Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам.

Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ:
ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4)
ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локализацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда является повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.

Энзимопатии наследственные (фенилкетонурия) и приобретенные (цинга). Применение ферментов для лечения болезней.

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке - энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из ниже перечисленных "сценариев". Рассмотрим условную схему метаболического пути:

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:

Нарушение образования конечных продуктов. Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:

Накопление субстратов-предшественников. При недостаточности фермента Е 3 будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента - ведущее звено развития многих заболеваний:

Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников. Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

А. Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;
• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

Изоферменты – это изофункциональные белки. Они катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по некоторым функциональным свойствам в силу отличий по:

Аминокислотному составу;

Электрофоретической подвижности;

Молекулярной массе;

Кинетике ферментативных реакций;

Способу регуляции;

Стабильности и др.

Изоферменты – это молекулярные формы фермента, различия в аминокислотном составе обусловлены генетическими факторами.

Примеры изоферментов: глюкокиназа и гексокиназа.

Гексокиназа может фосфорилировать любой шестичленный цикл, гексокиназа – только превращение глюкозы. После приёма пищи, богатой глюкозой, глюкокиназа начинает работать. Гексокиназа – стационарный фермент. Он катализирует реакцию расщепления глюкозы при низких её концентрациях, поступающих в организм. Отличаются по локализации (глюкокиназа – в печени, гексокиназа – в мышцах и печени), физиологическому значению, константе Михаэльса.

Если фермент – олигомерный белок, то изоформы могут получаться в результате различной комбинации протомеров. Например, лактатдегидрогеназа состоит из 4-х субъединиц. Н – субъединицы сердечного типа, М – мышечного. Может быть 5 комбинаций этих субъединиц, а, следовательно, и 5 изоферментов: НННН (ЛДГ 1 – в сердечной мышце), НННМ (ЛДГ 2), ННММ (ЛДГ 3), НМММ (ЛДГ 4), ММММ (ЛДГ 5 – в печени и мышцах). [рис. эти 4 буквы в кружочки.

Надо отличать изоферменты от множественных форм ферментов. Множественные формы ферментов – это ферменты, которые модифицированы после своего синтеза, например фосфорилаза A и B.

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Твитнуть

Все темы данного раздела:

Белки и их биологическая роль
Белок (протеины) – protos – предшествующий всему, первичный, наиглавнейший, определяющий всё остальное. Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, состо

Характеристика простых белков
В основе классификации (создана в 1908г.) лежит растворимость белков. По этому признаку выделяют: I. гистоныипротамины, растворимые в солевых растворах. О

Хромопротеины
Для них простетическая часть окрашена (chromos – краска). К хромопротеинам относятся гемоглобин, миоглобин, каталаза, пероксидаза, ряд флавинсодержащих ферментов (сукцинатдегидрогеназа, альдегидокс

Липид-белковые комплексы
Липид-белковые комплексы – сложные белки, простетическую часть которых составляют различные липидные компоненты. К таким компонентам относятся: 1. предельные и непредельные В

Нуклеопротеины
Нуклеопротеины – это сложные белки, содержащие в качестве небольшой части нуклеиновые кислоты (до 65%). НП состоят из 2-х частей: белковой (содержит гистоны и протамины, кото

Углевод-белковые комплексы
В качестве простетической группы выступают углеводы. Все углевод-белковые комплексы делятся на гликопротеины и протеогликаны. Гликопротеины (ГП)– комплекс белков с углеводными ко

Фосфопротеины
Белки, где в качестве простетической группы – фосфорная кислота. Присоединение фосфорной кислоты к полипептидной цепи идет с образованием сложноэфирной связи с АК СЕР или ТРЕ.

Строение коферментов
Коферменты в каталитических реакциях осуществляют транспорт различных групп атомов, электронов или протонов. Коферменты связываются с ферментами: - ковалентными связями; - ионными

Свойства ферментов
Общие черты ферментов и небиологических катализаторов: 1) и те, и другие катализируют только энергетически возможные реакции; 2) увеличивают скорость реакции; 3) н

Номенклатура ферментов
1) Существует тривиальная номенклатура – названия случайные, без системы и основания, например трипсин, пепсин, химотрипсин. 2) Рабочая номенклатура – название фермента составляется из наз

Современные представления о ферментативном катализе
Первая теория ферментативного катализа была выдвинута в начале 20 века Варбургом и Бейлисом. Эта теория предлагала считать, что фермент адсорбирует на себе субстрат, и называлась адсорбционной, но

