar os componentes de uma amostra, é necessário realizar o preparo da amostra para obter uma mistura contendo os compostos analisados. A preparação da amostra é baseada na extração de drogas da amostra com solventes orgânicos ( n-hexano, éter de petróleo, éter dietílico, clorofórmio), purificação do extrato e posterior cromatografia em camada fina de alumina ou sílica gel.

Existem várias variantes de TLC e BC, diferindo na forma fornecimento de solvente . Dependendo da direção do movimento da fase móvel, existem:

a)cromatografia ascendente  a fase móvel é despejada no fundo da câmara de separação, o papel (placa) é colocado verticalmente;

b)cromatografia descendente  a fase móvel é alimentada por cima e desce ao longo da camada sorvente da placa ou papel;

dentro)cromatografia radial  avanço horizontal da frente do solvente: a fase móvel é trazida para o centro do disco de papel (placa), onde é depositada a mistura a ser separada.

O mais comum é eluição ascendente (cromatografia). Frente eluente enquanto se move de baixo para cima. A escolha do solvente (fase móvel) é determinada pela natureza do sorvente e pelas propriedades das substâncias a serem separadas.

Separação cromatográfica Os métodos BC e TLC são realizados em câmara de separação com tampa rosqueada. Uma medida quantitativa da taxa de transferência de uma substância usando um adsorvente e solvente específico é valor R f (do inglês. retenção fator – coeficiente de atraso, este parâmetro é análogo ao tempo de retenção). Posição zonas do componente cromatografado definir o tamanho coeficiente R f igual à razão entre a velocidade de sua zona e a velocidade da frente do solvente. Valor R f é sempre menor que a unidade e não depende do comprimento do cromatograma. Pela quantidade R f influenciada por vários fatores. Assim, em baixas temperaturas, as substâncias se movem mais lentamente; contaminação do solvente, não homogeneidade do adsorvente, íons estranhos na solução analisada podem alterar o valor R f até 10%. No sistema selecionado, os analitos devem ter valores diferentes R f e distribuídos por todo o comprimento do cromatograma. É desejável que os valores R f estava na faixa de 0,05-0,85.

Na prática, o valor R f calculado como a razão da distância eu percorrida pela substância até a distância eu passado pelo solvente:

R f = l/l (6.1 )

Normalmente para cálculo escolha centro spot (Figura 1). Valor R f depende de muitos fatores como papel cromatográfico (sua porosidade, densidade, espessura, grau de hidratação) e absorvente (tamanho do grão, natureza dos grupos na superfície, espessura da camada, seu teor de umidade, natureza da substância, composição da fase móvel), condições experimentais (temperatura, tempo de cromatografia, etc.). Com a constância de todos os parâmetros cromatográficos, o valor R f determinado apenas pelas propriedades individuais de cada componente.

Arroz. 1. Determinação de valores no cromatograma RF para componentes MAS e NO,

seu grau de separação Rs e o número de pratos teóricos N .

A eficiência do BC e TLC também depende seletividade e sensibilidade reações usadas para detectar os componentes da mistura analisada. Normalmente, são utilizados reagentes que formam compostos coloridos com os componentes a serem determinados - reveladores. Para um mais confiável identificação de componentes compartilhados Aplique " testemunhas » -soluções substâncias padrão (no mesmo solvente que a amostra) que se espera que estejam presentes na amostra. Substância padrão aplicado na linha de partida ao lado da amostra analisada e cromatografado nas mesmas condições. Na prática, um valor relativo é frequentemente usado:

R f rel = R f x / R f ficar de pé (6.2)

Onde R f ficar de pé também calculado pela fórmula (6.1). Eficiência separação cromatográfica caracterizar número de pratos teóricos equivalentes e eles altura . Assim, no método TLC, o número de pratos teóricos equivalentes N MAS para componente MAS a mistura a ser separada é calculada pela fórmula:

N UMA = 16 (eu OA / uma (UMA )) 2 (6.3)

Valores eu OA e uma (MAS ) determinado como mostrado na Fig. 6.1. Então a altura do prato teórico equivalente H MAS é:

H UMA = eu OA /N = uma (UMA ) 2 / 16 eu OA . (6.4)

A separação é praticamente possível se R f (MAS)  R f (NO)  0,1 .

Caracterizar a separação de dois componentes MAS e NO usar grau (critério) de separação Rs :

Rs =  eu / (uma (UMA) / 2 + uma (B) / 2)= 2  eu / (uma (UMA) + uma (B)) (6.5)

Onde  eu  distância entre os centros dos pontos dos componentes MAS e NO;

uma (MAS) e uma (NO)  diâmetros de ponto MAS e NO no cromatograma (Fig. 6.1). O mais Rs , mais claramente as manchas dos componentes são separadas MAS e NO no cromatograma. Condições cromatografia são escolhidos de modo que o valor Rs diferente de zero e um, o valor ótimo Rs é 0,3  0,7. Para taxa seletividade de separação dois componentes MAS e NO usar fator de separação α :

α = eu B / eu UMA (6.6)

Se α = 1, então os componentes MAS e NO não são separados.

Em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a natureza dos processos que ocorrem na coluna cromatográfica é geralmente idêntica aos processos em cromatografia gasosa. A diferença está apenas no uso de um líquido como fase estacionária. Devido à alta densidade das fases móveis líquidas e à alta resistência das colunas, a cromatografia gasosa e líquida diferem muito na instrumentação.

Em HPLC, solventes puros ou suas misturas são geralmente usados ​​como fases móveis.

Para criar um fluxo de solvente puro (ou misturas de solventes), chamado de eluente em cromatografia líquida, são utilizadas bombas, que fazem parte do sistema hidráulico do cromatógrafo.

