Krv a erytrocyty. Pokračujeme vo zverejňovaní materiálov o krvi.
Ako vyzerá erytrocyt? Za normálnych fyziologických podmienok v krvnom obehu majú erytrocyty bikonkávny tvar s rovnomerným zhrubnutím po okrajoch a s centrálnou svetlejšou časťou – pellor.
V štúdii so svetelnou optikou má normálny erytrocyt bežne farbený kyslými farbivami tvar disku s priemerom 6,9-7,7 a až 9,0 mikrónov. V závislosti od veľkosti sa erytrocyty delia na mikro- a makrocyty, ale väčšinu z nich predstavujú normocyty / diskocyty.
Morfofunkčné vlastnosti erytrocytu
Erytrocyt je bikonkávna bunka bez jadra s priemerným objemom 90,0 µm 3 a plochou 142 µm 2 . Jeho najväčšia hrúbka je 2,4 µm, minimálna je 1 µm.
Vo vysušenom prípravku je priemerná veľkosť erytrocytu 7,55 um; 95% jeho sušiny pripadá na proteín obsahujúci železo hemoglobín a iba 5% - na podiel iných látok (iné proteíny a lipidy). Takéto bunky predstavujú absolútnu väčšinu – vyše 85 % – zdravých ľudských erytrocytov.
Jadrové formy zárodku erytrocytov sa dajú ľahko odlíšiť od väčšiny buniek série leukocytov absenciou granúl v ich cytoplazme (chyby sú možné iba pri identifikácii blastických buniek). Erytroblasty sa vyznačujú granulárnejším a hustejším jadrovým chromatínom.
Centrálna dutina (pellor) erytrocytového disku tvorí 35 až 55 % jeho povrchu a na priereze má erytrocyt tvar donutu, čo na jednej strane zabezpečuje zachovanie hemoglobínu a na strane druhej. na druhej strane umožňuje erytrocytom prejsť aj cez tie najtenšie kapiláry. V súčasnosti dostupné modely štruktúry erytrocytov zodpovedajú koncepcii špecifických vlastností tejto bunky, najmä jej membrány, ktorá napriek citlivosti na deformačný tlak poskytuje odolnosť proti ohybu a zväčšeniu celkového povrchu.
Literárne údaje naznačujú, že veľkosť a deformovateľnosť membrány erytrocytov sú ich najdôležitejšie charakteristiky, ktoré súvisia s normálnym fungovaním týchto buniek, vrátane vysokej migračnej schopnosti, účasti na metabolických procesoch (predovšetkým na výmene kyslíka).
Zmeny v mikroelastometrických vlastnostiach erytrocytov a „transformácia“ diskocytov na iné morfologické formy môžu byť spôsobené rôznymi činiteľmi. Vzhľad povrchových výrastkov teda vedie k zníženiu elasticity membrány, čo môže byť spôsobené opačnými silami vznikajúcimi v procese deformácie erytrocytu; deformácia sa zvyšuje s poklesom koncentrácie ATP v bunkách.
Ak sa naruší integrita bunkovej membrány, potom erytrocyt stratí svoj charakteristický tvar a zmení sa na sféroplast, ktorý sa naopak hemolyzuje. Štruktúra membrány erytrocytov (diskocytov) je v celom rozsahu rovnaká; a napriek tomu, že v jej rôznych častiach sa môžu vyskytovať priehlbiny a vydutiny, zmeny vnútro- alebo extracelulárneho tlaku s rozptylom ± 15 % nespôsobujú zvrásnenie celej bunky, pretože má značnú rezervu „antideformovateľnosti“ . Membrána erytrocytov má dostatočnú elasticitu, aby odolala vplyvu rôznych faktorov, ktoré sa vyskytujú pri cirkulácii erytrocytu krvným obehom.
Zloženie membrány erytrocytov zahŕňa: fosfolipidy (36,3 %), sfingomyelíny (29,6 %), cholesterol (22,2 %) a glykolipidy (11,9 %). Prvé dva prvky sú amfifilné molekuly vo vodnom médiu, ktoré tvoria charakteristickú lipidovú dvojvrstvu, ktorá je tiež preniknutá integrálnymi proteínovými molekulami spojenými vo vnútri erytrocytu s jeho cytoskeletom.
Membránové lipidy sú v tekutom stave, majú nízku viskozitu (iba 10-100-násobok viskozity vody). Na vonkajšom povrchu membrány sa nachádzajú lipidy, kyselina sialová, antigénne oligosacharidy, adsorbované proteíny; vnútorný povrch membrány predstavujú glykolytické enzýmy, sodík a vápnik, ATPáza, glykoproteíny a hemoglobín.
Dvojitá lipidová vrstva membrány plní tri funkcie: funkciu bariéry pre ióny a molekuly, štrukturálny základ pre fungovanie receptorov a enzýmov (proteíny, glykoproteíny, glykolipidy) a mechanickú. Pri realizácii špecializovanej, respiračnej funkcie – prenosu kyslíka alebo oxidu uhličitého – hrajú hlavnú úlohu membránové proteíny „usadené“ v lipidovej dvojvrstve. Zrelé erytrocyty nie sú schopné syntetizovať nukleové kyseliny a hemoglobín; vyznačujú sa nízkou úrovňou metabolizmu, čo zabezpečuje dostatočne dlhú dobu života týchto buniek (120 dní).
Starnutím erytrocytu sa jeho povrch zmenšuje, zatiaľ čo obsah hemoglobínu zostáva nezmenený. Zistilo sa, že v „zrelom“ veku si erytrocyty dlhodobo zachovávajú konštantné chemické zloženie, ale ako bunky starnú, obsah chemikálií v nich postupne klesá. Cytoskelet erytrocytov je tvorený a riadený multigénovými a s membránami spojenými „rodinami“ proteínov, ktoré organizujú špecializované membránové domény, ktoré udržujú funkciu a tvar tejto vysoko špecializovanej bunky.
Elektrický potenciál erytrocytu
Membrána erytrocytov obsahuje 50 % bielkovín, až 45 % lipidov a až 10 % sacharidov. Na povrchu intaktných buniek je „sieťové“ rozloženie nábojov určené glykoproteínom obsahujúcim kyselinu sialovú (neutramovú), ktorá určuje až 62 % povrchového negatívneho náboja bunky.
Predpokladá sa, že každý elektrický náboj zodpovedá 1 molekule tejto kyseliny. Strata kyseliny sialovej povrchom erytrocytov vedie k zníženiu jeho elektroforetickej mobility (EPM) a potlačeniu transportu katiónov. Následne je na povrchu bunky „mozaika“ nábojov, určená katiónovými a aniónovými skupinami, ktorých pomer určuje celkový elektrický náboj erytrocytov.
Na udržanie optimálneho stavu homeostázy musia mať krvinky stabilný náboj. Vysoká stabilita EFP je zabezpečená jemným mechanizmom jeho regulácie - rovnováhou procesov lipidovej peroxidácie (LPO) v membránach erytrocytov a ochranným účinkom antioxidačného systému.
Empiricky sa zistilo, že receptory pre protilátky sa nachádzajú na membráne erytrocytov a ich prítomnosť aj malého množstva na povrchu môže narušiť normálne fyziologické funkcie v organizme a zmeniť EFP erytrocytov. To môže ovplyvniť hladinu obsahu hemoglobínu v druhom z nich, pretože obsah hemoglobínu a EFP je prísne koordinovaný.
Malo by sa tiež vziať do úvahy, že pri extrémnych účinkoch negatívnych faktorov na telo ovplyvňujú produkty peroxidácie lipidov elektrokinetické vlastnosti erytrocytov. To sa zase odráža v rýchlosti peroxidových procesov v ich membránach.
Vďaka elektrostatickému odpudzovaniu („šíreniu“ podľa Chizhevského) podobne nabitých erytrocytových buniek sa tieto bunky voľne pohybujú krvnými cievami a vykonávajú svoju funkciu transportu kyslíka. Preto možno porušenie stability náboja považovať za integrálny indikátor patologických zmien v tele.
1.5 Témy praktických cvičení
ODDIEL 1. MEMBRÁNOVÁ BIOFYZIKA
1. 1. Biologické membrány. Štruktúra, vlastnosti.
Špecifická elektrická kapacita axónovej membrány, meraná intracelulárnou mikroelektródou, bola 0,5 mikrofarad/cm2. Pomocou vzorca plochého kondenzátora odhadnite hrúbku hydrofóbnej vrstvy membrány s dielektrickou konštantou 2.
