Sa high-performance liquid chromatography (HPLC), ang likas na katangian ng mga prosesong nagaganap sa chromatographic column ay karaniwang magkapareho sa mga proseso sa gas chromatography. Ang pagkakaiba lamang ay sa paggamit ng likido bilang isang nakatigil na yugto. Dahil sa mataas na densidad ng mga likidong mobile phase at ang mataas na pagtutol ng mga haligi, malaki ang pagkakaiba ng gas at likidong chromatography sa instrumentation.

Sa HPLC, ang mga dalisay na solvents o mixtures nito ay kadalasang ginagamit bilang mga mobile phase.

Upang lumikha ng isang stream ng purong solvent (o mga mixtures ng solvents), na tinatawag na eluent sa liquid chromatography, ginagamit ang mga pump na kasama sa hydraulic system ng chromatograph.

Isinasagawa ang adsorption chromatography bilang resulta ng pakikipag-ugnayan ng isang substance sa mga adsorbents, tulad ng silica gel o aluminum oxide, na may mga aktibong sentro sa ibabaw. Ang pagkakaiba sa kakayahang makipag-ugnayan sa mga sentro ng adsorption ng iba't ibang sample na molekula ay humahantong sa kanilang paghihiwalay sa mga zone sa panahon ng paggalaw kasama ang mobile phase sa kahabaan ng column. Ang paghihiwalay ng zone ng mga sangkap na nakamit sa kasong ito ay nakasalalay sa pakikipag-ugnayan sa parehong solvent at adsorbent.

Ang pinakamalawak na ginagamit sa HPLC ay mga silica gel adsorbents na may iba't ibang volume, surface area at pore diameters. Ang aluminyo oksido at iba pang mga adsorbents ay hindi gaanong ginagamit. Ang pangunahing dahilan para dito:

Hindi sapat na lakas ng makina, na hindi nagpapahintulot sa packaging at paggamit sa mataas na presyon na katangian ng HPLC;

Ang silica gel, kumpara sa aluminum oxide, ay may mas malawak na hanay ng porosity, surface area at pore diameter; Ang makabuluhang mas malaking catalytic na aktibidad ng aluminum oxide ay humahantong sa pagbaluktot ng mga resulta ng pagsusuri dahil sa agnas ng mga sample na bahagi o ang kanilang hindi maibabalik na chemisorption.

Mga detektor para sa HPLC

Ang high-performance liquid chromatography (HPLC) ay ginagamit upang makita ang mga polar non-volatile substance na, sa ilang kadahilanan, ay hindi maaaring ma-convert sa isang form na angkop para sa gas chromatography, kahit na sa anyo ng mga derivatives. Ang mga naturang substance, sa partikular, ay kinabibilangan ng mga sulfonic acid, water-soluble dyes at ilang pestisidyo, halimbawa phenyl-urea derivatives.

Mga Detektor:

UV detector sa isang diode matrix. Ang isang "matrix" ng mga photodiode (higit sa dalawang daan sa mga ito) ay patuloy na nagrerehistro ng mga signal sa UV at nakikitang mga rehiyon ng spectrum, kaya nagbibigay ng pagtatala ng UV-B spectra sa scanning mode. Nagbibigay-daan ito sa iyo na patuloy na mag-record, sa mataas na sensitivity, undistorted spectra ng mga bahagi na mabilis na dumadaan sa isang espesyal na cell.

Kung ikukumpara sa solong wavelength detection, na hindi nagbibigay ng impormasyon tungkol sa peak purity, ang kakayahang ihambing ang buong spectra ng isang diode array ay nagbibigay ng mas mataas na antas ng kumpiyansa sa resulta ng pagkakakilanlan.

Detektor ng fluorescence. Ang mahusay na katanyagan ng mga fluorescent detector ay dahil sa kanilang napakataas na selectivity at sensitivity, at ang katotohanan na maraming mga pollutant sa kapaligiran ang fluoresce (eg polyaromatic hydrocarbons).

Ang isang electrochemical detector ay ginagamit upang makita ang mga sangkap na madaling ma-oxidize o mabawasan: phenols, mercaptans, amines, aromatic nitro at halogen derivatives, aldehydes, ketones, benzidines.

Ang chromatographic separation ng isang mixture sa isang column dahil sa mabagal na pag-usad ng PF ay tumatagal ng maraming oras. Upang mapabilis ang proseso, ang chromatography ay isinasagawa sa ilalim ng presyon. Ang pamamaraang ito ay tinatawag na high-performance liquid chromatography (HPLC)

Ang modernisasyon ng mga kagamitan na ginagamit sa klasikal na likidong column chromatography ay ginawa itong isa sa mga pinaka-promising at modernong paraan ng pagsusuri. Ang high-performance na liquid chromatography ay isang maginhawang paraan para sa paghihiwalay, paghahanda sa paghihiwalay at qualitative at quantitative analysis ng mga non-volatile thermolabile compound na may parehong mababa at mataas na molekular na timbang.

Depende sa uri ng sorbent na ginamit, ang paraang ito ay gumagamit ng 2 opsyon sa chromatography: sa isang polar sorbent na gumagamit ng non-polar eluent (direct phase option) at sa isang non-polar sorbent na gumagamit ng polar eluent - ang tinatawag na reverse-phase high. -performance liquid chromatography (RPHPLC).

Sa panahon ng paglipat mula sa eluent hanggang eluent, ang equilibrium sa ilalim ng mga kondisyon ng HPLC ay naitatag nang maraming beses na mas mabilis kaysa sa ilalim ng mga kondisyon ng polar sorbents at non-aqueous PFs. Bilang resulta nito, pati na rin ang kaginhawaan ng pagtatrabaho sa mga aqueous at aqueous-alcohol eluent, ang OFVLC ay nakakuha na ngayon ng mahusay na katanyagan. Karamihan sa mga pagsusuri sa HPLC ay isinasagawa gamit ang pamamaraang ito.

Mga Detektor. Ang output ng isang indibidwal na bahagi mula sa hanay ay naitala gamit ang isang detektor. Para sa pagpaparehistro, maaari kang gumamit ng pagbabago sa anumang analytical signal na nagmumula sa mobile phase at nauugnay sa kalikasan at dami ng pinaghalong bahagi. Gumagamit ang liquid chromatography ng mga analytical signal tulad ng light absorption o light emission ng output solution (photometric at fluorimetric detector), refractive index (refractometric detector), potensyal at electrical conductivity (electrochemical detector), atbp.

Ang patuloy na natukoy na signal ay naitala ng isang recorder. Ang chromatogram ay isang sequence ng mga signal ng detector na naitala sa isang recorder tape, na nabuo kapag ang mga indibidwal na bahagi ng isang mixture ay umalis sa column. Kung ang pinaghalong pinaghihiwalay, ang mga indibidwal na peak ay makikita sa panlabas na chromatogram. Ang posisyon ng rurok sa chromatogram ay ginagamit para sa layunin ng pagtukoy ng sangkap, ang taas o lugar ng tuktok - para sa layunin ng dami ng pagpapasiya.

Aplikasyon

Ang HPLC ay pinakamalawak na ginagamit sa mga sumusunod na lugar ng pagsusuri ng kemikal (mga bagay ng pagsusuri kung saan halos walang kompetisyon ang HPLC ay naka-highlight):

· Kontrol sa kalidad ng pagkain - tonics at flavoring additives, aldehydes, ketones, bitamina, sugars, dyes, preservatives, hormonal drugs, antibiotics, triazine, carbamate at iba pang pesticides, mycotoxins, nitrosamines, polycyclic aromatic hydrocarbons, atbp.

· Proteksyon sa kapaligiran - mga phenol, mga organikong nitro compound, mono- at polycyclic aromatic hydrocarbons, isang bilang ng mga pestisidyo, pangunahing anion at cation.

· Forensics - mga gamot, mga organikong pampasabog at tina, makapangyarihang mga parmasyutiko.

· Industriya ng parmasyutiko - steroid hormones, halos lahat ng mga produkto ng organic synthesis, antibiotics, polymer preparations, bitamina, protina paghahanda.

· Medisina - ang nakalistang biochemical at medicinal substance at ang kanilang metabolites sa biological fluids (amino acids, purines at pyrimidines, steroid hormones, lipids) sa pag-diagnose ng mga sakit, pagtukoy sa rate ng pag-alis ng mga gamot mula sa katawan para sa layunin ng kanilang indibidwal na dosis.

· Agrikultura - pagpapasiya ng nitrate at pospeyt sa mga lupa upang matukoy ang kinakailangang dami ng mga pataba na inilapat, pagpapasiya ng nutritional value ng feed (amino acids at bitamina), pagsusuri ng mga pestisidyo sa lupa, tubig at mga produktong pang-agrikultura.

· Biochemistry, bioorganic chemistry, genetic engineering, biotechnology - sugars, lipids, steroids, proteins, amino acids, nucleosides at mga derivatives nito, bitamina, peptides, oligonucleotides, porphyrins, atbp.

· Organic chemistry - lahat ng matatag na produkto ng organic synthesis, dyes, thermolabile compound, non-volatile compound; inorganic chemistry (halos lahat ng natutunaw na compound sa anyo ng mga ion at kumplikadong compound).

· kontrol sa kalidad at kaligtasan ng pagkain, alkohol at di-alkohol na inumin, inuming tubig, mga kemikal sa sambahayan, pabango sa lahat ng yugto ng kanilang produksyon;

· pagpapasiya ng kalikasan ng polusyon sa lugar ng sakuna o emergency na gawa ng tao;

· pagtuklas at pagsusuri ng narcotic, potent, lason at explosive substance;

· pagpapasiya ng pagkakaroon ng mga nakakapinsalang sangkap (polycyclic at iba pang aromatic hydrocarbons, phenols, pesticides, organic dyes, ions ng heavy, alkaline at alkaline earth metals) sa mga likidong effluent, air emissions at solidong basura mula sa mga negosyo at sa mga buhay na organismo;

· pagsubaybay sa mga proseso ng organic synthesis, pagpino ng langis at karbon, biochemical at microbiological production;

pagsusuri ng kalidad ng lupa para sa pagpapabunga, ang pagkakaroon ng mga pestisidyo at herbicide sa lupa, tubig at mga produkto, pati na rin ang nutritional value ng feed; kumplikadong pananaliksik analytical na gawain; pagkuha ng mga microquantity ng ultrapure substance.



Panimula.

Ang mabilis na pag-unlad ng likidong chromatography sa huling 10 taon ay higit sa lahat dahil sa masinsinang pag-unlad ng mga teoretikal na pundasyon at ang praktikal na paggamit ng napaka-epektibong bersyon nito, pati na rin ang paglikha at pang-industriya na produksyon ng mga kinakailangang sorbent at kagamitan.

Ang isang natatanging tampok ng high-performance liquid chromatography (HPLC) ay ang paggamit ng mga sorbents na may laki ng butil na 3-10 microns, na nagsisiguro ng mabilis na paglipat ng masa na may napakataas na kahusayan sa paghihiwalay.

Sa kasalukuyan, ang HPLC ay nakakuha ng unang lugar sa mga instrumental na pamamaraan sa mga tuntunin ng mga rate ng pag-unlad, kahit na higit sa gas chromatography. Ang pinakamahalagang bentahe ng HPLC kumpara sa gas chromatography ay ang kakayahang pag-aralan ang halos anumang bagay nang walang anumang mga paghihigpit sa kanilang mga katangian ng physicochemical, halimbawa, mga punto ng kumukulo o timbang ng molekular.

Ngayon, ang HPLC ay isang mahusay na idinisenyong instrumental na paraan na malawakang ginagamit sa iba't ibang larangan ng agham at teknolohiya. Ang kahalagahan nito ay lalong malaki sa mga kritikal na lugar gaya ng biochemistry, molecular biology, environmental pollution control, gayundin sa kemikal, petrochemical, food at pharmaceutical na industriya.

dahil kinakailangang isaalang-alang ang isang bilang ng mga napaka-tiyak na kinakailangan dahil sa mga sumusunod na tampok ng pamamaraan.

A. Ang mga column ng HPLC ay puno ng napakaliit na particle diameter media. Bilang isang resulta, sa naturang solvent volumetric velocities na kinakailangan para sa mabilis na sample separation, ang mataas na presyon ay nilikha sa column.

b. Ang mga detector na ginagamit sa HPLC ay sensitibo sa mga pagbabago sa eluent flow at pressure (ingay). Bukod dito, kapag gumagamit ng mga detektor ng konsentrasyon, kinakailangan ang mas mataas na katatagan ng eluent volumetric velocity.

V. Ang proseso ng chromatographic separation ay sinamahan ng isang bilang ng mga antagonistic effect, halimbawa, ang pagpapakalat ng sample sa mobile phase ay humahantong sa paghahalo ng mga pinaghiwalay na bahagi at binabawasan ang maximum na konsentrasyon ng sangkap sa eluted peak (sa detector). Ang dispersion ay sinusunod sa lahat ng mga lugar ng system mula sa sample injection point hanggang sa detector.

d. Ang mga solvent na kumikilos bilang isang mobile phase ay kadalasang nagdudulot ng kaagnasan ng kagamitan. Pangunahing naaangkop ito sa mga solvent na ginagamit sa reverse phase chromatography, na mas gusto sa mga biochemical na aplikasyon ng HPLC.

Ang mga detalye ng HPLC bilang isang instrumental na pamamaraan ay dapat isaalang-alang sa panahon ng pagbuo, paglikha at pagpapatakbo ng mga sistemang ito. Tumagal ng higit sa sampung taon ng paghahanap at pagsasaliksik upang lumikha ng mga komersyal na sample ng mga chromatographic system at ang mga bahagi ng mga ito na sapat na maaasahan, simple at ligtas na gumana na may katanggap-tanggap na ratio sa pagitan ng presyo at teknikal na mga katangian. Ang kamakailang mga uso patungo sa pagbabawas ng mga column (parehong haba at diameter) ay nagpipilit ng mga bagong pangangailangan sa mga instrumento.

1.1. EFFICIENCYATSELECTIVITY

Ang Chromatography ay isang paraan ng paghihiwalay ng mga bahagi ng isang pinaghalong batay sa pagkakaiba sa kanilang equilibrium distribution sa pagitan ng dalawang "immiscible phase, ang isa ay nakatigil at ang isa ay mobile. Ang mga bahagi ng sample ay gumagalaw sa kahabaan ng column kapag sila ay nasa mobile phase, at nananatili sa lugar kapag sila ay nasa nakatigil na yugto Kung mas malaki ang affinity ng bahagi para sa nakatigil na yugto at mas mababa para sa mobile phase, mas mabagal itong gumagalaw sa column at mas matagal itong nananatili dito. Dahil sa pagkakaiba sa pagkakaugnay ng mga bahagi ng pinaghalong para sa mga nakatigil at mobile na yugto, ang pangunahing layunin ng chromatography ay nakamit - ang paghihiwalay ng isang katanggap-tanggap na tagal ng panahon ng pinaghalong sa mga indibidwal na banda (mga taluktok) ng mga bahagi habang sila ay gumagalaw kasama ang column na may mobile phase.

Mula sa mga pangkalahatang konsepto, malinaw na ang chromatographic separation ay posible lamang kung ang mga bahagi ng sample, na pumapasok sa column kapag ang sample ay ipinakilala, una, ay natunaw sa mobile phase at, pangalawa, nakikipag-ugnayan (nananatili) sa nakatigil na yugto. . Kung, kapag nagpapakilala ng isang sample, ang anumang mga bahagi ay wala sa anyo ng isang solusyon, sila ay sasalain at hindi lalahok sa proseso ng chromatographic. Gayundin, ang mga bahagi na hindi nakikipag-ugnayan sa nakatigil na yugto ay dadaan sa column na may mobile phase nang hindi naghihiwalay sa kanilang mga bahagi.

Tanggapin natin ang kundisyon na ang ilang dalawang bahagi ay natutunaw sa mobile phase at nakikipag-ugnayan sa nakatigil na yugto, ibig sabihin, ang proseso ng chroiatographic ay maaaring magpatuloy nang walang mga kaguluhan. Sa kasong ito, pagkatapos ipasa ang halo sa hanay, maaari kang makakuha ng mga chromatograms ng form a, b o V(Larawan 1.1). Ang mga chromatogram na ito ay naglalarawan ng mga chromatographic na paghihiwalay na naiiba sa kahusayan (A at b) na may pantay na selectivity at selectivity (b At V) na may pantay na kahusayan.

Ang mas makitid ang peak na nakuha sa parehong oras ng pagpapanatili, mas mataas ang kahusayan ng column. Ang kahusayan ng column ay sinusukat ng bilang ng mga theoretical plates (NPT) N: mas mataas ang kahusayan

kanin. 1.2. Chromatographic peak parameter at pagkalkula ng bilang ng mga theoretical plates:

t R - peak retention time; h - tuktok na taas; Wj/j - peak width sa kalahati ng taas nito

kanin. 1.1. Uri ng chromatogram depende sa kahusayan at selectivity ng column:

A- normal na selectivity, nabawasan ang kahusayan (mas kaunting mga teoretikal na plato); b - karaniwang pagpili at kahusayan; V - normal na kahusayan, tumaas na selectivity (mas mataas na ratio ng mga oras ng pagpapanatili ng bahagi)

kahusayan, mas malaki ang FTT, mas maliit ang pagpapalawak ng rurok ng unang makitid na banda habang dumadaan ito sa column, at mas makitid ang peak sa labasan ng column. Tinutukoy ng PTT ang bilang ng mga hakbang sa pagtatatag ng equilibrium sa pagitan ng mga mobile at nakatigil na phase.

Pag-alam sa bilang ng mga teoretikal na plato sa bawat haligi at ang haba ng hanay L (µm), pati na rin ang average na sorbent grain diameter d c (µm), madaling makuha ang mga halaga ng taas na katumbas ng isang theoretical plate (HETT), pati na rin ang pinababang taas na katumbas ng isang theoretical plate (RHETT):

BETT = L/ N

PVETT =B3TT/d c .

Ang pagkakaroon ng mga halaga ng FTT, HETT at PHETT, madaling maihambing ng isa ang kahusayan ng mga hanay ng iba't ibang uri, iba't ibang haba, na puno ng mga sorbents ng iba't ibang kalikasan at granularity. Sa pamamagitan ng paghahambing ng PTT ng dalawang haligi ng parehong haba, ang kanilang kahusayan ay inihambing. Kapag inihambing ang HETP, ang mga column na may sorbents ng parehong laki ng butil at magkaibang haba ay inihahambing. Sa wakas, pinapayagan ng halaga ng PVETT para sa alinmang dalawang column na suriin ang kalidad ng sorbent, una, at ang kalidad ng pagpuno sa mga column, at pangalawa, anuman ang haba ng mga column, ang granulation ng mga sorbent ng kalikasan nito.

Malaki ang papel ng pagpili ng column sa pagkamit ng chromatographic separation.

Ang selectivity ng isang column ay nakasalalay sa maraming salik, at ang kakayahan ng experimenter ay higit na tinutukoy ng kakayahang maimpluwensyahan ang selectivity ng paghihiwalay. Para dito, tatlong napakahalagang salik ang nasa kamay ng chromatographer: ang pagpili ng kemikal na kalikasan ng sorbent, ang pagpili ng komposisyon ng solvent at ang mga modifier nito, at isinasaalang-alang ang kemikal na istraktura at mga katangian ng mga pinaghiwalay na sangkap. . Minsan ang isang pagbabago sa temperatura ng haligi, na nagbabago sa mga koepisyent ng pamamahagi ng mga sangkap sa pagitan ng mga mobile at nakatigil na phase, ay may kapansin-pansing epekto sa selectivity.

Kapag isinasaalang-alang at sinusuri ang paghihiwalay ng dalawang bahagi sa isang chromatogram, ang resolution ay isang mahalagang parameter. R s, na nag-uugnay sa mga oras ng output at peak na lapad ng magkahiwalay na bahagi

Ang resolution bilang parameter na nagpapakilala sa peak separation ay tumataas habang tumataas ang selectivity, na sinasalamin ng pagtaas ng numerator, at ang kahusayan ay tumataas, na sinasalamin ng pagbaba sa halaga ng denominator dahil sa pagbaba sa lapad ng mga peak. Samakatuwid, ang mabilis na pag-unlad ng liquid chromatography ay humantong sa isang pagbabago sa konsepto ng "high pressure liquid chromatography" - ito ay pinalitan ng "high resolution liquid chromatography" (habang ang pinaikling anyo ng termino sa Ingles ay napanatili HPLC bilang ang pinakatama na nagpapakilala sa direksyon ng pag-unlad ng modernong likidong kromatograpiya).

Kaya, nababawasan ang paghuhugas ng column at nadaragdagan ang kahusayan kapag ginamit ang mas pinong sorbent, mas pare-pareho ang komposisyon (makitid na bahagi), mas siksik at pantay na naka-pack sa column, gamit ang mas manipis na graft phase layer, hindi gaanong malapot na solvent at pinakamainam na rate ng daloy.

Gayunpaman, kasama ang pag-blur ng chromatographic zone band sa panahon ng proseso ng paghihiwalay sa column, maaari din itong hugasan sa device para sa pagpapasok ng sample, sa connecting capillaries injector - column at column - detector, sa detector cell at sa ilang mga pantulong na aparato (microfilters para sa pag-trap ng mga mekanikal na particle mula sa mga sample na naka-install pagkatapos ng injector, pre-column, coil reactors, atbp.) - Kung mas malaki ang extra-column volume kumpara sa napanatili na volume ng peak, mas malaki ang erosion. Mahalaga rin kung saan matatagpuan ang dead volume: mas makitid ang chromatographic signal, mas malaki ang paglabo ng dead volume. Samakatuwid, ang espesyal na pansin ay dapat bayaran sa disenyo ng bahaging iyon ng chromatograph kung saan ang chromatographic zone ay ang pinakamakitid (ang injector at mga aparato mula sa injector hanggang sa column) - dito ang extra-column erosion ay pinaka-delikado at may pinakamalaking epekto. Bagama't pinaniniwalaan na sa mga chromatograph na mahusay na idinisenyo ang mga pinagmumulan ng karagdagang pagbabanto ng extra-column ay dapat na bawasan sa pinakamababa, gayunpaman, ang bawat bagong device, ang bawat pagbabago ng chromatograph ay kinakailangang magtapos sa pagsubok sa isang column at paghahambing ng resultang chromatogram kasama ang isang pasaporte. Kung ang pinakamataas na pagbaluktot o isang matalim na pagbaba sa kahusayan ay naobserbahan, ang mga capillary at iba pang mga aparato na bagong ipinakilala sa system ay dapat na maingat na inspeksyon.

Ang off-column washout at ang maling paghuhusga nito ay maaaring humantong sa isang makabuluhang (mahigit 50%) pagkawala ng kahusayan, lalo na sa mga kaso kung saan ang mga medyo lumang chromatograph ay tinangka na gamitin para sa high-speed HPLC, microcolumn HPLC, at iba pang variant ng modernong HPLC na nangangailangan microinjector, pagkonekta ng mga capillary na may panloob na diameter na 0.05-0.15 mm ng pinakamababang haba, mga haligi na may kapasidad na 10-1000 µl, mga detektor na may microcuvettes na may kapasidad na 0.03-1 µl at may mataas na bilis, high-speed recorder at integrator .

1.2. SOLVENT RETENTION AT LAKAS

Upang maihiwalay ang mga analyte sa haligi, tulad ng nabanggit sa itaas, ang koepisyent ng kapasidad k" dapat na mas malaki kaysa sa 0, ibig sabihin, ang mga sangkap ay dapat mapanatili ng nakatigil na yugto, ang sorbent. Gayunpaman, hindi dapat masyadong mataas ang capacity factor para makakuha ng katanggap-tanggap na oras ng elution. Kung para sa isang pinaghalong sangkap ay pinili ang isang nakatigil na yugto na nagpapanatili sa kanila, kung gayon ang karagdagang gawain sa pagbuo ng isang diskarte sa pagsusuri ay binubuo sa pagpili ng isang solvent na perpektong magbibigay ng iba para sa lahat ng mga bahagi, ngunit katanggap-tanggap na hindi masyadong malaki. k". Ito ay nakakamit sa pamamagitan ng pagbabago ng lakas ng elution ng solvent.