A cromatografia de adsorção é realizada como resultado da interação de uma substância com adsorventes, como gel de sílica ou óxido de alumínio, que possuem centros ativos na superfície. A diferença na capacidade de interagir com os centros de adsorção de diferentes moléculas da amostra leva à sua separação em zonas no processo de movimento com a fase móvel através da coluna. A divisão das zonas de componentes alcançada neste caso depende da interação com o solvente e o adsorvente.

Os adsorventes de sílica gel com diferentes volumes, superfícies e diâmetros de poros encontram a maior aplicação em HPLC. Óxido de alumínio e outros adsorventes são usados ​​com muito menos frequência. A principal razão para isso:

Resistência mecânica insuficiente, que não permite acondicionamento e uso em pressões elevadas típicas de HPLC;

o gel de sílica comparado ao óxido de alumínio tem uma faixa mais ampla de porosidade, superfície e diâmetro dos poros; uma atividade catalítica significativamente mais alta do óxido de alumínio leva a uma distorção dos resultados da análise devido à decomposição dos componentes da amostra ou sua quimissorção irreversível.

Detectores de HPLC

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é usada para detectar substâncias polares não voláteis, que por algum motivo não podem ser convertidas em uma forma conveniente para cromatografia gasosa, mesmo na forma de derivados. Tais substâncias, em particular, incluem ácidos sulfônicos, corantes solúveis em água e alguns pesticidas, como derivados de fenil-ureia.

Detectores:

UV - detector de arranjo de diodos. A "matriz" de fotodiodos (são mais de duzentos) registra constantemente sinais na região UV e visível do espectro, garantindo assim o registro dos espectros UV-B no modo de varredura. Isso torna possível gravar continuamente, com alta sensibilidade, espectros não distorcidos de componentes que passam rapidamente por uma célula especial.

Em comparação com a detecção de comprimento de onda único, que não fornece informações sobre a "pureza" do pico, a capacidade de comparar os espectros completos do arranjo de diodos fornece um resultado de identificação com um grau muito maior de certeza.

Detector fluorescente. A grande popularidade dos detectores fluorescentes se deve à alta seletividade e sensibilidade, e ao fato de que muitos poluentes ambientais fluorescem (por exemplo, hidrocarbonetos poliaromáticos).

Um detector eletroquímico é usado para detectar substâncias que são facilmente oxidadas ou reduzidas: fenóis, mercaptanos, aminas, nitro aromático e derivados de halogênio, aldeídos, cetonas, benzidinas.

A separação cromatográfica da mistura na coluna devido ao avanço lento do PF leva muito tempo. Para acelerar o processo, a cromatografia é realizada sob pressão. Este método é chamado de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

A modernização dos equipamentos utilizados na cromatografia em coluna líquida clássica a tornou um dos métodos de análise promissores e modernos. A cromatografia líquida de alta eficiência é um método conveniente para separar, isolar preparativamente e realizar análises qualitativas e quantitativas de compostos termolábeis não voláteis de baixo e alto peso molecular.

Dependendo do tipo de sorvente usado neste método, 2 variantes de cromatografia são usadas: em um sorvente polar usando um eluente não polar (opção de fase direta) e em um sorvente não polar usando um eluente polar - o chamado reverso cromatografia líquida de alta eficiência de fase (RPHLC).

Quando o eluente passa para o eluente, o equilíbrio sob condições de RPHLC é estabelecido muitas vezes mais rápido do que sob condições de sorventes polares e PFs não aquosos. Como resultado disso, além da conveniência de trabalhar com eluentes água e álcool-água, o RPHLC ganhou grande popularidade. A maioria das análises de HPLC são realizadas usando este método.

Detectores. O registro da saída da coluna de um componente separado é realizado usando um detector. Para registro, pode-se utilizar a alteração em qualquer sinal analítico proveniente da fase móvel e relacionado à natureza e quantidade do componente da mistura. A cromatografia líquida usa sinais analíticos como absorção de luz ou emissão de luz da solução de saída (detectores fotométricos e fluorimétricos), índice de refração (detectores refratométricos), potencial e condutividade elétrica (detectores eletroquímicos), etc.

O sinal continuamente detectado é gravado pelo gravador. O cromatograma é uma sequência de sinais detectores gravados na fita do gravador, gerados quando os componentes individuais da mistura saem da coluna. No caso de separação da mistura, os picos individuais são visíveis no cromatograma externo. A posição do pico no cromatograma é usada para fins de identificação da substância, altura ou área do pico - para fins de determinação quantitativa.

Inscrição

HPLC encontra a mais ampla aplicação nas seguintes áreas de análise química (objetos de análise onde HPLC praticamente não tem concorrência são identificados):

· Controle de qualidade de alimentos - aditivos tônicos e aromatizantes, aldeídos, cetonas, vitaminas, açúcares, corantes, conservantes, hormônios, antibióticos, triazina, carbamato e outros agrotóxicos, micotoxinas, nitrosoaminas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, etc.

· Proteção ambiental - fenóis, compostos nitro orgânicos, hidrocarbonetos aromáticos mono e policíclicos, vários pesticidas, principais ânions e cátions.

· Criminalística - drogas, explosivos orgânicos e corantes, fármacos potentes.

· Indústria farmacêutica - hormônios esteróides, praticamente todos os produtos de síntese orgânica, antibióticos, preparações poliméricas, vitaminas, preparações proteicas.

Medicina - as substâncias bioquímicas e medicinais listadas e seus metabólitos em fluidos biológicos (aminoácidos, purinas e pirimidinas, hormônios esteróides, lipídios) no diagnóstico de doenças, determinando a taxa de excreção de drogas do corpo para fins de dosagem individual .

· Agricultura - determinação de nitrato e fosfato nos solos para determinação da quantidade necessária de fertilizantes, determinação do valor nutricional dos alimentos (aminoácidos e vitaminas), análise de pesticidas no solo, água e produtos agrícolas.

