Na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a natureza dos processos que ocorrem na coluna cromatográfica é geralmente idêntica aos processos na cromatografia gasosa. A única diferença está na utilização do líquido como fase estacionária. Devido à alta densidade das fases móveis líquidas e à alta resistência das colunas, a cromatografia gasosa e líquida diferem muito na instrumentação.

Em HPLC, solventes puros ou misturas destes são geralmente usados ​​como fases móveis.

Para criar um fluxo de solvente puro (ou misturas de solventes), denominado eluente em cromatografia líquida, são utilizadas bombas incluídas no sistema hidráulico do cromatógrafo.

A cromatografia de adsorção é realizada a partir da interação de uma substância com adsorventes, como sílica gel ou óxido de alumínio, que possuem centros ativos na superfície. A diferença na capacidade de interagir com os centros de adsorção de diferentes moléculas de amostra leva à sua separação em zonas durante o movimento com a fase móvel ao longo da coluna. A separação de zonas dos componentes conseguida neste caso depende da interação tanto com o solvente quanto com o adsorvente.

Os mais utilizados em HPLC são os adsorventes de sílica gel com diferentes volumes, áreas superficiais e diâmetros de poros. O óxido de alumínio e outros adsorventes são usados ​​com muito menos frequência. A principal razão para isso:

Resistência mecânica insuficiente, que não permite acondicionamento e utilização em altas pressões características do HPLC;

a sílica gel, comparada ao óxido de alumínio, possui uma faixa mais ampla de porosidade, área superficial e diâmetro de poro; A atividade catalítica significativamente maior do óxido de alumínio leva à distorção dos resultados da análise devido à decomposição dos componentes da amostra ou à sua quimissorção irreversível.

Detectores para HPLC

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é usada para detectar substâncias polares não voláteis que, por algum motivo, não podem ser convertidas em uma forma adequada para cromatografia gasosa, mesmo na forma de derivados. Tais substâncias, em particular, incluem ácidos sulfónicos, corantes solúveis em água e alguns pesticidas, por exemplo derivados de fenilureia.

Detectores:

Detector UV em uma matriz de diodo. Uma “matriz” de fotodiodos (mais de duzentos deles) registra constantemente sinais nas regiões UV e visível do espectro, proporcionando assim o registro dos espectros UV-B no modo de varredura. Isso permite registrar continuamente, com alta sensibilidade, espectros não distorcidos de componentes que passam rapidamente por uma célula especial.

Em comparação com a detecção de comprimento de onda único, que não fornece informações sobre a pureza do pico, a capacidade de comparar espectros completos de um conjunto de diodos proporciona um grau de confiança muito maior no resultado da identificação.

Detector de fluorescência. A grande popularidade dos detectores fluorescentes deve-se à sua elevada selectividade e sensibilidade e ao facto de muitos poluentes ambientais apresentarem fluorescência (por exemplo, hidrocarbonetos poliaromáticos).

Um detector eletroquímico é usado para detectar substâncias que são facilmente oxidadas ou reduzidas: fenóis, mercaptanos, aminas, nitro aromático e derivados de halogênio, aldeídos, cetonas, benzidinas.

A separação cromatográfica de uma mistura em uma coluna devido ao lento progresso do PF leva muito tempo. Para acelerar o processo, a cromatografia é realizada sob pressão. Este método é chamado de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

A modernização dos equipamentos utilizados na cromatografia em coluna líquida clássica tornou-a um dos métodos de análise mais promissores e modernos. A cromatografia líquida de alta eficiência é um método conveniente para a separação, isolamento preparativo e análise qualitativa e quantitativa de compostos termolábeis não voláteis com baixo e alto peso molecular.

Dependendo do tipo de sorvente utilizado, este método utiliza 2 opções de cromatografia: em um sorvente polar usando um eluente apolar (opção de fase direta) e em um sorvente apolar usando um eluente polar - a chamada fase reversa alta -cromatografia líquida de alta performance (RPHPLC).

Durante a transição de eluente para eluente, o equilíbrio sob condições de HPLC é estabelecido muitas vezes mais rápido do que sob condições de sorventes polares e PFs não aquosos. Como resultado disso, bem como da conveniência de trabalhar com eluentes aquosos e aquoso-álcoois, o OFVLC ganhou grande popularidade. A maioria das análises de HPLC são realizadas utilizando este método.

Detectores. A saída de um componente individual da coluna é registrada usando um detector. Para registro, pode-se utilizar uma alteração em qualquer sinal analítico proveniente da fase móvel e associado à natureza e quantidade do componente da mistura. A cromatografia líquida utiliza sinais analíticos como absorção de luz ou emissão de luz da solução de saída (detectores fotométricos e fluorimétricos), índice de refração (detectores refratométricos), potencial e condutividade elétrica (detectores eletroquímicos), etc.

O sinal continuamente detectado é gravado por um gravador. Um cromatograma é uma sequência de sinais de detector gravados em uma fita gravadora, gerados quando componentes individuais de uma mistura deixam a coluna. Se a mistura for separada, picos individuais serão visíveis no cromatograma externo. A posição do pico no cromatograma é utilizada para fins de identificação da substância, a altura ou área do pico - para fins de determinação quantitativa.

Aplicativo

A HPLC é mais amplamente utilizada nas seguintes áreas de análise química (são destacados objetos de análise onde a HPLC praticamente não tem concorrência):

· Controle de qualidade alimentar – tônicos e aditivos aromatizantes, aldeídos, cetonas, vitaminas, açúcares, corantes, conservantes, medicamentos hormonais, antibióticos, triazinas, carbamato e outros pesticidas, micotoxinas, nitrosaminas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, etc.

· Proteção ambiental - fenóis, nitrocompostos orgânicos, hidrocarbonetos aromáticos mono e policíclicos, vários pesticidas, principais ânions e cátions.

· Perícia – drogas, explosivos orgânicos e corantes, produtos farmacêuticos potentes.

· Indústria farmacêutica - hormônios esteróides, quase todos os produtos de síntese orgânica, antibióticos, preparações poliméricas, vitaminas, preparações proteicas.

· Medicamentos - as substâncias bioquímicas e medicinais listadas e seus metabólitos em fluidos biológicos (aminoácidos, purinas e pirimidinas, hormônios esteróides, lipídios) no diagnóstico de doenças, determinando a taxa de eliminação de medicamentos do organismo para fins de sua dosagem individual.

· Agricultura - determinação de nitrato e fosfato em solos para determinação da quantidade necessária de fertilizantes aplicados, determinação do valor nutricional de rações (aminoácidos e vitaminas), análise de pesticidas em solo, água e produtos agrícolas.

· Bioquímica, química bioorgânica, engenharia genética, biotecnologia - açúcares, lipídios, esteróides, proteínas, aminoácidos, nucleosídeos e seus derivados, vitaminas, peptídeos, oligonucleotídeos, porfirinas, etc.

· Química orgânica – todos os produtos estáveis ​​de síntese orgânica, corantes, compostos termolábeis, compostos não voláteis; química inorgânica (quase todos os compostos solúveis na forma de íons e compostos complexos).

· controle da qualidade e segurança de alimentos, bebidas alcoólicas e não alcoólicas, água potável, produtos químicos domésticos, perfumes em todas as etapas de sua produção;

· determinação da natureza da poluição no local de uma catástrofe ou emergência de origem humana;

· detecção e análise de substâncias entorpecentes, potentes, venenosas e explosivas;

· determinação da presença de substâncias nocivas (hidrocarbonetos policíclicos e outros aromáticos, fenóis, pesticidas, corantes orgânicos, iões de metais pesados, alcalinos e alcalino-terrosos) em efluentes líquidos, emissões atmosféricas e resíduos sólidos de empresas e em organismos vivos;

· monitoramento de processos de síntese orgânica, refino de petróleo e carvão, produção bioquímica e microbiológica;

análise da qualidade do solo para fertilização, presença de pesticidas e herbicidas no solo, água e produtos, bem como o valor nutricional dos alimentos para animais; tarefas analíticas de pesquisa complexas; obtenção de microquantidades de substâncias ultrapuras.



Introdução.

O rápido desenvolvimento da cromatografia líquida nos últimos 10 anos deve-se principalmente ao intenso desenvolvimento de fundamentos teóricos e ao uso prático de sua versão altamente eficaz, bem como à criação e produção industrial dos sorventes e equipamentos necessários.

Uma característica distintiva da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é o uso de sorventes com tamanho de grão de 3 a 10 mícrons, o que garante rápida transferência de massa com altíssima eficiência de separação.

Atualmente, a HPLC ocupa o primeiro lugar entre os métodos instrumentais em termos de taxas de desenvolvimento, superando até mesmo a cromatografia gasosa. A vantagem mais importante da HPLC em comparação com a cromatografia gasosa é a capacidade de estudar quase qualquer objeto sem quaisquer restrições às suas propriedades físico-químicas, por exemplo, pontos de ebulição ou peso molecular.

Hoje, a HPLC é um método instrumental bem projetado que é amplamente utilizado em uma ampla variedade de campos da ciência e da tecnologia. A sua importância é especialmente grande em áreas críticas como a bioquímica, a biologia molecular, o controlo da poluição ambiental, bem como nas indústrias química, petroquímica, alimentar e farmacêutica.

uma vez que é necessário levar em consideração uma série de requisitos muito específicos devido às seguintes características da metodologia.

A. As colunas de HPLC são preenchidas com meios de partículas de diâmetro muito pequeno. Como resultado, em velocidades volumétricas do solvente necessárias para a rápida separação da amostra, é criada alta pressão na coluna.

b. Os detectores usados ​​em HPLC são sensíveis a flutuações no fluxo e pressão do eluente (ruído). Além disso, ao utilizar detectores de concentração, é necessária uma estabilidade ainda maior da velocidade volumétrica do eluente.

V. O processo de separação cromatográfica é acompanhado por uma série de efeitos antagônicos, por exemplo, a dispersão da amostra na fase móvel leva à mistura dos componentes separados e reduz a concentração máxima da substância no pico eluído (no detector). A dispersão é observada em todas as áreas do sistema, desde o ponto de injeção da amostra até o detector.

d. Os solventes que atuam como fase móvel podem frequentemente causar corrosão do equipamento. Isto se aplica principalmente a solventes usados ​​em cromatografia de fase reversa, que é preferida em aplicações bioquímicas de HPLC.

As especificidades da HPLC como técnica instrumental devem ser levadas em consideração durante o desenvolvimento, criação e operação destes sistemas. Foram necessários mais de dez anos de pesquisas e pesquisas para criar amostras comerciais de sistemas cromatográficos e seus componentes que fossem suficientemente confiáveis, simples e seguros para operar com uma relação aceitável entre preço e características técnicas. As tendências recentes de redução de colunas (tanto no comprimento como no diâmetro) impõem novas exigências aos instrumentos.

1.1. EFICIÊNCIAESELETIVIDADE

A cromatografia é um método de separação dos componentes de uma mistura com base na diferença em sua distribuição de equilíbrio entre duas "fases imiscíveis, uma das quais é estacionária e a outra móvel. Os componentes da amostra se movem ao longo da coluna quando estão no fase móvel e permanecem no lugar quando estão na fase estacionária. Quanto maior a afinidade do componente pela fase estacionária e menor pela fase móvel, mais lentamente ele se move através da coluna e mais tempo fica retido nela. Devido à diferença na afinidade dos componentes da mistura pelas fases estacionária e móvel, o objetivo principal da cromatografia é alcançado - a separação de um período de tempo aceitável da mistura em bandas individuais (picos) dos componentes à medida que se movem. ao longo da coluna com a fase móvel.

A partir destes conceitos gerais, fica claro que a separação cromatográfica só é possível se os componentes da amostra, que entram na coluna quando a amostra é introduzida, em primeiro lugar, estiverem dissolvidos na fase móvel e, em segundo lugar, interagirem (retidos) com a fase estacionária. . Se, ao introduzir uma amostra, algum componente não estiver na forma de solução, será filtrado e não participará do processo cromatográfico. Da mesma forma, os componentes que não interagem com a fase estacionária passarão pela coluna com a fase móvel sem se separarem em seus componentes.

Aceitemos a condição de que alguns dois componentes sejam solúveis na fase móvel e interajam com a fase estacionária, ou seja, o processo croiatográfico pode prosseguir sem perturbações. Neste caso, após passar a mistura pela coluna, é possível obter cromatogramas da forma um, b ou V(Fig. 1.1). Esses cromatogramas ilustram separações cromatográficas que diferem em eficiência (A e b) com igual seletividade e seletividade (b E V) com igual eficiência.

Quanto mais estreito for o pico obtido no mesmo tempo de retenção, maior será a eficiência da coluna. A eficiência da coluna é medida pelo número de placas teóricas (NPT) N: quanto maior a eficiência

Arroz. 1.2. Parâmetros de pico cromatográfico e cálculo do número de placas teóricas:

tR - tempo de retenção de pico; h - altura do pico; Wj/j - largura do pico na metade de sua altura

Arroz. 1.1. Tipo de cromatograma dependendo da eficiência e seletividade da coluna:

A- seletividade normal, eficiência reduzida (menos placas teóricas); b - seletividade e eficiência usuais; V - eficiência comum, maior seletividade (maior proporção de tempos de retenção de componentes)

eficiência, quanto maior o FTT, menor será o alargamento do pico da banda inicialmente estreita à medida que passa pela coluna e mais estreito será o pico na saída da coluna. O PTT caracteriza o número de etapas no estabelecimento do equilíbrio entre as fases móvel e estacionária.

Conhecendo o número de placas teóricas por coluna e o comprimento da coluna eu (µm), bem como o diâmetro médio do grão sorvente dc (µm), é fácil obter os valores da altura equivalente a um prato teórico (HETT), bem como da altura reduzida equivalente a um prato teórico (RHETT):

APOSTA = eu/ N

PVETT=B3TT/d c .

Tendo os valores de FTT, HETT e PHETT, pode-se facilmente comparar a eficiência de colunas de diferentes tipos, diferentes comprimentos, preenchidas com sorventes de diferentes naturezas e granularidades. Ao comparar o PTT de duas colunas do mesmo comprimento, sua eficiência é comparada. Ao comparar o HETP, são comparadas colunas com sorventes do mesmo tamanho de grão e comprimentos diferentes. Por fim, o valor PVETT permite avaliar a qualidade do sorvente em quaisquer duas colunas, em primeiro lugar, a qualidade do enchimento das colunas e, em segundo lugar, independentemente do comprimento das colunas, a granulação dos sorventes da sua natureza.

A seletividade da coluna desempenha um grande papel na obtenção da separação cromatográfica.

A seletividade de uma coluna depende de muitos fatores, e a habilidade do experimentador é largamente determinada pela capacidade de influenciar a seletividade da separação. Para isso, três fatores muito importantes estão nas mãos do cromatógrafo: a escolha da natureza química do sorvente, a escolha da composição do solvente e seus modificadores e a consideração da estrutura química e das propriedades dos componentes separados. . Às vezes, uma mudança na temperatura da coluna, que altera os coeficientes de distribuição de substâncias entre as fases móvel e estacionária, tem um efeito notável na seletividade.

Ao considerar e avaliar a separação de dois componentes num cromatograma, a resolução é um parâmetro importante. Rs, que relaciona os tempos de saída e as larguras de pico de ambos os componentes separados

A resolução como parâmetro que caracteriza a separação dos picos aumenta à medida que a seletividade aumenta, refletida por um aumento no numerador, e a eficiência aumenta, refletida por uma diminuição no valor do denominador devido a uma diminuição na largura dos picos. Portanto, o rápido progresso da cromatografia líquida levou a uma mudança no conceito de “cromatografia líquida de alta pressão” - foi substituído por “cromatografia líquida de alta resolução” (enquanto a forma abreviada do termo em inglês foi preservada HPLC como o que caracteriza mais corretamente a direção de desenvolvimento da cromatografia líquida moderna).

Assim, a lavagem da coluna é reduzida e a eficiência é aumentada quando um sorvente mais fino é usado, de composição mais uniforme (fração estreita), compactado de forma mais densa e uniforme na coluna, usando camadas de fase de enxerto mais finas, solventes menos viscosos e taxas de fluxo ideais.

Porém, junto com o borrão da banda da zona cromatográfica durante o processo de separação na coluna, ela também pode ser lavada no dispositivo de introdução de amostra, nos capilares de conexão injetor - coluna e detector de coluna, na célula detectora e em alguns dispositivos auxiliares (microfiltros para retenção de partículas mecânicas de amostras instaladas após o injetor, pré-colunas, reatores de bobina, etc.) - Quanto maior o volume extra-coluna em relação ao volume retido do pico, maior será a erosão. Também importa onde o volume morto está localizado: quanto mais estreito o sinal cromatográfico, maior será o desfoque do volume morto. Portanto, atenção especial deve ser dada ao projeto daquela parte do cromatógrafo onde a zona cromatográfica é mais estreita (o injetor e os dispositivos do injetor à coluna) - aqui a erosão extracoluna é mais perigosa e tem o maior impacto. Embora se acredite que em cromatógrafos bem projetados as fontes de diluição extra-coluna adicionais devam ser reduzidas ao mínimo, no entanto, cada novo dispositivo, cada modificação do cromatógrafo deve necessariamente terminar com testes em uma coluna e comparação do cromatograma resultante com o passaporte. Se for observada distorção de pico ou uma diminuição acentuada na eficiência, os capilares e outros dispositivos recentemente introduzidos no sistema deverão ser cuidadosamente inspecionados.

