សមាសធាតុគីមីនៃភ្នាស។ Membranes ត្រូវបានផ្សំឡើងដោយ lipid និងម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន បរិមាណដែលទាក់ទងគ្នាយ៉ាងទូលំទូលាយក្នុងចំណោមភ្នាសផ្សេងៗគ្នា។ កាបូអ៊ីដ្រាតមាននៅក្នុងទម្រង់នៃ glycoproteins, glycolipids និងបង្កើតបាន 0.5% -10% នៃសារធាតុភ្នាស។ នេះបើយោងតាមវត្ថុរាវ mosaic

ភ្នាសរំអិល។ Membrane lipids គឺជាម៉ូលេគុល amphiphilic, i.e. ម៉ូលេគុលមានទាំងក្រុម hydrophilic (ក្បាលប៉ូល) និងរ៉ាឌីកាល់ aliphatic (កន្ទុយ hydrophobic) ដែលបង្កើតដោយឯកឯងនូវស្រទាប់ bilayer ដែលកន្ទុយនៃ lipids ប្រឈមមុខគ្នាទៅវិញទៅមក។ កម្រាស់

ប្រូតេអ៊ីន តម្លៃអាហារូបត្ថម្ភនៃប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានធានាដោយវត្តមាននៃអាស៊ីតអាមីណូសំខាន់ៗ គ្រោងឆ្អឹងអ៊ីដ្រូកាបូនដែលមិនអាចសំយោគនៅក្នុងខ្លួនមនុស្សបាន ហើយតាមនោះពួកគេត្រូវតែត្រូវបានផ្គត់ផ្គង់ជាមួយអាហារ។ ពួកគេក៏ជាប្រភពសំខាន់នៃអាសូតផងដែរ។ ប្រាក់ឧបត្ថម្ភ​ប្រចាំថ្ងៃ

ប្រូតេអ៊ីនជាលិកាសាច់ដុំ មានប្រូតេអ៊ីនបីក្រុម៖ ១. ប្រូតេអ៊ីន myofibrillar - 45%; ប្រូតេអ៊ីន sarcoplasmic - 35%; ប្រូតេអ៊ីន stromal - ប្រូតេអ៊ីន Myofibrillar 20% ។ មីអូស៊ីន; សកម្មភាព; 3. actomyosin ក៏ដូចជាអ្វីដែលគេហៅថាប្រូតេអ៊ីននិយតកម្ម: 4. tropomyosin; 5.

ចំណាត់ថ្នាក់

ប្រូតេអ៊ីន Membrane អាចត្រូវបានចាត់ថ្នាក់តាមគោលការណ៍ topological ឬជីវគីមី។ ការចាត់ថ្នាក់ Topological គឺផ្អែកលើការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនទាក់ទងទៅនឹងស្រទាប់ខ្លាញ់ lipid ។ ការចាត់ថ្នាក់ជីវគីមីគឺផ្អែកលើកម្លាំងនៃអន្តរកម្មនៃប្រូតេអ៊ីនជាមួយភ្នាស។

ប្រភេទផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន polytopic ។ ការ​ចង​ភ្នាស​ដោយសារ (1) transmembrane alpha helix តែមួយ, (2) multiple transmembrane alpha helices, (3) a beta-sheet structure.

ប្រភេទផ្សេងៗគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន monotopic អាំងតេក្រាល ការភ្ជាប់ទៅនឹងភ្នាសដោយសារតែ (1) amphipathic alpha-helix ស្របទៅនឹងយន្តហោះនៃភ្នាស, (2) រង្វិលជុំ hydrophobic, (3) សំណល់អាស៊ីតខ្លាញ់ដែលភ្ជាប់ជាមួយ covalently, (4) អន្តរកម្មអេឡិចត្រូស្ទិច (ដោយផ្ទាល់ឬដោយកាល់ស្យូមសម្របសម្រួល។ )

ចំណាត់ថ្នាក់ Topological

ទាក់ទងទៅនឹងភ្នាសប្រូតេអ៊ីនភ្នាសត្រូវបានបែងចែកទៅជា poly- និង monotopic ។

• Polytopic ឬ transmembrane ប្រូតេអ៊ីនជ្រាបចូលទៅក្នុងភ្នាសទាំងស្រុង ហើយធ្វើអន្តរកម្មជាមួយភាគីទាំងពីរនៃ lipid bilayer ។ ជាធម្មតា បំណែក transmembrane នៃប្រូតេអ៊ីនគឺជា helix អាល់ហ្វាដែលមានអាស៊ីតអាមីណូ hydrophobic (អាចពី 1 ទៅ 20 បំណែកបែបនេះ) ។ មានតែនៅក្នុងបាក់តេរី ក៏ដូចជានៅក្នុង mitochondria និង chloroplasts បំណែក transmembrane អាចត្រូវបានរៀបចំជារចនាសម្ព័ន្ធសន្លឹកបេតា (ពី 8 ទៅ 22 វេននៃខ្សែសង្វាក់ polypeptide) ។
• ប្រូតេអ៊ីន monotopic អាំងតេក្រាល។បានបង្កប់ជាអចិន្ត្រៃយ៍នៅក្នុងស្រទាប់ខ្លាញ់ ប៉ុន្តែបានភ្ជាប់ទៅភ្នាសនៅម្ខាង ដោយមិនជ្រាបចូលផ្នែកម្ខាងទៀត។

ចំណាត់ថ្នាក់ជីវគីមី

យោងតាមការបែងចែកជីវគីមីប្រូតេអ៊ីនភ្នាសត្រូវបានបែងចែកទៅជា អាំងតេក្រាលនិង គ្រឿងកុំព្យូទ័រ.

• ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាល។បានបង្កប់យ៉ាងរឹងមាំនៅក្នុងភ្នាស ហើយអាចត្រូវបានយកចេញពីបរិយាកាស lipid បានតែដោយមានជំនួយពី detergents ឬសារធាតុរំលាយដែលមិនមែនជាប៉ូល។ ទាក់ទងទៅនឹង lipid bilayer ប្រូតេអ៊ីនអាំងតេក្រាលអាចជា transmembrane polytopic ឬអាំងតេក្រាល monotopic ។
• ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសគ្រឿងកុំព្យូទ័រគឺជាប្រូតេអ៊ីន monotopic ។ ពួកវាត្រូវបានចងយ៉ាងទន់ខ្សោយទៅនឹងភ្នាស lipid ឬភ្ជាប់ជាមួយប្រូតេអ៊ីនអាំងតេក្រាលដោយសារតែ hydrophobic, electrostatic ឬកម្លាំងមិនមែន covalent ផ្សេងទៀត។ ដូច្នេះ មិនដូចប្រូតេអ៊ីនអាំងតេក្រាលទេ ពួកវាបំបែកចេញពីភ្នាសនៅពេលព្យាបាលជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ aqueous សមស្រប (ឧទាហរណ៍ pH ទាប ឬខ្ពស់ កំហាប់អំបិលខ្ពស់ ឬភ្នាក់ងារ chaotropic)។ ការបំបែកនេះមិនតម្រូវឱ្យមានការរំខានភ្នាសទេ។

ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាចត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងភ្នាសដោយសារតែអាស៊ីតខ្លាញ់ឬសំណល់ prenyl ឬ glycosylphosphatidylinositol ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនក្នុងអំឡុងពេលនៃការកែប្រែក្រោយការបកប្រែរបស់ពួកគេ។

តំណភ្ជាប់

មូលនិធិវិគីមេឌា។ ឆ្នាំ ២០១០។

៖ លក្ខណៈ និងគោលការណ៍រចនាសម្ព័ន្ធ

1. រចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស

តួនាទីសំខាន់នៃ lipids នៅក្នុងភ្នាសគឺធ្វើឱ្យរចនាសម្ព័ន្ធ bilayer មានស្ថេរភាព ហើយប្រូតេអ៊ីនគឺជាសមាសធាតុសកម្មនៃ biomembranes ។ យើងនឹងពិភាក្សាអំពីគោលការណ៍មួយចំនួនដែលបង្ហាញថាមានប្រយោជន៍ក្នុងការបកស្រាយអំពីលក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ យើងនឹងផ្តល់ឧទាហរណ៍ដើម្បីបង្ហាញពីគោលការណ៍ទាំងនេះ។