Bioquímica, química bioorgânica, engenharia genética, biotecnologia - açúcares, lipídios, esteróides, proteínas, aminoácidos, nucleosídeos e seus derivados, vitaminas, peptídeos, oligonucleotídeos, porfirinas, etc.

· Química orgânica - todos os produtos estáveis ​​de síntese orgânica, corantes, compostos termolábeis, compostos não voláteis; química inorgânica (praticamente todos os compostos solúveis na forma de íons e compostos complexos).

· Controle de qualidade e segurança de produtos alimentícios, bebidas alcoólicas e não alcoólicas, água potável, produtos químicos domésticos, perfumes em todas as etapas de sua produção;

determinação da natureza da poluição no local de um desastre ou emergência de origem humana;

detecção e análise de substâncias entorpecentes, potentes, venenosas e explosivas;

determinação da presença de substâncias nocivas (hidrocarbonetos policíclicos e outros aromáticos, fenóis, pesticidas, corantes orgânicos, íons de metais pesados, alcalinos e alcalino-terrosos) em efluentes líquidos, emissões atmosféricas e resíduos sólidos de empresas e organismos vivos;

· acompanhamento dos processos de síntese orgânica, processamento de petróleo e carvão, produções bioquímicas e microbiológicas;

análise da qualidade do solo para adubação, presença de agrotóxicos e herbicidas no solo, água e produtos, bem como o valor nutricional da ração; tarefas analíticas de pesquisa complexas; obtendo uma micro quantidade de substância ultrapura.



(OFS 42-0096-09)

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é um método de cromatografia em coluna em que a fase móvel (MP) é líquida

osso movendo-se através de uma coluna cromatográfica preenchida com

a fase visual (sorvente). As colunas HPLC são caracterizadas por alta pressão hidráulica na entrada da coluna, portanto, HPLC às vezes é chamada de

chamado "Cromatografia Líquida de Alta Pressão".

Dependendo do mecanismo de separação de substâncias, distinguem-se:

opções gerais de HPLC: adsorção, distribuição, troca iônica,

exclusivo, quiral, etc.

Na cromatografia de adsorção, a separação das substâncias ocorre devido à sua diferente capacidade de serem adsorvidas e dessorvidas com o aumento da temperatura.

superfície do adsorvente com uma superfície desenvolvida, por exemplo, gel de sílica.

No HPLC de partição, a separação ocorre devido à diferença nos coeficientes de distribuição das substâncias a serem separadas entre os

(geralmente enxertado quimicamente na superfície de um suporte fixo) e

fases móveis.

Por polaridade, PF e NF HPLC são divididos em fase normal e ob-

rotação de fase.

A fase normal é chamada de variante da cromatografia, na qual

use um sorvente polar (por exemplo, gel de sílica ou gel de sílica com adição de

NH2 - ou grupos CN torcidos) e PF não polar (por exemplo, hexano com diferentes

suplementos pessoais). Na variante de fase reversa da cromatografia,

use sorventes quimicamente modificados não polares (por exemplo,

radical alquil não polar C18) e fases móveis polares (por exemplo,

metanol, acetonitrila).

Na cromatografia de troca iônica, as moléculas das substâncias da mistura, dissociação

em solução em cátions e ânions, são separados quando se movem

sorvente (trocador de cátions ou trocador de ânions) devido às suas diferentes taxas de câmbio com

grupos mi do sorvente.

Em exclusão (peneira, penetrante em gel, filtração em gel)

As moléculas de cromatografia de substâncias são separadas por tamanho devido à sua capacidade diferente de penetrar nos poros da fase estacionária. Ao mesmo tempo, o primeiro de

as maiores moléculas (com o maior peso molecular) que podem penetrar no número mínimo de poros da fase estacionária saem das colunas,

e as substâncias com tamanhos moleculares pequenos saem por último.

Muitas vezes, a separação ocorre não por um, mas por vários mecanismos ao mesmo tempo.

O método HPLC pode ser usado para controlar a qualidade de qualquer

analitos semelhantes. Para análise, são utilizados instrumentos apropriados - cromatógrafos líquidos.

A composição de um cromatógrafo líquido geralmente inclui os seguintes

nós:

– Unidade de preparação de PF, incluindo um recipiente com uma fase móvel (ou um recipiente

sti com solventes individuais que fazem parte da fase móvel

zy) e sistema de desgaseificação PF;

– sistema de bombeamento;

– misturador de fase móvel (se necessário);

– sistema de injeção de amostra (injetor);

– coluna cromatográfica (pode ser instalada em um termostato);

– detector;

– sistema de coleta e processamento de dados.

Sistema de bombeamento

As bombas fornecem o PF à coluna a uma determinada taxa constante. A composição da fase móvel pode ser constante ou variável.

durante a análise. No primeiro caso, o processo é chamado de isocrático,

e no segundo - gradiente. Às vezes instalado na frente do sistema de bombeamento

filtros com diâmetro de poro de 0,45 µm para filtrar a fase móvel. Moderno

O sistema de bombeamento variável de um cromatógrafo líquido consiste em uma ou mais bombas controladas por um computador. Isso permite que você altere a

tornando-se PF de acordo com um programa específico com eluição em gradiente. Sme-

a mistura dos componentes PF no misturador pode ocorrer tanto em baixa pressão

íon (antes das bombas) e em alta pressão (depois das bombas). O misturador pode ser usado para preparação de PF e eluição isocrática,

no entanto, uma proporção mais precisa de componentes é alcançada com preliminares

mistura de componentes de PF para um processo isocrático. As bombas analíticas de HPLC permitem manter uma taxa de fluxo constante de PF na coluna na faixa de 0,1 a 10 ml/min a uma pressão de entrada de coluna de até 50 MPa. É aconselhável, no entanto, que este valor não exceda

shalo 20 MPa. As pulsações de pressão são minimizadas por amortecimento especial

sistemas de ponteiras incluídos no projeto de bombas. Peças de trabalho em-

as bombas são feitas de materiais resistentes à corrosão, o que permite a utilização de componentes agressivos na composição do PF.