A lavagem fora da coluna e seu julgamento incorreto podem levar a uma perda significativa (mais de 50%) de eficiência, especialmente nos casos em que se tenta usar cromatógrafos relativamente antigos para HPLC de alta velocidade, HPLC de microcoluna e outras variantes de HPLC moderno que exigem microinjetores, capilares de conexão com diâmetro interno de 0,05-0,15 mm de comprimento mínimo, colunas com capacidade de 10-1000 µl, detectores com microcuvetas com capacidade de 0,03-1 µl e com gravadores e integradores de alta velocidade e alta velocidade .

1.2. RETENÇÃO E FORÇA DE SOLVENTE

Para que os analitos sejam separados na coluna, conforme mencionado acima, o coeficiente de capacidade k" deve ser maior que 0, ou seja, as substâncias devem ser retidas pela fase estacionária, o sorvente. Contudo, o factor de capacidade não deve ser demasiado elevado para obter um tempo de eluição aceitável. Se para uma determinada mistura de substâncias for selecionada uma fase estacionária que as retenha, então o trabalho adicional no desenvolvimento de uma técnica de análise consiste em escolher um solvente que idealmente forneça diferentes para todos os componentes, mas aceitavelmente não muito grandes k". Isto é conseguido alterando a força de eluição do solvente.

No caso de cromatografia de adsorção em sílica gel ou óxido de alumínio, via de regra, a força de um solvente de dois componentes (por exemplo, hexano com adição de isopropanol) é aumentada aumentando o teor do componente polar (isopropanol), ou diminuída pela diminuição do teor de isopropanol. Se o componente polar contido se tornar muito pequeno (menos de 0,1%), ele deverá ser substituído por uma força de eluição mais fraca. O mesmo é feito, substituindo um componente polar ou um apolar por outros, mesmo que este sistema não proporcione a seletividade desejada em relação aos componentes de interesse da mistura. Na seleção de sistemas solventes, são levadas em consideração tanto a solubilidade dos componentes da mistura quanto as séries eluotrópicas de solventes compiladas por diferentes autores.

A força do solvente é selecionada aproximadamente da mesma maneira quando se utilizam fases polares enxertadas (nitrila, amino, diol, nitro, etc.), levando em consideração possíveis reações químicas e excluindo solventes perigosos para a fase (por exemplo, cetonas para o fase amino).

No caso da cromatografia de fase reversa, a concentração do solvente é aumentada pelo aumento do teor do componente orgânico no eluente (metanol, acetonitrila ou THF) e diminuída pela adição de mais água. Caso não seja possível atingir a seletividade desejada, utilizam outro componente orgânico ou tentam alterá-lo com diversos aditivos (ácidos, reagentes de pares iônicos, etc.).

Nas separações por cromatografia de troca iônica, a força do solvente é alterada aumentando ou diminuindo a concentração da solução tampão ou alterando o pH, em alguns casos, utiliza-se a modificação com substâncias orgânicas;

No entanto, especialmente no caso de misturas naturais e biológicas complexas, muitas vezes não é possível selecionar a concentração do solvente de tal forma que todos os componentes da amostra eluam dentro de um tempo aceitável. Então é necessário recorrer à eluição gradiente, ou seja, utilizar um solvente cuja força de eluição muda durante o processo de análise para que aumente constantemente de acordo com um programa pré-determinado. Esta técnica permite conseguir a eluição de todos os componentes de misturas complexas num período de tempo relativamente curto e a sua separação em componentes na forma de picos estreitos.

1.3. TAMANHO DE PARTÍCULA SORVENTE, PERMEABILIDADE E EFICIÊNCIA

Considerando a erosão na coluna, indicamos que a eficiência da coluna (HETT) depende do tamanho das partículas sorventes. Em grande medida, o rápido desenvolvimento da HPLC nos últimos 10-12 anos deveu-se, em primeiro lugar, ao desenvolvimento de métodos para a produção de sorventes com tamanhos de partículas de 3 a 10 mícrons e com uma composição fracionada estreita, proporcionando alta eficiência com boa permeabilidade, e em segundo lugar, o desenvolvimento de métodos para enchimento de colunas com estes sorventes e, em terceiro lugar, o desenvolvimento e produção em série de cromatógrafos líquidos com bombas de alta pressão, injetores e detectores com cubetas de pequeno volume capazes de registrar picos de pequeno volume.

Para colunas bem compactadas com pasta fluida, a altura teórica equivalente reduzida da placa (LPHE) pode ser 2, independentemente de partículas de 3, 5, 10 ou 20 μm serem usadas para empacotamento. Neste caso, receberemos respectivamente colunas (com comprimento padrão de 250 mm) com eficiência de 41670, 25000, 12500 e 6250 t.t. Parece natural selecionar a coluna mais eficiente com partículas de 3 µm. No entanto, esta eficiência terá o custo de uma operação com pressão muito elevada e uma velocidade de separação relativamente baixa, uma vez que a bomba existente será muito provavelmente capaz de bombear solvente através de tal coluna a uma velocidade volumétrica elevada. Aqui nos deparamos com a questão da relação entre o tamanho das partículas do sorvente, a eficiência e a permeabilidade das colunas.

Se expressarmos daqui o fator de resistência da coluna - uma quantidade adimensional, obteremos a seguinte equação:

O fator de resistência para colunas empacotadas com micropartículas do mesmo tipo usando o mesmo método varia ligeiramente e é os seguintes valores:

Tipo de partícula "... Esférica Irregular

formulário

Embalagem seca. . . . . 1000-2000 800-1200

Embalagem de suspensão. . . 700-1500 500-700

A pressão de entrada da coluna é proporcional à velocidade linear do fluxo, ao fator de arrasto da coluna, à viscosidade do solvente e ao comprimento da coluna e inversamente proporcional ao quadrado do diâmetro da partícula.

Aplicando esta relação às colunas descritas acima com partículas com diâmetros de 3, 5, 10 e 20 µm e assumindo vazão linear constante, fator de resistência da coluna e viscosidade do solvente, obtemos uma razão de pressão de entrada de 44:16:4:1 para colunas de igual comprimento. Assim, se for um sorvente de fase reversa com tamanho de partícula de 10 μm ao usar sistemas solventes de metanol -. água (70:30) geralmente em uma coluna padrão com vazão de solvente de 1 ml/min, a pressão na entrada da coluna é de 5 MPa, então para partículas de 5 μm - 20 MPa e para 3 μm - 55 MPa . Ao utilizar sílica gel e um sistema solvente menos viscoso, hexano - isopropanol (100:2), os valores serão significativamente menores: 1, 4 e 11 MPa, respectivamente. Se no caso de um sorvente de fase reversa o uso de partículas com tamanho de 3 μm for muito problemático, e 5 μm for possível, mas não em todos os dispositivos, então para um sorvente de fase normal não há problemas de pressão. Deve-se notar que a HPLC moderna de alta velocidade normalmente utiliza uma taxa de fluxo de solvente mais alta do que no exemplo acima, portanto os requisitos de pressão aumentam ainda mais.

No entanto, nos casos em que é necessário um certo número de placas teóricas para a separação e é desejável realizar uma análise de taxa, o quadro muda um pouco. Já os comprimentos das colunas com sorventes com granulometria de 3, 5, 10 mícrons, com igual eficiência, serão de 7,5, respectivamente; 12,5 e 25 cm, então a relação de pressão na entrada das colunas mudará para 3:2:1. Assim, a duração da análise em tais colunas de igual eficiência estará na proporção de 0,3:0,5:1, ou seja, ao passar de 10 para 5 e 3 mícrons, a duração da análise será reduzida em 2 e 3,3 vezes. Esta análise mais rápida tem o custo de uma pressão proporcionalmente mais alta na entrada da coluna.

Os dados apresentados são válidos para aqueles casos em que sorventes de diferentes granulometrias possuem as mesmas curvas de distribuição granulométrica, as colunas são empacotadas da mesma forma e possuem o mesmo fator de resistência da coluna. Deve-se ter em mente que a dificuldade de obtenção de frações estreitas do sorvente aumenta à medida que o tamanho das partículas diminui e assim por diante. Frações de diferentes fabricantes possuem diferentes composições fracionárias. Portanto, o fator de resistência da coluna irá variar dependendo do tamanho do grão, tipo de sorvente, método de empacotamento da coluna, etc.

CLASSIFICAÇÃO DE MÉTODOS DE HPLC POR MECANISMO DE SEPARAÇÃO

A maioria das separações realizadas por HPLC baseia-se em um mecanismo misto de interação de substâncias com um sorvente, proporcionando maior ou menor retenção dos componentes na coluna. Os mecanismos de separação numa forma mais ou menos pura são bastante raros na prática, por exemplo, a adsorção quando se utiliza sílica gel absolutamente anidra e hexano anidro para separar hidrocarbonetos aromáticos.

Com um mecanismo de retenção misto para substâncias de diferentes estruturas e pesos moleculares, é possível avaliar a contribuição para a retenção de adsorção, distribuição, exclusão e outros mecanismos. Porém, para uma melhor compreensão e compreensão dos mecanismos de separação em HPLC, é aconselhável considerar separações com predominância de um ou outro mecanismo como relacionadas a um determinado tipo de cromatografia, por exemplo, cromatografia de troca iônica.

2.1.1 CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO

A separação por cromatografia de adsorção é realizada a partir da interação de uma substância com adsorventes, como sílica gel ou óxido de alumínio, que possuem centros ativos na superfície. A diferença na capacidade de interagir com os centros de adsorção de diferentes moléculas de amostra leva à sua separação em zonas durante o movimento com a fase móvel ao longo da coluna. A separação de zonas dos componentes conseguida neste caso depende da interação tanto com o solvente quanto com o adsorvente.

A sorção na superfície de um adsorvente contendo grupos hidroxila é baseada em uma interação específica entre a superfície polar do adsorvente e grupos polares (ou polarizáveis) ou seções de moléculas. Tais interações incluem a interação dipolo-dipolo entre dipolos permanentes ou induzidos, a formação de uma ligação de hidrogênio, até a formação de complexos r ou complexos de transferência de carga. Uma ocorrência possível e bastante frequente no trabalho prático é a manifestação de quimissorção, que pode levar a um aumento significativo do tempo de retenção, uma diminuição acentuada da eficiência, aparecimento de produtos de decomposição ou sorção irreversível da substância.

As isotermas de adsorção de substâncias têm formato linear, convexo ou côncavo. Com uma isoterma de adsorção linear, o pico da substância é simétrico e o tempo de retenção não depende do tamanho da amostra. Na maioria das vezes, as isotermas de adsorção de substâncias são não lineares e possuem formato convexo, o que leva a alguma assimetria do pico com a formação de uma cauda.

Os mais amplamente utilizados em HPLC são os adsorventes de sílica gel com diferentes volumes de poros, áreas superficiais e diâmetros de poros. O óxido de alumínio é usado com muito menos frequência e outros adsorventes, amplamente utilizados na coluna clássica e na cromatografia em camada delgada, são usados ​​extremamente raramente. A principal razão para isso é a resistência mecânica insuficiente da maioria dos outros adsorventes, o que não permite que sejam embalados ou utilizados em altas pressões características de HPLC.

Os grupos polares que causam adsorção e estão localizados na superfície da sílica gel e do óxido de alumínio têm propriedades semelhantes. Portanto, geralmente a ordem de eluição das misturas de substâncias e as séries eluotrópicas de solventes são as mesmas para elas. No entanto, a diferença na estrutura química da sílica gel e do óxido de alumínio às vezes leva a diferenças na seletividade - então é dada preferência a um ou outro adsorvente mais adequado para uma determinada tarefa específica. Por exemplo, a alumina proporciona maior seletividade para a separação de certos hidrocarbonetos aromáticos polinucleares.

A preferência geralmente dada à sílica gel em comparação ao óxido de alumínio é explicada por uma escolha mais ampla de sílica gel em termos de porosidade, superfície e diâmetro dos poros, bem como pela atividade catalítica significativamente maior do óxido de alumínio, o que muitas vezes leva à distorção dos resultados da análise devido à decomposição dos componentes da amostra ou à sua quimissorção irreversível.

2.1.2 Desvantagens da cromatografia de adsorção que limitam seu uso

A popularidade da cromatografia de adsorção diminuiu gradualmente à medida que o método HPLC se desenvolveu e foi cada vez mais substituído e continua a ser substituído por outras opções, como HPLC de fase reversa e fase normal em sorventes com fase enxertada. Quais são as desvantagens da cromatografia de adsorção que levaram a isso?

Em primeiro lugar, trata-se da longa duração dos processos de equilíbrio dos adsorventes com solventes contendo água em pequenas quantidades, da dificuldade de preparar tais solventes com uma umidade certa e reprodutível. Isso resulta em baixa reprodutibilidade dos parâmetros de retenção, resolução e seletividade. Pela mesma razão, é impossível usar a eluição gradiente - o retorno ao estado inicial é tão longo que excede significativamente o tempo ganho com o uso do gradiente.

Desvantagens significativas dos adsorventes, especialmente do óxido de alumínio, associadas a casos frequentes de rearranjos de compostos sensíveis à catálise, sua decomposição e sorção irreversível, também são bem conhecidas e têm sido repetidamente observadas na literatura. Substâncias irreversivelmente sorvidas, acumuladas na seção inicial da coluna, alteram a natureza do sorvente e podem levar ao aumento da resistência da coluna ou mesmo ao seu entupimento total. A última desvantagem pode ser eliminada usando uma pré-coluna, que Por-À medida que a resistência e o entupimento aumentam, ele é substituído por um novo* ou reabastecido com um novo sorvente. No entanto, a sorção irreversível, que também ocorre neste caso, resulta num cromatograma no qual os componentes da amostra sensíveis à sorção ou à decomposição catalítica estão total ou parcialmente ausentes.

2.2. CROMATOGRAFIA DE DISTRIBUIÇÃO

A cromatografia de partição é uma variante da HPLC em que a separação de uma mistura em componentes é realizada devido à diferença em seus coeficientes de distribuição entre duas fases imiscíveis: um solvente (fase móvel) e uma fase no sorvente (fase estacionária). Historicamente, os primeiros foram sorventes desse tipo, obtidos pela aplicação de fases líquidas (oxidipropionitrila, óleo de parafina, etc.) sobre suportes porosos, semelhante à forma como os sorventes foram e são preparados para cromatografia gás-líquido (GLC). No entanto, as desvantagens de tais sorventes foram imediatamente reveladas, a principal das quais foi a lavagem relativamente rápida da fase do veículo. Devido a isso, a quantidade de fase na coluna diminuiu gradativamente, os tempos de retenção também diminuíram e centros de adsorção não cobertos pela fase apareceram na seção inicial da coluna, causando a formação de caudas de pico. Esta desvantagem foi combatida saturando o solvente com a fase aplicada antes de entrar na coluna. O arrastamento também foi reduzido quando foram utilizadas fases poliméricas mais viscosas e menos solúveis, mas neste caso, devido à dificuldade de difusão a partir de filmes poliméricos espessos, a eficiência da coluna foi marcadamente reduzida.

Acabou sendo lógico enxertar a fase líquida no carreador por meio de ligações químicas de tal forma que sua remoção se tornasse fisicamente impossível, ou seja, transformar o carreador e a fase em um - no chamado sorvente de fase enxertada.

Os esforços subsequentes dos pesquisadores visaram a busca de reagentes cujo enxerto ocorresse de forma bastante rápida e completa, e as ligações formadas fossem tão estáveis ​​quanto possível. Tais reagentes foram os alquilclorossilanos e seus derivados, o que possibilitou, por meio de tecnologia semelhante, a obtenção de sorventes em fase de enxerto de diversos tipos e com diferentes grupos polares e apolares na superfície.

A aplicação bem sucedida deste último tipo de sorventes para HPLC contribuiu para o crescimento da sua produção por uma ampla variedade de fabricantes. Cada empresa produzia esses sorventes, via de regra, a partir de seu próprio tipo de sílica gel e utilizando tecnologia própria, o que normalmente constitui “know-how” de produção. Como resultado, um grande número de sorventes, quimicamente denominados exatamente iguais (por exemplo, sílica gel enxertada com octadecilsilano), possuem características cromatográficas muito diferentes. Isso se deve ao fato de que a sílica gel pode ter poros mais largos ou mais estreitos, uma superfície diferente, porosidade, sua superfície antes do enxerto pode ser hidroxilada ou não, mono-, di- ou triclorossilanos podem ser enxertados, as condições de enxerto podem dar monoméricos, poliméricos ou fase de camada mista, diferentes métodos são usados ​​para remover reagentes residuais, desativação adicional de silanol e outros grupos ativos pode ou não ser usada.

A complexidade da tecnologia de enxertia de reagentes e preparação de matérias-primas e materiais, sua natureza multiestágio, faz com que mesmo lotes de sorventes obtidos com a mesma tecnologia de uma empresa fabricante possam ter características cromatográficas ligeiramente diferentes. Isto é especialmente verdadeiro nos casos em que tais sorventes são utilizados para a análise de misturas multicomponentes contendo substâncias que diferem marcadamente no número e posição dos grupos funcionais e no tipo de funcionalidade.

Tendo em conta o acima exposto, deve-se sempre esforçar-se para garantir que, ao utilizar a técnica de análise descrita na literatura, seja utilizado o mesmo sorvente e as mesmas condições de operação. Nesse caso, a probabilidade de a obra não ser reproduzida é mínima. Se isso não for possível, mas for adquirido um sorvente de outra empresa com fase enxertada semelhante, é preciso estar preparado para o fato de que demorará muito para retrabalhar a técnica. Ao mesmo tempo, existe a possibilidade (e deve ser levada em consideração) de que com este sorvente, mesmo após um longo desenvolvimento, a separação necessária não possa ser alcançada. A presença na literatura de muitas técnicas de separação descritas em sorventes antigos e produzidos há muito tempo estimula sua produção e utilização por esse motivo. Porém, nos casos em que seja necessário avançar para o desenvolvimento de métodos originais, especialmente em relação a substâncias propensas à decomposição, quimissorção, rearranjos, é aconselhável começar a trabalhar em sorventes que foram desenvolvidos recentemente e produzidos com novos e melhorados versões da tecnologia. Os novos sorventes possuem composição fracionada mais uniforme, cobertura superficial mais uniforme e completa com a fase enxertada e estágios finais de processamento do sorvente mais avançados.