Молекулярные эффекты действия ферментов
1) Эффект концентрирования – это адсорбирование на поверхности молекулы фермента молекул реагирующих веществ, т.е. субстрата, что приводит к их лучшему взаимодействию. Пр.: электростатическое притя

Теория кислотно-основного катализа
В составе активного центра фермента имеются как кислые, так и основные функциональные группы. В результате этого фермент проявляет в ходе катализа кислотно-основные свойства, т.е. играет как роль д

Регуляция активности ферментов
Ферменты являются регулируемыми катализаторами. В качестве регуляторов могут выступать метаболиты, яды. Различают: - активаторы – вещества, увеличивающие скорость реакции;

Переваривание и всасывание белков
Функции белков многообразны, но особенно выделяются структурная, каталитическая и энергетическая функции. Энергетическая ценность белка около 4,1 ккал/г. Среди всех веществ, поступающих в

Превращение белков в органах пищеварения
Все белки подвергаются действию гидролаз (третий класс ферментов), а именно пептидаз – они, как правило, вырабатываются в неактивной форме, а затем активируются путем частичного протеолиза.

Переваривание сложных белков и их катаболизм
1. Гликопротеины гидролизуются с помощью гликозидаз (амилолитических ферментов). 2. Липопротеины – с помощью липолитических ферментов. 3. Гемсодержащие хромопроте

Гниение белков и обезвреживание его продуктов
Гниение белков – это бактериальный распад белковых веществ и АК под действием микрофлоры кишечника. Идет в толстой кишке, однако может наблюдаться и в желудке – при снижении кислотнос

Метаболизм аминокислот
Фонд АК организма пополняется за счет процессов: 1) гидролиза белков пищи, 2) гидролиза тканевых белков (под действием катепсинов лизосом). Расходуется АК-фонд на процесс

Общие пути обмена веществ
1. Переаминирование (открыто в 1937 г. Браунштейном и Крицмом).

Временное обезвреживание аммиака
Аммиак токсичен (50 мг аммиака убивает кролика, при этом =0,4-0,7 мг/л). Поэтому в тканях аммиак обезвреживается временными путями: 1) в основном – образов

Орнитиновый цикл мочевинообразования
Мочевина содержит 80-90% всего азота мочи. В сутки образуется 25-30 г мочевины NH2-CO-NH2. 1. NH3 + CO

Синтез и распад нуклеотидов
Особенности обмена нуклеотидов: 1. Ни сами нуклеотиды, ни азотистые основания, поступающие с пищей, не включаются в синтез нуклеиновых кислот и нуклеотидов организма. Т.е., нуклеотиды пищи

Окисление пуриновых нуклеозидов
Аденозин® (аденозиндезаминаза, +Н2О, –NH4+) инозин® (пуриннуклеозидфосфорилаза, +Фн –рибозил-1-Ф) гипоксантин (6-оксопурин) ® (ксантинокси

Функционирование ДЦ
Субстрат·Н2 → НАД → ФМН → КоQ → 2b → 2c1→ 2c → 2a → 2a3 → O

Репликация (самоудвоение, биосинтез) ДНК
В 1953 г. Уотсон и Крик открыли принцип комплементарности (взаимодополняемости). Так, А=Т, а ГºЦ. Условия, необходимые для репликации: 1. стр

Транскрипция (передача информации с ДНК на РНК) или биосинтез РНК
При транскрипции, в отличие от репликации, информации передается с небольшого участка ДНК. Элементарной единицей транскрипции является оперон (транскриптон)- участок ДНК, подвергающийся тран

Регуляция биосинтеза белка
Клетки многоклеточного организма содержат одинаковый набор ДНК, но белки синтезируются разные. Например, соединительная ткань активно синтезирует коллаген, а в мышечных клетках такого белка нет. В

Механизмы развития раковой опухоли
Рак – генетическое заболевание, т.е. повреждение генов. Виды повреждений генов: 1) потеря гена, 2) собственно повреждение гена, 3) активация гена,

Переваривание липидов
Поступая с пищей, липиды в ротовой полости подвергаются только механической обработке. Липолитические ферменты в ротовой полости не образуются. Переваривание липидов будет происходить в тех отделах

Механизм ресинтеза жира
Ресинтез жира в стенке кишечника происходит следующим образом: 1. сначала продукты гидролиза (глицерин, ВЖК) активируются с использованием АТФ. Далее происходит последовательное ацилирован

Транспортные формы липидов в организме
Липиды являются нерастворимыми в воде соединениями, поэтому для их переноса кровью необходимы специальные переносчики, растворимые в воде. Такими транспортными формами являются липопротеины плазмы