Torneiras

Por design, os misturadores podem ser estáticos ou dinâmicos.

microfone.

No misturador, uma única fase móvel é formada a partir de

solventes específicos fornecidos por bombas, se a mistura necessária não tiver sido preparada com antecedência. A mistura de solventes geralmente ocorre espontaneamente, mas às vezes são usados ​​sistemas com mistura forçada.

de costura.

Injetores

Os injetores podem ser universais para a introdução de amostras de

1 µl a 2 ml ou discreto para injeção de amostra de apenas um determinado volume

ema. Ambos os tipos de injetores podem ser automáticos ("auto-injetores" ou "auto-amostradores"). O injetor para entrar na amostra (solução) está localizado não -

imediatamente antes da coluna cromatográfica. O design do injetor permite alterar a direção do fluxo de PF e introduzir preliminarmente uma amostra em um loop de um determinado volume (geralmente de 10 a 100 μl).

Este volume é indicado na etiqueta do loop. O design do injetor permite a substituição do loop. Para introduzir a solução analisada em não-av-

injetor tomatic utiliza uma microseringa manual com volume significativamente

excedendo muito o volume do loop. O excesso da solução injetada, não

no loop é descartado e o volume exato e sempre o mesmo de amostra é injetado na coluna. O preenchimento manual incompleto do loop reduz a precisão

precisão e reprodutibilidade da dosagem e, consequentemente, degrada a precisão

e reprodutibilidade da análise cromatográfica.

Coluna de cromatografia

As colunas cromatográficas são geralmente tubos de aço inoxidável, vidro ou plástico preenchidos com sorvente e fechados.

em ambos os lados com filtros com um diâmetro de poro de 2–5 µm. A duração da análise

coluna, dependendo do mecanismo de separação cromatográfica, pode estar na faixa de 5 a 60 cm ou mais (geralmente é

10-25 cm), diâmetro interno - de 2 a 10 mm (geralmente 4,6 mm). Colunas com diâmetro interno inferior a 2 mm são usadas em microcolunas de cromo

tografia. Colunas capilares com diâmetros internos também são usadas.

rum cerca de 0,3-0,7 mm. As colunas para cromatografia preparativa têm um diâmetro interno de até 50 mm ou mais.

Antes da coluna analítica, cabos curtos podem ser instalados.

colunas (pré-colunas) executando várias funções auxiliares

(mais frequentemente - proteção da coluna analítica). Normalmente, a análise é feita em

à temperatura ambiente, no entanto, para aumentar a eficiência de separação e

encurtando a duração da análise, um termostato pode ser usado

coluna cansativa em temperaturas não superiores a 60 C. Em temperaturas mais altas, a degradação do sorvente e uma mudança na composição do PF são possíveis.

Fase estacionária (sorvente)

Os sorventes comumente usados ​​são:

1. Sílica gel, alumina, grafite porosa são usados ​​em

cromatografia de fase pequena. O mecanismo de retenção neste caso

chá - geralmente adsorção;

2. Resinas ou polímeros com grupos ácidos ou básicos. Escopo - cromatografia de troca iônica;

3. sílica gel ou polímeros porosos (cromatografia de exclusão de tamanho);

4. Sorventes quimicamente modificados (sorventes com

zami), preparado na maioria das vezes com base em gel de sílica. O mecanismo de retenção na maioria dos casos é a distribuição entre dispositivos móveis

noah e fases estacionárias;

5. Sorventes quirais modificados quimicamente, por exemplo,

celuloses aquosas e amiloses, proteínas e peptídeos, ciclodextrinas,

usado para separar enantiômeros (cromatografia quiral)

Os sorventes de fase ligada podem ter vários graus de

modificação chesky. As partículas sorventes podem ser esféricas ou não esféricas.

forma regular e porosidade variada.

As fases ligadas mais comumente usadas são:

– grupos octil(octilsilano sorvente ou C8);

– grupos octadecil(octadecilsilano sorvente

(ODS) ou C18);

– grupos fenil(fenilsilano sorvente);

– grupos cianopropilo(sorvente CN);

– grupos aminopropilo(sorvente NH2);

– grupos diol (diol sorvente).

Na maioria das vezes, a análise é realizada em fases ligadas não polares em

modo de fase reversa usando sorvente C18.

Em alguns casos, é mais apropriado usar

cromatografia de fase. Neste caso, sílica gel ou fases ligadas polares (“CN”, “NH2”, “diol”) são usadas em combinação com solutos não polares.

Os sorventes de fase ligada são quimicamente estáveis ​​em valores de pH de 2,0 a 8,0, a menos que especificado de outra forma pelo fabricante.

As partículas sorventes podem ter uma forma esférica ou irregular e uma variedade de porosidade. O tamanho de partícula do sorvente em HPLC analítica é geralmente de 3 a 10 µm, em HPLC preparativa, até 50 µm ou mais.

Sorventes monolíticos também são usados.

A alta eficiência de separação é proporcionada pela alta área superficial das partículas sorventes (que é consequência de sua microscopia).

a presença de poros), bem como a uniformidade da composição do sorvente e seu empacotamento denso e uniforme.

Detectores

Vários métodos de detecção são usados. No caso geral, PF com componentes dissolvidos nele após uma coluna cromatográfica

ki cai na célula detectora, onde uma ou outra de suas propriedades é medida continuamente (absorção na região UV ou visível do espectro, fluorescência,

índice de refração, condutividade elétrica, etc.). O cromatograma resultante é um gráfico da dependência de alguns fatores físicos

ou parâmetro físico-químico do PF na hora.