Akú vzdialenosť na povrchu membrány erytrocytov prekoná molekula fosfolipidu za 1 sekundu v dôsledku laterálnej difúzie? Koeficient laterálnej difúzie sa rovná 10 -12 m 2 /s. Porovnajte s obvodom erytrocytu s priemerom 8 mikrónov.
Počas fázového prechodu membránových fosfolipidov z kvapalno-kryštalického stavu do gélu sa mení hrúbka dvojvrstvy. Ako sa v tomto prípade zmení elektrická kapacita membrány? Ako sa zmení sila elektrického poľa v membráne?
Pomocou spinovo značených fosfolipidových molekúl sa stanovil gradient viskozity cez hrúbku membrány. Opíšte bývalý experiment. Kde je viskozita vyššia: na povrchu membrány alebo v jej strede?
1.1.1. Hrúbka biologickej membrány:
10 A, 3, OD um
10 nm 4,10 um
1.1.2. Model tekutej mozaiky biologickej membrány zahŕňa:
proteínová vrstva, polysacharidy a povrchové lipidy
lipidová monovrstva a cholesterol
lipidová dvojvrstva, proteíny, mikrofilamenty
lipidová dvojvrstva
1.1.3. Lipidová časť biologickej membrány je v nasledujúcom fyzikálnom stave:
kvapalina amorfná
tuhá kryštalická látka
pevný amorfný
tekutý kryštál
1.1.4. Špecifická elektrická kapacita axónovej membrány:
1.1.5. Charakteristický čas prenosu fosfolipidovej molekuly z jednej rovnovážnej polohy do druhej počas ich difúzie:
1.1.6. Fázový prechod lipidovej dvojvrstvy membrán z kvapalno-kryštalického stavu do gélu je sprevádzaný:
stenčenie membrány
hrúbka membrány sa nemení
zhrubnutie membrány
1.2. Transport látok cez biologické membrány.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
1. Od akých parametrov závisí kritický polomer lipidového póru v membráne?
2. Vypočítajte kritický polomer pórov pri absencii membránového potenciálu. Zvážte okrajové napätie pórov 10-11 N, povrchové napätie lipidovej dvojvrstvy 0,3 mN/m.
3. Ako sa zmení uľahčená difúzia kaoiových iónov za účasti molekuly valinomycínu po fázovom prechode membránových lipidov zo stavov tekutých kryštálov na gél?
4. Špecifická elektrická kapacita axónovej membrány, meraná intracelulárnou mikroelektródou, bola 0,5 mikrofarad/cm2. Pomocou vzorca plochého kondenzátora odhadnite hrúbku hydrofóbnej vrstvy membrány s dielektrickou konštantou 2.
Modelové monitorovacie testy
1.2.1. Transport iónov prebieha v smere:
1.2.2. Difúzna rovnica pre neelektrolyty (Fika) je napísaná:
2.3. Molekula valinomycínu sa prenáša cez membránu:
1.2.4. Prenos hmoty počas uľahčenej difúzie sa porovnáva s jednoduchou difúziou:
pomalšie
1.3. Bioelektrické potenciály.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
Aký transport iónov vytvára rozdiel membránového potenciálu: pasívny alebo aktívny?
Čo je väčšie: rýchlosť šírenia elektrického signálu po drôtoch námorného telegrafu alebo rýchlosť šírenia nervového impulzu po axónovej membráne? prečo?
Vysvetlite biofyzikálny mechanizmus účinku jedu Tetro-Dotoxin a lokálneho anestetika tetraetylamónia.
Ako koreluje priepustnosť membrány axónu chobotnice pre rôzne ióny v pokoji a počas excitácie?
Ako sa zmení tvar grafu akčného potenciálu, ak zmeníme chemické zloženie vo vnútri axónu a vonku: axoplazma je nahradená extracelulárnou tekutinou a extracelulárna tekutina - axoplazmou?
Aká je intenzita elektrického poľa na membráne v pokoji, ak je koncentrácia draselných iónov vo vnútri bunky 125 mmol / l, vonku - 2,5 mmol / l a hrúbka membrány je 8 nm?
(Odpoveď: 1,3 * 10 7 V / m.)
7. Vypočítajte amplitúdu akčného potenciálu, ak
koncentrácia draslíka a sodíka vo vnútri bunky excitabilného tkaniva
ani v uvedenom poradí: 125 mmol / l, 1,5 mmol / l a mimo
2,5 mmol/l a 125 mmol/l.(Odpoveď: 160 mV.)
Modelové monitorovacie testy
1.3.1 Membránový potenciál f m sa nazýva:
1.3.2. Priemer hrotu použitej intracelulárnej elektródy pre meranie membránového potenciálu:
úmerné veľkosti bunky
oveľa menšie ako bunka
oveľa väčšie bunky
1.4. Mechanizmus generovania akčného potenciálu.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
1. Je možný proces na membráne excitovateľného článku, pri ktorom súčasne prúdia toky rôznych iónov s rovnakým nábojovým znamienkom?
2. Aký je význam výrazu
pre fázu II akčného potenciálu kardiomyocytov?
3. Aký je dôvod, že prúd cez kanál je diskrétny a cez membránu - kontinuálny, plynulo sa meniaci?
Modelové monitorovacie testy
1.4.1. Vo fáze depolarizácie počas excitácie axónu sú toky iónov Na + smerované:
1. peklo 2. bd 3. peklo 4. v 5. ag
1. 4.2. Vo fáze repolarizácie axónov sú toky iónov smerované:
1.ad 2.bd 3.be 4.g
4.3. Trvanie akčného potenciálu kardiomyocytov v porovnaní s akčným potenciálom axónov
1. väčší ako 2. menší ako 3. rovný
4.4. Fáza plató v kardiomyocyte je určená tokmi iónov:
1. Antonov V.F. Biofyzika membrán // Sorovsky vzdelávací časopis. - 1997. - T. - 6. S. 1-15.
2. Antonov V.F., Smirnova E.Yu., Shevchenko E.V. Lipidové membrány počas fázových premien. - M.: Nauka, 1992. - S. 125.
3. Klenchin V.A. biologické membrány. - 1993. - T. 10. -S. 5-19.
4. Chizmajaev Yu.A., Arakelyan V.B., Pastushenko V.F. Biofyzika membrán. - M.: Nauka, 1981. - S. 207-229.
5. Kotek A., Janáček K. membránový transport. M.: Mir, 1980.
6. Ľahká noha E. Transportné javy v živých systémoch. M.: 1977.
7. Rubin A.B. Biofyzika. M.: Vyššie. Shk., 1987.
8. Biologické membrány: Kolekcia / Pod. Ed. D.S. Parsons. Moskva: Atomizdat, 1978.
9. Membrána: Iónové kanály: Sat. čl. M.: Mir, 1981.
10. Hills B.V. So. Membrána: iónové kanály. M.: Mir, 1981.
11. Fyziológia a patofyziológia srdca. Pod. vyd. N. Sperelakis: M.: Medicína, 1998.
12. Fyziológia človeka. Pod. vyd. Schmidt R. And Tevs G. T. 1. M.: Mir, 1996.
ODDIEL 2. BIOFYZIKA BUNIEK A ORGÁNOV
2. 1. Elektrická činnosť orgánov.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
1. Aký je princíp ekvivalentného generátora? Uveďte príklady využitia tohto princípu.
2. Prečo je inverzný problém elektrokardiografie diagnostickou úlohou, a nie priamou?
3. Aký je mechanizmus vzniku mapy elektrických potenciálov na povrchu ľudského tela?
4. Prečo je potrebné zaznamenať aspoň 3 zvody EKG a nie napríklad jeden?
Modelové monitorovacie testy
2.1.1. Pri modelovaní EKG sa predpokladá, že prostredie obklopujúce dipóly
a. homogénny a, heterogénny
b. izotropný b", anizotropný
v. obmedzený v", nekonečný
1. abc 2. a"b"c" 3.ab"c 4.abc"
2.1.2. Aký je dôvod zmien veľkosti a smeru integrálneho elektrického vektora srdca počas cyklu jeho práce?
kontrakcia srdcových komôr
postupné pokrytie vlny excitácie rôznych štruktúr srdca
metabolická aktivita kardiomyocytov
spomalenie rýchlosti vlny v atrioventrikulárnom uzle
2.1.3. Prečo nie sú amplitúdy rovnakých zubov EKG v rovnakom čase v rôznych zvodoch rovnaké?
pre rôzne zvody, hodnota integrálneho elektrického vektora E _
v rôznych zvodoch je rotácia vektora E rôzna
projekcie vektora E na rôznych zvodoch nie sú rovnaké
každý zvod má svoj vlastný vektor E
2.1.4. Integrálny elektrický vektor srdca E opisuje slučky P, QRS, T:
1.horizontálne
2.v rovine povrchu hrudníka
Z.v objemovom priestore XYZ
4. v rovine spájajúcej body pravej, ľavej ruky a ľavej nohy
2.1.5 Zaznamenané potenciálne rozdiely
1. ag 2. byť 3. vg 4. dv
2.2. Procesy automatickej vlny v aktívnom médiu.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
Aký je zásadný rozdiel medzi automatickými vlnami v aktívnych médiách a mechanickými vlnami v elastických médiách?