នៅពេលព្រឹកព្រលឹមនៃការអភិវឌ្ឍនៃ membranology វាត្រូវបានគេជឿថាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសមានភាពដូចគ្នានៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធរបស់វាហើយដាក់ក្នុងទម្រង់ជា 3 ស្រទាប់នៅលើផ្ទៃនៃ bilayer ។ ឥឡូវនេះយើងមានទំនោរក្នុងការជឿថា យ៉ាងហោចណាស់សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន transmembrane ផ្នែកទាំងនោះដែលត្រូវបានជ្រមុជនៅក្នុងភ្នាសមានផ្ទុក α-helices ។ ជាការពិតណាស់ ខ្ញុំចង់ទាញការសន្និដ្ឋានដែលមិនច្បាស់លាស់មួយចំនួនលើបញ្ហានេះ ប៉ុន្តែពួកគេត្រូវតែផ្អែកលើទិន្នន័យជាក់ស្តែង។ នៅចំពោះមុខភាពចម្រុះនៃរចនាសម្ព័ន្ធដ៏ធំសម្បើមនៃប្រូតេអ៊ីនរលាយ មនុស្សម្នាក់ឈានដល់ការសន្និដ្ឋានថាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលអាចស្មុគស្មាញជាងអ្វីដែលយើងស្រមៃនាពេលបច្ចុប្បន្ន។ ការចាត់ថ្នាក់នៃប្រូតេអ៊ីនរលាយតាមប្រភេទនៃរចនាសម្ព័ន្ធត្រូវបានអនុវត្តតែបន្ទាប់ពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនច្រើនជាង 100 ផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានកំណត់ក្នុងកម្រិតច្បាស់ខ្ពស់។ ចំពោះប្រូតេអ៊ីន transmembrane នេះត្រូវបានធ្វើតែនៅក្នុងករណីមួយប៉ុណ្ណោះ - សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននៃមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មរស្មីសំយោគនៃបាក់តេរី។ រួមជាមួយនឹងទិន្នន័យមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងដែលមានគុណភាពបង្ហាញទាបលើរចនាសម្ព័ន្ធរបស់ bacteriorhodopsin នេះគឺជាប្រភពតែមួយគត់ដែលគំរូសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន transmembrane ផ្សេងទៀតភាគច្រើនអាចត្រូវបានផ្អែកលើ។

ចំណុចសំខាន់មួយទៀតគឺវិធីសាស្រ្តនៃការភ្ជាប់ប្រូតេអ៊ីនទៅនឹងភ្នាស។ ពួកវាត្រូវបានបង្ហាញតាមគ្រោងការណ៍នៅក្នុងរូបភព។ ៣.១.

1. ការចងជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលជ្រមុជនៅក្នុង bilayer ។ ឧទាហរណ៍រួមមានផ្នែក Fi នៃ H + -ATPase ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងផ្នែក Fo ដែលបានបង្កប់នៅក្នុងភ្នាស។ ប្រូតេអ៊ីន cytoskeletal មួយចំនួនអាចត្រូវបានលើកឡើងផងដែរ។

2. ការចងទៅនឹងផ្ទៃ bilayer ។ អន្តរកម្មនេះ​ជា​ចម្បង​អេឡិច​ត្រូនិក ឬ​អ៊ីដ្រូហ្វីក​ក្នុង​ធម្មជាតិ។ នៅលើផ្ទៃនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសមួយចំនួនមានដែន hydrophobic ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយសារតែលក្ខណៈពិសេសនៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំឬទីបី។ អន្តរកម្មលើផ្ទៃទាំងនេះអាចត្រូវបានប្រើបន្ថែមពីលើអន្តរកម្មផ្សេងទៀតដូចជា យុថ្កា transmembrane ។

3. ការចងដោយប្រើ "យុថ្កា" hydrophobic; រចនាសម្ព័ន្ធនេះជាធម្មតាត្រូវបានបង្ហាញជាលំដាប់នៃសំណល់អាស៊ីតអាមីណូដែលមិនមានប៉ូឡា។ ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសខ្លះប្រើអាស៊ីតខ្លាញ់ ឬ phospholipids ដែលត្រូវបានចងភ្ជាប់ជាយុថ្កា។

4. ប្រូតេអ៊ីន transmembrane ។ ពួកគេខ្លះឆ្លងកាត់ភ្នាសតែមួយដងហើយខ្លះទៀតច្រើនដង។

ភាពខុសគ្នារវាងប្រូតេអ៊ីនភ្នាសខាងក្រៅនិងខាងក្នុងមិនកំណត់វិធីសាស្រ្តនៃការភ្ជាប់របស់ពួកគេទៅនឹង bilayer នេះ; ភាពខុសគ្នាទាំងនេះកំណត់តែកម្លាំងដែលទាក់ទងនៃការចងរបស់ពួកគេ។

2. ការបន្សុតនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស

ដើម្បីបន្សុទ្ធប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាល និងទទួលបានពួកវាក្នុងទម្រង់សកម្មជីវគីមី សារធាតុសាប៊ូត្រូវបានទាមទារដើម្បីរំលាយប្រូតេអ៊ីន និងរក្សាវានៅក្នុងដំណោះស្រាយ។ តម្រូវការសាប៊ូកក់សក់ដែលពាក់ព័ន្ធ និងការដោះស្រាយបង្កបញ្ហាប្រឈមបន្ថែមលើសពីអ្វីដែលជាធម្មតាជួបប្រទះនៅក្នុងការបន្សុតប្រូតេអ៊ីន។ វិធីសាស្រ្តជាក់លាក់ជាច្រើនត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រាប់ភាពឯកោនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាល ប៉ុន្តែគ្រោងការណ៍នៃការបន្សុតភាគច្រើនគឺផ្អែកលើបច្ចេកទេស chromatographic និង hydrodynamic ដូចគ្នាដែលប្រើសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនរលាយ។ នេះគឺជាក្រូម៉ូសូមនៅលើ DEAE-cellulose, Sepharose ឬ hydroxyl-patite, gel filtration, centrifugation in a sucrose density gradient, etc. ជម្រើសត្រឹមត្រូវនៃ detergent គឺមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់ ព្រោះវាជា detergent ដែលបំផ្លាញ biomembrane ជំនួស lipid ។ ជុំវិញប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់មួយ និងកំណត់ស្ថេរភាពនៃប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងដំណោះស្រាយ។ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់សាប៊ូបោកខោអាវត្រូវបានពិភាក្សានៅក្នុងការពិនិត្យឡើងវិញ។

2.1. ម្សៅសាប៊ូ

ក្នុងរយៈពេលពីរទស្សវត្សកន្លងមកនេះ សារធាតុសាប៊ូមួយចំនួនធំដែលសមរម្យសម្រាប់ការបន្សុតនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលបានក្លាយជាមាន។ ជាគោលការណ៍ គេគួរតែព្យាយាមស្វែងរកសារធាតុសាប៊ូដែលនឹងមិនរំខានដល់រចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ និងទីបីនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស ប៉ុន្តែគ្រាន់តែជំនួសភ្នាសភ្នាសភាគច្រើន ឬទាំងអស់ដែលមានទំនាក់ទំនងជាមួយតំបន់ hydrophobic នៃម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន។ គោលដៅចុងក្រោយនៃការរលាយគឺដើម្បីបញ្ចូលប្រូតេអ៊ីនទៅក្នុង micelle detergent; យុទ្ធសាស្ត្របន្សុតជាបន្តបន្ទាប់គឺដើម្បីបំបែកសារធាតុប្រូតេអ៊ីន-សាប៊ូកក់សក់។

បញ្ហាទីមួយគឺការជ្រើសរើសលក្ខខណ្ឌដ៏ល្អប្រសើរសម្រាប់ការរំលាយប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សា។ សាប៊ូដុសខ្លួនដែលមានជាតិប្រូតេអ៊ីនមិនស័ក្តិសមសម្រាប់កិច្ចការដ៏ឆ្ងាញ់នេះទេ។ ម្យ៉ាងវិញទៀត សារធាតុសាប៊ូជាច្រើនមិនមានប្រសិទ្ធភាពរំខានដល់ភ្នាស និងបង្កើតជាមីសែលចម្រុះដែលមានជាតិប្រូតេអ៊ីននោះទេ។ សាប៊ូបោកខោអាវបែបនេះអាចមានលក្ខណៈ hydrophobic ឬ hydrophilic ពេកក្នុងការលាយបញ្ចូលគ្នាប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពជាមួយនឹងភ្នាសរំអិល ហើយប្រសិនបើកំហាប់របស់វាខ្ពស់គ្រប់គ្រាន់ ដើម្បីបំប្លែង bilayer ទៅជា micelles ចម្រុះរាងមូល។ ដំបូងឡើយ គេសង្ឃឹមថាជម្រើសនៃសារធាតុសាប៊ូដែលត្រូវការអាចត្រូវបានរៀបចំជាប្រព័ន្ធដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រតែមួយហៅថាតុល្យភាព hydrophilic-lipophilic ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្រនេះប្រែប្រួលពី 1 ដល់ 20 ត្រូវបានប្រើក្នុងការរៀបចំសារធាតុ surfactants ជារង្វាស់នៃ hydrophobicity ដែលទាក់ទង។ ជាការពិត ការជាប់ទាក់ទងគ្នាមួយចំនួនត្រូវបានទទួល ដែលវាកើតឡើងថាតម្លៃ HLB នៃសារធាតុសាប៊ូអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីទស្សន៍ទាយឥរិយាបថរបស់វានៅក្នុងប្រព័ន្ធជីវសាស្ត្រ។ និយាយជាទូទៅ ម្សៅសាប៊ូដែលមានតម្លៃ HLB ក្នុងចន្លោះពី 12.5 ទៅ 14.5 អាចនិយាយបានថាជាសារធាតុរំលាយដ៏មានប្រសិទ្ធភាពបំផុតសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាល។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ក្រោយមកវាកាន់តែច្បាស់ថាការស្វែងរកសារធាតុសាប៊ូដែលល្អបំផុតសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសជាក់លាក់មួយតម្រូវឱ្យគិតគូរពីកត្តាជាច្រើន ហើយគួរតែត្រូវបានអមដោយការធ្វើតេស្តជាក់ស្តែងជានិច្ច។ ខាងក្រោមនេះត្រូវតែយកមកពិចារណា។

