V priebehu cytologickej štúdie sa študuje štruktúra buniek na detekciu malígnych, benígnych nádorov a lézií nenádorovej povahy. Hlavným účelom štúdie je potvrdiť alebo vyvrátiť skutočnosť malignity buniek odobratých na analýzu.

Metódy cytologického výskumu sú založené na štúdiu štruktúry buniek, bunkového zloženia tekutín a tkanív pod mikroskopom.

Existujú také metódy cytologických štúdií:

• svetelná mikroskopia;
• elektrónová mikroskopia;
• centrifugačná metóda. Používa sa, keď je potrebné oddeliť bunkové membrány od všeobecnej štruktúry;
• metóda značeného atómu. Používajú sa na štúdium biochemických procesov v bunkách: na tento účel sa do nich zavádza značený rádioaktívny izotop;
• celoživotné štúdium. Táto výskumná metóda umožňuje študovať dynamické procesy prebiehajúce v bunke.

Záver cytologickej štúdie je založený na znakoch zmien v cytoplazme, bunkovom jadre, jadrovo-cytoplazmatickom pomere, tvorbe komplexov a bunkových štruktúr.

Cytologický rozbor sa používa pri preventívnej prehliadke, na objasnenie diagnózy, pri operácii, na včasné odhalenie relapsov a kontrolu priebehu liečby.

Cytologické vyšetrenie náterov

Ako materiály na analýzu použite:

• tekutiny: moč, sekrét prostaty, spútum, výtery získané pri endoskopii rôznych orgánov, výtok z bradaviek, odtlačky a škrabance z ulceróznych a erodovaných povrchov, rany a fistuly, tekutina zo seróznych a kĺbových dutín;
• bodky: biologické materiály získané počas diagnostickej punkcie vykonanej tenkou ihlou;
• stery z dutiny a krčka maternice.

Väčšina týchto cytologických štúdií náterov sa vykonáva v prípade potreby na stanovenie a objasnenie diagnózy. Ale odporúča sa cytologické vyšetrenie steru z krčka maternice (Pap stear): raz ročne - pre ženy staršie ako 19 rokov, ktoré sú sexuálne aktívne; dvakrát ročne - ženy, ktoré užívajú hormonálnu antikoncepciu, mali genitálny herpes; viac ako dvakrát do roka – ženy, ktoré trpia neplodnosťou, krvácaním z maternice, obezitou, ktoré často striedajú sexuálnych partnerov, užívajú estrogény, ktoré majú bradavice na genitáliách, majú genitálny herpes.

Cytologické vyšetrenie krčka maternice

Na cytologické vyšetrenie krčka maternice sa pomocou špeciálnej drevenej špachtle odoberie ster z vonkajšej a vnútornej časti krčka maternice a z pošvových klenieb. Potom sa prenesie na sklo a zafixuje sa.

Cytologické vyšetrenie krčka maternice sa vykonáva na zistenie zmien rakovinových buniek a na záver lekár indikuje jednu z piatich fáz stavu buniek:

• štádium 1. Bunky s odchýlkami sa nenašli;
• štádium 2. Dochádza k malým zmenám v štruktúre buniek spôsobených zápalom vnútorných pohlavných orgánov. Tento stav buniek nespôsobuje strach, ale odporúča sa žene podstúpiť ďalšie vyšetrenie a liečbu;
• štádium 3. Bol zistený malý počet buniek so štrukturálnymi odchýlkami. V tomto prípade sa odporúča znova odobrať náter alebo vykonať histologické vyšetrenie zmeneného tkaniva;
• štádium 4. Nachádzajú sa jednotlivé bunky s malígnymi zmenami. Konečná diagnóza sa nevykonáva, je predpísané dodatočné vyšetrenie;
• štádium 5. V nátere sa našlo veľké množstvo rakovinových buniek.

Spoľahlivosť takejto cytologickej štúdie je vysoká, ale môže poskytnúť iba informácie o oblasti, z ktorej boli bunky odobraté na analýzu. Aby bolo možné posúdiť stav vajíčkovodov, vaječníkov, maternice, mali by ste absolvovať komplexné vyšetrenie.

Hlavnou črtou morfofunkčnej metódy na štúdium buniek je túžba pochopiť štrukturálny základ biochemických procesov, ktoré určujú danú funkciu, to znamená spojiť tieto procesy so špecifickými bunkovými štruktúrami.

Konečný cieľ tejto metódy je identický s tým, ktorý sleduje molekulárna biológia a bunková štrukturálna biochémia. Metódy, ktoré tieto vedy používajú na riešenie spoločného problému, sú však zásadne odlišné. Ak je v molekulárnej biológii a štruktúrnej biochémii nevyhnutnou podmienkou deštrukcia bunky a izolácia skúmanej štruktúry vo forme viac-menej čistej frakcie, potom v cytologických štúdiách je naopak zachovanie integrity bunka je podmienkou. V tomto prípade je potrebné usilovať sa o zníženie vonkajšieho rušenia na minimum a pokúsiť sa preskúmať štrukturálnu a biochemickú organizáciu určitých komponentov presne v medziach integrálneho bunkového systému.

Morfofunkčné štúdie sa v posledných desaťročiach rýchlo rozvíjali. V tom čase sa vyvinulo veľké množstvo zásadne nových metód na kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu bunkových štruktúr. Tento prístup úzko súvisí s novými odvetviami biologických vied a najmä s molekulárnou biológiou, čo podmieňuje veľmi významný prínos takýchto štúdií k pokroku v našich poznatkoch o všeobecných vzorcoch bunkovej organizácie.

elektrónová mikroskopia

Jednou z najbežnejších, ktorá sa stala klasickou metódou používanou v štrukturálnych a biochemických štúdiách, je metóda elektrónovej mikroskopie v jej rôznych modifikáciách. Tieto modifikácie sú spôsobené rôznymi prístupmi k analýze študovaných štruktúr a zvláštnosťami prípravy buniek na ultraštrukturálne štúdie. Vysoké rozlíšenie konvenčných transmisných (transmisných) mikroskopov umožňuje analyzovať nielen všetky organely jadrových a cytoplazmatických aparátov, ale aj niektoré štruktúry nachádzajúce sa na supramolekulárnej úrovni organizácie, napríklad podporné a kontraktilné mikrofibrily, mikrotubuly a niektoré multienzýmy. komplexy. V súčasnosti sa na štúdium buniek na systémovej a subsystémovej úrovni ich organizácie stále viac úspešne využíva metóda vysokonapäťovej elektrónovej mikroskopie. Vďaka oveľa vyššej energii prenikajúceho elektrónového lúča v porovnaní s transmisným elektrónovým mikroskopom umožňuje táto metóda pod mikroskopom študovať „hrubé“ rezy alebo dokonca celé rozprestreté bunky, čo umožňuje napr. systém submembránových fibríl bunkového povrchového aparátu ako celku.

Pri štúdiu funkcie povrchového aparátu bunky, vzťahu jednotlivých subsystémov povrchového aparátu jadra a radu ďalších otázok všeobecnej cytológie sa využíva metóda rastrovacej elektrónovej mikroskopie, ktorá umožňuje študovať tzv. povrch objektu v objeme, sa stáva podstatným.

Metóda štiepenia mrazom

Osobitné a zásadne dôležité miesto v cytologických štúdiách morfobiochemického smeru zaujíma metóda zmrazenia a štiepenia. Je to najšetrnejšia metóda prípravy biologických objektov na ultraštrukturálnu analýzu, t.j. spôsobuje minimálne zmeny v bunkových štruktúrach v porovnaní s ich prirodzeným stavom. Podstata metódy je nasledovná. Objekt je umiestnený v atmosfére tekutého dusíka, ktorá okamžite zastaví všetky metabolické procesy. Potom sa zo zmrazeného predmetu vyrábajú hranolky. Z povrchu čipov sa repliky získavajú nanesením kovového filmu na ne. Tieto filmy sa ďalej skúmajú pod elektrónovým mikroskopom. Výhodou metódy štiepenia zmrazením je, že rovina štiepenia zvyčajne prechádza cez hydrofóbnu fázu membrány, čo umožňuje študovať množstvo, veľkosť a usporiadanie integrálnych membránových proteínov na štiepeniach, teda priamo vnútorné membrány. morfobiochemická organizácia membrán. Metóda poskytla veľmi cenné výsledky pri štúdiu rôznych druhov membránových štruktúr a špeciálnych útvarov, napríklad určitých typov bunkových kontaktov.

Cytochemická metóda

Pre hlavnú úlohu štrukturálno-biochemického aspektu cytologických štúdií - objasnenie funkčného významu štruktúr prostredníctvom analýzy ich biochemickej organizácie - zohrávajú cytochemické metódy mimoriadne dôležitú úlohu. V súčasnosti sú neustále zdokonaľované ako z hľadiska presnej kvalitatívnej identifikácie chemických zlúčenín v skúmaných štruktúrach, tak aj z hľadiska ich kvantitatívneho hodnotenia. Pomocou špeciálnych prístrojov, ktoré umožňujú kvantitatívnu cytospektrofotometriu, je možné určiť obsah danej látky, ako je RNA a DNA, nielen v bunke ako celku, ale aj na úrovni jadrových či cytoplazmatických štruktúr. Vďaka interferenčnej mikroskopii je možné posúdiť celkové množstvo bielkovín v bunke a jej zmeny počas jej života.

Existuje metóda cytochemickej identifikácie enzýmov, ktorá umožňuje posúdiť nielen lokalizáciu a množstvo konkrétnej zlúčeniny v bunkových štruktúrach, ale aj procesy syntézy a intracelulárneho transportu týchto zlúčenín.

Cytochémia enzýmov je založená na princípe interakcie substrát-enzým s použitím markerových zlúčenín, ktoré v tomto prípade precipitujú. Určením lokalizácie a v niektorých prípadoch aktivity enzymatických systémov môžeme posúdiť lokalizáciu určitých biochemických procesov v bunkových štruktúrach.

Autorádiografia

Metóda autorádiografie, ako aj cytochémia enzýmov otvára možnosť štúdia intracelulárnej syntézy a transportu, no zároveň má ešte širšie možnosti. Metóda autorsko-diografie je založená na použití rádioaktívnych prekurzorov syntézy makromolekúl značených umelými izotopmi (3H, 14 C, 35 S atď.). Umožňuje nielen lokalizovať miesta syntézy určitých makromolekúl, ale aj sledovať špecifické cesty vnútrobunkového transportu týchto zlúčenín, poskytnúť relatívne kvantitatívne hodnotenie intenzity syntézy a rýchlosti pohybu makromolekúl v bunkových štruktúrach. Týmto spôsobom sa po prvý raz ukázal najmä pohyb RNA z jadra do cytoplazmy buniek, podrobne sa sledovala lokalizácia syntézy a transport intracelulárneho sekrétu v sekrečných bunkách a mnohé ďalšie skutočnosti dôležité pre všeobecnú cytológiu. boli odhalené. Vo svojom jadre je táto metóda jednou z najtypickejších metód charakteristických pre štrukturálne-biochemické smerovanie výskumu, pretože umožňuje priamo študovať procesy metabolizmu v intracelulárnych štruktúrach v integrálnej, nezničenej (ako v biochemických štúdiách) bunke. Podstata tejto metódy je založená na detekcii molekúl značených umelým izotopom pomocou fotografickej emulzie, ktorá pokrýva rezy buniek a tkanív fixované v rôznych časoch po zavedení značeného prekurzora.

Imunocytochemická metóda

V súčasnosti je možná aj veľmi presná kvalitatívna analýza jednotlivých proteínov bunkových štruktúr v rámci integrálneho bunkového systému. Takáto analýza sa uskutočňuje pomocou imunocytochemických metód. Podstata týchto metód spočíva v tom, že ako antigén slúži špecifický proteín, na ktorý sa v tele každého cicavca vytvárajú špecifické protilátky. Posledne menované sú kombinované s fluorescenčným farbivom alebo iným markerom. Potom sa študovaná bunka ošetrí sérom so značenými protilátkami. V tomto prípade sa špecifické označené protilátky viažu prísne selektívne na štruktúry obsahujúce študované proteíny. Touto metódou bola odhalená najmä lokalizácia hlavných a pomocných kontraktilných proteínov aktín-myozínového systému v submembránovom fibrilárnom aparáte buniek a ukázaná modifikácia ich distribúcie pri tvorbe mitotického aparátu a pri cytotómii. . Rovnaká metóda bola úspešne použitá na preukázanie platnosti modelu fluidnej mozaiky organizácie membrán.

Komplexné metódy bunkového výskumu

V poslednej dobe sa dosiahol obzvlášť veľký pokrok v štúdiu štruktúrnej a biochemickej organizácie buniek s komplexným využitím metód ultraštrukturálnej analýzy, cytochémie a metód autorádiografie. Tieto úspechy sú spôsobené najmä vývojom špeciálnych metód cytochémie a autorádiografie na ultraštrukturálnej úrovni, ktoré umožňujú priamo analyzovať metabolické procesy na uvedenej úrovni bunkovej organizácie, „štruktúrovať“ biochemické procesy a zistiť špecifický význam určité bunkové štruktúry.v samostatných väzbách zložitých procesov vnútrobunkového metabolizmu. V tomto ohľade sa nahromadil rozsiahly materiál o úlohe rôznych odrôd membránovej fázy cytoplazmy v syntetických anabolických procesoch a procesoch intracelulárneho katabolizmu.

Veľké úspechy sa dosiahli najmä v štúdiu organizácie a fungovania lyzozomálneho aparátu buniek. Pri štúdiu jadrového aparátu buniek sa získali dôležité nové skutočnosti. Pomocou cytochemických metód je možné identifikovať ribonukleoproteíny (RNP) a deoxyribonukleoproteíny (DNP) na ultraštrukturálnej úrovni a tým dosiahnuť významný pokrok v štúdiu organizácie transkripcie, dozrievania a intranukleárneho transportu rôznych typov RNP v eukaryotických bunkách. , a použitie elektrónovej autorádiografie umožnilo detailne popísať úlohu jednotlivých bunkových štruktúr v týchto procesoch. Napríklad bolo možné podrobne študovať funkciu jadierka a špecificky štruktúrovať procesy tvorby ribozomálnej RNA v ňom.