Sa kaso ng adsorption chromatography sa silica gel o aluminum oxide, bilang panuntunan, ang lakas ng isang dalawang bahagi na solvent (halimbawa, hexane na may pagdaragdag ng isopropanol) ay nadagdagan sa pamamagitan ng pagtaas ng nilalaman ng polar component (isopropanol), o nabawasan sa pamamagitan ng pagpapababa ng nilalaman ng isopropanol. Kung ang naglalaman ng polar component ay nagiging masyadong maliit (mas mababa sa 0.1%), dapat itong palitan ng mas mahinang puwersa ng elution. Ang parehong ay tapos na, pinapalitan ang alinman sa polar o non-polar component sa iba, kahit na ang system na ito ay hindi nagbibigay ng nais na selectivity na may paggalang sa mga bahagi ng interes sa timpla. Kapag pumipili ng mga solvent system, parehong ang solubility ng mga bahagi ng pinaghalong at ang eluotropic na serye ng mga solvent na pinagsama-sama ng iba't ibang mga may-akda ay isinasaalang-alang.

Ang lakas ng solvent ay pinili sa humigit-kumulang sa parehong paraan kapag gumagamit ng grafted polar phase (nitrile, amino, diol, nitro, atbp.), na isinasaalang-alang ang mga posibleng kemikal na reaksyon at hindi kasama ang mga solvent na mapanganib sa phase (halimbawa, ketones para sa amino phase).

Sa kaso ng reverse phase chromatography, ang lakas ng solvent ay nadaragdagan sa pamamagitan ng pagtaas ng nilalaman ng organic na bahagi sa eluent (methanol, acetonitrile o THF) at nababawasan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mas maraming tubig. Kung hindi posible na makamit ang nais na pagpili, gumamit sila ng isa pang organikong sangkap o subukang baguhin ito gamit ang iba't ibang mga additives (mga acid, ion-pair reagents, atbp.).

Sa mga paghihiwalay gamit ang ion exchange chromatography, ang lakas ng solvent ay binago sa pamamagitan ng pagtaas o pagbaba ng konsentrasyon ng buffer solution o pagbabago ng pH sa ilang mga kaso, ang pagbabago sa mga organikong sangkap ay ginagamit.

Gayunpaman, lalo na sa kaso ng mga kumplikadong natural at biological na pinaghalong, madalas na hindi posible na piliin ang lakas ng solvent sa paraan na ang lahat ng mga sample na bahagi ay nag-elute sa loob ng isang katanggap-tanggap na oras. Pagkatapos ay kailangan mong gumamit ng gradient elution, ibig sabihin, gumamit ng solvent na ang lakas ng elution ay nagbabago sa panahon ng proseso ng pagsusuri upang patuloy itong tumaas ayon sa isang paunang natukoy na programa. Ang pamamaraan na ito ay ginagawang posible upang makamit ang elution ng lahat ng mga bahagi ng mga kumplikadong mixtures sa isang medyo maikling panahon at ang kanilang paghihiwalay sa mga bahagi sa anyo ng makitid na mga taluktok.

1.3. SORBENT PARTICLE SIZE, PERMEABILITY AT EFFICIENCY

Isinasaalang-alang ang pagguho sa haligi, ipinahiwatig namin na ang kahusayan ng haligi (HETT) ay nakasalalay sa laki ng mga partikulo ng sorbent. Sa isang malaking lawak, ang mabilis na pag-unlad ng HPLC sa nakalipas na 10-12 taon ay dahil, una, sa pagbuo ng mga pamamaraan para sa paggawa ng mga sorbents na may mga laki ng butil mula 3 hanggang 10 microns at may isang makitid na fractional na komposisyon, na nagbibigay ng mataas na kahusayan na may mahusay. pagkamatagusin, at pangalawa, ang mga paraan ng pag-develop para sa pagpuno ng mga column gamit ang mga sorbent na ito at, pangatlo, ang pagbuo at serial production ng mga likidong chromatograph na may mga high-pressure pump, injector at detector na may maliit na volume na cuvettes na may kakayahang mag-record ng maliliit na volume na peak.

Para sa well-packed na slurry-packed na column, ang pinababang katumbas na theoretical plate height (LPHE) ay maaaring maging 2 hindi alintana kung 3, 5, 10, o 20 μm na particle ang ginagamit para sa pag-iimpake. Sa kasong ito, makakatanggap kami ng ayon sa pagkakabanggit ng mga column (na may karaniwang haba na 250 mm) na may kahusayan na 41670, 25000, 12500 at 6250 t.t. Mukhang natural na piliin ang pinaka-epektibong column na may 3 µm na particle. Gayunpaman, ang kahusayan na ito ay darating sa halaga ng napakataas na operasyon ng presyon at medyo mababa ang bilis ng paghihiwalay, dahil ang umiiral na bomba ay malamang na makakapagbomba ng solvent sa pamamagitan ng naturang column sa isang mataas na volumetric velocity. Narito tayo ay nahaharap sa tanong ng ugnayan sa pagitan ng laki ng butil ng sorbent, ang kahusayan at pagkamatagusin ng mga haligi.

Kung ipahayag natin ang salik ng paglaban ng haligi mula dito - isang walang sukat na dami, makukuha natin ang sumusunod na equation:

Ang resistance factor para sa mga column na naka-pack na may microparticle ng parehong uri gamit ang parehong paraan ay bahagyang nag-iiba at ang mga sumusunod na halaga:

Uri ng butil "... Irregular Spherical

anyo ng anyo

Tuyong packaging. . . . . 1000-2000 800-1200

Packaging ng suspensyon. . . 700-1500 500-700

Ang presyon ng pumapasok ng column ay proporsyonal sa linear flow velocity, column drag factor, solvent viscosity, at column length at inversely proportional sa square ng particle diameter.

Ang paglalapat ng ugnayang ito sa mga column na inilarawan sa itaas na may mga particle na may diameter na 3, 5, 10 at 20 µm at sa pag-aakalang pare-pareho ang linear flow rate, column resistance factor at solvent viscosity, nakakakuha kami ng inlet pressure ratio na 44:16:4:1. para sa mga haligi na may pantay na haba. Kaya, kung para sa isang reverse-phase sorbent na may laki ng particle na 10 μm kapag gumagamit ng methanol solvent system - . tubig (70:30) kadalasan sa isang karaniwang hanay sa isang solvent flow rate na 1 ml/min, ang presyon sa pasukan sa column ay 5 MPa, pagkatapos ay para sa mga particle na 5 μm - 20 MPa at para sa 3 μm - 55 MPa . Kapag gumagamit ng silica gel at isang hindi gaanong malapot na solvent system, hexane - isopropanol (100:2), ang mga halaga ay magiging makabuluhang mas mababa: 1, 4 at 11 MPa, ayon sa pagkakabanggit. Kung sa kaso ng isang reversed-phase sorbent ang paggamit ng mga particle na may sukat na 3 μm ay napaka-problema, at ang 5 μm ay posible, ngunit hindi sa lahat ng mga aparato, kung gayon para sa isang normal na phase na sorbent ay walang mga problema sa presyon. Dapat pansinin na ang modernong high-speed na HPLC ay karaniwang gumagamit ng mas mataas na solvent flow rate kaysa sa halimbawa sa itaas, kaya ang mga kinakailangan sa presyon ay tumataas pa.

Gayunpaman, sa mga kaso kung saan ang isang tiyak na bilang ng mga teoretikal na plato ay kinakailangan para sa paghihiwalay at ito ay kanais-nais na magsagawa ng pagtatasa ng rate, ang larawan ay medyo nagbabago. Dahil ang mga haba ng mga haligi na may sorbents na may mga laki ng butil na 3, 5, 10 microns, na may pantay na kahusayan, ay magiging 7.5, ayon sa pagkakabanggit; 12.5 at 25 cm, pagkatapos ay ang ratio ng presyon sa pumapasok sa mga haligi ay magbabago sa 3:2:1. Alinsunod dito, ang tagal ng pagsusuri sa naturang mga haligi ng pantay na kahusayan ay nasa ratio na 0.3:0.5:1, ibig sabihin, kapag lumilipat mula 10 hanggang 5 at 3 microns, ang tagal ng pagsusuri ay mababawasan ng 2 at 3.3 beses. Ang mas mabilis na pagsusuri na ito ay nagmumula sa halaga ng proporsyonal na mas mataas na presyon sa pumapasok ng column.

Ang data na ipinakita ay wasto para sa mga kaso kung saan ang mga sorbents ng iba't ibang laki ng butil ay may parehong mga curve ng pamamahagi ng laki ng particle, ang mga column ay naka-pack sa parehong paraan at may parehong column resistance factor. Dapat itong isipin na ang kahirapan sa pagkuha ng makitid na mga fraction ng sorbent ay tumataas habang ang laki ng butil ay bumababa at iyon. Ang mga fraction mula sa iba't ibang mga tagagawa ay may iba't ibang mga fractional na komposisyon. Samakatuwid, mag-iiba ang column resistance factor depende sa laki ng butil, uri ng sorbent, paraan ng pag-pack ng column, atbp.

CLASSIFICATION OF HPLC METHODS BY SEPARATION MECHANISM

Karamihan sa mga paghihiwalay na isinagawa ng HPLC ay batay sa isang halo-halong mekanismo ng pakikipag-ugnayan ng mga sangkap na may isang sorbent, na nagbibigay ng mas malaki o mas mababang pagpapanatili ng mga bahagi sa column. Ang mga mekanismo ng paghihiwalay sa mas marami o mas purong anyo ay medyo bihira sa pagsasanay, halimbawa, adsorption kapag gumagamit ng ganap na anhydrous silica gel at anhydrous hexane upang paghiwalayin ang mga aromatic hydrocarbon.

Sa isang halo-halong mekanismo ng pagpapanatili para sa mga sangkap ng iba't ibang mga istraktura at mga timbang ng molekular, posibleng suriin ang kontribusyon sa pagpapanatili ng adsorption, pamamahagi, pagbubukod at iba pang mga mekanismo. Gayunpaman, para sa isang mas mahusay na pag-unawa at pag-unawa sa mga mekanismo ng paghihiwalay sa HPLC, ipinapayong isaalang-alang ang mga paghihiwalay na may nangingibabaw na isa o ibang mekanismo na nauugnay sa isang tiyak na uri ng chromatography, halimbawa, ion exchange chromatography.

2.1.1 ADSORPTION CHROMATOGRAPHY

Ang paghihiwalay sa pamamagitan ng adsorption chromatography ay isinasagawa bilang isang resulta ng pakikipag-ugnayan ng isang sangkap sa mga adsorbents, tulad ng silica gel o aluminum oxide, na may mga aktibong sentro sa ibabaw. Ang pagkakaiba sa kakayahang makipag-ugnayan sa mga sentro ng adsorption ng iba't ibang sample na molekula ay humahantong sa kanilang paghihiwalay sa mga zone sa panahon ng paggalaw kasama ang mobile phase sa kahabaan ng column. Ang paghihiwalay ng zone ng mga sangkap na nakamit sa kasong ito ay nakasalalay sa pakikipag-ugnayan sa parehong solvent at adsorbent.

Ang sorption sa ibabaw ng isang adsorbent na naglalaman ng mga hydroxyl group ay batay sa isang partikular na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng polar surface ng adsorbent at polar (o polarable) na mga grupo o mga seksyon ng mga molekula. Kabilang sa mga naturang pakikipag-ugnayan ang dipole-dipole na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng permanente o sapilitan na mga dipoles, ang pagbuo ng isang hydrogen bond, hanggang sa pagbuo ng mga r-complex o charge transfer complex. Ang isang posible at medyo madalas na pangyayari sa praktikal na gawain ay ang pagpapakita ng chemisorption, na maaaring humantong sa isang makabuluhang pagtaas sa oras ng pagpapanatili, isang matalim na pagbaba sa kahusayan, ang hitsura ng mga produkto ng agnas o hindi maibabalik na pagsipsip ng sangkap.

Ang adsorption isotherms ng mga substance ay may linear, convex o concave na hugis. Sa isang linear adsorption isotherm, ang rurok ng sangkap ay simetriko at ang oras ng pagpapanatili ay hindi nakasalalay sa laki ng sample. Kadalasan, ang mga isotherm ng adsorption ng mga sangkap ay nonlinear at may convex na hugis, na humahantong sa ilang asymmetry ng peak na may pagbuo ng isang buntot.

Ang pinakamalawak na ginagamit sa HPLC ay ang mga silica gel adsorbents na may iba't ibang dami ng butas, mga lugar sa ibabaw, at mga diameter ng butas. Ang aluminyo oksido ay hindi gaanong ginagamit at ang iba pang mga adsorbents, na malawakang ginagamit sa klasikal na column at thin-layer chromatography, ay bihirang ginagamit. Ang pangunahing dahilan para dito ay ang hindi sapat na mekanikal na lakas ng karamihan sa iba pang mga adsorbents, na hindi pinapayagan ang mga ito na ma-package o magamit sa mataas na presyon na katangian ng HPLC.

Ang mga polar group na nagdudulot ng adsorption at matatagpuan sa ibabaw ng silica gel at aluminum oxide ay magkatulad sa mga katangian. Samakatuwid, kadalasan ang pagkakasunud-sunod ng elution ng mga pinaghalong sangkap at ang eluotropic na serye ng mga solvent ay pareho para sa kanila. Gayunpaman, ang pagkakaiba sa kemikal na istraktura ng silica gel at aluminyo oksido ay humahantong minsan sa mga pagkakaiba sa pagpili - pagkatapos ay ibinibigay ang kagustuhan sa isa o ibang adsorbent na mas angkop para sa isang partikular na gawain. Halimbawa, ang alumina ay nagbibigay ng higit na pagpili para sa paghihiwalay ng ilang polynuclear aromatic hydrocarbons.

Ang kagustuhan na karaniwang ibinibigay sa silica gel kumpara sa aluminum oxide ay ipinaliwanag ng mas malawak na pagpipilian ng mga silica gel sa mga tuntunin ng porosity, ibabaw at diameter ng butas, pati na rin ang makabuluhang mas mataas na catalytic na aktibidad ng aluminum oxide, na kadalasang humahantong sa pagbaluktot ng mga resulta ng pagsusuri. dahil sa agnas ng mga sample na bahagi o ang kanilang hindi maibabalik na chemisorption.

2.1.2 Mga disadvantages ng adsorption chromatography na naglilimita sa paggamit nito

Ang katanyagan ng adsorption chromatography ay unti-unting bumagsak habang ang pamamaraan ng HPLC ay pinapalitan at patuloy na pinapalitan ng iba pang mga opsyon, tulad ng reverse-phase at normal-phase na HPLC sa mga sorbent na may grafted phase. Ano ang mga disadvantages ng adsorption chromatography na humantong dito?

Una sa lahat, ito ang mahabang tagal ng mga proseso ng pag-equilibrate ng mga adsorbents na may mga solvent na naglalaman ng tubig sa mga bakas na dami, ang kahirapan sa paghahanda ng mga naturang solvent na may isang tiyak at maaaring kopyahin na kahalumigmigan. Nagreresulta ito sa hindi magandang reproducibility ng retention, resolution, at selectivity na mga parameter. Para sa parehong dahilan, imposibleng gumamit ng gradient elution - ang pagbabalik sa paunang estado ay napakatagal na ito ay makabuluhang lumampas sa oras na nakuha sa pamamagitan ng paggamit ng gradient.

Ang mga makabuluhang disadvantages ng mga adsorbents, lalo na ang aluminum oxide, na nauugnay sa madalas na mga kaso ng muling pagsasaayos ng mga compound na sensitibo sa catalysis, ang kanilang agnas, at hindi maibabalik na sorption, ay kilala rin at paulit-ulit na nabanggit sa panitikan. Ang mga hindi maibabalik na sorbed na mga sangkap, na naipon sa paunang seksyon ng haligi, ay nagbabago sa likas na katangian ng sorbent at maaaring humantong sa isang pagtaas sa paglaban ng haligi o maging sa kumpletong pagbara nito. Ang huling sagabal ay maaaring alisin sa pamamagitan ng paggamit ng isang pre-column, na Sa pamamagitan ng- Habang tumataas ang resistensya at pagbabara, pinapalitan ito ng bago* o nire-refill ng bagong sorbent. Gayunpaman, ang hindi maibabalik na sorption, na nangyayari rin sa kasong ito, ay nagreresulta sa isang chromatogram kung saan ang mga sample na bahagi na sensitibo sa sorption o catalytic decomposition ay ganap o bahagyang wala.

2.2. DISTRIBUTION CHROMATOGRAPHY

Ang partition chromatography ay isang variant ng HPLC kung saan ang paghihiwalay ng isang halo sa mga bahagi ay isinasagawa dahil sa pagkakaiba sa kanilang mga koepisyent ng pamamahagi sa pagitan ng dalawang hindi mapaghalo na mga phase: isang solvent (mobile phase) at isang phase sa sorbent (stationary phase). Sa kasaysayan, ang una ay mga sorbents ng ganitong uri, na nakuha sa pamamagitan ng paglalagay ng mga liquid phase (oxydipropionitrile, paraffin oil, atbp.) sa mga porous na suporta, katulad ng kung paano ang mga sorbents at inihanda para sa gas-liquid chromatography (GLC). Gayunpaman, ang mga disadvantages ng naturang mga sorbents ay agad na ipinahayag, ang pangunahing kung saan ay ang medyo mabilis na anlaw ng bahagi mula sa carrier. Dahil dito, unti-unting bumababa ang dami ng phase sa column, bumababa rin ang retention time, at ang mga adsorption center na hindi sakop ng phase ay lumitaw sa unang seksyon ng column, na nagiging sanhi ng pagbuo ng mga peak tails. Ang disbentaha na ito ay nalabanan sa pamamagitan ng saturating ng solvent sa inilapat na bahagi bago ito pumasok sa column. Ang entrainment ay nabawasan din kapag ginamit ang mas malapot at hindi gaanong natutunaw na mga yugto ng polimer, ngunit sa kasong ito, dahil sa kahirapan ng pagsasabog mula sa makapal na polymer film, ang kahusayan ng haligi ay kapansin-pansing nabawasan.

Ito ay naging lohikal na i-graft ang likidong bahagi sa carrier sa pamamagitan ng mga kemikal na bono sa paraang ang pag-alis nito ay magiging pisikal na imposible, ibig sabihin, upang gawing isa ang carrier at ang bahagi - sa tinatawag na grafted-phase sorbent.

Ang mga kasunod na pagsisikap ng mga mananaliksik ay naglalayong maghanap ng mga reagents na ang paghugpong ay magpapatuloy nang mabilis at ganap, at ang mga bono na nabuo ay magiging matatag hangga't maaari. Ang mga naturang reagents ay alkylchlorosilanes at ang kanilang mga derivatives, na naging posible, gamit ang isang katulad na teknolohiya, upang makakuha ng graft-phase sorbents ng iba't ibang uri at may iba't ibang mga polar at non-polar na grupo sa ibabaw.

Ang matagumpay na aplikasyon ng huling uri ng mga sorbent para sa HPLC ay nag-ambag sa paglago ng kanilang produksyon ng iba't ibang uri ng mga tagagawa. Ang bawat kumpanya ay gumawa ng gayong mga sorbents, bilang panuntunan, batay sa sarili nitong uri ng silica gel at gamit ang sarili nitong teknolohiya, na kadalasang bumubuo ng produksyon na "kaalaman". Bilang resulta, ang isang malaking bilang ng mga sorbents, na tinatawag na kemikal na eksaktong pareho (halimbawa, octadecylsilane-grafted silica gel), ay may ibang kakaibang katangian ng chromatographic. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang silica gel ay maaaring magkaroon ng mas malawak o mas makitid na mga pores, ibang ibabaw, porosity, ang ibabaw nito bago ang paghugpong ay maaaring hydroxylated o hindi, mono-, di- o trichlorosilanes ay maaaring grafted, grafting kondisyon ay maaaring magbigay ng monomeric, polymeric o mixed layer phase, iba't ibang pamamaraan ang ginagamit upang alisin ang mga natitirang reagents, ang karagdagang pag-deactivate ng silanol at iba pang aktibong grupo ay maaaring gamitin o hindi.

Ang pagiging kumplikado ng teknolohiya para sa paghugpong ng mga reagents at paghahanda ng mga hilaw na materyales at materyales, ang multi-stage na kalikasan nito, ay humahantong sa katotohanan na kahit na ang mga batch ng sorbents na nakuha gamit ang parehong teknolohiya mula sa isang kumpanya ng pagmamanupaktura ay maaaring magkaroon ng bahagyang magkakaibang mga katangian ng chromatographic. Ito ay totoo lalo na sa mga kaso kung saan ang mga naturang sorbents ay ginagamit para sa pagsusuri ng mga multicomponent mixtures na naglalaman ng mga sangkap na kapansin-pansing naiiba sa bilang at posisyon ng mga functional na grupo, at ang uri ng pag-andar.

Isinasaalang-alang ang nasa itaas, dapat palaging magsikap na tiyakin na kapag ginagamit ang pamamaraan ng pagsusuri na inilarawan sa panitikan, ang parehong sorbent at parehong mga kondisyon ng operating ay ginagamit. Sa kasong ito, ang posibilidad na ang akda ay hindi mai-reproduce ay minimal. Kung hindi ito posible, ngunit ang isang sorbent mula sa isa pang kumpanya na may katulad na grafted phase ay kinuha, kailangan mong maging handa para sa katotohanan na ito ay magtatagal upang muling isagawa ang pamamaraan. Kasabay nito, mayroong isang posibilidad (at dapat itong isaalang-alang) na sa sorbent na ito, kahit na pagkatapos ng mahabang pag-unlad, ang kinakailangang paghihiwalay ay maaaring hindi makamit. Ang pagkakaroon sa panitikan ng maraming inilarawan na mga diskarte sa paghihiwalay sa mga lumang sorbents na ginawa sa loob ng mahabang panahon ay nagpapasigla sa kanilang karagdagang produksyon at paggamit para sa kadahilanang ito. Gayunpaman, sa mga kaso kung saan kinakailangan na magpatuloy sa pagbuo ng mga orihinal na pamamaraan, lalo na may kaugnayan sa mga sangkap na madaling kapitan ng pagkabulok, chemisorption, muling pagsasaayos, ipinapayong magsimulang magtrabaho sa mga sorbents na binuo kamakailan at ginawa gamit ang bago, pinabuting mga bersyon ng teknolohiya. Ang mga bagong sorbent ay may mas pare-parehong fractional na komposisyon, mas pare-pareho at kumpletong saklaw sa ibabaw na may grafted phase, at mas advanced na huling yugto ng pagpoproseso ng sorbent.

2.3. ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

Sa ion exchange chromatography, ang paghihiwalay ng mga bahagi ng pinaghalong ay nakakamit sa pamamagitan ng nababaligtad na pakikipag-ugnayan ng mga ionizing substance sa mga ionic na grupo ng sorbent. Ang pagpapanatili ng elektrikal na neutralidad ng sorbent ay sinisiguro ng pagkakaroon ng mga counterion na may kakayahang ion exchange na matatagpuan malapit sa ibabaw. Ang ion ng ipinakilalang sample, na nakikipag-ugnayan sa nakapirming singil ng sorbent, ay nakikipagpalitan sa counterion. Ang mga sangkap na may iba't ibang affinity para sa mga fixed charge ay pinaghihiwalay sa mga anion exchanger o cation exchanger ay may positibong charge na mga grupo sa surface at ang mga cation exchanger ay naglalaman ng mga grupo na may -negative na charge na nakikipag-ugnayan sa mga cations.