1.ការរលាយអតិបរមានៃប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សា។ លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យគឺការផ្ទេរប្រូតេអ៊ីនទៅ supernatant បន្ទាប់ពីការ centrifugation ក្នុងអំឡុងពេលដែល sediments ភ្នាស។

2.Solubilization នៃប្រូតេអ៊ីនក្នុងទម្រង់ដែលចង់បាន។ ជាធម្មតាយើងកំពុងនិយាយអំពីការរក្សាសកម្មភាពអង់ស៊ីមរបស់វា ប៉ុន្តែជួនកាលលក្ខណៈវិសាលគមជាក់លាក់ ឬវត្តមានរបស់ភ្នាក់ងារប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់ត្រូវបានប្រើប្រាស់។ លើសពីនេះទៀតស្ថេរភាពប្រូតេអ៊ីនបន្ទាប់ពីការរលាយគឺជាតម្រូវការជាមុន។ ក្នុងករណីខ្លះ phospholipids exogenous ត្រូវបានបន្ថែមជាមួយ detergent ដើម្បីរក្សាសកម្មភាពជីវគីមី។ ឧទាហរណ៍មួយគឺការផលិត E. coli lactose permease និងប្រូតេអ៊ីនឆានែលសូដ្យូម។ ជួនកាល glycerol ឬ polyol ផ្សេងទៀតត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីធ្វើឱ្យប្រូតេអ៊ីនមានស្ថេរភាពបន្ទាប់ពីការរលាយ។ វាសមហេតុផលក្នុងការប្រើសារធាតុទប់ស្កាត់ protease និងអនុវត្តការរលាយនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដែលកាត់បន្ថយលទ្ធភាពនៃការរិចរិល proteolytic របស់ពួកគេ។

3. លទ្ធភាពនៃការប្រើប្រាស់ detergent នៅក្នុងបច្ចេកទេសនេះ។ ជាដំបូងវាចាំបាច់ណាស់ក្នុងការគិតគូរពីបន្ទុករបស់ detergent ឥរិយាបថនៅតម្លៃ pH ដែលបានផ្តល់ឱ្យ CMC និងទំហំនៃ micelles detergent ។ លក្ខណៈសម្បត្តិចុងក្រោយគឺមានសារៈសំខាន់ជាពិសេស។ សារធាតុ detergents CMC ទាបដែលបង្កើតជា micelles ធំមិនត្រូវបានយកចេញដោយការលាងឈាម ឬ ultrafiltration ទេ ព្រោះកំហាប់នៃ monomers detergent គឺទាបពេក។ នៅក្នុងន័យជាក់ស្តែង នេះមានន័យថា ប្រសិនបើប្រូតេអ៊ីនមួយត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយ ultrafiltration នោះកំហាប់នៃសារធាតុ detergent CMC ទាបក៏នឹងកើនឡើងផងដែរ ដែលអាចនាំអោយមានជាតិប្រូតេអ៊ីន។ សម្រាប់ហេតុផលនេះ អ្នកស្រាវជ្រាវជាច្រើនចូលចិត្តប្រើម្សៅសាប៊ូដែលមាន CMCs ខ្ពស់ ដូចជា octyl glucoside អំបិលទឹកប្រមាត់ ឬម្សៅសាប៊ូ zwitterionic ទំនើបជាងនេះ។ ជ័រ Polystyrene ដូចជា Biobidz SM-2 មានតម្លៃណាស់។ ពួកវាជ្រើសរើសភ្ជាប់ជាមួយសាប៊ូបោកខោអាវដូចជា Triton X-100 យកវាចេញពីដំណោះស្រាយ និងធ្វើឱ្យវាអាចធ្វើទៅបានដោយគ្មានការលាងឈាមទាំងស្រុង។ កត្តាមួយទៀតដែលត្រូវពិចារណាគឺការស្រូបយកពន្លឺនៃសារធាតុសាប៊ូ។ សារធាតុសាប៊ូមួយចំនួនដូចជា Triton X-100 ស្រូបនៅតំបន់ជិតកាំរស្មី UV ដែលធ្វើឱ្យវាមិនអាចកំណត់កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដោយការវាស់ស្ទង់ការស្រូបនៅ 280 nm ។

ដោយគិតគូរពីកត្តាទាំងអស់នេះ វាច្បាស់ណាស់ថាហេតុអ្វីបានជាក្នុងករណីជាច្រើនចាំបាច់ត្រូវប្រើសារធាតុសាប៊ូផ្សេងៗនៅពេលញែកប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលដាច់ដោយឡែក។ ឧទាហរណ៍ Triton X-100 អាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការរលាយប៉ុន្តែការបំបែកជាមួយ DEAE-cellulose ត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងល្អបំផុតនៅក្នុងវត្តមាននៃ octyl glucoside ។ សារធាតុសាប៊ូអាចត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរនៅដំណាក់កាល chromatography កំឡុងពេល centrifugation ជម្រាលដង់ស៊ីតេ និងក្នុងករណីខ្លះតាមរយៈការលាងឈាម។ វាគួរតែត្រូវបានចងចាំក្នុងចិត្តថា សារធាតុ detergent ដែលមិនស័ក្តិសមសម្រាប់ការរលាយប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់មួយ អាចមានប្រសិទ្ធភាពខ្លាំងក្នុងការរក្សាប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងដំណោះស្រាយបន្ទាប់ពីការផ្លាស់ប្តូរ detergent ។ ការបន្សុតគួរតែត្រូវបានធ្វើឡើងស្ទើរតែគ្រប់ពេលជាមួយនឹងសារធាតុសាប៊ូលើសនៅក្នុងដំណោះស្រាយ បើមិនដូច្នេះទេលំនឹងនឹងត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរឆ្ពោះទៅរកការប្រមូលផ្តុំនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស ជាជាងឆ្ពោះទៅរកការបង្កើតស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន។ ក្នុងករណីខ្លះ ការប្រមូលផ្តុំបែបនេះអាចជាការចង់បាន ហើយជំហាននៃការបន្សុតចុងក្រោយអាចជាការដកសារធាតុសាប៊ូចេញ។ ប៉ុន្តែតាមក្បួនមួយ ជាមួយនឹងការខ្វះសារធាតុ detergent ទឹកភ្លៀងដែលមិនអាចត្រឡប់វិញបាន និងការបាត់បង់ប្រូតេអ៊ីនកើតឡើង។

តម្រូវការដើម្បីរក្សាកំហាប់ម្សៅសាប៊ូនៅកម្រិតជាក់លាក់មួយបង្កើតការលំបាកបន្ថែមលើសពីអ្វីដែលជាធម្មតាជួបប្រទះនៅក្នុងការបន្សុតប្រូតេអ៊ីន។ យើងបាននិយាយអំពីពួកគេមួយចំនួនរួចហើយ។ បញ្ហាក៏កើតឡើងផងដែរនៅពេលប្រើវិធីស្ដង់ដារអំបិលចេញនៅកំហាប់ខ្ពស់នៃអាម៉ូញ៉ូមស៊ុលហ្វាត៖ ក្នុងករណីជាច្រើន ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបាន precipitated ជាមួយ detergent និង lipid ។ ដោយសារសូលុយស្យុងទឹកអំបិលមានដង់ស៊ីតេខ្ពស់ ហើយសារធាតុសាប៊ូនៅក្នុងការប្រមូលផ្តុំមានកម្រិតទាប កំឡុងពេលផ្ចិតផ្ចិត ទឹកភ្លៀងនឹងនៅតែមាននៅលើផ្ទៃ។ វាជារឿងសំខាន់ដែលត្រូវចងចាំថា សារធាតុចម្រាញ់ពីប្រូតេអ៊ីន គឺជាកម្មវត្ថុនៃការបន្សុត ដែលជារឿយៗមានបរិមាណដ៏ច្រើននៃសារធាតុ phospholipid ។ នេះប៉ះពាល់ដល់គុណភាពនៃការបំបែកកំឡុងពេល chromatography ក៏ដូចជាលទ្ធផលនៃការកំណត់លក្ខណៈនៃប្រូតេអ៊ីនរលាយចុងក្រោយ វាចាំបាច់ក្នុងការកំណត់ចំនួន និងទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃអនុ polypeptide, stoichiometry, ទំហំ និងរូបរាងរបស់ពួកវា។ ម៉ូលេគុល ក៏ដូចជាប្រសិនបើចាំបាច់ សកម្មភាពជីវគីមី។

3. លក្ខណៈនៃប្រូតេអ៊ីននៃភ្នាសអាំងតេក្រាលដែលបានបន្សុត

លក្ខណៈនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសដែលបានបន្សុត សូម្បីតែប្រភេទសាមញ្ញបំផុតក៏អាចជាបញ្ហាប្រឈមដែរ។ ដូចករណី