Prečo sa autovlna šíri v aktívnom prostredí bez tlmenia?
Pozoruje sa rušenie auto-vĺn v aktívnych médiách?
Od čoho závisia parametre autovln v aktívnom médiu?
Prahový potenciál pre bunky myokardiálnej oblasti je - 30 mV. Transmembránový potenciál buniek v tejto oblasti v určitom časovom okamihu dosiahol hodnotu 40 mV. Môže sa cez túto oblasť myokardu prenášať excitačná vlna?
Modelové monitorovacie testy
2.2.1. Excitačná vlna (autovlna), ktorá sa šíri aktívnym prostredím (napríklad štruktúrou myokardu), sa nerozpadá:
prenosom energie z jednej bunky do druhej
bude detekovať uvoľnenie energie uloženej každou bunkou
v dôsledku prenosu mechanickej energie kontrakcie myokardu
v dôsledku využitia energie elektrického poľa
2.2.2 Vlnová dĺžka budenia v aktívnom médiu závisí od:
a. amplitúdy akčného potenciálu kardiomyocytu
b. na rýchlosti šírenia vĺn myokardom
v. na pulzovej frekvencii kardiostimulátora
od trvania refraktérnej periódy excitovaného
bunky1. ab 2. bg 3. cg 4. ag
2.2.3 Cirkulácia autovlny (reentry) trvania X v kruhu s obvodom / môže nastať za podmienky:
2.2.4. Ak sú v nehomogénnom aktívnom prostredí zóny s refraktérnosťou R 1 a R 2 (R 2 > R :) a impulzy z kardiostimulátora nasledujú s periódou T, potom môže dôjsť k transformácii rytmu za podmienky:
1. T
R13.T = R2-R1 2.3. Biofyzika svalovej kontrakcie.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
Prečo má izometrická kontrakcia inú formu závislosti F(t) pri rôznych počiatočných dĺžkach svalov?
Je možné určiť maximálnu záťaž, ktorú sval dokáže udržať z V(P) Hillovej krivky?
Zvyšuje sa účinnosť svalovej kontrakcie so zvýšenou tvorbou tepla týmto svalom?
Aké sú rozdiely medzi elektromechanickým spojením v kardiomyocytoch a kostrových svaloch?
Modelové monitorovacie testy
2.3.1. Počas svalovej kontrakcie:
a. aktínové vlákna sa posúvajú do sarkoméry pozdĺž myozínu
b. myozín sa stláča ako pružina
v. mostíky sa pripájajú k aktívnym miestam aktínu
d) mosty otvorené
1. av 2. bg 3. bv 4. ag
2.3.2. Sila kontrakcie generovaná svalom je určená:
1. dĺžka aktívnej nite
2 zmena sily generovanej jedným mostíkom
počet súčasne uzavretých mostov
elasticita myozínového vlákna
2.3.3. Závislosť rýchlosti v jednej svalovej kontrakcie od zaťaženia P má tvar:
2.3.4 Elektromechanické spojenie je určené nasledujúcim reťazcom udalostí:
a. uvoľňovanie Ca 2+ iónov na myofibrilách
b. excitácia bunkovej membrány
v. aktívny transport iónov Ca 2+ do sarkoplazmatického retikula
d) uzavretie mostov k aktívnym centrám aktínu
kĺzanie aktínu do sarkoméry
1. Fyziológia človeka. T. 2. M.: Mir, 1996.
2. Vasiliev V.A., Romanovsky Yu.N., Yakhno V.G. Procesy automatických vĺn. Moskva: Nauka, 1987.
3.Ivanitsky G.R., Krinsky V.I., Selkov E.E. Matematická biofyzika bunky. Moskva: Nauka, 1978.
4. Chernysh A.M. Biomechanika nehomogenít srdcového svalu. Moskva: Nauka, 1993.
5. Bendol J. Svaly, molekuly a pohyb. M.: Mir, 1989.
ODDIEL 3. BIOFYZIKA KOMPLEXNÝCH SYSTÉMOV
3.1. Modelovanie biofyzikálnych procesov.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
Ako dlho po injekcii zostane v krvi 10 % počiatočnej hmotnosti liečiva, ak je konštanta vylučovania k = 0,3 (1/hod)?
Exkréčné konštanty dvoch rôznych liečiv sa líšia dvojnásobne. Pre tieto dva prípady nakreslite kvalitatívne grafy zmien hmotnosti lieku v krvi počas injekcií. Koľkokrát sa rýchlosť vylučovania líši v čase t = O?
Po určitom čase po nakvapkaní pacienta (keď koncentrácia liečiva dosiahla stacionárnu úroveň) dostal injekciu. Nakreslite kvalitatívny graf zmeny hmotnosti lieku v priebehu času.
Modelové monitorovacie testy
3.1.1. Model dravec-korisť ukazuje, že populácie predátorov a koristi vykonávajú harmonické oscilácie. Sú frekvencie a fázy týchto kmitov rovnaké?
a. frekvencie sú rovnaké. fázy sú rovnaké
b. frekvencie sú rôzne d.fázy sú rôzne
1. av 2. bv 3. ag 4. bg
3.1.2. Aký model je vhodný na štúdium elektrogenézy v bunkách?
1. lipozóm 2. dvojvrstvová lipidová membrána
3. axón chobotnice 4. Frank model
3.2. Biofyzika obehového systému.
Kontrolné otázky, úlohy, zadania na semináre
Vzdelávací a metodický komplex v odbore "štátna regulácia hospodárstva"
Tréningový a metodologický komplex... vzdelávacie-metodickýkomplexnýnadisciplína"ŠTÁTNA REGULÁCIA HOSPODÁRSTVA" UFA -2007 Štátna regulácia ekonomiky: vzdelávacie-metodickýkomplexný... ekonomické vedy vzdelávacie-metodickýkomplexnýnadisciplína"Štát...
Vzdelávací a metodický komplex v odbore všeobecná odborná príprava "teória a metódy vyučovania biológie" odbor "050102 65 - biológia"
Tréningový a metodologický komplexvzdelávacie-metodickýkomplexnýnaTréningový a metodologický komplex
... __________________________________________________________ (Celé meno.) vzdelávacie-metodickýkomplexnýnadisciplína Organizácia počítačov a ... Samme G.V. vzdelávacie-metodickýkomplexnýnadisciplína Organizácia počítačov a systémov (názov disciplín) skompilovaný...
Polomer plavidla sa zmenšil na polovicu. Koľkokrát sa zmení objemová rýchlosť prietoku krvi pri konštantnom poklese tlaku?
Vypočítajte krvný tlak vo vzdialenosti 5 cm od začiatku cievy, ak je na začiatku cievy tlak 10 4 Pa, jej polomer je 1 mm, viskozita krvi je 0,005 Pa s, lineárna rýchlosť krv je 20 cm/s.
Koľkokrát sa zmení rýchlosť poklesu tlaku na začiatku diastoly, ak sa hydraulický odpor malých ciev zvýši o 20%?
Koľkokrát je hydraulický odpor úseku aorty (polomer aorty 1,25 cm) menší ako hydraulický odpor úseku tepny rovnakej dĺžky (polomer tepny 2,5 mm)? Viskozita krvi v tepne je 0,9 viskozity krvi v aorte.
Koľkokrát by sa mal krvný tlak zvýšiť na začiatku veľkej cievy, aby pri zúžení jej priesvitu o 30% tlak na výstupe z cievy a objemový prietok krvi zostali rovnaké? V neprítomnosti zúženia je pokles tlaku v nádobe 0,2 tlaku na začiatku nádoby.
v odbore biológia, kandidátka pediatrických vied, docentka Osipová I.V. metodický pokyny pre študenta naštudovať disciplínDisciplína"Metodika mimoškolských...
1. Experimenty Pfefer, Hardy-Fischer, Overton. Povaha bunkovej membrány a alternatíva k bunkovej membráne.
2. Metóda fluorescenčných sond pri štúdiu bunkových membrán.
3. Špecifická elektrická kapacita axónovej membrány, meraná intracelulárnou elektródou, bola 0,5 μF/cm2. pomocou vzorca pre plochý kondenzátor určte hrúbku hydrofóbnej vrstvy membrány. Ε lipidov sa považuje za rovné 2.