2.3. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

Na cromatografia de troca iônica, a separação dos componentes da mistura é obtida através da interação reversível das substâncias ionizantes com os grupos iônicos do sorvente. A preservação da neutralidade elétrica do sorvente é garantida pela presença de contra-íons capazes de troca iônica localizados próximos à superfície. O íon da amostra introduzida, interagindo com a carga fixa do sorvente, troca com o contra-íon. Substâncias com diferentes afinidades para cargas fixas são separadas em trocadores de ânions ou trocadores de cátions. Os trocadores de ânions têm grupos carregados positivamente na superfície e absorvem ânions da fase móvel. Os trocadores de cátions contêm grupos com carga negativa que interagem com os cátions.

Como fase móvel são utilizadas soluções aquosas de sais de ácidos, bases e solventes como amônia líquida, ou seja, sistemas solventes com alta constante dielétrica e e maior tendência a ionizar compostos. Geralmente trabalham com soluções tampão que permitem o pH. valor a ser ajustado.

Durante a separação cromatográfica, os íons do analito competem com os íons contidos no eluente, tendendo a interagir com grupos de carga oposta do sorvente. Segue-se que a cromatografia de troca iônica pode ser usada para separar quaisquer compostos que possam ser ionizados de alguma forma. É possível analisar até moléculas de açúcar neutras na forma de seus complexos com o íon borato:

Açúcar + VO 3 2 - = Açúcar -VO 3 2 -.

A cromatografia de troca iônica é indispensável para a separação de substâncias altamente polares, que não podem ser analisadas por GLC sem conversão em derivados. Esses compostos incluem aminoácidos, peptídeos e açúcares.

A cromatografia de troca iônica é amplamente utilizada em medicina, biologia, bioquímica, para monitoramento ambiental, na análise do conteúdo de medicamentos e seus metabólitos no sangue e na urina, pesticidas em matérias-primas alimentares, bem como para a separação de compostos inorgânicos, incluindo radioisótopos, lantanídeos, actinídeos, etc. A análise de biopolímeros (proteínas, ácidos nucléicos, etc.), que geralmente demorava horas ou dias, é realizada por cromatografia de troca iônica em 20-40 minutos com melhor separação. O uso da cromatografia de troca iônica em biologia tem possibilitado a observação de amostras diretamente em meios biológicos, reduzindo a possibilidade de rearranjo ou isomerização, o que pode levar à interpretação incorreta do resultado final. É interessante utilizar este método para monitorar alterações que ocorrem em fluidos biológicos. A utilização de trocadores aniônicos fracos porosos à base de sílica gel permitiu a separação dos peptídeos. V

O mecanismo de troca iônica pode ser representado na forma das seguintes equações:

para troca aniônica

X-+R+Y- h ->■ Y-+R+X-.

para troca catiônica |

X+ + R-Y+ h=* Y++R-X+.

No primeiro caso, o íon da amostra X~ compete com o íon da fase móvel Y~ pelos centros iônicos R+ do trocador de íons, e no segundo caso, os cátions da amostra X+ competem com os íons Y+ da fase móvel pelo R ~ centros iônicos.

Naturalmente, os íons da amostra que interagem fracamente com o trocador de íons serão fracamente retidos na coluna durante esta competição e serão os primeiros a serem eliminados dela e, inversamente, os íons mais fortemente retidos serão os últimos a eluir da coluna . Normalmente, as interações BTqpH4Hbie de natureza não iônica ocorrem devido à adsorção ou ligações de hidrogênio da amostra com a parte não iônica da matriz ou devido à solubilidade limitada da amostra na fase móvel. É difícil isolar a cromatografia de troca iônica “clássica” em sua forma “pura” e, portanto, alguns cromatógrafos partem de princípios empíricos e não teóricos na cromatografia de troca iônica.

A separação de substâncias específicas depende principalmente da escolha do sorvente e da fase móvel mais adequados. Resinas de troca iônica e géis de sílica com grupos ionogênicos enxertados são usados ​​como fases estacionárias em cromatografia de troca iônica.

2.4. SEÇÃO CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO

A cromatografia de exclusão é uma opção! cromatografia líquida, em que a separação ocorre devido à distribuição de moléculas entre o solvente localizado dentro dos poros do sorvente e o solvente fluindo " entre suas partículas.

Ao contrário de outras opções de HPLC, onde a separação chegando Devido às diferentes interações dos componentes com a superfície do sorvente, o papel da carga sólida na cromatografia de exclusão granulométrica é apenas formar poros de determinado tamanho, sendo a fase estacionária o solvente que preenche esses poros. Portanto, o uso do termo “sorvente” para essas cargas é, até certo ponto, arbitrário.

Uma característica fundamental do método é a capacidade de separar moléculas de acordo com seu tamanho em solução na faixa de quase qualquer peso molecular - de 10 2 a 10 8, o que o torna indispensável para o estudo de sintéticos e biopolímeros.

Tradicionalmente, o processo realizado em solventes orgânicos ainda é frequentemente chamado de cromatografia de permeação em gel, e em sistemas aquosos - cromatografia de filtração em gel. Neste livro, para ambas as opções, é adotado um único termo, que vem do inglês “Size Exclusion” - exclusão por tamanho - e reflete de forma mais completa o mecanismo do processo.

Uma análise detalhada das ideias existentes sobre a teoria muito complexa do processo de cromatografia por exclusão de tamanho é realizada em monografias.

Volume total de solvente na coluna Vt (geralmente chamado de volume total da coluna, já que Vd não participa do processo cromatográfico) é a soma dos volumes das fases móvel e estacionária.

A retenção de moléculas em uma coluna de exclusão é determinada pela probabilidade de sua difusão nos poros e depende da razão entre os tamanhos das moléculas e dos poros, que é mostrada esquematicamente na Fig. 2.15. Coeficiente de distribuição Ka, como em outras variantes da cromatografia, é a razão entre as concentrações de uma substância nas fases estacionária e móvel.

Como as fases móvel e estacionária têm a mesma composição, então Kd uma substância para a qual ambas as fases são igualmente acessíveis é igual à unidade. Esta situação é percebida para moléculas C dos menores tamanhos (incluindo moléculas de solvente), que penetram em todos os poros (ver Fig. 2.15) e, portanto, movem-se mais lentamente pela coluna. Seu volume de retenção é igual ao volume total do solvente Vt-

Arroz. 2.15. Modelo de separação molecular por medida em cromatografia de exclusão de tamanho

Todas as moléculas cujo tamanho seja maior que o tamanho dos poros sorventes não podem entrar neles (exclusão completa) e passar pelos canais entre as partículas. Elas eluem da coluna com o mesmo volume de retenção, igual ao volume da fase móvel V 0 - O coeficiente de partição para essas moléculas é zero.

Moléculas de tamanho intermediário, capazes de penetrar apenas alguns dos poros, ficam retidas na coluna de acordo com seu tamanho. O coeficiente de distribuição dessas moléculas varia de zero a um e caracteriza a fração do volume dos poros acessível às moléculas de um determinado tamanho. Seu volume retido é determinado pela soma do Vo e da porção acessível do volume dos poros.

ANÁLISE QUALITATIVA

Um cromatógrafo que entra no campo da cromatografia líquida de alta eficiência deve se familiarizar com os fundamentos da análise qualitativa. A análise qualitativa é utilizada para identificar um produto conhecido, obtido de forma nova ou encontrado em mistura com outros produtos." É necessária no isolamento de vários componentes de misturas biológicas e químicas complexas, o que é especialmente importante em medicina, ciência forense, ecologia, para monitorar a presença de alguns produtos químicos medicinais e seus metabólitos em bioml.ter.ials..„ A análise "Familiaridade com os fundamentos qualitativos" ajudará a evitar erros comuns, por exemplo/distinguir impurezas em uma amostra de impurezas em uma amostra. solvente ou verificação da pureza de uma substância em mais de um espectrofotômetro, mas em diferentes, etc.

Antes de prosseguir com a análise, é necessário determinar se toda a amostra foi eluída da coluna por um determinado sistema de solventes ou não. Para ter certeza da eluição completa, é necessário coletar todo o líquido que flui da coluna, evaporar o solvente, pesar o resíduo e determinar o grau de recuperação da amostra.

A identificação de componentes em HPLC pode ser feita de três maneiras: 1) utilizando informações de retenção; 2) examinar as zonas obtidas durante a separação em coluna cromatográfica líquida utilizando métodos de análise espectral ou química; 3) conecte diretamente o analisador de espectro à coluna.

O volume de retenção é usado para registrar picos em cromatografia. VR ou tempo de retenção tR. Ambas as quantidades são características de uma substância em um determinado sistema cromatográfico. Como o tempo de retenção da substância a ser separada consiste no tempo de interação na coluna e no tempo de passagem das seções vazias do tubo, varia de instrumento para instrumento. É conveniente ter uma substância não retida por uma determinada coluna, tomando-a como padrão cujo tempo de retenção e volume t 0 , V o. A cromatografia da substância e do padrão deve ser realizada nas mesmas condições (pressão e vazão). Quando identificadas pelos dados de retenção, substâncias individuais conhecidas que podem estar presentes nas amostras são separadas no mesmo sistema cromatográfico e são obtidos valores para elas. tR. Comparando esses valores tR com o tempo de retenção do pico desconhecido, verifica-se que ou coincidem, caso em que é provável que os picos correspondam à mesma substância, ou tR substância conhecida não corresponde tR zona desconhecida. Então uma estimativa aproximada dos valores ainda é possível tR substâncias que não estão disponíveis para medição direta do grau de sua retenção. Vamos considerar as duas opções.

No primeiro caso, é obviamente necessário um estudo preliminar da amostra para postular a presença de substâncias específicas nela. Ao trabalhar com misturas simples, não é difícil determinar se o grau de retenção das zonas da amostra e das substâncias conhecidas coincide ou não, ou seja, os valores tb iguais ou diferentes. No caso de misturas complexas, diversas substâncias podem eluir com valores semelhantes. tR, e as zonas realmente obtidas durante a separação cromatográfica se sobrepõem. Como resultado, obtendo valores precisos tR torna-se impossível para diferentes zonas. A confiabilidade da identificação aumenta com o aumento da resolução, controle mais cuidadoso das condições de separação e medição repetida de valores tR e calculando a média dos valores encontrados. Neste caso, a separação cromatográfica de substâncias conhecidas e desconhecidas deve alternar-se. Ao separar misturas complexas, o valor tR as substâncias podem mudar sob a influência da própria matriz da amostra. Este efeito é possível no início do cromatograma e quando os picos se sobrepõem; Também é possível estreitar as zonas, como já foi mencionado.

Nestes casos, o padrão deve ser adicionado à amostra na proporção de 1:1. Se as substâncias forem idênticas, o valor. tR o material de partida não muda e apenas um pico é obtido no cromatograma. Se você possui um dispositivo com sistema de cromatografia cíclica, para uma identificação confiável é aconselhável passar várias vezes a mistura pela coluna.

Informações sobre taxas de retenção também podem ser encontradas na literatura, mas o valor desta informação é limitado. Como colunas do mesmo lote apresentam baixa reprodutibilidade, os valores da literatura nem sempre correspondem ao valor verdadeiro tR nesta coluna. Para cromatografia de adsorção, entretanto, é possível prever tR com base em dados da literatura. Outra dificuldade associada ao uso de significados literários tR, - a dificuldade de encontrá-los na literatura especializada, embora as revisões bibliográficas publicadas no Jornal de Cromatografia possuam índice atualizado por tipo de substância.

No segundo caso, quando os tempos de retenção dos compostos conhecidos e das zonas amostrais não coincidem, é possível prever o tempo de retenção do componente desconhecido. As previsões de retenção relativa baseadas em dados de estrutura em cromatografia de exclusão estérica são bastante confiáveis. Eles são menos precisos em cromatografia de adsorção e partição, e especialmente quando se trabalha em uma fase quimicamente ligada. Para cromatografia de íons e pares iônicos de substâncias com p conhecido Ka Apenas determinações aproximadas de valores são possíveis tR. É sempre mais fácil prever a retenção relativa ou valores *x do que valores absolutos k". Valores relativos tR mais fácil de avaliar para compostos ou derivados relacionados, como ácidos alquilcarboxílicos substituídos ou derivados de benzeno.

Ao separar isocraticamente homólogos ou oligômeros, às vezes é observado o seguinte padrão:

\ valeu" = A + Bn,

Onde A E EM- constantes para um número de amostras selecionadas e para um determinado sistema cromatográfico (na mesma coluna, com as mesmas fases móvel e estacionária); P- o número de unidades estruturais idênticas na molécula da amostra.

A introdução de um grupo funcional / na molécula da amostra levará a uma mudança k" na primeira equação por algum coeficiente constante a/ em um determinado sistema cromatográfico. É possível obter constantes de grupo a/ para vários grupos substituintes/, cujos valores aumentarão com o aumento da polaridade dos grupos funcionais em todos os tipos de cromatografia, exceto fase reversa, onde os valores das constantes diminuirão com aumentando a polaridade.

Algumas constantes de grupo a/ para vários grupos substituintes/ são fornecidas na tabela. 9.1.

Na cromatografia de adsorção, a primeira equação nem sempre é aplicável, pois é válida desde que todos os isômeros tenham o mesmo valor k", o que nem sempre é observado. É possível, no entanto, representar graficamente o logfe" dos mesmos compostos em uma coluna versus o logfe" dos mesmos compostos em uma coluna diferente ou versus as características correspondentes em cromatografia em camada delgada, por exemplo, log[(l- RF) IRf].

Os valores do coeficiente de capacidade podem ser usados ​​ao comparar dados de retenção k", porque ao contrário dele tR a velocidade da fase móvel e as características geométricas da coluna não são afetadas.

As separações de fases quimicamente ligadas são semelhantes às separações por cromatografia de partição com fases semelhantes e, portanto, os dados de extração em estado estacionário podem ser usados ​​para prever tempos de retenção.

Na cromatografia de troca iônica, três fatores influenciam o grau de retenção: o grau de ionização de ácidos e bases, a carga da molécula ionizada e a capacidade da substância da fase móvel aquosa usada na cromatografia de troca iônica de migrar para o orgânico. Estágio. Este último depende do peso molecular do composto e da sua hidrofobicidade. Portanto, ácidos ou bases mais fortes são retidos mais fortemente durante a troca aniônica ou a separação por troca catiônica. Ao diminuir pK a de um ácido individual incluído na amostra, a retenção aumenta quando vários ácidos são separados devido à troca aniônica, e com um aumento em p/C o, a retenção de bases aumenta quando elas são separadas devido à troca catiônica.

Assim, a coincidência dos tempos de retenção de uma substância conhecida com a observada permite assumir a sua identidade. A confiabilidade da identificação aumenta se os cromatogramas de uma substância conhecida e de um componente desconhecido forem comparados sob condições diferentes. Se as substâncias se comportarem de forma idêntica na adsorção e na fase reversa ou na cromatografia de troca iônica e exclusão de tamanho, a confiabilidade da identificação aumenta. Se a confiabilidade da identificação com retenção relativa igual for de 90%, então ao estudar o comportamento das mesmas substâncias sob condições significativamente diferentes, a confiabilidade da identificação já é de 99%.

Uma característica valiosa de uma substância utilizada na identificação é a proporção dos sinais obtidos para uma determinada substância em dois detectores diferentes. A substância analisada, após sair da coluna, passa primeiro pelo primeiro detector, depois pelo segundo, e os sinais vindos dos detectores são registrados simultaneamente em um gravador multicaneta ou em dois gravadores. Normalmente, é usada uma conexão em série de um detector ultravioleta (mais sensível, mas seletivo) com um refratômetro, ou um detector ultravioleta com um detector de fluorescência, ou dois detectores ultravioleta operando em comprimentos de onda diferentes. A resposta relativa, isto é, a relação entre o sinal do refratômetro e o sinal do fotômetro, é uma característica da substância, desde que ambos os detectores operem em sua faixa linear; isso é testado pela administração de diferentes quantidades da mesma substância. Informações qualitativas podem ser obtidas trabalhando com detectores fotométricos equipados com um dispositivo de parada de fluxo que permite registrar o espectro do pico emergente da coluna enquanto está na célula de fluxo, comparando-o com o espectro de um composto conhecido.

Espectrofotômetros modernos, ainda caros, com conjunto de diodos são de interesse significativo na identificação.

Uma substância completamente desconhecida não pode ser identificada apenas por cromatografia líquida de alta eficiência; outros métodos também são necessários.

ANÁLISE QUANTITATIVA

A cromatografia líquida quantitativa é um método analítico bem desenvolvido que não é inferior em precisão à cromatografia gasosa quantitativa e excede significativamente a precisão da TLC ou eletroforese. Infelizmente, em HPLC não há detector que tenha sensibilidade próxima para compostos de diferentes estruturas químicas (). como um catarômetro no GLC). Portanto, para obter resultados quantitativos, a calibração do dispositivo é obrigatória.

A análise quantitativa consiste nas seguintes etapas: 1) separação cromatográfica; 2) medição de áreas ou alturas de pico; 3) cálculo da composição quantitativa da mistura com base em dados cromatográficos; 4) interpretação dos resultados obtidos, ou seja, processamento estatístico. Vamos considerar todas essas etapas.