Bilang isang mobile phase, ang mga may tubig na solusyon ng mga asin ng mga acid, base at solvents tulad ng likidong ammonia ay ginagamit, ibig sabihin, mga solvent system na may mataas na dielectric na pare-pareho at isang mas malaking tendensya na mag-ionize ng mga compound halaga na dapat iakma.

Sa panahon ng chromatographic separation, ang mga ion ng analyte ay nakikipagkumpitensya sa mga ion na nakapaloob sa eluent, na may posibilidad na makipag-ugnayan sa magkasalungat na sinisingil na mga grupo ng sorbent. Ito ay sumusunod na ang ion exchange chromatography ay maaaring gamitin upang paghiwalayin ang anumang mga compound na maaaring ionized sa ilang paraan. Posibleng pag-aralan ang kahit na neutral na mga molekula ng asukal sa anyo ng kanilang mga complex na may borate ion:

Asukal + VO 3 2 - = Asukal -VO 3 2 -.

Ion exchange chromatography ay kailangang-kailangan para sa paghihiwalay ng mga highly polar substance, na hindi masusuri ng GLC nang walang conversion sa derivatives. Kasama sa mga compound na ito ang mga amino acid, peptides, at sugars.

Ang Ion exchange chromatography ay malawakang ginagamit sa medisina, biology, biochemistry, para sa pagsubaybay sa kapaligiran, sa pagsusuri ng nilalaman ng mga gamot at kanilang mga metabolite sa dugo at ihi, mga pestisidyo sa mga hilaw na materyales ng pagkain, pati na rin para sa paghihiwalay ng mga hindi organikong compound, kabilang ang radioisotopes, lanthanides, actinides, atbp. Ang pagsusuri ng mga biopolymer (protina, nucleic acid, atbp.), na karaniwang tumatagal ng mga oras o araw, ay isinasagawa gamit ang ion exchange chromatography sa loob ng 20-40 minuto na may mas mahusay na paghihiwalay. Ang paggamit ng ion exchange chromatography sa biology ay naging posible upang obserbahan ang mga sample nang direkta sa biological media, na binabawasan ang posibilidad ng muling pagsasaayos o isomerization, na maaaring humantong sa hindi tamang interpretasyon ng huling resulta. Ito ay kagiliw-giliw na gamitin ang paraang ito upang masubaybayan ang mga pagbabagong nagaganap sa mga biyolohikal na likido. Ang paggamit ng mga porous na mahinang anion exchangers batay sa silica gel ay nagpapahintulot sa paghihiwalay ng mga peptides. V

Ang mekanismo ng palitan ng ion ay maaaring katawanin sa anyo ng mga sumusunod na equation:

para sa pagpapalitan ng anion

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

para sa cation exchange |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

Sa unang kaso, ang X~ sample ion ay nakikipagkumpitensya sa mobile phase ion Y~ para sa R+ ion centers ng ion exchanger, at sa pangalawang kaso, ang X+ sample cations ay nakikipagkumpitensya sa Y+ ions ng mobile phase para sa R. ~ mga ionic center.

Naturally, ang mga sample na ion na mahinang nakikipag-ugnayan sa ion exchanger ay mahinang mananatili sa column sa panahon ng kumpetisyon na ito at ang unang mahuhugasan mula rito, at, sa kabaligtaran, ang mas malakas na napanatili na mga ion ay ang huling mag-elute mula sa column. . Kadalasan, nangyayari ang mga pakikipag-ugnayan ng BTqpH4Hbie na may likas na nonionic dahil sa adsorption o hydrogen bond ng sample na may nonionic na bahagi ng matrix o dahil sa limitadong solubility ng sample sa mobile phase. Mahirap na ihiwalay ang "klasikal" na chromatography ng pagpapalitan ng ion sa "purong" na anyo nito, at samakatuwid ang ilang mga chromatographer ay nagpapatuloy mula sa mga empirikal kaysa sa teoretikal na mga prinsipyo sa chromatography ng pagpapalitan ng ion.

Ang paghihiwalay ng mga partikular na sangkap ay pangunahing nakasalalay sa pagpili ng pinaka-angkop na sorbent at mobile phase. Ang mga resin ng pagpapalitan ng ion at mga silica gel na may mga grafted na ionogenic na grupo ay ginagamit bilang mga nakatigil na yugto sa chromatography ng pagpapalitan ng ion.

2.4. SECTION EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

Ang pagbubukod ng chromatography ay isang opsyon! liquid chromatography, kung saan nangyayari ang paghihiwalay dahil sa pamamahagi ng mga molekula sa pagitan ng solvent na matatagpuan sa loob ng mga pores ng sorbent at ng solvent na dumadaloy. " sa pagitan ng mga particle nito.

Hindi tulad ng iba pang mga pagpipilian sa HPLC, kung saan ang paghihiwalay darating Dahil sa iba't ibang pakikipag-ugnayan ng mga bahagi sa ibabaw ng sorbent, ang papel ng solid filler sa laki ng pagbubukod ng chromatography ay upang bumuo lamang ng mga pores ng isang tiyak na laki, at ang nakatigil na yugto ay ang solvent na pumupuno sa mga pores na ito. Samakatuwid, ang paggamit ng terminong "sorbent" sa mga tagapuno na ito ay sa isang tiyak na lawak arbitrary.

Ang isang pangunahing tampok ng pamamaraan ay ang kakayahang paghiwalayin ang mga molekula ayon sa kanilang laki sa solusyon sa hanay ng halos anumang molekular na timbang - mula 10 2 hanggang 10 8, na ginagawang kailangang-kailangan para sa pag-aaral ng synthetic at biopolymers.

Ayon sa kaugalian, ang proseso na isinasagawa sa mga organikong solvent ay madalas na tinatawag na gel permeation chromatography, at sa mga may tubig na sistema - gel filtration chromatography. Sa aklat na ito, isang termino ang pinagtibay para sa parehong mga opsyon, na nagmula sa English na "Size Exclusion" - pagbubukod ayon sa laki - at pinaka-ganap na sumasalamin sa mekanismo ng proseso.

Ang isang detalyadong pagsusuri ng mga umiiral na ideya tungkol sa napakakomplikadong teorya ng proseso ng pagbubukod ng laki ng kromatograpiya ay isinasagawa sa mga monograp.

Kabuuang dami ng solvent sa column Vt (ito ay madalas na tinatawag na kabuuang dami ng hanay, dahil Vd ay hindi nakikibahagi sa proseso ng chromatographic) ay ang kabuuan ng mga volume ng mga mobile at nakatigil na phase.

Ang pagpapanatili ng mga molekula sa isang haligi ng pagbubukod ay tinutukoy ng posibilidad ng kanilang pagsasabog sa mga pores at depende sa ratio ng mga sukat ng mga molekula at pores, na ipinapakita sa eskematiko sa Fig. 2.15. Koepisyent ng pamamahagi Ka, tulad ng sa iba pang mga variant ng chromatography, ito ay ang ratio ng mga konsentrasyon ng isang sangkap sa nakatigil at mobile phase.

Dahil ang mga mobile at nakatigil na phase ay may parehong komposisyon, kung gayon Kd isang sangkap kung saan ang parehong mga yugto ay pantay na naa-access ay katumbas ng pagkakaisa. Ang sitwasyong ito ay natanto para sa mga molekula C ng pinakamaliit na sukat (kabilang ang mga solvent na molekula), na tumagos sa lahat ng mga pores (tingnan ang Fig. 2.15) at samakatuwid ay gumagalaw sa hanay nang pinakamabagal. Ang kanilang dami ng pagpapanatili ay katumbas ng kabuuang dami ng solvent Vt-

kanin. 2.15. Modelo ng paghihiwalay ng molekular ayon sa sukat sa chromatography ng pagbubukod ng laki

Ang lahat ng mga molekula na ang laki ay mas malaki kaysa sa laki ng mga sorbent pores ay hindi maaaring pumasok sa kanila (kumpletong pagbubukod) at dumaan sa mga channel sa pagitan ng mga particle. Nag-elute sila mula sa column na may parehong volume ng retention na katumbas ng volume ng mobile phase V 0 - Ang partition coefficient para sa mga molecule na ito ay zero.

Ang mga molekula ng intermediate na laki, na may kakayahang tumagos lamang sa ilan sa mga pores, ay pinananatili sa haligi ayon sa kanilang laki. Ang koepisyent ng pamamahagi ng mga molekulang ito ay nag-iiba mula sa zero hanggang isa at nailalarawan ang bahagi ng dami ng butas na naa-access sa mga molekula ng isang naibigay na laki ay tinutukoy ng kabuuan ng V o at ang naa-access na bahagi ng dami ng butas.

KUALITATIVE ANALYSIS

Ang isang chromatographer na pumapasok sa larangan ng high-performance liquid chromatography ay dapat maging pamilyar sa mga batayan ng qualitative analysis. Ginagamit ang qualitative analysis upang matukoy ang isang kilalang produkto, nakuha sa isang bagong paraan o natagpuan sa isang halo sa iba pang mga produkto." Ito ay kinakailangan kapag naghihiwalay ng iba't ibang mga bahagi mula sa mga kumplikadong biological at kemikal na pinaghalong, na kung saan ay lalong mahalaga sa medisina, forensics, ekolohiya, para sa pagsubaybay sa pagkakaroon ng ilang mga produktong kemikal na panggamot at ang kanilang mga metabolite sa bioml.ter.ials..„ Ang "pamilyar sa mga pangunahing kaalaman sa husay" ay makakatulong upang maiwasan ang mga karaniwang pagkakamali, halimbawa/pagkilala sa mga impurities sa isang sample mula sa mga impurities sa isang solvent o sinusuri ang kadalisayan ng isang substance sa higit sa isang wavelength, ngunit sa iba't ibang mga, atbp.

Bago magpatuloy sa pagsusuri, kinakailangan upang matukoy kung ang buong sample ay na-eluted mula sa haligi ng isang naibigay na solvent system o hindi. Upang makatiyak ng kumpletong elution, kinakailangan upang kolektahin ang lahat ng likido na dumadaloy mula sa haligi, i-evaporate ang solvent, timbangin ang nalalabi at hanapin ang antas ng pagbawi ng sample.

Ang pagkilala sa mga bahagi sa HPLC ay maaaring gawin sa tatlong paraan: 1) paggamit ng impormasyon sa pagpapanatili; 2) suriin ang mga zone na nakuha sa panahon ng paghihiwalay sa isang likidong chromatograph column gamit ang spectral o chemical analysis na pamamaraan; 3) direktang ikonekta ang spectrum analyzer sa column.

Ang dami ng pagpapanatili ay ginagamit upang i-record ang mga peak sa chromatography. V R o oras ng pagpapanatili t R. Ang parehong dami ay katangian ng isang sangkap sa isang ibinigay na chromatographic system. Dahil ang oras ng pagpapanatili ng substance na pinaghihiwalay ay binubuo ng oras ng pakikipag-ugnayan sa column at ang oras ng pagpasa ng mga walang laman na seksyon ng tubo, nag-iiba ito sa bawat instrumento. Maginhawang magkaroon ng substance na hindi pinanatili ng isang naibigay na column, na isinasaalang-alang ito bilang isang pamantayan na ang oras ng pagpapanatili at dami t 0 , V o. Ang kromatograpiya ng sangkap at ang pamantayan ay dapat isagawa sa ilalim ng parehong mga kondisyon (presyon at rate ng daloy). Kapag natukoy ng data ng pagpapanatili, ang mga kilalang indibidwal na sangkap na maaaring naroroon sa mga sample ay pinaghihiwalay sa parehong chromatographic system at ang mga halaga ay nakuha para sa kanila. t R. Paghahambing ng mga halagang ito t R sa oras ng pagpapanatili ng hindi kilalang peak, makikita na sila ay nag-tutugma, kung saan malamang na ang mga taluktok ay tumutugma sa parehong sangkap, o t R hindi tumutugma ang kilalang sangkap t R hindi kilalang zone. Pagkatapos ay posible pa rin ang isang tinatayang pagtatantya ng mga halaga t R mga sangkap na hindi magagamit para sa direktang pagsukat ng antas ng kanilang pagpapanatili. Isaalang-alang natin ang parehong mga pagpipilian.

Sa unang kaso, ang isang paunang pag-aaral ng sample ay malinaw na kinakailangan upang i-postulate ang pagkakaroon ng mga partikular na sangkap dito. Kapag nagtatrabaho sa mga simpleng halo, hindi mahirap matukoy kung ang antas ng pagpapanatili ng mga zone ng sample at kilalang mga sangkap ay nag-tutugma o hindi, i.e. ang mga halaga. tB pareho o iba. Sa kaso ng mga kumplikadong pinaghalong, maraming mga sangkap ang maaaring mag-elute na may katulad na mga halaga t R, at ang mga zone na aktwal na nakuha sa panahon ng chromatographic separation ay magkakapatong. Bilang resulta, ang pagkuha ng mga tumpak na halaga t R nagiging imposible para sa iba't ibang mga zone. Ang pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan ay tumataas sa pagtaas ng resolusyon, mas maingat na kontrol sa mga kondisyon ng paghihiwalay, at paulit-ulit na pagsukat ng mga halaga t R at pag-average ng mga nahanap na halaga. Sa kasong ito, ang chromatographic separation ng kilala at hindi kilalang mga sangkap ay dapat na kahalili. Kapag naghihiwalay ng mga kumplikadong mixtures, ang halaga t R ang mga sangkap ay maaaring magbago sa ilalim ng impluwensya ng matrix ng sample mismo. Posible ang epektong ito sa simula ng chromatogram at kapag nagsasapawan ang mga taluktok; Posible rin na higpitan ang mga zone, tulad ng nabanggit na.

Sa ganitong mga kaso, ang pamantayan ay dapat idagdag sa sample sa isang 1:1 ratio Kung ang mga sangkap ay magkapareho, ang halaga t R ang panimulang materyal ay hindi nagbabago, at isang peak lamang ang nakuha sa chromatogram. Kung mayroon kang isang aparato na may isang cyclic chromatography system, pagkatapos ay para sa maaasahang pagkakakilanlan ay ipinapayong ipasa ang halo sa haligi ng maraming beses.

Ang impormasyon sa mga rate ng pagpapanatili ay matatagpuan din sa literatura, ngunit ang halaga ng impormasyong ito ay limitado. Dahil ang mga haligi mula sa kahit na parehong batch ay nagbibigay ng hindi magandang muling paggawa, ang mga halaga ng panitikan ay hindi palaging tumutugma sa tunay na halaga t R sa column na ito. Para sa adsorption chromatography, gayunpaman, posibleng hulaan t R batay sa datos ng panitikan. Isa pang kahirapan na nauugnay sa paggamit ng mga kahulugang pampanitikan t R, - ang kahirapan sa paghahanap ng mga ito sa espesyal na literatura, bagaman ang mga pagsusuri sa bibliograpikong inilathala sa Jornal ng chromatography ay may na-update na index ayon sa uri ng sangkap.

Sa pangalawang kaso, kapag ang mga oras ng pagpapanatili ng mga kilalang compound at sample zone ay hindi nagtutugma, posibleng hulaan ang oras ng pagpapanatili ng hindi kilalang bahagi. Ang mga hula ng kamag-anak na pagpapanatili batay sa data ng istraktura sa steric exclusion chromatography ay lubos na maaasahan. Hindi gaanong tumpak ang mga ito sa adsorption at partition chromatography, at lalo na kapag nagtatrabaho sa isang chemically bound phase. Para sa ion at ion-pair chromatography ng mga substance na may alam na p Ka Tanging mga tinatayang pagpapasiya ng mga halaga ang posible tR. Palaging mas madaling hulaan ang kaugnay na pagpapanatili o *x na mga halaga kaysa sa mga ganap na halaga k". Mga kamag-anak na halaga t R mas madaling masuri para sa mga nauugnay na compound o derivatives, tulad ng mga substituted na alkylcarboxylic acid o benzene derivatives.

Kapag isocratically na naghihiwalay ng mga homologue o oligomer, ang sumusunod na pattern ay minsan sinusunod:

\ gk" = A + Bn,

saan A At SA- mga constant para sa isang bilang ng mga napiling sample at para sa isang ibinigay na chromatographic system (sa parehong column, na may parehong mobile at stationary phase); P- ang bilang ng magkatulad na mga yunit ng istruktura sa sample na molekula.

Ang pagpapakilala ng isang functional group / sa sample na molekula ay hahantong sa isang pagbabago k" sa unang equation ng ilang constant coefficient a/ sa isang ibinigay na chromatographic system. Posibleng makakuha ng mga constant ng grupo a/ para sa iba't ibang mga substituent na grupo/, ang mga halaga nito ay tataas sa pagtaas ng polarity ng mga functional na grupo sa lahat ng uri ng chromatography, maliban sa reverse phase, kung saan ang mga halaga ng mga constant ay bababa sa pagtaas ng polarity.

Ang ilang mga constant ng grupo a/ para sa iba't ibang mga substituent na grupo/ ay ibinibigay sa talahanayan. 9.1.

Sa adsorption chromatography, ang unang equation ay hindi palaging naaangkop, dahil valid ito kung ang lahat ng isomer ay may parehong halaga. k", na hindi laging sinusunod. Posible, gayunpaman, na i-plot ang logfe" ng parehong mga compound sa isang column laban sa logfe" ng parehong mga compound sa ibang column o laban sa mga kaukulang katangian sa thin layer chromatography, halimbawa, log[(l- Rf) IRf].

Maaaring gamitin ang mga halaga ng koepisyent ng kapasidad kapag inihahambing ang data ng pagpapanatili k", dahil hindi katulad niya t R hindi apektado ang bilis ng mobile phase at ang mga geometric na feature ng column.

Ang mga paghihiwalay ng phase na may kaugnayan sa kemikal ay katulad ng mga paghihiwalay ng chromatography ng partition na may magkakatulad na mga phase, at samakatuwid ay maaaring gamitin ang data ng steady state extraction upang mahulaan ang mga oras ng pagpapanatili.

Sa ion exchange chromatography, tatlong salik ang nakakaimpluwensya sa antas ng pagpapanatili: ang antas ng ionization ng mga acid at base, ang singil ng ionized molecule, at ang kakayahan ng substance mula sa aqueous mobile phase na ginagamit sa ion exchange chromatography na lumipat sa organic yugto. Ang huli ay nakasalalay sa molecular weight ng compound at ang hydrophobicity nito. Samakatuwid, ang mas malakas na mga acid o base ay mas malakas na nananatili sa panahon ng paghihiwalay ng anion-exchange o cation-exchange. Kapag bumababa pK a ng isang indibidwal na acid na kasama sa sample, ang retention ay tumataas kapag ang isang bilang ng mga acid ay pinaghihiwalay dahil sa anion exchange, at sa pagtaas ng p/C o, ang retention ng mga base ay tumataas kapag sila ay nahiwalay dahil sa cation exchange.

Kaya, ang pagkakataon ng mga oras ng pagpapanatili ng isang kilalang sangkap sa naobserbahan ay ginagawang posible na ipagpalagay ang kanilang pagkakakilanlan. Ang pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan ay tumataas kung ang mga chromatogram ng isang kilalang sangkap at isang hindi kilalang sangkap ay inihahambing sa ilalim ng magkaibang mga kundisyon. Kung ang mga sangkap ay kumikilos nang magkapareho sa adsorption at reverse phase o ion exchange at size exclusion chromatography, tumataas ang pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan. Kung ang pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan na may pantay na kamag-anak na pagpapanatili ay 90%, kung gayon kapag pinag-aaralan ang pag-uugali ng parehong mga sangkap sa ilalim ng makabuluhang magkakaibang mga kondisyon, ang pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan ay 99%.

Ang isang mahalagang katangian ng isang substance na ginagamit sa pagkilala ay ang ratio ng mga signal na nakuha para sa isang partikular na substance sa dalawang magkaibang detector. Ang nasuri na sangkap, pagkatapos umalis sa hanay, ay dumaan muna sa unang detektor, pagkatapos ay sa pangalawa, at ang mga senyas na nagmumula sa mga detektor ay naitala nang sabay-sabay gamit ang isang multi-pen recorder o sa dalawang recorder. Karaniwan, ginagamit ang isang seryeng koneksyon ng isang ultraviolet detector (mas sensitibo, ngunit pumipili) na may refractometer, o isang ultraviolet na may fluorescence detector, o dalawang ultraviolet detector na gumagana sa magkaibang wavelength. Ang kamag-anak na tugon, i.e. ang ratio ng signal ng refractometer sa signal ng photometer, ay isang katangian ng sangkap, sa kondisyon na ang parehong mga detektor ay gumagana sa kanilang linear range; ito ay sinusuri sa pamamagitan ng pagbibigay ng iba't ibang dami ng parehong substance. Maaaring makuha ang qualitative na impormasyon sa pamamagitan ng pagtatrabaho sa mga photometric detector na nilagyan ng stop flow device na nagpapahintulot sa spectrum ng peak na lumalabas mula sa column na maitala habang ito ay nasa flow cell, na inihahambing ito sa spectrum ng isang kilalang compound.

Ang moderno, mahal pa rin, spectrophotometers na may diode array ay may malaking interes sa pagkakakilanlan.

Ang isang ganap na hindi kilalang substance ay hindi matukoy gamit ang high-performance na liquid chromatography lamang ay kailangan din;

QUANTITATIVE ANALYSIS

Ang quantitative liquid chromatography ay isang mahusay na binuo na pamamaraan ng analytical na hindi mababa sa katumpakan sa quantitative gas chromatography at makabuluhang lumampas sa katumpakan ng TLC o electrophoresis, sa kasamaang-palad, sa HPLC ay walang detector na magkakaroon ng malapit na sensitivity para sa mga compound ng iba't ibang mga istrukturang kemikal (). tulad ng isang katharometer sa GLC).

Ang quantitative analysis ay binubuo ng mga sumusunod na yugto: 1) chromatographic separation; 2) pagsukat ng mga peak area o taas; 3) pagkalkula ng dami ng komposisyon ng pinaghalong batay sa chromatographic data; 4) interpretasyon ng mga resultang nakuha, ibig sabihin, pagpoproseso ng istatistika. Isaalang-alang natin ang lahat ng mga yugtong ito.

4.1. CHRMATOGRAPHIC SEPARATION

Maaaring magkaroon ng mga error sa panahon ng pagkolekta ng sample. Ito ay lalong mahalaga upang maiwasan ang pagkakamali at makakuha ng sapat na kinatawan na sample ng mga heterogenous na solid, pabagu-bago ng isip o hindi matatag na mga sangkap, at mga produktong pang-agrikultura at biomaterial. Ang mga heterogenous na sample, halimbawa mga produktong pagkain, ay lubusang pinaghalo at pinaghiwa-hiwalay. Sa pamamagitan ng pagsasagawa ng operasyong ito nang maraming beses, nakakamit ang sample homogeneity.

Ang mga pagkakamali at pagkawala ng mga sangkap ay maaaring gawin sa yugto ng pagkuha, paghihiwalay, paglilinis, atbp.

Ang mga sample ay dapat na ganap na matunaw at ang kanilang mga solusyon ay inihanda sa isang katumpakan ng ±0.1%. Maipapayo na i-dissolve ang sample sa mobile phase, na mag-aalis ng posibilidad ng pag-ulan pagkatapos ng pagpapakilala sa chromatograph. Kung hindi posible ang dissolution sa mobile phase, dapat gumamit ng solvent na nahahalo dito at dapat ipasok ang sample volume (mas mababa sa 25 µl) sa chromatograph.