4. Mechanizmus tvorby akčného potenciálu kardiomycét.
5. Metóda spinových sond pri štúdiu bunkových membrán.
6. Akú vzdialenosť na povrchu membrány erytrocytov prekoná molekula fosfolipidu za 1 sekundu v dôsledku laterálnej difúzie? Koeficient laterálnej difúzie sa rovná 10 -12 m 2 /s. porovnajte s obvodom erytrocytu s priemerom 8 µm.
7. Štruktúra iónového kanála.
8.Metóda diferenciálnej mikrokalorimetrie.
9. Počas fázového prechodu membránových fosfolipidov z kvapalného kryštálového stavu do gélu sa mení hrúbka dvojvrstvy. Ako sa v tomto prípade zmení kapacita membrány?
10. Iónové kanály bunkových membrán.
11. Röntgenová štrukturálna analýza pri štúdiu bunkových membrán. Princípy a príklady.
12. Počas fázového prechodu membránových fosfolipidov z kvapalného kryštálového stavu do gélu sa mení hrúbka dvojvrstvy. Ako sa v tomto prípade zmení sila elektrického poľa v membráne?
13. Iónové prúdy v axóne. Model Hodgkin-Huxley.
14. Metódy štúdia priepustnosti membrán.
15. Pomocou spinovo značených fosfolipidových molekúl bol stanovený hrúbkový gradient viskozity v membráne. Opíšte experiment.
16.Mechanizmus tvorby akčného potenciálu.
17. Aplikácia konduktometrie pri štúdiu membrán. Frickeho experimenty.
18. Tam, kde je viskozita hydrofóbnej vrstvy vyššia: na povrchu membrány alebo v jej hrúbke. Ako sa inštaluje?
19. Distribúcia nervového impulzu pozdĺž excitabilného vlákna.
20. Elektrokinetické javy v bunkách a suspenziách.
21. Ako sa zmení uľahčená difúzia draselných iónov za účasti molekuly valinomycínu po fázovom prechode membránových lipidov z tekuto-kryštálového stavu do gélu?
22. Akčný potenciál. fyzikálny mechanizmus.
23. Elektrosmóza v živých bunkách a tkanivách.
24. Dôjde k osmotickému efektu (opuch v hypotonických a zvrásnenie v hypertonických roztokoch) pri akumulácii sodíkových iónov podľa schémy antiport?
25. Oddychový potenciál. Jeho povaha.
26. Podstata osmózy v živých bunkách.
27. Vyskytne sa osmotický efekt (opuch v hypotonických a zvrásnenie v hypertonických roztokoch) pri akumulácii sodíkových iónov podľa symportovej schémy?
28. Povaha bioelektrických potenciálov.
29. Bunka je ako osmometer. Príklad stanovenia izotonicity roztoku pomocou živých buniek.
30. Ukážte, že Nernst-Planckova rovnica je redukovaná na Fickovu rovnicu pre prípad difúzie nenabitých častíc.
31. Rozdiely medzi proteínovými kanálmi a lipidovými pórmi.
32. Povaha usadzovania mŕtvych buniek. Fyzikálne chemické základy metódy ESR.
33. Enzým Na + -K + - ATPáza v plazmatickej membráne erytrocytu absolvoval šesť cyklov. Koľko sodíkových a draselných iónov bolo aktívne transportovaných? Koľko energie sa minulo v tomto prípade, ak hydrolýzu jedného mólu ATP sprevádza uvoľnenie 33,6 kJ?. Predpokladá sa, že účinnosť väzby je 100 %.
34.mechanizmus priepustnosti membrán pre molekuly vody. Kink hypotéza.
35. NMR spektroskopia pri štúdiu membrán. Príklady a princípy.
36. V bunkových membránach sú známe tri iónové pumpy: sodík-draslík, protón a vápnik. Ako prebieha aktívny transport cukru a aminokyselín?
37. Model tvorby pórov počas fázového prechodu.
38. Metódy merania mikroviskozity v membránach.
39. Je možný súčasný transmembránový prenos iónov draslíka a sodíka podľa schémy symport?
40. elektrický rozklad membránových lipidov.
42.metódy spektrálnych sond.
43. Je možný súčasný transmembránový prenos iónov draslíka a sodíka podľa schémy antiport?
44. model kritického lipidového póru.
45. aplikácia iónovo selektívnych elektród pri štúdiu permeability membrán.
46.Je možný súčasný transmembránový prenos iónov draslíka a sodíka podľa schémy uniport?
47. lipidové póry vo svetle stability membrány.
48. metódy erytrogramov. ich informačnú hodnotu.
49. Aký transport iónov vytvára rozdiel membránového potenciálu: pasívny alebo aktívny?
50. Mechanizmus a vzorce sekundárneho aktívneho transportu iónov.
51. Experimentálne kritériá pre uľahčenú difúziu.
52. Aká je väčšia rýchlosť šírenia elektrického signálu po drôtoch námorného telegrafu alebo rýchlosť šírenia nervového vzruchu po axónovej membráne? prečo?
53. Elektrogénne iónové čerpadlá.
54. Metódy bunkovej frakcionácie.
55. Aký je biofyzikálny mechanizmus účinku lokálneho anestetika tetraylamónia?
56. Skúsenosti a schéma Ussinga.
57. Povaha síl interakcie lipid-lipid v membráne. Výskumné metódy.
Kalendárový tematický plán pre disciplínu
"Molekulárna organizácia biologických membrán"
akademický rok 2011/2012 ročník (4. ročník, 7. semester Celoruského biofyzikálneho ústavu)
dátum č. p / p Typ a názov vzdelávacieho modulu Edukačná a metodická podpora vzdelávacieho modulu PREDNÁŠKY: Biologické membrány ako univerzálne štruktúrne a funkčné útvary živých systémov. Zhrnutie prednášky. Štrukturálna organizácia biomembrán. Zhrnutie prednášky. Membránové proteíny a lipidy. Zhrnutie prednášky. Interakcie proteín-lipid. Zhrnutie prednášky. Dynamické vlastnosti membrán. Zhrnutie prednášky. Modelovanie štruktúry membrán. Zhrnutie prednášky. Výpočty membránových štruktúr Zhrnutie prednášky. CELKOM - 14 hodín Workshopy * Výpočty elektrickej kapacity a impedancie membrán. Počítačová trieda katedry. Stanovenie hrúbky membrány erytrocytov pomocou elektrickej vodivosti. Počítačová trieda katedry. Štúdium mechanickej pevnosti membrán erytrocytov. Počítačová trieda katedry. Štúdium vplyvu cholesterolu na deformovateľnosť membrán erytrocytov. Počítačová trieda katedry. Výpočty pevnosti membrán erytrocytov. Počítačová trieda katedry. Štúdium vplyvu magnetického poľa na mechanické vlastnosti membrán erytrocytov Počítačová trieda katedry. Celkom - 22 hodín * - každá praktická lekcia je koncipovaná na 4 hodiny.
Schválené na porade oddelenia ______________________________________________
1. Z toho sa usúdilo, že membrána erytrocytov pozostáva z lipidových molekúl usporiadaných v dvoch vrstvách.
Zdá sa, že tento záver Gortera a Grendela sa ukázal ako správny len vďaka vzájomnej kompenzácii chýb, avšak z historického hľadiska mala táto práca veľký význam, pretože odvtedy sa koncepcia lipidovej dvojvrstvy ako štrukturálneho základu biologického membrány sa stali dominantnými a v skutočnosti sa ukázali ako správne.
Koncept bimolekulárnej lipidovej membrány bol ďalej vyvinutý v modeli Devson-Danielli z roku 1935 alebo „sendvičovom“ modeli, v ktorom sa predpokladalo, že proteíny pokrývajú povrch lipidovej dvojvrstvy. Bol to nezvyčajne úspešný model a v priebehu nasledujúcich 30 rokov početné experimentálne údaje, najmä tie, ktoré boli získané pomocou röntgenovej difrakcie a elektrónovej mikroskopie, plne potvrdili jeho primeranosť. Zároveň sa však zistilo, že membrány vykonávajú obrovské množstvo funkcií a na vysvetlenie tohto javu bol pôvodný model Devson-Danielli opakovane upravovaný.
