Trapová metóda na stanovenie antioxidačnej aktivity. Metóda stanovenia celkovej antioxidačnej aktivity

Vynález sa týka potravinárskeho priemyslu a možno ho použiť na stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity. Metóda sa uskutočňuje nasledovne: analyt interaguje s činidlom 0,006 M Fe(III) - 0,01 M o-fenantrolínu. Kyselina askorbová (AA) interaguje s rovnakým činidlom, ktoré sa pridáva v pomere 1:100. Potom sa inkubuje aspoň 90 minút a meria sa pri 510 ± 20 nm. Potom sa stanoví závislosť hodnoty analytického signálu od množstva látky a vypočíta sa hodnota celkovej AOA. Predložená metóda umožňuje časovo menej náročné a spoľahlivejšie stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity rastlinných materiálov a potravinových produktov na nej založených. 2 w.p. f-ly, 1 ochor., 5 tab.

Vynález sa týka analytickej chémie a možno ho použiť na stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity (AOA) rastlinných materiálov a potravinových produktov na nej založených.

Známa coulometrická metóda na stanovenie celkovej AOA čaju, založená na interakcii vodných extraktov produktu s elektrogenerovanými zlúčeninami brómu (I.F. Abdulin, E.N. Turova, G.K. Budnikov Coulometrické hodnotenie antioxidačnej kapacity čajových extraktov elektrogenerovaným brómom // Zhurn Chemistry, 2001, zväzok 56, č. 6, strany 627-629). Voľba elektrogenerovaných zlúčenín brómu ako titračného činidla je spôsobená ich schopnosťou vstupovať do rôznych reakcií: radikálovej, redoxnej, elektrofilnej substitúcie a adície násobnými väzbami. To umožňuje pokryť širokú škálu biologicky aktívnych čajových zlúčenín s antioxidačnými vlastnosťami. Nevýhodou metódy je možnosť bromačnej reakcie s látkami, ktoré nie sú antioxidantmi a vyjadrenie výslednej hodnoty celkovej AOA v jednotkách množstva elektriny (kC/100 g), čo sťažuje vyhodnotenie. výsledky.

Známa voltametrická metóda na stanovenie celkovej antioxidačnej aktivity relatívnou zmenou prúdu elektroredukcie kyslíka v rozsahu potenciálov od 0,0 do -0,6 V (rel. sat. c.s.e.) na ortuťovej filmovej elektróde (pat. IPC 7 G 01 N 33/01 Voltametrická metóda na stanovenie celkovej aktivity antioxidantov / E. I. Korotkova, Yu. Nevýhodou tejto metódy je výskyt vedľajších elektrochemických reakcií, ktoré znižujú účinnosť stanovenia antioxidantov, čo vedie k zníženiu spoľahlivosti výsledkov.

Známy spôsob kontroly celkovej AOA profylaktických a terapeutických antioxidačných činidiel na peroxidáciu lipidov na malónový aldehyd so spektrofotometrickou alebo chemiluminiscenčnou detekciou (patent 2182706, Rusko, IPC 7 G 01 N 33/15, 33/52. fondy / Pavlyuchenko I.I., Basov A.A., Fedosov S.R. - č. 2001101389/14; prihláška 15.01.2001; zverejnená 20.05.2002). Antioxidačná aktivita je zároveň nepriamo úmerná hladine produktov peroxidácie lipidov. Za nevýhodu tejto metódy možno považovať obmedzený okruh analyzovaných objektov, keďže za týchto podmienok sa stanovujú antioxidanty len jednej skupiny, lipidy.

Známa metóda stanovenia celkovej AOA rastlinného extraktu, ktorá spočíva v inkubácii extraktu s linetolom a síranom železnatým, iniciáciou oxidačnej reakcie UV žiarením a následnou interakciou s kyselinou tiobarbiturovou v prítomnosti tritonu X-100 ( Prihláška 97111917/13, Rusko, IPC 6 G 01 N 33/00 Metóda stanovenia celkovej antioxidačnej aktivity / Rogozhin VV - prihláška 08.07.1997; zverejnená 10.06.1999). Pri vykonávaní spektrofotometrie sa používa zmes etanolu a chloroformu v pomere 7:3. Hodnota AOA biologického materiálu je určená pomerom akumulácie reakčného produktu - malondialdehydu vo vzorke obsahujúcej extrakt ku vzorke s prooxidantom. Nevýhoda tejto metódy spočíva v možnosti vedľajších reakcií pri UV žiarení, čo znižuje spoľahlivosť výsledkov analýzy.

Uvedené metódy na stanovenie celkovej AOA majú množstvo nevýhod: vysoká pracnosť, nízka spoľahlivosť, nameraná hodnota celkovej AOA nesúvisí a nie je porovnateľná so žiadnou konvenčnou látkou.

Najbližším analógom k nárokovanému vynálezu je spôsob stanovenia celkovej AOA liečivých rastlín meraním chemiluminiscencie, ku ktorej dochádza pri reakcii s luminolom v prítomnosti oxidačného činidla peroxid vodíka (M.Kh. canary grass by chemiluminescence // Journal of Analytická chémia, 2004, V.59, č. 1, S.84-86). Pre kvantitatívne posúdenie celkovej AOA bola porovnávaná redukčná schopnosť extraktu liečivých surovín a aktivita silného antioxidantu - kyseliny askorbovej v množstve 25-110 μg. V porovnaní s vyššie uvedenými metódami sa v prototype používa ako oxidačné činidlo peroxid vodíka, ktorý interaguje so širokým spektrom antioxidantov a nameraná hodnota celkovej AOA objektu je určená a vyjadrená vo vzťahu ku kyseline askorbovej, ktorá je bežný antioxidant, ktorý umožňuje získať spoľahlivé výsledky pri zachovaní ďalších nevýhod. Medzi nevýhody patrí aj zložitosť zariadenia použitého v metóde.

Technickým cieľom nárokovaného vynálezu je vývoj menej časovo náročného a spoľahlivého spôsobu stanovenia celkovej antioxidačnej aktivity rastlinných materiálov a potravinových produktov na jeho základe.

Na vyriešenie technického problému sa navrhuje interagovať analyt s činidlom 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolín a kyselinou askorbovou (AA) s rovnakým činidlom, ktoré sa pridáva v pomere 1:100. inkubovali sa aspoň 90 minút, merali sa pri 510 ± 20 nm, potom sa stanovila závislosť analytického signálu od množstva látky a vypočítala sa celková AOA. Výpočet sa môže uskutočniť najmä podľa vzorca (I), odvodeného z rovnice kvantitatívnej zhody medzi skúmaným objektom a kyselinou askorbovou:

kde a, b sú koeficienty v regresnej rovnici pre závislosť analytického signálu od množstva AA;

a", c" - koeficienty v regresnej rovnici pre závislosť analytického signálu od množstva skúmaného objektu;

x slnko. - hmotnosť študovaného redukčného činidla (vzorky), mg.

Použitie navrhovaného činidla za týchto podmienok nám umožnilo rozšíriť lineárny rozsah a znížiť spodnú hranicu stanovených množstiev kyseliny askorbovej. Navrhovaný súbor základných funkcií vám umožňuje určiť celkovú AOA širokej škály rastlinných materiálov a potravinových produktov, ktoré sú na nej založené.

Kvantitatívne korešpondenčné rovnice spájajú závislosť analytického signálu od množstva kyseliny askorbovej a závislosť analytického signálu od množstva skúmaného objektu za predpokladu, že antioxidačná aktivita je rovnaká.

Po spracovaní výsledkov fotometrických meraní veľkosti analytického signálu metódou najmenších štvorcov (K. Derffel Statistics in analytická chémia. - M.: "Mir", 1994. S. 164-169; A.K. Charykov Matematické spracovanie výsledky chemickej analýzy - L .: Chemistry, 1984. S.137-144) tieto závislosti boli opísané lineárnou regresnou funkciou: y=ax+b, kde a je regresný koeficient, b je voľný člen. Koeficient a v regresnej rovnici sa rovná dotyčnici sklonu priamky k osi x; koeficient b - vzdialenosť pozdĺž osi y od začiatku (0,0) k prvému bodu (x 1 , y 1).

Koeficienty a a b sa vypočítajú podľa vzorcov:

Regresná rovnica pre závislosť AS od množstva kyseliny askorbovej v danom čase má tvar:

y AK \u003d a x AK (mg) + b,

regresná rovnica pre závislosť AS od množstva skúmaného objektu (redukčného činidla):

y VOST \u003d a "x VOST (mg) + b",

kde pre AK je pre VOST optická hustota fotometrického roztoku;

x AK (mg), x VOST (mg) - koncentrácia kyseliny askorbovej (redukčné činidlo) v roztoku;

potom porovnaním hodnôt funkcií získame vzorec (I) na výpočet antioxidačnej aktivity skúmaného objektu v jednotkách množstva (mg) kyseliny askorbovej.

Na obrázku je znázornená závislosť analytického signálu od množstva redukčného činidla.

Optická hustota analyzovaných roztokov sa merala na fotoelektrickom kolorimetri KFK-2MP.

Je známe (F. Umland, A. Yasin, D. Tirik, G. Vunsch Komplexné zlúčeniny v analytickej chémii - M.: Mir, 1975. - 531 s.), že o-fenantrolín tvorí so železom vo vode rozpustný chelát ( II) červeno-oranžová farba, ktorá je charakterizovaná absorpčným maximom pri λ=512 nm. Preto sa v navrhovanej metóde fotometria uskutočňuje pri λ=510±20 nm.

Optimalizácia zloženia činidla a jeho množstva zavedeného do reakcie sa uskutočnila na základe výsledkov multifaktoriálneho plánovania experimentu metódou Latin Square, ktorá spočívala v zmene všetkých študovaných faktorov v každom experimente, a to v každom úroveň každého faktora len raz spĺňa rôzne úrovne iných faktorov. To vám umožňuje identifikovať a vyhodnotiť účinok spôsobený každým skúmaným faktorom samostatne.