Превращение липидов в тканях
В тканях постоянно идут процессы распада и синтеза липидов. Основную массу липидов организма человека составляют ТГ, которые в клетке имеются в виде включений. Период обновления ТГ в разных тканях

Биосинтез глицерина и ВЖК в тканях
Биосинтез глицерина в тканях тесно связан с метаболизмом глюкозы, которая в результате катаболизма проходит стадии образования триоз. Глицеральдегид–3–фосфат в цитоплазме по

Патология липидного обмена
На этапе поступления с пищей. Обильная жирная пища на фоне гиподинамии ведёт к развитию алиментарного ожирения. Нарушение обмена может быть связано с недостаточным поступлением жир

Ионы Са2+
Образуют соединение с белком - кальмодулин. Комплекс Са2+-кальмодулин активирует ферменты (аденилатциклазу, фосфодиэстеразу, Са2+-зависимую протеинкиназу). Есть группа

Гормоны паращитовидных желез
Парат-гормон, состоит из 84 АК, регулирует уровень Са2+, стимулирует выход кальция (и фосфора) из костей в кровь; Повышают реабсорбцию кальция в почках, но стимулируется выход фосфора; С

Роль витаминов в обмене веществ
1.(!) витамины – предшественники коферментов и простетических групп ферментов. Напр., В1 – тиамин – входит в состав кофермента декарбоксилаз кетокислот в виде ТПФ (ТДФ), В2 – рибофлавин –

Понятие о гиповитаминозах, авитаминозах и гипервитаминозах
Гиповитаминоз – патологическое состояние, связанное с недостатком витамина в организме. Авитаминоз – патологическое состояние, вызванное отсутствием витамина в организме.

Причины гиповитаминозов
1. Первичные: недостаток витамина в пище. 2. Вторичные: а) снижение аппетита; б) повышенный расход витаминов; в) нарушения всасывания и утилизации, напр., энтеро

Витамин А
Витамеры: А1 – ретинол и А2 – ретиналь. Клиническое название: антиксерофтальмический витамин. По химической природе: циклический непредельный одноатомный спирт на основе кольца b-

Витамин D
Антирахитический витамин. Существуют два витамера: D2 – эргокальциферол и D3 – холекальциферол. Витамин D2 содержится в грибах. Витамин D3 синтезируется в орг

Витамин Е
Устар.: антистерильный витамин, антиоксидантный энзим. В химическом плане это альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолы, но преобладающим является альфа-токоферол. Витамин Е устой

Витамин К
Антигеморрагический витамин. Витамеры: К1 – филлохинон и К2 – менахинон. Роль витамина К в обмене веществ Это кофактор карбоксилирования глутамино

Витамин С
Аскорбиновая кислота, антискорбутный витамин (скорбут = цинга). Является лактоном. Легко окисляется: О=С─┐ О=С─┐ | │ | │ НО-С

Витамин В1
Тиамин, антиневритный витамин. Тиамин устойчив в кислой среде (до 140ºС), а в щелочной среде бы

Витамин В2
Рибофлавин Устойчив в кислой среде, но разрушается в нейтральной и щелочной. Легко окисляется по дво

Витамин РР
Антипеллагрический витамин. Витамеры: никотиновая к-та, никотинамид, ниацин.

Витамин В6
Антидерматитный витамин. Пиридоксин → пиридоксаль → пиридоксамин [нарисовать формулы]

Витамин В12
Кобаламин. Антианемический витамин. Имеет красный цвет. На свету разлагается. Роль кобаламина в обмене веществ - транспорт метильных групп; - участвует в

Витамин В3
Пантотеновая кислота. [рис. формулы НОСН2-С((СН3)2)-СН(ОН)-СО-NH-СН2-СН2-СООН] Состоит из масляной кислоты с b-аланином.

Гидроксилирование ксенобиотиков с участием микросомальной монооксигеназной системы
1. бензола: [рис. бензол+ О2 +НАДФН2®(гидроксилаза, цитохром Р450) фенол + НАДФ+ Н2О] 2. индола: [рис. индол+ О2 +Н

Роль печени в пигментном обмене
Пигментный обмен представляет собой совокупность сложных взаимопревращений окрашенных веществ тканей и жидкостей организма человека. К пигментам относятся 4 группы веществ: 1. гем

Биосинтез гема
Биосинтез гема идет в большинстве тканей, за исключением эритроцитов, которые не имеют митохондрий. В организме человека гем синтезируется из глицина и сукцинил-КоА, образованного в результате мета

Распад гема
Большая часть гемхромагенных пигментов в организме человека образуется при распаде гема. Главным источником гема является гемоглобин. В эритроцитах содержание гемоглобина составляет 80%, время жизн