Rýchly pokrok v membránológii, ktorý viedol k vytvoreniu moderných konceptov, sa dosiahol najmä vďaka pokroku v štúdiu vlastností membránových proteínov. Štúdie elektrónového mikroskopu využívajúce metódu zmrazenia a šmyku ukázali, že guľovité častice sú vložené do membrán. Medzitým sa biochemikom pomocou detergentov podarilo oddeliť membrány do stavu funkčne aktívnych „častíc“. Spektrálne údaje ukázali, že membránové proteíny sú charakterizované vysokým obsahom a-helixov a že pravdepodobne skôr tvoria globule, než aby boli distribuované ako monovrstva na povrchu lipidovej dvojvrstvy. Nepolárne vlastnosti membránových proteínov naznačujú prítomnosť hydrofóbnych kontaktov medzi proteínmi a vnútornou nepolárnou oblasťou lipidovej dvojvrstvy. Zároveň boli vyvinuté metódy, ktoré umožnili odhaliť tekutosť lipidovej dvojvrstvy. Singer a Nicholson spojili všetky tieto nápady a vytvorili model tekutej mozaiky. V rámci tohto modelu je membrána reprezentovaná ako tekutá fosfolipidová dvojvrstva, v ktorej sú ponorené voľne difundujúce proteíny. Starý model Devson-Danielli bol statický a úspešne vysvetlil štrukturálne údaje dostupné v tom čase, získané v pomerne nízkom rozlíšení. Od roku 1970 sa zároveň veľká pozornosť venuje štúdiu dynamických vlastností a ich vzťahu k funkciám membrán. V posledných rokoch bol upravený aj model fluidnej mozaiky a tento proces bude pokračovať. Najmä sa teraz ukázalo, že nie všetky membránové proteíny voľne difundujú v kvapalnej lipidovej dvojvrstve. Existujú údaje o existencii laterálnych j-domén v samotnej membráne. Pozorne sa študuje aj úloha cytoskeletu. Je čoraz jasnejšie, že sa zdá, že niektoré časti membrán sa líšia štruktúrou od klasickej lipidovej dvojvrstvy. Napriek tomu v dohľadnej budúcnosti bude model tekutej mozaiky vo svojich rôznych modifikáciách slúžiť ako koncepčný základ pre mnohé membránové štúdie.
3. Morfológia membránPri objasňovaní morfológie membrán zohrali dôležitú úlohu dve metódy: röntgenová difrakcia a elektrónová mikroskopia. Práve s ich pomocou sa potvrdila správnosť dvojvrstvového modelu. Treba však mať na pamäti, že obe tieto metódy čelia mnohým obmedzeniam pri objasňovaní podrobného obrazu molekulárnej organizácie membrán.
3.1 Röntgenová difrakcia
Pri štúdiu vysoko usporiadaných kryštalických vzoriek pomocou metódy röntgenovej difrakcie je možné získať informácie o štruktúre s vysokým rozlíšením. V prípade zle objednaných preparátov sú možnosti tejto metódy obmedzené. Niektoré špecializované membránové systémy už majú pravidelnú štruktúru, a preto ich možno študovať röntgenovými difrakčnými metódami. Príkladom tohto druhu je myelínová pošva periférnych nervových vlákien; je to membrána, ktorá opakovane ovinie okolo axónu a vytvára pravidelný systém koncentrických membránových štruktúr. Röntgenové difrakčné štúdie na myelíne, uskutočnené v 30. rokoch 20. storočia, potvrdzujú primeranosť dvojvrstvového modelu membrán. K rovnakému záveru dospelo aj štúdium vonkajšieho segmentu tyčiniek sietnice stavovcov, ktoré sú prirodzenými usporiadanými membránovými systémami, ako aj umelo usporiadanými systémami, ktoré sa tvoria počas kolapsu membránových vezikúl získaných z mitochondrií a erytrocytov za podmienok centrifugácie. . Vo všetkých týchto prípadoch bolo pozorované podobné rozloženie hustoty elektrónov v membráne, ako je znázornené na obr. 1.4
Na interpretáciu údajov o röntgenovej difrakcii je potrebné určiť nielen intenzity odrazov, ale aj ich fázy. V prípade pravidelne naplnených membránových systémov je problém značne zjednodušený, pretože tieto systémy pozostávajú z opakujúcich sa prvkov so stredovou symetriou.
Zo získaných údajov vyplýva, že štruktúra všetkých membrán je podobná: majú hydrofóbnu vnútornú oblasť s nízkou hustotou elektrónov a dve vrstvy polárnych skupín s vysokou hustotou elektrónov. Údaje röntgenovej difrakcie získané pre rôzne membrány sa líšia len mierne, napriek veľkým rozdielom v ich obsahu proteínov. Hoci údaje o röntgenovej difrakcii poskytujú určité informácie o tom, ako sa väčšina membránových proteínov nachádza v membráne, vo všeobecnosti metóda röntgenovej difrakčnej analýzy neposkytuje podrobný molekulárny obraz.
Wilkins a ďalší v roku 1971 poznamenali, že rôntgenová difrakcia sa môže použiť aj na štúdium vodných disperzií membrán a fosfolipidov. V tomto prípade odrazy generované polárnymi oblasťami na oboch stranách dvojvrstvy umožňujú nájsť jej hrúbku rovnú vzdialenosti medzi polárnymi hlavami a vzdialenosť medzi týmito reťazcami možno určiť z odrazov generovaných usporiadanými uhľovodíkovými reťazcami. . Aj v tomto prípade membránové preparáty získané z rôznych zdrojov poskytli podobný difrakčný obrazec, čo potvrdzuje univerzálnosť dvojvrstvového modelu.
Nemožnosť získania podrobného molekulárneho vzoru pomocou difrakčnej metódy obmedzuje aplikáciu tejto metódy na štúdium biologických membrán. Môže však byť veľmi užitočný pri štúdiu usporiadaných lipidovo-vodných systémov.
3.2 Elektrónová mikroskopia
Transmisná elektrónová mikroskopia tenkých rezov myelínu a vlastne všetkých ostatných membrán odhaľuje charakteristickú trojvrstvovú štruktúru pozostávajúcu z dvoch elektrón-hustých pásov oddelených medzerou asi 80 A. Tento obraz sa získa do značnej miery ako výsledok ošetrenia prípravkov oxidom osmičelým, zvyčajne používaným pri tejto metóde. Robertson nazval pozorovanú štruktúru „unitárnou“, aby zdôraznil jej univerzálnosť, a hoci molekulárne mechanizmy farbenia membrány osmiom nie sú známe, táto štruktúra sa považovala za potvrdenie platnosti dvojvrstvového modelu membrány. Je však jasné, že membrány môžu byť nepriaznivo ovplyvnené počas prípravy vzoriek na transmisnú elektrónovú mikroskopiu. Najmä je známe, že pôsobenie oxidu osmičelého vedie k významnej strate proteínu z membrány erytrocytov. A hoci trojvrstvová štruktúra pozorovaná v tomto prípade do určitej miery odráža organizáciu dvojvrstvových membrán, touto metódou nemožno získať podrobnejšie informácie o lokalizácii proteínov.
Niektoré informácie o umiestnení membránových proteínov poskytli nové metódy, ktoré sa v súčasnosti stali „klasickými“ – metódy zmrazenia-štiepenia a zmrazenia-leptania. V týchto prípadoch sa prípravky rýchlo zmrazia bez toho, aby boli vystavené akýmkoľvek škodlivým účinkom, ako pri získavaní tenkých rezov. Proces prípravy liečiva zahŕňa nasledujúce operácie.
Po zmrazení sa vzorka, ktorá je suspenziou buniek alebo membrán, odreže nožom pri nízkej teplote vo vysokom vákuu. Sily vznikajúce pri sekaní vedú k vytvoreniu rezu, ktorý prechádza cez vzorku. Ukázalo sa, že keď rovina rezu prechádza cez membránu, táto sa rozdelí hlavne pozdĺž svojej strednej oblasti a rozdelí sa na dve polovice. V dôsledku toho je vnútorná oblasť membrány odkrytá na vytvorených štiepnych rovinách.
V prípade potreby sa vzorka podrobí leptaniu - zvyčajná sublimácia ľadu sa vykonáva vo vákuu. To umožňuje lepšiu vizualizáciu povrchových štruktúr bunkových membrán.
Potom sa získa takzvaná replika z exponovaného povrchu. Práve táto replika je študovaná pod elektrónovým mikroskopom. Na získanie repliky sa platina najskôr nanesie na vzorku pod uhlom asi 45°, aby sa odhalili topologické charakteristiky prípravku. Potom sa platinovej replike dodá mechanická pevnosť nanesením vrstvy uhlíka na ňu. Potom sa prípravok rozmrazí, replika vypláva nahor a zachytí sa pomocou špeciálnej siete.