Boli použité nasledujúce faktory: množstvá Fe(III), o-fenantrolínu a objem činidla zavedeného do reakcie. Kombinácia faktorov by mala poskytnúť široký rozsah linearity analytického signálu (AS) s dostatočnou citlivosťou na jednej strane a stabilitou činidla v priebehu času na strane druhej. To umožnilo vyčleniť pre každý faktor nasledujúce úrovne:

množstvo Fe(III): 0,003 M (Ai); 0,006 M (A2); 0,009 M (A3);

množstvo o-fenantrolínu: 0,01 M (B1); 0,02 M (B2); 0,03 M (B3);

objem činidla: 0,5 ml (C1); 1,0 ml (C2); 2,0 ml (C 3) (tabuľka 1).

Pre výber optimálnej kombinácie hladín faktorov boli získané kalibračné závislosti AS od množstva kyseliny askorbovej v rozsahu od 10 do 150 μg (čo je potrebné na potvrdenie linearity funkcie), regresná rovnica získanej závislosti bola vypočítaná a potom hodnota AS pri danom množstve (120 μg) kyseliny askorbovej. Pre každé zloženie činidla (faktory A, B) bol teda zvolený objem (faktor C), pri ktorom je hodnota AC maximálna. To umožnilo znížiť počet uvažovaných kombinácií na deväť (tabuľka 2).

Porovnaním celkových AS pre každú úroveň boli identifikované množstvá s maximálnou hodnotou: ΣA 2 (0,991); ΣBi (1,066); ΣC2 (1,361). To umožnilo dospieť k záveru, že zloženie činidla je optimálne: 0,006 M Fe (III) - 0,01 M o-fenantrolín s jeho objemom zavedeným do reakcie, 1,0 ml na 100 ml roztoku.

Pri optimálnej koncentrácii činidla sme študovali zmenu závislosti AS od koncentrácie kyseliny askorbovej a niektorých redukčných činidiel bežných v prírodných objektoch (tanín, rutín, kvercetín) pri rôznych inkubačných časoch reakčnej zmesi (30, 60 , 90, 120 minút). Zistilo sa, že u všetkých študovaných redukčných činidiel je závislosť AS od ich obsahu lineárna v rozmedzí 10-150 μg (pozri nákres) a hodnota AS závisí od inkubačnej doby (tabuľka 3).

Z nákresu je vidieť, že zmena AC pri pôsobení rutínu je nevýznamná, tanín sa približuje a kvercetín prevyšuje rovnakú závislosť pre kyselinu askorbovú. Pri zvažovaní zmeny AC od času inkubácie pre všetky študované redukčné činidlá (tabuľka 3) sa zistilo, že stabilizácia analytického signálu v priebehu času sa pozoruje od 90 minút.

Tabuľka 3 Zmena AS redukčných činidiel v priebehu času
Testovaná látka	m látok, mg/cm3	Analytický signál
Testovaná látka	m látok, mg/cm3	Doba inkubácie reakčnej zmesi, min
30	60	90	120
Vitamín C	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Tanín	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Rutín	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
kvercetín	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Na preukázanie sumárneho charakteru stanovenej hodnoty AOA bol študovaný účinok činidla Fe (III) - o-fenantrolínu na modelové roztoky, ktoré obsahovali redukčné činidlá: tanín, rutín, kvercetín a kyselinu askorbovú v rôznych pomeroch. Tabuľka 4 uvádza výsledky analýzy modelových zmesí.

Tabuľka 4 Výsledky analýzy modelových zmesí (P=0,95; n=3)
Počet zložiek v zmesi	Celková AOA, vypočítaná, mcgAA	Celková AOA, nájdená, mcgAA
zavedené	Celková AOA, vypočítaná, mcgAA	Celková AOA, nájdená, mcgAA	v zmysle AK
AK	Tanín	Rutín	kvercetín	AK	Tanín	Rutín	kvercetín
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Výpočet teoretickej hodnoty celkovej AOA bol uskutočnený podľa rovníc kvantitatívnej korešpondencie charakterizujúcich antioxidačnú kapacitu študovaného redukčného činidla vzhľadom na kyselinu askorbovú, za podmienok rovnakej antioxidačnej aktivity: .

Hodnota experimentálnej (nájdenej) AOA bola vypočítaná pomocou spriemerovanej regresnej rovnice pre závislosť AS od množstva kyseliny askorbovej. Z výsledkov uvedených v tabuľke 4 je vidieť, že experimentálne získané hodnoty AOA uspokojivo súhlasia s teoreticky vypočítanými hodnotami.

Stanovená hodnota AOA je teda celkovým ukazovateľom a určenie jej hodnoty pomocou rovníc kvantitatívnej korešpondencie je správne.

Navrhovaná metóda bola testovaná na reálnych vzorkách. Na stanovenie celkovej AOA reálnej vzorky alebo jej extraktu sa získali kalibračné závislosti AS od množstva analytu a kyseliny askorbovej pri inkubačnej dobe reakčnej zmesi aspoň 90 minút. Výpočet celkovej AOA sa uskutočnil podľa vzorca (I) a vyjadril sa v mg kyseliny askorbovej na gram testovaného objektu (mgAA/g).

Na potvrdenie správnosti navrhovanej metódy boli tieto vzorky testované podľa známych metód, pričom sa hodnotil obsah kyseliny askorbovej (GOST 24556-89 Spracované produkty z ovocia a zeleniny. Metódy stanovenia vitamínu C) a prevládajúcich redukčných činidiel: v čaji - tanín (GOST 19885-74 Čaj. Metódy stanovenia obsahu tanínu a kofeínu), v šípkach - množstvo organických kyselín (GOST 1994-93 šípky. Špecifikácie) (tabuľka 5).

], definícia antioxidantov ako chemických zlúčenín však neposkytuje úplný obraz o ochranných vlastnostiach skúmaného objektu: sú určené nielen množstvom toho či onoho antioxidantu, ale aj aktivitou každého z nich. . Antioxidačná aktivita alebo antioxidačná aktivita, AOA, je rýchlostná konštanta pre reakciu antioxidantu s voľným radikálom (kInH). Metóda chemiluminiscencie (CL) umožňuje určiť celkové množstvo radikálov, ktoré antioxidanty viažu vo vzorke (celková antioxidačná kapacita, TAU), a pri použití metódy matematického modelovania kinetiky CL aj rýchlosť tvorby a reakcie radikály s antioxidantmi, t.j. AOA [ , , ].

Najbežnejšia modifikácia chemiluminiscenčnej metódy na stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity je založená na použití luminolu ako chemiluminiscenčného aktivátora [ , , , ]. Do kyvety chemiluminometra sa umiestni vzorka s prídavkom luminolu, peroxidu vodíka a zlúčeniny schopnej vytvárať radikály v dôsledku spontánneho rozkladu (termolýzy), napríklad 2,2'-azobis-(2-amidinopropán) dihydrochlorid (ABAP): ABAP -> 2R. V prítomnosti molekulárneho kyslíka tvorí alkylový radikál R peroxylový radikál ROO : R + 02 → ROO . Ďalej peroxylový radikál oxiduje chemiluminiscenčnú sondu luminol (LH 2) a vzniká luminolový radikál (LH ): ROO + LH 2 → ROOH + LH . Z LH sa vytváraním medziproduktov (hydroperoxid luminolu a endoperoxid luminolu) v elektronicky excitovanom stave vytvorí molekula konečného produktu oxidácie luminolu, kyselina aminoftalová, ktorá emituje fotón a v dôsledku toho sa pozoruje chemiluminiscencia. . Intenzita CL je úmerná rýchlosti produkcie fotónov, ktorá je zase úmerná stacionárnej koncentrácii LH v systéme. Interakciou s radikálmi antioxidanty prerušujú opísaný reťazec premien a zabraňujú tvorbe fotónu.

Zlúčeniny podliehajúce termolýze nie sú jediným možným zdrojom radikálov pri analýze antioxidačnej kapacity vzorky chemiluminiscenčnou metódou. Alternatívou sú systémy chrenová peroxidáza – peroxid vodíka [ , ], hemín – peroxid vodíka, cytochróm s–kardiolipín–peroxid vodíka atď. Schéma reakcií oxidácie luminolu peroxidázami sa zaoberá v práci Cormiera et al. .

Kinetické krivky CL pre tieto systémy odrážajú dve fázy reakcie: štádium zvýšenia intenzity CL a štádium plató alebo postupného poklesu luminiscencie, keď je intenzita CL buď konštantná, alebo pomaly klesá. Článok popisuje dva prístupy k meraniu celkovej antioxidačnej kapacity, ktoré zohľadňujú túto vlastnosť kriviek. Metóda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) je založená na meraní latentnej periódy CL τ a možno ich použiť na stanovenie antioxidantov ako je trolox alebo kyselina askorbová: vyznačujú sa vysokou hodnotou konštanty rýchlosti reakcie s radikálmi a z tohto dôvodu ich možno nazvať silnými antioxidantmi. Počas latentného obdobia dochádza k ich úplnej oxidácii. Metóda TAR (Total Antioxidant Reactivity) meria stupeň zhášania chemiluminiscencie q na plató alebo na maxime chemiluminiscenčnej krivky: vzorec , kde I je intenzita chemiluminiscencie bez antioxidantu a I1 je intenzita CL v prítomnosti antioxidantu. Táto metóda sa používa, ak systém obsahuje prevažne slabé antioxidanty s nízkymi rýchlostnými konštantami interakcie s radikálmi - oveľa nižšími v porovnaní s luminolovou konštantou.

Pôsobenie antioxidantov je charakterizované nielen indikátormi τ a q. Ako je možné vidieť z [ , ], účinok takých antioxidantov, ako je kyselina močová v systéme hemín-H2O2-luminol alebo tokoferol, rutín a kvercetín v cytochróme s–kardiolipín–H 2 O 2 –luminol, charakterizovaný zmenou maximálnej rýchlosti vzostupu CL ( vmax). Ako ukazujú výsledky matematického modelovania kinetiky, hodnoty rýchlostných konštánt interakcie týchto antioxidantov s radikálmi sú blízke hodnote luminolovej konštanty, preto sa takéto antioxidanty môžu nazývať stredne silné antioxidanty.