Патология пигментного обмена
Как правило, связана с нарушением процессов катаболизма гема и выражается гипербилирубинемией и проявляется в желтушечности кожи и видимых слизистых оболочек. Накапливаясь в ЦНС, билирубин вызывает

Типы изменения биохимического состава крови
I. Абсолютные и относительные. Абсолютные обусловлены нарушением синтеза, распада, выведения того или иного соединения. Относительные обусловлены изменением объема ц

Белковый состав крови
Функции белков крови: 1. поддерживают онкотическое давление (в основном за счет альбуминов); 2. определяют вязкость плазмы крови (в основном за счет альбуминов);

Общий белок
В норме общий белок крови 65-85 г/л. Общий белок – это сумма всех белковых веществ крови. Гипопротеинемия – снижение альбуминов. Причины:

Глобулины в норме 20-30 г/л
I. α1 -глобулины α-антитрипсин – ингибирует трипсин, пепсин, эластазу, некоторые другие протеазы крови. Выполняет антивоспалитель

Остаточный азот
Остаточный азот – это сумма азота всех небелковых азотсодержащих веществ крови. В норме 14-28 ммоль/л. 1. Метаболиты: 1.1. аминокислоты (25%); 1.2. креат

Углеводный обмен
Глюкоза в капиллярной крови натощак 3,3-5,5 ммоль/л. 1. Гипергликемия (повышение глюкозы): 1.1. панкреатическая гипергликемия – при отсутствии инсул

Липидный обмен
Холестерин в норме 3-5,2 ммоль/л. В плазме находится в составе ЛПНП, ЛПОНП (атерогенные фракции) и ЛПВП (антиатерогенная фракция). Вероятность развития атеросклероза

Минеральный обмен
Натрий – это основной внеклеточный ион. На уровень Na+ в крови влияют минералокортикоиды (альдостерон задерживает натрий в почках). Уровень натрия увеличивается за счет гем

Ферменты плазмы крови
Классифицируются: 1. Функционирующие ферменты (собственно плазменные). Напр., ренин (повышает АД через ангиотензин II), холинестераза (расщепляет ацетилхолин). Их активность выше в

Физические свойства мочи здорового человека, их изменения при патологии
I. Количество мочи в норме 1,2-1,5 л. Полиурия – увеличение количества мочи из-за: 1) увеличения фильтрации (под действием адреналина увеличивается фи

Показатели химического состава мочи
Общий азот – это совокупность азота всех азотсодержащих веществ в моче. В норме – 10-16 г/сутки. При патологиях общий азот может: ü увеличиваться – гиперазотурия

Особенности обмена веществ в нервной ткани
Энергетический обмен. В ткани головного мозга увеличено клеточное дыхание (преобладают аэробные процессы). Мозг потребляет большее количество кислорода, чем постоянно работающее сер

Химическая передача нервного возбуждения
Передача возбуждения с одной клетки на другую происходит с помощью нейромедиаторов: - нейропептидов; - АК; - ацетилхолина; - биогенных аминов (адреналин,

Варбург установил, что альдолазы дрожжей из различных животных тканей различаются по ряду св-в. Пепсин, трипсин, химотрипсин также различались по растворимости, рН, температурному оптимуму.

В конце пятидесятых годов биохимики Виланд и Пфлейдерер, а также другие исследователи выделяли из тканей животных чистые кристаллические препараты фермента лактатдегидрогеназы и подвергали их электрофорезу. В результате электрофореза фермент разделялся, как правило, на 5 фракций , имеющнх различную электрофоретическую подвижность. Все эти фракции обладали лактатдегидрогеназной активностью. Таким образом было установлено, что фермент лактатдегидрогеназа присутствует в тканях в виде нескольких форм. Эти формы в соответствии с их электрофоретпческой подвижностью получили обозначение ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3. ЛДГ4, ЛДГ5. (ЛДГ - сокращенное обозначекие лактатдегидрогеназы), причем номером 1 обозначают компонент с наибольшей элсктрофоретической подвижностью.

Исследования иэоферментов лактатдегидрогеназы, выделенных из разных органов животных, показали, что они различаются как по электрофоретическим и хроматографическим свойствам, так и по химическому составу, термостабильности, чувствительности к действию ингибитооров, К m и по другим свойствам. При анализах лактатдегидрогеназы разных видов животных выявлены очень большие межвидовые различия, однако в пределах данного вида распределение изоферментов характеризуется большим постоянством.