Os mais comuns são espectrofotométricos

detectores (incluindo diodo-matriz), registrando uma mudança na

densidade no ultravioleta, visível e muitas vezes no infravermelho próximo

outras regiões do espectro de 190 a 800 ou 900 nm. O cromatograma neste caso

chá é a dependência da densidade óptica do PF no tempo.

O detector espectrofotométrico tradicionalmente usado permite

permite a detecção em qualquer comprimento de onda em sua faixa de operação

zona. Também são utilizados detectores multi-onda, que permitem conduzir

realizar a detecção em vários comprimentos de onda simultaneamente.

Com a ajuda de um detector de arranjo de diodos, é possível não apenas realizar a detecção em vários comprimentos de onda ao mesmo tempo, mas também quase instantaneamente

veno (sem varredura) para obter o espectro óptico do PF a qualquer momento, o que simplifica muito a análise qualitativa dos componentes separados

componentes.

A sensibilidade dos detectores fluorescentes é aproximadamente 1000 vezes maior que a dos espectrofotométricos. Neste caso, é utilizada a sua própria fluorescência ou a fluorescência dos derivados correspondentes, se o próprio analito não fluorescer. Moderno

Detectores fluorescentes intercambiáveis ​​tornam possível não só obter cromato-

gramas, mas também para registrar os espectros de excitação e fluorescência da análise.

conexões zyable.

Os detectores refratométricos são usados ​​para analisar amostras que não absorvem nas regiões UV e visível do espectro (por exemplo, carboidratos).

(refratômetros). As desvantagens desses detectores são sua baixa sensibilidade (em comparação com detectores espectrofotométricos) e dependência significativa da temperatura da intensidade do sinal (o detector deve ser termostato).

Detectores eletroquímicos também são usados ​​(conductometric

céu, amperometria, etc.), espectrometria de massa e Fourier-IR

detectores, detectores de dispersão de luz, radioatividade e alguns outros

na fase móvel

NO Uma variedade de solventes, tanto individuais quanto suas misturas, podem ser usados ​​como PF.

NO fase normal A cromatografia geralmente usa carbono líquido

hidrocarbonetos (hexano, ciclohexano, heptano) e outros relativamente não polares

solventes com pequenas adições de compostos orgânicos polares,

que regulam a força de eluição do PF.

Na cromatografia de fase reversa, a composição do PF inclui

solventes orgânicos (geralmente acetonitrila e metanol) e água. Para opti-

Os estudos de separação costumam usar soluções aquosas com um certo sinal

valor de pH, em particular soluções tampão. Os aditivos inorgânicos são usados

ácidos cálicos e orgânicos, bases e sais e outros compostos (sobre

Por exemplo, modificadores quirais para separar enantiômeros em

não sorvente).

O controle do valor de pH deve ser feito separadamente para o componente aquoso, e não para sua mistura com um solvente orgânico.

PF pode consistir em um solvente, geralmente dois, se necessário

dimidade - de três ou mais. A composição do PF é indicada como a razão volumétrica de seus solventes constituintes. Em alguns casos, a massa

razão, que deve ser especialmente estipulada.

Ao usar um detector espectrofotométrico UV, o PF não deve ter uma absorção pronunciada no comprimento de onda escolhido para detecção. O limite de transparência ou densidade óptica ao determinar

o comprimento de onda especificado do solvente de um determinado fabricante é frequentemente indicado

está no pacote.

A análise cromatográfica é muito influenciada pelo grau de pureza do PF, por isso é preferível usar solventes produzidos

nye especificamente para cromatografia líquida (incluindo água).

O PF e as soluções analisadas não devem conter

partículas e bolhas de gás. Água obtida em laboratório

soluções aquosas pré-misturadas com solventes orgânicos de água

Os solventes, assim como as soluções analisadas, devem ser submetidos a filtração fina e desgaseificação. A filtragem geralmente é usada para essa finalidade.

sob vácuo através de um filtro de membrana inerte em relação a um determinado solvente ou solução com um tamanho de poro de 0,45 μm.

Sistema de coleta e processamento de dados

Um moderno sistema de processamento de dados é um conjugado

computador pessoal conectado ao cromatógrafo com software instalado

software que permite registrar e processar cronômetros

matograma, bem como gerenciar o funcionamento do cromatógrafo e monitorar os principais

parâmetros mi do sistema cromatográfico.

Lista de condições cromatográficas a serem especificadas

Em uma monografia particular, as dimensões do co-

colunas, tipo de sorvente com indicação do tamanho da partícula, temperatura da coluna (se for necessário controle de temperatura), volume da amostra injetada (volume do loop),

Status do PF e método de sua preparação, taxa de alimentação do PF, condições do detector e detecção, descrição do modo de gradiente (se usado), tempo de cromatografia.

TROCA IÔNICA E HPLC IÔNICA

A cromatografia de troca iônica é usada para análise como um

skikh (bases heterocíclicas, aminoácidos, proteínas, etc.), e não-ou-

compostos gânicos (vários cátions e ânions). Separação de componentes

componentes da mistura analisada na cromatografia de troca iônica baseia-se na interação reversível dos íons das substâncias analisadas com grupos iônicos.

sorvente pami. Trocadores de ânions ou trocadores de cátions são usados ​​como sorventes.

tu. Esses sorventes são principalmente íons poliméricos

resinas de troca (geralmente copolímeros de estireno e divinilbenzeno com enxerto

grupos iônicos), ou gel de sílica com grupos de troca iônica enxertados. Sorventes com grupos -(CH2)3N+X– são usados ​​para separar ânions, e sorventes com grupos -(CH2)SO3–H+ são usados ​​para separar cátions.

Normalmente, as resinas poliméricas são usadas para separar ânions e para separar e-

cátions são géis de sílica modificados.