Ak by skúmaný materiál, najmä rastlinné suroviny, obsahoval iba jeden typ antioxidantov, potom by ich obsah mohol byť charakterizovaný jedným z troch vyššie uvedených ukazovateľov ( τ , q alebo vmax). Rastlinné suroviny ale obsahujú zmes antioxidantov rôznej sily. Na vyriešenie tohto problému niektorí autori [ , , , ] použili zmenu sumy chemiluminiscenčného svetla za určitý čas ∆S, vypočítanú podľa vzorca , kde ∆ S0 a ∆ S S- Svetelné súčty CL za daný čas t v kontrolnej a testovanej vzorke. Čas by mal byť dostatočný na oxidáciu všetkých antioxidantov v systéme, to znamená na to, aby CL krivka testovanej vzorky dosiahla úroveň CL krivky kontrolnej vzorky. Posledne menovaný naznačuje, že výskumníci by mali nielen zaznamenávať svetelný súčet luminiscencie, ale mali by zaznamenávať aj krivku kinetiky CL na dostatočne dlhú dobu, čo sa zďaleka nerobí vždy.

Pretože všetky merané ukazovatele závisia od zariadenia a podmienok merania, antioxidačný účinok látky v skúmanom systéme sa zvyčajne porovnáva s účinkom antioxidantu braného ako štandard, napríklad Trolox [ , ].

Systém chrenová peroxidáza – peroxid vodíka bol použitý na analýzu celkovej antioxidačnej kapacity rastlinných materiálov mnohými autormi. V prácach [ , ] bola na odhad množstva antioxidantov vo vzorkách použitá latentná perióda CL (metóda TRAP) a v prácach [ , , ] plocha pod krivkou vývoja CL. Uvedené práce však neposkytujú jasné odôvodnenie výberu jedného alebo druhého parametra na odhad TAU.

Cieľom štúdie bolo zistiť, ako pomer antioxidantov rôznych typov ovplyvňuje TAU a upraviť chemiluminiscenčnú metódu tak, aby bolo možné presnejšie stanoviť TAU v rastlinných materiáloch. Aby sme to dosiahli, stanovili sme si niekoľko úloh. Po prvé, porovnať CL kinetiku študovaných objektov s kinetikou štandardných antioxidantov troch typov (silné, stredné a slabé), aby sme pochopili, ktorý typ antioxidantov tvorí hlavný príspevok k TAE študovaných objektov. Po druhé, vypočítať RAE študovaných objektov meraním poklesu súčtu svetla CL pri pôsobení týchto objektov v porovnaní s pôsobením antioxidantu, ktorý poskytuje najväčší príspevok k TAC.

MATERIÁLY A METÓDY

Predmetom štúdie boli priemyselné vzorky plodov hlohu, jaseňa a divokej ruže z produkcie Krasnogorskleksredstva JSC (Rusko), ako aj plodov malín zozbieraných autormi v Moskovskej oblasti v podmienkach prirodzeného rastu a sušených pri teplote 60–80 °C, kým neprestanú vytláčať šťavu a tlakové deformácie.

Činidlá na analýzu antioxidačnej kapacity chemiluminiscenčnou metódou boli: KH2P04, 20 mM tlmivý roztok (pH 7,4); peroxidáza z koreňov chrenu (aktivita 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM vodný roztok; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazíndión, hydrazid kyseliny 3-aminoftalovej, M=177,11), 1 mM vodný roztok; peroxid vodíka (H202, M = 34,01), 1 mM vodný roztok; roztoky antioxidantov (kyselina askorbová, kvercetín, tokoferol). Všetky činidlá boli vyrobené spoločnosťou Sigma Aldrich (USA).

Odvary z plodov hlohu, jaseňa a divokej ruže a nálev z malinových plodov boli pripravené podľa metodiky Štátneho liekopisu ZSSR uvedenej vo všeobecnom liekopisnom článku „Nálevy a odvary“.

Celková antioxidačná kapacita bola stanovená registráciou chemiluminiscencie na chemiluminometri Lum-100 (DISoft, Rusko) pomocou softvéru PowerGraph 3.3. Na stanovenie TAU v rastlinných materiáloch sa použije 40 µl luminolu v koncentrácii 1 mM, 40 µl chrenovej peroxidázy v koncentrácii 0,1 µM, od 10 do 50 µl odvaru alebo infúzie (v závislosti od koncentrácie) a fosfátový tlmivý roztok v množstve potrebnom na úpravu celkového objemu vzorky na 1 ml. Kyveta sa nainštalovala do zariadenia a zaznamenal sa CL, pričom sa pozoroval signál pozadia. Po 48 sekundách registrácie signálu pozadia sa do kyvety pridalo 100 ul H202 s koncentráciou 1 mM a registrácia CL pokračovala 10 minút. Boli pripravené štyri vzorky s rôznymi koncentráciami každého z rastlinných objektov. CL bol tiež zaznamenaný pre roztoky kyseliny askorbovej, kvercetínu a tokoferolu v piatich rôznych koncentráciách pre každý z antioxidantov. Následne bola TAU vzoriek odvarov a infúzií prepočítaná na kvercetín.

Koncentrácie luminolu, chrenovej peroxidázy a peroxidu vodíka boli zvolené tak, aby sa v primeranom čase (nie viac ako 10 minút) stanovila antioxidačná kapacita vodných extraktov z liečivých rastlinných materiálov. Počas tejto doby chemiluminiscenčné krivky pre antioxidanty askorbát a flavonoid kvercetín (hlavné antioxidanty rastlinných materiálov) dosiahli plató, čo naznačovalo úplné zničenie antioxidantov v systéme. Riedenie študovaných vzoriek a koncentrácie roztokov štandardných antioxidantov (uvedené v titulkoch k obrázkom) boli zvolené tak, aby všetky CL kinetické krivky boli merané pri rovnakej citlivosti prístroja.

Antioxidačná kapacita bola vypočítaná zo zmeny plochy (∆ S) pod kinetickou krivkou chemiluminiscencie (svetelný súčet) s prídavkom látky obsahujúcej antioxidant. Pre toto sme počítali S0 pre systém bez antioxidantu a odpočítaná od toho plocha S S charakterizujúce systém, do ktorého bol antioxidant pridaný. hodnota ∆ S závisí od citlivosti chemiluminometra a podmienok merania. Pomer ∆ S/C V(kde C- koncentrácia študovaného biologického materiálu v kyvete, g/l, a V- objem kyvety, l) vyjadruje antioxidačnú kapacitu 1 g študovaného materiálu, t.j. rastlinných materiálov.

Antioxidačná kapacita ∆ S A roztok štandardného antioxidantu, ako je kvercetín, umiestnený v rovnakom objeme reakčnej zmesi. Pomer ∆ S A / C A V(kde C A- hmotnostná koncentrácia antioxidantu v kyvete, g/l) vyjadruje antioxidačnú kapacitu 1 g antioxidantu.

Pre každý zo štandardných antioxidantov sa zaznamenal signál z roztokov niekoľkých koncentrácií, aby sa zaistilo, že výpočty boli vykonané v medziach lineárneho vzťahu a získané výsledky boli reprodukovateľné. V skutočnosti bola získaná lineárna závislosť (∆ S A = k A C A) signál z koncentrácie, z ktorej bol vypočítaný stechiometrický koeficient kA. Podľa Fisherovho kritéria hodnoty získané pre štandardné antioxidanty kAštatisticky významné s pravdepodobnosťou 0,975. Ďalej bol pre každú zo štyroch vzoriek rastlín zaznamenaný signál zo štyroch koncentrácií a pre všetky vzorky bola zaznamenaná lineárna závislosť signálu od koncentrácie (∆ S = k C), ktorý sa použil na výpočet stechiometrického koeficientu k. S pravdepodobnosťou 0,975 (Fischerov test) sú hodnoty k získané pre vzorky rastlín štatisticky významné. Celková antioxidačná kapacita rastlinného materiálu z hľadiska hmotnosti štandardného antioxidantu (mg %) bola zistená pomocou vzorca .

Hodnoty boli prezentované ako aritmetický priemer ± štandardná odchýlka (M ± δ) pri p

VÝSLEDKY ŠTÚDIE

Štúdium kinetiky chemiluminiscencie v prítomnosti askorbátu sodného (obr. 1. Vplyv askorbátu sodného na kinetiku chemiluminiscencie" data-note="Koncentrácie zložiek systému: luminol - 40 µM, chrenová peroxidáza - 4 nM, peroxid vodíka - 100 µM. Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,05 µM; 3 - 0,10 µM; 4 - 0,15 µM; 5 - 0,2 µM; 6 - 0,25 µM askorbát sodný. antioxidant sa vyznačuje latentným obdobím, kedy je CL takmer úplne potlačený. je úmerná množstvu antioxidantu v systéme.Zároveň sa nemení ani sklon kriviek CL, ani intenzita CL na plató.Je to spôsobené tým, že kyselina askorbová je silný antioxidant, ktorý zachytáva všetky radikály tvorené v systéme, vrátane luminolových radikálov, a CL sa nevyvinie, kým sa všetok askorbát nezoxiduje.

Iní výskumníci tiež ukázali, že výsledky chemickej analýzy a hodnota TAU stanovená chemiluminiscenčnou metódou sa často nezhodujú. V práci celková antioxidačná kapacita stanovená v systéme peroxidáza–luminol–peroxid vodíka korelovala s obsahom triterpénových zlúčenín. V práci tých istých autorov, v ktorej bola predmetom skúmania iná rastlina, však nebola pozorovaná žiadna korelácia medzi TAU a obsahom žiadnej skupiny látok, vrátane flavonoidov.