Takáto syntéza molekulárno-biologických a štruktúrno-biochemických aspektov a metód je veľmi typická aj pre vývoj mnohých ďalších dôležitých otázok o jemnej organizácii jednotlivých bunkových komponentov. Úzky vzťah medzi molekulárnobiologickou a morfobiochemickou cytologickou analýzou sa zároveň prejavuje nielen v syntéze konečných výsledkov, ale aj v ich interakcii v procese samotnej štúdie. Takáto interakcia sa uskutočňuje buď vykonávaním komplexných prác pomocou biochemických a cytologických metód odborníkmi, biochemikmi a cytológmi, alebo pomocou špeciálnych komplexných metód, ktoré sú na hranici biochemickej a cytologickej analýzy bunkových štruktúr.

Príkladom prvého druhu je kombinácia metód biochemickej izolácie bunkových komponentov s ich jemnou ultraštrukturálnou analýzou. Týmto spôsobom boli prvýkrát získané fotografie pracovných génov s identifikáciou DNA, RNA polymeráz a transkribovaných molekúl RNA na nich. Zlepšenie tejto metódy teraz umožňuje v niektorých prípadoch zohľadniť intenzitu transkripcie priamym počítaním počtu RNA polymerázových komplexov. Pomocou elektrónového mikroskopu môžete priamo študovať vzory replikácie DNA na biochemicky izolovaných, kruhových alebo lineárnych molekulách DNA. Metódy ultraštrukturálnej analýzy sú tiež široko používané pri imunocytochemickom štúdiu lokalizácie jednotlivých proteínov, v subčasticiach ribozómov, pri štúdiu rôznych úrovní organizácie DNP a v mnohých ďalších prípadoch.

Typickým príkladom špeciálne vyvinutých komplexných metód je hybridizácia DNA a RNA na rezoch. Jeho podstata je nasledovná. DNA, ktorá je súčasťou DNP celej bunky, je denaturovaná a potom spracovaná frakciami RNA označenými rádioaktívnymi izotopmi. Výsledkom je, že DNA autorádiograficky odhaľuje oblasti, ktoré sú komplementárne k daným frakciám RNA, t.j. miesta ich transkripcie, inými slovami, je možné presne určiť lokalizáciu určitých génov.

V rámci experimentálnej metódy sa študuje funkčná organizácia bunky ako celku alebo jej jednotlivých komponentov zmenou jej stavu pomocou vonkajšieho vplyvu. Pozorovaním zmien vitálnej aktivity bunky alebo jej zložiek je možné vyvodiť závery o určitých vlastnostiach študovaných mechanizmov. Tento druh metódy je v súčasnosti v niektorých úsekoch cytológie veľmi rozšírený a v niektorých jej oblastiach stále zaujíma dominantné postavenie cytofyziologický aspekt analýzy bunkových štruktúr.

To je práve stav problému transportnej funkcie povrchového aparátu bunky. Na jednej strane sa v štúdiu tejto problematiky dosiahol významný pokrok: na základe výsledkov cytofyziologickej analýzy bolo možné identifikovať odrody transmembránového transportu látok, charakterizovať rôzne vlastnosti transportných systémov. Na druhej strane, konečné riešenie otázky mechanizmov transmembránového transportu je možné len vtedy, ak sa objasní špecifická organizácia lipidovo-proteínového systému membrán a presná znalosť vlastností a úlohy zostávajúcich zložiek membrán. membránové transportné systémy, teda na úrovni štruktúrnej a biochemickej analýzy plazmatickej membrány a celého povrchového aparátu bunky.

Obmedzené možnosti cytofyziologického štúdia transmembránového transportu jasne demonštruje príklad stavu problematiky organizácie iónových kanálov, ktoré zohrávajú významnú úlohu v mnohých dôležitých procesoch, ako je napríklad šírenie nervu. impulz. Pomocou celého arzenálu rôznych cytofyziologických metód sa ukázalo, že v plazmatickej membráne sú špeciálne kanály pre ióny Na, K, Cl, ktoré sa líšia svojimi vlastnosťami. Špecifické znalosti o ich štruktúrnej organizácii sú však stále obmedzené nepriamymi údajmi o ich proteínovej povahe. Zdá sa teda, že riešenie otázky organizácie najmä iónových kanálov a membránových transportných systémov vo všeobecnosti patrí do rúk vedcov, ktorí sú zbehlí v štrukturálnych biochemických metódach, pretože v tomto prípade mnohé a veľmi cenné fakty získané v cytofyziologických štúdie sú len prvým fenomenologickým štádiom analýzy týchto všeobecných bunkových mechanizmov. Napriek tomu v určitých aspektoch štúdia bunky môže veľa dať cytofyziologický prístup.

Rôznorodosť metód cytofyziologických štúdií je v súčasnosti určovaná tak neustále sa zvyšujúcim arzenálom činidiel, ktoré sa objavujú u cytológov, ako aj používaním jemných metód na analýzu zmien, ku ktorým dochádza v dôsledku pôsobenia týchto činidiel na bunka. Ak skôr, na analýzu zmien v bunkách pod pôsobením vonkajších činidiel, také metódy známe fyziológom, ako je registrácia elektrických potenciálov, hodnotenie bunkového dýchania absorpciou kyslíka, kvantitatívne hodnotenie sorpcie farbiva, registrácia kvalitatívnych zmien vo farbení buniek atď. V súčasnosti sa na tieto účely čoraz viac používajú metódy charakteristické pre štrukturálny a funkčný smer: elektrónové mikroskopické štúdium ultraštrukturálnych zmien, autorádiografická analýza syntetických procesov atď.

Medzi činidlami používanými v experimentálnych štúdiách možno rozlíšiť dve hlavné skupiny. Prvú skupinu tvoria látky, ktorých „bod aplikácie“ vo vnútri bunky je viac-menej známy – ide o látky blokujúce jednotlivé články vnútrobunkového metabolizmu (napríklad aktinomycín D, ktorý inhibuje transkripciu, alebo puromycín, ktorý blokuje syntézu bielkovín, 2,4-dinitrofenol, ktorý rozpája dýchanie a oxidačnú fosforyláciu), látky, ktoré selektívne ničia určité bunkové štruktúry (napríklad kolchicín, ktorý ničí mikrotubuly, alebo cytochalazín B, ktorý pôsobí na mikrofibrily). Druhú skupinu tvoria činidlá tzv. komplexného účinku, ktoré celkovo menia metabolizmus buniek - teplotu, osmotický tlak, pH atď. Použitie takých činidiel, ako je napr. množstvo otázok týkajúcich sa konjugácie dýchania a fosforylácie v dýchacom reťazci mitochondrií; použitie inhibítorov syntézy RNA a proteínov umožnilo študovať niektoré väzby syntézy proteínov v ribozómoch a transkripčných procesov; pomocou kolchicínu a cytochalazínu bola objasnená úloha mikrotubulov a mikrofilamentov v procesoch intracelulárneho transportu.

Prostriedky druhej skupiny (komplexné pôsobenie) majú tú výhodu, že sú pre bunky akoby prirodzenejšie, pretože bunky v prirodzených podmienkach narážajú na podobné zmeny vonkajšieho prostredia. Zároveň ovplyvňujú takmer všetky aspekty bunkového metabolizmu, čo sťažuje analýzu zmien, ku ktorým v tomto prípade dochádza. Štúdium účinku takýchto činidiel na bunku má však nezávislý význam a je absolútne nevyhnutné pre štúdium mechanizmov adaptácie buniek na meniace sa faktory prostredia, čím sa rieši problém pomeru špecifických a nešpecifických procesov v reakcii buniek na vonkajšie vplyvy a iné podobné úlohy., ktoré zohrávajú dôležitú úlohu pri rozvíjaní problému bunkovej integrácie.

Pri štúdiu funkčnej organizácie buniek má veľký význam analýza mechanizmov interakcie jednotlivých bunkových systémov. V mnohých prípadoch je možné tento problém vyriešiť vytvorením špeciálnych experimentálnych modelov. Najtypickejšími príkladmi tohto druhu sú jadrové transplantácie v rôznych objektoch (prvoky, vajíčka obojživelníkov); hybridizácia somatických buniek; transplantácia bunkových častí u prvokov; výskum využívajúci množstvo ďalších mikrochirurgických techník vykonávaných na protozoologických objektoch a in vitro kultivovaných bunkách cicavcov.

Pomocou takýchto modelov sa študovali najdôležitejšie všeobecné cytologické problémy. Napríklad výsledky experimentov s transplantáciou jadier diferencovaných buniek obojživelníkov do vajíčka bez vlastného jadra boli jedným z najpresvedčivejších argumentov v prospech teórie diferenciálnej génovej aktivity. Podstatou toho druhého je konštatovanie štrukturálnej identity genómov diferencovaných buniek mnohobunkového organizmu. Z toho vyplýva zásadne dôležitá pozícia, že proces diferenciácie neprebieha nevratnými zmenami v dedičnom aparáte buniek, ale reguláciou aktivity súboru génov, ktorá je rovnaká pre všetky bunky daného organizmu.

Veľmi zaujímavé fakty sa našli na experimentálnom modeli na štúdium procesu dediferenciácie hybridnej bunky — kuracieho erytrocytu a cicavčej rakovinovej bunky. Zvláštnosť tohto heterokaryónu spočíva v tom, že pri splynutí kuracieho erytrocytu s rakovinovou bunkou nastáva hemoglobínová hemolýza a v cytoplazme rakovinovej bunky sa nachádza normálne, takmer úplne inaktivované jadro erytrocytu. Tu sa teda uskutočňuje transplantácia diferencovaného jadra do neobvyklých podmienok aktívnej cytoplazmy. Starostlivé pozorovania zmien v štruktúrnej organizácii týchto jadier ukázali, že v nových podmienkach dochádza k výraznému nárastu ich objemu. Proteíny pochádzajúce z cytoplazmy zohrávajú významnú úlohu pri opuchu jadier. Tieto vonkajšie zmeny v jadrovom aparáte erytrocytu odrážajú hlboké procesy reštrukturalizácie jeho vnútornej organizácie, čo vedie k obnoveniu transkripcie "kuracej" messenger RNA. K implementácii informácií v ňom obsiahnutých vo forme syntézy „kuracích“ proteínov však dochádza až vtedy, keď sa v jadrovom aparáte kuracích erytrocytov vytvorí jadierko a nezačne sa syntéza ribozomálnej RNA. Dôkladná analýza experimentálnych modelov teda ukázala prítomnosť komplexnej cytoplazmatickej kontroly nad aktivitou jadrového aparátu.

Pomocou experimentálnych modelov bolo možné vyriešiť množstvo ďalších dôležitých všeobecných cytologických problémov. Napríklad otázka mechanizmov pohybu anafázových chromozómov bola úspešne študovaná na natívnom mitotickom aparáte izolovanom z drvivých blastomér morského ježka a pracujúcom mimo bunky. Väčšinou na experimentálnych modeloch bolo možné stanoviť rozšírený všeobecný vzorec bunkovej organizácie, konkrétne absenciu rigidného princípu príčina-následok vo vzťahu komplexných intracelulárnych procesov. Ukázalo sa, že také viaczložkové procesy, ako je reprodukcia buniek, procesy syntézy a vnútrobunkový transport zlúčenín s vysokým obsahom polymérov atď., pozostávajú zo samostatných, relatívne autonómnych štádií, ktoré nie sú spojené rigidným kauzálnym vzťahom. Objasnenie tohto vzoru na jednej strane vytvára predpoklady na pochopenie mechanizmov úžasnej plasticity bunkovej organizácie. Na druhej strane, rovnaká pravidelnosť je základom pre štúdium mechanizmov integrácie takýchto procesov v integrálnom bunkovom systéme za normálnych podmienok.

V súčasnosti narastá počet a rôznorodosť experimentálnych modelov určených na riešenie určitých špecifických všeobecných cytologických problémov. To výrazne prispieva k pokroku v našom poznaní v relatívne slabo preštudovanej oblasti cytológie - mechanizmov interakcie a integrácie práce subcelulárnych systémov.

Je potrebné zdôrazniť, že špecifikom výskumu realizovaného v rámci experimentálneho prístupu k analýze vzorcov bunkovej organizácie je stále väčšie prehlbovanie kritérií a znakov, pomocou ktorých sa analyzujú integračné mechanizmy a špecifické funkcie jednotlivých Zároveň sa ukazuje, že úspešné riešenie úloh, ktorým takýto výskum čelí, je možné len so širokým zavedením metód štruktúrno-funkčného prístupu do praxe.

Podstatou komparatívnej cytologickej metódy výskumu vo všeobecnej cytológii je objasnenie všeobecných vzorcov bunkovej organizácie pomocou celej škály ich odrôd, ktoré vedcom poskytuje živá príroda. Porovnávacia metóda má dva aspekty. Na jednej strane sa tradične používa na identifikáciu súvisiacich vzťahov medzi jednotlivými typmi buniek (najmä pri jednobunkových organizmoch). Na základe takto vytvorenej fylogenetickej systematiky prokaryotických a nižších a vyšších eukaryotických buniek, realizovanej s použitím jemných cytologických kritérií, je možné sledovať tvorbu jednotlivých jednotlivých bunkových systémov a všeobecných mechanizmov regulácie a integrácie bunka ako integrálny systém. Príkladom tohto druhu aplikácie komparatívnej cytologickej analýzy v bunkovom výskume môžu byť zaujímavé údaje o jemnej organizácii jadrového aparátu v prokaryotických, nižších a vyšších eukaryotických bunkách.

Hlavnými znakmi organizácie jadrového aparátu eukaryotických buniek je prítomnosť komplexného povrchového aparátu jadra, výrazne väčšie množstvo DNA koncentrovanej v chromozómoch v porovnaní s prokaryotickými bunkami a napokon aj druh balenia DNA pomocou hlavné bielkoviny – históny.analýza jadrového aparátu nižších eukaryot umožnila medzi nimi identifikovať bunky, ktoré z hľadiska štruktúry jadra zaujímajú medzipolohu medzi pro- a eukaryotickými bunkami. Pancierové bičíkovce majú typický povrchový aparát jadra, ale ich chromozómy, podobne ako u prokaryotov, tvoria prstencové molekuly DNA, ktoré sú organizované do kompaktných štruktúr bez účasti histónov, charakteristických pre všetky eukaryoty.