Maaaring mangyari ang mga makabuluhang error sa panahon ng sample na iniksyon dahil sa sample fractionation, leakage, at peak smearing. Ang paglabo ng mga taluktok ay nagiging sanhi ng pagbuo ng mga buntot, na humahantong sa bahagyang pagsasanib ng mga taluktok at, bilang resulta, sa mga pagkakamali sa pagtuklas. Ang mga loop valve device ay mas gusto kaysa sa mga syringe para sa sample na pagpapakilala sa quantitative analysis dahil sa mas mataas na katumpakan at mas kaunting dependency ng operator.

Kapag ang chromatographic separation ng mga substance, maaari ding lumitaw ang mga komplikasyon na humantong sa pagbaluktot ng data: quantitative analysis. Maaaring may agnas o conversion ng sample sa panahon ng proseso ng chromatographic o hindi maibabalik na adsorption ng substance papunta sa column. Mahalagang tiyakin ang kawalan ng mga hindi kanais-nais na phenomena na ito at, kung kinakailangan, muling buuin ang column o palitan ito. Ang peak overlap at tailing ay maaari ding bawasan sa pamamagitan ng pag-iiba-iba ng mga kondisyon ng chromatography.

Mga taluktok na may mali o hindi malinaw na mga hugis, pati na rin ang mga taluktok na malapit na ang oras ng paglabas sa, dahil maaaring hindi sapat ang kanilang paghihiwalay. Karaniwan, ang mga taluktok na may halagang d"^0.5 ay ginagamit. Ang pinakamataas na kahusayan ng column ay nakakamit sa pamamagitan ng pagpapakilala ng 10~ 5 -10~ 6 g ng dissolved substance bawat 1 g ng sorbent. Kapag naglalagay ng malalaking dami ng sample, ang dependence ng ang peak height sa load ay maaaring lumabas na nonlinear at kailangan ng quantitative assessment sa mga peak area.

Ang mga error na nauugnay sa detection o amplification ay humantong sa makabuluhang pagbaluktot ng mga resulta ng chromatographic separation. Ang bawat detector ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagtitiyak, linearity at sensitivity. Ang pagsusuri sa pagpili ay lalong mahalaga kapag sinusuri ang mga bakas na dumi. Ang tugon ng mga UV detector ay maaaring mag-iba sa pamamagitan ng isang salik na 104 sa mga sangkap na may katulad na mga functional na grupo. Kinakailangang i-calibrate ang tugon ng detector para sa bawat analyte. Naturally, ang mga substance na hindi sumisipsip sa UV region ay hindi magbibigay ng signal sa recorder kapag ginamit bilang photometer detector. Kapag gumagamit ng refractometer, maaaring lumitaw ang mga negatibong peak. Bilang karagdagan, ang detector na ito ay dapat na thermostated, na hindi kinakailangan para sa UV detector.

Tinutukoy ng linearity ng detector ang laki ng na-inject na sample. Mahalagang tandaan na ang rate ng daloy ng column, mga temperatura ng column at detector, at disenyo ng detector ay nakakaapekto lahat sa katumpakan ng quantitative analysis. Ang mga error sa pagpapadala ng isang de-koryenteng signal sa isang output device (recorder), integrator o computer ay maaaring lumitaw dahil sa ingay induction, kakulangan ng grounding, pagbabagu-bago ng boltahe sa network, atbp.

4.2. PAGSUKAT NG PEAK AREA O TAAS

Pinakamataas na taas h (Fig. 10.1) ay ang distansya mula sa tuktok ng peak hanggang sa baseline; ito ay sinusukat nang linear o sa pamamagitan ng pagbilang ng bilang ng mga dibisyon sa isang recorder. Ang ilang mga electronic integrator at computer ay nagbibigay ng impormasyon sa mga pinakamataas na taas. Ang posisyon ng baseline ng mga shifted peak ay matatagpuan sa pamamagitan ng interpolating ang ordinate values ​​na tumutugma sa simula at dulo ng peak (peak 1 at 3 tingnan ang fig. 10.1). Upang mapabuti ang katumpakan, kinakailangan na magkaroon ng isang patag, matatag na baseline. Sa kaso ng hindi nahahati na mga taluktok, ang baseline ay iginuhit sa pagitan ng simula at pagtatapos ng peak sa halip na papalitan ng zero na linya. Dahil ang mga peak height ay hindi gaanong nakadepende sa impluwensya ng mga katabing nagsasapawan na mga peak, ang pagtatantya ng peak height ay mas tumpak at halos palaging ginagamit sa trace trace analysis.

Ang tugatog na lugar ay maaaring matukoy sa iba't ibang paraan. Tingnan natin ang ilan sa kanila.

1. Ang pamamaraan ng planimetric ay nagsasangkot ng pagsubaybay sa peak gamit ang isang hand-held planimeter, na isang aparato na mekanikal na tumutukoy sa lugar ng peak. Ang pamamaraan ay tumpak, ngunit labor-intensive at hindi maganda ang reproducible. Ang pamamaraang ito ay hindi inirerekomenda.

2. Paraan ng silweta ng papel - ang rurok ay pinutol at tinimbang. Ang pamamaraan ay lubos na maaaring kopyahin, ngunit labor-intensive, at ang chromatogram ay nawasak. Ang kakayahang magamit nito ay nakasalalay sa pagkakapareho ng strip ng tsart. Ang pamamaraan ay hindi rin maaaring malawak na inirerekomenda.

4. Ang pamamaraan ng triangulation ay binubuo ng pagbuo ng isang tatsulok sa pamamagitan ng pagguhit ng mga tangent sa mga gilid ng tuktok. Ang tuktok ng tatsulok ay mas mataas kaysa sa tuktok ng tuktok. Ang pagtaas ng lugar na nabuo ng pinahabang vertex na ito ay magiging pare-pareho sa buong chromatogram at hindi lubos na makakaapekto sa katumpakan. Bilang karagdagan, ang ilang lugar na nawala kapag gumuhit ng mga tangent ay mababayaran. Ang base ng tatsulok ay tinutukoy ng intersection ng mga tangent na may base line, at ang lugar ay tinutukoy ng produkto ng 7 g ng base at ang taas. Ang pamamaraang ito ay ang pinakamainam para sa pagtukoy ng mga lugar ng mga asymmetric na peak. Gayunpaman, ang reproducibility kapag gumagawa ng mga tangent ng iba't ibang operator ay iba at samakatuwid; mababa.

5. Ang paraan ng disk integrator ay batay sa isang electromechanical device na nakakabit sa isang recorder. Ang panulat na nakakabit sa integrator ay gumagalaw kasama ang isang strip sa ilalim ng tape sa bilis na proporsyonal sa paggalaw ng recorder pen.

Tulad ng mga manu-manong pagsukat, ang peak ay dapat manatili sa sukat ng recorder, ngunit ang mga pagsasaayos upang mabayaran ang mga pagbabago sa baseline at hindi kumpletong paghihiwalay ng mga katabing peak ay nagbabawas sa pagiging maaasahan at nagpapataas ng oras ng pagsusuri.

Ang pamamaraan ay mas tumpak kaysa sa mga manu-manong pamamaraan ng pagsukat, lalo na para sa mga asymmetric na peak, at nag-aalok ng isang kalamangan sa bilis. Bilang karagdagan, nagbibigay ito ng isang permanenteng tala ng dami ng pagsusuri.

6. Ang mga paraan gamit ang mga electronic integrator na tumutukoy sa peak area at naka-print na impormasyon tungkol sa lugar na iyon at mga oras ng pagpapanatili ay maaaring kabilang ang baseline shift correction at matukoy ang lugar ng mga bahagyang nalutas na mga peak. Ang pangunahing bentahe ay katumpakan, bilis, kalayaan ng pagkilos mula sa pagpapatakbo ng recorder. Ang mga integrator ay may memorya at maaaring i-program para sa isang partikular na pagsusuri gamit ang isang paunang naka-install na programa. Kasama sa mga bentahe ng integrator ang kakayahang gumamit ng mga salik sa pagwawasto para sa tugon ng detektor kapag muling kinakalkula ang orihinal na data sa mga peak na lugar, na binabayaran ang mga pagkakaiba sa sensitivity ng detector sa iba't ibang mga sangkap. Ang mga ganitong sistema ay nakakatipid ng oras, nagpapabuti ng katumpakan ng analytical, at kapaki-pakinabang para sa regular na pagsusuri ng analytical.

7. Sa liquid chromatography, ang mga computer ay malawakang ginagamit upang sukatin ang mga peak area. Nag-print sila ng kumpletong mensahe, kabilang ang mga pangalan ng mga substance, peak area, retention time, detector response correction factor, at abundance (wt %) para sa iba't ibang sample na bahagi.

Liquid chromatography ay isang paraan para sa paghihiwalay at pagsusuri ng mga kumplikadong paghahalo ng mga sangkap kung saan ang isang likido ay nagsisilbing mobile phase. Naaangkop ito sa paghihiwalay ng mas malawak na hanay ng mga sangkap kaysa sa gas chromatography. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang karamihan sa mga sangkap ay hindi pabagu-bago, marami sa kanila ay hindi matatag sa mataas na temperatura (lalo na ang mga high-molecular compound) at nabubulok kapag na-convert sa isang gas na estado. Ang paghihiwalay ng mga sangkap sa pamamagitan ng likidong chromatography ay madalas na isinasagawa sa temperatura ng silid.

Ang mga tampok ng lahat ng uri ng likidong chromatography ay dahil sa ang katunayan na ang mobile phase sa loob nito ay likido, at ang pagsipsip ng mga bahagi mula sa gaseous at liquid eluent ay nagpapatuloy nang iba. Kung sa gas chromatography ang carrier gas ay gumaganap lamang ng isang transport function at hindi na-sorbed ng nakatigil na bahagi, kung gayon ang likidong mobile phase sa likidong chromatography ay isang aktibong eluent ang mga molekula nito ay maaaring ma-sorbed ng nakatigil na yugto. Kapag dumadaan sa haligi, ang mga molekula ng mga sangkap ng pinag-aralan na halo na matatagpuan sa eluent ay dapat na palitan ang mga molekula ng eluent mula sa ibabaw na layer ng sorbent, na humahantong sa pagbawas sa enerhiya ng pakikipag-ugnayan ng mga molekula ng analyte kasama ang ibabaw ng sorbent. Samakatuwid, ang mga halaga ng mga napanatili na volume V R, na proporsyonal sa pagbabago sa libreng enerhiya ng system, ay mas maliit sa liquid chromatography kaysa sa gas chromatography, at mas malawak ang range ng linearity ng sorption isotherm sa liquid chromatography.

Sa pamamagitan ng paggamit ng iba't ibang eluent, maaaring baguhin ang mga parameter ng pagpapanatili at selectivity ng chromatographic system. Ang selectivity sa liquid chromatography, hindi tulad ng gas chromatography, ay tinutukoy hindi ng isa, ngunit sa pamamagitan ng dalawang mga kadahilanan - ang likas na katangian ng mobile (eluent) at nakatigil na mga phase.

Ang likidong mobile phase ay may mas mataas na density at lagkit kaysa sa gaseous phase, diffusion coefficients D at 3–4 na order ng magnitude na mas mababa kaysa sa gas. Ito ay humahantong sa mas mabagal na paglipat ng masa sa likidong chromatography kumpara sa gas chromatography. Ang Van Deemter equation dahil sa ang katunayan na ang termino SA hindi gumaganap ng papel sa likidong kromatograpiya ( D at  D G), nagbabago rin ang graphical na pag-asa ng kahusayan N mula sa linear flow rate ng mobile phase ay may form na ipinapakita sa Fig. 1.9.

Sa klasikong bersyon ng column liquid chromatography, ang nasuri na sample na natunaw sa eluent ay ipinapasok sa isang glass column na may taas na 1-2 m, na puno ng sorbent na may sukat na particle na 100 μm at isang eluent, at ang eluent ay ipinapasa. , pagpili ng mga bahagi ng eluate sa labasan ng column. Ang bersyon na ito ng liquid chromatography ay ginagamit pa rin sa laboratory practice, ngunit dahil mababa ang rate ng pagpasa ng eluent sa ilalim ng impluwensya ng gravity, ang pagsusuri ay mahaba.

Ang modernong bersyon ng liquid chromatography, ang tinatawag na high-performance liquid chromatography HPLC, ay gumagamit ng volumetric at superficially porous sorbents na may particle size na 5–10 microns, injection pump na nagbibigay ng pressure ng system hanggang 400 atm, at napakasensitibong detector. Ang mabilis na paglipat ng masa at mataas na kahusayan sa paghihiwalay ay ginagawang posible na gumamit ng HPLC para sa paghihiwalay ng mga molekula (liquid adsorption at liquid-liquid partition chromatography), para sa paghihiwalay ng mga ion (ion exchange, ion, ion-pair chromatography), para sa paghihiwalay ng macromolecules (size exclusion chromatography).

1.3. SOLVENT RETENTION AT LAKAS

Upang ang nasuri na mga sangkap ay ihiwalay sa haligi, tulad ng nabanggit sa itaas, ang kapasidad na koepisyent k" ay dapat na mas malaki kaysa sa 0, ibig sabihin, ang mga sangkap ay dapat na mapanatili ng nakatigil na yugto, ang sorbent. Gayunpaman, ang koepisyent ng kapasidad ay hindi dapat masyadong malaki upang makakuha ng isang katanggap-tanggap na oras ng elution Kung para sa isang pinaghalong sangkap ay pinili ang isang nakatigil na yugto na nagpapanatili sa mga ito, kung gayon ang karagdagang gawain sa pagbuo ng isang pamamaraan ng pagsusuri ay binubuo sa pagpili ng isang solvent na perpektong magbibigay ng iba ngunit katanggap-tanggap. hindi masyadong malaki k". Ito ay nakakamit sa pamamagitan ng pagbabago ng lakas ng elution ng solvent.

Sa kaso ng adsorption chromatography sa silica gel o aluminum oxide, bilang panuntunan, ang lakas ng isang dalawang bahagi na solvent (halimbawa, hexane na may pagdaragdag ng isopropanol) ay nadagdagan sa pamamagitan ng pagtaas ng nilalaman ng polar component (isopropanol), o nabawasan sa pamamagitan ng pagpapababa ng nilalaman ng isopropanol. Kung ang nilalaman ng polar component ay nagiging masyadong mababa (mas mababa sa 0.1%), dapat itong mapalitan ng mas mahinang puwersa ng elution. Ang parehong ay tapos na, pinapalitan ang alinman sa isang polar o isang non-polar na bahagi sa iba, kahit na ang sistemang ito ay hindi nagbibigay ng nais na selectivity na may paggalang sa mga bahagi ng interes sa pinaghalong. Kapag pumipili ng mga solvent system, parehong ang solubility ng mga bahagi ng pinaghalong at ang eluotropic na serye ng mga solvent na pinagsama-sama ng iba't ibang mga may-akda ay isinasaalang-alang.

Ang lakas ng solvent ay pinili sa humigit-kumulang sa parehong paraan kapag gumagamit ng grafted polar phase (nitrile, amino, diol, nitro, atbp.), na isinasaalang-alang ang mga posibleng reaksyon ng kemikal at hindi kasama ang mga solvent na mapanganib sa phase (halimbawa, aldehydes at ketones. para sa amino phase).

Sa kaso ng reverse phase chromatography, ang lakas ng solvent ay nadaragdagan sa pamamagitan ng pagtaas ng nilalaman ng organic na bahagi sa eluent (methanol, acetonitrile o THF) at nababawasan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mas maraming tubig. Kung hindi posible na makamit ang nais na pagpili, gumamit sila ng isa pang organikong sangkap o subukang baguhin ito gamit ang iba't ibang mga additives (mga acid, ion-pair reagents, atbp.).

Sa mga paghihiwalay gamit ang ion exchange chromatography, ang lakas ng solvent ay binago sa pamamagitan ng pagtaas o pagbaba ng konsentrasyon ng buffer solution o pagbabago ng pH sa ilang mga kaso, ang pagbabago sa mga organikong sangkap ay ginagamit.

Gayunpaman, lalo na sa kaso ng mga kumplikadong natural at biological na pinaghalong, madalas na hindi posible na piliin ang lakas ng solvent upang ang lahat ng mga sample na bahagi ay mag-elute sa loob ng isang katanggap-tanggap na time frame. Pagkatapos ay kailangan mong gumamit ng gradient elution, i.e. gumamit ng solvent na nagbabago ang lakas ng elution sa panahon ng proseso ng pagsusuri upang patuloy itong tumaas ayon sa isang paunang natukoy na programa. Ang pamamaraan na ito ay ginagawang posible upang makamit ang elution ng lahat ng mga bahagi ng mga kumplikadong mixtures sa isang medyo maikling panahon at ang kanilang paghihiwalay sa mga bahagi sa anyo ng makitid na mga taluktok.

1.6.1. Adsorption liquid chromatography. Ang adsorption liquid chromatography, depende sa polarity ng stationary at mobile phase, ay nahahati sa normal-phase (NPC) at reverse-phase (RPC) chromatography. Sa NPC, isang polar adsorbent at non-polar mobile phase ang ginagamit, sa OPC, isang non-polar adsorbent at polar mobile phase ang ginagamit, ngunit sa parehong mga opsyon, ang pagpili ng mobile phase ay kadalasang mas mahalaga kaysa sa pagpili ng nakatigil na yugto. Ang nakatigil na yugto ay dapat panatilihin ang mga sangkap na pinaghihiwalay. Ang mobile phase, ibig sabihin, ang solvent, ay dapat magbigay ng iba't ibang kapasidad ng column at mahusay na paghihiwalay sa loob ng isang katanggap-tanggap na oras.

Ang polar at non-polar na pinong dispersed porous na materyales na may partikular na lugar sa ibabaw na higit sa 50 m 2 /g ay ginagamit bilang isang nakatigil na yugto sa adsorption liquid chromatography. Ang mga polar adsorbents (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil, atbp.) ay may mahinang mga grupo ng acid sa ibabaw na maaaring magpanatili ng mga sangkap na may mga pangunahing katangian. Ang mga adsorbents na ito ay pangunahing ginagamit para sa paghihiwalay ng mga non-polar at moderately polar compound. Ang kanilang kawalan ay ang kanilang mataas na sensitivity sa nilalaman ng tubig sa mga eluent na ginamit. Upang maalis ang kawalan na ito, ang mga polar sorbents ay ginagamot ng mga amine, diol at iba pang mga reagents, na nagreresulta sa paghugpong sa ibabaw ng mga reagents na ito, pagbabago sa ibabaw at pagbabago sa selectivity na may paggalang sa mga analytes.

Ang mga non-polar adsorbents (graphitized carbon black, diatomaceous earth, kieselguhr) ay hindi pumipili sa mga polar molecule. Upang makakuha ng mga non-polar adsorbents, ang mga non-polar na grupo ay madalas na pinagsama sa ibabaw ng, halimbawa, silica gel, halimbawa, alkylsilyl -SiR 3, kung saan ang R -alkyl group ay C 2 -C 22.

Ang mobile phase ay dapat na ganap na matunaw ang sample na sinusuri, magkaroon ng isang mababang lagkit (upang ang diffusion coefficients ay sapat na malaki), at ito ay kanais-nais na ito ay posible na ihiwalay ang mga pinaghiwalay na mga bahagi mula dito. Ito ay dapat na hindi gumagalaw na may kinalaman sa mga materyales ng lahat ng bahagi ng chromatograph, ligtas, mura, at angkop para sa detector.

Ang mga mobile phase na ginagamit sa liquid chromatography ay nag-iiba sa kanilang lakas ng elution. Ang elution force ng isang solvent ay nagpapakita kung gaano karaming beses ang sorption energy ng isang partikular na eluent sa isang adsorbent ay mas malaki kaysa sa sorption energy ng eluent na pinili bilang isang standard, halimbawa n-heptane. Ang mga mahihinang solvent ay mahinang na-adsorbed ng nakatigil na yugto, samakatuwid ang mga koepisyent ng pamamahagi ng mga sorbed substance (sorbate) ay mataas. Sa kabaligtaran, ang mga malakas na solvent ay na-adsorbed nang maayos, kaya ang mga coefficient ng partition ng sorbate ay mababa. Ang mas malakas na solvent, mas mataas ang solubility ng nasuri na sample sa loob nito, at mas malakas ang pakikipag-ugnayan ng solvent-sorbate.

Upang matiyak ang mataas na kahusayan sa paghihiwalay sa isang column, kinakailangan na pumili ng isang mobile phase na may polarity na pinakamainam para sa pinaghalong paghiwalayin sa ilalim ng mga napiling kundisyon ng paghihiwalay. Karaniwan, ang isang nakatigil na bahagi ay unang pinili na may polarity na malapit sa mga bahagi na pinaghihiwalay. Pagkatapos ay pinili ang mobile phase, tinitiyak na ang koepisyent ng kapasidad k" lumabas na nasa hanay mula 2 hanggang 5. Kung ang polarity ng mobile phase ay masyadong malapit sa polarity ng stationary phase, ang oras ng pagpapanatili ng mga bahagi ay magiging masyadong maikli, at kung ang polarity ng mobile at stationary Ang mga yugto ay ibang-iba, ang oras ng pagpapanatili ay magiging masyadong mahaba.

Kapag pumipili ng mga mobile phase, ginagabayan sila ng tinatawag na eluotropic series, batay sa paggamit ng mga indeks ng polarity Snyder R", na naghahati sa lahat ng solvents sa malakas (polar) at mahina (mahinang polar at non-polar). Ang polarity scale ay batay sa solubility ng mga substance na ginagamit bilang mga mobile phase sa dioxane, nitromethane at ethanol.

Ipinapakita ng talahanayan 1.2 ang mga halaga ng mga indeks ng polarity at puwersa ng elution (na may kaugnayan sa SiO 2) para sa isang bilang ng mga solvent na kadalasang ginagamit sa liquid chromatography bilang mga mobile phase. Ang mga short-wavelength na limitasyon ng transparency ng mga solvent na ito ay ipinahiwatig din dito, na nagpapadali sa pagpili ng mga kondisyon para sa pag-detect ng mga bahagi ng pinaghalong.

Talahanayan 1.2

Mga katangian ng mga solvent na ginagamit sa liquid chromatography

Solvent	Polarity index	Lakas ng elution (SiO 2)	Limitasyon ng transparency ng short-wavelength
Fluoroalkan
Cyclohexane
n-Hexane
Carbon tetrachloride
Diisopropyl eter
Diethyl eter
Dichloromethane
Tetrahydrofuran
Chloroform
Acetic acid
Acetonitrile
Nitromethane

Sa likidong kromatograpiya, ang mga paghahalo ng mga ito sa halip na mga indibidwal na solvents ay kadalasang ginagamit. Kadalasan ang mga menor de edad na pagdaragdag ng isa pang solvent, lalo na ang tubig, ay makabuluhang magpapataas ng eluent na lakas ng eluent.

Kapag naghihiwalay ng mga multicomponent mixture, maaaring hindi paghiwalayin ng isang mobile phase bilang eluent ang lahat ng sample na bahagi sa isang katanggap-tanggap na oras. Sa kasong ito, ginagamit ang isang stepwise o gradient na paraan ng elution, kung saan ang mga dumaraming mas malakas na eluent ay sunud-sunod na ginagamit sa panahon ng proseso ng chromatography, na ginagawang posible na mag-elute ng mataas na napanatili na mga sangkap sa mas kaunting oras.