Tieto nezrovnalosti súvisia najmenej s tromi faktormi. Po prvé, dôležitá je aktivita antioxidantov, teda rýchlosť ich interakcie s radikálmi, ktorá je pre rôzne antioxidanty, ktoré tvoria rastlinnú vzorku, rozdielna. Podľa Izmailova sú rýchlostné konštanty zodpovedajúcich reakcií pre mexidol, tokoferol a kvercetín vo vzťahu 0,04: 2: 60. Po druhé, každá molekula antioxidantu, ktorá vstupuje do chemickej reakcie, môže zachytiť rôzny počet radikálov. Podľa práce kvercetín, kyselina močová a kyselina askorbová zachytili 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 a 0,5 ± 0,2 radikálov na zreagovanú molekulu antioxidantu (bol použitý systém hemín–H 2 O 2 – luminol). Po tretie, výsledky štúdie by mohli byť ovplyvnené prítomnosťou aktivity peroxidázy v samotných vzorkách rastlín, ako v práci, ako aj prítomnosťou vápnika vo vzorkách, ktorý, ako je uvedené v práci, je schopný zvýšiť aktivita chrenovej peroxidázy za určitých podmienok. To zvyčajne spôsobuje vyššiu intenzitu CL na plató ako na kontrolných krivkách, čo sme však nepozorovali.

Prvý faktor výrazne obmedzuje použitie takého parametra, ako je zmena svetelného súčtu, keďže čas merania chemiluminiscencie by mal byť dlhší ako čas spotreby všetkých antioxidantov v testovanej vzorke. Prístup k tomuto momentu možno posúdiť iba meraním kinetiky chemiluminiscencie. Okrem toho je príspevok slabých antioxidantov k OAE výrazne podceňovaný, pretože čas ich úplnej oxidácie je mnohonásobne dlhší ako prijateľný čas merania (10–20 minút).

Ešte väčší význam má stechiometrický koeficient antioxidantu. Počet radikálov n, ním zachytený, sa rovná , kde ρ - stechiometrický koeficient a ∆ m- zmena koncentrácie antioxidantu počas merania, v našom prípade - počiatočná koncentrácia testovanej látky v testovanej vzorke.

Rozdiel v súčte svetla v neprítomnosti antioxidantu a v jeho prítomnosti je úmerný n. Celkový počet zachytených radikálov je , kde ρ i je stechiometrický koeficient konkrétneho antioxidantu a m i- jeho koncentrácia počas merania. Celkový počet zachytených radikálov sa zjavne nerovná celkovému množstvu antioxidantov, pretože koeficienty ρ i sa nielenže nerovnajú jednote, ale výrazne sa líšia aj pre rôzne antioxidanty.

Hodnota n je úmerná rozdielu v sumách svetla nameraných za určitý čas medzi vzorkou obsahujúcou antioxidant a kontrolnou vzorkou bez antioxidantov: S = k n, kde k- konštanta koeficientu za rovnakých podmienok merania.

Metóda uvedená v článku umožňuje určiť celkovú antioxidačnú kapacitu, zatiaľ čo chemická analýza umožňuje určiť celkový obsah antioxidantov v produkte. Preto sa zdá, že chemiluminiscenčná metóda je informatívnejšia ako chemické analýzy.

Podmienky, ktoré sme zvolili na posúdenie celkovej antioxidačnej kapacity rastlinných surovín zaznamenávaním kinetiky chemiluminiscencie v systéme pozostávajúcom z chrenovej peroxidázy, peroxidu vodíka a luminolu (koncentrácie zložiek sú 4 nM, 100 μM a 40 μM, v tomto poradí; 20 mM fosfátový pufor, pH 7,4), zabezpečil oxidáciu silných antioxidantov (kyselina askorbová) a stredne silných antioxidantov (kvercetín) za 10 min. Toto trvanie merania je pohodlné a zabezpečuje požadovanú kvalitu meraní.

Analýza kinetiky chemiluminiscencie ukázala, že v skúmaných objektoch (odvary z jarabiny, divozelu, plodov hlohu a nálevu z plodov malín) sú hlavnými antioxidantmi stredne silné antioxidanty vrátane flavonoidov a slabo silné antioxidanty (tokoferol atď.). ). Na základe poklesu sumy chemiluminiscenčného svetla bola vypočítaná celková antioxidačná kapacita pre študované objekty. Porovnanie získaných hodnôt TAU s výsledkami chemickej analýzy ukázalo, že produkty obsahujúce rovnaké množstvo antioxidantov v rôznych pomeroch sa môžu líšiť v schopnosti účinne chrániť organizmus pred škodlivými účinkami voľných radikálov. Opísaná technika je sľubná pre štúdium rastlinných objektov obsahujúcich zmes rôznych antioxidantov. Zároveň sa vyznačuje jednoduchosťou a nízkymi nákladmi na výskum. Spojenie merania kinetiky chemiluminiscencie s matematickým modelovaním reakcií nielen zautomatizuje proces stanovenia TAU, ale aj určí príspevok jednotlivých skupín antioxidantov k indexu.

absolventská práca

1.4 Metódy výskumu antioxidantov

antioxidačná aktivita sa klasifikuje: podľa metód registrácie prejavenej AOA (volumetrické, fotometrické, chemiluminiscenčné, fluorescenčné, elektrochemické); podľa typu zdroja oxidácie; podľa typu oxidovanej zlúčeniny; podľa spôsobu merania oxidovanej zlúčeniny.

Najznámejšie metódy na stanovenie antioxidačnej aktivity sú však:

1 TEAC (trox ekvivalentná antioxidačná kapacita): metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

Metmyoglobín + H 2 O 2 > Ferylglobín + ABTS > ABTS * + AO.

Metóda ekvivalencie Trolox (TEAC) je založená na schopnosti antioxidantov redukovať 2,2-azinobis radikálové katióny (ABTS) a tým inhibovať absorpciu v časti spektra s dlhou vlnovou dĺžkou (600 nm). Významnou nevýhodou metódy je dvojstupňová reakcia získania radikálu. To predlžuje čas analýzy a môže zvýšiť rozptyl výsledkov napriek skutočnosti, že na analýzu sa používa štandardizovaná sada činidiel.

2 FRAP (železo redukujúca antioxidačná sila): metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

Fe(III)-tripyridyltriazín+AO>Fe(II)-tripyridyltriazín.

Železo redukujúca/antioxidačná kapacita (FRAP). Tu sa používa redukčná reakcia Fe(III)-tripyridyltriazín na Fe(II)-tripyridyltriazín. Táto metóda však nedokáže určiť niektoré antioxidanty, ako je glutatión. Táto metóda umožňuje priame stanovenie antioxidantov s nízkou molekulovou hmotnosťou. Pri nízkom pH je redukcia tripyridyltriazínového komplexu Fe(III) na komplex Fe(II) sprevádzaná objavením sa intenzívnej modrej farby. Merania sú založené na schopnosti antioxidantov potlačiť oxidačný účinok reakčných častíc vznikajúcich v reakčnej zmesi. Táto metóda je jednoduchá, rýchla a nenáročná na realizáciu.

3 ORAC (absorbčná kapacita kyslíkových radikálov): metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

Fe (II) + H202 > Fe (III) + OH* + AO> OH* + Luminol.

Stanovenie schopnosti absorbovať kyslíkové radikály (ORAC). Pri tejto metóde sa zaznamenáva fluorescencia substrátu (fykoerytrínu alebo fluoresceínu), ku ktorej dochádza v dôsledku jeho interakcie s ROS. Ak sú v testovanej vzorke antioxidanty, potom sa pozoruje pokles fluorescencie v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Túto metódu pôvodne vyvinul Dr. Guohua Cao v Národnom inštitúte starnutia v roku 1992. V roku 1996 sa Dr. Cao spojil s Dr. Ronaldom Pryerom v spoločnej skupine vo výskumnom centre USDA pre starnutie, kde bola vyvinutá poloautomatická metóda. vyvinuté.

4 TRAP (úplný antioxidačný parameter zachytávajúci radikály): metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

AAPH+AO>AAPH* + PL (PE).

Táto metóda využíva schopnosť antioxidantov interagovať s peroxylovým radikálom 2,2-azobis(2-amidinopropán) dihydrochloridom (AAPH). Modifikácie TRAP pozostávajú z metód na registráciu analytického signálu. Najčastejšie v konečnom štádiu analýzy AAPH peroxyradikál interaguje s luminiscenčným (luminolom), fluorescenčným (dichlórfluorescín diacetát, DCFH-DA) alebo iným opticky aktívnym substrátom.

Vo vode rozpustný derivát vitamínu E Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboxylová kyselina) sa používa ako štandard pre metódy TEAC, ORAC a TRAP.

V poslednom čase vzrástol záujem o využitie elektrochemických metód na hodnotenie antioxidačnej aktivity. Tieto metódy sú vysoko citlivé a rýchle analýzy.

Hodnotenie antioxidačnej aktivity niektorých potravinárskych výrobkov sa uskutočňuje potenciometrickou metódou, založenou na využití vlastnosti antioxidačných látok podieľať sa na redoxných reakciách v dôsledku enolových (-OH) a sulfhydrylových (-SH) skupín.

Stanovenie antioxidačných vlastností roztokov je založené na chemickej interakcii antioxidantov so systémom mediátorov, čo vedie k zmene jeho redoxného potenciálu. Elektrochemický článok je nádoba obsahujúca tlmivý roztok K-Na-fosfátu, mediátorový systém Fe(III)/Fe(II) a komplexnú elektródu pred meraním redox potenciálu. Antioxidačná aktivita sa odhaduje v g-ekv/l.

Amperometrická metóda stanovenia antioxidačnej aktivity je založená na meraní elektrického prúdu, ktorý vzniká pri oxidácii testovanej látky na povrchu pracovnej elektródy, ktorá je pod určitým potenciálom. Citlivosť amperometrickej metódy je určená povahou pracovnej elektródy a potenciálom, ktorý je na ňu aplikovaný. Detekčný limit amperometrického detektora polyfenolov, flavonoidov na úrovni nanopikogramov, pri takto nízkych koncentráciách je nižšia pravdepodobnosť vzájomného ovplyvňovania rôznych antioxidantov v ich spoločnej prítomnosti, najmä prejav fenoménu synergizmu. . Nevýhody metódy zahŕňajú jej špecifickosť: za týchto podmienok nie je možné analyzovať antioxidanty, ktoré samotné sú oxidované alebo redukované v oblasti potenciálov elektroredukcie kyslíka. Medzi výhody metódy patrí jej rýchlosť, prostata a citlivosť.