V poslednej dobe, v súvislosti s objavením zásadných znakov v organizácii genómu pro- a eukaryotických buniek, prinieslo porovnanie procesov transkripcie a dozrievania RNA v týchto organizmoch, ako aj v mezokaryotoch a bunkách nižších eukaryotov. V dôsledku takýchto porovnaní môžu nastať významné zmeny v našich tradičných predstavách o príbuzenských vzťahoch v hlavných skupinách organizmov a najmä vo vzťahu medzi pro- a eukaryotickými bunkami.

Druhým príkladom tradičnej aplikácie evolučného prístupu k cytologickým problémom môžu byť pokusy navrhnúť hypotézu o komplikácii mechanizmov rovnako dedičnej distribúcie chromozómov medzi dcérskymi bunkami v procese evolúcie, vyvinutú na základe komparatívneho analýza mnohých variantov chromozómovej divergencie u prvokov a nižších rastlín. V týchto prípadoch sa membrány jadrového obalu aktívne podieľajú na procesoch segregácie chromozómov, čo umožňuje určitú homológiu s prokaryotickými bunkami, v ktorých hrá bunková membrána vedúcu úlohu v rovnomernej distribúcii sesterských chromozómov medzi dcérskymi bunkami. .

Napokon, široko akceptovaná symbiotická hypotéza pôvodu mitochondrií a chloroplastov môže slúžiť ako tretí príklad tradičného evolučného prístupu k všeobecným cytologickým problémom. Jeho podstata spočíva v predpoklade, že tieto dôležité organely energetického metabolizmu vzišli z prokaryotických organizmov, ktoré napadli eukaryotické bunky v pomerne skorom štádiu eukaryotického vývoja.

Napriek dôležitosti tohto druhu všeobecných biologických konštrukcií pre rozvoj všeobecnej cytológie má tradičný historický prístup k vývoju všeobecných cytologických problémov v súčasnosti stále dosť obmedzené využitie. Jednou z hlavných príčin tohto stavu je prítomnosť špecifických a stále nedostatočne prebádaných čŕt evolučného procesu na bunkovej a subcelulárnej úrovni organizácie, čo mimoriadne sťažuje určenie vzťahu medzi jednotlivými skupinami jednobunkových organizmov a následne , konštrukcia rozumných evolučných nyh hypotéz v oblasti všeobecnej cytológie.

V súčasnosti je rozšírenejší iný aspekt používania komparatívnej cytologickej metódy, ktorý nesleduje cieľ priameho objasnenia historickej podmienenosti konkrétnej bunkovej štruktúry alebo procesu. V modernej všeobecnej cytológii prešiel tento aspekt aplikácie porovnávacej metódy viacerými modifikáciami.

V prvej fáze, počas zavádzania zásadne nových morfobiochemických metód do praxe cytologickej analýzy, bol výber predmetu štúdia určený nasledujúcimi úvahami. Po prvé, záležalo na vhodnosti tohto alebo toho objektu pre aplikáciu použitej metódy. Po druhé, dôležitú úlohu zohral stupeň expresie tohto znaku v skúmanej bunke. Takže na štúdium všeobecných vzorcov organizácie eukaryotických buniek boli obľúbeným objektom cicavčie pečeňové bunky s ich harmonicky vyvinutým systémom membránových organel.

Pre komplexné cytologické a molekulárne biologické štúdie organizácie prokaryotických buniek bola široko používaná Escherichia coli; Modelmi na štúdium organizácie nižších eukaryotov boli kvasinky a plesne. Zároveň sa ukázalo, že zákonitosti stanovené na týchto objektoch majú univerzálny význam, pretože v mnohých prípadoch sú vo všetkých eukaryotických alebo všetkých prokaryotických bunkách zásadne podobné. Okrem toho sa množstvo vzorov subcelulárnej organizácie, najmä na molekulárnej a supramolekulárnej úrovni, ukázalo ako univerzálnych pre bunky pro- aj eukaryotického typu (organizácia membrán, princíp štruktúry ribozómov atď.), a to aj napriek skutočnosť, že tieto typy buniek sa od seba v niektorých ohľadoch zásadne líšia. Táto okolnosť viedla k myšlienke, že je možné rozvinúť hlavné všeobecné cytologické problémy na obmedzenom rozsahu objektov, ktoré sú metodicky vhodné, a potom rozšíriť zavedené vzorce na ďalšie bunky v dôsledku ich zásadne podobnej organizácie.

V posledných rokoch sa však takéto zjednodušené používanie komparatívneho prístupu začalo kritizovať, pretože moderné cytologické metódy sa zavádzajú do špeciálnych biologických vied o bunke - konkrétne cytológie, protozoológie, botaniky nižších rastlín. Morfobiochemická analýza aplikovaná v týchto oblastiach vedy umožnila zistiť fakty, ktoré svedčia o obrovskej rôznorodosti špecifickej implementácie tej či onej spoločnej črty bunkovej organizácie, diverzita je oveľa väčšia, než vyplýva z výsledkov získaných skôr na „modeli“. „predmety. Táto rozmanitosť je obzvlášť veľká na najvyšších podsystémoch a systémových úrovniach bunkovej organizácie. Je typický aj pre také zložité a viaczložkové procesy, akými sú procesy vnútrobunkového metabolizmu a transportu či rovnomerné dedičné rozloženie genetického materiálu pri delení buniek.

Zovšeobecnenie veľkého porovnávacieho cytologického materiálu, získaného na úrovni moderných metodologických možností, nás prinútilo opustiť vyššie uvedenú zjednodušenú predstavu o úlohe porovnávacej metódy. V tomto smere vo všeobecnej cytológii (najmä pokiaľ ide o eukaryotické bunky) dominantné postavenie získava myšlienka potreby použiť komparatívnu metódu na analýzu jednotlivých bunkových systémov alebo procesov podobných funkčnej aktivite vo všetkých rôznorodosť ich prejavov v špecifických bunkách.RES nie je spôsobená „typickými“, „priemernými“ bunkami, ale naopak bunkami, ktoré sa výrazne odchyľujú od priemerného typu organizácie, buniek, v ktorých sú určité znaky hypertrofované.

Najväčší počet takýchto „únikových“ variantov sa nachádza medzi bunkami vyšších mnohobunkových organizmov, kde je vyvinutá ďalekosiahla špecializácia buniek ako súčasti jednotlivých tkanivových systémov. Prípady „odklonu“ od stredného typu sú rozšírené aj medzi vyššími prvokmi, ktoré prešli evolúciou, pričom si zachovali jednobunkovú úroveň organizácie. Práve počas štúdia tohto druhu atypických buniek bolo možné odhaliť veľké množstvo nových zaujímavých faktov, ktoré výrazne prehĺbili naše chápanie všeobecných zákonitostí bunkovej organizácie a jej evolučnej plasticity, ktorá určuje pozorovanú diverzitu bunkových systémov. . Zároveň, ako už bolo uvedené vyššie, v prípade špeciálnych vied je najväčší záujem o špecifický prejav spoločných znakov charakteristických pre všetky bunky v rôznych objektoch.

Na rozdiel od špeciálnych vied so všeobecným cytologickým prístupom je táto otázka postavená v trochu inej rovine, pretože výskumník sa snaží zistiť, ako rozšírené sú špecifické prejavy tohto znaku v rôznych bunkách, aká kombinácia všeobecných mechanizmov a aké presne je to kvôli. Protozoológom sa napríklad podarilo objaviť veľmi zaujímavú dynamiku tvorby makronukleusu po konjugácii v gastrociliárnych ciliátoch. Vo vznikajúcom makronuklee dochádza k výraznému zvýšeniu množstva DNA a potom sa pozoruje prudké zníženie dedičného materiálu (až o 93 %). Takýto proces redukcie genetického materiálu prebieha aj v somatických bunkách mnohých skupín mnohobunkových živočíchov (niektorý hmyz, háďatká). Zvyšná DNA, v celkovom množstve malá, ale obsahujúca všetky informácie potrebné pre fungovanie makronuklea, sa mnohokrát replikuje. V dôsledku toho vzniká definitívny makronukleus, ktorý sa od mikrojadra líši nielen množstvom DNA, ale aj kvalitatívnym zložením. Absentuje tu prevažná väčšina nefunkčných génov, pričom funkčné lokusy sú zastúpené značným počtom kópií.

Tieto fakty vyvolávajú veľký všeobecný cytologický záujem práve preto, že tu pozorované javy spravidla nie sú len paradoxnými znakmi charakteristickými len pre vyššie jednobunkové organizmy. Procesy polytenizácie, selektívnej replikácie jednotlivých úsekov chromozómovej DNA a napokon aj selektívnej redukcie významných úsekov genómu – všetky tieto javy prebiehajú aj v špecializovaných bunkách mnohobunkových organizmov. Vykonávajú sa pravdepodobne na základe spoločných elementárnych mechanizmov. A špecifickosť zložitého procesu zmien v jadrovom aparáte počas tvorby makronuklea u gastrociliátov je spôsobená najmä zvláštnou kombináciou všeobecných, univerzálnych elementárnych mechanizmov pre eukaryotické bunky. Myšlienky tohto druhu sú teraz široko používané vo všeobecnej cytológii. Sú to mimoriadne stimulujúce riadené porovnávacie cytologické štúdie venované objasneniu dôležitých všeobecných cytologických problémov. materiál zo stránky

Príkladom cielenej komparatívnej cytologickej štúdie je štúdium mechanizmu rovnomernej dedičnej distribúcie chromozómov počas mitózy u eukaryotov pomocou analýzy mitózy rôznych typov rozsievok: na týchto objektoch je na rozdiel od typických mitóz buniek metazoa možné jednoznačne morfologicky vysledovať komplexné zmeny v organizujúcich centrách mikrotubulov, vznik a vzájomnú divergenciu mikrotubulárnych polovretieňov, divergenciu chromozómov k pólom bunky pomocou vzniku v metafáze zvláštnej štruktúry - goliera.

Vo svetle najnovších údajov o vedúcej úlohe mechanochemického systému tubulín-dyneín v anafázovom pohybe chromozómov v bunkách metazoa je veľmi pravdepodobné, že tento systém je prítomný aj v rozsievkach, t. j. aj tu existuje len jedna zvláštna kombinácia elementárnych mechanizmov spoločných pre všetky bunky a spôsobujúcich mechanochemické procesy počas mitózy.

Je zrejmé, že pre analýzu týchto mechanizmov, ktorých objasnenie je jedným z najnaliehavejších problémov všeobecnej cytológie, by bolo sľubné mať taký objekt, kde by boli jasne diferencované a morfologicky vyjadrené.

Počet takýchto príkladov neustále rastie. Dôvodom je na jednej strane neustále sa rozširujúce zavádzanie zložitých moderných metód do praxe jednotlivých cytologických, protozoologických a botanických štúdií, na druhej strane hromadenie faktov v samotných komparatívnych cytologických štúdiách, ktoré sa čoraz viac stávajú dôležité pre všeobecnú cytológiu a sú v centre jej pozornosti. A to všetko zase vedie k tomu, že porovnávacia cytologická analýza začína zaujímať mimoriadne dôležité miesto v cytológii.

Stručný popis hlavných smerov a aspektov moderného všeobecného cytologického výskumu ukazuje, že v tomto štádiu vývoja cytológie existuje pomerne jasné rozlíšenie jednotlivých oblastí a ich syntéza. Rozdiel je v metodologickom aj logickom riešení konkrétnych problémov stanovených v každom zo smerov a prístupov. V morfofunkčnom aspekte cytologických štúdií dominuje diskrétny prístup k analýze bunkových štruktúr. Jednou z najdôležitejších vlastností experimentálneho prístupu k štúdiu vzorcov bunkovej organizácie je zameranie sa na analýzu všeobecných integračných mechanizmov organizácie bunkových systémov a celej bunky. Zároveň, ako už bolo zdôraznené vyššie, riešenie problémov, ktorým takéto štúdie čelia, nie je možné bez širokého používania metód, ktoré sú vlastné morfofunkčnému prístupu. Experimentálna analýza poskytuje fenomenologickú charakterizáciu vlastností určitých bunkových mechanizmov a vnútrobunkových procesov, čím vytvára nevyhnutný základ pre aplikáciu bohatého arzenálu štrukturálnych a biochemických metód.

V súčasnom štádiu vývoja všeobecnej cytológie sú teda predpoklady pre veľmi úzku kombináciu týchto dvoch aspektov cytologických štúdií. Je to prirodzené, keďže v konečnom dôsledku oba prístupy sledujú rovnaký cieľ – objasniť funkčnú organizáciu bunkových štruktúr a mechanizmy regulácie procesov v integrálnom bunkovom systéme.

Porovnávací cytologický prístup k analýze všeobecných cytologických problémov zaujíma v modernej všeobecnej cytológii osobitné postavenie. Porovnávacia cytologická analýza sa vykonáva na základe údajov získaných na základe morfofunkčných a experimentálnych prístupov, t.j. metodicky všetky hlavné aspekty cytologických štúdií navzájom úzko súvisia.

Špecifikom komparatívneho cytologického prístupu, špecifickosťou, ktorá určuje jeho osobitné postavenie, je cieľavedomé využitie rôznych objektov voľne žijúcich živočíchov na štúdium všeobecných zákonitostí organizácie jednotlivých bunkových štruktúr, vnútrobunkových procesov a integračných mechanizmov v celej rozmanitosti ich prejavov v rôzne typy buniek.

Takže, ako je zrejmé z vyššie uvedeného, ​​hlavné smery cytologického výskumu do značnej miery určujú špecifiká súčasného štádia vývoja všeobecnej cytológie a určujú jej úzky vzťah s príbuznými biologickými vedami. Jednou z najcharakteristickejších čŕt tejto etapy je úzke prepojenie všetkých najdôležitejších oblastí cytologického výskumu v metodologickom zmysle. Navyše takáto metodická integrácia často presahuje rámec všeobecnej cytológie.