Najcharakteristickejšími štruktúrami pozorovanými pri štúdiu membrán metódou štiepenia mrazom sú početné intramembránové častice s priemerom 80 až 100 Á, ležiace v rovine štiepenia membrán. Zvyčajne sú umiestnené náhodne, ale niekedy tvoria skupiny. Početné štúdie ukázali, že tieto častice sú pravdepodobne membránové proteíny. Je zvláštne, že elektrónová mikroskopia tenkých rezov takéto štruktúry neodhalí. Repliky získané z dvoch polovíc delenej membrány nie sú vždy topologicky komplementárne. To znamená, že niektoré častice sú viazané len na jednu z polovíc membrány. Údaje o zmrazení a štiepení boli široko používané Singerom a Nicholsonom pri vývoji modelu fluidnej mozaiky membrán, pretože presvedčivo ukázali, že globulárne proteíny sa nachádzajú nielen na povrchu membrány, ale aj vo vnútri dvojvrstvy.
Obrázok 1.6 ukazuje elektrónovú mikrosnímku prípravku proteolipozómov rekonštruovaných z vaječného fosfatidylcholínu a nefrakcionovaného prípravku proteínu pásu 3 z membrány ľudských erytrocytov; Prípravok bol získaný metódou zmrazovania-štiepenia.
Proteín pásu 3 je hlavnou proteínovou zložkou membrány erytrocytov a je známe, že transportuje anióny. Ak fosfolipidové vezikuly neobsahujú tento proteín, potom výsledné mrazené čipsové prípravky majú hladký povrch.
Po začlenení proteínu pásu 3 do fosfolipidových vezikúl sa na štiepeniach objavia intramembránové častice, ktoré sú prakticky nerozoznateľné od častíc pozorovaných v membránach erytrocytov. Navyše pri pH 5,5 častice viditeľné v membráne erytrocytov agregujú a táto agregácia sa uskutočňuje ako výsledok interakcie proteínu pásu 3 s dvoma ďalšími proteínmi, spektrínom a aktínom.
Posledne menované sú súčasťou cytoskeletu umiestneného na vnútornom povrchu membrány erytrocytov. Rekonštruovaný systém pozostávajúci z proteínu pásu 3 a fosfatidylcholínu sa správa podobne, pričom agregácia častíc sa pozoruje v prítomnosti spektrínu a aktínu pri pH 5,5, ale nie pri pH 7,6.
Tieto údaje ďalej posilnili koncepciu membránových proteínov ako globulárnych častíc voľne sa pohybujúcich v membránovej rovine. Zaujímavé je, že statické mikrofotografie preparátov získané metódou štiepenia mrazom pomohli výskumníkom pri štúdiu dynamických vlastností membrán. Ako uvidíme, v membránach je veľa bielkovín, ktoré nemôžu voľne plávať v lipidovom mori.
4. Izolácia membránPočas posledných troch desaťročí bolo čoraz jasnejšie, že prevažná väčšina bunkových funkcií sa vykonáva za priamej účasti membrán.
Rastlinné aj živočíšne bunky sú rozdelené do kompartmentov a mnohé cytoplazmatické organely, ako je znázornené v časti 1.1, sú membránovej povahy.
Okrem organel charakteristických pre väčšinu buniek existujú aj špecializované membránové systémy, ako je sarkoplazmatické retikulum svalových buniek, myelínový obal periférnych nervových vlákien, tylakoidné membrány chloroplastov a membrány diskov v tyčinkách sietnice. Prokaryotické organizmy majú tiež membrány, aj keď nie také vyvinuté ako eukaryotické.
Gram-pozitívne baktérie, ako je Bacillus subtilis, majú iba cytoplazmatickú membránu, zatiaľ čo gramnegatívne baktérie, ako je Escherichia coli, majú tiež vonkajšiu membránu umiestnenú na vrchole tenkej peptidoglykánovej bunkovej steny.
Niektoré špecializované organely sa našli aj v prokaryotických bunkách. Niektoré vírusy patogénne pre zvieratá, ako napríklad obalené vírusy, majú skutočnú membránu a ukázalo sa, že štúdium takýchto membrán je mimoriadne zaujímavé.
Štúdium membrán je spravidla spojené s ich čistením a každý typ membrány sa vyznačuje vlastnými podmienkami na preparatívnu izoláciu.
Takže, ak musíte študovať plazmatickú membránu akýchkoľvek buniek, potom musíte najskôr izolovať tieto bunky z tkaniva. Potom sa musia zvoliť optimálne podmienky na rozrušenie buniek a oddelenie požadovaných membrán od iných bunkových zložiek. Osobitnú pozornosť si zasluhujú kritériá čistoty izolovaných membrán.
4.1 Zničenie buniek
Je žiaduce zvoliť techniku, ktorá účinne ničí samotné bunky pri zachovaní štruktúry membrán, ktoré sa majú izolovať. Pre mnohé živočíšne bunky možno použiť relatívne šetrný postup, ako je homogenizácia v homogenizátoroch Downs alebo Potter-Elveheim so sklenenými stenami s teflónovým tĺčikom. V tomto prípade sú bunky zničené v dôsledku šmykových síl, ktoré vznikajú, keď je suspenzia pretláčaná cez úzku medzeru medzi teflónovým tĺčikom a sklenenou stenou homogenizátora. Pri tomto ošetrení sa plazmatická membrána „rozpadne“ a väzby medzi rôznymi organelami sa zničia, pričom sa zachová integrita samotných organel. Pomocou tohto postupu môžu byť od seba oddelené aj špecializované oblasti plazmatickej membrány, napríklad bazolaterálne alebo apikálne oblasti membrány epitelových buniek. Je žiaduce pracovať v podmienkach, kde je zachovaná integrita organel, aby sa minimalizovala možnosť uvoľnenia hydrolytických enzýmov a aby sa uľahčili následné operácie membránovej separácie.
Na deštrukciu buniek so stenou sú potrebné prísnejšie metódy. Niekedy sa bunky pred zničením najskôr ošetria enzýmami, ktoré rozložia zložky bunkovej steny, aby sa uľahčila jej následná deštrukcia. Napríklad ošetrenie pufrom Tris-EDTA a lyzozýmom sa používa na zničenie buniek E. coli. Prísnejšie techniky zahŕňajú trenie buniek, ich sonikáciu a vytláčanie. Brúsenie sa zvyčajne vykonáva v prítomnosti rôznych abrazívnych materiálov - piesku, oxidu hlinitého alebo sklenených guľôčok. Malé objemy materiálu je možné rozdrviť v mažiari, ale pre väčšie objemy je potrebné použiť špeciálne mechanické zariadenia. Bakteriálne bunky sú často zničené pomocou ultrazvuku. Predpokladá sa, že v tomto prípade k deštrukcii dochádza pôsobením šmykových síl vyplývajúcich z kavitácie. Rovnaké sily vznikajú, keď sa suspenzia buniek pretlačí cez malý otvor, napríklad keď sa bunky ničia pomocou francúzskeho lisu. Existuje mnoho druhov týchto metód a ich výber závisí od charakteristík membránového systému, ktorý sa má študovať.
Je potrebné poznamenať, že membránové fragmenty získané počas deštrukcie buniek zvyčajne spontánne vytvárajú vezikuly. Príkladom je:
1) mikrozómy odvodené z plazmatickej membrány, endoplazmatického retikula alebo špecializovaných systémov, ako je sarkoplazmatická membrána;
2) submitochondriálne častice z vnútornej mitochondriálnej membrány;
3) synaptozómy vznikajúce pri odtrhnutí nervových zakončení v oblasti synaptických kontaktov;
4) vezikuly bakteriálnej membrány vytvorené z plazmatickej membrány E. coli. Vezikuly sa tvoria aj z iných membránových systémov, napríklad z membrán Golgiho aparátu. Ich veľkosť vo väčšine prípadov silne závisí od spôsobu deštrukcie buniek. Toto je obzvlášť dôležité, pretože veľkosť vezikúl do značnej miery určuje rýchlosť ich sedimentácie počas odstreďovania a ich správanie v nasledujúcich fázach čistenia membrán. Niektoré membrány netvoria vezikuly, najmä membrány bočných povrchov živočíšnych buniek, ktoré sú vo vzájomnom kontakte. Keď sú takéto bunky zničené, odtrhne sa pár susedných fragmentov membrány, ktoré držia pohromade kontaktnou oblasťou. Prítomnosť takýchto kontaktov zabraňuje uzavretiu fragmentov do vezikúl, takže membrány sa uvoľňujú vo forme dosiek alebo pásikovitých štruktúr.