Лактатдегидрогеназа была первым ферментом, отдельные компоненты которого были подвергнуты детальзому изучению. Несколько позднее были получены данные о множественных формах и молекулярной неоднородности ряда других фермеатов, а в 1959 г. было предложено называть такие формы изоферментами или изоэнзимами. Комиссия по ферментам Международного биохимического союза официально рекомендовала этот термин для обозначевия мвожествеинь форм ферментов, того же биологического вида.

Итак , изоферменты - это группа ферментов из одного и того же источника, обладающих одним типом субстратной специфичности, катализирующих одну и ту же химическую реакцию, но различающихся по ряду физико-химических свойств .

Наличие множественных форм ферментов, или изоферментов, установлено более чем для 100 ферментов , выделеаных из различных видов животных, растений и микроорганизмов. Изоферменты не всегда состоят из двух или нескольких субъединиц. У ряда ферментов отдельные изофермсаты представляют собой разные по химическому строению белки, обладающие одной и той же каталитической активностью, но состоящие только из одной субъединицы.

Основным критерием для номенклатуры изоферментов в настоящее время принята их электрофоретическая подвижвость. Это объясняется, тем, что по сравнению с другими способами характеристики изферментов электрофорез дает наиболее высокую разрешающую способность.

К настоящему времени в результате изучения растительных изоферментов установлено, что многие ферменты присутствуют в растениях в виде множественных форм. Познакомимся с некоторыми из этих ферментов.

М а л а т д е г и д р о г е н а з а (1.1.1.37) имеет довольно сложвый изофермецтный состав. В семенах хлопчатника и листьях шпината обнаружено по 4 изофермента малатдегидрогеназы, различающихся по электрофоретической подвижности, причем молекулярная масса каждого из четырех изофермевтов шпината равнялась примерно 60 тыс. Разные растения содержат неодинаковое число изоферментов малатдегидрогеназы. Например, в семенах различных сорта к пшеницы обнаружено 7-10 изоферментов, в корнях кукурузы - 4-5, а в различных органах горе (корень, семядоли, подсемядольное и надсемядольное колено) обнаруживали 9-12 изофермевтов малатдегидрогеназы, причем число изоферментов изменялось в зависимости от фазы развития растений.

Отмечалась, что молекулярные массы изоферментоэ малатдегидрогеназы иногда существенно различались. Например, в листьях хлопчатника содержится 7 изоферментов малатдегидрогеназы, из которых 4 изофермеета являются изоформами, имеющими различный электрический заряд, но одинаковую молекулярную массу, равную примерно 60 тыс. Пятый изофермент имел молекулярную массу около 500 тыс. и был олигомером по крайней мере одной из изо форм малатдегидрогеназы с молекулярной массой 60 тыс. Так как в этих исследованиях молекулярные массы определяли приближенно, то можао полагать, что этот изофермент состоит из 8 субъединиц изофермента с молекулярной массой 60 тыс.

Устойчивость и восприимчивость растений к болезням часто связана с регуляцией синтеза изоферментов. В качестве ответной реакции на внедрение инфекции у растениий усилива интенсивность обмена вв., прежде всего окислительно-восставовительньных. Поэтому активность ОВ ферментов и число их изоферментов при поражении растений увеличиваются.

Повышевие активности и увеличение числа изоферментов пероксидазы и о-дифенолоксидазы наблюдаются при различных заболеваниях кукурузы фасоли, табака, клевера, картофелям льна, овса и других растении. На рисунке 22 схематически показано изменение числа изоферментов пероксидазы и их активности при поражении томатов фитофторой. Если в листьях здоровых растений содержалось четыре изофермента пероксидазы, то в пораженных листьях их число возрастало до девяти, причем активность всех изо ферментов значительно повышалась.

При изучении изменений в изоферментном составе пероксидазы п полифенолоксидазы митохондрий при вирусном патогенезе устойчивого и неустойчивого к вирусу табачной мозаики видов табака установлено, что вирусная инфекция вызывает качественно различные изменения изо ферментного состава разных по устойчивости видов табака. У устойчивого вида активность ряда изоферментов повышается в большей степени, чем у восприимчивого. Таким образом, в зависимости от потенциальной способности растения к биосинтезу зоферментов изменяется восприимчивость растения к инфекционным заболевакиям.

Глутаматдегидрогеназы

Эстеразы

Сахараза

Биологическая роль изоферментов в растениях.

ИФ свидетельствуют о большой лабильности ферментативного аппарата растений, дает возможность осуществлять необходимые процессы обмена вв. в клетке при изменении условий внешней среды, обеспечивает специфику обмена вв. для данного органа или ткани растений. Способствует приспособляемости растений к изменяющимся условиям вн. среды.