3.1 ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃរង

Polyacrylamide gel electrophoresis នៅក្នុងវត្តមាននៃសូដ្យូម dodecyl sulfate គឺជាបច្ចេកទេសទូទៅមួយប៉ុន្តែនៅក្នុងករណីនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលវាបង្កបញ្ហាពិសេស។ នៅក្នុងវិធីសាស្រ្តនេះ dodecyl sulfate ត្រូវបានភ្ជាប់ជាមួយខ្សែសង្វាក់ polypeptide និងប្រូតេអ៊ីន-DNS ស្មុគស្មាញត្រូវបានបំបែកនៅក្នុងជែល polyacrylamide យោងតាម ​​Stokes radii របស់ពួកគេដែលក្នុងករណីភាគច្រើនអាស្រ័យលើទម្ងន់ម៉ូលេគុល។ ម៉ាស់ម៉ូលេគុលត្រូវបានកំណត់ដោយការប្រៀបធៀបការចល័ត electrophoretic នៃស្មុគស្មាញដែលបានផ្តល់ឱ្យនិងស្តង់ដារដែលគេស្គាល់។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការចង SDS ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស្គាល់អាចមានគុណភាពខុសពីការចងទៅនឹងស្តង់ដារ ហើយបន្ទាប់មកលទ្ធផលមិនត្រឹមត្រូវនឹងត្រូវបានទទួល។ ស្ថានភាពស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលដែលមានមាតិកាខ្ពស់នៃសំណល់អាស៊ីតអាមីណូដែលមិនមានប៉ូឡា។ SDS បង្កើតជាស្មុគ្រស្មាញជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលរលាយបានច្រើនបំផុតក្នុងសមាមាត្រនៃ 1.4 ក្រាមនៃ SDS ក្នុង 1 ក្រាមនៃប្រូតេអ៊ីន ហើយសារធាតុ detergent ច្រើនទៀតអាចភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលមានភាគរយដ៏ធំនៃសំណល់មិនរាងប៉ូល។ ការចោទប្រកាន់អវិជ្ជមានបន្ថែមដែលកើតឡើងក្នុងករណីនេះនាំឱ្យមានការកើនឡើងមិនធម្មតានៃការចល័ត electrophoretic ហើយទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលបានកំណត់ប្រែទៅជាតិចជាងការពិត។ ស្ថានភាពមួយទៀតក៏អាចធ្វើទៅបានដែរ។ ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសដែលភ្ជាប់ទៅនឹង SDS ប្រហែលជាមិនត្រូវបានលាតត្រដាងពេញលេញទេ ដែលនឹងនាំឱ្យមានការកើនឡើងមិនធម្មតានៃការចល័ត electrophoretic ដោយសារតែការបង្កើតស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីន-SDS កាន់តែបង្រួម។ ផលប៉ះពាល់ទាំងអស់នេះមានសារៈសំខាន់ណាស់។ ឧទាហរណ៍ lactose permease មាន mol ជាក់ស្តែង។ ម៉ាស់ 33,000 នៅពេលវាស់ដោយ PAGE នៅក្នុងវត្តមានរបស់ SDS; នាងនិយាយថាតាមពិត លទ្ធផលនៃការវិភាគហ្សែនបង្ហាញ។ ម៉ាស់គឺ 46 000 ។ ក្នុងករណីជាច្រើន វាអាចប៉ាន់ប្រមាណទម្ងន់ម៉ូលេគុលបានកាន់តែត្រឹមត្រូវដោយការសាងសង់គ្រោង Ferguson ដែលតំណាងឱ្យការពឹងផ្អែកនៃការចល័ត electrophoretic លើមាតិកា acrylamide សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនស្តង់ដារ និងប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សា។ ក្រាហ្វនេះអាស្រ័យលើកាំ Stokes ហើយក្នុងកម្រិតតិចជាងនេះ លើបន្ទុកនៃស្មុគស្មាញ។ ឧទាហរណ៍ យោងទៅតាមលទ្ធផលនៃ electrophoresis នៅក្នុងជែល acrylamide 12% អនុផ្នែកមួយនៃ cytochrome o complex នៃ E. coli មានទម្ងន់ម៉ូលេគុលជាក់ស្តែង។ ម៉ាស់ 28,000 ហើយពីក្រាហ្វ Ferguson តម្លៃគឺ 43,000 ដែលស្របគ្នានឹង mol ។ ម៉ាស់គណនាពីទិន្នន័យលំដាប់នៃ DNA ដែលត្រូវគ្នា។

បញ្ហាមួយទៀតគឺវត្តមានដែលអាចកើតមាននៃរចនាសម្ព័ន្ធ quaternary ។ ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសមួយចំនួនប្រមូលផ្តុំសូម្បីតែនៅក្នុងវត្តមាននៃ SDS ។ ឧទាហរណ៍ glycophorin A ឬប្រូតេអ៊ីនស្រោមសំបុត្រនៃ bacteriophage M13 ត្រូវបានរកឃើញជាចម្បងនៅក្នុងទម្រង់នៃ dimers កំឡុងពេល electrophoresis នៅក្នុង polyacrylamide gels ជាមួយ SDS ។ ជួនកាលការប្រមូលផ្តុំត្រូវបានពង្រឹងបន្ថែមដោយការកំដៅល្បាយប្រូតេអ៊ីន-SDS។ រូបភាពនេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញជាឧទាហរណ៍ សម្រាប់អនុផ្នែកនៃទាំង mitochondrial និងបាក់តេរី oxidases ស្ថានីយ។ ដើម្បីវាយតម្លៃសមត្ថភាពរបស់ប្រូតេអ៊ីនក្នុងការប្រមូលផ្តុំដែលមិនអាចត្រឡប់វិញបាន ការវិភាគប្រៀបធៀបនៃលទ្ធផលនៃ electrophoresis នៅក្នុង polyacrylamide gel ជាមួយ SDS សម្រាប់សំណាកដែលគេឱ្យឈ្មោះថា និង unheated គួរតែត្រូវបានអនុវត្ត។ បញ្ហាស្រដៀងគ្នានេះជួនកាលកើតឡើងដោយសារតែវត្តមានរបស់សារធាតុសាប៊ូដែលប្រើក្នុងការបន្សុតប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ សាប៊ូបោកខោអាវនេះត្រូវតែយកចេញ និងជំនួសដោយ SDS ចាប់តាំងពីក្នុងករណីខ្លះមានការពឹងផ្អែកយ៉ាងច្បាស់នៃការចល័ត electrophoretic លើវត្តមានរបស់ detergent ដែលអង់ស៊ីមត្រូវបានរលាយ។

ដូច្នេះហើយ មានហេតុផលក្នុងការគិតថាការវាយតម្លៃទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃអនុផ្នែកនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលមិនប៉ូលខ្ពស់ ដែលកំណត់ដោយប្រើ SDS-PAGE អាចមិនត្រឹមត្រូវ។ ជាអកុសល មិនមានជម្រើសដ៏សាមញ្ញចំពោះវិធីសាស្ត្រនេះទេ ហើយតម្លៃត្រឹមត្រូវតែងតែទទួលបានពីទិន្នន័យលំដាប់បឋមពេញលេញ ឬពីការវិភាគអ៊ីដ្រូឌីណាមិកត្រឹមត្រូវ។

3.2 ការ​កំណត់​ទម្ងន់​ម៉ូលេគុល​នៃ​ប្រូតេអ៊ីន​ដើម​ដោយ​ប្រើ​វិធី​សាស្ត្រ​វារី​អគ្គិសនី

ការអនុវត្តវិធីសាស្រ្តទាំងនេះចំពោះប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាចជួបការលំបាកដោយសារការភ្ជាប់សារធាតុ detergent ។ ដើម្បីដឹងគុណយ៉ាងពេញលេញនេះ ចូរយើងពិចារណាជាដំបូងនូវប្រូតេអ៊ីនរលាយសាមញ្ញ ដែល mol ។ បរិមាណនៃអនុរងដោយប្រើ SDS-PAGE ហើយវាចាំបាច់ក្នុងការស្វែងយល់ថាតើវាជាអ្វីនៅក្នុងទម្រង់សកម្មដែលមិនមានលក្ខណៈធម្មតារបស់វា - monomer, dimer ឬ oligomer លំដាប់ខ្ពស់ជាង។ ការច្រោះជែលដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការប្រៀបធៀបជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនស្តង់ដារ ត្រូវបានគេប្រើជាញឹកញាប់ដើម្បីកំណត់ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន។ នៅទីនេះបញ្ហាកើតឡើងដោយសារតែការពិតដែលថាប្រូតេអ៊ីនស្តង់ដារទាំងអស់មានរាងជារាងមូល ហើយប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សាអាចមិនមែនជារាងពងក្រពើទេ ប៉ុន្តែត្រូវបានពន្លូតបន្តិច។ ប្រូតេអ៊ីនបែបនេះជាមួយ mol ។ ទំងន់ 50,000 អាចលោតក្នុងល្បឿនដែលត្រូវនឹង mol ។ ឧសភា

se 100 LLC ។ ក្នុងន័យនេះ ជួរឈរចម្រោះជែលត្រូវតែត្រូវបានក្រិតស្របតាមកាំ Stokes ពោលគឺវិមាត្រនៃ "លំហអ៊ីដ្រូឌីណាមិកសមមូល" ហើយលើសពីនេះទៀត វិធីសាស្ត្រមួយចំនួនទៀតត្រូវតែប្រើស្របគ្នា។ ជាធម្មតា អត្រា sedimentation ត្រូវបានវាស់ដោយប្រើ ការវិភាគ ultracentrifugation ឬ sucrose density centrifugation។ មេគុណ sedimentation គឺស្មើនឹង