Veľký význam pri ničení buniek má aj správny výber média. Napríklad, aby sa membránové organely udržali uzavreté, malo by sa použiť médium, ktoré je izoosmotické k ich vnútornému obsahu. Najčastejšie sa na to používa roztok sacharózy v koncentrácii 0,25-0,30 M. V niektorých prípadoch je lepšie použiť sorbitol a manitol. Je potrebné poznamenať, že zachovanie izotonicity zohráva dôležitú úlohu aj v nasledujúcich fázach preparatívnej izolácie intaktných organel.
4.2 Separácia membrán
V súčasnosti sa na oddelenie membrán najčastejšie používa centrifugácia. Membránové častice možno klasifikovať podľa rýchlosti sedimentácie alebo hustoty vztlaku. Prvá metóda sa nazýva zonálna centrifugácia a separácia prebieha podľa hodnôt S a druhá metóda je izopyknická centrifugácia a separácia prebieha za podmienok hustoty rovnováhy. V praxi sa zvyčajne používa nejaký hybrid týchto dvoch metód. Obrázok 1.7 ukazuje polohu niektorých subcelulárnych jednotiek v rovine súradníc „S-g“.
Na vodorovnej osi sú sedimentačné koeficienty častíc a na osi y je hustota.
Princíp separácie rýchlosťou sedimentácie možno ľahko pochopiť porovnaním hodnôt S pre rôzne frakcie. Napríklad jadrá majú relatívne vysoké hodnoty S, t.j. rýchlosť ich sedimentácie je oveľa vyššia ako u väčšiny ostatných subcelulárnych organel. Jadrá môžu byť selektívne peletované centrifugáciou bunkového homogenátu, pričom všetky ostatné organely zostanú v supernatante. Súčasne nie je možné oddeliť hladké a drsné endoplazmatické retikulum pomocou zonálnej centrifugácie.
Rozdiely v ich hustote sa často používajú na izoláciu rôznych membránových frakcií z bunkového homogenátu. Na tento účel sa uskutočňuje odstreďovanie v hustotnom gradiente. Najčastejšie sa na vytvorenie gradientu hustoty používa sacharóza, ale táto metóda má vážne nevýhody. Na získanie hustoty potrebnej na oddelenie rôznych membránových frakcií je potrebné pripraviť roztoky s vysokou koncentráciou sacharózy, ktoré majú vysokú viskozitu a sú tiež hypertonické. Zavedenie subcelulárnych organel do hypertonického roztoku sacharózy vedie k ich dehydratácii a následné prispôsobenie roztoku izotonickým podmienkam je často sprevádzané lýzou a poškodením organel. Ďalším problémom je, že mnohé membránové organely sú priepustné pre sacharózu. Môže tiež viesť k osmotickej deštrukcii organel. Prienik sacharózy do separovateľných membránových organel môže zmeniť ich efektívnu hustotu.
Tabuľka 1.1. Fyzický čas čoraz viac využíva iné médiá na vytvorenie gradientu hustoty. Niektoré z týchto prostredí sú uvedené v tabuľke 1.1
Na vyriešenie týchto problémov sú posledné vlastnosti gradientových médií.
1. Ficoll. Vysokomolekulárny hydrofilný polymér sacharózy, z ktorého je možné získať roztoky C" s hustotou až 1,2 g/ml. Jeho hlavnou výhodou je nízky osmotický tlak roztokov v porovnaní s roztokmi s ekvivalentnou koncentráciou sacharózy. Vďaka tomu, je možné vytvárať roztoky, ktoré sú izotonické v celom rozsahu koncentrácií vďaka dodatočnému zahrnutiu sacharózy alebo fyziologicky prijateľných solí do média. Nevýhodou je vysoká viskozita výsledných roztokov a výrazne nelineárna závislosť viskozity a osmolarity na koncentrácie.
2. Metrizamid. Trijódsubstituovaná glukózabenzamid Roztoky metrizamidu majú vyššiu hustotu ako roztoky ficoll pri rovnakých koncentráciách. Hlavnou výhodou roztokov metrizamidu je ich veľmi nízka viskozita, ktorá umožňuje rýchlejšiu separáciu.35% roztok metrizamidu má takmer fyziologickú osmolaritu, takže väčšinu operácií počas membránovej separácie je možné vykonávať bez ich vystavenia hypertonickým roztokom. Metrizoát sodný je príbuzná zlúčenina s podobnými vlastnosťami ako metrizamid, len s tým rozdielom, že jeho roztok je izotonický v koncentrácii okolo 20 %. Metrizoát sodný sa používa predovšetkým na izoláciu intaktných buniek. Naidenz je tiež derivátom kyseliny trijódbenzoovej, ale má tri hydrofilné bočné reťazce. Pri odstreďovaní rýchlo vyvinie svoj vlastný hustotný gradient; Používa sa na izoláciu subcelulárnych organel.
Percoll. Koloidná suspenzia silikagélu potiahnutá polyvinylpyrolidónom. Tento povlak znižuje toxický účinok silikagélu. Hlavnou výhodou percoll je, že nepreniká biologickými membránami a jeho roztoky majú nízku viskozitu a nízku osmolaritu. Vzhľadom na veľkú veľkosť častíc vedie odstreďovanie roztoku Percoll miernou rýchlosťou k vytvoreniu hustotného gradientu. Preto k oddeleniu zvyčajne dochádza veľmi rýchlo. Médium použité na centrifugáciu môže byť izotonické v celom objeme v dôsledku zahrnutia solí alebo sacharózy v ňom. Nie je ťažké vytvoriť jemný gradient, ktorý umožňuje veľmi efektívnu separáciu membránových frakcií podľa ich vztlakovej hustoty.
Sorbitol a manitol. Tieto látky sa niekedy používajú namiesto sacharózy, pretože podľa publikovaných údajov prenikajú cez niektoré biologické membrány horšie ako sacharóza.
Všimnite si, že glycerol sa nepoužíva na vytvorenie hustotného gradientu, pretože nemôže dosiahnuť dostatočne vysoké hodnoty hustoty. Soli alkalických kovov, ako je CsCl, sa používajú iba vtedy, keď sa vyžadujú roztoky s vysokou hustotou. Treba však mať na pamäti, že pri koncentráciách potrebných na vytvorenie rovnovážnej hustoty majú tieto soli často škodlivý účinok na membránové organely.
Na izoláciu membrán z bunkových homogenátov sa používajú aj iné metódy, aj keď nie tak často ako centrifugácia.
1. Rozdelenie fáz. V tomto prípade dochádza k separácii membránových častíc v súlade s ich povrchovými vlastnosťami. Na tento účel sa vytvoria dve nemiešateľné vrstvy vodných roztokov rôznych vo vode rozpustných polymérov. Príkladmi sú zmesi polyetylénglykoldextránu a dextranfikolu. Membránové častice sa oddeľujú podľa ich afinity k týmto fázam. Posledne menované môžu byť zvolené tak, aby oddeľovali membrány ich povrchovým nábojom alebo hydrofóbnosťou.
Kontinuálna elektroforéza s voľným prietokom. V tomto prípade dochádza k separácii častíc v súlade s ich elektrickým nábojom. Liečivo, ktoré sa má rozdeliť, sa kontinuálne zavádza do tenkej vrstvy pufra stekajúcej po zvislej stene. V tomto prípade sa elektrické pole aplikuje kolmo na smer prúdenia. Elektroforetická separácia častíc teda prebieha cez prúdiaci tlmivý roztok, ktorý sa zhromažďuje na dne komory vo forme oddelených frakcií.
afinitná adsorpcia. Separácia je založená na biošpecifickej interakcii medzi zložkami membrány a tuhou fázou. S objavom monoklonálnych protilátok bolo možné vytvoriť preparatívne techniky založené na použití špecifických antigénnych zložiek na izoláciu membrán. Výsledné protilátky môžu byť kovalentne pripojené k pevnému nosiču a s ich pomocou uskutočniť špecifickú väzbu príslušných membrán. Najčastejšie sa táto metóda používa na izoláciu membránových proteínov. Jeden z problémov, ktoré tu vznikajú, súvisí s výberom podmienok membránovej elúcie, ktoré by nespôsobili denaturáciu proteínu.