Galvanostatická coulometrická metóda využívajúca elektrogenerované oxidanty - metóda je použiteľná na analýzu antioxidantov rozpustných v tukoch.

Na stanovenie kyseliny askorbovej boli vyvinuté rôzne metódy:

amperometrická metóda využívajúca hliníkovú elektródu modifikovanú filmom hexakyanoželezitanu nikelnatého jednoduchou metódou ponorenia do roztoku;

metóda na spektrofotometrické a vizuálne stanovenie kyseliny askorbovej v tuhej fáze s použitím xerogélu kyseliny kremičitej modifikovaného Wawelovým činidlom a meďou (II) ako indikátorovým práškom;

chemiluminiscenčné stanovenie kyseliny askorbovej sa môže uskutočniť prietokovou injekčnou metódou podľa chemiluminiscenčnej reakcie rodamínu B s cérom (IV) v prostredí kyseliny sírovej.

stanovenie kyseliny askorbovej v rozsahu 10 -8 -10 -3 g/cm 3 anodickou voltametriou vo vodnom a vodno-organickom prostredí.

Najbežnejšia je metóda FRAP, keďže je expresná, vysoko citlivá. Počas niekoľkých posledných desaťročí sa vyvinulo veľké množstvo rôznych metód na stanovenie antioxidačnej aktivity metódou FRAP (tabuľka 1).

Tabuľka 1 Vývoj metódy FRAP a jej aplikácia na stanovenie antioxidačnej aktivity rôznych predmetov

	Predmety analýzy	Poznámky
	krvnej plazmy	t = 4 min. Študovala sa reakčná stechiometria a aditívnosť.
	Čaj, víno	Stanovenie AOA v dôsledku polyfenolov
		Porovnávajú sa hodnoty AOA rôznych druhov čaju
Pulido, Bravo, Saura-Calixto	Modelové riešenia	t = 30 min. Zistil sa vplyv nevodného rozpúšťadla
	Rastliny
	krv, tkanivo	metóda PIA. Kontroloval sa vplyv cudzorodých látok.
Firuzi, Lacanna, Petrucci atď.	Modelové riešenia	Študovala sa citlivosť stanovenia rôznych AO ako funkcia ich štruktúry a redoxného potenciálu.
Katalinic, Miloš,	Rôzne vína
Temerdashev, Tsyupko a ďalší.	Modelové zmesi
Loginová, Konovalová	Lieky. Prípravky	testovacia metóda
Temerdashev, Tsyupko a ďalší.	Červené suché vína	Korelácia AOA s inými ukazovateľmi kvality vína
Tabuľka 1 pokračuje
	Modelové zmesi	Citlivosť stanovenia rôznych AO
Vershinin, Vlasova, Tsyupko	Modelové zmesi	Bola odhalená neaditívnosť signálu s nedostatkom oxidačného činidla
Anisimovič, Deineka a ďalší.	Modelové riešenia	Navrhujú sa kinetické parametre pre odhad AOA.

Poznámky: konvenčne označené: FIA-flow-injection analýza, TPTZ-tripyridyltriazín, DIP-2,2, -dipyridyl, PHEN-o-fenantrolín, DPA-pyridíndikarboxylová kyselina, FZ-ferrozín, AA-askorbová kyselina, CT-katechol, t - doba expozície, min.

Interakcia medzi proteínmi a polyelektrolytmi vo vodných roztokoch

Na charakterizáciu komplexov proteín-polyelektrolyt sa používajú rôzne metódy analýzy. Inštrumentálne metódy poskytujú informácie o štruktúrnych a optických vlastnostiach, ako aj určujú dynamiku a povahu väzby PEC...

Vplyv d-kovových zlúčenín na rýchlosť disociácie molekuly vody v bipolárnej membráne

V procese syntézy nových BPM je potrebné venovať veľkú pozornosť štúdiu vlastností získaných vzoriek pre následný výber podmienok syntézy, ktoré zabezpečia zlepšenie elektrochemických charakteristík syntetizovaných membrán...

Dizajnérske drogy a syntetické kanabinoidy

Detekciu syntetických kanabinoidov v rastlinných zmesiach možno vykonávať rôznymi fyzikálno-chemickými metódami, ako je chromatografia-hmotnostná spektrometria, plynová, tenkovrstvová a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia...

Vývoj metódy na stanovenie flavonoidov v liečivých rastlinných materiáloch

Syntéza a farmakologické vlastnosti chinolinónov-2

Predmet štúdie: Chinolín-2. Metóda výskumu: Pomocou počítačového programu „Marvin JS“ bola vytvorená štruktúra látky. Potom bola poslaná na stránku "http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php" na ďalšie vyšetrovanie...

Termospektrálna metóda na štúdium produktov odparovania epoxidového polyméru

Technológia na získanie vysoko purifikovaného chitosanu z lastúr kôrovcov

Stanovenie molekulovej hmotnosti chitosanu Molekulová hmotnosť chitosanu bola stanovená viskozimetricky podľa štandardného postupu. Roztoky s koncentráciou 0,05 a 0,5 g/dl boli pripravené rozpustením odváženej časti polymérneho prášku v acetátovom pufri (0...

Fyzikálna a geografická charakteristika územia prírodného parku

Kľúčové slová

voľný radikál/antioxidant/ antioxidačná aktivita / celková antioxidačná kapacita / chemiluminiscencia/ luminol / voľný radikál / antioxidant / antioxidačná aktivita / celková antioxidačná kapacita / chemiluminiscencia / luminol

anotácia vedecký článok o chemických vedách, autor vedeckého článku - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Liečivé rastlinné materiály sú jedným zo zdrojov antioxidantov pre ľudský organizmus. Spomedzi metód na stanovenie obsahu antioxidantov v rastlinných objektoch je rozšírená metóda chemiluminiscenčnej analýzy. V tejto práci sa použil na odhad celková antioxidačná kapacita(OAU) odvary z jarabiny, divokej ruže a plodov hlohu a nálev z plodov malín. V experimente sa zaznamenávala kinetika chemiluminiscencia v systéme pozostávajúcom z chrenovej peroxidázy, peroxidu vodíka a luminolu. Koncentrácie a objemy komponentov systému vo vzorke boli zvolené tak, aby silné antioxidanty (kyselina askorbová) a stredne silné antioxidanty (kvercetín) boli počas doby merania (10 min) úplne zoxidované. Je navrhnutý a odôvodnený spôsob výpočtu TAU na základe zmeny svetelného súčtu. chemiluminiscencia v prítomnosti vzoriek rastlín. Kinetická analýza chemiluminiscencia ukázali, že v skúmaných objektoch prevládajú stredne silné antioxidanty vrátane flavonoidov a slabé antioxidanty (tokoferol a pod.). Porovnanie vypočítaných hodnôt TAU pre študované objekty a údaje z ich chemickej analýzy ukázali, že produkty obsahujúce rovnaké množstvo antioxidantov s rôznym pomerom podľa typu sa môžu líšiť v schopnosti chrániť organizmus pred škodlivými účinkami voľných radikálov. Opísaná technika je perspektívna pre štúdium rastlinných objektov obsahujúcich zmes antioxidantov rôznych typov.

Súvisiace témy vedecké práce v chemických vedách, autor vedeckého článku - Georgy Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

2016 / Georgij Vladimirov, Sergunova E.V., Izmaylov D.Yu., Vladimirov Yu.A.
Stanovenie antioxidantov aktivovanou chemiluminiscenciou s použitím 2,2"-azo-bis(2-amidinopropánu)
2012 / Alekseev A.V., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Antioxidačné pôsobenie dihydrokvercetínu a rutínu v peroxidázových reakciách katalyzovaných cytochrómom c
2008 / Demin E.M., Proskurnina E.V., Vladimirov Yu.A.
Hodnotenie oxidačnej a antioxidačnej kapacity biologických substrátov pomocou chemiluminiscencie indukovanej Fentonovou reakciou
2016 / Piskarev Igor Michajlovič, I.P. Ivanova
Stanovenie obsahu lipohydroperoxidov v lipoproteínoch krvného séra systémom mikroperoxidáza-luminol
2011 / Teselkin Jurij Olegovič, Babenková Irina Vladimirovna
Metódy štúdia antioxidantov
2004 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V.
Antioxidačná aktivita rastlín používaných v etnomedicíne Tuvy
2012 / Chekhani N.R., Teselkin Yu.O., Pavlova L.A., Kozin S.V., Lyubitsky O.B.
Štúdium antioxidačných vlastností Fosprenilu v rôznych biologických testovacích systémoch
2017 / A. V. Sanin, A. N. Narovlyansky, A. V. Pronin, T. N. Kozhevnikova, V. Yu. Sanina, A. D. Agafonova
Vplyv rôznych dávok polychlórovaných bifenylov na stav spontánnej a imunoglobulínmi indukovanej luminol-dependentnej chemiluminiscencie plnej krvi
2016 / Gabdulkhakova I.R., Kayumova A.F., Samohodova O.V.
Hodnotenie lipidového peroxidačného systému antioxidačnej ochrany u detí s esenciálnou arteriálnou hypertenziou pomocou spektrofotometrických a chemiluminiscenčných metód
2014 / Natyaganova Larisa Viktorovna, Gavrilova Oksana Aleksandrovna, Kolesnikova Larisa Romanovna

Chemiluminiscenčné stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity v liečivom rastlinnom materiáli

Liečivý rastlinný materiál je jedným zo zdrojov antioxidantov pre ľudský organizmus. Chemiluminiscenčná analýza je jednou z bežných metód stanovenia obsahu antioxidantov v rastlinných materiáloch. V našej práci bola chemiluminiscenčná analýza použitá na stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity (TAC) ovocných odvarov jaseňa, ruže a hlohu, ako aj nálevu z malinového ovocia. Experimenty stanovili kinetiku chemiluminiscencie systému pozostávajúceho z chrenovej peroxidázy, peroxidu vodíka a luminolu. Koncentrácie a objemy komponentov systému boli zvolené tak, aby silné antioxidanty (kyselina askorbová) a antioxidanty strednej sily (kvercetín) boli počas merania (10 minút) úplne oxidované. Bola navrhnutá a zdôvodnená metóda výpočtu TAC založená na zmenách súčtu chemiluminiscenčného svetla v prítomnosti vzoriek rastlín. Analýza kinetiky chemiluminiscencie ukázala, že v skúmaných objektoch dominujú antioxidanty priemernej sily, vrátane flavonoidov a slabých antioxidantov (tokoferol a iné). Porovnanie vypočítaných hodnôt TAC pre skúmané objekty a ich údaje z chemickej analýzy ukázali, že produkty obsahujúce rovnaké množstvo antioxidantov s rôznymi pomermi antioxidantov podľa typu sa môžu líšiť v ich schopnosti chrániť telo pred škodlivými účinkami voľných radikálov. . Opísaná technika je sľubná pre štúdium rastlinných objektov obsahujúcich zmes rôznych typov antioxidantov.