Одновременное присутствие в клетках множественных форм одного и того же фермента, наряду с другими механизмами регуляции, способствует согласованности процессов обмена вв. в клетке и быстрой адаптации растений к изменяющимся условиям среды.

В самом деле мы отмечали, что отдельные изоерменты различаются по температурным оптимумам, оптимумам рН, отношению к ингибиторам и другим свойствам. Отсюда следует, что если, например, резко изменяются температурные условия, которые становятся неблагоприятными для проявления каталитической активности некоторых изоферментов, то их активность подавляется. Однако данный фермеатативный процесс в растениях не прекращается полностью, так как начинают проявлять каталитическую активность другие изоферменты того же фермента, для которых данная температура является благоприятной. Если в силу каких-либо причин изменяется рН реакционной среды, то также ослабляется активность некоторых изоферментов, но вместо них начинают проявлять каталитическую активность изоферменты, имеющие иной оптимум рН. Высокие концентр ации солей подавляют активность многих ферментов, что является одной из причин ухудшения роста растений на засоленных почвах. Однако даже при высоких концентрациях солей в клетках ферментативные процессы не прекращаются полностью, так как отдельные изоферменты неодинаково относятся к повышению концентрации солей: активность одних изоферментов снижается, других повышается..

Устойчивость и восприимчивость к болезням часто основана на регуляции синтеза ИФ.

Биосинтез изоферментов определяется генетическими факторами и каждый вид растений характеризуется специфическим для данного вида набором изоферментов, т.е. проявляется видовая специфичность по изоферментному составу.

Разные органы одного растения различаются по ИФ.Изучение свойств изоферментов лактатдегидрогеназы, выделенных из различных тканей животных показало, что все изофермевты имеют приблизительно одинаковую молекулярную массу (около 140 тыс) вых условиях, например под действием обработки 42М мочевиной каждый из изоферментов диссоциирует на 4 субъедивицы с молекулярной массой около 35 тыс. Таким образом, каждый из пяти изоферментов лактатдегттдрогеназы представляет собой тетрамер. Установлено что все изоферменты лактатдегирогеназы представляют собой возможные комбинации всего лишь субъединиц двух типов, условно обозначаемых буквами А и В. Разные сочетания этих типов субъединиц образуют все пять изофермеатов лактатдегидрогеназы (рис. 18). Это показывает, что изоферменты лактатдегидрогеназы имеют строго упорядоченную структуру, причем отдельные субъединицы в молекуле этого белка-фермента соединевы водородными связями, которые могут быть разорваны под действием концентрированного раствора мочевивы.

Возникает вопрос, чем отличаются друг от друга отдельные субъединицы лактатдегидрогеаазы и с чем связава различная электрофоретическая подвижность отдельных из изоферментов? На этот вопрос сейчас получены довольно определенные ответы. Оказалось, что субъединицы А и В т- ц аминокислот. Субъединица В содержит большее количество кислых мелочных аминокислот по сравнению с субъединицей А. В связи с этим все изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ1 - ЛДГ2) различаются по количеству этих аминокислот, молекулы их имеют разную величину электрического заряда и разную электрофоретическую подвижность. Изоферменты лактатдегидрогеаазы различаются и по ряду других свойств, в частности константам Михаэлиса Км, отношению к ряду ингибиторов, термостабильности.

В основе многих патологических и предпатологических состояний организма лежат нарушения функционирования ферментных систем. Многие ферменты локализуются внутри клеток, а поэтому в сыворотке (плазме) крови их активность низка или вообще отсутствует. Именно поэтому анализируя внеклеточные жидкости (кровь), по активности определенных ферментов можно выявить изменения, происходящие внутри клеток различных органов и тканей организма. другие ферменты постоянно содержатся в крови, в известных количествах и имеют определенную функцию (например, ферменты системы свертывания крови).

Активность ферментов в сыворотке крови отражает сбалансированность скорости синтеза ферментов внутри клеток и выхода их из клеток. Увеличение активности ферментов крови может быть результатом ускорения процессов синтеза, понижения скорости выведения, повышения проницаемости клеточных мембран, действия активаторов, некроза клеток. Уменьшение активности ферментов вызывается повышением скорости выведения фермента, действием ингибиторов, угнетением синтеза.

Повышение активности в крови того или иного фермента является весьма ранним диагностическим тестом. Дополнительное определение изоферментного спектра позволяет уточнить локализацию патологического процесса, так как каждый орган имеет свой определенный изоферментный спектр.