ដែល m ជាទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន

v គឺជាបរិមាណជាក់លាក់របស់វា ij គឺជា viscosity នៃដំណោះស្រាយ b គឺជាដង់ស៊ីតេនៃដំណោះស្រាយ។

ចាប់តាំងពី e និង H ត្រូវបានគេស្គាល់ថា aRc អាចត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ gel filtration មានតែបរិមាណមិនស្គាល់ពីរប៉ុណ្ណោះដែលនៅសល់ - v និង m សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនរលាយក្នុងទឹក v អាចត្រូវបានគណនាដោយផ្អែកលើសមាសធាតុអាស៊ីតអាមីណូ ឬវាស់ដោយផ្ទាល់ ឬគ្រាន់តែយកស្មើនឹង។ 0.72-0.75 មីលីលីត្រ / ក្រាម។ ដូច្នេះដោយការវាស់វែង S 0 យើងអាចរកឃើញ m ។

ឥឡូវនេះសូមឱ្យយើងពិចារណាស្ថានភាពជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ បញ្ហាបន្ថែមកើតឡើងនៅទីនេះ ដោយហេតុថាភាគល្អិតអ៊ីដ្រូឌីណាមិកគឺជាសារធាតុចម្រាញ់ប្រូតេអ៊ីន ដូច្នេះ m និង v ក្នុងករណីនេះគឺជាទម្ងន់ម៉ូលេគុល និងបរិមាណជាក់លាក់នៃស្មុគស្មាញ M k និង K ។ ជាអកុសល K មិនអាចត្រូវបានវាយតម្លៃដោយមិនដឹងអ្វីទាំងអស់អំពីសមាសភាពនៃស្មុគស្មាញ។ ក្នុងករណីនេះវិធីសាស្រ្តពីរត្រូវបានប្រើដើម្បីស្វែងរកម៉ាស់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន។

1. វាស់ដោយផ្ទាល់នូវបរិមាណនៃសារធាតុ detergent ក្នុង 1 ក្រាមនៃប្រូតេអ៊ីន។ ចំពោះគោលបំណងនេះ វិធីសាស្ត្រវិសាលគម ឬសារធាតុសាប៊ូដែលមានស្លាកវិទ្យុសកម្មត្រូវបានប្រើ ហើយវិធីសាស្ត្រផ្សេងៗ ដូចជាការចម្រោះជែល ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែកសារធាតុស្មុគស្មាញ។ ដោយបានបង្កើតមាតិកាដែលទាក់ទងនៃប្រូតេអ៊ីន និងសារធាតុសាប៊ូនៅក្នុងស្មុគស្មាញ តម្លៃ K ត្រូវបានទទួលជាទម្ងន់មធ្យមនៃតម្លៃដែលត្រូវគ្នាសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនសុទ្ធ និងសារធាតុសាប៊ូសុទ្ធ។ បន្ទាប់ពីនេះ m ត្រូវបានរកឃើញយ៉ាងងាយស្រួលហើយចាប់តាំងពីសមាមាត្ររវាងប្រូតេអ៊ីននិងសារធាតុសាប៊ូនៅក្នុងស្មុគស្មាញត្រូវបានគេដឹងនោះទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានរកឃើញ។

2. S0 ត្រូវបានវាស់នៅក្នុងប្រព័ន្ធផ្សព្វផ្សាយដែលមានដង់ស៊ីតេដំណោះស្រាយខុសៗគ្នា ឃ. ប្រព័ន្ធផ្សព្វផ្សាយបែបនេះត្រូវបានរៀបចំជាធម្មតាដោយប្រើល្បាយនៃ HgO និង D2O ។ ពីក្រាហ្វនៃ S° ធៀបនឹង q ទាំង L/“ និង v t ត្រូវបានរកឃើញ។ វាត្រូវបានសន្មត់ថា K គឺជាទម្ងន់មធ្យមនៃតម្លៃដែលត្រូវគ្នាសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនសុទ្ធ និងសារធាតុសាប៊ូសុទ្ធ។

ការវាយតម្លៃ Kvelo* និងយកសារធាតុសាប៊ូចេញពីតារាង ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃសមាសធាតុប្រូតេអ៊ីន m ត្រូវបានទទួល។

ដើម្បី​កំណត់​ការ​អាស្រ័យ​នៃ 5° លើ q ការ​ចាប់​ផ្ចិត​វិភាគ​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត។ ការផ្តោតអារម្មណ៍ក៏អាចត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងជម្រាលដង់ស៊ីតេ sucrose ដោយប្រើល្បាយនៃ H2O និង D2O ប៉ុន្តែការវិភាគនៃលទ្ធផលក្នុងករណីនេះគឺស្មុគស្មាញជាងទោះបីជាវាមិនខុសគ្នាជាមូលដ្ឋានពីករណីមុនក៏ដោយ។

វិធីសាស្រ្តជំនួសសម្រាប់កំណត់ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃទម្រង់ដើមនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសគឺដោយតុល្យភាព ultracentrifugation ។ ការចែកចាយសារធាតុនៅលំនឹងគឺដូចជាជម្រាលនៃក្រាហ្វនៃលោការីតនៃការផ្តោតអារម្មណ៍ធៀបនឹង r 2 គឺស្មើនឹង

ដែល r គឺជាចំងាយពីកណ្តាលរបស់ rotor ទៅចំណុចដែលបានផ្តល់ឱ្យនៅក្នុងបំពង់ centrifuge, W គឺជាប្រេកង់បង្វិល។

ប្រសិនបើតម្លៃ Y ត្រូវបានគេស្គាល់ ឬងាយស្រួលក្នុងការប៉ាន់ស្មាន ដូចជាសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលរលាយបានភាគច្រើន បញ្ហានេះត្រូវបានដោះស្រាយយ៉ាងសាមញ្ញ។ ចំពោះប្រូតេអ៊ីនភ្នាសក្នុងករណីនេះ

តារាងទី 3. ការចងសារធាតុសាប៊ូទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនភ្នាសមួយចំនួន

ក្លូននៃបន្ទាត់ត្រង់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញនៅតម្លៃផ្សេងគ្នានៃ q ដែលទទួលបានដោយការលាយ HgO និង D2O ។ ដូចពីមុន Mk និង K ត្រូវបានរកឃើញក្នុងពេលដំណាលគ្នាហើយបន្ទាប់មកទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកំណត់។

ប្រសិនបើសមាសធាតុទីបីមានវត្តមាននៅក្នុងស្មុគស្មាញនោះបញ្ហាបន្ថែមកើតឡើង។ ក្នុងករណីណាក៏ដោយ នីតិវិធីទាំងអស់ដែលបានពិពណ៌នាគឺស្មុគស្មាញខ្លាំង ហើយអាចផ្តល់លទ្ធផលខុសឆ្គង។ បរិមាណនៃសារធាតុ detergent ដែលទាក់ទងនឹងប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលដែលបានបន្សុតអាចមានសារៈសំខាន់ណាស់ - ពី 0,3 ទៅ 1,5 ដោយទម្ងន់នៃប្រូតេអ៊ីនហើយសូម្បីតែកំហុសតូចតាចនៅក្នុងតម្លៃនេះនឹងនាំឱ្យមានការបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយសំខាន់នៃទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន។ នៅក្នុងតារាង តារាង 3.3 ផ្តល់ទិន្នន័យអំពីបរិមាណនៃសារធាតុសាប៊ូដែលមាននៅក្នុងការត្រៀមប្រូតេអ៊ីនមួយចំនួន។ ចំណាំថាប្រូតេអ៊ីនរលាយមិនភ្ជាប់ទៅនឹងសារធាតុសាប៊ូទាំងនេះទេ។ នេះបង្ហាញម្តងទៀតថាវាគឺជាផ្នែកមិនប៉ូលនៃប្រូតេអ៊ីន ដែលជាធម្មតាមានទំនាក់ទំនងជាមួយភ្នាសរំអិល ដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការភ្ជាប់ទៅនឹងសារធាតុសាប៊ូ។