Metóda založená na použití silikagélových mikrogranúl. Podiel plazmatických membrán zvyčajne nepredstavuje viac ako 1°7o celkovej hmotnosti všetkých membrán eukaryotických buniek. Preto je izolácia absolútne čistých plazmatických membrán spojená s veľkými ťažkosťami. Jeden prístup, ktorý bol vyvinutý špeciálne na izoláciu plazmatických membrán, je založený na použití kationizovaných mikroperličiek silikagélu. Tieto granuly sú silne adsorbované na vonkajšom povrchu plazmatickej membrány intaktných buniek a frakcia plazmatických membrán spojených s granulami je ľahko oddelená v hustotnom gradiente sacharózy od iných membrán v dôsledku vyššej hustoty granúl. Znakom tejto metódy je, že vo výslednom prípravku sa plazmatická membrána s vnútorným povrchom premení na roztok.
4.3 Kritériá čistoty pre membránové frakcie
Snáď najobjektívnejším kritériom pre čistotu izolovanej membránovej frakcie je prítomnosť nejakej jedinečnej zložky, ktorá je obsiahnutá iba v tejto membráne alebo v nej prevláda. Typicky sú takými zložkami enzýmy, ktoré sa v tomto prípade nazývajú markery. Zoznam markerových enzýmov, ktoré sa používajú na kontrolu čistoty membránových frakcií, je uvedený v tabuľke 1.2 Pri určovaní aktivity enzýmu treba vziať do úvahy, že môže byť v latentnej forme, napr. skutočnosť, že je lokalizovaná na vnútornom povrchu secernovaných membránových vezikúl. Ďalšie problémy spojené s hodnotením čistoty izolovaných membrán sú zvažované v prehľade. Treba poznamenať, že odporúčané metódy sú vo väčšine prípadov dobre vyvinuté a štandardizované.
V niektorých prípadoch sú vhodnejšie membránové markery nie enzýmy, ale špecifické receptory pre lektíny, hormóny, toxíny alebo protilátky. Ak sú skúmané systémy dobre charakterizované, potom možno čistotu membránovej frakcie posúdiť podľa jej proteínového zloženia stanoveného elektroforézou na polyakrylamidovom géli v prítomnosti dodecylsulfátu sodného. Napríklad vonkajšia membrána gramnegatívnych baktérií má charakteristickú sadu polypeptidov, ktoré nie sú prítomné v cytoplazmatickej membráne.
Tabuľka 1.2 Markery používané na kontrolu čistoty membránových frakcií izolovaných z buniek cicavcov "
Membránová frakcia markerový enzým Plazmatické membrány 5"-nukleotidáza Alkalická fosfodiesteráza Na * / K + -ATPáza (bazolaterálna-
epiteliálna membrána bunky) Adenylátcykláza (baz hepatocytová membrána) Aminopeptidáza (membrána epitel kefového lemu) Mitochondrie (vnútorné Cytochróm c oxidáza membrána) sukcinát-cytochróm c-oxido- reduktázy Mitochondrie (vonkajšie Monoaminooxidáza membrána) lyzozómy Kyslá fosfatáza 0-galaktosendáza Peroxizómy kataláza urátoxidáza D-aminokyselinová oxidáza Prístrojové membrány galaktozyltransferáza golgi Endoplazmatický Glukóza-6-fosfatáza retikulum Cholín fosfotransferáza NADPH-cytochróm c-oxido- reduktázy Cytosol laktátdehydrogenáza Ďalšie kritériá, ktoré možno použiť na posúdenie čistoty membrán, zahŕňajú ich morfológiu, ktorá sa zisťuje pomocou elektrónovej mikroskopie, a charakteristiky chemického zloženia. Napríklad frakcie predstavujúce plazmatickú membránu, Golgiho aparát alebo mitochondrie možno identifikovať podľa ich morfológie. V niektorých prípadoch je liek charakterizovaný obsahom cholesterolu v ňom. Napríklad mitochondriálne membrány obsahujú oveľa menej cholesterolu ako Golgiho a plazmatické membrány.
Molekuly detergentu na micelu. Vo výskume membrán sa používa pomerne obmedzený rozsah detergentov. V tabuľke. 1 sú uvedené tie, ktoré sa najčastejšie používajú na solubilizáciu a rekonštrukciu membrán. Tieto pracie prostriedky sa vyznačujú pomerne vysokými hodnotami CMC (10-4-10-2 M) a skutočnosťou, že patria do kategórie takzvaných mäkkých čistiacich prostriedkov, teda takých ...
Tvorba dvojvrstvy je špeciálna vlastnosť molekúl lipidov a je realizovaná aj mimo bunky. Najdôležitejšie vlastnosti dvojvrstvy: - schopnosť samozostavy - tekutosť - asymetria. 1.2. Hoci hlavné vlastnosti biologických membrán sú určené vlastnosťami lipidovej dvojvrstvy, väčšinu špecifických funkcií zabezpečujú membránové proteíny. Väčšina z nich preniká dvojvrstvou v podobe jedinej...
Štúdium proteínov obsiahnutých v plazmatickej membráne erytrocytov umožnilo formulovať nové predstavy o štruktúre membrán. Predovšetkým bol predpoklad, že aspoň niektoré membrány majú „kostru“. Membrána ľudských erytrocytov obsahuje päť hlavných proteínov a veľký počet vedľajších proteínov. Väčšina membránových proteínov sú glykoproteíny. Integrálne proteíny v membráne erytrocytov zahŕňajú glykoforín ("nosič cukru"). Jeho molekulová hmotnosť je 30 000; glykoforín obsahuje 130 aminokyselinových zvyškov a mnoho cukrových zvyškov, ktoré tvoria asi 60 % celej molekuly. Na jednom konci polypeptidového reťazca je hydrofilná hlava komplexnej štruktúry, ktorá zahŕňa až 15 oligosacharidových reťazcov, z ktorých každý pozostáva z približne 10 cukrových zvyškov. Na druhom konci polypeptidového reťazca glykoforínu je veľké množstvo zvyškov kyseliny glutámovej a kyseliny asparágovej (obr. 12-20), ktoré pri pH 7,0 nesú negatívny náboj. V strede molekuly, medzi dvoma hydrofilnými koncami, je úsek polypeptidového reťazca obsahujúci asi 30 hydrofóbnych aminokyselinových zvyškov. Na cukor bohatý koniec molekuly glykoforínu je lokalizovaný na vonkajšom povrchu erytrocytovej membrány a vyčnieva z nej vo forme kríka. Predpokladá sa, že hydrofóbna oblasť umiestnená v strede molekuly glykoforínu prechádza cez lipidovú dvojvrstvu a polárny koniec so záporne nabitými aminokyselinovými zvyškami je ponorený do cytosólu. Hlava glykoforínu bohatá na cukor obsahuje antigénne determinanty, ktoré určujú krvnú skupinu (A, B alebo O). Okrem toho má miesta, ktoré viažu niektoré patogénne vírusy.
Podiel ďalšej dôležitej bielkoviny membrány erytrocytov – spektrino – tvorí až 20 % z celkového množstva bielkovín v membráne.
Ryža. 12-20. Molekula glykoforínu v membráne erytrocytov. Rozvetvené sacharidové reťazce vyčnievajúce z membrány nesú špecifické miesta, ktoré určujú krvnú skupinu, ako aj miesta zodpovedné za väzbu určitých vírusov.
Tento periférny proteín sa nachádza na vnútornom povrchu membrány; je ľahké extrahovať. Molekula spektrínu pozostáva zo štyroch polypeptidových reťazcov, ktorých celková molekulová hmotnosť je približne 1 milión; tieto reťazce tvoria dlhé pružné tyče dlhé 100–200 nm. Väzbou na určité proteíny a lipidy na vnútornom povrchu membrány erytrocytov tvoria molekuly spektrínu flexibilnú mriežku, ktorá zjavne zohráva úlohu membránového skeletu. Aktínové mikrofilamenty sa tiež viažu na spektrín a je veľmi pravdepodobné, že spájajú spektrínové tyčinky navzájom. Môžeme teda povedať, že membrána erytrocytov má kostru alebo kostru, na ktorej sú naviazané špecifické lipidy a membránové proteíny (obr. 12-21).
Plazmatické membrány iných buniek majú zložitejšiu štruktúru.
Ryža. 12-21. Schematické znázornenie rezu membrány erytrocytov. Schéma ukazuje oligosacharidové "antény" tvorené membránovými glykoproteínmi a glykolipidmi, bočné oligosacharidové reťazce glykoforínu, ako aj kostrový základ spektrínových molekúl pripojených k vnútornému povrchu membrány, prepojených krátkymi aktínovými vláknami.
Na vonkajšom povrchu buniek v mnohých hustých tkanivách sa nachádza ďalší dôležitý glykoproteín, fibronektín (sek. 11.12), ktorý má vysokú adhéznu schopnosť a prípadne zabezpečuje adhéziu buniek rovnakého typu k sebe.
v opačnom smere