Text vedeckej práce na tému "Chemiluminiscenčná metóda stanovenia celkovej antioxidačnej kapacity v liečivých rastlinných materiáloch"

chemiluminiscenčná metóda na stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity v liečivých rastlinných materiáloch

G. K. Vladimirov1^, E. V. Sergunova2, D. Yu. Izmailov1, Yu. A. Vladimirov1

1 Ústav lekárskej biofyziky, Fakulta základného lekárstva, Moskovská štátna univerzita Lomonosova, Moskva

2 Katedra farmakognózie, Farmaceutická fakulta,

I. M. Sechenov Prvá Moskovská štátna lekárska univerzita, Moskva

Liečivé rastlinné materiály sú jedným zo zdrojov antioxidantov pre ľudský organizmus. Spomedzi metód na stanovenie obsahu antioxidantov v rastlinných objektoch je rozšírená metóda chemiluminiscenčnej analýzy. V tejto práci bola použitá na hodnotenie celkovej antioxidačnej kapacity (TOA) odvarov z jarabiny, divokej ruže, hlohu a infúzie plodov malín. V experimente sa kinetika chemiluminiscencie zaznamenávala v systéme pozostávajúcom z chrenovej peroxidázy, peroxidu vodíka a luminolu. Koncentrácie a objemy komponentov systému vo vzorke boli zvolené tak, aby silné antioxidanty (kyselina askorbová) a stredne silné antioxidanty (kvercetín) boli počas doby merania (10 min) úplne zoxidované. Navrhuje sa a zdôvodňuje metóda výpočtu RAE na základe zmeny sumy chemiluminiscenčného svetla v prítomnosti vzoriek rastlín. Analýza kinetiky chemiluminiscencie ukázala, že v skúmaných objektoch prevládajú stredne silné antioxidanty vrátane flavonoidov a slabé antioxidanty (tokoferol a pod.). Porovnanie vypočítaných hodnôt TAU pre študované objekty a údaje z ich chemickej analýzy ukázali, že produkty obsahujúce rovnaké množstvo antioxidantov s rôznym pomerom podľa typu sa môžu líšiť v schopnosti chrániť organizmus pred škodlivými účinkami voľných radikálov. Opísaná technika je perspektívna pre štúdium rastlinných objektov obsahujúcich zmes antioxidantov rôznych typov.

Kľúčové slová: voľný radikál, antioxidant, antioxidačná aktivita, celková antioxidačná kapacita, chemiluminiscencia, luminol

Financovanie: Táto práca bola podporená Ruskou vedeckou nadáciou, grant číslo 14-15-00375.

Ex3 Korešpondencia by mala byť adresovaná: Georgij Konstantinovič Vladimirov

119192, Moskva, Lomonosovsky pr-t, 31, budova 5; [chránený e-mailom]

Článok prijatý: 03.10.2016 Článok prijatý na uverejnenie: 18.03.2016

chemiluminiscenčné stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity v liečivom rastlinnom materiáli

1 Ústav lekárskej biofyziky, Fakulta základného lekárstva, Moskovská štátna univerzita Lomonosova, Moskva, Rusko

2 Katedra farmakognózie, Farmaceutická fakulta,

Prvá Sechenov Moskovská štátna lekárska univerzita, Moskva, Rusko

Kľúčové slová: voľný radikál, antioxidant, antioxidačná aktivita, celková antioxidačná kapacita, chemiluminiscencia, luminol

Financovanie: táto práca bola podporená Ruskou vedeckou nadáciou, grant č. 14-15-00375.

Poďakovanie: autori ďakujú Andreyovi Alekseevovi z Lomonosovovej Moskovskej štátnej univerzity za pomoc pri realizácii experimentu. Korešpondenciu treba riešiť: George Vladimirov

Lomonosovský prospekt, r. 31, k. 5, Moskva, Rusko, 119192; [chránený e-mailom] Prijaté: 03/10/2016 Prijaté: 03/18/2016

Voľné radikály generované v tele narúšajú štruktúru bunkových membrán, čo následne vedie k rozvoju rôznych patologických stavov. Deštruktívnemu oxidačnému účinku radikálov bráni antioxidačný obranný systém organizmu, v ktorom hrajú dôležitú úlohu nízkomolekulárne zlúčeniny – lapače (lapače) radikálov. Jedným zo zdrojov antioxidantov sú liečivé rastlinné suroviny, ako aj prípravky na ich základe, ktorých štúdium antioxidačného potenciálu pomáha zvyšovať ich preventívny a liečebný účinok.

Hlavné metódy stanovenia antioxidantov sú v prácach zvažované, avšak definícia antioxidantov ako chemických zlúčenín neposkytuje úplný obraz o ochranných vlastnostiach skúmaného objektu: sú určené nielen množstvom jedného alebo druhého antioxidantu. , ale aj činnosťou každého z nich. Antioxidačná aktivita alebo antioxidačná aktivita, AOA, je rýchlostná konštanta pre reakciu antioxidantu s voľným radikálom (kInH). Metóda chemiluminiscencie (CL) umožňuje určiť celkové množstvo radikálov, ktoré antioxidanty viažu vo vzorke (celková antioxidačná kapacita, TAU), a pri použití metódy matematického modelovania kinetiky CL aj rýchlosť tvorby a reakcie radikály s antioxidantmi, teda AOA.

Najbežnejšia modifikácia chemiluminiscenčnej metódy na stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity je založená na použití luminolu ako chemiluminiscenčného aktivátora. Do kyvety chemiluminometra sa umiestni vzorka s prídavkom luminolu, peroxidu vodíka a zlúčeniny schopnej vytvárať radikály v dôsledku spontánneho rozkladu (termolýzy), napríklad 2,2"-azobis-(2-amidinopropánu). ) dihydrochlorid (ABAP):

V prítomnosti molekulárneho kyslíka tvorí alkylový radikál R^ peroxylový radikál ROO^:

ROO^ + LH2 ^ ROOH + LHv Z LH sa tvorbou intermediárnych látok (luminolhydroperoxid a luminolendoperoxid) v elektronicky excitovanom stave vytvorí molekula konečného produktu oxidácie luminolu, kyselina aminoftalová, ktorá emituje fotón. a ako výsledok je pozorovaná chemiluminiscencia. Intenzita CL je úmerná rýchlosti produkcie fotónov, ktorá je zase úmerná stacionárnej koncentrácii LH v systéme. Interakciou s radikálmi antioxidanty prerušujú opísaný reťazec premien a zabraňujú tvorbe fotónu.

Zlúčeniny podliehajúce termolýze nie sú jediným možným zdrojom radikálov pri analýze antioxidačnej kapacity vzorky chemiluminiscenčnou metódou. Alternatívami sú chrenová peroxidáza-peroxid vodíka, hemín-peroxid vodíka, cytochróm c-kardiolipín-peroxid vodíka atď. Schéma reakcií oxidácie luminolu peroxidázami je uvažovaná v práci Cormiera et al. .

Kinetické krivky CL pre tieto systémy odrážajú dve fázy reakcie: štádium zvýšenia intenzity CL a štádium plató alebo postupného poklesu luminiscencie, keď

Intenzita CL je buď konštantná, alebo pomaly klesá. Článok popisuje dva prístupy k meraniu celkovej antioxidačnej kapacity, ktoré zohľadňujú túto vlastnosť kriviek. Metóda TRAP (Total Reactive Antioxidant Potential) je založená na meraní CL latencie t a možno ju použiť na stanovenie antioxidantov, ako je trolox alebo kyselina askorbová: vyznačujú sa vysokou konštantou rýchlosti reakcie s radikálmi a z tohto dôvodu môžu byť nazývané silné antioxidanty. Počas latentného obdobia dochádza k ich úplnej oxidácii. Metóda TAR (Total Antioxidant Reactivity) meria stupeň zhášania chemiluminiscencie q na plató alebo na maxime chemiluminiscenčnej krivky:

kde I je intenzita chemiluminiscencie bez antioxidantu a 11 je intenzita CL v prítomnosti antioxidantu. Táto metóda sa používa, ak systém obsahuje prevažne slabé antioxidanty s nízkymi rýchlostnými konštantami interakcie s radikálmi - oveľa nižšími v porovnaní s luminolovou konštantou.

Pôsobenie antioxidantov charakterizujú nielen ukazovatele t a c. Ako vidno z prác, pôsobenie antioxidantov ako je kyselina močová v systéme hemín-H202-luminol alebo tokoferol, rutín a kvercetín v systéme cytochróm c-kardiolipín-H202-luminol je charakterizované zmenou maximálnej rýchlosti vzostupu CL (utx). Ako ukazujú výsledky matematického modelovania kinetiky, hodnoty rýchlostných konštánt interakcie týchto antioxidantov s radikálmi sú blízke hodnote luminolovej konštanty, preto sa takéto antioxidanty môžu nazývať stredne silné antioxidanty.