3.3 វិធីសាស្រ្តអសកម្មនៃវិទ្យុសកម្ម

វិធីសាស្រ្តនៃការអសកម្មវិទ្យុសកម្មដើម្បីកំណត់ទំហំគោលដៅត្រូវបានប្រើប្រាស់កាន់តែខ្លាំងឡើងក្នុងការសិក្សាអំពីប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ ទាំងប្រូតេអ៊ីនដែលបានបន្សុត និងការត្រៀមលក្ខណៈឆៅ រួមទាំង biomembranes ដដែលអាចត្រូវបានសិក្សា។ ខ្លឹមសារនៃវិធីសាស្រ្តគឺដើម្បីកំណត់សមាមាត្រនៃម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានបំផ្លាញដោយការ irradiation ។ ចំពោះគោលបំណងនេះ វិធីសាស្ត្រអង់ស៊ីមនៃអរម៉ូនចង ឬលីហ្គែន ឬវិធីសាស្ត្រវិសាលគមផ្សេងទៀតត្រូវបានប្រើប្រាស់។ នីតិវិធីមានដូចខាងក្រោម។ គំរូ ដែលជាធម្មតាត្រូវបានកក គឺត្រូវបានប៉ះពាល់នឹងវិទ្យុសកម្មថាមពលខ្ពស់។ នៅចន្លោះពេលផ្សេងៗគ្នា គំរូត្រូវបានគេយក រលាយ និងវាស់វែង។ ការខូចខាតប្រូតេអ៊ីនដែលស្ថិតនៅក្រោមឥទ្ធិពលនៃវិទ្យុសកម្មត្រូវបានរកឃើញឧទាហរណ៍ដោយប្រើ SDS-PAGE ។ បទពិសោធន៍បង្ហាញថាអង្គភាពរងមួយចំនួនបាត់បង់សកម្មភាពជីវសាស្រ្តទាំងស្រុងនៅពេលដែលការខូចខាតវិទ្យុសកម្មត្រូវបានណែនាំទៅកន្លែងណាមួយនៅក្នុងខ្សែសង្វាក់ polypeptide ។ ចំណុចសំខាន់គឺថាម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីនកាន់តែធំ លទ្ធភាពនៃការខូចខាតកាន់តែធំ ហើយដូច្នេះលទ្ធភាពនៃការអសកម្ម។ ប្រូបាប៊ីលីតេនេះមិនអាស្រ័យលើរូបរាងរបស់ម៉ូលេគុលនោះទេប៉ុន្តែនៅលើម៉ាស់របស់វា។ ជាធម្មតា ប្រូតេអ៊ីននៃទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលគេស្គាល់ត្រូវបាន irradiated ស្របគ្នាដើម្បីជួយសម្រួលដល់ការបកស្រាយលទ្ធផល។ ប្រសិនបើប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សាមានច្រើនជាងមួយរង ការលំបាកមួយចំនួនកើតឡើងនៅពេលវិភាគលទ្ធផល។ ការខូចខាតដល់អង្គភាពរងមួយ មិនចាំបាច់អមដោយការដាច់នៃចំណង covalent នៅក្នុងអនុឯកតាផ្សេងទៀតទេ។ ដូច្នេះសម្រាប់អង់ស៊ីមដែលមានផ្នែករងផ្សេងៗគ្នាដែលមានសកម្មភាពខុសៗគ្នា ទំហំគោលដៅផ្សេងគ្នាអាចទទួលបានអាស្រ័យលើវិធីសាស្ត្រសម្រាប់កំណត់កម្រិតនៃភាពអសកម្ម។

លក្ខណៈពិសេសគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃវិធីសាស្រ្តគឺថាវាអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលនៅក្នុងកន្លែង។ វត្ថុបុរាណនិងបញ្ហាដែលកើតឡើងក្នុងករណីនេះត្រូវបានពិភាក្សានៅក្នុងការងារ។ បញ្ហាជាក់ស្តែងមួយគឺតម្រូវការប្រើប្រាស់វិទ្យុសកម្មដែលមានថាមពលខ្ពស់។ ក្នុងន័យនេះ ការងារភាគច្រើនត្រូវតែអនុវត្តដោយសហការជាមួយមន្ទីរពិសោធន៍ដែលមានប្រភពសមស្រប និងបានស្ទាត់ជំនាញវិធីសាស្ត្រវិភាគពិសេស។

3.4 វិធីសាស្រ្តពិសេស និងរចនាសម្ព័ន្ធអនុវិទ្យាល័យ

វិធីសាស្រ្តជាច្រើនត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់មាតិកានៃ α-helices និង β-sheets នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ អវត្ដមាននៃអង្គការបីវិមាត្រមនុស្សម្នាក់អាចព្យាយាមបង្កើតគំរូសមស្របដោយផ្អែកលើពួកគេ។ វិធីសាស្រ្តដែលប្រើជាទូទៅបំផុតគឺ dichroism រាងជារង្វង់។ Infrared និង Raman spectroscopy ក៏ដូចជា NMR ត្រូវបានប្រើប្រាស់កាន់តែខ្លាំងឡើង។

1. វិធីសាស្រ្ត dichroism រាងជារង្វង់គឺផ្អែកលើការវាស់ភាពខុសគ្នានៃការស្រូបពន្លឺប៉ូឡូញឆ្វេងនិងស្តាំ; សកម្មភាពអុបទិកនេះគឺជារង្វាស់នៃ chirality នៃម៉ូលេគុល ឬរង្វាស់នៃភាពមិនស៊ីមេទ្រីរបស់វា។ នៅក្នុងតំបន់អ៊ុលត្រាវីយូឡេឆ្ងាយ ស៊ីឌីត្រូវបានកំណត់ជាចម្បងដោយការស្រូបយកអាមីដនៃក្រុមកាបូនអ៊ីលនៃឆ្អឹងខ្នង polypeptide ។ នៅក្នុងវត្តមាននៃផ្នែកនៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំឧទាហរណ៍ α-helices វិសាលគមស៊ីឌីមានលក្ខណៈពិសេសជាក់លាក់ជាច្រើនដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងលក្ខណៈនៃបរិស្ថានអេឡិចត្រូនិចនៃក្រុមអាមីដូនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះ។ នៅពេលវិភាគវិសាលគមស៊ីឌីនៃប្រូតេអ៊ីន វាជាធម្មតាត្រូវបានតំណាងថាជាផលបូកនៃសមាសធាតុដែលត្រូវគ្នានឹងការស្រូបយកផ្នែកផ្សេងៗនៃម៉ូលេគុលប្រូតេអ៊ីន៖ α-helices ស្រទាប់β-ស្រទាប់ និងឧបករណ៏ចៃដន្យ។ ដោយបានកំណត់វិសាលគមនៃរចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះតាមមធ្យោបាយមួយឬមួយផ្សេងទៀត ពួកគេត្រូវបានសង្ខេបដោយជ្រើសរើសមេគុណសមស្របតាមរបៀបដែលការឆ្លើយឆ្លងដ៏ល្អបំផុតទៅនឹងវិសាលគមដែលបានវាស់វែងត្រូវបានសម្រេច។ មេគុណទម្ងន់ដែលបានជ្រើសរើសតំណាងឱ្យសមាមាត្រដែលធ្លាក់ក្នុងម៉ូលេគុលសម្រាប់ប្រភេទនីមួយៗនៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។

វិធីសាស្រ្តទាំងនេះត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលអាចរលាយបាន ប៉ុន្តែគ្មានហេតុផលអ្វីដែលត្រូវសង្ស័យថាពួកគេអាចត្រូវបានអនុវត្តដោយជោគជ័យចំពោះប្រូតេអ៊ីនភ្នាសនោះទេ។ ភាគច្រើនទំនងជាតំបន់ក្រោយៗទៀតមានតំបន់ដែលមានប្រភេទដូចគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំដូចជាប្រូតេអ៊ីនរលាយ ហើយការលំបាកដូចគ្នានឹងកើតឡើងនៅពេលសិក្សាពួកវា។ ប្រូតេអ៊ីនមួយចំនួនអាចត្រូវបានសិក្សានៅក្នុងកន្លែងដោយប្រើការព្យួរភ្នាស។ ឧទាហរណ៏នៃប្រភេទនេះគឺ bacteriorhodopsin ពីភ្នាសពណ៌ស្វាយនៃ Halobacteriumhalobium និង Ca 2 + -ATPase ពីភ្នាសនៃ reticulum sarcoplasmic ។ ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសដែលបានបន្សុតអាចត្រូវបានពិនិត្យដោយប្រើស៊ីឌីនិងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ detergents ប្រសិនបើការស្រូបយកក្រោយនៅក្នុងតំបន់ឆ្ងាយកាំរស្មី UV មិនខ្ពស់ពេកឬនៅក្នុងសមាសភាពនៃ vesicles ដែលត្រូវបានសាងសង់ឡើងវិញ។ បញ្ហាពីរកើតឡើងនៅទីនេះ៖ 1) ការខ្ចាត់ខ្ចាយពន្លឺឌីផេរ៉ង់ស្យែល នៅពេលដែលទំហំនៃភាគល្អិតភ្នាសមានទំហំធំជាងរលកពន្លឺ។ 2) ភាពស្មើគ្នានៃការស្រូបយកដោយសារតែការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងភ្នាសឬ vesicles ពោលគឺដោយសារតែភាពមិនដូចគ្នានៃការបែងចែករបស់វានៅក្នុងដំណោះស្រាយ។ វត្ថុបុរាណទាំងនេះអាចមានសារៈសំខាន់ណាស់ ប៉ុន្តែអាចត្រូវបានរាប់បញ្ចូលក្នុងការប្រើប្រាស់វិធីសាស្ត្រសមស្រប។