4.1. SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

Erros podem ser cometidos durante a coleta da amostra. É especialmente importante evitar erros e obter uma amostra representativa adequada de sólidos heterogêneos, substâncias voláteis ou instáveis, e produtos agrícolas e biomateriais. Amostras heterogêneas, por exemplo produtos alimentícios, são cuidadosamente misturadas e divididas em quartos. Ao realizar esta operação muitas vezes, a homogeneidade da amostra é alcançada.

Erros e perdas de substâncias podem ser cometidos na fase de extração, isolamento, purificação, etc.

As amostras devem ser completamente dissolvidas e suas soluções preparadas com uma precisão de ±0,1%. É aconselhável dissolver a amostra na fase móvel, o que eliminará a possibilidade de sua precipitação após introdução no cromatógrafo. Se a dissolução na fase móvel não for possível, deve ser utilizado um solvente miscível com esta e devem ser introduzidos volumes de amostra (menos de 25 µl) no cromatógrafo.

Erros significativos podem ocorrer durante a injeção da amostra devido ao fracionamento da amostra, vazamento e manchas de pico. A indefinição dos picos provoca a formação de caudas, levando à sobreposição parcial dos picos e, consequentemente, a erros na detecção. Os dispositivos de válvula de loop são preferíveis às seringas para introdução de amostras em análises quantitativas devido à maior precisão e menor dependência do operador.

Na separação cromatográfica de substâncias também podem surgir complicações que levam à distorção dos dados: análise quantitativa. Pode haver decomposição ou conversão da amostra durante o processo cromatográfico ou adsorção irreversível da substância na coluna. É importante garantir a ausência destes fenómenos indesejáveis ​​e, se necessário, regenerar a coluna ou substituí-la. A sobreposição de picos e a cauda também podem ser reduzidas variando as condições cromatográficas.

Picos com formas falsas ou pouco claras, bem como picos cujo tempo de liberação está próximo de para, uma vez que a sua separação pode não ser suficiente. Normalmente, são utilizados picos com valor d"^0,5. A maior eficiência da coluna é alcançada pela introdução de 10~ 5 -10~ 6 g de substância dissolvida por 1 g de sorvente. Ao introduzir grandes quantidades de amostra, a dependência de a altura do pico na carga pode revelar-se não linear e é necessária uma avaliação quantitativa das áreas de pico.

Erros associados à detecção ou amplificação levam a distorções significativas dos resultados da separação cromatográfica. Cada detector é caracterizado pela especificidade, linearidade e sensibilidade. O teste de seletividade é especialmente importante ao analisar vestígios de impurezas. A resposta dos detectores UV pode variar por um fator de 104 para substâncias com grupos funcionais semelhantes. É necessário calibrar a resposta do detector para cada analito. Naturalmente, as substâncias que não absorvem na região UV não darão sinal ao gravador quando usadas como detector de fotômetro. Ao usar um refratômetro, podem aparecer picos negativos. Além disso, este detector deve ser termostatizado, o que não é necessário para o detector UV.

A linearidade do detector determina o tamanho da amostra injetada. É importante lembrar que a taxa de fluxo da coluna, as temperaturas da coluna e do detector e o design do detector afetam a precisão da análise quantitativa. Erros na transmissão de um sinal elétrico para um dispositivo de saída (gravador), integrador ou computador podem surgir devido à indução de ruído, falta de aterramento, flutuações de tensão na rede, etc.

4.2. MEDIÇÃO DE ÁREA DE PICO OU ALTURA

Altura do pico h (Fig. 10.1) é a distância do topo do pico até a linha de base, medida linearmente ou contando o número de divisões em um registrador; Alguns integradores eletrônicos e computadores fornecem informações sobre as alturas dos picos. A posição da linha de base dos picos deslocados é encontrada interpolando os valores ordenados correspondentes ao início e final do pico (pico 1 e 3 veja a fig. 10.1). Para melhorar a precisão, é necessário ter uma linha de base plana e estável. No caso de picos não divididos, a linha de base é traçada entre o início e o fim do pico, em vez de ser substituída por uma linha zero. Como as alturas dos picos são menos dependentes da influência de picos adjacentes sobrepostos, a estimativa da altura dos picos é mais precisa e quase sempre usada na análise de traços.

A área de pico pode ser determinada de várias maneiras. Vejamos alguns deles.

1. O método planimétrico envolve traçar o pico com um planímetro portátil, que é um dispositivo que determina mecanicamente a área do pico. O método é preciso, mas trabalhoso e pouco reprodutível. Este método não é recomendado.

2. Método de silhueta de papel - o pico é cortado e pesado. O método é altamente reprodutível, mas trabalhoso, e o cromatograma é destruído. Sua aplicabilidade depende da uniformidade da faixa do gráfico. O método também não pode ser amplamente recomendado.

4. O método de triangulação consiste em construir um triângulo traçando tangentes aos lados do pico. O topo do triângulo é mais alto que o topo do pico. Aumentar a área formada por este vértice estendido será consistente em todo o cromatograma e não afetará muito a precisão. Além disso, alguma área perdida ao desenhar tangentes será compensada. A base do triângulo é determinada pela intersecção das tangentes com a linha de base, e a área é determinada pelo produto de 7 g da base pela altura. Este método é o melhor para determinar as áreas de picos assimétricos. Porém, a reprodutibilidade na construção de tangentes por diferentes operadores é diferente e, portanto; baixo.

5. O método do integrador de disco é baseado em um dispositivo eletromecânico conectado a um gravador. A caneta presa ao integrador se move ao longo de uma tira na parte inferior da fita a uma velocidade proporcional ao movimento da caneta gravadora.

Tal como acontece com as medições manuais, o pico deve permanecer na escala do gravador, mas os ajustes para compensar as mudanças na linha de base e a separação incompleta dos picos adjacentes reduzem a confiabilidade e aumentam o tempo de análise.

O método é mais preciso que os métodos de medição manual, especialmente para picos assimétricos, e oferece uma vantagem de velocidade. Além disso, fornece um registro quantitativo permanente da análise.

6. Métodos que usam integradores eletrônicos que determinam a área do pico e imprimem informações sobre essa área e tempos de retenção podem incluir correção de deslocamento da linha de base e determinar a área de picos apenas parcialmente separados. As principais vantagens são precisão, velocidade e independência de ação da operação do gravador. Os integradores possuem memória e podem ser programados para uma análise específica através de um programa pré-instalado. As vantagens do integrador incluem a capacidade de usar fatores de correção para a resposta do detector ao recalcular os dados originais nas áreas de pico, compensando diferenças na sensibilidade do detector a diferentes substâncias. Esses sistemas economizam tempo, melhoram a precisão analítica e são úteis para análises analíticas de rotina.

7. Na cromatografia líquida, os computadores são amplamente utilizados para medir áreas de pico. Eles imprimem uma mensagem completa, incluindo os nomes das substâncias, áreas de pico, tempos de retenção, fatores de correção de resposta do detector e abundância (% em peso) para os vários componentes da amostra.

Cromatografia liquida é um método para separar e analisar misturas complexas de substâncias nas quais um líquido serve como fase móvel. É aplicável à separação de uma gama mais ampla de substâncias do que a cromatografia gasosa. Isso se deve ao fato de que a maioria das substâncias não são voláteis, muitas delas são instáveis ​​​​em altas temperaturas (especialmente compostos de alto peso molecular) e se decompõem quando convertidas ao estado gasoso. A separação de substâncias por cromatografia líquida é geralmente realizada à temperatura ambiente.

As características de todos os tipos de cromatografia líquida se devem ao fato de que a fase móvel nela é líquida e a sorção dos componentes do eluente gasoso e líquido ocorre de maneira diferente. Se na cromatografia gasosa o gás de arraste desempenha apenas uma função de transporte e não é sorvido pela fase estacionária, então a fase móvel líquida na cromatografia líquida é um eluente ativo, suas moléculas podem ser sorvidas pela fase estacionária; Ao passar pela coluna, as moléculas dos componentes da mistura analisada localizadas no eluente devem deslocar as moléculas do eluente da camada superficial do sorvente, o que leva a uma diminuição na energia de interação das moléculas do analito com a superfície do sorvente. Portanto, os valores dos volumes retidos V R, proporcional à mudança na energia livre do sistema, é menor na cromatografia líquida do que na cromatografia gasosa, e a faixa de linearidade da isoterma de sorção na cromatografia líquida é mais ampla.

Ao utilizar diferentes eluentes, os parâmetros de retenção e seletividade do sistema cromatográfico podem ser alterados. A seletividade na cromatografia líquida, diferentemente da cromatografia gasosa, é determinada não por um, mas por dois fatores - a natureza das fases móvel (eluente) e estacionária.

A fase móvel líquida tem densidade e viscosidade maiores que a fase gasosa, coeficientes de difusão D e 3–4 ordens de magnitude menor do que no gás. Isto leva a uma transferência de massa mais lenta na cromatografia líquida em comparação com a cromatografia gasosa. A equação de Van Deemter devido ao fato de que o termo EM não desempenha um papel na cromatografia líquida ( D e  D G), a dependência gráfica da eficiência também muda N da vazão linear da fase móvel tem a forma mostrada na Fig. 1.9.

Na versão clássica da cromatografia líquida em coluna, a amostra analisada dissolvida no eluente é introduzida em uma coluna de vidro de 1–2 m de altura, preenchida com um sorvente com tamanho de partícula de 100 μm e um eluente, e o eluente é passado , selecionando porções do eluato na saída da coluna. Esta versão da cromatografia líquida ainda é utilizada na prática laboratorial, mas como a taxa de passagem do eluente sob a influência da gravidade é baixa, a análise é demorada.

A versão moderna da cromatografia líquida, a chamada cromatografia líquida de alta eficiência HPLC, usa sorventes volumétricos e superficialmente porosos com tamanho de partícula de 5 a 10 mícrons, bombas de injeção que fornecem pressão do sistema de até 400 atm e detectores altamente sensíveis. A rápida transferência de massa e a alta eficiência de separação tornam possível o uso de HPLC para a separação de moléculas (adsorção líquida e cromatografia de partição líquido-líquido), para a separação de íons (cromatografia de troca iônica, íon, par de íons), para a separação de macromoléculas (cromatografia de exclusão de tamanho).

1.3. RETENÇÃO E FORÇA DE SOLVENTE

Para que as substâncias analisadas sejam separadas na coluna, conforme mencionado acima, o coeficiente de capacidade k" deve ser maior que 0, ou seja, as substâncias devem ser retidas pela fase estacionária, o sorvente. Porém, o coeficiente de capacidade não deve ser muito grande para obter um tempo de eluição aceitável. Se para uma determinada mistura de substâncias for selecionada uma fase estacionária que as retenha, então o trabalho adicional no desenvolvimento de uma técnica de análise consiste em escolher um solvente que idealmente forneça um solvente diferente, mas aceitável. não muito grande k ". Isto é conseguido alterando a força de eluição do solvente.

No caso de cromatografia de adsorção em sílica gel ou óxido de alumínio, via de regra, a força de um solvente de dois componentes (por exemplo, hexano com adição de isopropanol) é aumentada aumentando o teor do componente polar (isopropanol), ou diminuída pela diminuição do teor de isopropanol. Se o conteúdo do componente polar ficar muito baixo (menos de 0,1%), ele deverá ser substituído por uma força de eluição mais fraca. O mesmo é feito, substituindo um componente polar ou um apolar por outros, mesmo que este sistema não proporcione a seletividade desejada em relação aos componentes de interesse da mistura. Ao selecionar sistemas de solventes, são levadas em consideração tanto a solubilidade dos componentes da mistura quanto as séries eluotrópicas de solventes compiladas por diferentes autores.

A força do solvente é selecionada aproximadamente da mesma forma quando se utilizam fases polares enxertadas (nitrila, amino, diol, nitro, etc.), levando em consideração possíveis reações químicas e excluindo solventes perigosos para a fase (por exemplo, aldeídos e cetonas para a fase amino).

No caso da cromatografia de fase reversa, a concentração do solvente é aumentada pelo aumento do teor do componente orgânico no eluente (metanol, acetonitrila ou THF) e diminuída pela adição de mais água. Caso não seja possível atingir a seletividade desejada, utilizam outro componente orgânico ou tentam alterá-lo com diversos aditivos (ácidos, reagentes de pares iônicos, etc.).

Nas separações por cromatografia de troca iônica, a força do solvente é alterada aumentando ou diminuindo a concentração da solução tampão ou alterando o pH, em alguns casos, utiliza-se a modificação com substâncias orgânicas;

No entanto, especialmente no caso de misturas naturais e biológicas complexas, muitas vezes não é possível selecionar a concentração do solvente de modo que todos os componentes da amostra eluam dentro de um período de tempo aceitável. Então você tem que recorrer à eluição gradiente, ou seja, use um solvente cuja força de eluição mude durante o processo de análise, de modo que aumente constantemente de acordo com um programa predeterminado. Esta técnica permite conseguir a eluição de todos os componentes de misturas complexas num período de tempo relativamente curto e a sua separação em componentes na forma de picos estreitos.

1.6.1. Cromatografia líquida de adsorção. A cromatografia líquida de adsorção, dependendo da polaridade das fases estacionária e móvel, é dividida em cromatografia de fase normal (NPC) e de fase reversa (RPC). No NPC utiliza-se um adsorvente polar e fases móveis apolares, no OPC utiliza-se um adsorvente apolar e fases móveis polares, mas em ambas as opções a escolha da fase móvel é muitas vezes mais importante do que a escolha da fase móvel. fase estacionária. A fase estacionária deve reter as substâncias que estão sendo separadas. A fase móvel, isto é, o solvente, deve fornecer capacidades de coluna variadas e separação eficiente dentro de um tempo aceitável.

Materiais porosos polares e não polares finamente dispersos com uma área superficial específica superior a 50 m 2 /g são usados ​​​​como fase estacionária na cromatografia líquida de adsorção. Adsorventes polares (SiO 2 , Al 2 O 3 , florisil, etc.) possuem grupos ácidos fracos na superfície que podem reter substâncias com propriedades básicas. Esses adsorventes são usados ​​principalmente para a separação de compostos apolares e moderadamente polares. A desvantagem é a alta sensibilidade ao teor de água dos eluentes utilizados. Para eliminar esta desvantagem, os sorventes polares são tratados com aminas, dióis e outros reagentes, resultando no enxerto superficial destes reagentes, modificação da superfície e alteração na seletividade em relação aos analitos.

Adsorventes não polares (negro de fumo grafitado, terra diatomácea, kieselguhr) não são seletivos em relação às moléculas polares. Para obter adsorventes não polares, grupos não polares são frequentemente enxertados na superfície de, por exemplo, gel de sílica, por exemplo, alquilsilil -SiR 3, onde os grupos R-alquil são C 2 -C 22.

A fase móvel deve dissolver completamente a amostra analisada, ter baixa viscosidade (para que os coeficientes de difusão sejam suficientemente grandes) e é desejável que dela seja possível isolar os componentes separados. Deve ser inerte em relação aos materiais de todas as partes do cromatógrafo, seguro, barato e adequado para o detector.

As fases móveis usadas na cromatografia líquida variam em sua força de eluição. A força de eluição de um solvente mostra quantas vezes a energia de sorção de um determinado eluente em um determinado adsorvente é maior que a energia de sorção do eluente escolhido como padrão, por exemplo, n-heptano. Solventes fracos são mal adsorvidos pela fase estacionária, portanto os coeficientes de distribuição das substâncias sorvidas (sorbato) são altos. Pelo contrário, solventes fortes são bem adsorvidos, de modo que os coeficientes de partição de sorbato são baixos. Quanto mais forte o solvente, maior será a solubilidade da amostra analisada nele e mais forte será a interação solvente-sorbato.

Para garantir alta eficiência de separação em uma coluna, é necessário selecionar uma fase móvel que tenha uma polaridade ideal para a mistura a ser separada nas condições de separação selecionadas. Normalmente, é selecionada primeiro uma fase estacionária que tenha uma polaridade próxima daquela dos componentes que estão sendo separados. Em seguida é selecionada a fase móvel, garantindo que o coeficiente de capacidade k" acabou por estar na faixa de 2 a 5. Se a polaridade da fase móvel estiver muito próxima da polaridade da fase estacionária, o tempo de retenção dos componentes será muito curto, e se as polaridades da fase móvel e estacionária as fases são muito diferentes, o tempo de retenção será muito longo.

Na seleção das fases móveis, elas são guiadas pelas chamadas séries eluotrópicas, baseadas no uso de índices de polaridade Snyder R", que divide todos os solventes em fortes (polares) e fracos (fracamente polares e apolares). A escala de polaridade é baseada na solubilidade das substâncias utilizadas como fases móveis em dioxano, nitrometano e etanol.

A Tabela 1.2 mostra os valores dos índices de polaridade e força de eluição (em relação ao SiO 2) para vários solventes mais frequentemente utilizados em cromatografia líquida como fases móveis. Os limites de transparência de comprimento de onda curto desses solventes também são indicados aqui, o que facilita a seleção das condições para detecção dos componentes da mistura.

Tabela 1.2

Características dos solventes utilizados em cromatografia líquida

Solvente	Índice de polaridade	Força de eluição (SiO 2)	Limite de transparência de comprimento de onda curto
Fluoroalcano
Ciclohexano
n-Hexano
Tetracloreto de carbono
Éter diisopropílico
Éter dietílico
Diclorometano
Tetrahidrofurano
Clorofórmio
Ácido acético
Acetonitrila
Nitrometano

Na cromatografia líquida, são frequentemente utilizadas misturas deles em vez de solventes individuais. Freqüentemente, pequenas adições de outro solvente, especialmente água, aumentarão significativamente a resistência do eluente.