В клинической биохимии большое значение имеет показатель активности аспарататаминотраисферазы и аланинаминотрансферазы. Эти трансаминазы содержатся в митохондриях и в растворимой фракции цитоплазмы клеток. Роль трансаминаз сводится к передаче аминогрупп аминокислот на кетокислоту. Коферментом трансаминаз служит пиридоксальфосфат, производное витамина В6. В крови животных активность обоих ферментов очень мала, по сравнению с их активностью в других тканях. Однако при патологиях, сопровождающихся деструкцией клеток, трансаминазы выходят через мембраны клеток в кровь, где их активность значительно увеличивается по сравнению с нормой. Несмотря на отсутствие строгой органной специфичности этих ферментов, повышение их активности наблюдают при гепатитах, мышечных дистрофиях, травмах, при чрезмерных физических нагрузках на организм, в частности, у спортивных лошадей.

Лактатдегидрогеназа(ЛдГ), гликолитический фермент, катализирующий обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную. ЛдГ состоит из четырех субъединиц и включает пять изоферментов. Причем в мышечной ткани преобладает изофермент ЛдГ5, в сердечной мышце ЛдГ1 и ЛдГ2. При остром инфаркте миокарда у больных в сыворотке крови повышается активность изоферментов ЛДГ1 и ЛдГ2. При паренхиматозном гепатите в сыворотке крови значительно возрастает активность изоферментов ЛдГ4 и ЛдГ5, тогда как активность ЛдГ1 и ЛдГ2 снижается.Активность ЛдГ в цельной крови существенно выше активности фермента в плазме крови. Поэтому даже минимальный гемолиз крови значительно изменяет активность фермента в плазме, что следует учитывать в лабораторной работе.

Креатинфосфокиназа(КФК), важную роль играет в энергетическом обмене. Креатинфосфокиназа необходима для ресинтеза АТФ за счет трансфосфорилирования АдФ с креатинфосфатом. Креатинфосфат относится к богатым энергией фосфатным соединениям,которые обеспечивают сокращение мышечного волокна, его расслабление, транспорт метаболитов в мышечную ткань.

Креатин-Ф + АдФ КФК > Креатин + АТФ.

Креатинфосфокиназа состоит из двух субъединиц - М и В, образующих три изофермента: ММ (мышечныий тип), МВ (сердечный тип), ВВ (мозговой тип).

Анализ тканей свидетельствует, что значительная активность КФК имеет место в скелетной мышце,миокарде, мозге. Сердечная мьшца содержит в основном изофермент ММ и МВ.Повышение активности изофермента МВ в сыворотке крови пациента свидетельствует о поражении сердечной мышцы. Определение изоферментов КФК является лучшим методом диагностики при наследственной мышечной дистрофии у цыплят, при недостатке селена у крупного рогатого скота, при паралитической миоглобинурии у лошадей.

Щелочная фосфатаза (ЩФ), - гидролитический фермент, синтезируемый в основном в печени выделяется из организма в составе желчи. Его оптимум активности находится при рН = 8-9. Это неспецифический фермент, катализирующий гидролиз многих фосфорных эфиров и присутствующий в плазме в форме изоферментов. Основной источник щелочной фосфатазы у молодых растущих животных - костная ткань. Активность щелочной фосфатазы значительно повышается при болезнях печени и костей, в частности, при остеомаляциях. Основная роль щелочной фосфатазы, вероятно, связана с отложением фосфатов кальция в костной ткани. Установлено повышение активности щелочной фосфатазы сыворотки крови при новообразованиях кости.

Холинэстераза - фермент, участвующий в процессе передачи нервного импульса, гидролизу ацетилхолин на ацетат и холин. Холинэстераза сыворотки крови включает два вида холинэстераз организма, основной субстрат которых - ацетилхолин. Ацетилхолинэстераза (АХЭ), гидролизирующая ацетилхолин в синапсах, называется истинной. Она присутствует в печени, эритроцитах и лишь малое ее количество локализовано в плазме. Холинэстераза плазмы крови является псевдохолинэстеразой, она гидролизует бутирилхолин в 4 раза быстрее, чем ацетилхолин. Этот фермент находится также в печени, поджелудочной железе, слизистой оболочке кишечника. Синтез АХЭ сыворотки крови происходит в печени, а поэтому при патологии этого органа наблюдается снижение активности фермента.

Необратимыми ингибиторами АХЭ являются токсические фосфорорганические соединения (ФОС). Так,ФОС инсектициды (хлорофос, фосфамид, карбофос, октаметил) избирательно связывают активные центры молекулы АХЭ и тем самым блокируют ее активность. Вследствие высокой липотропности ФОС способны проникать в организм животного через неповрежденную кожу и слизистые оболочки. При отравлении ФОС отмечают беспокойство животного, чувство страха, возбуждение, судороги, которые развиваются на фоне приступов удушья и кашля из-за спазма бронхов. Характерными при этом являются изменения со стороны глаз: резко суживается зрачок, начинается слезотечение, нарушается аккомодация. Чаще всего непосредственной причиной гибели животного, отравленного ФОС является паралич дыхательного центра.