ជាអកុសល ទិន្នន័យរចនាសម្ព័ន្ធដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់មិនមានសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសខាងក្នុងទេ ដូច្នេះការបកស្រាយត្រឹមត្រូវនៃ CD spectra គឺមិនអាចទៅរួចទេ។ ជាមួយនឹងករណីលើកលែងមួយចំនួន វិធីសាស្ត្រវិសាលគមផ្សេងៗគ្នាមិនត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាប្រូតេអ៊ីនដូចគ្នាទេ ហើយមិនមានការប្រៀបធៀបបរិមាណនៃលទ្ធផលត្រូវបានធ្វើឡើងទេ។ វាគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ដែលថាសម្រាប់ bacteriorhodopsin ដែលត្រូវបានសិក្សាដោយវិធីសាស្រ្ត CD, IR និង NMR ក្នុងករណីទាំងបីលទ្ធផលដូចគ្នាត្រូវបានទទួលដែលបង្ហាញពីមាតិកាសំខាន់នៃ 3 ស្រទាប់នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីននេះ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយវិធីសាស្ត្រនីមួយៗមានគុណវិបត្តិយ៉ាងសំខាន់។ ដូច្នេះទិន្នន័យនៅលើមាតិកាខ្ពស់នៃស្រទាប់ D នៅក្នុង bacteriorhodopsin ភាគច្រើនពឹងផ្អែកលើវិធីសាស្រ្តនៃគណនេយ្យវត្ថុបុរាណអុបទិក។ ការវិនិច្ឆ័យដោយទិន្នន័យការបង្កើតឡើងវិញមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងដែលកំណត់លក្ខណៈដោយគុណភាពបង្ហាញទាប 80% នៃ bacteriorhodopsin មាន α-helices និង 0-layers គឺអវត្តមានទាំងស្រុង។ ដើម្បីយល់ពីហេតុផលនៃភាពខុសគ្នាទាំងនេះ វាចាំបាច់ក្នុងការធ្វើការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធនៃប្រូតេអ៊ីនតាមដំណោះស្រាយអាតូមិច។ មាន​ភ្នាស​សម្បូរ​ប្រូតេអ៊ីន​ពីរ​ផ្សេង​ទៀត​ដែល​លាតសន្ធឹង​និង Staphylococcus aureus a-toxin ។ ប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការបង្កើតរន្ធញើសនៅក្នុង bilayer នេះ។

2. Infrared spectroscopy និង Raman spectroscopy ។ វិធីសាស្រ្តទាំងនេះមិនត្រឹមតែផ្តល់ព័ត៌មានអំពីការអនុលោមតាមភ្នាសរំអិលប៉ុណ្ណោះទេប៉ុន្តែវាក៏អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សារចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៃប្រូតេអ៊ីនផងដែរ។ វិសាលគមរំញ័រនៃឆ្អឹងខ្នង polypeptide អាស្រ័យលើប្រភេទនៃរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ និងផ្តល់ព័ត៌មានអំពីខ្លឹមសារនៃរចនាសម្ព័ន្ធ a- និង /3- នៅក្នុងម៉ូលេគុល។ វិធីសាស្រ្តទាំងនេះអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាខ្សែភាពយន្តស្ងួតដោយខ្យល់ ការព្យួរ aqueous នៃភ្នាស ក៏ដូចជាប្រូតេអ៊ីនដែលបានបន្សុត ទាំងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ detergent និងជាផ្នែកមួយនៃ vesicles ដែលត្រូវបានសាងសង់ឡើងវិញ។ ឧទាហរណ៍ យោងទៅតាម Fourier transform IR spectroscopy ស្មុគ្រស្មាញ Ca 2+ -ATPase នៅក្នុងភ្នាសមានជាចម្បងនៃតំបន់ α-helical និងតំបន់ដែលមានទម្រង់ជារនាំងស្ថិតិ ហើយ myelin ប្រូតេអ៊ីន hydrophobic នៅក្នុង vesicles ដែលត្រូវបានសាងសង់ឡើងវិញមាន α- និង / ។ ៣- ដីឡូតិ៍។

3. NMR spectroscopy ក៏អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសិក្សាប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សមត្ថភាពនៃវិធីសាស្ត្រក្នុងករណីនេះមានកម្រិត ដែលភាគច្រើនគឺដោយសារតែចលនាយឺតនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលនៅក្នុងកន្លែង និងនៅក្នុងស្មុគស្មាញជាមួយសាប៊ូ។ ដូច្នេះ វិធីសាស្ត្រដ៏មានអានុភាពដូចជា NMR ពីរវិមាត្រ ដែលអាចផ្តល់នូវរូបភាពលម្អិតនៃស្ថានភាពអនុលោមភាពនៃប្រូតេអ៊ីនតិចតួចនៅក្នុងដំណោះស្រាយ មិនទាន់សមស្របសម្រាប់ការសិក្សាអំពីប្រូតេអ៊ីនភ្នាសទេ។ វិធីសាស្ត្រ NMR នៃសំណាករឹងគឺអាចទទួលយកបាន។ វិធីសាស្ត្រ 2H- និង 3C-NMR មានសក្ដានុពលខ្លាំង ទោះបីជារហូតមកដល់ពេលនេះ ពួកវាមិនត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយក៏ដោយ។ ទិន្នន័យត្រូវបានគេទទួលបាននៅលើការអនុលោមតាមមធ្យមនៃស្នូលនិងថាមវន្តនៃខ្សែសង្វាក់ចំហៀង។ វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាវិធីសាស្ត្រ NMR របស់រដ្ឋរឹងមិនត្រឹមតែមិនត្រូវបានប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែក្នុងករណីភាគច្រើនវាមិនអាចប្រើបានទេ។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយក្នុងស្ថានភាពដ៏កម្រដែលការប្រើប្រាស់របស់ពួកគេអាចធ្វើទៅបាន ពួកវាមានតម្លៃខ្លាំងណាស់។

3.5 សកម្មភាពអង់ស៊ីម

វិធីសាស្រ្តដ៏សំខាន់បំផុតមួយសម្រាប់កំណត់លក្ខណៈនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសដែលបានបន្សុតគឺច្បាស់ជាការកំណត់សកម្មភាពជីវគីមី។ ក្នុងករណីនេះ លក្ខណៈវិនិច្ឆ័យដូចគ្នាជាមូលដ្ឋានត្រូវបានប្រើសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីនរលាយ ប៉ុន្តែការលំបាករបស់ពួកគេអាចកើតឡើង។ ទីមួយនៃទាំងនេះគឺដោយសារតែការពិតដែលថាសកម្មភាពជីវគីមីនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសច្រើនតែពឹងផ្អែកលើការចងនៃ lipids និង detergents ទៅប្រូតេអ៊ីន។ ការ​បាត់​បង់​សកម្ម​ភាព​អាច​ត្រឡប់​មក​វិញ​ឬ​មិន​អាច​ត្រឡប់​មក​វិញ​បាន។ វាត្រូវបានណែនាំឱ្យមានការប៉ាន់ប្រមាណប្រភេទមួយចំនួននៃសកម្មភាពជាក់លាក់នៃប្រូតេអ៊ីនដែលកំពុងសិក្សានៅក្នុង vivo ឬជាផ្នែកមួយនៃភ្នាសមុនពេលរលាយ។ សារធាតុសាប៊ូដែលលើសអាចមានឥទ្ធិពលរារាំង ឧទាហរណ៍ដោយការពនលាយស្រទាប់ខាងក្រោមដែលមិនមានប៉ូលនៅក្នុងចំនួនប្រជាជនមីសែល និងកាត់បន្ថយសកម្មភាពអង់ស៊ីម។ នៅពេលវាស់សកម្មភាពនៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសណាមួយ វាត្រូវតែចងចាំថានៅក្នុងទីតាំងវាត្រូវបានហ៊ុំព័ទ្ធដោយ lipids ដែលធានានូវសកម្មភាពល្អបំផុត។ បញ្ហាទីពីរទាក់ទងនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលមានសកម្មភាព "transbilayer" ។ ឧទាហរណ៍រួមមានប្រូតេអ៊ីនបង្កើតឆានែល និងប្រូតេអ៊ីនដឹកជញ្ជូន។ នៅក្នុងករណីទាំងនេះ ចលនានៃសារធាតុរំលាយពីបន្ទប់មួយទៅបន្ទប់មួយទៀតត្រូវតែយកមកពិចារណា។