Ao separar misturas multicomponentes, uma única fase móvel como eluente pode não separar todos os componentes da amostra num tempo aceitável. Neste caso, utiliza-se um método de eluição gradual ou gradiente, no qual eluentes cada vez mais fortes são utilizados sequencialmente durante o processo de cromatografia, o que permite eluir substâncias altamente retidas em menos tempo.

Na cromatografia líquida existem alguns empírico regras que são muito úteis na escolha de um eluente:

- a sorção de um composto, via de regra, aumenta com o aumento do número de ligações duplas e grupos OH nele contidos;

 a sorção diminui em vários compostos orgânicos: ácidos álcooisaldeídoscetonaséstereshidrocarbonetos insaturadoshidrocarbonetos saturados;

 para separar substâncias de polaridade diferente e separar substâncias de diferentes classes, utiliza-se a cromatografia de fase normal: a amostra analisada é dissolvida e eluída com um eluente apolar, compostos de diferentes classes saem da coluna com um adsorvente polar em momentos diferentes, enquanto o tempo de retenção de compostos com diferentes grupos funcionais aumenta durante a transição de compostos apolares para compostos fracamente polares. Para moléculas muito polares os tempos de retenção são tão longos que a análise não é possível com um eluente não polar. Para reduzir o tempo de retenção dos componentes polares, mude para eluentes polares;

 na versão de fase reversa, a fase estacionária (adsorvente apolar) adsorve mais fortemente o componente apolar dos eluentes polares, por exemplo, da água;

- Ao reduzir a polaridade do eluente adicionando um solvente menos polar, a retenção de componentes pode ser reduzida.

1.6.2. Cromatografia líquida de partição. Na partição ou cromatografia líquido-líquido, a separação dos componentes da amostra analisada se deve a diferenças nos coeficientes de sua distribuição entre duas fases líquidas imiscíveis, uma das quais é estacionária e localizada na superfície ou nos poros de um sólido portadora estacionária e a segunda é móvel.

Em termos da natureza das forças de interação que determinam a distribuição diferente entre as duas fases de substâncias que diferem na sua estrutura química, a cromatografia de partição é semelhante à cromatografia de adsorção, ou seja, também aqui a separação é baseada na diferença no forças de interação intermolecular entre os componentes da amostra analisada e as fases líquidas estacionárias e móveis.

Dependendo da técnica, a cromatografia de partição, assim como a cromatografia de adsorção, pode ser em coluna ou planar (papel ou camada fina).

Substâncias indiferentes ao solvente móvel e aos componentes da amostra analisada, mas capazes de reter a fase estacionária na superfície e nos poros, são utilizadas como carreadores sólidos. Na maioria das vezes, substâncias polares (celulose, sílica gel, amido) são usadas como transportadores. Uma fase estacionária – um solvente polar, geralmente água ou álcool – é aplicada a eles. Neste caso, substâncias menos polares ou apolares (álcoois, aminas, cetonas, hidrocarbonetos, etc.) são utilizadas como fases móveis. Este tipo de cromatografia de partição é chamada fase normal. É usado para separar substâncias polares.

A segunda versão da cromatografia de partição difere porque transportadores não polares (borracha, fluoroplástico, sílica gel hidrofobizada) são usados ​​​​como fase sólida estacionária, solventes não polares (hidrocarbonetos) são usados ​​​​como fase líquida estacionária e solventes polares (álcoois , aldeídos) são usados ​​como fase líquida móvel, cetonas, etc., geralmente água). Esta versão da cromatografia de partição é chamada fase invertida e é usado para separar substâncias apolares.

Para conseguir a separação ideal dos componentes da amostra analisada, a seleção da fase móvel é muito importante. Os solventes (fases líquidas móveis e estacionárias) devem ser selecionados de modo que os coeficientes de distribuição dos componentes da mistura difiram significativamente. Os seguintes requisitos se aplicam às fases líquidas: requisitos:

1) os solventes utilizados devem dissolver bem as substâncias a serem separadas, e sua solubilidade na fase estacionária deve ser maior que na fase móvel;

2) os solventes utilizados como fases móvel e estacionária devem ser mutuamente saturados, ou seja, a composição do solvente deve ser constante durante a passagem pela coluna;

3) a interação dos solventes utilizados como fase móvel com a fase estacionária deve ser mínima.

Na maioria das vezes, na cromatografia líquida de partição, não substâncias individuais, mas suas misturas em várias proporções são usadas como fases líquidas móveis. Isto permite regular a polaridade da fase móvel, alterar a proporção das polaridades das fases móvel e estacionária e alcançar condições ideais para a separação dos componentes de uma determinada mistura em análise.

Uma desvantagem significativa deste método cromatográfico é que a fase líquida estacionária aplicada é rapidamente removida do veículo. Para eliminá-lo, o solvente utilizado como fase móvel é saturado com uma substância utilizada como fase líquida estacionária, ou a fase líquida estacionária é estabilizada enxertando-a no transportador.

Uma variação da cromatografia líquida de partição é o método HPLC amplamente utilizado.

Os sistemas cromatográficos mais comuns são sistemas que possuem um princípio de montagem modular. Bombas, dispositivos de desgaseificação, detectores, dispensadores (amostradores automáticos), termostatos de coluna, coletores de frações, unidades de controle do sistema cromatográfico e dispositivos de registro estão disponíveis como módulos separados. Uma ampla seleção de módulos permite resolver com flexibilidade vários problemas analíticos e alterar rapidamente a configuração do sistema, se necessário, com custos mínimos. Ao mesmo tempo, também são produzidos LCs monomodulares (integrados), cuja principal vantagem é a miniaturização de unidades individuais e a compactação do dispositivo.

Dependendo do método de eluição, os cromatógrafos líquidos são divididos em isocráticos e gradientes.

Esquema de um cromatógrafo isocrático

A fase móvel do recipiente (1) através do filtro de entrada (9) é fornecida por uma bomba de alta pressão de precisão (2) ao sistema de injeção de amostra (3) - um injetor manual ou amostrador automático, e a amostra também é introduzida lá . A seguir, através de um filtro em linha (8), a amostra com corrente da fase móvel entra no elemento (elementos) de separação (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. Em seguida, o eluato entra no detector (5) e é removido para o recipiente de drenagem (7). Quando o eluato flui através do circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transferidos para um gravador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema), a partir dos teclados de cada um dos módulos do sistema ou por um programa de controle a partir de um computador pessoal.

No caso da eluição gradiente, são utilizados dois tipos fundamentalmente diferentes de cromatógrafos líquidos. Eles diferem no ponto em que o gradiente da composição da fase móvel é formado.

Esquema de um cromatógrafo gradiente com formação de um gradiente da composição da fase móvel em uma linha de baixa pressão.

A fase móvel dos recipientes (1) através de filtros de entrada (9) e um programador de gradiente (10) é fornecida por uma bomba de alta pressão de precisão (2) ao sistema de injeção de amostra (3) - um injetor manual ou amostrador automático, e o amostra também é introduzida lá. A operação das válvulas programadoras de gradiente é controlada pelo módulo de controle do sistema (bomba ou controlador) ou por um programa de controle de PC. Sistemas deste tipo formam um gradiente binário, tridimensional e quadridimensional. A forma da função de processamento de gradiente depende do módulo de controle ou programa de controle específico, bem como da funcionalidade dos módulos controlados e de controle. A seguir, através de um filtro em linha (8), a amostra com corrente da fase móvel entra no elemento (elementos) de separação (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. Em seguida, o eluato entra no detector (5) e é removido para o recipiente de drenagem (7). Quando o eluato flui através do circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transferidos para um gravador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema) ou realizado por um programa de controle a partir de um computador pessoal. No caso de controle por módulo de controle, é possível controlar o detector de forma independente a partir de seu próprio teclado.

Apesar da aparente atractividade de tais sistemas (utilizam apenas uma bomba de alta pressão de precisão), estes sistemas apresentam uma série de desvantagens, entre as quais a principal, talvez, seja a estrita necessidade de desgaseificação completa dos componentes da fase móvel, mesmo antes da misturador de baixa pressão (câmara do programador de gradiente). É realizado por meio de desgaseificadores de fluxo especiais. Devido a este facto, o seu custo torna-se comparável a outro tipo de sistemas gradientes - sistemas com a formação de uma composição gradiente de fase móvel numa linha de alta pressão.

A diferença fundamental entre sistemas com formação de composição gradiente de fase móvel em linha de alta pressão é a mistura dos componentes na linha de alta pressão naturalmente, com esta abordagem o número de bombas de precisão é determinado pelo número de tanques; para misturar a fase móvel. Com esta abordagem, os requisitos para a desgaseificação completa dos componentes são significativamente reduzidos.

Esquema de um cromatógrafo gradiente com formação de um gradiente da composição da fase móvel em uma linha de alta pressão.

A fase móvel dos recipientes (1) através dos filtros de entrada (9) é fornecida por bombas de precisão de alta pressão (2 e 11) através de um misturador de fluxo estático ou dinâmico (10) para o sistema de entrada de amostras (3) - um injetor manual ou amostrador automático, e a amostra também é introduzida lá. A operação das bombas controladas é controlada pelo módulo de controle do sistema (bomba mestre ou controlador) ou por um programa de controle de PC. Neste caso, todas as bombas são controláveis. Sistemas deste tipo formam um gradiente binário ou tridimensional. A forma da função de processamento de gradiente depende do módulo de controle ou programa de controle específico, bem como da funcionalidade dos módulos controlados e de controle. A seguir, através de um filtro em linha (8), a amostra com corrente da fase móvel entra no elemento (elementos) de separação (4) - através da pré-coluna na coluna de separação. O eluato então entra no detector (5) e é removido para o recipiente de drenagem (7). Quando o eluato flui através do circuito de medição do detector, o cromatograma é registrado e os dados são transferidos para um gravador analógico (gravador) (6) ou outro sistema de coleta e processamento de dados cromatográficos (integrador ou computador). Dependendo do design dos módulos funcionais, o sistema pode ser controlado a partir do teclado do módulo de controle (geralmente uma bomba ou controlador do sistema) ou realizado por um programa de controle a partir de um computador pessoal. No caso de controle por módulo de controle, é possível controlar o detector de forma independente a partir de seu próprio teclado.

Os esquemas propostos são bastante simplificados. Os sistemas podem incluir dispositivos adicionais - um termostato de coluna, sistemas de derivatização pós-coluna, sistemas de preparação e concentração de amostras, um reciclador de solvente, sistemas de membrana para suprimir a condutividade elétrica de fundo (para cromatografia iônica), sistemas de proteção adicionais (filtros, colunas), etc. Os diagramas também não mostram os módulos manométricos separadamente. Via de regra, esses dispositivos são integrados às unidades de bombeamento. Estas unidades podem combinar várias bombas, uma bomba com um programador de gradiente e um controlador de sistema comum. A estrutura do sistema depende da sua configuração e de cada fabricante específico.

Uma complicação tão radical do suporte técnico do processo cromatográfico leva ao surgimento de uma série de requisitos para as propriedades da fase móvel que estão ausentes na coluna clássica e na cromatografia planar. A fase líquida deve ser adequada para detecção (ser transparente em uma determinada região do espectro ou ter baixo índice de refração, certa condutividade elétrica ou constante dielétrica, etc.), inerte aos materiais das partes do trato cromatográfico, não formar gás bolhas nas válvulas da bomba e na célula do detector, não possuem impurezas mecânicas.

Em cromatografia líquida Muitos tipos de bombas são usados. Para LC de baixa pressão, bombas peristálticas são frequentemente utilizadas (Fig. 1).

Figura 1 Bomba peristáltica programável MasterFlex.

Na HPLC, bombas de alta pressão são utilizadas para garantir o fluxo da fase móvel através da coluna com os parâmetros especificados.

As características técnicas mais importantes das bombas HPLC incluem: faixa de vazão; pressão máxima de trabalho; reprodutibilidade do fluxo; faixa de pulsação do fornecimento de solvente.

Dependendo da natureza do fornecimento de solvente, as bombas podem ter fornecimento (fluxo) constante e pressão constante. Basicamente, durante o trabalho analítico, é utilizado um modo de vazão constante e, no enchimento de colunas, é utilizado um modo de pressão constante.

Com base no seu princípio de funcionamento, as bombas HPLC são divididas em: seringa e assim por diante desentupidor retribuindo .

Bombas de seringa

A principal característica distintiva destas bombas é a natureza cíclica do seu funcionamento e, portanto, os cromatógrafos em que estas bombas são utilizadas também se distinguem pelo seu funcionamento cíclico.

Arroz. 2. Projeto básico de uma bomba de seringa para HPLC.

Arroz. 2A. Bomba de seringa.

A unidade de controle BU fornece tensão ao motor D, que determina a velocidade e o sentido de sua rotação. A rotação do motor através da caixa de velocidades P é convertida no movimento do pistão P dentro do cilindro D. A bomba funciona em 2 ciclos. Durante o ciclo de enchimento, a válvula K2 está fechada, K1 está aberta, o solvente flui do reservatório para o cilindro C. No modo de alimentação, a válvula K1 está fechada e através da válvula K2 a fase móvel entra no dispositivo de dosagem.

As bombas deste tipo são caracterizadas por uma quase completa ausência de pulsações no fluxo da fase móvel durante a operação.

Desvantagens da bomba:

a) alto consumo de tempo e solvente para lavagem na troca de solvente;

b) o volume do PF é limitado pelo volume da seringa e, portanto, o tempo de separação é limitado;

c) suspensão da separação durante o enchimento da bomba;

d) grandes dimensões e peso, garantindo alto fluxo e pressão (são necessários um motor potente e uma grande força de pistão com sua grande área).

Bombas de êmbolo alternativo.

Arroz. 3. Projeto básico de uma bomba de êmbolo.

Princípio de funcionamento.

O motor D, através da caixa de engrenagens P, coloca o êmbolo P em movimento alternativo, movendo-se na cabeça de trabalho da bomba. As válvulas K1 e K2 abrem quando a bomba está nas fases de sucção e entrega, respectivamente. A quantidade de alimentação volumétrica é determinada por três parâmetros: o diâmetro do êmbolo (geralmente 3,13; 5,0; 7,0 mm), sua amplitude (12-18 mm) e frequência (que depende da velocidade de rotação do motor e da caixa de câmbio).

Bombas deste tipo fornecem um fornecimento volumétrico constante da fase móvel por um longo período. Pressão máxima de operação 300-500 atm, vazão 0,01-10 ml/min. Repetibilidade de alimentação volumétrica -0,5%. A principal desvantagem é que o solvente é fornecido ao sistema na forma de uma série de pulsos sucessivos, portanto há pulsações de pressão e fluxo (Fig. 4). Esta é a principal razão para o aumento do ruído e a redução da sensibilidade de quase todos os detectores utilizados em LC, especialmente os eletroquímicos.

Figura 4. Pulsações da bomba de êmbolo.

Maneiras de lidar com pulsações.

1. Aplicação de dispositivos de amortecimento.

São tubos espirais de perfil especial em aço inoxidável, conectados em série ou paralelo ao sistema entre a bomba e o dispensador.

Arroz. 5. Amortecedor espiral.

O amortecedor desenrola-se à medida que a pressão aumenta (aceleração da bomba). Quando a pressão cai, ele enrola, seu volume diminui, espreme parte do solvente, mantendo uma vazão constante e reduzindo as pulsações. Este amortecedor funciona bem em pressões de 50 atm e superiores.

A uma pressão de 5-30 atm, suaviza melhor as pulsações amortecedor de ar, feito a partir de uma coluna (Fig. 6.). O ar na coluna amortecida (6x200 mm) é comprimido e as pulsações são amortecidas. O ar se dissolve nele em 24 horas.

Arroz. 6. Amortecedor de ar.

2. Aplicação de dispositivos eletrônicos.

Ao usar um sensor de pressão eletrônico, você pode usar as leituras do sensor para controlar a operação da bomba. Quando a pressão cai, a rotação do motor aumenta e compensa a diminuição da pressão. Também é possível compensar vazamentos nas válvulas e parcialmente nos manguitos. O uso de um amortecedor eletrônico (BPZh-80, KhPZh-1, etc.) permite reduzir as pulsações de pressão para 1 atm a uma pressão de 100-150 kgf/cm2.

1.6.3. Cromatografia de troca iônica, íon, par iônico. Os métodos de troca iônica, cromatografia de íons e pares de íons são baseados no processo dinâmico de substituição de íons associados à fase estacionária por íons eluentes que entram na coluna. O principal objetivo do processo cromatográfico é a separação de íons inorgânicos ou orgânicos do mesmo signo. A retenção nestes tipos de cromatografia é determinada pela mudança na energia livre da reação de troca iônica. A proporção das concentrações de íons trocados em solução e na fase sorvente é caracterizada pelo equilíbrio de troca iônica. Troca iônica é que algumas substâncias (trocadores de íons), quando imersas em uma solução eletrolítica, absorvem dela cátions ou ânions, liberando na solução uma quantidade equivalente de outros íons com carga de mesmo sinal. Ocorre uma troca de cátions entre o trocador de cátions e a solução, e uma troca de ânions ocorre entre o trocador de ânions e a solução.

Os trocadores de cátions são, na maioria das vezes, substâncias poliméricas insolúveis especialmente sintetizadas contendo em sua estrutura grupos ionogênicos de natureza ácida: –SO 3 H; –COOH; -OH; –PO3H2; –AsO 3 H 2 .

As fórmulas químicas dos trocadores de cátions podem ser representadas esquematicamente como R-SO 3 H; R-SO3Na. No primeiro caso, o trocador de cátions está na forma H, no segundo, na forma Na. R – matriz polimérica.