Ak by študovaný materiál, najmä rastlinné suroviny, obsahoval iba jeden typ antioxidantov, potom by ich obsah mohol byť charakterizovaný jedným z troch vyššie uvedených ukazovateľov (m, q, alebo V). Rastlinné suroviny ale obsahujú zmes antioxidantov rôznej sily. Na vyriešenie tohto problému niektorí autori použili zmenu sumy chemiluminiscenčného svetla za určitý DE čas, vypočítanú podľa vzorca

DE = DE0 – DE,

kde DE0 a DE5 sú svetelné sumy CL za daný čas? v kontrolnej a testovanej vzorke. Čas by mal byť dostatočný na oxidáciu všetkých antioxidantov v systéme, to znamená na to, aby CL krivka testovanej vzorky dosiahla úroveň CL krivky kontrolnej vzorky. Posledne menovaný naznačuje, že výskumníci by mali nielen zaznamenávať svetelný súčet luminiscencie, ale mali by zaznamenávať aj krivku kinetiky CL na dostatočne dlhú dobu, čo sa zďaleka nerobí vždy.

Keďže všetky merané ukazovatele závisia od prístroja a podmienok merania, antioxidačný účinok látky v skúmanom systéme sa zvyčajne porovnáva s účinkom antioxidantu braného ako štandard, akým je napríklad Trolox.

Systém chrenová peroxidáza-peroxid vodíka bol použitý na analýzu celkovej antioxidačnej kapacity rastlinných materiálov mnohými autormi. V prácach bola na odhad množstva antioxidantov vo vzorkách použitá CL latentná perióda (metóda TRAP) a v prácach plocha pod krivkou vývoja CL. Tieto práce však nedávajú jasné odôvodnenie

výber jedného alebo druhého parametra na odhad OAU.

Cieľom štúdie bolo zistiť, ako pomer antioxidantov rôznych typov ovplyvňuje TAU a upraviť chemiluminiscenčnú metódu tak, aby bolo možné presnejšie stanoviť TAU v rastlinných materiáloch. Aby sme to dosiahli, stanovili sme si niekoľko úloh. Po prvé, porovnať CL kinetiku študovaných objektov s kinetikou štandardných antioxidantov troch typov (silné, stredné a slabé), aby sme pochopili, ktorý typ antioxidantov tvorí hlavný príspevok k TAE študovaných objektov. Po druhé, vypočítať TAE študovaných objektov meraním poklesu súčtu CL svetla pri pôsobení týchto objektov v porovnaní s pôsobením antioxidantu, ktorý poskytuje najväčší príspevok k TAE.

MATERIÁLY A METÓDY

Predmetom štúdie boli priemyselné vzorky plodov hlohu, jaseňa a divokej ruže z produkcie Krasnogorskleksredstva JSC (Rusko), ako aj plodov malín zozbieraných autormi v Moskovskej oblasti v prirodzených podmienkach pestovania a sušených pri teplote 60- 80 °C, kým neprestanú izolovať šťavu a deformácie tlaku.

Reagencie na analýzu antioxidačnej kapacity chemiluminiscenčnou metódou boli: KH2P04, 20 mM tlmivý roztok (pH 7,4); peroxidáza z koreňov chrenu (aktivita 112 U/mg, M = 44 173,9), 1 mM vodný roztok; luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazíndión, hydrazid kyseliny 3-aminoftalovej, M=177,11), 1 mM vodný roztok; peroxid vodíka (H202, M = 34,01), 1 mM vodný roztok; roztoky antioxidantov (kyselina askorbová, kvercetín, tokoferol). Všetky činidlá boli vyrobené spoločnosťou Sigma Aldrich (USA).

Celková antioxidačná kapacita bola stanovená zaznamenaním chemiluminiscencie na chemiluminometri Lum-100 (DISoft, Rusko) pomocou softvéru PowerGraph 3.3. Na stanovenie TAU v rastlinných materiáloch sa použije 40 µl luminolu v koncentrácii 1 mM, 40 µl chrenovej peroxidázy v koncentrácii 0,1 µM, od 10 do 50 µl odvaru alebo infúzie (v závislosti od koncentrácie) a fosfátový tlmivý roztok v množstve potrebnom na úpravu celkového objemu vzorky na 1 ml. Kyveta sa nainštalovala do zariadenia a zaznamenal sa CL, pričom sa pozoroval signál pozadia. Po 48 sekundách registrácie signálu pozadia sa do kyvety pridalo 100 μl H2O2 s koncentráciou 1 mM a registrácia CL pokračovala 10 minút. Boli pripravené štyri vzorky s rôznymi koncentráciami každého z rastlinných objektov. CL bol tiež zaznamenaný pre roztoky kyseliny askorbovej, kvercetínu a tokoferolu v piatich rôznych koncentráciách pre každý z antioxidantov. Následne bola TAU vzoriek odvarov a infúzií prepočítaná na kvercetín.

dosiahli plató, čo naznačovalo úplné zničenie antioxidantov v systéme. Riedenie študovaných vzoriek a koncentrácie roztokov štandardných antioxidantov (uvedené v titulkoch k obrázkom) boli zvolené tak, aby všetky CL kinetické krivky boli merané pri rovnakej citlivosti prístroja.

Antioxidačná kapacita sa vypočítala zo zmeny plochy (AS) pod kinetickou krivkou chemiluminiscencie (svetelný súčet) po pridaní látky obsahujúcej antioxidant. Na tento účel sme vypočítali S0 pre systém bez antioxidantu a odpočítali sme od neho plochu SS, ktorá charakterizuje systém, do ktorého bol antioxidant pridaný. Hodnota AS závisí od citlivosti chemiluminometra a podmienok merania. Pomer AS/C ■ V (kde C je koncentrácia študovaného biologického materiálu v kyvete g/l a V objem kyvety l) vyjadruje antioxidačnú kapacitu 1 g študovaného materiálu, t.j. , rastlinný materiál.

Antioxidačná kapacita ASa roztoku štandardného antioxidantu, napríklad kvercetínu, umiestneného v rovnakom objeme reakčnej zmesi, bola vypočítaná podobným spôsobom. Pomer AS/CÄ ■ V (kde CA je hmotnostná koncentrácia antioxidantu v kyvete, g/l) vyjadruje antioxidačnú kapacitu 1 g antioxidantu.

Pre každý zo štandardných antioxidantov sa zaznamenal signál z roztokov niekoľkých koncentrácií, aby sa zaistilo, že výpočty boli vykonané v medziach lineárneho vzťahu a získané výsledky boli reprodukovateľné. Získala sa totiž lineárna závislosť (ASa = kA ■ CA) signálu od koncentrácie, z ktorej sa vypočítal stechiometrický koeficient kA. Podľa Fisherovho kritéria sú hodnoty kA získané pre štandardné antioxidanty štatisticky významné s pravdepodobnosťou 0,975. Ďalej bol pre každú zo štyroch vzoriek rastlín zaznamenaný signál zo štyroch koncentrácií a pre všetky vzorky bola získaná lineárna závislosť signálu od koncentrácie (AS = k ■ C), z ktorej bol vypočítaný stechiometrický koeficient k. S pravdepodobnosťou 0,975 (Fischerov test) sú hodnoty k získané pre vzorky rastlín štatisticky významné. Celková antioxidačná kapacita rastlinného materiálu z hľadiska hmotnosti štandardného antioxidantu (mg %) bola zistená vzorcom

OAU = k ■ 105. k

Hodnoty boli prezentované ako aritmetický priemer ± štandardná odchýlka (M ± 5) na str<0,05.

VÝSLEDKY ŠTÚDIE

Štúdium kinetiky chemiluminiscencie v prítomnosti askorbátu sodného (obr. 1) ukázalo, že tento antioxidant sa vyznačuje latentnou periódou, kedy je CL takmer úplne potlačená. Jeho trvanie je úmerné množstvu antioxidantov v systéme. V tomto prípade sa nemení ani sklon kriviek CL, ani intenzita CL na plató. Vysvetľuje to skutočnosť, že kyselina askorbová je silný antioxidant, ktorý zachytáva všetky radikály vytvorené v systéme, vrátane radikálov luminolu, a CL sa nevyvinie, kým sa všetok askorbát nezoxiduje.

Pôsobenie tokoferolu (obr. 2) sa prejavilo poklesom intenzity CL na plató, čo je typické pre slabé antioxidanty, aj keď tokoferol je považovaný za jeden z najviac

silné antioxidanty. Možno je tento nesúlad spôsobený skutočnosťou, že v našom experimente boli voľné radikály vo vodnom roztoku, zatiaľ čo pôsobenie tokoferolu sa zvyčajne študuje v nepolárnych médiách. V práci, kde komplex cytochrómu c s kardiolipínom slúžil ako zdroj radikálov a v rámci tohto komplexu prebiehala reakcia s luminolom, mal tokoferol vlastnosti stredne silného antioxidantu.

Po preštudovaní účinku rôznych koncentrácií kvercetínu na náš systém (obr. 3) a porovnaní jeho kinetických kriviek a askorbátu sodného a tokoferolu možno poznamenať, že hlavný účinok kvercetínu sa prejavuje v zmene sklonu krivky, teda rýchlosť rozvoja CL, ktorá je typická pre stredne silné antioxidanty.

Krivky CL pre všetky študované odvary (obr. 4) sa podobajú krivkám pre kvercetín s miernym poklesom intenzity CL na konci, t.j.

Čas, min

Ryža. 1. Účinok askorbátu sodného na kinetiku chemiluminiscencie

Koncentrácie komponentov systému: luminol - 40 μM, chrenová peroxidáza - 4 nM, peroxid vodíka - 100 μM. Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,05 uM; 3 - 0,10 uM; 4 - 0,15 uM; 5 - 0,2 uM; 6 - 0,25 μM askorbátu sodného.

plošina. Ako je uvedené v práci, toto správanie je typické pre antioxidanty strednej sily, medzi ktoré v našom prípade patria polyfenoly – flavonoidy a taníny. Pre nálev z malinových plodov (obr. 4, D) je badateľný pokles chemiluminiscencie na úrovni plató, čo je typické pre slabé antioxidanty, ktorým je v tomto prípade tokoferol. Pokiaľ ide o kvercetín a tokoferol, nálev z malinových plodov obsahuje 4,7 ± 0,9 µmol/g kvercetínu a 11,9 ± 0,8 µmol/g tokoferolu.