Амилаза продуцируется слюнными железами и в больших количествах поджелудочной железой. Амилаза обладает специфическим действием на с-1,4-глюкозидные связи полисахаридов. Повышение активности амилазы сыворотки крови свидетельствует о развитии острого панкреатита. Умеренное повышение активности фермента отмечается при воспалении слюнных желез.

Когда мы говорим «малатдегидрогеназа» или «глюкозо-6-фосфатаза», то обычно имеем в виду конкретный белок, обладающий форментативной активностью, однако в действительности эти наименования охватывают все белки, катализирующие окисление малата в оксалоацетат или гидролиз глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы и . В частности, после выделения малатдегидрогеназы из различных источников (печени крысы, Е. coli) обнаружилось, что ферменты из печени и фермент из Е. coli, катализирующие одну и ту же реакцию, различаются во многих отношениях по своим физическим и химическим свойствам. Физически различимые формы ферментов, обладающие одним и тем же видом каталитической активности, могут присутствовать в разных тканях одного организма, в разных типах клеток одной ткани и даже в прокариотическом организме, например в Е. coli. Это открытие было сделано благодаря применению электрофоретических методов разделения белков, в результате чего были обнаружены электрофоретически разные формы определенной ферментативной активности.

Термин «изофермент» («изозим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изозимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах. При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфос-форилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам.

Диагностическое значение изозимов

Медицинский интерес к изозимам возник после того, как было обнаружено, что сыворотка человека содержит несколько изозимов лактатдегидрогеназы и что их относительное содержание значительно изменяется при определенных патологических состояниях. Впоследствии было выявлено много других случаев изменения относительного содержания изозимов при разных заболеваниях.

Изозимы сывороточной лактатдегидрогеназы обнаруживаются после электрофореза при на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При указанном значении изозимы несут разный заряд и распределяются на электрофореграмме в пяти разных местах. Далее изозимы можно обнаружить благодаря их способности катализировать восстановление бесцветных красителей в нерастворимую окрашенную форму.

Типичный набор реагентов для обнаружения изозимов дегидрогеназы включает:

1) восстановленный субстрат (например, лактат);

2) кофермент ;

3) краситель в окисленной форме (например, голубая нитротетразолиевая соль);

4) переносчик электронов от NADH к красителю [например, феназинметасульфат (ФМС)];

5) буфер; активирующие ионы (если требуются).

Лактатдегидрогеназа катализирует перенос двух электронов и одного иона от лактата к

Рис. 7.8. Реакция, катализируемая -лактатдегидрогеназой.

(рис. 7.8). Если электрофореграмму опрыскать приведенной выше смесью и затем инкубировать при то реакция сопряженного переноса электронов будет протекать только в тех местах, где присутствует лактатдегидрогеназы (рис. 7.9). Относительную плотность окраски полос можно далее оценить количественно с помощью сканирующего фотометра (рис. 7.10). Изозим с наибольшим отрицательным зарядом обозначают .

Физическая природа изозимов

Олигомерные ферменты, образованные разными протомерами, могут быть представлены несколькими формами. Часто определенная ткань продуцирует преимущественно один из протомеров. Если активный олигомерный фермент (например, тетрамер) может быть построен из таких протомеров в различных комбинациях, то образуются изозимы.

Изозимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол. массой около 34000). Каталитической активностью обладает только тетрамерная молекула.

Рис. 7.9. Локализация лактатдегидрогеназы на электрофореграммс с использованием системы сопряженных реакций.

Если порядок соединения протомеров не имеет значения, то протомеры могут быть скомпонованы пятью способами:

Маркерт подобрал условия для разрушения и реконструкции четвертичной структуры и сумел выяснить взаимоотношения между изозимами лактатдегидрогеназы. Расщепление и реконструкция лактат-дегидрогеназ I, и 15 не приводят к образованию новых изозимов. Следовательно, эти два изозима содержат только один тип протомеров. Когда такой же процедуре была подвергнута смесь лактатдегидрогеназ 1, и 15, появились также формы 12, 13 и 14. Соотношение изозимов соответствует приведенному ниже субъединичному составу:

Синтез Н- и М-субъединиц детерминируется разными генетическими локусами, и они по-разному экспрессируются в разных тканях (например, в сердечной и скелетной мышцах).