As reações de troca catiônica são escritas como reações químicas heterogêneas comuns:

RNa +Na + RNa+H +

Os trocadores de ânions contêm em sua estrutura grupos ionogênicos básicos: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + etc. Suas fórmulas químicas podem ser representadas como RNH 3 OH e RNH 3 Cl ou ROH, RCl. No primeiro caso, o trocador aniônico está na forma OH, no segundo caso, na forma Cl. A reação de troca aniônica pode ser escrita da seguinte forma:

R–OH+Cl – RCl+OH –

São conhecidos trocadores de íons anfotéricos que contêm grupos ácidos e básicos em sua estrutura. Trocadores de íons contendo grupos ácidos (básicos) do mesmo tipo (por exemplo, SO 3 H) são chamados de monofuncionais; trocadores de íons contendo diferentes tipos (por exemplo, SO 3 H, OH) de grupos ácidos (básicos) são polifuncionais.

Trocadores de íons monofuncionais são obtidos por reação de polimerização. A reação de policondensação permite obter trocadores iônicos multifuncionais. Para que os trocadores de íons resultantes tenham características de desempenho suficientemente altas, eles devem ser insolúveis, mas inchados no solvente apropriado e ter um número suficientemente grande de grupos ionogênicos capazes de trocar com grupos ionogênicos da amostra analisada. Isto pode ser conseguido se as cadeias poliméricas resultantes forem suficientemente ramificadas e ligadas entre si por pontes de reticulação. Por exemplo, na produção de trocadores de cátions do tipo polimerização à base de estireno, o divinilbenzeno é mais frequentemente usado como agente de reticulação, cuja introdução em uma quantidade de até 16% garante a produção de trocadores de íons com vários graus de inchaço e , portanto, permite regular a porosidade do trocador iônico. O grau de inchaço do trocador de íons, expresso em mililitro/grama, é o volume de 1 g de trocador de íons seco ao ar embalado em uma coluna.

O trocador de íons absorve, via de regra, um dos contra-íons - íons presentes na fase móvel, ou seja, apresenta certa seletividade. A série de afinidade, ou seletividade, de íons em relação a diferentes tipos de trocadores de íons foi estabelecida experimentalmente. Por exemplo, em baixas concentrações de solução em trocadores de cátions fortemente ácidos, íons com a mesma carga são sorvidos na seguinte sequência:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Para íons com cargas diferentes, a sorção aumenta com o aumento da carga:

Na+Ca2+

No entanto, alterar as condições da reação de troca iônica pode levar à reversão da série. Séries de afinidade também foram estabelecidas para trocadores de ânions. Por exemplo, a capacidade de absorção de ânions em trocadores de ânions básicos fortes aumenta na seguinte ordem:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Trocadores de íons contendo grupos fortemente ácidos ou fortemente básicos em sua estrutura entram em reações de troca iônica com quaisquer íons em solução com cargas do mesmo sinal do sinal do contra-íon. Esses trocadores de íons são chamados de universais.

O processo de troca iônica entre o analito e o trocador iônico pode ser realizado de três maneiras: estática, dinâmica (método de filtro de troca iônica) e cromatográfica.

Método estático troca iônica é que uma amostra do trocador iônico é colocada em contato com um determinado volume de solução e misturada ou agitada por um certo tempo até que o equilíbrio seja estabelecido. Este é um método rápido e simples de troca iônica, utilizado para concentrar íons de soluções diluídas, removendo impurezas desnecessárias, mas não garante a absorção completa dos íons, pois a troca iônica é um processo de desequilíbrio e, como resultado, não garante a separação completa. de íons.

Ao realizar troca iônica de forma dinâmica uma solução passa pela coluna com o trocador de íons, que, à medida que se move ao longo da coluna, entra em contato com novos grânulos do trocador de íons. Este processo proporciona uma troca mais completa que o método estático, pois os produtos de troca são removidos pelo fluxo da solução. Eles podem concentrar íons de soluções diluídas e separar íons que diferem muito em propriedades, por exemplo, íons de cargas diferentes (separar cátions de ânions), mas separar íons com o mesmo sinal de carga é quase impossível. A separação quantitativa de tais íons só é possível com a repetição repetida de atos elementares de sorção-dessorção sob condições dinâmicas, ou seja, método cromatográfico . Ao trabalhar com este método, são utilizadas altas camadas de trocador de íons e a mistura a ser separada é introduzida nesta camada em quantidade significativamente menor que a capacidade da coluna, garantindo múltiplas repetições de atos elementares de troca iônica.

Em termos de técnica de análise, a cromatografia de troca iônica é semelhante à cromatografia molecular e pode ser realizada nas opções eluente (revelação), frontal e deslocamento. A diferença entre cromatografia molecular e de troca iônica é que na cromatografia molecular os componentes separados da mistura são eluídos da coluna com um eluente puro, enquanto na cromatografia de troca iônica uma solução eletrolítica é usada como eluente. Neste caso, o íon trocado do eluente deve ser sorvido de forma menos seletiva do que qualquer um dos íons da mistura sendo separada.

Ao realizar a cromatografia de troca iônica de desenvolvimento, que é usada com mais frequência, uma coluna preenchida com um trocador de íons é primeiro lavada com uma solução eletrolítica até que todos os seus íons sejam completamente substituídos no trocador de íons pelos íons contidos no eluente. Em seguida, um pequeno volume de uma solução do analito, contendo os íons separados em uma quantidade de cerca de 1% da capacidade do trocador de íons, é introduzido na coluna. A seguir, a coluna é lavada com a solução eluente, selecionando as frações eluídas e analisando-as.

Uma mistura de íons Cl – , Br – , J – pode ser separada em um trocador de ânions altamente básico (poliestireno reticulado contendo grupos de bases de amônio quaternário – N (CH 3) 3 +), por exemplo, AB-17, que tem uma série de seletividade (seletividade): NO 3 – Cl – Br – J – . Como resultado, uma solução de NaNO 3 é usada como eluente. Primeiro, esta solução é passada através do trocador de íons até ficar completamente saturada com íons NO 3 –. Quando a mistura a ser separada é introduzida na coluna, os íons Cl – , Br – , J – são absorvidos pelo trocador aniônico, deslocando os íons NO 3 –. Quando a coluna é posteriormente lavada com uma solução de NaNO 3, os íons Cl – , Br – , J – nas camadas superiores do trocador de ânions são gradualmente substituídos novamente por íons NO 3 –. Os íons Cl – serão deslocados mais rapidamente e os íons J – permanecerão na coluna por mais tempo. A diferença na seletividade do trocador de íons aos íons da mistura leva à formação de zonas separadas de íons Cl – , Br – e J – sorvidos na coluna, movendo-se ao longo da coluna em velocidades diferentes. À medida que você se move ao longo da coluna, a distância entre as zonas aumenta. Em cada zona existe apenas um dos ânions da mistura a ser separada e no ânion eluente no intervalo entre as zonas existe apenas o ânion eluente; Assim, aparecerão frações no eluente na saída da coluna, que contêm componentes individuais da mistura a ser separada.

Para resolver problemas práticos, as condições para a separação de íons são variadas selecionando uma fase móvel adequada (composição, concentração, pH, força iônica) ou alterando a porosidade da matriz polimérica do trocador de íons, ou seja, o número de ligações intercadeias no matriz, e criando peneiras de troca iônica que são permeáveis ​​a alguns íons e capazes de trocá-los e impenetráveis ​​a outros. Também é possível alterar a natureza e o arranjo relativo dos grupos ionogênicos, bem como obter sorventes capazes de reações químicas seletivas devido à formação de complexos. Por exemplo, trocadores de íons formadores de complexos contendo em sua estrutura grupos quelantes de reagentes orgânicos dimetilglioxima, ditizona, 8-hidroxiquinolina, etc., bem como éteres de coroa, possuem alta seletividade.

O maior uso em troca iônica, cromatografia de íons e pares iônicos é encontrado em trocadores de íons orgânicos sintéticos de macro e micromalha com grande capacidade de troca (3–7 mmol/g), bem como materiais de troca iônica inorgânicos. Os trocadores de íons de micromalha são capazes de trocar íons apenas no estado inchado, enquanto os trocadores de íons de macromalha são capazes de trocar íons apenas nos estados inchado e não inchado. Outro tipo estrutural de trocadores de íons são os trocadores de íons de filme superficial, cujo núcleo sólido é feito de um copolímero não poroso de estireno e divinilbenzeno, vidro ou sílica gel e é cercado por uma fina película de trocador de íons. O diâmetro total de tal partícula é de cerca de 40 µm, a espessura do filme trocador de íons é de 1 µm. A desvantagem de tais trocadores de íons é o diâmetro relativamente grande das partículas e a baixa capacidade de troca devido à baixa área superficial específica, pelo que é necessário trabalhar com amostras pequenas e, consequentemente, utilizar detectores altamente sensíveis. Além disso, esses trocadores de íons são rapidamente envenenados e não são capazes de regeneração.

Em troca iônica de alto desempenho e cromatografia iônica, trocadores de íons de poliestireno poroso volumétrico, sílicas porosas volumétricas com um diâmetro de grânulo de cerca de 10 mícrons, bem como copolímeros de estireno e divinilbenzeno com superfície porosa e modificada de superfície praticamente não intumescentes com sulfo ionogênico - e grupos amino são usados.

Na cromatografia de par iônico, são utilizados sorventes “escova” - géis de sílica com fases reversas enxertadas C 2, C 8, C 18, que são facilmente convertidos em um trocador de cátions ao absorver surfactantes iônicos da fase móvel, por exemplo, sulfatos de alquila ou sais de bases de amônio quaternário.

Ao realizar a separação cromatográfica usando trocadores de íons, soluções aquosas de sais são mais frequentemente utilizadas como fase móvel. Isso se deve ao fato da água possuir excelentes propriedades dissolventes e ionizantes, devido às quais as moléculas da amostra analisada se dissociam instantaneamente em íons, os grupos de troca iônica do trocador de íons são hidratados e também se transformam em uma forma total ou parcialmente dissociada. Isso garante uma troca rápida de contra-íons. A força de eluição da fase móvel é influenciada principalmente pelo pH, força iônica, natureza da solução tampão e conteúdo de solvente orgânico ou surfactante (cromatografia de pares iônicos).

O valor do pH é selecionado dependendo da natureza dos grupos ionogênicos, dos íons separados e da matriz. Você pode trabalhar com trocadores de íons fortemente ácidos e fortemente básicos em pH = 2–12, com trocadores de íons fracamente ácidos em pH = 5–12, com trocadores de íons fracamente básicos em pH = 2–6. Sorventes à base de sílica não podem ser usados ​​em pH 9. A força iônica da fase móvel afeta a capacidade do trocador de íons. À medida que a força iônica aumenta, a sorção de íons geralmente diminui, à medida que a força de eluição da fase móvel aumenta. Portanto, no início da separação, a fase móvel deve ter uma força iônica baixa (0,05–0,1), e o valor final desta característica não deve exceder 2. Na eluição gradiente, são frequentemente utilizados tampões com força iônica crescente.

Para eluição seletiva de íons absorvidos por um trocador de íons, pode-se usar água, soluções tampão (fosfato, acetato, borato, hidrocarbonato, etc.) com determinado valor de pH e força iônica, soluções minerais (clorídrico, nitrogênio, enxofre, fósforo) e ácidos orgânicos (fenol, cítrico, láctico, tartárico, oxálico, EDTA). A escolha do eluente é facilitada pelo fato de que os coeficientes limitantes de distribuição da maioria dos elementos entre soluções aquosas (aquoso-orgânicas) de muitos complexantes e trocadores de íons do tipo padrão são determinados e apresentados em tabelas.

1.6.4. Cromatografia de exclusão de tamanho. A cromatografia de exclusão de tamanho é um tipo de cromatografia líquida em que a separação dos componentes se baseia na distribuição das moléculas de acordo com o seu tamanho entre o solvente localizado nos poros do sorvente e o solvente que flui entre suas partículas. Durante o processo de separação, pequenas moléculas entram na rede polimérica, em cujos poros o solvente atua como fase estacionária, e ali ficam retidas. Moléculas grandes não conseguem penetrar na rede polimérica e são eliminadas da coluna pela fase móvel. As moléculas maiores são eluídas primeiro, depois as de tamanho médio e, finalmente, as pequenas.

A cromatografia de exclusão de tamanho é dividida em permeação em gel e filtração em gel. Na cromatografia de permeação em gel, a separação ocorre em polímeros que incham em solventes orgânicos. A versão de filtração em gel da cromatografia de exclusão de tamanho envolve o uso de polímeros que incham em água como fases estacionárias.

A duração da retenção dos componentes da amostra analisada na coluna de exclusão de tamanho depende do tamanho de suas moléculas e da difusão nos poros do sorvente, bem como do tamanho dos poros da fase estacionária.

Neste tipo de cromatografia líquida, o coeficiente de distribuição D para as menores moléculas da amostra analisada, que se movem na coluna cromatográfica na menor velocidade, penetrando na rede de fase estacionária, é igual a 1, pois a fase móvel e o solvente localizado nos poros da fase estacionária possuem o mesma composição. Neste caso, a equação básica da cromatografia em coluna assume a forma

Moléculas grandes que não cabem nos poros da fase estacionária eluem da coluna junto com a fase móvel. Para eles D= 0, uma V R =V eu. Esta faixa de valores de coeficiente de distribuição (de 0 a 1) é típica apenas para cromatografia de exclusão de tamanho.

Todas as moléculas da substância multicomponente analisada devem ser removidas da coluna passando um pequeno volume de solvente da V eu antes V eu +V é e a separação termina antes que o pico do solvente seja liberado. Portanto, neste tipo de cromatografia é necessário utilizar colunas bastante longas e com grande volume livre. V eu e um grande número de poros no sorvente.

A resolução dos picos cromatográficos em separações por exclusão de tamanho pode ser melhorada usando eluição gradiente com solventes mistos.

Cada sorvente utilizado na cromatografia de exclusão de tamanho é caracterizado por um determinado volume de poros e, portanto, possui uma determinada região de pesos moleculares separáveis ​​e uma determinada curva de calibração. Neste caso, o gráfico de calibração que caracteriza a dependência do volume retido do peso molecular ou tamanho molecular, via de regra, tem um aspecto complexo.

As fases estacionárias na cromatografia de exclusão de tamanho são selecionadas com base em tarefas analíticas específicas. Inicialmente é estabelecido qual sistema de solventes pode ser utilizado para análise (aquoso ou aquoso-orgânico). Dependendo disso, o tipo de sorvente é determinado. Se for necessário separar amostras solúveis em água, por exemplo, dextranos reticulados que incham em água (Sephadex) ou poliacrilamidas (Biogel R) são usados ​​como fases estacionárias. A separação de substâncias solúveis em solventes orgânicos pode ser realizada em poliestirenos com vários graus de reticulação, inchamento em solventes orgânicos (estirogel, poragel, biobid C). Esses géis inchados são tipicamente instáveis ​​à pressão e permitem taxas de fluxo de fase móvel muito baixas, o que aumenta o tempo de análise. Para implementar uma versão altamente eficiente de cromatografia de exclusão de tamanho, é necessário utilizar fases estacionárias com matrizes rígidas – géis de sílica, cuja desvantagem – alta atividade de adsorção – é eliminada pela silanização da superfície ou seleção de um eluente que seja apropriado em polaridade.

As substâncias que podem ser usadas como fases móveis na cromatografia de exclusão de tamanho são:

- dissolver completamente a amostra analisada;

- molhe bem o sorvente;

- neutralizar a adsorção dos componentes da amostra no sorvente;

 possuem baixa viscosidade e toxicidade.

1.6.5. Cromatografia plana. A cromatografia plana inclui cromatografia em camada fina e cromatografia em papel. Esses tipos de cromatografia líquida são de técnica simples, rápida e não requerem equipamentos caros, o que é sua vantagem inegável.

A separação de uma mistura de substâncias por estes métodos pode ser realizada utilizando vários sistemas cromatográficos. Portanto, são distinguidas adsorção, distribuição, fase normal e reversa, troca iônica, etc., papel e cromatografia em camada fina. Atualmente, a cromatografia em camada delgada é a mais amplamente utilizada.

A cromatografia em papel e em camada fina são semelhantes em técnica. A fibra de celulose do papel é usada como fase estacionária na cromatografia em camada fina, vários sorventes (Al 2 O 3, sílica gel, etc.) são aplicados em uma camada fina e uniforme (100–300 μm) em um vidro, substrato metálico ou plástico (transportador). A camada adsorvente no suporte pode ou não estar fixada.

A separação cromatográfica em métodos planares, bem como em coluna, se deve à transferência dos componentes do analito pela fase móvel ao longo da camada de fase estacionária em diferentes taxas de acordo com os coeficientes de distribuição das substâncias a serem separadas. Em ambos os casos, são utilizados sistemas cromatográficos: sorvente líquido-sólido (mecanismo de separação por adsorção), transportador líquido-líquido-sólido (distribuição, troca iônica e outros mecanismos).

Vários solventes ou misturas destes, ácidos orgânicos ou inorgânicos são utilizados como fases móveis.

A produção prática de cromatogramas planares é a seguinte.