V cytologickej práci sú široko používané čisto biochemické a molekulárno-biologické metódy a naopak, v biochemických a molekulárno-biologických štúdiách sú široko používané cytologické morfologické metódy. Metodická integrácia príbuzných vied a jednota ich konečných cieľov viedli k vytvoreniu novej syntetickej vedy o bunke – bunkovej biológie. Spája cytológiu, štrukturálnu biochémiu, molekulárnu biológiu, molekulárnu genetiku a súkromné ​​biologické vedy o bunkovej úrovni organizácie. Takéto spojenie príbuzných vied je nepochybne progresívnym javom. Napriek takejto syntéze si však každá z vied zachováva svoje metodologické špecifiká a špecifiká vo formulácii a metódach rozvíjania problémov bunkovej organizácie. Dominantné postavenie v tejto syntetickej vede má v súčasnosti výskum v molekulárnobiologickej a molekulárne genetickej oblasti. Táto situácia je spôsobená rýchlym pokrokom našich vedomostí o nižších úrovniach bunkovej organizácie, ale je to len dočasný jav.

V skutočnosti by popredné miesto v novej syntetickej vede o bunke mala zaujať všeobecná cytológia - veda o všeobecných vzorcoch bunkovej úrovne organizácie živej hmoty. Z moderných biologických vied zaoberajúcich sa touto úrovňou organizácie živej hmoty je všeobecná cytológia, rozširujúca účelový komparatívny cytologický prístup založený na štruktúrnych biochemických metódach, najviac pripravená na hlbokú všeobecnú biologickú generalizáciu obrovského množstva faktografického materiálu na diskrétnej analýze jednotlivé -ny bunkové štruktúry v početných varietách buniek. Vedúce postavenie by mala zaujať všeobecná cytológia v analýze všeobecných mechanizmov bunkovej integrácie. Dôležitým predpokladom je rýchly vývoj nových experimentálnych modelov. Ich hĺbková analýza modernými metódami a rozsiahle zavádzanie experimentálnych modelov v cielených komparatívnych cytologických štúdiách by mali zabezpečiť pokrok v riešení jedného z hlavných problémov bunkovej organizácie – problému bunkovej integrácie.

S nahromadením faktografického materiálu o základných univerzálnych mechanizmoch bunkovej integrácie a rozsahu ich modifikácií stojí všeobecná cytológia pred úlohou vykonať hĺbkovú analýzu historickej podmienenosti organizácie jednotlivých bunkových systémov a bunkovej organizácie. ako celku, ako aj špecifiká evolučného procesu na bunkovej a subcelulárnej úrovni organizácie živej hmoty. Riešenie tohto problému je uľahčené tendenciou, ktorá sa teraz jasne objavuje vo všeobecných cytologických štúdiách, kombinovať diskrétnu analýzu jednotlivých zložiek bunky so štúdiom jej kg. na kompletný systém.

Na tejto stránke sú materiály k témam:

Plán:

1. Čo študuje cytológia.

2. Myšlienka, že organizmy sa skladajú z buniek.

3. Metódy výskumu používané v cytológii.

4. Frakcionácia buniek.

5. Rádiová autografia.

6. Stanovenie dĺžky trvania niektorých štádií bunkového cyklu autorádiografiou.

Cytológia je veda o bunke. Z prostredia iných biologických vied vyčnieval takmer pred 100 rokmi. Po prvýkrát boli zovšeobecnené informácie o štruktúre buniek zozbierané v knihe J.-B. Carnoyova Biológia bunky, publikovaná v roku 1884. Moderná cytológia študuje štruktúru buniek, ich fungovanie ako elementárnych živých systémov: študuje sa funkcie jednotlivých bunkových zložiek, procesy reprodukcie buniek, ich opravy, adaptácia na podmienky prostredia a mnohé ďalšie procesy, ktoré umožňujú posúdiť vlastnosti a funkcie spoločné pre všetky bunky. Cytológia berie do úvahy aj štrukturálne znaky špecializovaných buniek. Inými slovami, moderná cytológia je fyziológia buniek. Cytológia je úzko spätá s vedeckými a metodologickými výdobytkami biochémie, biofyziky, molekulárnej biológie a genetiky. To poslúžilo ako základ pre hĺbkové štúdium bunky už z hľadiska týchto vied a pre vznik určitej syntetickej vedy o bunke - bunkovej biológie, alebo bunkovej biológie. V súčasnosti sa pojmy cytológia a bunková biológia zhodujú, keďže predmetom ich štúdia je bunka s vlastnými vzorcami organizácie a fungovania. Disciplína "Bunková biológia" sa vzťahuje na základné časti biológie, pretože skúma a opisuje jedinú jednotku všetkého života na Zemi - bunku.

Dlhé a podrobné štúdium bunky ako takej viedlo k formulácii dôležitého teoretického zovšeobecnenia všeobecného biologického významu, konkrétne k vzniku bunkovej teórie. V 17. storočí Robert Hooke, fyzik a biológ s veľkou vynaliezavosťou, vytvoril mikroskop. Pri skúmaní tenkej časti korku pod mikroskopom Hooke zistil, že pozostáva z malých prázdnych buniek oddelených tenkými stenami, ktoré, ako už vieme, pozostávajú z celulózy. Tieto malé bunky nazval bunky. Neskôr, keď iní biológovia začali skúmať rastlinné tkanivá pod mikroskopom, ukázalo sa, že malé bunky, ktoré našiel Hooke v mŕtvom vysušenom korku, sa nachádzajú aj v živých rastlinných tkanivách, ale nie sú prázdne, ale každá obsahuje malé želatínové teliesko. . Po mikroskopickom skúmaní živočíšnych tkanív sa zistilo, že pozostávajú aj z malých želatínových teliesok, ale že tieto telá sú od seba oddelené stenami len zriedkavo. Výsledkom všetkých týchto štúdií bolo, že v roku 1939 Schleiden a Schwann nezávisle sformulovali bunkovú teóriu, ktorá uvádza, že bunky sú elementárne jednotky, z ktorých sú v konečnom dôsledku postavené všetky rastliny a všetky živočíchy. Dvojitý význam slova bunka ešte nejaký čas spôsoboval nedorozumenia, no potom sa v týchto malých rôsolovitých telách pevne zakorenil.

Moderné chápanie bunky úzko súvisí s technickým pokrokom a vylepšeniami výskumných metód. Okrem konvenčnej svetelnej mikroskopie, ktorá nestratila svoju úlohu, získala v posledných desaťročiach veľký význam polarizačná, ultrafialová, fluorescenčná a fázovo kontrastná mikroskopia. Medzi nimi osobitné miesto zaujíma elektrónová mikroskopia, ktorej rozlíšenie umožnilo preniknúť a študovať submikroskopickú a molekulárnu štruktúru bunky. Moderné výskumné metódy umožnili odhaliť detailný obraz bunkovej organizácie.

Každá bunka pozostáva z jadra a cytoplazmy, oddelených od seba a od vonkajšieho prostredia membránami. Zložky cytoplazmy sú: membrána, hyaloplazma, endoplazmatické retikulum a ribozómy, Golgiho aparát, lyzozómy, mitochondrie, inklúzie, bunkové centrum, špecializované organely.

Časť organizmu, ktorá vykonáva určitú funkciu, sa nazýva orgán. Každý orgán – napríklad pľúca, pečeň, obličky – má každý svoju špeciálnu štruktúru, vďaka ktorej hrá v tele určitú úlohu. Rovnakým spôsobom existujú v cytoplazme špeciálne štruktúry, ktorých zvláštna štruktúra im umožňuje vykonávať určité funkcie potrebné pre metabolizmus buniek; tieto štruktúry sa nazývajú organely ("malé orgány").

Objasnenie povahy, funkcie a distribúcie cytoplazmatických organel sa stalo možným až po rozvoji metód modernej bunkovej biológie. Najužitočnejšie v tomto smere boli: 1) elektrónová mikroskopia; 2) bunková frakcionácia, pomocou ktorej môžu biochemici izolovať relatívne čisté frakcie buniek obsahujúce určité organely, a tak študovať jednotlivé pre nich zaujímavé metabolické reakcie; 3) autorádiografia, ktorá umožnila priame štúdium jednotlivých metabolických reakcií vyskytujúcich sa v organelách.

Metóda, ktorou sa izolujú organely z buniek, sa nazýva frakcionácia. Táto metóda sa ukázala ako veľmi plodná a dala biochemikom možnosť izolovať rôzne bunkové organely v relatívne čistej forme. Umožňuje tiež určiť chemické zloženie organel a v nich obsiahnutých enzýmov a na základe získaných údajov vyvodiť závery o ich funkciách v bunke. Ako prvý krok sa bunky zničia homogenizáciou v nejakom vhodnom médiu, ktoré zachováva organely a zabraňuje ich agregácii. Veľmi často sa na to používa roztok sacharózy. Hoci mitochondrie a mnohé ďalšie bunkové organely zostávajú nedotknuté, spleti membrán, ako je endoplazmatické retikulum a plazmatická membrána, sú fragmentované. Výsledné fragmenty membrány sa však často uzatvárajú do seba, výsledkom čoho sú zaoblené bubliny rôznych veľkostí.

V ďalšom štádiu sa bunkový homogenát podrobí sérii centrifugácií, ktorých rýchlosť a trvanie sa zakaždým zvýši; tento proces sa nazýva diferenciálna centrifugácia. Rôzne bunkové organely sa ukladajú na dno centrifugačných skúmaviek pri rôznych rýchlostiach centrifugácie v závislosti od veľkosti, hustoty a tvaru organel. Výsledná zrazenina sa môže odobrať a preskúmať. Väčšie, hustejšie štruktúry, ako sú jadrá, sa zrážajú najrýchlejšie, zatiaľ čo menšie, menej husté štruktúry, ako sú vezikuly endoplazmatického retikula, vyžadujú vyššiu rýchlosť a dlhší čas. Preto sa pri nízkych rýchlostiach odstreďovania zrážajú jadrá, zatiaľ čo ostatné bunkové organely zostávajú v suspenzii. Pri vyšších rýchlostiach sa zrážajú mitochondrie a lyzozómy a pri dlhom odstreďovaní a veľmi vysokých rýchlostiach sa vyzrážajú aj malé častice, ako sú ribozómy. Precipitáty je možné skúmať pomocou elektrónového mikroskopu na stanovenie čistoty výsledných frakcií. Všetky frakcie sú do určitej miery kontaminované inými organelami. Ak je napriek tomu možné dosiahnuť dostatočnú čistotu frakcií, potom sa tieto podrobia biochemickej analýze, aby sa určilo chemické zloženie a enzymatická aktivita izolovaných organel.

Pre napredovanie histológie, cytológie a embryológie má veľký význam zavádzanie výdobytkov fyziky a chémie, nové metódy príbuzných vied - biochémia, molekulárna biológia, genetické inžinierstvo.

Moderné výskumné metódy umožňujú študovať tkanivá nielen ako celok, ale aj z nich izolovať jednotlivé typy buniek, aby mohli dlhodobo študovať ich životnú aktivitu, izolovať jednotlivé bunkové organely a ich makromolekuly (napríklad DNA) a študovať ich funkčné vlastnosti.

Takéto možnosti sa otvorili v súvislosti s vytvorením nových prístrojov a technológií - rôzne typy mikroskopov, počítačová technika, röntgenová difrakčná analýza, využitie nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR), rádioaktívne izotopy a autorádiografia, elektroforéza a chromatografia, frakcionácia bunkového obsahu pomocou ultracentrifugácie, separácie a kultivácie buniek, získanie hybridov; využitie biotechnologických metód – získavanie hybridómov a monoklonálnych protilátok, rekombinantnej DNA a pod.

Biologické objekty je teda možné študovať na tkanivovej, bunkovej, subcelulárnej a molekulárnej úrovni. Napriek zavedeniu rôznych biochemických, biofyzikálnych, fyzikálnych a technologických metód do prírodných vied nevyhnutných na riešenie mnohých problémov súvisiacich s vitálnou aktivitou buniek a tkanív zostáva histológia v podstate morfologickou vedou s vlastným súborom metód. Tieto umožňujú charakterizovať procesy prebiehajúce v bunkách a tkanivách, ich štrukturálne vlastnosti.

Hlavnými fázami cytologickej a histologickej analýzy sú výber predmetu štúdie, jeho príprava na vyšetrenie pod mikroskopom, použitie mikroskopických metód a kvalitatívna a kvantitatívna analýza obrazov.

Predmetom štúdia sú živé a fixované bunky a tkanivá, ich obrazy získané vo svetelných a elektrónových mikroskopoch alebo na televíznej obrazovke. Existuje množstvo metód, ktoré umožňujú analýzu týchto objektov.

Metódy mikroskopie histologických preparátov

Hlavnými metódami štúdia biologických mikroobjektov sú svetelná a elektrónová mikroskopia, ktoré sú široko používané v experimentálnej a klinickej praxi.

Mikroskopia je hlavnou metódou štúdia mikroobjektov používaných v biológii už viac ako 300 rokov. Od vzniku a používania prvých mikroskopov sa neustále zdokonaľovali. Moderné mikroskopy sú rôzne zložité optické systémy s vysokým rozlíšením. Veľkosť najmenšej štruktúry, ktorú je možné vidieť pod mikroskopom, je určená najmenšou rozlíšiteľnou vzdialenosťou (d o ), ktorá závisí najmä od vlnovej dĺžky svetla. (\) a vlnové dĺžky elektromagnetických kmitov toku elektrónov atď. Táto závislosť je približne určená vzorcom d 0 = 1 / 2 \. Čím je teda vlnová dĺžka menšia, tým menšia je rozlíšiteľná vzdialenosť a tým menšie sú mikroštruktúry, ktoré možno v prípravku vidieť. Na štúdium histologických preparátov sa používajú rôzne typy svetelných mikroskopov a elektrónových mikroskopov.

Ryža. 1. Mikroskopy pre biologický výskum.