Como PF na cromatografia de troca iônica, são utilizadas soluções aquosas de ácidos, bases e sais. As corridas de buffer são geralmente usadas

soluções que permitem manter determinados valores de pH. Também é possível usar pequenos aditivos de compostos orgânicos miscíveis em água

solventes cal - acetonitrilo, metanol, etanol, tetra-hidrofurano.

Cromatografia de íons- uma variante de cromatografia de troca iônica, em

que, para determinar a concentração de íons do analito, é usado

usando um detector condutométrico. Para operações altamente sensíveis

Para determinar mudanças na condutividade elétrica que passa pelo detector PF, a condutividade elétrica de fundo do PF deve ser baixa.

Existem duas variantes principais de cromatografia de íons.

A primeira delas baseia-se na supressão da condutividade elétrica do

que PF usando a segunda coluna de troca iônica localizada entre o anal-

coluna lítica e detector. Nesta coluna, a neutralização ocorre

PF e os compostos analisados ​​entram na célula detectora em deionização

água zirovannoy. Os íons detectados são os únicos íons

garantindo a condutividade do PF. A desvantagem da coluna supressora é a necessidade de sua regeneração em intervalos bastante curtos.

mim. A coluna de supressão pode ser substituída por um

supressor de membrana, no qual a composição da membrana é continuamente

é o fluxo da solução regeneradora movendo-se na direção

oposta à direção do fluxo de PF.

A segunda versão da cromatografia de íons é a cromatografia de íons de coluna única.

matografia. Nesta variante, é utilizado um PF com uma condutividade elétrica muito baixa.

teor de água. Compostos orgânicos fracos são amplamente utilizados como eletrólitos.

ácidos do céu - benzóico, salicílico ou isoftálico.

TAMANHO HPLC

A cromatografia de exclusão de tamanho (cromatografia em gel) é uma versão especial da HPLC baseada na separação de moléculas de acordo com seu tamanho. Distribuição

moléculas entre as fases estacionária e móvel é baseado no tamanho do

moléculas e em parte em sua forma e polaridade. Para separação, use

sorventes porosos - polímeros, sílica gel, vidros porosos e polissacarídeos.

O tamanho de partícula dos sorventes é de 5 a 10 µm.

As vantagens dos vidros porosos e do gel de sílica são a rápida difusão de PF e moléculas de analito nos poros, estabilidade sob várias condições (mesmo em altas temperaturas). sorbeno polimérico -

vocês são copolímeros de estireno e divinilbenzeno (este é um hidro-

sorventes fóbicos usados ​​com fases móveis não polares) e

géis hidrofílicos obtidos a partir de resinas sulfonadas de divinilbenzeno ou poliacrilamida.

Dois tipos limitantes de interação de moléculas com uma fase estacionária porosa são possíveis. Moléculas maiores que o diâmetro médio de um poro não penetram no sorvente e são eluídas junto com a fase móvel.

zo primeiro. Moléculas com diâmetro muito menor que o tamanho dos poros do tipo

dobras penetram livremente nele, permanecem na fase estacionária por mais tempo e são eluídos por último. Moléculas de tamanho médio penetram nos poros do sorvente dependendo de seu tamanho e parcialmente dependendo de sua forma. Eles eluem com diferentes tempos de retenção entre

nossas maiores e menores moléculas. A separação dos componentes da amostra cromatografada ocorre como resultado de ações repetidas.

a difusão dos componentes da amostra nos poros do sorvente e vice-versa.

Na cromatografia de exclusão de tamanho, para caracterizar a retenção,

um volume de retenção igual ao produto da vazão de PF e o tempo de retenção é usado.

na fase móvel. A escolha do PF depende do tipo de sorvente. Exclusão-

a cromatografia é geralmente dividida em filtração em gel e cromatografia em gel.

cromatografia de permeação.

O método de cromatografia de filtração em gel é usado para separar

de compostos solúveis em água em sorventes hidrofílicos. As fases móveis são soluções tampão aquosas com um determinado valor de pH.

A cromatografia de permeação em gel usa

solventes orgânicos não polares (tolueno, diclorometano, tetra-

hidrofurano). Este método é usado para analisar compostos que são ligeiramente solúveis

bordada em água.

Detectores. Como detectores em cromatografia de exclusão de tamanho, são usados ​​detectores refractométricos diferenciais, bem como detectores espectrofotométricos (incluindo aqueles na região IR do espectro).

Detectores de laser viscométricos e de fluxo também são usados.

Esses detectores, em combinação com um refratômetro ou outro

detector permite que você determine continuamente o peso molecular de

cal em PF.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA PERFORMANCE

A cromatografia líquida de ultra desempenho é uma variante da cromatografia líquida mais eficiente

stu em comparação com HPLC clássica.

Uma característica da cromatografia líquida de ultra desempenho é

o uso de sorventes com um tamanho de partícula de 1,5 a 2 mícrons. Cro-

as colunas matográficas geralmente têm 50 a 150 mm de comprimento e 1

até 4 mm de diâmetro. O volume da amostra injetada pode ser de 1 a 50 µl.

Equipamento cromatográfico usado no clássico

riante HPLC, geralmente especialmente adaptado para este tipo de cromatografia

Equipamentos projetados para cromatografia líquida de ultra performance também podem ser utilizados na versão clássica de HPLC.

A separação cromatográfica da mistura na coluna devido ao avanço lento do PF leva muito tempo. Para acelerar o processo, a cromatografia é realizada sob pressão. Este método é chamado de Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)

A modernização dos equipamentos utilizados na cromatografia em coluna líquida clássica a tornou um dos métodos de análise promissores e modernos. A cromatografia líquida de alta eficiência é um método conveniente para a separação, isolamento preparativo e análise qualitativa e quantitativa de compostos termolábeis não voláteis de baixo e alto peso molecular.