3.6 រចនាសម្ព័ន្ធចតុកោណ និងស្រទាប់ឈើឆ្កាងគីមី

អង់ស៊ីមភ្នាសជាច្រើនគឺជាស្មុគស្មាញដែលមានផ្នែករងជាច្រើន។ ឧទាហរណ៍រួមមាន H + -ATPase, Na + / K + -ATPase, ស្មុគស្មាញដឹកជញ្ជូនអេឡិចត្រុង mitochondrial និងមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មរស្មីសំយោគ។ ប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលមួយចំនួនត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់យ៉ាងតឹងរ៉ឹងជាមួយប្រូតេអ៊ីនដែលរលាយតាមរយៈអន្តរកម្មមិនកូវ៉ាឡេន។ នៅក្នុង E. coli សមាសភាគ Fo ដែលយោងទៅតាម SDS-PAGE electrophoresis មានបីប្រភេទរង បង្កើតជាប៉ុស្តិ៍ប្រូតុង aFi ដែលមាន 5 ប្រភេទរង មានមជ្ឈមណ្ឌលសកម្មដែលពាក់ព័ន្ធនឹង hydrolysis នៃ ATP ។ ចំពោះប្រូតេអ៊ីនបែបនេះ វាមានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់ក្នុងការកំណត់ពីលក្ខណៈនៃអនុផ្នែក ស្តូឈីអូមេទ្រីនៃស្មុគស្មាញ និងអន្តរកម្មភ្លាមៗនៃសមាសធាតុរបស់វា។ នេះគឺជាការងារដ៏លំបាកមួយ សូម្បីតែនៅពេលដែលស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានដាច់ឆ្ងាយរួចហើយ។ បញ្ហា​ដែល​កើត​ឡើង​នៅ​ទី​នេះ គឺ​សំខាន់​មិន​ខុស​គ្នា​ពី​ការ​ស្មុគស្មាញ​ប្រូតេអ៊ីន​ដែល​រលាយ​នោះ​ទេ ប៉ុន្តែ​មាន​ការ​លំបាក​បន្ថែម​ទៀត។

ជាដំបូង វាគួរតែត្រូវបានចងចាំក្នុងចិត្តថា អន្តរកម្មរវាងអនុរងគឺពឹងផ្អែកខ្លាំងទៅលើប្រភេទ lipid និង detergents ដែលប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់។ ឧទាហរណ៍ succinate dehydrogenase នៃ E. coli នៅពេលដែលរលាយជាមួយ Lubrol PX ហាក់ដូចជាមានបួនរង ប៉ុន្តែនៅពេលដែលរលាយជាមួយសារធាតុសាប៊ូផ្សេងទៀតភាគច្រើន រួមទាំង Triton X-100 មានតែពីរប៉ុណ្ណោះ។ sdh operon ត្រូវបានគេស្គាល់ថាបានអ៊ិនកូដ polypeptides ទាំងបួន ហើយទម្រង់រងពីរមានវិសាលគម ER មិនធម្មតា។ ដូច្នេះវាច្បាស់ណាស់ថានៅក្នុង vivo អង់ស៊ីមមានបួនរង។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយទម្រង់ទាំងពីរមានសកម្មភាព succinate dehydrogenase ដូច្នេះលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យជីវគីមីដែលប្រើមានសារៈសំខាន់ក្នុងការសន្និដ្ឋានថាតើទម្រង់ត្រឹមត្រូវត្រូវបានរលាយឬអត់។

បញ្ហាមួយទៀតគឺថាប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាចបង្កើតជាស្មុគស្មាញនៅក្នុង bilayer ដោយសារតែកំហាប់ក្នុងតំបន់ខ្ពស់របស់ពួកគេ។ កំឡុងពេលរលាយ ដោយមិនគិតពីសារធាតុដែលប្រើរួច ការរំលាយប្រូតេអ៊ីនភ្នាស និងការបំបែករបស់វាអាចកើតឡើង។ យោងទៅតាមច្បាប់នៃសកម្មភាពដ៏ធំនេះនឹងនាំឱ្យមានការបំបែកនៃស្មុគស្មាញដែលអន្តរកម្មរវាងសមាសធាតុមិនខ្លាំង។ ជារឿយៗវាពិបាកក្នុងការកំណត់ថាតើស្មុគ្រស្មាញមួយណាត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងកន្លែង និងមួយណាបន្ទាប់ពីការរលាយ និងការបន្សុត។ បញ្ហាស្រដៀងគ្នានេះកើតឡើងនៅក្នុងការសិក្សាអំពីប្រព័ន្ធស្មុគស្មាញជាច្រើន ឧទាហរណ៍ ប្រព័ន្ធ /3-adrenergic receptor-adeylacyl cyclase ខ្សែសង្វាក់ដឹកជញ្ជូនអេឡិចត្រុងនៅក្នុង mitochondria និងប្រព័ន្ធ microsomal cytochrome P450 និង b$ ។

ដើម្បីសិក្សា stoichiometry នៃអនុunits និងសមាគមរបស់ពួកគេនៅក្នុងស្មុគ្រស្មាញបន្សុត មានតែវិធីសាស្រ្តមួយចំនួនប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់: 1) crosslinking គីមី; 2) ការវិភាគបរិមាណនៃអាស៊ីតអាមីណូស្ថានីយ N; 3) ការកំណត់សមាមាត្រម៉ាស់នៃអនុក្រុមក្នុង SDS-polyacrylamide gels ដោយកំណត់អាំងតង់ស៊ីតេនៃស្នាមប្រឡាក់ដោយប្រើ autoradiography ឬ immunoblotting ។ វិធីសាស្រ្តនីមួយៗមានដែនកំណត់របស់វា ប៉ុន្តែពួកវាទាំងអស់ត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការអនុវត្តជាក់ស្តែង។ ឧទាហរណ៍ stoichiometry នៃអនុក្រុមចំនួនប្រាំនៃ nicotinic acetylcholic receptor ត្រូវបានកំណត់ដោយការវិភាគបរិមាណនៃអាស៊ីតអាមីណូ N-coic និងអនុក្រុមបីនៃសមាសភាគ Fo នៃ E. coli H + -ATPase ដោយការបំបែកនៅក្នុង SDS-polyacrylamide gels ។ ចំណាំថា Coomassie ពណ៌ខៀវភ្លឺដែលប្រើជាទូទៅដើម្បីប្រឡាក់ប្រូតេអ៊ីនបន្ទាប់ពីការបំបែក SDS-PAGE ភ្ជាប់ជាអាទិភាពទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនដែលមានសំណល់អាស៊ីតអាមីណូជាមូលដ្ឋាន ហើយមានឧទាហរណ៍នៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាសខាងក្នុងដែលមិនប្រឡាក់ខ្លាំងដែលមានស្នាមប្រឡាក់ទទេ។

ការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងគីមីត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់អន្តរកម្មរយៈពេលខ្លីទាំងនៅក្នុងស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនដែលបានបន្សុត និងនៅក្នុងបរិវេណស្មុគស្មាញ។ តំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ hydrophobic ជាក់លាក់មួយចំនួនត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគអន្តរកម្មរយៈពេលខ្លីនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនភ្នាស។ ពួកគេមួយចំនួនត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងតារាង។ ៣.៤. វិធីសាស្រ្តដែលបានប្រើមិនខុសពីវិធីសាស្ត្រសម្រាប់ប្រព័ន្ធរលាយទេ។ ផលិតផលតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ជាធម្មតាត្រូវបានវិភាគដោយ PAGE ជាញឹកញាប់ដោយប្រើភ្នាក់ងារទំនាក់ទំនងឆ្លងកាត់ដែលអាចបំបែកបាន ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការវិភាគនៃសារធាតុ polypeptides ។ អង្គបដិប្រាណចំពោះសារធាតុ polypeptides នីមួយៗក៏ត្រូវបានគេប្រើសម្រាប់ immunoblotting បន្ទាប់ពី SDS-PAGE ដើម្បីកំណត់សមាសធាតុនៃផលិតផលលទ្ធផលនីមួយៗ។ មនុស្សម្នាក់អាចសន្មត់ថា ដោយសារអាយុកាលយូរនៃសារធាតុ reagents ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង biomembranes នឹងត្រូវបានភ្ជាប់គ្នាជាលទ្ធផលនៃការសាយភាយសាមញ្ញនៅក្នុង bilayer ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យោងទៅតាមការសិក្សាជាច្រើន នេះមិនមែនជាករណីនោះទេ៖ ផលិតផលដែលភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងគឺជាដៃគូប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់ ហើយមិនមែនជាការបង្កើតដោយចៃដន្យនោះទេ។ ដូច្នេះនៅក្នុងភ្នាសសំយោគនៃ Rhodobacter capsulata តំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ត្រូវបានបង្កើតឡើងតែរវាងផ្នែករងនៃសមាសធាតុនៃមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មក៏ដូចជារវាងមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មនិង "អង់តែន" ស្មុគស្មាញ B870 ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការផ្ទេរថាមពល។ ទៅមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្ម។

ជាចុងក្រោយ យើងកត់សំគាល់ថា ការភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងគីមីជាញឹកញាប់ត្រូវបានគេប្រើដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនភ្នាសអាំងតេក្រាលដែលភ្ជាប់ទៅនឹងសមាសធាតុរលាយដែលគេស្គាល់។ ឧទាហរណ៍មួយគឺការភ្ជាប់ឆ្លងនៃ 1) a- និង b-subunits នៃសមាសភាគ Fo-kom នៃ H + -ATPase ជាមួយ /3-subunit នៃសមាសភាគរលាយ Fi; 2) cytochrome c c subunits នៃ mitochondrial cytochrome c oxidase; 3) អរម៉ូន peptide ជាមួយនឹងការទទួលអរម៉ូន។

តារាងទី 4. សារធាតុភ្ជាប់ឆ្លងកាត់មួយចំនួនដែលប្រើដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ quaternary នៃប្រូតេអ៊ីនភ្នាស"