Sa liquid chromatography mayroong ilan empirical mga panuntunan na lubhang kapaki-pakinabang kapag pumipili ng eluent:

- sorption ng isang compound, bilang isang panuntunan, ay nagdaragdag sa isang pagtaas sa bilang ng mga double bond at OH group sa loob nito;

 bumababa ang sorption sa isang bilang ng mga organikong compound: mga acid alcoholsaldehydesketonesestersunsaturated hydrocarbonssaturated hydrocarbons;

 upang paghiwalayin ang mga sangkap na may iba't ibang polarity at hiwalay na mga sangkap ng iba't ibang klase, ginagamit ang normal-phase chromatography: ang nasuri na sample ay natunaw at na-eluted na may non-polar eluent, ang mga compound ng iba't ibang klase ay umalis sa column na may polar adsorbent sa iba't ibang oras, habang ang oras ng pagpapanatili ng mga compound na may iba't ibang mga functional na grupo ay tumataas sa panahon ng paglipat mula sa mga non-polar compound patungo sa mga mahinang polar. Para sa mga napaka-polar na molekula, ang mga oras ng pagpapanatili ay napakatagal na ang pagsusuri ay hindi posible sa isang non-polar eluent. Upang bawasan ang oras ng pagpapanatili ng mga polar component, lumipat sa mga polar eluent;

 sa reversed-phase na bersyon, ang stationary phase (non-polar adsorbent) ay mas malakas na sumisipsip sa non-polar component mula sa polar eluents, halimbawa mula sa tubig;

- Sa pamamagitan ng pagbabawas ng polarity ng eluent sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mas kaunting polar solvent, ang pagpapanatili ng mga bahagi ay maaaring mabawasan.

1.6.2. Partition liquid chromatography. Sa partition o liquid-liquid chromatography, ang paghihiwalay ng mga bahagi ng nasuri na sample ay dahil sa mga pagkakaiba sa mga coefficient ng kanilang pamamahagi sa pagitan ng dalawang immiscible liquid phase, isa sa mga ito ay nakatigil at matatagpuan sa ibabaw o sa mga pores ng solid. nakatigil na carrier, at ang pangalawa ay mobile.

Sa mga tuntunin ng likas na katangian ng mga puwersa ng pakikipag-ugnayan na tumutukoy sa magkakaibang pamamahagi sa pagitan ng dalawang yugto ng mga sangkap na naiiba sa kanilang kemikal na istraktura, ang partition chromatography ay katulad ng adsorption chromatography, ibig sabihin, dito, din, ang paghihiwalay ay batay sa pagkakaiba sa pwersa ng intermolecular na interaksyon sa pagitan ng mga bahagi ng nasuri na sample at ng mga nakatigil at mobile na likidong phase.

Depende sa pamamaraan, ang partition chromatography, tulad ng adsorption chromatography, ay maaaring column o planar (papel o manipis na layer).

Ang mga sangkap na walang malasakit sa mobile solvent at mga bahagi ng nasuri na sample, ngunit may kakayahang mapanatili ang nakatigil na yugto sa ibabaw at sa mga pores, ay ginagamit bilang solid carrier. Kadalasan, ang mga polar substance (cellulose, silica gel, starch) ay ginagamit bilang mga carrier. Ang isang nakatigil na yugto—isang polar solvent, kadalasang tubig o alkohol—ay inilalapat sa kanila. Sa kasong ito, ang mas kaunting polar o non-polar substance (alcohols, amines, ketones, hydrocarbons, atbp.) ay ginagamit bilang mga mobile phase. Ang ganitong uri ng partition chromatography ay tinatawag normal-phase. Ito ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga polar substance.

Ang pangalawang bersyon ng partition chromatography ay naiiba dahil ang mga non-polar carrier (goma, fluoroplastic, hydrophobized silica gel) ay ginagamit bilang isang nakatigil na solid phase, ang mga non-polar solvent (hydrocarbons) ay ginagamit bilang isang nakatigil na likidong phase, at mga polar solvents (alcohols). , aldehydes) ay ginagamit bilang isang mobile liquid phase , ketones, atbp., kadalasang tubig). Ang bersyon na ito ng partition chromatography ay tinatawag baligtad na yugto at ginagamit upang paghiwalayin ang mga non-polar substance.

Upang makamit ang pinakamainam na paghihiwalay ng mga bahagi ng nasuri na sample, ang pagpili ng mobile phase ay napakahalaga. Ang mga solvent (mobile at stationary na mga phase ng likido) ay dapat mapili upang ang mga koepisyent ng pamamahagi ng mga bahagi ng pinaghalong medyo makabuluhang naiiba. Ang mga sumusunod na kinakailangan ay nalalapat sa mga phase ng likido: kinakailangan:

1) ang mga solvent na ginamit ay dapat na matunaw ng mabuti ang mga sangkap na pinaghihiwalay, at ang kanilang solubility sa nakatigil na bahagi ay dapat na mas malaki kaysa sa mobile phase;

2) ang mga solvent na ginamit bilang mga mobile at stationary na mga phase ay dapat na magkaparehong puspos, ibig sabihin, ang komposisyon ng solvent ay dapat na pare-pareho sa panahon ng pagpasa sa haligi;

3) ang pakikipag-ugnayan ng mga solvent na ginamit bilang isang mobile phase sa nakatigil na yugto ay dapat na minimal.

Kadalasan, sa partition liquid chromatography, hindi mga indibidwal na sangkap, ngunit ang kanilang mga mixtures sa iba't ibang ratios ay ginagamit bilang mga mobile liquid phase. Ginagawa nitong posible na i-regulate ang polarity ng mobile phase, baguhin ang ratio ng mga polarities ng mobile at stationary phase, at makamit ang pinakamainam na kondisyon para sa paghihiwalay ng mga bahagi ng isang partikular na pinaghalong sinusuri.

Ang isang makabuluhang kawalan ng pamamaraang chromatographic na ito ay ang inilapat na nakatigil na bahagi ng likido ay mabilis na nahuhugas mula sa carrier. Upang maalis ito, ang solvent na ginamit bilang mobile phase ay puspos ng isang substance na ginagamit bilang stationary liquid phase, o ang stationary liquid phase ay pinapatatag sa pamamagitan ng paghugpong nito sa carrier.

Ang isang pagkakaiba-iba ng partition liquid chromatography ay ang malawakang ginagamit na pamamaraan ng HPLC.

Ang pinakakaraniwang mga chromatographic system ay ang mga system na mayroong modular assembly principle. Available ang mga pump, degassing device, detector, dispenser (autosampler), column thermostat, fraction collector, chromatographic system control unit at recording device bilang hiwalay na mga module. Ang isang malawak na seleksyon ng mga module ay nagbibigay-daan sa iyo upang madaling malutas ang iba't ibang mga analytical na problema at mabilis na baguhin ang configuration ng system kung kinakailangan na may kaunting gastos. Kasabay nito, ang mga monomodular (integrated) na LC ay ginawa din, ang pangunahing bentahe nito ay ang miniaturization ng mga indibidwal na yunit at ang compactness ng device.

Depende sa paraan ng elution, ang mga likidong chromatograph ay nahahati sa isocratic at gradient.

Schematic ng isang isocratic chromatograph

Ang mobile phase mula sa lalagyan (1) sa pamamagitan ng inlet filter (9) ay ibinibigay ng isang precision high-pressure pump (2) sa sample injection system (3) - isang manu-manong injector o autosampler, at ang sample ay ipinapasok din doon . Susunod, sa pamamagitan ng isang in-line na filter (8), ang sample na may kasalukuyang ng mobile phase ay pumapasok sa elemento ng paghihiwalay (mga elemento) (4) - sa pamamagitan ng pre-column papunta sa separation column. Pagkatapos, ang eluate ay pumasok sa detector (5) at aalisin sa lalagyan ng alisan ng tubig (7). Kapag ang eluate ay dumadaloy sa pamamagitan ng pagsukat ng circuit ng detector, ang chromatogram ay naitala at ang data ay inililipat sa isang analog recorder (recorder) (6) o ibang sistema para sa pagkolekta at pagproseso ng chromatographic data (integrator o computer). Depende sa disenyo ng mga functional na module, ang system ay maaaring kontrolin mula sa keyboard ng control module (karaniwan ay isang pump o system controller), mula sa mga keyboard ng bawat isa sa mga module ng system, o sa pamamagitan ng isang control program mula sa isang personal na computer.

Sa kaso ng gradient elution, dalawang pangunahing magkakaibang uri ng likidong chromatograph ang ginagamit. Nag-iiba sila sa punto kung saan nabuo ang gradient ng komposisyon ng mobile phase.

Scheme ng isang gradient chromatograph na may pagbuo ng isang gradient ng komposisyon ng mobile phase sa isang low-pressure na linya.

Ang mobile phase mula sa mga container (1) sa pamamagitan ng mga input filter (9) at isang gradient programmer (10) ay ibinibigay ng isang precision high-pressure pump (2) sa sample injection system (3) - isang manu-manong injector o autosampler, at ang ang sample ay ipinakilala din doon. Ang operasyon ng mga gradient programmer valve ay kinokontrol ng system control module (pump o controller) o ng isang PC control program. Ang mga sistema ng ganitong uri ay bumubuo ng binary, three-dimensional at four-dimensional na gradient. Ang anyo ng gradient processing function ay depende sa partikular na control module o control program, pati na rin ang functionality ng controlled at control modules. Susunod, sa pamamagitan ng isang in-line na filter (8), ang sample na may kasalukuyang ng mobile phase ay pumapasok sa elemento ng paghihiwalay (mga elemento) (4) - sa pamamagitan ng pre-column papunta sa separation column. Pagkatapos, ang eluate ay pumasok sa detector (5) at aalisin sa lalagyan ng alisan ng tubig (7). Kapag ang eluate ay dumadaloy sa pamamagitan ng pagsukat ng circuit ng detector, ang chromatogram ay naitala at ang data ay inililipat sa isang analog recorder (recorder) (6) o ibang sistema para sa pagkolekta at pagproseso ng chromatographic data (integrator o computer). Depende sa disenyo ng mga functional module, ang system ay maaaring kontrolin mula sa keyboard ng control module (karaniwan ay isang pump o system controller), o isinasagawa ng isang control program mula sa isang personal na computer. Sa kaso ng kontrol ng isang control module, posible na independiyenteng kontrolin ang detector mula sa sarili nitong keyboard.

Sa kabila ng maliwanag na pagiging kaakit-akit ng mga naturang sistema (gumagamit lamang sila ng isang precision high-pressure pump), ang mga sistemang ito ay may ilang mga kawalan, bukod sa kung saan ang pangunahing isa, marahil, ay ang mahigpit na pangangailangan para sa masusing pag-degassing ng mga bahagi ng mobile phase kahit na bago ang low-pressure mixer (gradient programmer chamber). Isinasagawa ito gamit ang mga espesyal na flow-through degassers. Dahil sa katotohanang ito, ang kanilang gastos ay nagiging maihahambing sa isa pang uri ng gradient system - mga system na may pagbuo ng isang mobile phase gradient composition sa isang high-pressure na linya.

Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng mga sistema na may pagbuo ng isang komposisyon ng gradient ng mobile phase sa isang linya ng mataas na presyon ay ang natural na paghahalo ng mga bahagi sa linya ng mataas na presyon, sa diskarteng ito, ang bilang ng mga precision na bomba ay tinutukoy ng bilang ng mga tangke para sa paghahalo ng mobile phase. Sa diskarteng ito, ang mga kinakailangan para sa masusing pag-degas ng mga bahagi ay makabuluhang nabawasan.

Scheme ng isang gradient chromatograph na may pagbuo ng isang gradient ng komposisyon ng mobile phase sa isang high-pressure na linya.

Ang mobile phase mula sa mga container (1) sa pamamagitan ng mga input filter (9) ay ibinibigay ng precision high-pressure pump (2 at 11) sa pamamagitan ng static o dynamic na flow mixer (10) papunta sa sample input system (3) - isang manual injector o autosampler, at ang sample ay ipinakilala din doon. Ang operasyon ng mga kinokontrol na bomba ay kinokontrol alinman sa pamamagitan ng system control module (master pump o controller) o ng isang PC control program. Sa kasong ito, ang lahat ng mga bomba ay nakokontrol. Ang mga sistema ng ganitong uri ay bumubuo ng binary o tatlong-dimensional na gradient. Ang anyo ng gradient processing function ay depende sa partikular na control module o control program, pati na rin ang functionality ng controlled at control modules. Susunod, sa pamamagitan ng isang in-line na filter (8), ang sample na may kasalukuyang ng mobile phase ay pumapasok sa elemento ng paghihiwalay (mga elemento) (4) - sa pamamagitan ng pre-column papunta sa separation column. Ang eluate pagkatapos ay pumapasok sa detector (5) at aalisin sa lalagyan ng alisan ng tubig (7). Kapag ang eluate ay dumadaloy sa pamamagitan ng pagsukat ng circuit ng detector, ang chromatogram ay naitala at ang data ay inililipat sa isang analog recorder (recorder) (6) o ibang sistema para sa pagkolekta at pagproseso ng chromatographic data (integrator o computer). Depende sa disenyo ng mga functional module, ang system ay maaaring kontrolin mula sa keyboard ng control module (karaniwan ay isang pump o system controller), o isinasagawa ng isang control program mula sa isang personal na computer. Sa kaso ng kontrol ng isang control module, posible na independiyenteng kontrolin ang detector mula sa sarili nitong keyboard.

Ang mga iminungkahing scheme ay medyo pinasimple. Ang mga system ay maaaring magsama ng mga karagdagang device - isang column thermostat, post-column derivatization system, sample preparation at sample concentration system, isang solvent recycler, membrane system para sa pagsugpo sa background electrical conductivity (para sa ion chromatography), karagdagang mga protective system (mga filter, column), atbp. Ang mga diagram ay hindi rin nagpapakita ng mga manometric na module nang hiwalay. Bilang isang patakaran, ang mga aparatong ito ay binuo sa mga yunit ng bomba. Maaaring pagsamahin ng mga unit na ito ang ilang pump, isang pump na may gradient programmer, at isang karaniwang controller ng system. Ang istraktura ng system ay nakasalalay sa pagsasaayos nito at sa bawat partikular na tagagawa.

Ang ganitong radikal na komplikasyon ng teknikal na suporta ng proseso ng chromatographic ay humahantong sa paglitaw ng isang bilang ng mga kinakailangan para sa mga katangian ng mobile phase na wala sa classical na column at planar chromatography. Ang likidong bahagi ay dapat na angkop para sa pagtuklas (maging transparent sa isang partikular na rehiyon ng spectrum o may mababang refractive index, isang tiyak na electrical conductivity o dielectric constant, atbp.), Inert sa mga materyales ng mga bahagi ng chromatographic tract, hindi bumubuo ng gas mga bula sa mga balbula ng bomba at cell ng detektor, walang mga impurities sa makina.

Sa likidong kromatograpiya Maraming uri ng bomba ang ginagamit. Para sa mababang presyon ng LC, ang mga peristaltic pump ay kadalasang ginagamit (Larawan 1).

Fig. 1 MasterFlex programmable peristaltic pump.

Sa HPLC, ang mga high-pressure pump ay ginagamit upang matiyak ang daloy ng mobile phase sa pamamagitan ng column na may tinukoy na mga parameter.

Ang pinakamahalagang teknikal na katangian ng HPLC pump ay kinabibilangan ng: flow range; maximum na presyon ng pagtatrabaho; muling paggawa ng daloy; hanay ng pulsation ng supply ng solvent.

Depende sa likas na katangian ng supply ng solvent, ang mga bomba ay maaaring maging pare-pareho ang supply (daloy) at pare-pareho ang presyon. Karaniwan, sa panahon ng analytical na gawain, ginagamit ang isang pare-parehong mode ng rate ng daloy, at kapag pinupunan ang mga haligi, ginagamit ang isang pare-parehong mode ng presyon.

Batay sa kanilang prinsipyo sa pagpapatakbo, ang mga HPLC pump ay nahahati sa: hiringgilya at sa plunger gumaganti .

Mga bomba ng syringe

Ang pangunahing natatanging katangian ng mga bombang ito ay ang paikot na katangian ng kanilang operasyon, at samakatuwid ang mga chromatograph kung saan ginagamit ang mga bombang ito ay nakikilala rin sa kanilang paikot na operasyon.

kanin. 2. Pangunahing disenyo ng isang syringe pump para sa HPLC.

kanin. 2A. Syringe pump.

Ang control unit na BU ay nagbibigay ng boltahe sa motor D, na tumutukoy sa bilis at direksyon ng pag-ikot nito. Ang pag-ikot ng makina gamit ang gearbox P ay na-convert sa paggalaw ng piston P sa loob ng cylinder D. Ang pump ay nagpapatakbo sa 2 cycle. Sa panahon ng pag-ikot ng pagpuno, ang balbula K2 ay sarado, ang K1 ay bukas, ang solvent ay dumadaloy mula sa reservoir patungo sa cylinder C. Sa supply mode, ang balbula K1 ay sarado, at sa pamamagitan ng balbula K2 ang mobile phase ay pumapasok sa dosing device.

Ang mga bomba ng ganitong uri ay nailalarawan sa pamamagitan ng halos kumpletong kawalan ng mga pulsation sa daloy ng mobile phase sa panahon ng operasyon.

Mga disadvantages ng pump:

a) mataas na pagkonsumo ng oras at solvent para sa paghuhugas kapag binabago ang solvent;

b) ang dami ng PF ay limitado sa dami ng hiringgilya, at samakatuwid ang oras ng paghihiwalay ay limitado;

c) suspensyon ng paghihiwalay habang pinupuno ang bomba;

d) malalaking sukat at bigat habang tinitiyak ang mataas na daloy at presyon (kailangan ang isang malakas na makina at isang malaking puwersa ng piston na may malaking lugar).

Mga reciprocating plunger pump.

kanin. 3. Pangunahing disenyo ng isang plunger pump.

Prinsipyo ng pagpapatakbo.

Ang Motor D, sa pamamagitan ng gearbox P, ay nagtatakda ng plunger P sa reciprocating motion, na gumagalaw sa gumaganang ulo ng pump. Ang mga balbula K1 at K2 ay bubukas kapag ang bomba ay nasa mga yugto ng pagsipsip at paghahatid, ayon sa pagkakabanggit. Ang dami ng volumetric feed ay tinutukoy ng tatlong mga parameter: ang diameter ng plunger (karaniwang 3.13; 5.0; 7.0 mm), ang amplitude nito (12-18 mm) at dalas (na depende sa bilis ng pag-ikot ng motor at gearbox).

Ang mga bomba ng ganitong uri ay nagbibigay ng patuloy na volumetric na supply ng mobile phase sa loob ng mahabang panahon. Maximum na operating pressure 300-500 atm, flow rate 0.01-10 ml/min. Volumetric feed repeatability -0.5%. Ang pangunahing kawalan ay ang solvent ay ibinibigay sa system sa anyo ng isang serye ng mga sunud-sunod na pulso, kaya may mga presyon at daloy ng mga pulsation (Larawan 4). Ito ang pangunahing dahilan para sa pagtaas ng ingay at pagbawas ng sensitivity ng halos lahat ng mga detektor na ginagamit sa LC, lalo na ang mga electrochemical.

Fig.4. Plunger pump pulsations.

Mga paraan upang harapin ang mga pulsation.

1. Paglalapat ng mga damping device.

Ang mga ito ay spiral tubes ng isang espesyal na profile na gawa sa hindi kinakalawang na asero, konektado sa serye o parallel sa sistema sa pagitan ng pump at ng dispenser.

kanin. 5. Spiral damper.

Ang damper ay nakaka-unwind habang tumataas ang pressure dito (pump acceleration). Kapag bumaba ang presyon, ito ay kulot, ang dami nito ay bumababa, pinipiga nito ang bahagi ng solvent, pinapanatili ang isang pare-pareho ang rate ng daloy at binabawasan ang mga pulsation. Ang damper na ito ay gumagana nang maayos sa mga presyon na 50 atm at pataas.

Sa isang presyon ng 5-30 atm ito smooths out pulsations mas mahusay air damper, na ginawa mula sa isang haligi (Larawan 6.). Ang hangin sa damped column (6x200 mm) ay naka-compress at ang mga pulsation ay damped. Ang hangin ay natutunaw dito sa loob ng 24 na oras.

kanin. 6. Air damper.

2. Application ng mga elektronikong aparato.

Kapag gumagamit ng electronic pressure sensor, maaari mong gamitin ang mga pagbabasa ng sensor upang kontrolin ang pagpapatakbo ng pump. Kapag bumaba ang presyon, tataas ang bilis ng makina at nababayaran ang pagbaba ng presyon. Posible rin na mabayaran ang mga pagtagas sa mga balbula at bahagyang sa cuffs. Ang paggamit ng isang electronic damper (BPZh-80, KhPZh-1, atbp.) Ay ginagawang posible upang mabawasan ang mga pulsation ng presyon sa 1 atm sa isang presyon ng 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Ion exchange, ion, ion-pair chromatography. Ang mga paraan ng pagpapalitan ng ion, chromatography ng ion at pares ng ion ay batay sa dinamikong proseso ng pagpapalit ng mga ion na nauugnay sa nakatigil na yugto ng mga eluent na ion na pumapasok sa column. Ang pangunahing layunin ng proseso ng chromatographic ay ang paghihiwalay ng mga inorganic o organic ions ng parehong sign. Ang pagpapanatili sa mga ganitong uri ng chromatography ay tinutukoy ng pagbabago sa libreng enerhiya ng reaksyon ng pagpapalitan ng ion. Ang ratio ng mga konsentrasyon ng mga ipinagpapalit na ions sa solusyon at sa sorbent phase ay nailalarawan sa pamamagitan ng ion exchange equilibrium. Ang palitan ng ion ay ang ilang mga sangkap (ion exchanger), kapag inilubog sa isang electrolyte solution, sumisipsip ng mga cation o anion mula dito, na naglalabas sa solusyon ng katumbas na halaga ng iba pang mga ion na may singil na parehong tanda. Ang pagpapalitan ng mga cation ay nangyayari sa pagitan ng cation exchanger at ng solusyon, at ang isang pagpapalitan ng mga anion ay nangyayari sa pagitan ng anion exchanger at ng solusyon.

Ang mga cation exchangers ay kadalasang espesyal na na-synthesize na hindi matutunaw na mga polymer substance na naglalaman sa kanilang istraktura ng mga ionogenic na grupo ng acidic na kalikasan: –SO 3 H; –COOH; –OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Ang mga kemikal na formula ng mga cation exchanger ay maaaring ilarawan sa eskematiko bilang R-SO 3 H; R-SO 3 Na. Sa unang kaso, ang cation exchanger ay nasa H-form, sa pangalawa, sa Na-form. R - polymer matrix.

Ang mga reaksyon ng pagpapalitan ng cation ay isinulat bilang ordinaryong heterogenous na mga reaksiyong kemikal:

RNa +Na + RNa+H +

Ang mga anion exchanger ay naglalaman sa kanilang istraktura ng mga pangunahing ionogenic na grupo: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + atbp. Ang kanilang mga kemikal na formula ay maaaring ilarawan bilang RNH 3 OH at RNH 3 Cl o ROH, RCl. Sa unang kaso, ang anion exchanger ay nasa OH form, sa pangalawang kaso, sa Cl form. Ang reaksyon ng pagpapalitan ng anion ay maaaring isulat tulad ng sumusunod:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Ang mga amphoteric ion exchanger ay kilala na naglalaman ng parehong acidic at pangunahing mga grupo sa kanilang istraktura. Ang mga ion exchanger na naglalaman ng parehong uri (halimbawa, SO 3 H) acidic (basic) na mga grupo ay tinatawag na monofunctional; Ang mga ion exchanger na naglalaman ng iba't ibang uri (halimbawa, SO 3 H, OH) acidic (basic) na mga grupo ay polyfunctional.