Dependendo do tipo de sorvente usado neste método, 2 variantes de cromatografia são usadas: em um sorvente polar usando um eluente não polar (opção de fase direta) e em um sorvente não polar usando um eluente polar - o chamado reverso cromatografia líquida de alta eficiência de fase (RPHLC).

Quando o eluente passa para o eluente, o equilíbrio sob condições de RPHLC é estabelecido muitas vezes mais rápido do que sob condições de sorventes polares e PFs não aquosos. Como resultado disso, além da conveniência de trabalhar com eluentes água e álcool-água, o RPHLC ganhou grande popularidade. A maioria das análises de HPLC são realizadas usando este método.

Instrumentação para HPLC

As colunas para HPLC são feitas de aço inoxidável com diâmetro interno de 2-6 mm e comprimento de 10-25 cm. As colunas são preenchidas com um sorvente (NF). Sílica gel, alumina ou sorventes modificados são usados ​​como NF. O gel de sílica é geralmente modificado pela introdução química de vários grupos funcionais em sua superfície.

Detectores. O registro da saída da coluna de um componente separado é realizado usando um detector. Para registro, pode-se utilizar a alteração em qualquer sinal analítico proveniente da fase móvel e relacionado à natureza e quantidade do componente da mistura. A cromatografia líquida usa sinais analíticos como absorção de luz ou emissão de luz da solução de saída (detectores fotométricos e fluorimétricos), índice de refração (detectores refratométricos), potencial e condutividade elétrica (detectores eletroquímicos), etc.

O sinal continuamente detectado é gravado pelo gravador. O cromatograma é uma sequência de sinais detectores gravados na fita do gravador, gerados quando os componentes individuais da mistura saem da coluna. No caso de separação da mistura, picos separados são visíveis no cromatograma externo. A posição do pico no cromatograma é usada para fins de identificação da substância, altura ou área do pico - para fins de determinação quantitativa.

Análise qualitativa

As características mais importantes do cromatograma - o tempo de retenção t r e o volume de retenção associado a ele - refletem a natureza das substâncias, sua capacidade de sorção no material da fase estacionária e, portanto, sob condições cromatográficas constantes, são um meio de identificar uma substância. Para uma determinada coluna com determinada vazão e temperatura, o tempo de retenção de cada composto é constante (Fig. - tempo de retenção do padrão interno (substância inicialmente ausente na mistura analisada), h - altura do pico (mm), a 1 /2 - largura do pico na metade de sua altura, mm.

Para identificar uma substância por cromatograma, geralmente são usadas amostras padrão ou substâncias puras. O tempo de retenção do componente desconhecido t Rx é comparado com o tempo de retenção t RCT das substâncias conhecidas. Mas identificação mais confiável medindo o tempo de retenção relativo

Neste caso, uma substância conhecida (padrão interno) é primeiro introduzida na coluna e seu tempo de retenção t R(BC) é medido, então a mistura de teste é separada cromatograficamente (cromatografada), à qual o padrão interno é adicionado preliminarmente.

Análise quantitativa

Esta análise é baseada na dependência da altura do pico h ou sua área S da quantidade de substância. Para picos estreitos, a medida h é preferível, para picos amplos e borrados - S. A área do pico é medida de diferentes maneiras: multiplicando a altura do pico (h) pela sua largura (a 1/2), medida na metade de sua altura; planejamento; usando um integrador. Os cromatógrafos modernos são equipados com integradores elétricos ou eletrônicos.

Três métodos são usados ​​principalmente para determinar o conteúdo de substâncias em uma amostra: o método de calibração absoluta, o método de normalização interna e o método de padrão interno.

O método de calibração absoluta é baseado em uma determinação preliminar da relação entre a quantidade da substância introduzida e a área ou altura do pico no cromatograma. Uma quantidade conhecida da mistura de calibração é introduzida no cromatograma e as áreas ou alturas dos picos obtidos são determinadas. Construa um gráfico da área ou altura do pico a partir da quantidade de substância injetada. A amostra de teste é analisada, a área ou altura do pico do componente a ser determinado é medida e sua quantidade é calculada com base na curva de calibração.

O método de normalização interna é baseado em trazer para 100% a soma das áreas de todos os picos no cromatograma.

Este método fornece informações apenas sobre o teor relativo do componente na mistura, mas não permite determinar seu valor absoluto.

O método do padrão interno é baseado na comparação de um parâmetro de pico selecionado de um analito com o mesmo parâmetro de uma substância padrão introduzida na amostra em uma quantidade conhecida. Uma quantidade conhecida de tal substância padrão é introduzida na amostra de teste, cujo pico é suficientemente bem separado dos picos dos componentes da mistura de teste.

Os dois últimos métodos requerem a introdução de fatores de correção que caracterizem a sensibilidade dos detectores utilizados às substâncias analisadas. Para diferentes tipos de detectores e diferentes substâncias, o coeficiente de sensibilidade é determinado experimentalmente.

A cromatografia de adsorção líquida também utiliza a análise de frações de soluções coletadas no momento em que a substância sai da coluna. A análise pode ser realizada por vários métodos físico-químicos.

A cromatografia de adsorção líquida é usada principalmente para a separação de substâncias orgânicas. Este método é muito bem sucedido no estudo da composição de óleo, hidrocarbonetos, separando efetivamente isômeros trans e cis, alcalóides, etc. HPLC pode ser usado para determinar corantes, ácidos orgânicos, aminoácidos, açúcares, impurezas de pesticidas e herbicidas, substâncias medicinais e outros contaminantes em produtos alimentícios.

Equipamento para cromatografia líquida.

Na cromatografia líquida moderna, são usados ​​instrumentos de vários graus de complexidade - desde os sistemas mais simples até cromatógrafos de ponta equipados com vários dispositivos adicionais. Na fig. 1. mostra um diagrama de blocos de um cromatógrafo líquido contendo o conjunto mínimo necessário de componentes, de uma forma ou de outra, presentes em qualquer sistema cromatográfico.