A - svetelný biologický mikroskop "Biolam-S": 1 - základňa; 2 - držiak rúrky; 3 - naklonená trubica; 4 - okulár, 5 - revolver; 6 - šošovky; 7 - tabuľka; 8 - kondenzátor s irisovou clonou; 9 - skrutka kondenzátora; 10 - zrkadlo; 11 - mikrometrová skrutka; 12 - makrometrická skrutka. B - elektrónový mikroskop EMV-100AK s automatizovaným systémom spracovania obrazu: 1 - stĺpec mikroskopu (s elektrónovo-optickým systémom a kamerou na vzorky); 2 - ovládací panel; 3 - kamera s luminiscenčnou obrazovkou; 4 - blok analýzy obrazu; 5 - snímač video signálu.

Svetelná mikroskopia. Na štúdium histologických mikroobjektov sa používajú bežné svetelné mikroskopy a ich odrody, ktoré využívajú svetelné zdroje s rôznymi vlnovými dĺžkami. V konvenčných svetelných mikroskopoch je zdrojom osvetlenia prirodzené alebo umelé svetlo (obr. 1, A). Minimálna vlnová dĺžka viditeľnej časti spektra je približne 0,4 µm. Preto je pre bežný svetelný mikroskop najmenší vzdialenosť rozlíšenia je približne 0,2 µm ( d o = "/, - 0,4 μm = 0,2 μm) a celkové zväčšenie (súčin zväčšenia šošovky a zväčšenia okuláru) môže byť 1500-2500.

Vo svetelnom mikroskope tak možno vidieť nielen jednotlivé bunky s veľkosťou od 4 do 150 mikrónov, ale aj ich vnútrobunkové štruktúry – organely, inklúzie. Na zvýšenie kontrastu mikroobjektov sa používa ich farbenie.

ultrafialová mikroskopia. Ide o typ svetelnej mikroskopie. Ultrafialový mikroskop využíva kratšie ultrafialové lúče s vlnovou dĺžkou asi 0,2 µm. Rozlíšená vzdialenosť je tu 2-krát menšia ako v bežných svetelných mikroskopoch a je približne 0,1 μm (d o = V2 - 0,2 μm = 0,1 μm). Obraz získaný v ultrafialových lúčoch, okom neviditeľný, sa premení na viditeľný registráciou na fotografickej doske alebo pomocou špeciálnych zariadení (luminiscenčná obrazovka, elektrón-optický konvertor).

Fluorescenčná (luminiscenčná) mikroskopia. Fenomén fluorescencie spočíva v tom, že atómy a molekuly množstva látok pohlcujúcich krátkovlnné lúče prechádzajú do excitovaného stavu. Spätný prechod z excitovaného stavu do normálneho stavu nastáva pri emisii svetla, ale s dlhšou vlnovou dĺžkou. Vo fluorescenčnom mikroskope sa ako svetelné zdroje na excitáciu fluorescencie používajú ortuťové alebo ultravysokotlakové xenónové výbojky, ktoré majú vysoký jas v spektrálnej oblasti 0,25-0,4 μm (blízko ultrafialových lúčov) a 0,4-0,5 μm (modrofialové lúče). ). Vlnová dĺžka fluorescenčnej svetelnej vlny je vždy väčšia ako vlnová dĺžka excitačného svetla, preto sa oddeľujú pomocou svetelných filtrov a obraz objektu sa študuje iba vo fluorescenčnom svetle. Rozlišujte medzi vlastnou alebo primárnou a indukovanou alebo sekundárnou fluorescenciou. Každá bunka živého organizmu má svoju vlastnú fluorescenciu, ale často je extrémne slabá.

Serotonín, katecholamíny (adrenalín, noradrenalín) obsiahnuté v nervových, žírnych a iných bunkách majú primárnu fluorescenciu po fixácii tkaniva v parách formaldehydu pri 60-80 °C (Falkova metóda).

Sekundárna fluorescencia nastáva, keď sú prípravky ošetrené špeciálnymi farbivami - fluorochrómmi.

Existujú rôzne fluorochrómy, ktoré sa špecificky viažu na určité makromolekuly (akridínová oranž, rodamín, fluoresceín atď.). Napríklad pri spracovaní prípravkov sa najčastejšie používa fluorochróm akridínová oranž. V tomto prípade sú DNA a jej zlúčeniny v bunkách jasne zelené a RNA a jeho deriváty - jasne červená žiara. Spektrálne zloženie žiarenia teda nesie informáciu o vnútornej štruktúre objektu a jeho chemickom zložení. Variant metódy fluorescenčnej mikroskopie, pri ktorej dochádza k excitácii aj emisii fluorescencie v ultrafialovej oblasti spektra, sa nazýva metóda ultrafialová fluorescenčná mikroskopia.

Fázová kontrastná mikroskopia. Táto metóda sa používa na získanie kontrastných obrazov priehľadných a bezfarebných živých predmetov, ktoré sú bežnými mikroskopickými metódami neviditeľné. Ako už bolo spomenuté, v bežnom svetelnom mikroskope sa potrebný kontrast štruktúr dosiahne farbením. Metóda fázového kontrastu poskytuje kontrast študovaných nefarbených štruktúr vďaka špeciálnej prstencovej membráne umiestnenej v kondenzore a takzvanej fázovej platni umiestnenej v objektíve. Táto konštrukcia optiky mikroskopu umožňuje previesť okom nevnímané fázové zmeny svetla prechádzajúceho cez nezafarbený preparát na zmenu jeho amplitúdy, t.j. jas výsledného obrazu. Zvýšenie kontrastu vám umožní vidieť všetky štruktúry, ktoré sa líšia indexom lomu. Variantom metódy fázového kontrastu je metóda kontrast fázy-tmavého poľa, poskytnutie negatívneho oproti pozitívnemu fázovému kontrastnému obrazu.

Mikroskopia v tmavom poli. V mikroskope v tmavom poli sa k objektívu dostane len svetlo, ktoré ohýba štruktúry v preparáte. To sa deje v dôsledku prítomnosti špeciálneho kondenzátora v mikroskope, ktorý osvetľuje prípravok prísne šikmým svetlom; lúče z iluminátora smerujú zboku. Pole teda vyzerá tmavo a malé častice v prípravku odrážajú svetlo, ktoré potom vstupuje do šošovky. Rozlíšenie tohto mikroskopu nemôže byť lepšie ako rozlíšenie mikroskopu vo svetlom poli, pretože sa používa rovnaká vlnová dĺžka. Ale je tu väčší kontrast. Používa sa na štúdium živých objektov, autorádiografických objektov, ako sú strieborné zrná, ktoré sa v tmavom poli javia ako svetlé. Na klinike sa používa na štúdium kryštálov v moči (kyselina močová, oxaláty), na preukázanie spirochét, najmä treponema pallidum, ktorý spôsobuje syfilis atď.

interferenčnej mikroskopie. Druhy mikroskopu s fázovým kontrastom sú interferenčný mikroskop, ktorý je určený na kvantifikáciu hmoty tkaniva, a diferenciálny interferenčný mikroskop (s optikou Nomarsky), ktorý sa špecificky používa na štúdium povrchového reliéfu buniek a iných biologických objektov.

V interferenčnom mikroskope je lúč svetla z iluminátora rozdelený do dvoch prúdov: jeden prechádza objektom a mení fázu oscilácie, druhý prechádza obchádzaním objektu. V hranoloch objektívu sú oba lúče spojené a navzájom sa rušia. V dôsledku toho sa vytvorí obraz, v ktorom sa kontrastne líšia úseky mikroobjektu rôznej hrúbky a hustoty. Po kvantifikácii zmien stanovte koncentráciu a hmotnosť sušiny.

Mikroskopy s fázovým kontrastom a interferenčné mikroskopy umožňujú študovať živé bunky. Využívajú interferenčný efekt, ktorý nastáva, keď sa spoja dve sady vĺn na vytvorenie obrazu mikroštruktúr. Výhodou fázového kontrastu, interferencií a mikroskopie v tmavom poli je schopnosť pozorovať bunky v procese pohybu a mitózy. V tomto prípade je možné zaznamenať pohyb buniek pomocou časozberného mikrofilmovania (snímka po snímke).

polarizačná mikroskopia. Polarizačný mikroskop je modifikácia svetelného mikroskopu, v ktorej sú nainštalované dva polarizačné filtre - prvý (polarizačný) medzi svetelným lúčom a objektom a druhý (analyzátor) medzi šošovkou objektívu a okom. Svetlo prechádza cez prvý filter len jedným smerom, druhý filter má hlavnú os, ktorá je kolmá na prvý filter, a neprepúšťa svetlo. To vytvára efekt tmavého poľa. Oba filtre je možné otáčaním meniť smer svetelného lúča. Ak je analyzátor otočený o 90° vzhľadom na polarizátor, neprenikne cez ne žiadne svetlo. Štruktúry obsahujúce pozdĺžne orientované molekuly (kolagén, mikrotubuly, mikrofilamenty) a kryštalické štruktúry (v Leydigových článkoch 1) sa javia ako svietiace pri zmene osi rotácie. Schopnosť kryštálov alebo parakryštalických útvarov rozdeliť svetelnú vlnu na obyčajnú vlnu a na ňu kolmú vlnu sa nazýva dvojlom. Túto schopnosť majú fibrily priečne pruhovaných svalov.

Elektrónová mikroskopia. Veľkým krokom vpred vo vývoji mikroskopickej techniky bolo vytvorenie a využitie elektrónového mikroskopu (pozri obr. 1, B). Elektrónový mikroskop využíva prúd elektrónov s kratšími vlnovými dĺžkami ako svetelný mikroskop. Pri napätí 50 000 V je vlnová dĺžka elektromagnetických kmitov vznikajúcich pohybom prúdu elektrónov vo vákuu 0,0056 nm. Teoreticky sa vypočítalo, že rozlíšiteľná vzdialenosť za týchto podmienok môže byť približne 0,002 nm alebo 0,000002 um, t.j. 100 000 krát menej; než vo svetelnom mikroskope. V praxi je v moderných elektrónových mikroskopoch rozlíšiteľná vzdialenosť asi 0,1-0,7 nm.

V súčasnosti sú široko používané transmisné (transmisné) elektrónové mikroskopy (TEM) a skenovacie (skenovacie) elektrónové mikroskopy (SEM). Pomocou TEM možno získať len rovinný obraz skúmaného mikroobjektu. Na získanie priestorovej reprezentácie štruktúr sa používajú SEM, ktoré dokážu vytvoriť trojrozmerný obraz. Rastrovací elektrónový mikroskop pracuje na princípe skenovania skúmaného objektu elektrónovou mikrosondou, teda ostro zaostreným elektrónovým lúčom postupne „ohmatáva“ jednotlivé body povrchu. Na štúdium vybranej oblasti sa mikrosonda pohybuje po jej povrchu pôsobením vychyľovacích cievok (princíp televízneho skenovania). Takéto skúmanie objektu sa nazýva skenovanie (čítanie) a vzor, ​​po ktorom sa mikrosonda pohybuje, sa nazýva raster. Výsledný obraz sa zobrazí na televíznej obrazovke, ktorej elektrónový lúč sa pohybuje synchrónne s mikrosondou.

Hlavnými výhodami rastrovacej elektrónovej mikroskopie sú veľká hĺbka ostrosti, široký rozsah kontinuálnych zmien zväčšenia (od desiatok až po desaťtisíckrát) a vysoké rozlíšenie.

Mraziaca elektrónová mikroskopia- štiepkovanie používa sa na štúdium detailov štruktúry membrán a medzibunkových spojení. Bunky sa zmrazia pri nízkej teplote (-160 °C), aby sa vytvorili čipy. Pri skúmaní membrány prechádza rovina štiepenia stredom lipidovej dvojvrstvy. Ďalej sa na vnútorných povrchoch získaných polovíc membrán ukladajú kovy (platina, paládium, urán), študujú sa pomocou TEM a mikrofotografie.

Metóda kryoelektrónovej mikroskopie. Rýchlo zmrazená tenká vrstva (asi 100 nm) vzorky tkaniva sa umiestni na mikroskopickú mriežku a skúma sa pod mikroskopom vo vákuu pri -160 °C.

Metóda elektrónovej mikroskopie „zmrazenie- leptanie" Používa sa na štúdium vonkajšieho povrchu bunkových membrán. Po rýchlom zmrazení buniek pri veľmi nízkej teplote sa blok rozštiepi čepeľou noža. Výsledné ľadové kryštály sa odstránia sublimáciou vody vo vákuu. Potom sa oblasti buniek zatienia naprašovaním tenkého filmu ťažkého kovu (napríklad platiny). Metóda umožňuje odhaliť trojrozmernú organizáciu štruktúr.

Metódy zmrazenia-štiepenia a zmrazenia-leptania teda umožňujú študovať nefixované bunky bez toho, aby sa v nich vytvárali fixáciou indukované artefakty.

Metódy kontrastu so soľami ťažkých kovov umožňujú študovať jednotlivé makromolekuly - DNA, veľké proteíny (napríklad myozín) v elektrónovom mikroskope. Pri negatívnom kontraste sa študujú agregáty makromolekúl (ribozómy, vírusy) alebo proteínových filamentov (aktínové filamenty).

Elektrónová mikroskopia ultratenkých rezov získaných kryoultramikrotómiou. Pri tejto metóde sa kúsky tkaniva bez fixácie a zaliatia do pevných médií rýchlo ochladia v tekutom dusíku pri teplote -196 °C. To poskytuje inhibíciu metabolických procesov buniek a prechodu vody z kvapalnej fázy do pevnej. Ďalej sa bloky režú na ultramikrotóme pri nízkej teplote. Táto metóda delenia sa zvyčajne používa na stanovenie aktivity enzýmov, ako aj na vykonávanie imunochemických reakcií. Na detekciu antigénov sa používajú protilátky spojené s časticami koloidného zlata, ktorých lokalizáciu je možné na prípravkoch ľahko identifikovať.

Metódy ultravysokonapäťovej mikroskopie. Používajú sa elektrónové mikroskopy s urýchľovacím napätím do 3 000 000 V. Výhodou týchto mikroskopov je, že umožňujú skúmať predmety s veľkou hrúbkou (1-10 μm), keďže pri vysokej energii elektrónov sú objektom menej absorbované. Stereoskopické zobrazovanie umožňuje získať informácie o trojrozmernej organizácii intracelulárnych štruktúr s vysokým rozlíšením (asi 0,5 nm).