Em uma tira de papel cromatográfico ou em uma fina camada de sorvente, marque uma linha inicial com um lápis a uma distância de 1 cm da borda inferior da tira ou placa. Usando uma micropipeta, aplique a amostra na linha de partida na forma de um ponto com diâmetro não superior a 2–3 mm. A borda da tira ou placa é então baixada para um recipiente contendo a fase móvel localizada numa câmara selada. À medida que a fase móvel sobe ao longo da tira ou placa e ocorrem múltiplos atos elementares de sorção-dessorção, distribuição entre duas fases líquidas, troca iônica, etc., comuns em cromatografia, os componentes da mistura analisada são separados. O processo geralmente continua até que o solvente passe da linha inicial 10 cm. Depois disso, a tira ou placa é removida da câmara e seca. Se os componentes do analito forem coloridos, eles apresentam manchas coloridas correspondentes no cromatograma. Para detectar componentes incolores do analito, o cromatograma deve ser desenvolvido. O desenvolvimento de um cromatograma e a detecção dos componentes da amostra podem ser realizados por diversos métodos e dependem da composição das misturas analisadas. A manifestação pode ser realizada:

- usando iluminação UV. O método é aplicável para a detecção de substâncias capazes de emitir radiação própria (luminescência) na faixa de comprimento de onda visível sob a influência da radiação UV;

- através do desenvolvimento de reagentes. Por exemplo, a presença de aminoácidos na mistura analisada pode ser detectada utilizando ninidrina. O cromatograma seco é imerso em uma solução de ninidrina a 0,2% em acetona e depois seco. As manchas correspondentes aos diversos componentes da mistura adquirem um visual e, via de regra, uma cor específica de cada substância;

- usando iodo. Neste caso, o cromatograma detectado é introduzido em um recipiente no fundo do qual existem cristais de iodo. O vapor de iodo é adsorvido mais fortemente nas manchas, tornando-as visíveis. O iodo é um reagente revelador inespecífico. Utilizando reagentes específicos é possível não só determinar o número de componentes da mistura, mas também identificar as substâncias separadas pela cor das manchas.

A cromatografia em papel e em camada fina é mais frequentemente realizada na chamada versão ascendente descrita acima. Muitas vezes, para melhorar a qualidade dos cromatogramas, é necessário utilizar variantes mais complexas da cromatografia planar, por exemplo, descendente, circular, bidimensional. Ao realizar cromatografia descendente em papel ou em camada delgada, o analito é aplicado na linha inicial de uma placa ou tira de papel localizada na parte superior, e o eluente é fornecido não por baixo, mas por cima. O efeito positivo de melhorar a separação é devido à contribuição da gravidade dos componentes para o processo de separação.

Tanto a cromatografia ascendente quanto a descendente podem ser realizadas nas versões unidimensional e bidimensional. Em contraste com o processo de separação unidimensional em leito plano descrito acima, na separação cromatográfica bidimensional a amostra a ser analisada é primeiro separada em um solvente, depois separada em uma direção perpendicular ao primeiro usando outro solvente, girando o primeiro cromatograma por 90 o C.

Ao realizar a cromatografia circular, o analito é aplicado como uma gota no meio de uma placa ou folha de papel cromatográfico. Um ou mais solventes também são adicionados gota a gota aqui. Isto resulta no cromatograma resultante sendo um conjunto de pontos radiais.

A posição dos pontos (zonas) que formam os componentes separados do analito em um cromatograma plano é caracterizada pela velocidade relativa de movimento dos componentes em uma camada fina R fi. Experimentalmente o valor R fi definido como a razão da distância eu eu passado eu-ésimo componente, à distância eu atravessado pelo solvente da linha de partida até a linha de frente (Fig. 1.10):

Magnitude R fi depende da natureza do componente correspondente da amostra analisada, da natureza da fase estacionária, da sua espessura, da natureza e qualidade da fase móvel, do método de aplicação da amostra e de outros fatores, mas sempre R fi 1.

Magnitude R fié na verdade idêntico ao tempo de retenção de uma substância ou ao seu volume de retenção, que caracteriza a taxa de passagem de uma substância através de uma coluna cromatográfica, podendo ser utilizado para identificação qualitativa dos componentes da amostra analisada, e do diâmetro do ponto é idêntico à altura ou área do pico cromatográfico e, portanto, reflete até certo ponto o conteúdo quantitativo da substância.

No caso mais simples, a determinação quantitativa da composição da amostra analisada pode ser avaliada visualmente pela intensidade da própria cor dos pontos ou pela intensidade do brilho fluorescente dos pontos resultantes durante a detecção UV. Para estes fins, a eluição de manchas cromatográficas é amplamente utilizada. Neste caso, a mancha obtida no cromatograma é cuidadosamente recortada ou raspada, tratada com solvente adequado e a solução resultante é examinada pelo método físico-químico adequado. Você também pode usar o método de pesagem, no qual o ponto correspondente é cortado do cromatograma e pesado. A quantidade de uma substância é determinada pela diferença nos pesos do papel limpo da mesma área e do papel com a substância.

Papel (BH ) E cromatografia em camada fina (TLC ) de acordo com o mecanismo de separação pertencem a cromatografia de partição . No método BH, o transportador é um especial papel de cromatografia com certas propriedades. Fase estacionária a água é adsorvida na superfície e nos poros do papel (até 20%), mobile é um solvente orgânico, miscível ou imiscível com água, água ou soluções eletrolíticas.

Mecanismo No papel é bastante complicado. Na fase estacionária, uma substância pode ser retida não apenas pela dissolução na água adsorvida pelo papel, mas também adsorver diretamente da celulose. Impresso em papel componentes compartilhados passam para a fase móvel e se movem através dos capilares do papel em diferentes velocidades de acordo com coeficiente de distribuição interfacial cada um deles. Inicialmente cromatografia parte da substância do papel vai para na fase móvel e seguir em frente. Quando o solvente orgânico atinge uma porção do papel que não contém o soluto, isso ocorre novamente. redistribuição : da fase orgânica a substância passa para a fase aquosa, sorvida no papel. Como os componentes têm diferentes afinidade pelo sorvente , quando o eluente se move, ocorre a separação: algumas substâncias ficam retidas no início do caminho, outras avançam. Aqui eles combinam termodinâmico (estabelecendo uma distribuição de equilíbrio de substâncias entre as fases) e cinético (movimento de componentes em velocidades diferentes) aspectos de separação. Como resultado, cada componente está concentrado em uma área específica da folha de papel: zonas de componentes individuais sobre cromatograma . O uso da cromatografia em papel apresenta uma série de desvantagens significativas: a dependência do processo de separação da composição e propriedades do papel, alterações no teor de água nos poros do papel quando as condições de armazenamento mudam, velocidade de cromatografia muito baixa ( até vários dias) e baixa reprodutibilidade dos resultados. Estas deficiências afectam seriamente a difusão da cromatografia em papel como método cromatográfico.

EM Método TLC o processo de separação de uma mistura de substâncias é realizado em camada fina sorvente , depositado em um substrato sólido inerte, e é fornecido pelo movimento na fase móvel (solvente) através do sorvente sob a influência forças capilares . Pormecanismo de separação diferenciar cromatografia de partição, adsorção e troca iônica . A separação dos componentes ocorre nestes casos quer como resultado dos seus diferentes coeficientes de distribuição entre as duas fases líquidas ( cromatografia de partição ), ou devido à diferente adsorvibilidade dos compostos pelo sorvente ( cromatografia de adsorção ). O método de adsorção é baseado em vários graus de sorção-dessorção dos componentes separados na fase estacionária. Adsorção realizado às custas de forças de van der Waals , que é a base adsorção física , polimolecular (formação de várias camadas de adsorbato na superfície do adsorvente) e quimissorção (interação química de adsorvente e adsorbato).

No caso de usar tais sorventes para TLC como alumina ou gel de sílica desempenhar um papel na separação distribuição , então adsorção na superfície ativa desenvolvida do sorvente (150–750 m 2 /g). Distribuição componentes da mistura ocorre entre a água na superfície do transportador (tal adsorventes , Como alumina , amido , celulose , Kieselguhr - E água forma fase estacionária ), e o solvente movendo-se através desta fase estacionária ( na fase móvel ). O componente da mistura mais solúvel em água move-se mais lentamente do que o componente mais solúvel na fase móvel.

Adsorção se manifesta no fato de que entre operadora , por exemplo, óxido de alumínio, e os componentes da mistura são estabelecidos equilíbrio de adsorção – cada componente tem o seu próprio, cujo resultado é diferentes velocidades de movimento componentes da mistura. Dois casos extremos podem ser distinguidos:

a) a concentração da substância no adsorvente é zero. A substância se dissolve completamente na fase móvel e é levada por ela (move-se junto com frente solvente ).

b) a substância é totalmente adsorvida, não interage com o solvente e permanece no início.

Na prática, com seleção hábil de solvente e adsorvente distribuição compostos estão localizados entre esses casos extremos, e a substância gradualmente transferido de uma camada sorvente para outra devido a processos que ocorrem simultaneamente sorção E dessorção .

O solvente que passa pelo sorvente é chamado eluente , o processo de mover uma substância junto com o eluente  eluição . À medida que o líquido se move ao longo da placa, a mistura de substâncias se separa devido à ação de forças adsorção , distribuição , troca iônica ou a combinação de todos esses fatores. Como resultado, separe zonas cromatográficas componentes da mistura, ou seja, acontece que cromatograma .

Seleção correta sorvente E eluente determina a eficiência da separação da mistura. A mobilidade da substância em estudo depende da sua afinidade pelo sorvente e força de eluição (polaridade) do eluente. À medida que a polaridade de um composto aumenta, a sua afinidade pelo sorvente polar também aumenta. Aumentando o grau de adsorção gel de sílica compostos orgânicos estão dispostos em uma fileira: hidrocarbonetos<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь para sílica gel os eluentes podem ser organizados em ordem crescente de “polaridade” ( capacidade de eluição ) e formam uma série de solventes ( série eluotrópica ) de acordo com dados experimentais: alcanos>benzeno>clorofórmio>éter dietílico>acetato de etila>álcoois C 2 -C 4>água>acetona>ácido acético>metanol. Assim, o composto polar, o álcool, é fortemente adsorvido na sílica gel e, portanto, move-se fracamente sob a influência de um solvente não polar, como o hexano, e permanece próximo da linha de partida. Por sua vez, o hidrocarboneto aromático apolar bifenil é visivelmente mais móvel em hexano, mas mesmo aqui para alcançar R f cerca de 0,5, é necessário um eluente aprótico mais polar - cloreto de metileno. Força do eluente regular usando misturas de solventes vizinhos série eluotrópica com polaridade diferente.

Atualmente, os seguintes são usados ​​principalmente em TLC: sorventes : para divisão substâncias lipofílicas  gel de sílica , alumina , celulose acetilada , poliamidas ; para separação substâncias hidrofílicas  celulose , trocadores de íons de celulose , Kieselguhr , poliamidas . A característica mais importante do sorvente é a sua atividade , ou seja habilidade absorver (manter) os componentes da mistura a serem separados. No exterior, diversas empresas produzem gel de sílica , Kieselguhr E alumina com adição de 5% de gesso, que é utilizado para fixar a camada sorvente na confecção independente das placas.

O sorvente mais comum é gel de sílica - ácido silícico hidratado, formado pela ação de ácidos minerais sobre o Na 2 SiO 3 e secagem do sol resultante. Após a moagem do sol, é utilizada uma fração de um determinado tamanho de grão (indicado na placa, geralmente 5-20 mícrons). Gel de sílica é sorvente polar com grupos OH como centros ativos. Adsorve facilmente água na superfície e forma ligações de hidrogênio.

Alumina é um adsorvente fracamente básico e é usado principalmente para a separação de compostos fracamente básicos e neutros. A desvantagem das placas de óxido de alumínio é a ativação obrigatória da superfície antes do uso em forno em altas temperaturas (100-150 o C) e a baixa capacidade de adsorção da camada em relação à sílica gel.

Terra de diatomáceas - adsorvente obtido a partir de minerais naturais - terras diatomáceas. O sorvente possui propriedades hidrofílicas e menor capacidade de adsorção da camada em comparação à sílica gel.

Celulose: placas de camada fina revestidas com celulose são muito eficazes para separar moléculas orgânicas complexas. O adsorvente consiste principalmente em esferas de celulose com diâmetro de até 50 mícrons, fixadas em um suporte com amido. Tal como na cromatografia em papel, a ascensão da frente do solvente ocorre muito lentamente.

Análise cromatográfica realizado em placas industriais fabricadas na República Tcheca " Silufol » (« Silufol ") feito de folha de alumínio, às vezes reforçado com papelão, e " Siluplast » fabricado em plástico, revestido com uma camada de sorventes - sílica gel LS 5-40 com amido ou gesso como aglutinante (até 10%), ou óxido de alumínio com e sem adição de indicadores fluorescentes. Registros " Silufol » têm uma alta taxa de eluição, mas são caracterizados por baixa capacidade de separação e baixa sensibilidade. Durante o armazenamento, são sensíveis às condições (umidade, temperatura, ambientes agressivos, etc.). Algumas empresas fornecem placas de cromatografia com uma camada de sorvente de espessura variável (geralmente até 0,25 mm), mas estritamente constante (sílica gel, celulose, resina de troca iônica), sobre vidro e substratos de folha de alumínio, plástico, fibra de vidro impregnada.

Pratos " Sorbfil » (TU 26-11-17-89) são produzidos na Rússia em uma base de polímero (tereftalato de polietileno, grau P) ou substrato de alumínio (grau AF) com uma camada de trabalho aplicada sorvente de sílica gel microfracionada graus STX-1A e STX-1VE (produzidos na URSS como sílica gel fracionada KSKG) com espessura de 90-120 mícrons (até 200 mícrons), fixados com um aglutinante especial - sol de sílica . Ao usar sol de ácido silícico (sol de sílica) como aglutinante, que após aquecimento se transforma em sílica gel, as placas de TLC resultantes consistem em dois componentes: uma camada de sílica gel e um substrato. A uniformidade da espessura da camada sorvente em uma placa é de ±5 µm. Exemplo de designação: “Sorbfil-PTSH-AF-V-UV (10x10)” - placas TLC de alto desempenho sobre substrato de alumínio, com fósforo, 10x10 cm.

Se você usar um substrato de vidro (grau C), essas placas serão reutilizáveis ​​e quimicamente resistentes. Sua resistência química é determinada pela resistência química da sílica gel. Como resultado, as placas de TLC podem ser tratadas repetidamente com reagentes agressivos, por exemplo, uma mistura de cromo quente, que elimina restrições ao uso de reagentes correlacionados para detectar manchas e modificar o sorvente, e permite repetidos (até 30 vezes ou mais ) regeneração das placas com mistura de cromo. As placas de vidro podem ser cortadas nos tamanhos desejados. A resistência mecânica da camada sorvente pode ser ajustada, proporcionando, por um lado, o transporte e reprocessamento das placas e, por outro lado, a possibilidade de extração de camadas adsorventes com substâncias separadas para posterior lixiviação de compostos individuais do sorvente e seu estudo posterior por métodos instrumentais (espectrometria IR e UV, métodos estruturais de raios X, RMN, etc.).

As placas diferem no tamanho das frações (distribuição de partículas) da sílica gel que compõe a camada. Em placas analíticas (grau A) a fração é de 5 a 17 mícrons, em placas de alto desempenho (grau B) - 8 a 12 mícrons. Uma distribuição mais estreita aumenta a eficiência das placas, ou seja, as manchas das substâncias separadas tornam-se mais compactas (menores em tamanho) e, portanto, são melhor separadas quando a frente do eluente percorre uma distância menor. Nos wafers russos, as camadas analíticas e de alto desempenho não diferem muito, ao contrário dos wafers da Merck (Alemanha). Placas de alta eficiência devem ser utilizadas se as substâncias não puderem ser separadas nas placas analíticas. Placas de todas as modificações são produzidas com fósforo (grau UV) com excitação de 254 nm. O prazo de validade é ilimitado, pratos " Sorbfil » amplamente testado na análise de derivados de aminoácidos, pesticidas, lipídios, antibióticos.

O método TLC é realizado identificação de qualidade componentes. quantificação para TLC também é possível, isso requer a aplicação da quantidade exata de substância e estudos densitométricos com um registro claro da intensidade das manchas. O mais comum é método semi-quantitativo . É baseado em comparação visual o tamanho e a intensidade de uma mancha de um componente com as características correspondentes de uma série de manchas da mesma substância em concentrações variadas ( soluções de referência padrão ). Ao usar uma amostra na quantidade de 1-5 μg, este método simples garante uma precisão na determinação do conteúdo do componente de cerca de 5-10%. Muitas vezes, para determinar os componentes de uma amostra, é necessário realizar o preparo da amostra para obter uma mistura contendo os compostos analisados. O preparo da amostra é baseado na extração dos fármacos da amostra com solventes orgânicos ( n-hexano, éter de petróleo, éter dietílico, clorofórmio), purificação do extrato e posterior cromatografia em camada fina de óxido de alumínio ou sílica gel.

Existem diversas opções de TLC e HD, diferindo na forma fornecimento de solvente . Dependendo da direção do movimento da fase móvel, existem:

A)cromatografia ascendente - a fase móvel é despejada no fundo da câmara de separação, o papel (placa) é colocado verticalmente;

b)cromatografia descendente  a fase móvel é alimentada por cima e desce ao longo da camada sorvente da placa ou papel;

V)cromatografia radial  avanço horizontal da frente do solvente: a fase móvel é levada até o centro do disco de papel (placa), onde é aplicada a mistura a ser separada.

O mais comum é eluição ascendente (cromatografia). Frente eluente enquanto se move de baixo para cima. A escolha do solvente (fase móvel) é determinada pela natureza do sorvente e pelas propriedades das substâncias a serem separadas.