Ang mga monofunctional ion exchanger ay nakukuha sa pamamagitan ng polymerization reaction. Ginagawang posible ng reaksyon ng polycondensation na makakuha ng mga multifunctional ion exchanger. Upang ang mga nagresultang ion exchanger ay magkaroon ng sapat na mataas na mga katangian ng pagganap, dapat silang hindi malulutas, ngunit pamamaga sa naaangkop na solvent at may sapat na malaking bilang ng mga ionogenic na grupo na may kakayahang makipagpalitan ng mga ionogenic na grupo ng nasuri na sample. Ito ay maaaring makamit kung ang mga resultang polymer chain ay sapat na branched at naka-link sa bawat isa sa pamamagitan ng cross-linking bridges. Halimbawa, kapag naghahanda ng polymerization-type cation exchangers batay sa styrene, ang divinylbenzene ay kadalasang ginagamit bilang isang cross-linking agent, ang pagpapakilala nito sa halagang hanggang 16% ay tinitiyak ang paggawa ng mga ion exchanger na may iba't ibang antas ng pamamaga at , samakatuwid, ginagawang posible na ayusin ang porosity ng ion exchanger. Ang antas ng pamamaga ng ion exchanger, na ipinahayag sa milliliter/gram, ay ang dami ng 1 g ng air-dry ion exchanger na nakaimpake sa isang column.

Ang ion exchanger ay sumisipsip, bilang isang panuntunan, ang isa sa mga counterion - mga ion na naroroon sa mobile phase, i.e. ito ay nagpapakita ng isang tiyak na selectivity. Ang serye ng affinity, o selectivity, ng mga ion na may paggalang sa iba't ibang uri ng mga palitan ng ion ay nai-eksperimentong naitatag. Halimbawa, sa mababang konsentrasyon ng solusyon sa mga malakas na acidic na cation exchanger, ang mga ion na may parehong singil ay sinusuri sa sumusunod na pagkakasunud-sunod:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Para sa mga ion na may iba't ibang singil, tumataas ang sorption sa pagtaas ng singil:

Na+ Ca 2+

Gayunpaman, ang pagbabago ng mga kondisyon ng reaksyon ng pagpapalitan ng ion ay maaaring humantong sa pagbabalik ng serye. Ang serye ng affinity ay naitatag din para sa mga anion exchanger. Halimbawa, ang sorbability ng mga anion sa malakas na pangunahing mga anion exchanger ay tumataas sa sumusunod na pagkakasunud-sunod:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Ang mga palitan ng ion na naglalaman ng malakas na acidic o malakas na pangunahing mga grupo sa kanilang istraktura ay pumapasok sa mga reaksyon ng pagpapalitan ng ion sa anumang mga ion sa solusyon na may mga singil na kapareho ng tanda ng counterion. Ang ganitong mga ion exchanger ay tinatawag na unibersal.

Ang proseso ng pagpapalitan ng ion sa pagitan ng analyte at ng ion exchanger ay maaaring isagawa sa isa sa tatlong paraan: static, dynamic (paraan ng filter ng ion exchange) at chromatographic.

Static na pamamaraan Ang pagpapalitan ng ion ay ang isang sample ng ion exchanger ay dinadala sa pakikipag-ugnayan sa isang tiyak na dami ng solusyon at pinaghalo o inalog para sa isang tiyak na oras hanggang sa maitatag ang ekwilibriyo. Ito ay isang mabilis at simpleng paraan ng pagpapalitan ng ion, na ginagamit upang pag-concentrate ang mga ion mula sa mga dilute na solusyon, pag-alis ng mga hindi kinakailangang impurities, ngunit hindi nito tinitiyak ang kumpletong pagsipsip ng mga ion, dahil ang pagpapalitan ng ion ay isang prosesong hindi balanse, at bilang resulta ay hindi ginagarantiyahan ang kumpletong paghihiwalay ng mga ion.

Kapag nagsasagawa ng palitan ng ion sa isang dinamikong paraan ang isang solusyon ay ipinapasa sa haligi na may ion exchanger, na, habang ito ay gumagalaw sa kahabaan ng haligi, ay nakikipag-ugnayan sa mga bagong butil ng ion exchanger. Ang prosesong ito ay nagbibigay ng isang mas kumpletong palitan kaysa sa static na paraan, dahil ang mga produkto ng palitan ay inalis sa pamamagitan ng daloy ng solusyon. Maaari silang mag-concentrate ng mga ions mula sa mga dilute na solusyon at magkahiwalay na mga ion na malaki ang pagkakaiba sa mga katangian, halimbawa, mga ions ng iba't ibang mga singil (hiwalay na mga cation mula sa mga anion), ngunit ang paghihiwalay ng mga ions ng parehong sign ng pagsingil ay halos imposible. Ang dami ng paghihiwalay ng naturang mga ions ay posible lamang sa paulit-ulit na pag-uulit ng sorption-desorption elementary acts sa ilalim ng mga dynamic na kondisyon, i.e. paraan ng chromatographic . Kapag nagtatrabaho sa pamamaraang ito, ang mga matataas na layer ng ion exchanger ay ginagamit at ang halo na ihihiwalay ay ipinakilala sa layer na ito sa isang halaga na mas mababa kaysa sa kapasidad ng haligi, dahil sa kung saan maraming mga pag-uulit ng elementarya na mga pagkilos ng ion exchange ay natiyak.

Sa mga tuntunin ng mga diskarte sa pagsusuri, ang ion exchange chromatography ay katulad ng molecular chromatography at maaaring isagawa gamit ang eluent (developing), frontal at displacement na mga opsyon. Ang pagkakaiba sa pagitan ng molecular at ion exchange chromatography ay na sa molecular chromatography ang mga pinaghihiwalay na bahagi ng mixture ay na-eluted mula sa column na may purong eluent, habang sa ion exchange chromatography isang electrolyte solution ang ginagamit bilang eluent. Sa kasong ito, ang ipinagpapalit na ion ng eluent ay dapat na sorbed nang mas kaunti kaysa sa alinman sa mga ion ng pinaghalong pinaghihiwalay.

Kapag nagsasagawa ng pag-unlad ng chromatography ng pagpapalitan ng ion, na kadalasang ginagamit, ang isang haligi na puno ng isang ion exchanger ay unang hinuhugasan ng isang electrolyte solution hanggang ang lahat ng mga ion nito ay ganap na mapalitan sa ion exchanger ng mga ion na nakapaloob sa eluent. Pagkatapos ng isang maliit na dami ng isang solusyon ng analyte, na naglalaman ng mga pinaghiwalay na mga ion sa isang halaga na halos 1% ng kapasidad ng exchanger ng ion, ay ipinakilala sa haligi. Susunod, ang haligi ay hugasan ng eluent solution, pinipili ang eluate fraction at pinag-aaralan ang mga ito.

Ang pinaghalong Cl – , Br – , J – ions ay maaaring paghiwalayin sa isang highly basic anion exchanger (cross-linked polystyrene na naglalaman ng mga grupo ng quaternary ammonium bases – N (CH 3) 3 +), halimbawa, AB-17, na ay may bilang ng selectivity (selectivity): NO 3 – Cl – Br – J – . Bilang resulta, ang isang NaNO 3 na solusyon ay ginagamit bilang isang eluent. Una, ang solusyon na ito ay ipinapasa sa ion exchanger hanggang sa ganap na puspos ng NO 3 – ions. Kapag ang halo na ihihiwalay ay ipinasok sa column, ang Cl – , Br – , J – ions ay nasisipsip ng anion exchanger, na inilipat ang NO 3 – ions. Kapag ang haligi ay kasunod na hugasan ng isang NaNO 3 na solusyon, ang Cl – , Br – , J – ions sa itaas na mga layer ng anion exchanger ay unti-unting pinapalitan muli ng NO 3 – ions. Ang mga Cl – ions ay pinakamabilis na maililipat, at ang J – ions ay mananatili sa column ang pinakamatagal. Ang pagkakaiba sa selectivity ng ion exchanger sa mga ions ng pinaghalong humahantong sa pagbuo ng magkahiwalay na mga zone ng sorbed Cl – , Br – at J – ions sa column, na gumagalaw kasama ang column sa iba’t ibang bilis. Habang gumagalaw ka sa column, tataas ang distansya sa pagitan ng mga zone. Sa bawat zone mayroon lamang isa sa mga anion ng pinaghalong pinaghihiwalay at ang eluent anion sa pagitan ng mga zone ay mayroon lamang ang eluent anion. Kaya, lilitaw ang mga fraction sa eluent sa labasan ng column, na naglalaman ng mga indibidwal na bahagi ng pinaghalong pinaghihiwalay.

Upang malutas ang mga praktikal na problema, ang mga kondisyon para sa paghihiwalay ng ion ay iba-iba sa pamamagitan ng pagpili ng angkop na mobile phase (komposisyon, konsentrasyon, pH, lakas ng ionic) o pagbabago ng porosity ng polymer matrix ng ion exchanger, ibig sabihin, ang bilang ng mga interchain bond sa matrix, at paglikha ng mga salaan ng pagpapalitan ng ion na natatagusan ng ilang mga ion at may kakayahang palitan ang mga ito at hindi malalampasan sa iba. Posible ring baguhin ang kalikasan at kamag-anak na pag-aayos ng mga ionogenic na grupo, pati na rin makakuha ng mga sorbents na may kakayahang pumipili ng mga reaksiyong kemikal dahil sa kumplikadong pagbuo. Halimbawa, ang mga complex-forming ion exchangers na naglalaman sa kanilang mga istraktura chelating group ng mga organic reagents dimethylglyoxime, dithizone, 8-hydroxyquinoline, atbp., pati na rin ang mga crown ether, ay may mataas na selectivity.

Ang pinakamalaking gamit sa pagpapalitan ng ion, chromatography ng ion at pares ng ion ay matatagpuan sa mga sintetikong macro- at micromesh na mga organic na ion exchanger na may malaking kapasidad ng pagpapalitan (3–7 mmol/g), gayundin sa mga inorganic na materyales sa pagpapalitan ng ion. Ang mga micromesh ion exchanger ay may kakayahang makipagpalitan ng mga ion lamang sa namamaga na estado, habang ang mga macromesh ion exchanger ay may kakayahang makipagpalitan ng mga ion lamang sa namamaga at hindi namamaga na mga estado. Ang isa pang istrukturang uri ng ion exchangers ay ang surface-film ion exchangers, ang solid core nito ay gawa sa isang non-porous copolymer ng styrene at divinylbenzene, glass o silica gel at napapalibutan ng manipis na film ng ion exchanger. Ang kabuuang diameter ng naturang particle ay halos 40 µm, ang kapal ng ion exchanger film ay 1 µm. Ang kawalan ng naturang mga palitan ng ion ay ang medyo malaking diameter ng butil at mababang kapasidad ng palitan dahil sa mababang tiyak na lugar sa ibabaw, bilang isang resulta kung saan kinakailangan upang gumana sa mga maliliit na sample at, nang naaayon, gumamit ng mga sensitibong detektor. Bilang karagdagan, ang mga naturang ion exchanger ay mabilis na nalason at hindi kaya ng pagbabagong-buhay.

Sa high-performance ion exchange at ion chromatography, volumetric porous polystyrene ion exchangers, volumetric porous silicas na may granule diameter na humigit-kumulang 10 microns, pati na rin ang halos hindi namamaga na surface-porous at surface-modified copolymers ng styrene at divinylbenzene na may ionogenic sulfo - at mga amino group ay ginagamit.

Sa ion-pair chromatography, ang "brush" sorbents ay ginagamit - silica gels na may grafted reverse phase C 2, C 8, C 18, na madaling ma-convert sa isang cation exchanger kapag sumisipsip ng mga ionic surfactant mula sa mobile phase, halimbawa alkyl sulfates o mga asin ng quaternary ammonium base.

Kapag nagsasagawa ng chromatographic separation gamit ang ion exchangers, ang mga may tubig na solusyon ng mga asin ay kadalasang ginagamit bilang mobile phase. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang tubig ay may mahusay na dissolving at ionizing properties, dahil sa kung saan ang mga molekula ng nasuri na sample ay agad na naghihiwalay sa mga ions, ang mga ion exchange group ng ion exchanger ay hydrated at nagbabago din sa isang ganap o bahagyang dissociated form. Tinitiyak nito ang mabilis na pagpapalitan ng mga counterion. Ang lakas ng elution ng mobile phase ay pangunahing naiimpluwensyahan ng pH, lakas ng ionic, likas na katangian ng buffer solution, at ang nilalaman ng organic solvent o surfactant (ion-pair chromatography).

Ang halaga ng pH ay pinili depende sa likas na katangian ng mga ionogenic na grupo, ang pinaghiwalay na mga ion at ang matrix. Maaari kang magtrabaho sa mga malakas na acidic at malakas na pangunahing ion exchanger sa pH = 2–12, na may mahinang acidic sa pH = 5–12, na may mahinang basic sa pH = 2–6. Ang mga silica-based na sorbent ay hindi maaaring gamitin sa pH 9. Ang lakas ng ionic ng mobile phase ay nakakaapekto sa kapasidad ng ion exchanger. Habang tumataas ang lakas ng ionic, kadalasang bumababa ang sorption ng mga ion, habang tumataas ang puwersa ng elution ng mobile phase. Samakatuwid, sa simula ng paghihiwalay, ang mobile phase ay dapat magkaroon ng isang mababang lakas ng ionic (0.05-0.1), at ang pangwakas na halaga ng katangiang ito ay hindi dapat lumampas sa 2. Sa gradient elution, ang mga buffer na may pagtaas ng lakas ng ionic ay kadalasang ginagamit.

Para sa pumipili na elution ng mga ion na hinihigop ng isang ion exchanger, maaari mong gamitin ang tubig, mga buffer solution (phosphate, acetate, borate, hydrocarbonate, atbp.) na may isang tiyak na halaga ng pH at lakas ng ionic, mga solusyon sa mineral (hydrochloric, nitrogen, sulfur, phosphorus) at mga organic (phenol, citric, lactic, tartaric, oxalic, EDTA) acids. Ang pagpili ng eluent ay pinadali ng katotohanan na ang paglilimita sa mga koepisyent ng pamamahagi ng karamihan sa mga elemento sa pagitan ng may tubig (aqueous-organic) na mga solusyon ng maraming mga complexant at karaniwang uri ng ion exchanger ay tinutukoy at ipinakita sa mga talahanayan.

1.6.4. Sukat ng pagbubukod ng chromatography. Ang size exclusion chromatography ay isang uri ng liquid chromatography kung saan ang paghihiwalay ng mga bahagi ay batay sa distribusyon ng mga molekula ayon sa kanilang laki sa pagitan ng solvent na matatagpuan sa mga pores ng sorbent at ng solvent na dumadaloy sa pagitan ng mga particle nito. Sa panahon ng proseso ng paghihiwalay, ang mga maliliit na molekula ay pumapasok sa polymer network, sa mga pores kung saan ang solvent ay nagsisilbing isang nakatigil na yugto, at nananatili doon. Ang mga malalaking molekula ay hindi maaaring tumagos sa polymer network at nahuhugasan sa labas ng column ng mobile phase. Ang mga pinakamalaking molekula ay unang na-eluted, pagkatapos ay ang mga katamtaman ang laki, at sa wakas ay ang mga maliliit.

Ang chromatography ng pagbubukod ng laki ay nahahati sa gel permeation at gel filtration. Sa gel permeation chromatography, ang paghihiwalay ay nangyayari sa mga polimer na namamaga sa mga organikong solvent. Ang bersyon ng pagsasala ng gel ng chromatography ng pagbubukod ng laki ay nagsasangkot ng paggamit ng mga polimer na bumubulusok sa tubig bilang mga nakatigil na yugto.

Ang tagal ng pagpapanatili ng mga bahagi ng nasuri na sample sa column ng pagbubukod ng laki ay nakasalalay sa laki ng kanilang mga molekula at pagsasabog sa mga pores ng sorbent, pati na rin sa laki ng butas ng nakatigil na yugto.

Sa ganitong uri ng liquid chromatography, ang distribution coefficient D para sa pinakamaliit na molekula ng nasuri na sample, na gumagalaw sa chromatographic column sa pinakamababang bilis, na tumagos sa stationary phase network, ito ay katumbas ng 1, dahil ang mobile phase at ang solvent na matatagpuan sa mga pores ng stationary phase ay may parehong komposisyon. Sa kasong ito, ang pangunahing equation ng column chromatography ay nasa anyo

Ang mga malalaking molekula na hindi magkasya sa mga pores ng nakatigil na bahagi ay nag-elute mula sa haligi kasama ang mobile phase. Para sa kanila D= 0, a V R =V m. Ang hanay ng mga halaga ng koepisyent ng pamamahagi (mula 0 hanggang 1) ay tipikal lamang para sa chromatography ng pagbubukod ng laki.

Ang lahat ng mga molecule ng multicomponent substance na sinusuri ay dapat na hugasan sa labas ng column sa pamamagitan ng pagpasa ng isang maliit na volume ng solvent mula sa V m dati V m +V s at ang paghihiwalay ay nagtatapos bago ang solvent peak ay pinakawalan. Samakatuwid, sa ganitong uri ng chromatography kinakailangan na gumamit ng medyo mahahabang mga haligi na may malaking libreng volume V m at isang malaking bilang ng mga pores sa sorbent.

Ang resolution ng mga chromatographic peak sa mga paghihiwalay ng pagbubukod ng laki ay maaaring mapabuti sa pamamagitan ng paggamit ng gradient elution na may mga halo-halong solvent.

Ang bawat sorbent na ginagamit sa chromatography ng pagbubukod ng laki ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang tiyak na dami ng butas at, samakatuwid, ay may isang tiyak na rehiyon ng mapaghihiwalay na mga timbang ng molekular at isang tiyak na curve ng pagkakalibrate. Sa kasong ito, ang graph ng pagkakalibrate na nagpapakilala sa pagtitiwala ng napanatili na dami sa molekular na timbang o laki ng molekular, bilang panuntunan, ay may isang kumplikadong hitsura.

Pinipili ang mga nakatigil na yugto sa chromatography ng pagbubukod ng laki batay sa mga partikular na gawaing analitikal. Sa una, ito ay itinatag kung aling solvent system ang maaaring gamitin para sa pagsusuri (may tubig o may tubig-organic). Depende dito, natutukoy ang uri ng sorbent. Kung kinakailangan upang paghiwalayin ang mga sample na nalulusaw sa tubig, halimbawa, ang water-swellable na cross-linked dextrans (Sephadex) o polyacrylamides (Biogel R) ay ginagamit bilang mga nakatigil na yugto. Ang paghihiwalay ng mga sangkap na natutunaw sa mga organikong solvent ay maaaring isagawa sa mga polystyrene na may iba't ibang antas ng cross-linking, pamamaga sa mga organikong solvent (styrogel, poragel, biobid C). Ang ganitong mga namamagang gel ay karaniwang hindi matatag ang presyon at nagbibigay-daan sa napakababang mga rate ng daloy ng mobile phase, na nagpapataas ng oras ng pagsusuri. Upang ipatupad ang isang napakahusay na bersyon ng chromatography ng pagbubukod ng laki, kinakailangan na gumamit ng mga nakatigil na yugto na may mga matibay na matrice—silica gels, ang kawalan nito—mataas na aktibidad ng adsorption—ay inaalis sa pamamagitan ng silanization ng ibabaw o pagpili ng isang eluent na naaangkop sa polarity.

Ang mga sangkap na maaaring gamitin bilang mga mobile phase sa size exclusion chromatography ay:

- ganap na matunaw ang nasuri na sample;

 basang mabuti ang sorbent;

- kontrahin ang adsorption ng mga sample na bahagi sa sorbent;

 may mababang lagkit at toxicity.

1.6.5. Plane chromatography. Kasama sa plane chromatography ang thin layer chromatography at paper chromatography. Ang mga uri ng likidong kromatograpiyang ito ay simple sa pamamaraan, mabilis, at hindi nangangailangan ng mamahaling kagamitan, na hindi maikakaila na kalamangan nito.

Ang paghihiwalay ng isang halo ng mga sangkap sa pamamagitan ng mga pamamaraang ito ay maaaring isagawa gamit ang iba't ibang mga chromatographic system. Samakatuwid, ang adsorption, distribution, normal- at reverse-phase, ion-exchange, atbp. papel at thin-layer chromatography ay nakikilala. Sa kasalukuyan, ang thin layer chromatography ay pinaka-malawakang ginagamit.

Ang papel at manipis na layer na chromatography ay magkatulad sa pamamaraan. Ang cellulose fiber ng papel ay ginagamit bilang isang nakatigil na yugto sa chromatography ng papel, sa manipis na layer na chromatography, ang iba't ibang mga sorbents (Al 2 O 3, silica gel, atbp.) ay inilalapat sa isang pare-parehong manipis (100-300 μm) na layer sa isang baso, metal o plastik na substrate (carrier) . Ang adsorbent layer sa carrier ay maaaring nakakabit o hindi.

Ang paghihiwalay ng kromatograpiko sa mga pamamaraan ng planar, pati na rin sa isang haligi, ay dahil sa paglipat ng mga bahagi ng analyte sa pamamagitan ng mobile phase kasama ang nakatigil na phase layer sa iba't ibang mga rate alinsunod sa mga koepisyent ng pamamahagi ng mga sangkap na pinaghihiwalay. Sa parehong mga kaso, ginagamit ang mga chromatographic system: likido - solid sorbent (mekanismo ng paghihiwalay ng adsorption), likido - likido - solid carrier (distribution, ion exchange at iba pang mga mekanismo).

Ang iba't ibang mga solvents o mixtures nito, organic o inorganic acids ay ginagamit bilang mga mobile phase.

Ang praktikal na produksyon ng planar chromatograms ay ang mga sumusunod.

Sa isang strip ng chromatographic paper o sa isang manipis na layer ng sorbent, markahan ang panimulang linya gamit ang isang lapis sa layo na 1 cm mula sa ilalim na gilid ng strip o plato. Gamit ang isang micropipette, ilapat ang sample sa panimulang linya sa anyo ng isang lugar na may diameter na hindi hihigit sa 2-3 mm. Ang gilid ng strip o plato ay ibinababa sa isang sisidlan na naglalaman ng mobile phase na matatagpuan sa isang selyadong silid. Habang tumataas ang mobile phase sa kahabaan ng strip o plate at maraming elementarya na pagkilos ng sorption-desorption, ang distribusyon sa pagitan ng dalawang liquid phase, ion exchange, atbp., na karaniwan sa chromatography, ay nangyayari, ang mga bahagi ng pinag-aralan na timpla ay pinaghihiwalay. Ang proseso ay karaniwang ipinagpapatuloy hanggang ang solvent ay pumasa mula sa panimulang linya 10 cm Pagkatapos nito, ang strip o plato ay tinanggal mula sa silid at tuyo. Kung ang mga bahagi ng analyte ay may kulay, nagbibigay sila ng kaukulang kulay na mga spot sa chromatogram. Upang matukoy ang mga di-kulay na bahagi ng analyte, dapat mabuo ang chromatogram. Ang pagbuo ng isang chromatogram at ang pagtuklas ng mga sample na bahagi ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan at depende sa komposisyon ng nasuri na mga mixture. Ang pagpapakita ay maaaring isagawa:

- gamit ang UV lighting. Ang pamamaraan ay naaangkop para sa pagtuklas ng mga sangkap na may kakayahang maglabas ng kanilang sariling radiation (luminesce) sa nakikitang hanay ng haba ng daluyong sa ilalim ng impluwensya ng UV radiation;

- sa pamamagitan ng pagbuo ng mga reagents. Halimbawa, ang pagkakaroon ng mga amino acid sa pinag-aralan na halo ay maaaring makita gamit ang ninhydrin. Ang pinatuyong chromatogram ay inilulubog sa isang 0.2% na solusyon ng ninhydrin sa acetone, pagkatapos ay tuyo. Ang mga spot na naaayon sa iba't ibang bahagi ng pinaghalong nakakakuha ng isang visual at, bilang isang panuntunan, kulay na tiyak sa bawat sangkap;

- gamit ang yodo. Sa kasong ito, ang nakitang chromatogram ay ipinakilala sa isang sisidlan sa ilalim kung saan mayroong mga kristal na yodo. Ang singaw ng yodo ay mas malakas na na-adsorbed sa mga spot, na ginagawang nakikita ang mga spot. Ang Iodine ay isang nonspecific na developer reagent. Gamit ang mga tiyak na reagents, posible hindi lamang upang matukoy ang bilang ng mga bahagi ng pinaghalong, kundi pati na rin upang makilala ang mga pinaghiwalay na sangkap sa pamamagitan ng kulay ng mga spot.