Röntgenová difrakčná analýza. Na štúdium štruktúry makromolekúl na atómovej úrovni sa používajú metódy využívajúce röntgenové žiarenie s vlnovou dĺžkou asi 0,1 nm (priemer atómu vodíka). Molekuly, ktoré tvoria kryštálovú mriežku, sa študujú pomocou difrakčných vzorov, ktoré sa zaznamenávajú na fotografickú platňu vo forme mnohých škvŕn rôznej intenzity. Intenzita škvŕn závisí od schopnosti rôznych objektov v poli rozptyľovať žiarenie. Poloha škvŕn v difrakčnom obrazci závisí od polohy objektu v systéme a ich intenzita udáva jeho vnútornú atómovú štruktúru.

Metódy štúdia fixných buniek a tkanív

Štúdium fixných buniek a tkanív. Hlavným predmetom výskumu sú histologické prípravky, vyrobené z pevných konštrukcií. Liekom môže byť náter (napríklad náter krvi, kostnej drene, slín, mozgovomiechového moku atď.), odtlačok (napríklad sleziny, týmusu, pečene), film tkaniva (napr. spojivové alebo peritoneálne, pleura, pia mater), tenký rez. Najčastejšie sa na štúdium používa časť tkaniva alebo orgánu. Histologické preparáty je možné študovať bez špeciálneho spracovania. Napríklad pripravený krvný náter, výtlačok, film alebo časť orgánu je možné okamžite vidieť pod mikroskopom. Ale vzhľadom na to, že štruktúry majú "slabý kontrast", sú v bežnom svetelnom mikroskope zle detekované a je potrebné použitie špeciálnych mikroskopov (fázový kontrast a pod.) Preto sa častejšie používajú špeciálne spracované prípravky.

Proces výroby histologického preparátu pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu zahŕňa tieto hlavné kroky: 1) odoberanie materiálu a jeho fixovanie, 2) zhutňovanie materiálu, 3) príprava rezov, 4) farbenie alebo kontrastné rezy. Pre svetelnú mikroskopiu je potrebný ešte jeden krok - uzatváranie rezov v balzame alebo inom transparentnom médiu (5). Fixácia zabezpečuje prevenciu rozkladných procesov, čo pomáha zachovať celistvosť štruktúr. Dosahuje sa to tak, že malá vzorka odobratá z orgánu sa buď ponorí do fixačného prostriedku (alkohol, formalín, roztoky solí ťažkých kovov, kyselina osmiová, špeciálne fixačné zmesi), alebo sa podrobí tepelnému spracovaniu. Pôsobením fixačného prostriedku dochádza v tkanivách a orgánoch k zložitým fyzikálno-chemickým zmenám. Najvýznamnejším z nich je proces ireverzibilnej koagulácie proteínov, v dôsledku čoho prestáva životne dôležitá aktivita a štruktúry sú mŕtve, fixované. Fixácia vedie k zhutneniu a zmenšeniu objemu kusov, ako aj k zlepšeniu následného farbenia buniek a tkanív.

tesniace kusy, potrebné na prípravu rezov, sa vyrába impregnáciou predtým dehydratovaného materiálu parafínom, celoidínom, organickými živicami. Rýchlejšie zhutnenie sa dosiahne použitím metódy zmrazenia kusov, napríklad v tekutej kyseline uhličitej.

Príprava sekcie vyrobené na špeciálnych zariadeniach - mikrotómy(pre svetelnú mikroskopiu) a ultramikrotómy(pre elektrónovú mikroskopiu).

Farbenie sekcií(vo svetelnej mikroskopii) príp ich postriekaním kovovými soľami(v elektrónovej mikroskopii) slúži na zvýšenie kontrastu obrazu jednotlivých štruktúr pri pohľade pod mikroskopom. Metódy farbenia histologických štruktúr sú veľmi rôznorodé a vyberajú sa v závislosti od cieľov štúdie. Histologické škvrny sa delia na kyslé, zásadité a neutrálne. Príklady zahŕňajú najznámejšie zásadité farbivo azúr II, ktoré farbí jadrá do fialova, a kyslé farbivo eozín, ktoré farbí cytoplazmu do ružovo-oranžova. Selektívna afinita štruktúr k určitým farbivám je spôsobená ich chemickým zložením a fyzikálnymi vlastnosťami. Štruktúry, ktoré sa dobre farbia kyslými farbivami, sa nazývajú oxyfilný(acidofilné, eozinofilné) a farbenie zásadité - bazofilné. Sú to štruktúry, ktoré prijímajú kyslé aj zásadité farbivá neutrofilné(heterofilné). Farebné prípravky sa zvyčajne dehydratujú v alkoholoch so zvyšujúcou sa silou a vyčistia sa v xyléne, benzéne, toluéne alebo niektorých olejoch. Pre dlhodobú konzerváciu sa dehydrovaný histologický rez vloží medzi sklíčko a krycie sklíčko do kanadského balzamu alebo iných látok. Hotový histologický preparát je možné používať na mikroskopické vyšetrenie dlhé roky. Pre elektrónovú mikroskopiu sa rezy získané na ultramikrotóme umiestnia na špeciálne mriežky, kontrastujú so soľami mangánu, kobaltu atď., Potom sa prezerajú pod mikroskopom a fotografujú. Získané mikrofotografie slúžia ako predmet štúdia spolu s histologickými preparátmi.

Metódy štúdia živých buniek a tkanív

Štúdium živých buniek a tkanív vám umožňuje získať najúplnejšie informácie o ich živote - sledovať pohyb, procesy delenia, ničenia, rastu, diferenciácie a interakcie buniek, trvanie ich životného cyklu, reaktívne zmeny v reakcii. na pôsobenie rôznych faktorov.

In vivo štúdie buniek v tele (vvivo). Jednou z dôležitých metód výskumu je pozorovanie štruktúr v živom organizme. Pomocou špeciálnych priesvitných mikroskopov-iluminátorov je napríklad možné študovať dynamiku krvného obehu v mikrocievach. Po anestézii zvieraťa sa predmet štúdie (napríklad mezentéria čreva) vyberie a vyšetrí pod mikroskopom, pričom tkanivá musia byť neustále zvlhčované izotonickým roztokom chloridu sodného. Trvanie takéhoto pozorovania je však obmedzené. Najlepšie výsledky sa dosiahnu implantáciou priehľadných komôr do tela zvieraťa.

Najvhodnejším orgánom na implantáciu takýchto kamier a následné pozorovanie je ucho zvieraťa (napríklad králika). Na stolík mikroskopu sa umiestni časť ucha s priehľadnou komorou a za týchto podmienok sa dlhodobo študuje dynamika zmien v bunkách a tkanivách. Tak možno študovať procesy vylučovania leukocytov z krvných ciev, rôzne štádiá tvorby spojivového tkaniva, kapilár, nervov a ďalšie procesy. Oko pokusných zvierat možno použiť ako prirodzenú priehľadnú kameru. Bunky, tkanivá alebo vzorky orgánov sa umiestnia do tekutiny prednej komory oka pod uhlom, ktorý tvorí rohovka a dúhovka a možno ich pozorovať cez priehľadnú rohovku. Týmto spôsobom sa transplantovalo oplodnené vajíčko a sledovali sa rané štádiá embryonálneho vývoja. Opiciam transplantovali malé kúsky maternice a študovali zmeny na sliznici maternice v rôznych fázach menštruačného cyklu.

Metóda transplantácie buniek krvi a kostnej drene zo zdravých darcovských zvierat príjemcom, ktorí boli vystavení letálnemu ožiareniu, našla široké uplatnenie. Príjemcovia po transplantácii zostali nažive vďaka prihojeniu darcovských buniek tvoriacich kolónie hematopoetických buniek v slezine. Štúdium počtu kolónií a ich bunkového zloženia umožňuje identifikovať počet rodičovských hematopoetických buniek a rôzne štádiá ich diferenciácie. Pomocou metódy tvorby kolónií boli stanovené zdroje vývoja pre všetky krvinky.

Vitálne a supravitálne farbenie. Pri životnom (celoživotnom) farbení buniek a tkanív sa farbivo dostáva do tela živočícha, pričom selektívne farbí určité bunky, ich organely alebo medzibunkovú látku. Napríklad pomocou trypánovej modrej alebo lítiumkarmínu sa detegujú fagocyty a pomocou alizarínu, novovytvorenej kostnej matrice.

Supravitálne farbenie sa vzťahuje na farbenie živých buniek izolovaných z tela. Týmto spôsobom sa zisťujú mladé formy erytrocytov - krvné retikulocyty (brilantná kresylová modrá), mitochondrie v bunkách (farbivo Janusovo zelené), lyzozómy (neutrálne červené farbivo).

Štúdie živých buniek a tkanív v kultúre (vin vitro). Táto metóda je jednou z najbežnejších. Bunky izolované z ľudského alebo zvieracieho tela, malé vzorky tkanív alebo orgánov sa vkladajú do sklenených alebo plastových nádob obsahujúcich špeciálne živné médium - krvnú plazmu, embryonálny extrakt, ako aj umelé médiá. Existujú suspenzné kultúry (bunky suspendované v médiu), tkanivové, orgánové a jednovrstvové kultúry (explantované bunky tvoria súvislú vrstvu na skle). Je zabezpečená sterilita média a teplota zodpovedajúca telesnej teplote. Za týchto podmienok si bunky po dlhú dobu zachovávajú hlavné ukazovatele vitálnej aktivity - schopnosť rásť, rozmnožovať sa, diferencovať a pohybovať sa. Takéto kultúry môžu existovať mnoho dní, mesiacov a dokonca rokov, ak sa kultivačné médium obnoví a životaschopné bunky sa transplantujú do iných nádob. Niektoré typy buniek môžu v dôsledku zmien vo svojom genóme pretrvávať a množiť sa v kultúre, pričom vytvárajú súvislé bunkové línie. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky a F. M. Lazarenko výrazne prispeli k rozvoju metód kultivácie buniek a tkanív. V súčasnosti boli získané bunkové línie fibroblastov, myocytov, epiteliocytov, makrofágov atď., ktoré existujú už mnoho rokov.

Použitie kultivačnej metódy umožnilo odhaliť množstvo vzorcov diferenciácie, malígnej transformácie buniek, bunkových interakcií, interakcií buniek s vírusmi a mikróbmi. Ukázala sa schopnosť buniek chrupavky vytvárať v kultúre medzibunkovú látku a schopnosť buniek nadobličiek produkovať hormóny. Kultivácia embryonálnych tkanív a orgánov umožnila sledovať vývoj kostí, kože a iných orgánov. Bola vyvinutá technika kultivácie nervových buniek.

Metóda tkanivových kultúr má osobitný význam pre uskutočňovanie experimentálnych pozorovaní na ľudských bunkách a tkanivách. Bunky odobraté z ľudského tela pri punkcii alebo biopsii sa môžu použiť v tkanivovej kultúre na určenie pohlavia, dedičných chorôb, malígnej degenerácie a na identifikáciu účinkov množstva toxických látok.

V posledných rokoch sa bunkové kultúry široko používajú na hybridizáciu buniek.

Boli vyvinuté metódy na separáciu tkanív do buniek, izoláciu jednotlivých typov buniek a ich kultiváciu.

Najprv sa tkanivo premení na bunkovú suspenziu zničením medzibunkových kontaktov a medzibunkovej matrice za pomoci proteolytických enzýmov (trypsín, kolagenáza) a zlúčenín viažucich Ca 2+ (pomocou EDTA - kyseliny etyléndiamíntetraoctovej). Výsledná suspenzia sa ďalej delí na frakcie buniek rôznych typov centrifugáciou, ktorá umožňuje oddelenie ťažších buniek od ľahších, veľkých od malých, alebo nalepením buniek na sklo alebo plast, ktorých schopnosť je pre rôzne typy rôzna. bunky. Na zabezpečenie špecifickej adhézie buniek k povrchu skla sa používajú protilátky, ktoré sa špecificky viažu na bunky rovnakého typu. Adherujúce bunky sa potom oddelia rozbitím matrice pomocou enzýmov, čím sa získa suspenzia homogénnych buniek. Jemnejším spôsobom separácie buniek je značenie protilátkami spojenými s fluorescenčnými farbivami. Označené bunky sa oddelia od neoznačených buniek pomocou triedičky (elektronický fluorescenčne aktivovaný bunkový analyzátor). Bunkový analyzátor triedi na 1 s približne 5000 bunkami. Izolované bunky možno študovať v kultivačných podmienkach.

Spôsob kultivácie buniek umožňuje študovať ich životnú aktivitu, reprodukciu, diferenciáciu, interakciu s inými bunkami, vplyv hormónov, rastových faktorov atď.

Kultúry sa zvyčajne pripravujú z bunkovej suspenzie pripravenej metódou tkanivovej disociácie opísanou vyššie. Väčšina buniek nie je schopná rásť v suspenzii, potrebujú pevný povrch, ktorým je povrch plastovej kultivačnej misky, niekedy so zložkami extracelulárnej matrice, ako je kolagén. Primárne plodiny sa nazývajú kultúry pripravené bezprostredne po prvej fáze bunkovej frakcionácie, sekundárne- bunkové kultúry transplantované z primárnych kultúr do nového média. Bunky môžu byť transplantované postupne počas týždňov a mesiacov, pričom bunky si zachovávajú svoje charakteristické znaky diferenciácie (napríklad epitelové bunky tvoria vrstvy). Východiskovým materiálom pre bunkové kultúry sú zvyčajne fetálne a neonatálne tkanivá.

Ako živné pôdy sa používajú zmesi solí, aminokyselín, vitamínov, konské sérum, extrakt z kuracieho embrya, embryonálne sérum atď.. Na kultiváciu rôznych typov buniek boli vyvinuté špeciálne médiá. Obsahujú jeden alebo viac proteínových rastových faktorov nevyhnutných na život a reprodukciu buniek. Napríklad nervový rastový faktor (NGF) je potrebný na rast nervových buniek.