Separação cromatográfica pelos métodos BCh e TLC são realizados em câmara de separação com tampa dobrada. Uma medida quantitativa da taxa de transferência de uma substância ao usar um determinado adsorvente e solvente é Valor R f (do inglês retenção fator – coeficiente de atraso, este parâmetro é análogo ao tempo de retenção). Posição zonas do componente cromatografado definir de acordo com o tamanho coeficiente R f , igual à razão entre a velocidade de movimento de sua zona e a velocidade de movimento da frente do solvente. Magnitude R f é sempre menor que um e não depende do comprimento do cromatograma. Pela quantidade R f são influenciados por vários fatores. Assim, a baixas temperaturas, as substâncias movem-se mais lentamente; contaminação por solvente, falta de homogeneidade do adsorvente, íons estranhos na solução analisada podem alterar o valor R f até 10%. No sistema escolhido, os analitos devem ter valores diferentes R f e distribuído ao longo de todo o comprimento do cromatograma. É desejável que os valores R f estava na faixa de 0,05-0,85.

Na prática o valor R f calculado como a razão da distância eu percorrido pela substância até a distância eu passou pelo solvente:

R f = l/L (6.1 )

Geralmente para cálculo escolha centro de pontos (Figura 1). Magnitude R f depende de muitos fatores: tipo papel de cromatografia (sua porosidade, densidade, espessura, grau de hidratação) e sorvente (tamanho do grão, natureza dos grupos na superfície, espessura da camada, sua umidade, natureza da substância, composição da fase móvel), condições experimentais (temperatura, tempo de cromatografia, etc.). Se todos os parâmetros cromatográficos forem constantes, o valor R f determinado apenas pelas propriedades individuais de cada componente.

Arroz. 1. Determinação de valores no cromatograma RF para componentes A E EM,

grau de sua separação R$ e o número de placas teóricas N .

A eficiência do HD e do TLC também depende seletividade e sensibilidade reações usadas para detectar os componentes da mistura analisada. Normalmente, são utilizados reagentes que formam compostos coloridos - reveladores - com os componentes sendo determinados. Para mais confiável identificação de componentes compartilhados aplicar " testemunhas » soluções substâncias padrão (no mesmo solvente da amostra), cuja presença é esperada na amostra. Substância padrão aplicado na linha de partida próximo à amostra sendo analisada e cromatografado nas mesmas condições. Na prática, um valor relativo é frequentemente usado:

R f rel = R f x / R f ficar (6.2)

Onde R f ficar também calculado usando a fórmula (6.1). Eficiência separação cromatográfica caracterizar número de placas teóricas equivalentes e eles altura . Assim, no método TLC o número de placas teóricas equivalentes N A para componente A a mistura a ser separada é calculada usando a fórmula:

N A = 16 (eu O.A. / a (A )) 2 (6.3)

Valores eu O.A. E A (A ) determinado como mostrado na Fig. 6.1. Então a altura da placa teórica equivalente N A é:

H A = eu O.A. /N = a (A ) 2 / 16 eu O.A. . (6.4)

A separação é praticamente possível se R f (A)  R f (EM)  0,1 .

Para caracterizar a separação de dois componentes A E EM usar grau (critério) de separação Rs :

R$ =  eu/ (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  eu/ (a (A) + a (B)) (6.5)

Onde  eu  distância entre os centros dos pontos dos componentes A E EM;

A (A) E A (EM)  diâmetros pontuais A E EM no cromatograma (Fig. 6.1). O mais R$ , mais claramente os pontos componentes são separados A E EM no cromatograma. Condições cromatografia selecionado para que o valor R$ diferiu de zero e um, o valor ideal R$ é 0,3  0,7. Para taxa seletividade de separação dois componentes A E EM usar fator de separação α :

α = eu B / eu A (6.6)

Se α = 1, então os componentes A E EM não estão separados.

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HPLC é uma cromatografia em coluna líquida na qual uma variedade de mecanismos de sorção podem ser usados. Essencialmente, HPLC é uma forma moderna de cromatografia em coluna líquida clássica. Algumas das características de qualidade mais significativas do HPLC estão listadas abaixo:
- alta velocidade do processo, o que permitiu reduzir o tempo de separação de várias horas e dias para minutos;
- grau mínimo de turvação das zonas cromatográficas, o que permite separar compostos que diferem apenas ligeiramente nas constantes de sorção;
- um alto grau de mecanização e automação na separação e processamento de informações, graças ao qual a cromatografia líquida em coluna atingiu um novo nível de reprodutibilidade e precisão.

A intensa pesquisa nas últimas décadas e uma enorme quantidade de dados experimentais acumulados permitem hoje falar sobre a classificação de variantes no âmbito do método de cromatografia líquida de alta eficiência. É claro que a classificação de acordo com o mecanismo de sorção dado acima permanece válida.

Uma classificação comum é baseada na polaridade comparativa das fases móvel e estacionária. Neste caso, é feita uma distinção entre cromatografia de fase normal e de fase reversa.

A cromatografia de fase normal (NPC) é uma variante da HPLC quando a fase móvel é menos polar que a fase estacionária, e há razões para acreditar que o principal fator que determina a retenção é a interação dos sorbatos diretamente com a superfície ou volume do sorvente.

A cromatografia de fase reversa (RPC) é uma variante da HPLC onde a fase móvel é mais polar que a fase estacionária, e a retenção é determinada pelo contato direto das moléculas de sorbato com a superfície ou volume do sorvente; neste caso, os sorbatos ionizados não são trocados por íons da fase móvel sorvidos na superfície.

A cromatografia de troca iônica é uma opção em que a sorção é realizada pela troca dos íons sorvidos da fase móvel por íons das substâncias que estão sendo cromatografadas; A cromatografia de troca de ligantes pode ser definida de uma maneira completamente análoga.

A cromatografia em sorventes modificados dinamicamente é uma variante da HPLC na qual o sorbato não interage diretamente com a superfície do sorvente, mas entra em associação com moléculas das camadas superficiais do eluente.
A cromatografia de pares iônicos é uma variante da cromatografia de fase reversa de compostos ionizados na qual um contra-íon hidrofóbico é adicionado à fase móvel, o que altera qualitativamente as características de sorção do sistema.

A cromatografia de exclusão de tamanho é um método de separação de compostos por seus pesos moleculares, baseado na diferença na taxa de difusão de moléculas de diferentes tamanhos nos poros da fase estacionária.

Para HPLC, uma característica muito importante é o tamanho dos sorventes, geralmente de 3 a 5 mícrons, agora até 1,8 mícrons. Isto permite que misturas complexas de substâncias sejam separadas rápida e completamente (tempo médio de análise de 3 a 30 minutos).

O problema de separação é resolvido por meio de uma coluna cromatográfica, que é um tubo preenchido com um sorvente. Ao realizar uma análise, um líquido (eluente) de determinada composição é alimentado através de uma coluna cromatográfica a uma velocidade constante. Uma dose de amostra medida com precisão é injetada neste fluxo. Os componentes de uma amostra introduzida em uma coluna cromatográfica, devido às suas diferentes afinidades pelo sorvente da coluna, movem-se ao longo dela em velocidades diferentes e chegam ao detector sequencialmente em momentos diferentes.

Assim, a coluna cromatográfica é responsável pela seletividade e eficiência de separação dos componentes. Ao selecionar diferentes tipos de colunas, o grau de separação dos analitos pode ser controlado. Os compostos são identificados pelo seu tempo de retenção. A determinação quantitativa de cada um dos componentes é calculada com base na magnitude do sinal analítico medido por meio de um detector conectado à saída da coluna cromatográfica.

Sorventes. O desenvolvimento da HPLC está amplamente associado à criação de novas gerações de sorventes com boas propriedades cinéticas e diversas propriedades termodinâmicas. O principal material para sorventes em HPLC é a sílica gel. É mecanicamente forte e possui porosidade significativa, o que proporciona uma grande capacidade de troca com colunas de tamanhos pequenos. O tamanho de partícula mais comum é de 5 a 10 mícrons. Quanto mais próxima da forma esférica das partículas, menor será a resistência ao fluxo e maior será a eficiência, especialmente se uma fração muito estreita for filtrada (por exemplo, 7 +1 mícron).

A superfície específica do gel de sílica é de 10-600 m2/g. A sílica gel pode ser modificada com diversos grupos químicos enxertados na superfície (C-18, CN, NH2, SO3H), o que permite o uso de sorventes à base dela para separar uma ampla variedade de classes de compostos. A principal desvantagem da sílica gel é sua baixa resistência química em pH< 2 и рН >9 (a sílica se dissolve em álcalis e ácidos). Portanto, atualmente existe uma intensa busca por sorventes à base de polímeros que sejam estáveis ​​em pH de 1 a 14, por exemplo, à base de polimetilmetacrilato, poliestireno, etc.

Sorventes para cromatografia de troca iônica. Devido às peculiaridades de separação (em ambiente ácido ou alcalino), o material principal é sorvente em poliestireno com divinilbenzeno de vários graus de reticulação com SO3 -H+ (trocadores de cátions fortemente ácidos) ou -COO-Naf (cátions fracamente ácidos trocadores de ânions), grupos -H2N+ (CH3) enxertados em sua superfície 3Cl- (trocadores de ânions básicos fortes) ou -N+HR2Cl- (trocadores de ânions básicos fracos).

Sorventes para cromatografia de permeação em gel. O tipo principal é o estireno-DVB. Vidros macroporosos, metacrilato de metila e sílica gel também são usados. Os mesmos sorventes são usados ​​para cromatografia de exclusão iônica.
Bombas. Para garantir o fluxo da fase móvel (MP) através da coluna com os parâmetros especificados, são utilizadas bombas de alta pressão. As características técnicas mais importantes das bombas LC incluem: faixa de vazão; pressão máxima de trabalho; reprodutibilidade do fluxo; faixa de pulsação do fornecimento de solvente.

Dependendo da natureza do fornecimento de solvente, as bombas podem ter fornecimento (fluxo) constante e pressão constante. Basicamente, durante o trabalho analítico, é utilizado um modo de vazão constante e, no enchimento de colunas, é utilizado um modo de pressão constante. Com base no seu princípio de funcionamento, as bombas são divididas em bombas de seringa e bombas de êmbolo alternativo.

Bombas de seringa. As bombas deste tipo são caracterizadas por uma quase completa ausência de pulsações no fluxo da fase móvel durante a operação. Desvantagens da bomba: a) alto consumo de tempo e solvente para lavagem na troca do solvente; b) suspensão da separação durante o enchimento da bomba; c) grandes dimensões e peso, garantindo alto fluxo e pressão (são necessários um motor potente e uma grande força de pistão com sua grande área).

Bombas de êmbolo alternativo. Bombas deste tipo fornecem um fornecimento volumétrico constante da fase móvel por um longo período. Pressão máxima de operação 300-500 atm, vazão 0,01-10 ml/min. A reprodutibilidade do fluxo de volume é de 0,5%. A principal desvantagem é que o solvente é fornecido ao sistema na forma de uma série de pulsos sucessivos, portanto há pulsações de pressão e fluxo.

Esta é a principal razão para o aumento do ruído e a redução da sensibilidade de quase todos os detectores utilizados em LC, especialmente os eletroquímicos. Formas de combater as pulsações: utilizando bombas duplas ou bomba Bag-Lai de êmbolo duplo, utilizando dispositivos de amortecimento e dispositivos eletrônicos.

A quantidade de alimentação volumétrica é determinada por três parâmetros: o diâmetro do êmbolo (geralmente 3,13; 5,0; 7,0 mm), sua amplitude (12-18 mm) e frequência (que depende da velocidade de rotação do motor e da caixa de engrenagens).

Dispensadores. A finalidade do dispensador é transferir uma amostra à pressão atmosférica para a entrada de uma coluna a uma pressão de até várias atmosferas. É importante que não existam volumes “mortos” no dispensador que não possam ser lavados pela fase móvel e que não haja erosão da amostra durante a dosagem. No início, os dispensadores de LC eram semelhantes aos dispensadores de gás com perfuração da membrana. Porém, as membranas não suportam mais de 50-100 atm; sua resistência química é insuficiente; suas peças contaminam filtros de coluna e capilares;

A fase líquida tem uma taxa de difusão muito menor que a fase gasosa. Portanto, você pode dosar interrompendo o fluxo - a amostra não tem tempo de se desgastar no dispensador. Enquanto a amostra é introduzida no dispensador, uma válvula especial interrompe o fluxo do solvente. A pressão na entrada da coluna diminui rapidamente após alguns segundos, a amostra pode ser injetada na câmara do dispensador com uma microseringa convencional; Em seguida, o dispensador é travado, o fluxo de solvente é ativado e ocorre a separação.

A pressão que esta torneira mantém é de 500-800 atm. Mas quando o fluxo para, o equilíbrio na coluna é perturbado, o que pode levar ao aparecimento de picos adicionais “vagos”.

Os dispensadores de loop são os mais utilizados. Quando o dispensador está cheio, as entradas 1, 2 e o canal entre elas estão sob alta pressão. Entradas 3-6, os canais entre elas e o circuito de dosagem estão sob pressão atmosférica, o que permite encher o circuito usando uma seringa ou bomba. Quando o dispensador é girado, o fluxo da fase móvel desloca a amostra para dentro da coluna. Para reduzir o erro, a alça é lavada com 5 a 10 vezes o volume da amostra. Se a amostra for pequena, ela pode ser injetada na alça com uma microseringa. O volume do loop é geralmente de 5 a 50 µl.

NO. Voinov, T.G. Volova

(principalmente intermolecular) no limite da fase. Como método de análise, o HPLC faz parte de um grupo de métodos que, devido à complexidade dos objetos em estudo, inclui a separação preliminar da mistura complexa original em outras relativamente simples. As misturas simples resultantes são então analisadas utilizando métodos físico-químicos convencionais ou métodos especiais desenvolvidos para cromatografia.

O método HPLC é amplamente utilizado em áreas como química, petroquímica, biologia, biotecnologia, medicina, indústria alimentícia, proteção ambiental, produção farmacêutica e muitas outras.

De acordo com o mecanismo de separação das substâncias analisadas ou separadas, a HPLC é dividida em adsorção, distribuição, troca iônica, exclusão, troca de ligantes e outros.

Deve-se ter em mente que no trabalho prático a separação muitas vezes ocorre não por meio de um, mas por meio de vários mecanismos simultaneamente. Assim, a separação por exclusão pode ser complicada por efeitos de adsorção, a separação por adsorção por efeitos de distribuição e vice-versa. Além disso, quanto maior for a diferença entre as substâncias numa amostra em termos de grau de ionização, basicidade ou acidez, peso molecular, polarizabilidade e outros parâmetros, maior será a probabilidade de um mecanismo de separação diferente para tais substâncias.

HPLC de fase normal

A fase estacionária é mais polar que a fase móvel, portanto o solvente apolar predomina no eluente:

• Hexano:isopropanol = 95:5 (para substâncias de baixa polaridade)
• Clorofórmio:metanol = 95:5 (para substâncias polares médias)
• Clorofórmio:metanol = 80:20 (para substâncias altamente polares)

HPLC de fase reversa

A fase estacionária é menos polar que a fase móvel, portanto o eluente quase sempre contém água. Neste caso, é sempre possível garantir a dissolução completa do BAS na fase móvel, é quase sempre possível utilizar a detecção UV, quase todas as fases móveis são mutuamente miscíveis, pode ser utilizada eluição gradiente, a coluna pode ser rapidamente refeita -equilibrada, a coluna pode ser regenerada.

Os eluentes comuns para HPLC de fase reversa são:

• Acetonitrila:água
• Metanol:água
• Isopropanol:água

Matrizes para HPLC

As matrizes utilizadas em HPLC são compostos inorgânicos, como sílica gel ou alumina, ou polímeros orgânicos, como poliestireno (reticulado com divinilbenzeno) ou polimetacrilato. A sílica gel é, obviamente, agora geralmente aceita.

Principais características da matriz:

• Tamanho de partícula (µm);
• Tamanho interno dos poros (Å, nm).

Preparação de sílica gel para HPLC:

1. Moldagem de microesferas de ácido polissilícico;
2. Secagem de partículas de sílica gel;
3. Separação de ar.

Partículas sorventes:

• Regular (esférico): maior resistência à pressão, maior custo;
• Não esférico: menor resistência à pressão.

O tamanho dos poros em HPLC é um dos parâmetros mais importantes. Quanto menor for o tamanho dos poros, pior será a sua permeabilidade às moléculas das substâncias eluídas. E, portanto, pior será a capacidade de sorção dos sorventes. Quanto maiores os poros, menor, em primeiro lugar, a estabilidade mecânica das partículas sorventes e, em segundo lugar, quanto menor for a superfície de sorção, portanto, pior será a eficiência.

Vacinações em fase estacionária

HPLC de fase normal:

• Fase estacionária com enxerto de propilnitrila (nitrila);
• Fase estacionária com enxerto de propilamina (amina).

HPLC de fase reversa:

• Fase estacionária com enxerto alquílico;
• Fase estacionária com enxerto de alquilsilila.

End-capping é a proteção de áreas não enxertadas do sorvente por enxerto adicional com moléculas “pequenas”. Capeamento final hidrofóbico (C1, C2): maior seletividade, pior molhabilidade; cobertura final hidrofílica (diol): menor seletividade, maior molhabilidade.

Detectores para HPLC

• ultravioleta
• Matriz de diodo
• Fluorescente
• Eletroquímico
• Refratométrico
• Seletivo em massa

Ligações

Fundação Wikimedia. 2010.

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Cromatografia líquida baseada em decomp. capacidade de íons separados para troca iônica com fixo. íons sorventes formados como resultado da dissociação dos grupos ionogênicos destes últimos. Trocadores de cátions são usados ​​para separar cátions, para... ... Enciclopédia Química

HPLC- cromatografia líquida de alta performance… Dicionário de abreviaturas russas

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