Ang papel at manipis na layer na chromatography ay madalas na isinasagawa sa tinatawag na pataas na bersyon na inilarawan sa itaas. Kadalasan, upang mapabuti ang kalidad ng mga chromatogram, kinakailangan na gumamit ng mas kumplikadong mga variant ng planar chromatography, halimbawa, pababang, pabilog, dalawang-dimensional. Kapag nagsasagawa ng pababang papel o manipis na layer na chromatography, ang analyte ay inilalapat sa panimulang linya ng isang plato o strip ng papel na matatagpuan sa itaas, at ang eluent ay ibinibigay hindi mula sa ibaba, ngunit mula sa itaas. Ang positibong epekto ng pagpapabuti ng paghihiwalay ay dahil sa kontribusyon ng gravity ng mga bahagi sa proseso ng paghihiwalay.

Ang parehong pataas at pababang chromatography ay maaaring isagawa sa isa at dalawang-dimensional na bersyon. Kabaligtaran sa proseso ng one-dimensional na flat-bed separation na inilarawan sa itaas, sa two-dimensional chromatographic separation ang sample na susuriin ay unang pinaghihiwalay sa isang solvent, pagkatapos ay pinaghihiwalay sa direksyon na patayo sa una gamit ang isa pang solvent, na umiikot sa unang chromatogram sa pamamagitan ng 90 o C.

Kapag nagsasagawa ng circular chromatography, ang analyte ay inilalapat bilang isang patak sa gitna ng isang plato o sheet ng chromatography na papel. Ang isa o higit pang mga solvents ay idinagdag din ng dropwise dito. Nagreresulta ito sa nagreresultang chromatogram na isang hanay ng mga radial spot.

Ang posisyon ng mga spot (zone) na bumubuo ng mga pinaghiwalay na bahagi ng analyte sa isang flat chromatogram ay nailalarawan sa pamamagitan ng kamag-anak na bilis ng paggalaw ng mga bahagi sa isang manipis na layer R fi. Eksperimento ang halaga R fi tinukoy bilang ratio ng distansya L i pumasa i-ika bahagi, sa layo L dinadaanan ng solvent mula sa panimulang linya hanggang sa harap na linya (Larawan 1.10):

Magnitude R fi depende sa likas na katangian ng kaukulang bahagi ng nasuri na sample, ang likas na katangian ng nakatigil na yugto, ang kapal nito, ang kalikasan at kalidad ng mobile phase, ang paraan ng paglalapat ng sample at iba pang mga kadahilanan, ngunit palaging R fi 1.

Magnitude R fi ay aktwal na kapareho ng oras ng pagpapanatili ng isang sangkap o dami ng pagpapanatili nito, na nagpapakilala sa bilis ng pagdaan ng isang sangkap sa pamamagitan ng isang chromatographic column, at maaaring magamit para sa qualitative identification ng mga bahagi ng nasuri na sample, at ang diameter ng spot ay magkapareho sa taas o lugar ng chromatographic peak at, samakatuwid, sa ilang sukat ay sumasalamin sa dami ng nilalaman ng sangkap.

Sa pinakasimpleng kaso, ang quantitative determination ng komposisyon ng nasuri na sample ay maaaring masuri nang biswal sa pamamagitan ng intensity ng sariling kulay ng mga spot o ang intensity ng fluorescent glow ng mga resultang spot sa panahon ng UV detection. Para sa mga layuning ito, malawakang ginagamit ang elution ng mga chromatographic spot. Sa kasong ito, ang lugar na nakuha sa chromatogram ay maingat na pinutol o nasimot, ginagamot sa isang angkop na solvent, at ang resultang solusyon ay sinusuri gamit ang naaangkop na physicochemical method. Maaari mo ring gamitin ang paraan ng timbang, kung saan ang kaukulang lugar ay pinutol mula sa chromatogram at tinimbang. Ang dami ng substance ay natutukoy sa pamamagitan ng pagkakaiba sa mga timbang ng malinis na papel ng parehong lugar at papel na may substance.

Papel (BH ) At manipis na layer na chromatography (TLC ) ayon sa mekanismo ng paghihiwalay nabibilang sa chromatography ng partisyon . Sa paraan ng BH, ang carrier ay isang espesyal papel ng chromatography na may ilang mga katangian. Nakatigil na yugto ang tubig ay na-adsorbed sa ibabaw at mga pores ng papel (hanggang sa 20%), ang mobile ay isang organikong solvent, natutunaw o hindi nahahalo sa mga solusyon sa tubig, tubig o electrolyte.

Mekanismo Sa papel ito ay medyo kumplikado. Sa nakatigil na yugto, ang isang sangkap ay maaaring mapanatili hindi lamang dahil sa paglusaw sa tubig na na-adsorbed ng papel, kundi pati na rin sumipsip direkta mula sa selulusa. Naka-print sa papel ibinahaging bahagi pumasa sa mobile phase at lumipat sa mga capillary ng papel sa iba't ibang bilis alinsunod sa koepisyent ng pamamahagi ng interface bawat isa sa kanila. Sa simula kromatograpiya ang ilan sa mga sangkap mula sa papel ay pumapasok mobile phase at magpatuloy. Kapag ang organikong solvent ay umabot sa isang seksyon ng papel na hindi naglalaman ng solute, ito ay nangyayari muli. muling pamamahagi : mula sa organic na bahagi ang sangkap ay pumasa sa may tubig na bahagi, na nasorbed sa papel. Dahil ang mga sangkap ay magkakaiba pagkakaugnay para sa sorbent , kapag gumagalaw ang eluent, nangyayari ang paghihiwalay: ang ilang mga sangkap ay nananatili sa simula ng landas, ang iba ay gumagalaw pa. Dito sila pinagsama thermodynamic (pagtatatag ng ekwilibriyong pamamahagi ng mga sangkap sa pagitan ng mga yugto) at kinetiko (paggalaw ng mga bahagi sa iba't ibang bilis) mga aspeto ng paghihiwalay. Bilang isang resulta, ang bawat bahagi ay nakatuon sa isang tiyak na lugar ng sheet ng papel: mga zone ng mga indibidwal na sangkap sa chromatogram . Ang paggamit ng chromatography sa papel ay may isang bilang ng mga makabuluhang disadvantages: ang pagtitiwala sa proseso ng paghihiwalay sa komposisyon at mga katangian ng papel, mga pagbabago sa nilalaman ng tubig sa mga pores ng papel kapag nagbabago ang mga kondisyon ng imbakan, isang napakababang bilis ng chromatography ( hanggang ilang araw), at mababang reproducibility ng mga resulta. Ang mga pagkukulang na ito ay seryosong nakakaapekto sa pagkalat ng papel na chromatography bilang isang chromatographic na pamamaraan.

SA Paraan ng TLC ang proseso ng paghihiwalay ng isang halo ng mga sangkap ay isinasagawa sa isang manipis na layer sorbent , idineposito sa isang inert solid substrate, at ibinibigay sa pamamagitan ng paggalaw mobile phase (solvent) sa pamamagitan ng sorbent sa ilalim ng impluwensya mga puwersa ng capillary . Sa pamamagitan ngmekanismo ng paghihiwalay magkaiba partition, adsorption at ion exchange chromatography . Ang paghihiwalay ng mga bahagi ay nangyayari sa mga kasong ito bilang resulta ng kanilang magkakaibang koepisyent ng pamamahagi sa pagitan ng dalawang likidong phase ( chromatography ng partisyon ), o dahil sa iba't ibang adsorbability ng mga compound ng sorbent ( adsorption chromatography ). Ang paraan ng adsorption ay batay sa iba't ibang antas ng sorption-desorption ng mga pinaghiwalay na bahagi sa nakatigil na yugto. Adsorption natupad sa gastos ng mga puwersa ng van der Waals , na siyang batayan pisikal na adsorption , polymolecular (pagbubuo ng ilang mga layer ng adsorbate sa ibabaw ng adsorbent) at chemisorption (chemical interaction ng adsorbent at adsorbate).

Sa kaso ng paggamit ng mga naturang sorbents para sa TLC bilang alumina o silica gel may papel sa paghihiwalay pamamahagi , kaya adsorption sa nabuong aktibong ibabaw ng sorbent (150–750 m 2 /g). Pamamahagi ang mga bahagi ng pinaghalong nangyayari sa pagitan ng tubig sa ibabaw ng carrier (tulad ng adsorbents , Paano alumina , almirol , selulusa , kieselguhr - At tubig anyo nakatigil na yugto ), at ang solvent na gumagalaw sa nakatigil na bahaging ito ( mobile phase ). Ang bahagi ng pinaghalong mas natutunaw sa tubig ay gumagalaw nang mas mabagal kaysa sa isa na mas natutunaw sa mobile phase.

Adsorption manifests mismo sa ang katunayan na sa pagitan carrier , halimbawa, aluminum oxide, at ang mga bahagi ng pinaghalong ay itinatag adsorption equilibria – ang bawat bahagi ay may sariling, ang resulta nito ay iba't ibang bilis ng paggalaw mga bahagi ng pinaghalong. Dalawang matinding kaso ang maaaring makilala:

a) ang konsentrasyon ng sangkap sa adsorbent ay zero. Ang sangkap ay ganap na natutunaw sa mobile phase at dinadala nito (gumagalaw kasama ng may solvent na harap ).

b) ang sangkap ay ganap na na-adsorbed, hindi nakikipag-ugnayan sa solvent at nananatili sa simula.

Sa pagsasagawa, na may mahusay na pagpili ng solvent at adsorbent pamamahagi Ang mga compound ay matatagpuan sa pagitan ng mga matinding kaso na ito, at ang sangkap ay unti-unti inilipat mula sa isang sorbent layer patungo sa isa pa dahil sa sabay-sabay na mga proseso pagsipsip At desorption .

Ang solvent na dumadaan sa sorbent ay tinatawag maliwanag , ang proseso ng paglipat ng isang substance kasama ng eluent  elution . Habang gumagalaw ang likido sa kahabaan ng plato, naghihiwalay ang pinaghalong mga sangkap dahil sa pagkilos ng mga puwersa adsorption , pamamahagi , pagpapalitan ng ion o ang kumbinasyon ng lahat ng mga salik na ito. Bilang resulta, maghiwalay mga chromatographic zone mga bahagi ng pinaghalong, i.e. iyon pala chromatogram .

Tamang pagpili sorbent At maliwanag tinutukoy ang kahusayan ng paghihiwalay ng pinaghalong. Ang kadaliang mapakilos ng sangkap ng pagsubok ay nakasalalay sa pagkakaugnay nito para sa sorbent at puwersa ng elution (polarity) ng eluent. Habang tumataas ang polarity ng isang compound, tumataas din ang affinity nito para sa polar sorbent. Sa pamamagitan ng pagtaas ng antas ng adsorption silica gel ang mga organikong compound ay nakaayos sa isang hilera: hydrocarbons<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь para sa silica gel ang mga eluent ay maaaring isaayos sa pagkakasunud-sunod ng pagtaas ng "polarity" ( kapasidad ng elution ) at bumuo ng isang serye ng mga solvents ( eluotropic na serye ) alinsunod sa pang-eksperimentong data: alkanes>benzene>chloroform>diethyl ether>ethyl acetate>C 2 -C 4 alcohols>water>acetone>acetic acid>methanol. Kaya, ang polar compound, ang alkohol, ay lubos na na-adsorbed sa silica gel at samakatuwid ay gumagalaw nang mahina sa ilalim ng impluwensya ng isang non-polar solvent tulad ng hexane, at nananatiling malapit sa panimulang linya. Sa turn, ang nonpolar aromatic hydrocarbon biphenyl ay kapansin-pansing mas mobile sa hexane, ngunit kahit dito upang makamit R f tungkol sa 0.5, kinakailangan ang isang mas polar aprotic eluent - methylene chloride. Eluent na lakas regulate gamit ang mga mixtures ng solvents na kalapit eluotropic na serye na may iba't ibang polarity.

Sa kasalukuyan, ang mga sumusunod ay pangunahing ginagamit sa TLC: mga sorbents : para sa dibisyon mga sangkap na lipophilic  silica gel , alumina , acetylated cellulose , polyamides ; para sa paghihiwalay mga sangkap na hydrophilic  selulusa , cellulose ion exchangers , kieselguhr , polyamides . Ang pinakamahalagang katangian ng sorbent ay ang nito aktibidad , ibig sabihin. kakayahan sorb (hawakan) ang mga bahagi ng pinaghalong ihihiwalay. Sa ibang bansa, maraming kumpanya ang gumagawa silica gel , kieselguhr At alumina kasama ang pagdaragdag ng 5% dyipsum, na ginagamit upang ma-secure ang sorbent layer kapag gumagawa ng mga plato nang nakapag-iisa.

Ang pinakakaraniwang sorbent ay silica gel - hydrated silicic acid, na nabuo sa pamamagitan ng pagkilos ng mga mineral acid sa Na 2 SiO 3 at pagpapatuyo ng nagresultang sol. Pagkatapos ng paggiling ng sol, ang isang bahagi ng isang tiyak na laki ng butil ay ginagamit (ipinahiwatig sa plato, karaniwang 5-20 microns). Silica gel ay polar sorbent na may mga OH na grupo bilang mga aktibong sentro. Madali itong sumisipsip ng tubig sa ibabaw at bumubuo ng mga bono ng hydrogen.

Alumina ay isang mahinang pangunahing adsorbent at ginagamit pangunahin para sa paghihiwalay ng mahinang pangunahing at neutral na mga compound. Ang kawalan ng aluminum oxide plates ay ang ipinag-uutos na pag-activate ng ibabaw bago gamitin sa isang oven sa mataas na temperatura (100-150 o C) at ang mababang kapasidad ng adsorption ng layer kumpara sa silica gel.

Diatomaceous earth - adsorbent na nakuha mula sa natural na mineral - diatomaceous earths. Ang sorbent ay may hydrophilic properties at mas mababang adsorption capacity ng layer kumpara sa silica gel.

Cellulose: Ang mga manipis na layer na pinahiran ng selulusa ay napakaepektibo para sa paghihiwalay ng mga kumplikadong organikong molekula. Ang adsorbent ay pangunahing binubuo ng cellulose beads na may diameter na hanggang 50 microns, na naayos sa isang carrier na may almirol. Tulad ng chromatography ng papel, ang pagtaas ng harap ng solvent ay nangyayari nang napakabagal.

Pagsusuri ng Chromatographic ginanap sa mga pang-industriyang plato na ginawa sa Czech Republic " Silufol » (« Silufol ") gawa sa aluminum foil, kung minsan ay pinalalakas ng karton, at " Siluplast » gawa sa plastic, pinahiran ng isang layer ng sorbents - silica gel LS 5-40 na may starch o gypsum bilang isang binder (hanggang 10%), o aluminum oxide na may at walang pagdaragdag ng mga fluorescent indicator. Mga tala « Silufol » may mataas na elution rate, ngunit nailalarawan sa mababang kakayahan sa paghihiwalay at mababang sensitivity. Sa panahon ng pag-iimbak, sila ay sensitibo sa mga kondisyon (halumigmig, temperatura, agresibong kapaligiran, atbp.). Nagsusuplay ang ilang kumpanya mga plato ng chromatography na may isang sorbent layer ng iba't ibang (karaniwan ay hanggang sa 0.25 mm) ngunit mahigpit na pare-pareho ang kapal (silica gel, selulusa, ion exchange resin), sa salamin at mga substrate na gawa sa aluminum foil, plastic, pinapagbinhi na fiberglass.

Mga plato « Sorbfil » (TU 26-11-17-89) ay ginawa sa Russia sa isang polymer base (polyethylene terephthalate, grade P) o isang aluminum substrate (grade AF) na may inilapat na working layer microfractionated silica gel sorbent grades STX-1A at STX-1VE (ginawa sa USSR bilang fractionated silica gel KSKG) na may kapal na 90-120 microns (hanggang 200 microns), na naayos na may espesyal na binder - silica sol . Kapag gumagamit ng silicic acid sol (silica sol) bilang isang binder, na pagkatapos ng pag-init ay nagiging silica gel, ang mga nagresultang TLC plate ay binubuo ng dalawang bahagi: isang silica gel layer at isang substrate. Ang pagkakapareho ng kapal ng sorbent layer sa isang plato ay ±5 µm. Halimbawa ng pagtatalaga: "Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)" - mga high-performance na TLC plate sa isang aluminum substrate, na may phosphor, 10x10 cm.

Kung gumagamit ka ng isang glass substrate (grade C), kung gayon ang mga naturang plato ay magagamit muli at lumalaban sa kemikal. Ang kanilang paglaban sa kemikal ay tinutukoy ng paglaban ng kemikal ng silica gel. Bilang resulta, ang mga plate ng TLC ay maaaring paulit-ulit na tratuhin ng mga agresibong reagents, halimbawa, isang mainit na chromium mixture, na nag-aalis ng mga paghihigpit sa paggamit ng mga correlated reagents para sa pag-detect ng mga spot at pagbabago ng sorbent, at nagbibigay-daan para sa paulit-ulit (hanggang sa 30 beses o higit pa. ) pagbabagong-buhay ng mga plato na may pinaghalong kromo. Maaaring i-cut ang mga glass plate sa kinakailangang laki. Ang mekanikal na lakas ng sorbent layer ay maaaring iakma, na nagbibigay, sa isang banda, transportasyon at paulit-ulit na pagproseso ng mga plato at, sa kabilang banda, ang posibilidad ng pagkuha ng mga adsorbent layer na may hiwalay na mga sangkap para sa kasunod na pag-leaching ng mga indibidwal na compound mula sa sorbent at ang kanilang karagdagang pag-aaral sa pamamagitan ng mga instrumental na pamamaraan (IR at UV spectrometry , X-ray structural method, NMR, atbp.).

Ang mga plate ay naiiba sa laki ng mga fraction (particle distribution) ng silica gel na bumubuo sa layer. Sa analytical plates (grade A) ang fraction ay 5-17 microns, sa high-performance plates (grade B) - 8-12 microns. Ang isang mas makitid na pamamahagi ay nagdaragdag sa kahusayan ng mga plato, i.e. ang mga spot ng mga pinaghiwalay na sangkap ay nagiging mas siksik (mas maliit sa laki) at samakatuwid ay mas mahusay na pinaghihiwalay kapag ang eluent na harap ay dumaan sa isang mas maikling distansya. Sa mga wafer ng Russia, ang analytical at high-performance na mga layer ay hindi masyadong naiiba, hindi katulad ng mga wafer mula sa Merck (Germany). Ang mga high efficiency plate ay dapat gamitin kung ang mga substance ay hindi mapaghihiwalay sa analytical plates. Ang mga plato ng lahat ng mga pagbabago ay ginawa gamit ang phosphor (UV grade) na may excitation 254 nm. Ang buhay ng istante ay walang limitasyon, mga plato " Sorbfil » malawakang nasubok sa pagsusuri ng mga derivatives ng amino acid, pestisidyo, lipid, antibiotics.

Ang pamamaraan ng TLC ay isinasagawa pagkakakilanlan ng kalidad mga bahagi. dami para sa TLC ay posible rin, ito ay nangangailangan ng paglalapat ng eksaktong dami ng sangkap at karagdagang pag-aaral ng densitometric na may malinaw na pag-record ng intensity ng mga spot. Ang pinakakaraniwan ay semi-quantitative na pamamaraan . Ito ay batay sa visual na paghahambing ang laki at intensity ng isang spot ng isang component na may kaukulang mga katangian ng isang serye ng mga spot ng parehong substance ng iba't ibang concentrations ( karaniwang mga solusyon sa sanggunian ). Kapag gumagamit ng isang sample sa isang halaga ng 1-5 μg, ang simpleng paraan na ito ay nagsisiguro ng katumpakan ng pagpapasiya ng sangkap na nilalaman ng tungkol sa 5-10%. Kadalasan, upang matukoy ang mga sangkap sa isang sample, kinakailangan na magsagawa ng paghahanda ng sample upang makakuha ng isang halo na naglalaman ng mga nasuri na compound. Ang paghahanda ng sample ay batay sa pagkuha ng mga gamot mula sa sample na may mga organikong solvent ( n-hexane, petroleum ether, diethyl ether, chloroform), paglilinis ng extract at kasunod na chromatography sa isang manipis na layer ng aluminum oxide o silica gel.

Mayroong ilang mga opsyon para sa TLC at HD, na naiiba sa paraan panustos ng solvent . Depende sa direksyon ng paggalaw ng mobile phase, mayroong:

A)pataas na chromatography - ang mobile phase ay ibinuhos sa ilalim ng separation chamber, ang papel (plate) ay inilalagay nang patayo;

b)pababang chromatography  ang mobile phase ay pinapakain mula sa itaas at gumagalaw pababa sa kahabaan ng sorbent layer ng plato o papel;

V)radial chromatography  pahalang na pag-usad ng solvent front: ang mobile phase ay dinadala sa gitna ng paper disk (plate), kung saan ang halo na ihihiwalay ay inilalapat.

Ang pinakakaraniwan ay pataas na elution (chromatography). harap maliwanag habang lumilipat mula sa ibaba hanggang sa itaas. Ang pagpili ng solvent (mobile phase) ay tinutukoy ng likas na katangian ng sorbent at ang mga katangian ng mga sangkap na pinaghihiwalay.

Chromatographic na paghihiwalay sa pamamagitan ng BCh at TLC pamamaraan ay isinasagawa sa silid ng paghihiwalay na may lapped lid. Ang isang quantitative measure ng rate ng paglipat ng isang substance kapag gumagamit ng isang partikular na adsorbent at solvent ay halaga ng R f (mula sa English pagpapanatili salik – koepisyent ng pagkaantala, ang parameter na ito ay kahalintulad sa oras ng pagpapanatili). Posisyon mga zone ng chromatographed component itinakda ayon sa sukat koepisyent R f , katumbas ng ratio ng bilis ng paggalaw ng zone nito sa bilis ng paggalaw ng solvent front. Magnitude R f ay palaging mas mababa sa isa at hindi nakadepende sa haba ng chromatogram. Sa dami R f ay naiimpluwensyahan ng iba't ibang mga kadahilanan. Kaya, sa mababang temperatura, ang mga sangkap ay gumagalaw nang mas mabagal; solvent contamination, inhomogeneity ng adsorbent, ang mga dayuhang ions sa nasuri na solusyon ay maaaring magbago ng halaga R f hanggang 10%. Sa napiling sistema, ang mga analyte ay dapat magkaroon ng iba't ibang mga halaga R f at ipinamahagi sa buong haba ng chromatogram. Ito ay kanais-nais na ang mga halaga R f ay nasa hanay na 0.05-0.85.

Sa pagsasagawa, ang halaga R f kinakalkula bilang ratio ng distansya l dinadaanan ng substance hanggang sa malayo L dumaan sa solvent:

R f = l/L (6.1 )

Karaniwan para sa pagkalkula pumili spot center (Larawan 1). Magnitude R f depende sa maraming mga kadahilanan: uri papel ng chromatography (ang porosity nito, density, kapal, antas ng hydration) at sorbent (laki ng butil, likas na katangian ng mga pangkat sa ibabaw, kapal ng layer, halumigmig nito, likas na katangian ng sangkap, komposisyon ng mobile phase), mga pang-eksperimentong kondisyon (temperatura, oras ng chromatography, atbp.). Kung pare-pareho ang lahat ng chromatographic parameter, ang value R f tinutukoy lamang ng mga indibidwal na katangian ng bawat bahagi.

kanin. 1. Pagpapasiya ng mga halaga sa chromatogram Rf para sa mga bahagi A At SA,

antas ng kanilang paghihiwalay Rs at ang bilang ng mga teoretikal na plato N .