Arroz. 1. Diagrama de blocos de um cromatógrafo líquido.

A bomba (2) foi projetada para criar um fluxo constante de solvente. Seu projeto é determinado principalmente pela pressão de operação no sistema. Para operação na faixa de 10-500 MPa, são utilizadas bombas do tipo pistão (seringa) ou pistão. A desvantagem da primeira é a necessidade de paradas periódicas para preenchimento com eluente, e a segunda é a grande complexidade do projeto e, consequentemente, o alto preço. Para sistemas simples com baixas pressões de operação de 1-5 MPa, bombas peristálticas baratas são usadas com sucesso, mas como é difícil atingir uma pressão e vazão constantes, seu uso é limitado a tarefas preparatórias.

O injetor (3) garante que uma amostra da mistura de componentes separados seja injetada na coluna com uma reprodutibilidade suficientemente alta. Os sistemas simples de injeção de amostra "stop-flow" exigem que a bomba seja parada e, portanto, são menos convenientes do que as pipetas de loop da Reodyne.

As colunas HPLC (4) são tubos de aço inoxidável de paredes espessas capazes de suportar alta pressão. Um papel importante é desempenhado pela densidade e uniformidade do empacotamento da coluna com um sorvente. Para cromatografia líquida de baixa pressão, colunas de vidro de paredes espessas são usadas com sucesso. A constância da temperatura é assegurada pelo termostato (5).

Os detectores (6) para cromatografia líquida possuem uma célula de fluxo na qual alguma propriedade do eluente que flui é medida continuamente. Os tipos mais populares de detectores de uso geral são os refratômetros, que medem o índice de refração, e os detectores espectrofotométricos, que medem a absorbância de um solvente em um comprimento de onda fixo (geralmente na região do ultravioleta). As vantagens dos refratômetros (e as desvantagens dos espectrofotômetros) incluem baixa sensibilidade ao tipo de composto que está sendo determinado, que pode não conter grupos cromóforos. Por outro lado, o uso de refratômetros é limitado a sistemas isocráticos (com composição eluente constante), portanto, o uso de gradiente de solvente não é possível neste caso.

O sistema de gravação (7) no caso mais simples consiste em um amplificador diferencial e um gravador. Também é desejável ter um integrador que permita calcular as áreas relativas dos picos resultantes. Em sistemas cromatográficos complexos, é utilizado um bloco de interface que conecta o cromatógrafo a um computador pessoal (8), que não apenas coleta e processa informações, mas também controla o instrumento.

Detectores de HPLC

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é usada para detectar substâncias polares não voláteis, que por algum motivo não podem ser convertidas em uma forma conveniente para cromatografia gasosa, mesmo na forma de derivados. Tais substâncias, em particular, incluem ácidos sulfônicos, corantes solúveis em água e alguns pesticidas, como derivados de fenil-ureia.

Detectores:

UV - detector de arranjo de diodos. A "matriz" de fotodiodos (são mais de duzentos) registra constantemente sinais na região UV e visível do espectro, garantindo assim o registro dos espectros UV-B no modo de varredura. Isso torna possível gravar continuamente, com alta sensibilidade, espectros não distorcidos de componentes que passam rapidamente por uma célula especial.

Em comparação com a detecção de comprimento de onda único, que não fornece informações sobre a "pureza" do pico, a capacidade de comparar os espectros completos do arranjo de diodos fornece um resultado de identificação com um grau muito maior de certeza.

Detector fluorescente. A grande popularidade dos detectores fluorescentes se deve à alta seletividade e sensibilidade, e ao fato de que muitos poluentes ambientais fluorescem (por exemplo, hidrocarbonetos poliaromáticos).

Um detector eletroquímico é usado para detectar substâncias que são facilmente oxidadas ou reduzidas: fenóis, mercaptanos, aminas, nitro aromático e derivados de halogênio, aldeídos, cetonas, benzidinas.

Tubos indicadores para a determinação de teste de aminas aromáticas no ar da área de trabalho

As aminas aromáticas têm altas propriedades tóxicas e são caracterizadas por baixas concentrações máximas permitidas no ar. A propensão à degradação oxidativa desses poluentes em objetos ambientais limita a possibilidade de controle operacional de seu conteúdo em locais de emissões locais. Isso determina a relevância do uso de sistemas analíticos baseados em determinações de teste de substâncias para avaliar a contaminação de vários meios. Os métodos de teste, que incluem dispositivos analíticos com detecção direta de um sinal analítico sem amostragem adicional e preparação de amostras das amostras analisadas, permitem obter informações mais econômicas e objetivas sobre o estado do ambiente.

O objetivo deste trabalho é desenvolver tubos indicadores para teste de determinação de compostos amino no ar com base em uma nova e promissora classe de reagentes para análise orgânica molecular de benz-2,1,3-oxadiazol substituído por clorodinitro e seus N-óxidos .

A cor dos derivados resultantes depende da natureza do composto a ser determinado, e o desvio batocrômico observado das bandas de absorção é determinado pelo grau de substituição do grupo amino e pela presença de substituintes. Isso torna possível usar a detecção visual direta de um sinal analítico como base do método de teste. Os limites de detecção visual de tóxicos atingem 0,05 mg/m 3 .

Os tubos indicadores desenvolvidos são usados ​​como amostradores de quimissorção eficazes (dosímetros químicos) para a análise de ar contendo uma mistura de compostos amino. A taxa de amostragem foi estabelecida experimentalmente pelo grau de absorção dos tóxicos pela camada seletiva. A composição e quantidade de, por exemplo, anilinas substituídas podem ser determinadas após eluição dos produtos de quimissorção de gel de sílica por HPLC. Ao mesmo tempo, uma ampla gama de componentes potenciais dos ecossistemas industriais não afeta os resultados das determinações.