Väčšina buniek v kultúre má určitý počet delení (50-100) a potom odumierajú. Niekedy sa v kultúre objavia mutantné bunky, ktoré sa donekonečna množia a tvoria bunkovú líniu (fibroblasty, epiteliocyty, myoblasty atď.). Mutantné bunky sa líšia od rakovinových buniek, ktoré sú tiež schopné nepretržitého delenia, ale môžu rásť bez toho, aby boli pripojené k pevnému povrchu. Rakovinové bunky v kultivačných miskách tvoria hustejšiu populáciu ako normálne bunkové populácie. Podobná vlastnosť môže byť indukovaná experimentálne v normálnych bunkách ich transformáciou vírusmi podobnými nádorom alebo chemickými zlúčeninami, čo vedie k vytvoreniu neoplasticky transformovaných bunkových línií. Bunkové línie netransformovaných a transformovaných buniek môžu byť dlhodobo skladované pri nízkych teplotách (-70 °C). Genetická homogenita buniek je posilnená klonovaním, kedy sa z jednej bunky pri jej postupnom delení získa veľká kolónia homogénnych buniek. Klon je populácia buniek odvodených z jednej progenitorovej bunky.

bunkové hybridy. Keď sa spoja dve bunky rôznych typov, vznikne heterokaryón – bunka s dvoma jadrami. Na získanie heterokaryónu sa bunková suspenzia ošetrí polyetylénglykolom alebo inaktivovanými vírusmi, aby sa poškodili bunkové plazmolémy, po čom sú bunky schopné fúzie. Napríklad neaktívne jadro kuracieho erytrocytu sa stane aktívnym (syntéza RNA, replikácia DNA), keď sa bunky spoja a prenesú do cytoplazmy inej bunky rastúcej v tkanivovej kultúre. Heterokaryón je schopný mitózy, výsledkom čoho je tvorba hybridná bunka. Plášte jadier heterokaryónu sú zničené a ich chromozómy sú spojené do jedného veľkého jadra.

Klonovanie hybridných buniek vedie k vytvoreniu hybridných bunkových línií, ktoré sa používajú na štúdium genómu. Napríklad v hybridnej bunkovej línii myši a človeka bola stanovená úloha ľudského chromozómu 11 pri syntéze inzulínu.

Hybridómy. Hybridómové bunkové línie sa používajú na získanie monoklonálnych protilátok. Protilátky sú produkované plazmatickými bunkami, ktoré vznikajú z B-lymfocytov počas imunizácie. Špecifický typ protilátky sa získa imunizáciou myší špecifickými antigénmi. Ak sú takéto imunizované lymfocyty klonované, možno získať veľké množstvo homogénnych protilátok. Životnosť B-lymfocytov v kultúre je však obmedzená. Preto sa spájajú s „nesmrteľnými“ nádorovými bunkami (B-lymfómy). V dôsledku toho sa vytvárajú hybridy. (hybridná bunka, s genómom z dvoch rôznych buniek; ohm - končiace na názvy nádorov). Takéto hybridómy sú schopné sa dlhodobo množiť v kultúre a syntetizovať protilátky určitého typu. Každý hybridómový klon je zdrojom monoklonálnych protilátok. Všetky molekuly protilátok daného druhu majú rovnakú antigén-väzbovú špecificitu. Je možné vytvoriť monoklonálne protilátky proti akémukoľvek proteínu obsiahnutému v bunke a použiť ich na lokalizáciu proteínov v bunke, ako aj na izoláciu proteínu zo zmesi (purifikácia proteínu), čo umožňuje študovať štruktúru a funkciu proteínov. . Monoklonálne protilátky sa tiež používajú v technológii klonovania génov.

Protilátky možno použiť na štúdium funkcie rôznych molekúl ich zavedením cez plazmalemu priamo do cytoplazmy buniek pomocou tenkej sklenenej pipety. Napríklad zavedenie protilátok proti myozínu do cytoplazmy oplodneného vajíčka morského ježka zastaví delenie cytoplazmy.

Technológia rekombinantnej DNA. Klasické genetické metódy umožňujú študovať funkciu génov analýzou fenotypov mutantných organizmov a ich potomkov. Tieto metódy dopĺňa technológia rekombinantnej DNA, ktorá umožňuje podrobnú chemickú analýzu genetického materiálu a získanie veľkého množstva bunkových proteínov.

Hybridizačné metódy sú široko používané v modernej biológii na štúdium štruktúry génov a ich expresie.

Metódy štúdia chemického zloženia a metabolizmu buniek a tkanív

Na štúdium chemického zloženia biologických štruktúr - lokalizácie látok, ich koncentrácie a dynamiky v metabolických procesoch sa používajú špeciálne metódy výskumu.

Cyto- a histochemické metódy. Tieto metódy umožňujú odhaliť lokalizáciu rôznych chemikálií v štruktúrach buniek, tkanív a orgánov – DNA, RNA, bielkoviny, sacharidy, lipidy, aminokyseliny, minerály, vitamíny, aktivitu enzýmov. Tieto metódy sú založené na špecifickosti reakcie medzi chemickým činidlom a substrátom, ktorý je súčasťou bunkových a tkanivových štruktúr, a na farbení produktov chemickej reakcie. Na zvýšenie špecifickosti reakcie sa často používa enzymatická kontrola. Napríklad na detekciu ribonukleovej kyseliny (RNA) v bunkách sa často používa gallocyanín - farbivo so zásaditými vlastnosťami a prítomnosťou RNA potvrdené kontrolným ošetrením ribonukleázou, ktorá štiepi RNA. Gallocyanínové škvrny RNA v modro-fialovej farbe. Ak je rez vopred ošetrený ribonukleázou a potom zafarbený gallocyanínom, potom absencia farbenia potvrdzuje prítomnosť ribonukleovej kyseliny v štruktúre. Početné cyto- a histochemické metódy sú opísané v špecifických manuáloch.

Kombinácia histochemických metód s metódou elektrónovej mikroskopie viedla v posledných rokoch k rozvoju novej perspektívnej oblasti – elektrónovej histochémie. Táto metóda umožňuje študovať lokalizáciu rôznych chemikálií nielen na bunkovej, ale aj na subcelulárnej a molekulárnej úrovni.

Na štúdium bunkových makromolekúl sa využívajú veľmi citlivé metódy využívajúce rádioaktívne izotopy a protilátky, ktoré umožňujú detekovať aj malý obsah molekúl (menej ako 1000).

rádioaktívne izotopy pri rozpade jadra vyžarujú nabité častice (elektróny) alebo žiarenie (napríklad gama lúče), ktoré je možné zaregistrovať v špeciálnych prístrojoch. Rádioaktívne izotopy sa používajú v rádioautografii. Napríklad pomocou rádioizotopov 3H-tymidínu sa skúma jadrová DNA, pomocou 3H-uridínu - RNA.

rádioautografická metóda. Táto metóda umožňuje maximálne študovať metabolizmus v rôznych štruktúrach. Metóda je založená na použití rádioaktívnych prvkov (napríklad fosfor - 32 P, uhlík - 14 C, síra - 35 S, vodík - 3 H) alebo nimi značených zlúčenín. Rádioaktívne látky v histologických rezoch sa zisťujú pomocou fotografickej emulzie, ktorá sa nanesie na prípravok a následne vyvolá. V oblastiach liečiva, kde sa fotografická emulzia dostáva do kontaktu s rádioaktívnou látkou, dochádza k fotoreakcii, v dôsledku ktorej vznikajú osvetlené plochy (stopy). Touto metódou možno určiť napríklad rýchlosť inkorporácie značených aminokyselín do bielkovín, tvorbu nukleových kyselín, metabolizmus jódu v bunkách štítnej žľazy atď.

Metódy imunofluorescenčnej analýzy. Použitie protilátok. Protilátky sú ochranné proteíny produkované plazmatickými bunkami (deriváty B-lymfocytov) v reakcii na pôsobenie cudzorodých látok (antigénov). Počet rôznych foriem protilátok dosahuje milión. Každá protilátka má miesta na „rozpoznanie“ molekúl, ktoré spôsobili syntézu tejto protilátky. Vďaka vysokej špecificite protilátok na antigény je možné ich použiť na detekciu akýchkoľvek bunkových proteínov. Na identifikáciu lokalizácie proteínov sa protilátky zafarbia fluorescenčnými farbivami a potom sa bunky skúmajú pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Protilátky možno použiť aj na štúdium antigénov na ultraštrukturálnej úrovni pomocou elektrónového mikroskopu. Na tento účel sú protilátky označené časticami s hustotou elektrónov (mikroguľôčky koloidného zlata). Na zvýšenie špecifickosti reakcie sa používajú monoklonálne protilátky, tvorené bunkovou líniou – klonmi získanými hybridómovou metódou z jednej bunky. Hybridómová metóda umožňuje získať monoklonálne protilátky s rovnakou špecifickosťou a v neobmedzenom množstve.

Metódy imunofluorescenčnej analýzy sú široko a efektívne používané v modernej histológii. Tieto metódy sa používajú na štúdium procesov diferenciácie buniek, na identifikáciu špecifických chemických zlúčenín a štruktúr v nich. Sú založené na reakciách antigén-protilátka. Každá bunka tela má špecifické antigénne zloženie, ktoré je určené najmä proteínmi. Reakčné produkty môžu byť zafarbené a detegované vo fluorescenčnom mikroskope, napríklad detekcia aktínu a tubulínu v bunke pomocou metódy imunofluorescenčnej analýzy (pozri kapitolu IV).

Moderné výskumné metódy umožňujú analyzovať chemické zloženie rôznych štruktúrnych zložiek buniek, fixných aj živých. Štúdium jednotlivých intracelulárnych štruktúr bolo možné po vývoji technológií frakcionácie bunkového obsahu.

Frakcionácia bunkového obsahu

Bunkové štruktúry a makromolekuly môžu byť frakcionované rôznymi metódami – ultracentrifugáciou, chromatografiou, elektroforézou. Tieto metódy sú podrobnejšie popísané v učebniciach biochémie.

Ultracentrifugácia. Pomocou tejto metódy možno bunky rozdeliť na organely a makromolekuly. Po prvé, bunky sú zničené osmotickým šokom, ultrazvukom alebo mechanickým pôsobením. V tomto prípade sa membrány (plazmolema, endoplazmatické retikulum) rozpadnú na fragmenty, z ktorých sa vytvoria najmenšie vezikuly a jadrá a organely (mitochondrie, Golgiho aparát, lyzozómy a peroxizómy) zostanú nedotknuté a sú vo formujúcej sa suspenzii.

Na oddelenie vyššie uvedených bunkových zložiek sa používa vysokorýchlostná centrifúga (80 000-150 000 ot./min.). Najprv sa väčšie časti (jadrá, cytoskelet) usadia (sediment) na dne skúmavky. S ďalším zvýšením rýchlosti odstreďovania frakcií supernatantu sa postupne usadzujú menšie častice - najskôr mitochondrie, lyzozómy a peroxizómy, potom mikrozómy a najmenšie vezikuly a nakoniec ribozómy a veľké makromolekuly. Počas odstreďovania sa rôzne frakcie usadzujú rôznymi rýchlosťami a vytvárajú v skúmavke oddelené pásy, ktoré je možné izolovať a skúmať. Frakcionované bunkové extrakty (bezbunkové systémy) sa široko používajú na štúdium vnútrobunkových procesov, napríklad na štúdium biosyntézy bielkovín, dešifrovanie genetického kódu atď.

Chromatografia sa široko používa na frakcionáciu proteínov.

Elektroforéza umožňuje oddeliť molekuly proteínov s rôznym nábojom umiestnením ich vodných roztokov (alebo do pevnej poréznej matrice) do elektrického poľa.

Metódy chromatografie a elektroforézy sa používajú na analýzu peptidov získaných štiepením molekuly proteínu a na získanie takzvaných peptidových máp proteínov. Tieto metódy sú podrobne popísané v učebniciach biochémie.

Štúdium chemického zloženia živých buniek. Na štúdium distribúcie látok a ich metabolizmu v živých bunkách sa využívajú techniky nukleárnej magnetickej rezonancie a mikroelektródy.

Nukleárna magnetická rezonancia (NMR) umožňuje študovať malé molekuly látok s nízkou molekulovou hmotnosťou. Vzorka tkaniva obsahuje atómy v rôznych molekulách a v rôznych prostrediach, takže bude absorbovať energiu pri rôznych rezonančných frekvenciách. Absorpčný diagram pri rezonančných frekvenciách pre danú vzorku bude jej spektrum NMR. V biológii je signál NMR z protónov (jadier vodíka) široko používaný na štúdium proteínov, nukleových kyselín atď. Na štúdium makromolekúl vo vnútri živej bunky sa často používajú izotopy 3H, 13 C, 35 K, 31 P na získanie NMR signál a sledovať jeho zmenu.v priebehu života bunky. Takže 3| P sa používa na štúdium svalovej kontrakcie - zmeny obsahu ATP a anorganického fosfátu v tkanivách. Izotop 13C umožňuje pomocou NMR študovať mnohé procesy, na ktorých sa podieľa glukóza. Použitie NMR je obmedzené jeho nízkou citlivosťou: 1 g živého tkaniva musí obsahovať aspoň 0,2 mm testovanej látky. Výhodou metódy je jej neškodnosť pre živé bunky.

Mikroelektródová technológia. Mikroelektródy sú sklenené trubičky naplnené elektricky vodivým roztokom (zvyčajne roztokom KC1 vo vode), ktorých koncový priemer sa meria v zlomkoch mikrónu. Hrot takejto skúmavky je možné cez plazmalemu zaviesť do bunkovej cytoplazmy a určiť koncentráciu iónov H +, Na +, K +, C1", Ca 2+, Mg 2+, rozdiel potenciálov na plazmatickej membráne, a tiež vstreknúť molekuly do bunky.Na stanovenie koncentrácie konkrétneho iónu sa používajú iónovo selektívne elektródy, ktoré sú naplnené iónomeničovou živicou, ktorá je priepustná len pre tento ión.V posledných rokoch sa používa mikroelektródová technológia používa sa na štúdium transportu iónov cez špeciálne iónové kanály (špecializované proteínové kanály) v plazmatickej membráne.V tomto prípade mikroelektróda s hrubším hrotom, ktorý je tesne pritlačený k zodpovedajúcej časti plazmalemy.Táto metóda umožňuje študovať funkciu jedinej molekuly proteínu.Zmenu koncentrácie iónov vo vnútri bunky možno určiť pomocou luminiscenčných indikátorov.Napríklad na štúdium intracelulárnej koncentrácie Ca 2+ sa používa luminiscenčný proteín akvarín (izolovaný z medúzy), ktorý vyžaruje svetlo t v prítomnosti iónov Ca 2+ a reaguje na zmeny ich koncentrácie v rozsahu 0,5-10 μM. Boli tiež syntetizované fluorescenčné indikátory, ktoré sa silne viažu na Ca2+. Vytvorenie rôznych nových typov intracelulárnych indikátorov a moderné metódy analýzy obrazu umožňujú presne a rýchlo určiť intracelulárnu koncentráciu mnohých látok s nízkou molekulovou hmotnosťou.