Ang kahusayan ng HD at TLC ay nakasalalay din sa selectivity at sensitivity mga reaksyong ginagamit upang makita ang mga bahagi ng pinag-aralan na pinaghalong. Karaniwan, ginagamit ang mga reagents na bumubuo ng mga may kulay na compound - mga developer - na tinutukoy ang mga bahagi. Para mas mapagkakatiwalaan pagkakakilanlan ng mga ibinahaging bahagi mag-apply" mga saksi » mga solusyon karaniwang mga sangkap (sa parehong solvent bilang sample), ang pagkakaroon nito ay inaasahan sa sample. Karaniwang sangkap inilapat sa panimulang linya sa tabi ng nasuri na sample at na-chromatograph sa ilalim ng parehong mga kundisyon. Sa pagsasagawa, ang isang kamag-anak na halaga ay kadalasang ginagamit:

R f rel = R f x / R f tumayo (6.2)

saan R f tumayo kinakalkula din gamit ang formula (6.1). Kahusayan chromatographic separation katangian bilang ng mga katumbas na teoretikal na plato at sila taas . Kaya, sa paraan ng TLC ang bilang ng mga katumbas na teoretikal na plato N A para sa sangkap A ang halo na ihihiwalay ay kinakalkula gamit ang formula:

N A = 16 (l O.A. / a (A )) 2 (6.3)

Mga halaga l O.A. At A (A ) tinutukoy tulad ng ipinapakita sa Fig. 6.1. Pagkatapos ang taas ng katumbas na teoretikal na plato N A ay:

H A = l O.A. /N = a (A ) 2 / 16 l O.A. . (6.4)

Ang paghihiwalay ay halos posible kung R f (A)  R f (SA)  0,1 .

Upang makilala ang paghihiwalay ng dalawang bahagi A At SA gamitin degree (criterion) ng paghihiwalay Rs :

Rs =  l/ (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l/ (a (A) + a (B)) (6.5)

saan  l  distansya sa pagitan ng mga sentro ng bahagi ng lugar A At SA;

A (A) At A (SA)  mga diameter ng spot A At SA sa chromatogram (Larawan 6.1). Ang higit pa Rs , mas malinaw na pinaghihiwalay ang mga bahagi ng bahagi A At SA sa chromatogram. Mga kundisyon kromatograpiya pinili upang ang halaga Rs naiiba mula sa zero at isa, ang pinakamainam na halaga Rs ay 0.3  0.7. Para sa rate separation selectivity dalawang sangkap A At SA gamitin salik ng paghihiwalay α :

α = l B / l A (6.6)

Kung α = 1, kung gayon ang mga bahagi A At SA ay hindi naghihiwalay.

9801 0

Ang HPLC ay isang liquid column chromatography kung saan maaaring gamitin ang iba't ibang mekanismo ng sorption. Sa esensya, ang HPLC ay isang modernong anyo ng classical liquid column chromatography. Ang ilan sa mga pinakamahalagang katangian ng kalidad ng HPLC ay nakalista sa ibaba:
- mataas na bilis ng proseso, na naging posible upang mabawasan ang tagal ng paghihiwalay mula sa ilang oras at araw hanggang minuto;
- minimal na antas ng pag-blur ng mga chromatographic zone, na ginagawang posible na paghiwalayin ang mga compound na bahagyang naiiba lamang sa mga constant ng sorption;
- isang mataas na antas ng mekanisasyon at automation ng paghihiwalay at pagproseso ng impormasyon, salamat sa kung saan ang column liquid chromatography ay umabot sa isang bagong antas ng reproducibility at katumpakan.

Ang masinsinang pananaliksik sa mga nakalipas na dekada at isang malaking halaga ng naipon na pang-eksperimentong data ay nagpapahintulot sa ngayon na pag-usapan ang tungkol sa pag-uuri ng mga variant sa loob ng balangkas ng high-performance na paraan ng liquid chromatography. Siyempre, ang pag-uuri ayon sa mekanismo ng sorption na ibinigay sa itaas ay nananatiling wasto.

Ang isang karaniwang pag-uuri ay batay sa comparative polarity ng mobile at stationary phase. Sa kasong ito, ang isang pagkakaiba ay ginawa sa pagitan ng normal at reverse phase chromatography.

Ang normal na phase chromatography (NPC) ay isang variant ng HPLC kapag ang mobile phase ay hindi gaanong polar kaysa sa nakatigil na phase, at may dahilan upang maniwala na ang pangunahing salik sa pagtukoy ng pagpapanatili ay ang pakikipag-ugnayan ng mga sorbate nang direkta sa ibabaw o dami ng sorbent.

Ang reversed phase chromatography (RPC) ay isang variant ng HPLC kung saan ang mobile phase ay mas polar kaysa sa stationary phase, at ang retention ay tinutukoy sa pamamagitan ng direktang kontak ng mga molekula ng sorbate sa ibabaw o dami ng sorbent; sa kasong ito, ang mga ionized sorbate ay hindi ipinagpapalit para sa mga mobile phase ions na na-sorbed sa ibabaw.

Ang chromatography ng pagpapalitan ng ion ay isang opsyon kung saan ang sorption ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagpapalit ng mga sorbed ions ng mobile phase para sa mga ions ng mga substance na kino-chromatograph; Ang ligand exchange chromatography ay maaaring tukuyin sa isang ganap na kahalintulad na paraan.

Ang Chromatography sa mga dynamic na binagong sorbent ay isang variant ng HPLC kung saan ang sorbate ay hindi direktang nakikipag-ugnayan sa ibabaw ng sorbent, ngunit pumapasok sa kaugnayan sa mga molekula ng mga layer sa ibabaw ng eluent.
Ang ion-pair chromatography ay isang variant ng reverse-phase chromatography ng mga ionized compound kung saan ang isang hydrophobic counterion ay idinaragdag sa mobile phase, na husay na nagbabago sa mga katangian ng sorption ng system.

Ang size exclusion chromatography ay isang paraan ng paghihiwalay ng mga compound sa pamamagitan ng kanilang mga molekular na timbang, batay sa pagkakaiba sa rate ng diffusion ng mga molekula na may iba't ibang laki sa mga pores ng nakatigil na yugto.

Para sa HPLC, ang isang napakahalagang katangian ay ang laki ng mga sorbents, karaniwang 3-5 microns, ngayon hanggang 1.8 microns. Nagbibigay-daan ito sa mga kumplikadong pinaghalong sangkap na mabilis at ganap na paghiwalayin (average na oras ng pagsusuri mula 3 hanggang 30 minuto).

Ang problema sa paghihiwalay ay nalulutas gamit ang isang chromatographic column, na isang tubo na puno ng sorbent. Kapag nagsasagawa ng pagsusuri, ang isang likido (eluent) ng isang tiyak na komposisyon ay pinapakain sa pamamagitan ng isang chromatographic column sa isang pare-parehong bilis. Ang isang tiyak na nasusukat na dosis ng sample ay ini-inject sa stream na ito. Ang mga bahagi ng isang sample na ipinasok sa isang chromatographic column, dahil sa kanilang magkakaibang affinity para sa column sorbent, ay gumagalaw kasama nito sa iba't ibang bilis at umabot sa detector nang sunud-sunod sa iba't ibang oras.

Kaya, ang chromatographic column ay responsable para sa selectivity at kahusayan ng paghihiwalay ng mga bahagi. Sa pamamagitan ng pagpili ng iba't ibang uri ng mga column, makokontrol ang antas ng paghihiwalay ng mga analyte. Natutukoy ang mga compound ayon sa oras ng kanilang pagpapanatili. Ang dami ng pagpapasiya ng bawat isa sa mga bahagi ay kinakalkula batay sa magnitude ng analytical signal na sinusukat gamit ang isang detektor na konektado sa output ng chromatographic column.

Mga sorbent. Ang pag-unlad ng HPLC ay higit na nauugnay sa paglikha ng mga bagong henerasyon ng mga sorbent na may magandang kinetic na katangian at magkakaibang mga thermodynamic na katangian. Ang pangunahing materyal para sa sorbents sa HPLC ay silica gel. Ito ay mekanikal na malakas at may makabuluhang porosity, na nagbibigay ng malaking kapasidad ng palitan na may maliliit na laki ng haligi. Ang pinakakaraniwang laki ng butil ay 5-10 microns. Ang mas malapit sa spherical na hugis ng mga particle, mas mababa ang flow resistance, mas mataas ang kahusayan, lalo na kung ang isang napakakitid na fraction ay na-screen out (halimbawa, 7 +1 microns).

Ang tiyak na ibabaw ng silica gel ay 10-600 m / g. Maaaring mabago ang silica gel gamit ang iba't ibang grupo ng kemikal na na-graft sa ibabaw (C-18, CN, NH2, SO3H), na nagpapahintulot sa paggamit ng mga sorbents batay dito upang paghiwalayin ang iba't ibang klase ng mga compound. Ang pangunahing kawalan ng silica gel ay ang mababang resistensya ng kemikal sa pH< 2 и рН >9 (natutunaw ang silica sa alkalis at acids). Samakatuwid, kasalukuyang may masinsinang paghahanap para sa mga sorbents batay sa mga polimer na matatag sa pH mula 1 hanggang 14, halimbawa, batay sa polymethyl methacrylate, polystyrene, atbp.

Sorbents para sa chromatography ng pagpapalitan ng ion. Dahil sa mga kakaibang katangian ng paghihiwalay (sa isang acidic o alkaline na kapaligiran), ang pangunahing materyal ay sorbent sa polystyrene na may divinylbenzene ng iba't ibang antas ng cross-linking sa SO3 -H+ (strongly acidic cation exchangers) o -COO-Naf (weakly acidic cation exchangers), -H2N+ (CH3) na mga pangkat na idinagdag sa kanilang ibabaw na 3Cl- (malakas na basic anion exchanger) o -N+HR2Cl- (mahina na basic anion exchanger).

Sorbents para sa gel permeation chromatography. Ang pangunahing uri ay styrene-DVB. Ginagamit din ang macroporous glasses, methyl methacrylate, at silica gel. Ang parehong mga sorbent ay ginagamit para sa chromatography ng pagbubukod ng ion.
Mga bomba. Upang matiyak ang daloy ng mobile phase (MP) sa pamamagitan ng column na may tinukoy na mga parameter, ginagamit ang mga high-pressure pump. Ang pinakamahalagang teknikal na katangian ng LC pumps ay kinabibilangan ng: flow range; maximum na presyon ng pagtatrabaho; muling paggawa ng daloy; hanay ng pulsation ng supply ng solvent.

Depende sa likas na katangian ng supply ng solvent, ang mga bomba ay maaaring maging pare-pareho ang supply (daloy) at pare-pareho ang presyon. Karaniwan, sa panahon ng analytical na gawain, ginagamit ang isang pare-parehong mode ng rate ng daloy, at kapag pinupunan ang mga haligi, ginagamit ang isang pare-parehong mode ng presyon. Batay sa kanilang prinsipyo sa pagpapatakbo, ang mga pump ay nahahati sa mga syringe pump at reciprocating plunger pump.

Mga bomba ng syringe. Ang mga bomba ng ganitong uri ay nailalarawan sa pamamagitan ng halos kumpletong kawalan ng mga pulsation sa daloy ng mobile phase sa panahon ng operasyon. Mga disadvantages ng pump: a) mataas na pagkonsumo ng oras at solvent para sa paghuhugas kapag pinapalitan ang solvent; b) suspensyon ng paghihiwalay habang pinupuno ang bomba; c) malalaking sukat at bigat habang tinitiyak ang mataas na daloy at presyon (kailangan ang isang malakas na makina at isang malaking puwersa ng piston na may malaking lugar).

Mga reciprocating plunger pump. Ang mga bomba ng ganitong uri ay nagbibigay ng patuloy na volumetric na supply ng mobile phase sa loob ng mahabang panahon. Maximum na operating pressure 300-500 atm, flow rate 0.01-10 ml/min. Ang reproducibility ng daloy ng volume ay 0.5%. Ang pangunahing kawalan ay ang solvent ay ibinibigay sa system sa anyo ng isang serye ng mga sunud-sunod na pulso, kaya may mga presyon at daloy ng mga pulsation.

Ito ang pangunahing dahilan para sa pagtaas ng ingay at pagbawas ng sensitivity ng halos lahat ng mga detektor na ginagamit sa LC, lalo na ang mga electrochemical. Mga paraan upang labanan ang mga pulsation: gamit ang double pump o isang double-plunger Bag-Lai pump, gamit ang mga damping device at electronic device.

Ang dami ng volumetric feed ay tinutukoy ng tatlong mga parameter: ang diameter ng plunger (karaniwang 3.13; 5.0; 7.0 mm), ang amplitude nito (12-18 mm) at dalas (na depende sa bilis ng pag-ikot ng motor at gearbox).

Mga dispenser. Ang layunin ng dispenser ay maglipat ng sample sa atmospheric pressure sa inlet ng isang column sa pressure na hanggang sa ilang atmospheres. Mahalaga na walang mga "patay" na volume sa dispenser na hindi maaaring hugasan ng mobile phase at walang pagguho ng sample sa panahon ng dosing. Sa una, ang mga dispenser ng LC ay katulad ng mga dispenser ng gas na may pagbutas ng lamad. Gayunpaman, ang mga lamad ay hindi makatiis ng higit sa 50-100 atm ang kanilang paglaban sa kemikal ay hindi sapat;

Ang likidong bahagi ay may mas mababang diffusion rate kaysa sa gas phase. Samakatuwid, maaari kang mag-dose sa pamamagitan ng paghinto ng daloy - ang sample ay walang oras upang masira sa dispenser. Habang ang sample ay ipinapasok sa dispenser, pinapatay ng isang espesyal na balbula ang daloy ng solvent. Ang presyon sa pumapasok sa haligi ay mabilis na bumababa pagkatapos ng ilang segundo, ang sample ay maaaring iturok sa silid ng dispenser na may isang maginoo na microsyringe. Susunod, naka-lock ang dispenser, naka-on ang daloy ng solvent, at nangyayari ang paghihiwalay.

Ang pressure na hawak ng gripo na ito ay hanggang 500-800 atm. Ngunit kapag huminto ang daloy, ang ekwilibriyo sa hanay ay nabalisa, na maaaring humantong sa paglitaw ng mga "bakanteng" karagdagang mga taluktok.

Ang mga loop dispenser ay ang pinakamalawak na ginagamit. Kapag napuno ang dispenser, ang mga inlet 1, 2 at ang channel sa pagitan ng mga ito ay nasa ilalim ng mataas na presyon. Ang mga input 3-6, ang mga channel sa pagitan ng mga ito at ang dosing loop ay nasa ilalim ng atmospheric pressure, na nagpapahintulot sa iyo na punan ang loop gamit ang isang syringe o pump. Kapag nakabukas ang dispenser, inilipat ng daloy ng mobile phase ang sample sa column. Upang mabawasan ang error, ang loop ay hugasan ng 5-10 beses ang dami ng sample. Kung maliit ang sample, maaari itong iturok sa loop gamit ang microsyringe. Ang dami ng loop ay karaniwang 5-50 µl.

SA. Voinov, T.G. Volova

(pangunahin ang intermolecular) sa interface ng phase. Bilang isang paraan ng pagsusuri, ang HPLC ay bahagi ng isang pangkat ng mga pamamaraan na, dahil sa pagiging kumplikado ng mga bagay na pinag-aaralan, kasama ang paunang paghihiwalay ng orihinal na kumplikadong pinaghalong sa medyo simple. Ang mga resultang simpleng mixtures ay pagkatapos ay sinusuri gamit ang conventional physicochemical method o mga espesyal na pamamaraan na binuo para sa chromatography.

Ang pamamaraan ng HPLC ay malawakang ginagamit sa mga larangan tulad ng kimika, petrochemistry, biology, biotechnology, gamot, industriya ng pagkain, proteksyon sa kapaligiran, produksyon ng parmasyutiko at marami pang iba.

Ayon sa mekanismo ng paghihiwalay ng nasuri o pinaghiwalay na mga sangkap, ang HPLC ay nahahati sa adsorption, pamamahagi, palitan ng ion, pagbubukod, palitan ng ligand at iba pa.

Dapat itong isipin na sa praktikal na gawain, ang paghihiwalay ay madalas na nangyayari hindi sa pamamagitan ng isa, ngunit sa pamamagitan ng ilang mga mekanismo nang sabay-sabay. Kaya, ang paghihiwalay ng pagbubukod ay maaaring kumplikado sa pamamagitan ng mga epekto ng adsorption, paghihiwalay ng adsorption sa pamamagitan ng mga epekto sa pamamahagi, at kabaliktaran. Bukod dito, mas malaki ang pagkakaiba sa pagitan ng mga sangkap sa isang sample sa mga tuntunin ng antas ng ionization, basicity o acidity, molekular na timbang, polarizability at iba pang mga parameter, mas malaki ang posibilidad ng ibang mekanismo ng paghihiwalay para sa mga naturang sangkap.

Normal na bahagi ng HPLC

Ang nakatigil na bahagi ay mas polar kaysa sa mobile phase, samakatuwid ang nonpolar solvent ay nangingibabaw sa eluent:

• Hexane:isopropanol = 95:5 (para sa mga low-polarity substance)
• Chloroform:methanol = 95:5 (para sa mga mid-polar substance)
• Chloroform:methanol = 80:20 (para sa mga highly polar substance)

Baliktad na bahagi ng HPLC

Ang nakatigil na bahagi ay hindi gaanong polar kaysa sa mobile phase, kaya ang eluent ay halos palaging naglalaman ng tubig. Sa kasong ito, palaging posible upang matiyak ang kumpletong paglusaw ng BAS sa mobile phase, halos palaging posible na gumamit ng UV detection, halos lahat ng mga mobile phase ay magkakahalo, ang gradient elution ay maaaring gamitin, ang column ay maaaring mabilis na muling -equilibrated, ang column ay maaaring muling buuin.

Ang mga karaniwang eluent para sa reverse phase HPLC ay:

• Acetonitrile: tubig
• Methanol: tubig
• Isopropanol: tubig

Mga matrice para sa HPLC

Gumagamit ang HPLC ng mga inorganic na compound bilang mga matrice, gaya ng silicon oxide (silica gel) o alumina, o mga organikong polymer, gaya ng polystyrene (cross-linked sa divinylbenzene) o polymethacrylate. Siyempre, ang silica gel ay tinatanggap na ngayon.

Mga pangunahing katangian ng matrix:

• Laki ng butil (µm);
• Laki ng panloob na butas (Å, nm).

Paghahanda ng silica gel para sa HPLC:

1. Paghubog ng polysilicic acid microspheres;
2. Pagpapatuyo ng mga particle ng silica gel;
3. Paghihiwalay ng hangin.

Sorbent particle:

• Regular (spherical): mas mataas na paglaban sa presyon, mas mataas na gastos;
• Non-spherical: mas mababang pressure resistance.

Ang laki ng butas sa HPLC ay isa sa pinakamahalagang parameter. Ang mas maliit ang laki ng butas, mas malala ang kanilang pagkamatagusin para sa mga molekula ng mga eluted substance. At samakatuwid, mas masahol pa ang kapasidad ng sorption ng mga sorbents. Kung mas malaki ang mga pores, mas kaunti, una, ang mekanikal na katatagan ng mga partikulo ng sorbent, at, pangalawa, mas maliit ang ibabaw ng sorption, samakatuwid, mas masahol pa ang kahusayan.

Nakatigil na yugto ng pagbabakuna

Normal na bahagi ng HPLC:

• Stationary phase na may propylnitrile grafting (nitrile);
• Stationary phase na may propylamine grafting (amine).

Baliktad na bahagi ng HPLC:

• Nakatigil na yugto na may alkyl grafting;
• Stationary phase na may alkylsilyl grafting.

Ang end-capping ay ang proteksyon ng hindi na-grafted na mga lugar ng sorbent sa pamamagitan ng karagdagang paghugpong na may "maliit" na mga molekula. Hydrophobic end-capping (C1, C2): mas mataas na selectivity, mas malala ang pagkabasa; hydrophilic end-capping (diol): mas mababang selectivity, mas mataas na pagkabasa.

Mga detektor para sa HPLC

• UV
• Diode matrix
• Fluorescent
• Electrochemical
• Refractometric
• Mass selective

Mga link

Wikimedia Foundation. 2010.

Tingnan kung ano ang "High Performance Liquid Chromatography" sa iba pang mga diksyunaryo:

mataas na pagganap ng likido chromatography- - [A.S. Goldberg. English-Russian energy dictionary. 2006] Mga Paksa: enerhiya sa pangkalahatan EN high performance liquid chromatography HPLC ... Gabay ng Teknikal na Tagasalin

Ang terminong high performance liquid chromatography Ang termino sa English high performance liquid chromatography Mga kasingkahulugan Mga pagdadaglat HPLC, HPLC Mga kaugnay na termino adsorption, oligopeptide, proteomics, sorbent, fullerene, endohedral, chromatography... ...

Liquid chromatography, kung saan, upang madagdagan ang kahusayan ng paghihiwalay, ang solvent (eluent) sa ilalim ng presyon (higit sa 3x107 Pa) ay pumped sa pamamagitan ng mga haligi na puno ng sorbent na may mga particle ng maliit na diameter (hanggang sa 1 μm), at perfusion filter ay din ginamit......

Isang uri ng chromatography kung saan ang likido (eluent) ay nagsisilbing mobile phase, at ang nakatigil. sorbent, TV isang carrier na may likido o gel na inilapat sa ibabaw nito. Isagawa sa isang column na puno ng sorbent (column chromatography) sa isang patag... ... Likas na agham. encyclopedic Dictionary

- [κρώμα (υrum) color] isang proseso batay sa hindi pantay na kakayahan ng mga indibidwal na bahagi ng pinaghalong (likido o gas) na manatili sa ibabaw ng adsorbent kapwa kapag sinisipsip ang mga ito mula sa daloy ng carrier at kapag ... ... Geological encyclopedia

- (mula sa ibang Griyego ... Wikipedia

Ang terminong chromatography Ang termino sa Ingles na chromatography Mga kasingkahulugan Mga Kaugnay na termino high performance liquid chromatography, clathrate, laboratoryo sa isang chip, porometry, proteome, proteomics, sorbent, enzyme, fullerene, endohedral... ... Encyclopedic Dictionary ng Nanotechnology

Liquid chromatography batay sa decomp. kakayahan ng mga pinaghiwalay na ion sa pagpapalitan ng ion na may nakapirming. nabuo ang mga sorbent ions bilang resulta ng paghihiwalay ng mga ionogenic group ng huli. Ang mga cation exchanger ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga cation, para sa... ... Ensiklopedya ng kemikal

HPLC- high performance na liquid chromatography... Diksyunaryo ng mga pagdadaglat ng Ruso

Ang high-performance liquid chromatography (HPLC) ay isa sa mga epektibong pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga kumplikadong pinaghalong sangkap, na malawakang ginagamit kapwa sa analytical chemistry at kemikal na teknolohiya. Ang batayan ng chromatographic separation ay ang partisipasyon ... Wikipedia

Mga libro

• Praktikal na High Performance Liquid Chromatography, Veronica R. Mayer. Ipinakita namin sa mambabasa ang ika-5 edisyon ng aklat, na pinalawak ng mga makabagong pamamaraan at kagamitan. Marami ang napabuti sa aklat at maraming mga sanggunian ang naidagdag. Yung mga lugar sa text kung saan...