Kvantitatívne metódy

V súčasnosti sú popri kvalitatívnych metódach vyvinuté a používané kvantitatívne histochemické metódy na stanovenie obsahu rôznych látok v bunkách a tkanivách. Znakom kvantitatívno-histochemických (na rozdiel od biochemických) metód výskumu je možnosť štúdia koncentrácie a obsahu chemických zložiek v špecifických bunkových a tkanivových štruktúrach.

Cytospektrofotometria- metóda kvantitatívneho štúdia vnútrobunkových látok ich absorpčnými spektrami.

Cytospektrofluorometria- metóda na kvantitatívne štúdium intracelulárnych látok ich fluorescenčnými spektrami alebo intenzitou fluorescencie pri jednej vopred zvolenej vlnovej dĺžke (cytofluorometria).

Moderné mikroskopy - cytofluorometre umožňujú detegovať malé množstvá látky v rôznych štruktúrach (do 10-14 -10-16 g) a odhadnúť lokalizáciu študovaných látok v mikroštruktúrach.

Metódy obrazovej analýzy bunkových a tkanivových štruktúr

Získané snímky mikroobjektov v mikroskope, na televíznej obrazovke, na elektrónových mikrofotografiách je možné podrobiť špeciálnej analýze - identifikácii morfometrických, denzitometrických parametrov a ich štatistickému spracovaniu.

Morfometrické metódy umožňujú určiť pomocou špeciálnych mriežok (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) počet akýchkoľvek štruktúr, ich plochy, priemery atď. Najmä v bunkách, oblasti jadier, cytoplazmy, ich priemery. , jadrovo-cytoplazmatické pomery atď. Existuje manuálna morfometria a automatizovaná morfometria, pri ktorej sa všetky parametre merajú a zaznamenávajú v prístroji automaticky.

V posledných rokoch sa čoraz viac rozširuje automatizácieintegrované systémy spracovania obrazu (ASOIS), umožňujúce čo najefektívnejšiu implementáciu vyššie uvedených kvantitatívnych metód na štúdium buniek a tkanív. Analytické možnosti kvantitatívnej mikroskopie sú zároveň doplnené metódami analýzy a rozpoznávania vzoriek založených na spracovaní informácií extrahovaných z obrazov buniek a tkanív pomocou elektronických počítačov (počítačov). V podstate môžeme hovoriť o zariadeniach, ktoré nielen zlepšujú optické možnosti ľudského vizuálneho analyzátora, ale tiež výrazne rozširujú jeho analytické možnosti. Vyjadruje sa názor, že ASOIz robí rovnakú revolúciu v morfológii, ku ktorej došlo asi pred 300 rokmi vďaka vynálezu svetelného mikroskopu a asi pred 50 rokmi - elektrónového mikroskopu, pretože nielenže nemerateľne zvyšujú produktivitu výskumníka a nielen objektivizujú pozorovania, ale umožňujú aj získavať nové informácie o dovtedy nedetekovateľných procesoch, numericky modelovať a predpovedať ich vývoj v bunkách a tkanivách.

Účasť na počítačovom experimente zároveň vyžaduje od výskumníka nový prístup k jeho implementácii, zručnosti pri zostavovaní algoritmov pre výskumný proces, presnosť uvažovania a v konečnom dôsledku zvýšenie vedeckej a metodologickej úrovne výskumu.

Jednou z metód, ktorá výrazne rozšírila počet riešených morfologických problémov, je opticko-štrukturálna strojová analýza (OSMA), navrhol v roku 1965 K. M. Bogdanov. V roku 1978 bola autorovi metódy udelená Štátna cena ZSSR. S príchodom OSMA sa urobil kvalitatívne nový krok vo vývoji jednotnej metodológie pre kvantitatívnu analýzu mikroštruktúr na základe štatistických charakteristík. OSMA našla v poslednom období efektívne uplatnenie vo výskumnej praxi a národnom hospodárstve.

Na obr. 2 je znázornený automatizovaný systém spracovania obrazu Protva-MP vytvorený u nás spoločnosťou LOMO. Systém je určený na komplexné štúdium buniek a tkanív pomocou absorpčnej, fluorescenčnej mikroskopie a autorádiografie.

Špeciálny rastrovací optický alebo elektrónový mikroskop, ktorý je súčasťou systému, postupne zosníma obraz preparátu v dvoch súradniciach, prevedie ho do digitálnej podoby a vloží do počítača, ktorý následne obraz digitálne spracuje a poskytuje informácie o geometrických a iných charakteristikách analyzovaného objektu.

Pomocou farebného displeja môže výskumník obraz „rozrezať“, pričom zvýrazní len tie štrukturálne komponenty, ktoré ho zaujímajú. Priestranné zariadenia na ukladanie informácií, ktoré sú súčasťou počítača na magnetických diskoch alebo páskach, umožňujú ukladať ako samotné obrázky, tak aj výsledky ich spracovania na následné ukladanie a dokumentáciu.

Využitie metód na automatizovanú analýzu mikroobjektov zvážime na príklade spracovania obrazu krvného leukocytu (obr. 3) Skenovací mikroskop-fotometer umožňuje „prezerať“ hodnoty optickej hustoty riadok po riadku s krokom špecifikovaným výskumníkom Výsledkom je, že optický signál zodpovedajúci optickej hustote objektu sa prevedie do digitálnej podoby Výsledná digitálna matrica sa pripravuje pomocou špeciálneho matematického prístroja

Najprv sa odstráni pozadie a izoluje sa "čistý" objekt - obraz bunky (1a), potom sa z obrazu bunky vyberie akýkoľvek detail, ktorý výskumníka zaujíma, napríklad cytoplazma (16) a jadra (radujem priemernú a integrálnu hodnotu optickej hustoty, disperzie, asymetrie, špičatosti a pod. Na základe obrazu objektu sa získajú morfometrické parametre: plocha, obvod, priemer, jadrovo-cytoplazmatický pomer, tvarový faktor a pod.

Ďalšou fázou spracovania obrazu je konštrukcia dvojrozmerných diagramov vzájomnej závislosti optickej hustoty pre celú bunku (pozri obr. 3), jej cytoplazmu (Wb) a jadro (Nm) a jadrá. Tieto diagramy umožňujú vypočítať parametre histogramu druhého rádu – homogenita, lokálny kontrast, entropia atď.

Ryža. 3. Automatizované spracovanie obrazu bunky (diagram).

Obrázok leukocytu (a), jeho cytoplazmy (b) a jadra (c). I - digitálny obraz; II - histogramy optickej hustoty; III - dvojrozmerné histogramy závislosti hodnôt optickej hustoty.

Takto získané parametre predstavujú viacrozmerný „portrét“ bunky a majú špecifické číselné vyjadrenie. Môžu byť podrobené rôznym metódam štatistického spracovania, umožňujú mimoriadne presnú klasifikáciu mikroobjektov, odhaľujú znaky ich štruktúry, ktoré nie sú vizuálne zistiteľné.

Aplikácia nových výskumných metód v histológii, cytológii a embryológii teda umožňuje objasniť všeobecné zákonitosti organizácie tkanív a buniek, štruktúrne základy biochemických procesov, ktoré určujú funkciu špecifických štruktúrnych zložiek bunky.

Štruktúra, ultraštruktúra a fungovanie bunkových organel sa v súčasnosti študuje pomocou týchto hlavných metód: svetlo a elektrón, tmavé pole, fázový kontrast, polarizácia, luminiscenčná mikroskopia, ktorá sa používa na štúdium štruktúry, ultraštruktúry fixovaných buniek a diferenciálna centrifugácia. , ktorý umožňuje izolovať jednotlivé organely a analyzovať ich cytochemickými, biochemickými, biofyzikálnymi a inými metódami.

Svetelná mikroskopia.

Princíp metódy spočíva v tom, že lúč svetla prechádzajúci objektom vstupuje do šošovkového systému objektívu a vytvára primárny obraz, ktorý sa zväčšuje pomocou šošoviek okuláru. Hlavnou optickou časťou mikroskopu, ktorá určuje jeho hlavné schopnosti, je šošovka.

V moderných mikroskopoch sú šošovky zameniteľné, čo vám umožňuje študovať bunky pri rôznych zväčšeniach. Hlavnou charakteristikou mikroskopu ako optického systému je jeho rozlišovacia schopnosť, t.j. schopnosť poskytnúť samostatný obraz dvoch objektov blízko seba.

Obrazy poskytované objektívom je možné mnohonásobne zväčšiť použitím silného okuláru alebo napríklad projekciou na plátno (až 10 5-krát). Rozlíšenie svetelného mikroskopu je obmedzené vlnovou dĺžkou svetla: čím je vlnová dĺžka kratšia, tým je rozlíšenie vyššie. Svetelné mikroskopy zvyčajne používajú svetelné zdroje vo viditeľnej oblasti spektra (400-700 nm), takže maximálne rozlíšenie mikroskopu v tomto prípade nesmie byť vyššie ako 200-350 nm (0,2-0,35 mikrónov). Ak používate fialové svetlo (260-280 nm), potom môžete zvýšiť rozlíšenie na 130 - 140 nm (0,13-0,14 mikrónov). Toto bude hranica teoretického rozlíšenia svetelného mikroskopu, určeného vlnovou povahou svetla.

Takže jediné, čo môže svetelný mikroskop poskytnúť ako pomocné zariadenie nášmu oku, je zvýšiť jeho rozlišovaciu schopnosť asi 1000-krát (ľudské voľné oko má rozlíšenie asi 0,1 mm, čo sa rovná 100 mikrónov). Ide o „užitočné“ zväčšenie mikroskopu, nad ktorým už len zväčšíme obrysy obrazu bez toho, aby sme v ňom odhalili nové detaily. Preto, keď sa používa viditeľná oblasť svetla, 0,2-0,3 µm je konečný limit rozlíšenia svetelného mikroskopu.

Elektrónová mikroskopia.

Pre rastrovací elektrónový mikroskop sa materiál často zmrazuje, aby sa vytvoril povrch pokrytý ľadom. V tomto prípade je vylúčená strata vody vo vode rozpustných látok a menšie sú aj chemické zmeny v štruktúrach. Pri analýze údajov získaných pomocou elektrónového mikroskopu je potrebné pamätať na to, že táto metóda skúma statické stavy bunky v momente rýchleho zastavenia pohybu cytoplazmy spôsobeného pôsobením fixačných chemikálií.

Mikroskopia v tmavom poli.

Jeho podstatou je, že podobne ako čiastočky prachu v lúči svetla (Tyndallov efekt), v bunke pod bočným osvetlením žiaria drobné čiastočky (menej ako 0,2 mikrónu), ktorých odrazené svetlo vstupuje do šošovky mikroskopu. Táto metóda bola úspešne použitá pri štúdiu živých buniek.

Na určenie lokalizácie miest pre syntézu biopolymérov, na určenie prenosu látok v bunke, na sledovanie migrácie alebo vlastností jednotlivých buniek sú široko používané autorádiografická metóda- registrácia látok označených izotopmi. Napríklad pri použití tejto metódy s použitím značených prekurzorov RNA sa ukázalo, že všetka RNA sa syntetizuje iba v interfázovom jadre a prítomnosť cytoplazmatickej RNA je výsledkom migrácie syntetizovaných molekúl z jadra.

V cytológii rôzne analytické a preparatívne metódy biochémia. V druhom prípade je možné získať rôzne bunkové zložky vo forme oddelených frakcií a študovať ich chémiu, ultraštruktúru a vlastnosti. V súčasnosti sa takmer všetky bunkové organely a štruktúry získavajú vo forme čistých frakcií.

Jedným z hlavných spôsobov izolácie bunkových štruktúr je diferenciálna (separačná) centrifugácia. Princíp jeho aplikácie spočíva v tom, že čas usadzovania častíc v homogenáte závisí od ich veľkosti a hustoty: čím väčšia je častica alebo čím je ťažšia, tým rýchlejšie sa usadí na dne skúmavky. Na urýchlenie tohto procesu usadzovania sa využívajú zrýchlenia vytvorené odstredivkou.

Opakovaným frakčným odstreďovaním zmiešaných podfrakcií možno získať čisté frakcie. V prípadoch jemnejšej separácie frakcií sa využíva odstreďovanie v hustotnom gradiente sacharózy, čo umožňuje dobre oddeliť zložky, dokonca sa od seba mierne líšia mernou hmotnosťou. Získané frakcie sa musia pred analýzou biochemickými metódami skontrolovať na čistotu pomocou elektrónového mikroskopu.

Testovacie otázky:

1. Úrovne organizácie živej hmoty

2. Bunková teória organizácie organizmov

3. Výskumné metódy v cytológii

4. Úlohy a predmet cytológie

5. Zariadenie svetelného mikroskopu

6. Zariadenie elektrónového mikroskopu

7. Bezpečnostné opatrenia pri cytologickej práci

8. Požiadavky na prípravu biologického materiálu na cytologické vyšetrenie

9. Fixačné činidlá, mechanizmus účinku

10. Cytochémia, materiálové požiadavky a možnosti

11. Kvantitatívna analýza (morfometria), požiadavky a možnosti

12. Artefakty v cytológii, spôsoby objektivizácie výsledkov

1. Zavarzin A.A., Kharazova A.D. Základy všeobecnej cytológie. - L., 1982.

2. Chentsov Yu.S. Základy cytológie. - M., 1984.

3. Shubniková E.A. Funkčná morfológia tkanív. - M., Vydavateľstvo Moskovskej štátnej univerzity, 1981.