Pri porovnaní chemiluminiscenčných kriviek získaných pre rôzne koncentrácie štyroch študovaných vodných extraktov z rastlinných materiálov sa ukázalo, že príspevok stredných a slabých antioxidantov k celkovej antioxidačnej kapacite vzoriek klesal v nasledujúcom poradí: infúzia malinového ovocia (obr. 4, D), odvar z plodov šípky (obr. 4, C), odvar z plodov jarabiny (obr. 4, A), odvar z plodov hlohu (obr. 4, B). Hodnoty AS z hľadiska koncentrácie C skúmanej látky v kyvete a hodnoty celkovej antioxidačnej kapacity z hľadiska kvercetínu sú uvedené v tabuľke.

DISKUSIA O VÝSLEDKOCH

Údaje získané počas experimentov a hodnoty TAU študovaných objektov vypočítané na ich základe boli porovnané s obsahom hlavných antioxidantov v nich, stanoveným pomocou chemických metód analýzy. Napriek tomu, že pozitívna korelácia medzi celkovým množstvom antioxidantov a TAU v rôznych objektoch je nepopierateľná, medzi týmito ukazovateľmi sú badateľné rozdiely. Napríklad, ak vezmeme súčet obsahu flavonoidov, trieslovín a kyseliny askorbovej, potom sa ukáže, že je viac ako vypočítaný TAU pre všetky študované objekty, okrem odvaru plodov hlohu (tabuľka).

Iní výskumníci tiež ukázali, že výsledky chemickej analýzy a hodnota TAU stanovená chemiluminiscenčnou metódou sa často nezhodujú. V práci bola stanovená celková antioxidačná kapacita

46 Čas, min

I" "h chi----.

Ryža. 2. Účinok tokoferolu na kinetiku chemiluminiscencie

Koncentrácie komponentov systému: luminol - 40 μM, chrenová peroxidáza - 4 nM, peroxid vodíka - 100 μM. Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,01 uM; 3 - 0,025 uM; 4 - 0,06 uM; 5 - 0,1 uM; 6 - 0,2 μM tokoferolu.

46 Čas, min

Ryža. Obr. 3. Vplyv kvercetínu na kinetiku chemiluminiscencie Koncentrácie komponentov systému: luminol - 40 μM, chrenová peroxidáza - 4 nM, peroxid vodíka - 100 μM. Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,02 uM; 3 - 0,03 uM; 4 - 0,04 uM; 5 - 0,05 uM; 6 - 0,06 uM kvercetínu.

Čas, min

46 Čas, min

120 I 100 80 \ 60 40 20

46 Čas, min

Ryža. Obr. 4. Vplyv odvarov z plodov jarabiny (A), hlohu (B), divej ruže (C) a nálevu z plodov malín (D) na kinetiku chemiluminiscencie. (A) Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,002 g/l; 3 - 0,004 g/l; 4 - 0,006 g/l; 5 - 0,008 g/l odvar z plodov jarabiny. (B) Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,005 g/l; 3 - 0,0075 g/l; 4 - 0,01 g/l; 5 - 0,0125 g/l odvar z plodov hlohu. (C) Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,0015 g/l; 4 - 0,002 g/l; 5 - 0,0025 g/l odvar zo šípok. (D) Krivky: 1 - kontrolná vzorka; 2 - 0,001 g/l; 3 - 0,003 g/l; 4 - 0,004 g/l; 5 - 0,005 g/l nálev z malín.

v systéme peroxidáza-luminol-peroxid vodíka koreloval s obsahom triterpénových zlúčenín. V práci tých istých autorov, v ktorej bola predmetom skúmania iná rastlina, však nebola pozorovaná žiadna korelácia medzi TAU a obsahom žiadnej skupiny látok, vrátane flavonoidov.

Tieto nezrovnalosti súvisia najmenej s tromi faktormi. Po prvé, dôležitá je aktivita antioxidantov, teda rýchlosť ich interakcie s radikálmi, ktorá je pre rôzne antioxidanty, ktoré tvoria rastlinnú vzorku, rozdielna. Podľa Izmailova sú rýchlostné konštanty zodpovedajúcich reakcií pre mexidol, tokoferol a kvercetín vo vzťahu 0,04: 2: 60. Po druhé, každá molekula antioxidantu, ktorá vstupuje do chemickej reakcie, môže zachytiť rôzny počet radikálov. Podľa práce kvercetín, kyselina močová a kyselina askorbová zachytili 3,6 ± 0,1, 1,4 ± 0,1 a 0,5 ± 0,2 radikálov na zreagovanú molekulu antioxidantu (bol použitý systém gemin-H202-luminol). Po tretie, výsledky štúdie by mohli byť ovplyvnené prítomnosťou aktivity peroxidázy v samotných vzorkách rastlín, ako v práci, ako aj prítomnosťou vápnika vo vzorkách, ktorý, ako je uvedené v práci, je schopný zvýšiť aktivita chrenovej peroxidázy za určitých podmienok. To zvyčajne vedie k viacerým

vyššia intenzita CL na plató ako na kontrolných krivkách, čo sme však nezaznamenali.

Ešte väčší význam má stechiometrický koeficient antioxidantu. Počet nimi zachytených radikálov n je rovný

kde p je stechiometrický koeficient a Am je zmena koncentrácie antioxidantu počas doby merania, v našom prípade počiatočná koncentrácia testovanej látky v testovanej vzorke.

Rozdiel v súčte svetla luminiscencie v neprítomnosti antioxidantu a v jeho prítomnosti je úmerný n. Celkový počet zachytených radikálov je n = Y.p. m,

kde je stechiometrický koeficient konkrétneho antioxidantu a m je jeho koncentrácia počas zmeny

Predmet štúdie Flavonoidy, mg%* Taníny, mg%* Kyselina askorbová, mg%* AS/C ■ 10-8, arb. Jednotky OAU, mg% kvercetínu

Odvar z plodov jarabiny 8,87 ± 0,01 210,00 ± 10,00 0,67 ± 0,02 7,13 ± 0,96 56,53 ± 7,61

Odvar zo šípok 4,66 ± 0,04 850,00 ± 20,00 3,70 ± 0,12 16,60 ± 3,40 131,63 ± 27,26

Odvar z plodov hlohu 3,01 ± 0,06 12,00 ± 3,00 0,23 ± 0,002 3,18 ± 0,29 25,20 ± 2,32

Nálev sušených malín 90,00 ± 4,00 40,00 ± 20,00 3,91 ± 0,08 6,65 ± 1,21 52,69 ± 9,56

Poznámka: * - literárne údaje, . AS - zmena svetelného súčtu pre vzorku, rel. jednotky, C - koncentrácia vzorky v kyvete, g/l. Vypočítané hodnoty sú spoľahlivé na str<0,05. Число измерений для каждого образца - четыре.

rénium. Celkový počet zachytených radikálov sa zjavne nerovná celkovému množstvu antioxidantov, pretože koeficienty pt sa nielenže nerovnajú jednotke, ale pre rôzne antioxidanty sa tiež výrazne líšia.

Hodnota n je úmerná rozdielu v sumách svetla nameraných za určitý čas medzi vzorkou obsahujúcou antioxidant a kontrolnou vzorkou bez antioxidantov:

kde k je koeficient, ktorý je konštantný za rovnakých podmienok merania.

Podmienky, ktoré sme vybrali na posúdenie celkovej antioxidačnej kapacity rastlinných surovín zaznamenaním kinetiky chemiluminiscencie v systéme pozostávajúcom z chrenovej peroxidázy, peroxidu vodíka a luminolu (koncentrácie zložiek sú 4 nM, 100 μM a 40 μM, v tomto poradí; 20 mM fosfátový pufor, pH 7,4),

zabezpečila oxidáciu silných antioxidantov (kyselina askorbová) a stredne silných antioxidantov (kvercetín) za 10 min. Toto trvanie merania je pohodlné a zabezpečuje požadovanú kvalitu meraní.

Literatúra

1. Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Voľné radikály ako účastníci regulačných a patologických procesov. In: Grigoriev A. I., Vladimirov Yu. A., editori. Základné vedy – medicína. Biophys. med. technol. Moskva: MAKS Press; 2015. zväzok 1. s. 38-71.

3. Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Maltseva E. V. Metódy štúdia antioxidantov. Chem. rast. suroviny. 2004; (3): 63-75.

4. Vasiliev R. F., Kancheva V. D., Fedorova G. F., Batovska D. I., Trofimov A. V. Antioxidačná aktivita chalkónov. Chemiluminiscenčné stanovenie reaktivity a kvantovo-chemický výpočet energií a štruktúr činidiel a medziproduktov. Kinetika a katalýza. 2010; 51(4): 533-41.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasiľ "ev RF, Veprintsev TL. Peroxy-

radikálmi sprostredkovaná chemiluminiscencia: mechanická diverzita a základy antioxidačného testu. Arkivoc. 2007; 8:163-215.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert ČR, Baader WJ. Hodnotenie antiradikálovej kapacity pomocou H2O2-hemínom indukovanej luminolovej chemiluminiscencie. J Agric Food Chem. 3. decembra 2003; 51 (25): 7481-8.

9. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V. Voľné radikály a bunková chemiluminiscencia. Úspechy biol. chem. 2009; 49:341-88.

10. Vladimirov Yu. A., Proskurnina E. V., Izmailov D. Yu Kinetická chemiluminiscencia ako metóda na štúdium reakcií voľných radikálov. Biofyzika. 2011; 56(6): 1081-90.

11. Izmailov D. Yu., Demin E. M., Vladimirov Yu. A. Stanovenie antioxidačnej aktivity meraním kinetiky chemiluminiscencie. Fotobiológia a fotomedicína. 2011; 7(2):70-6.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminolová luminiscencia indukovaná termolýzou 2,2"-azo-bis(2-amidinopropánu). Bezplatná

Radic Res Commun. 1992; 17(5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O použití zhášania luminolovej luminiscencie na vyhodnotenie aktivity SOD. Free Radic Biol Med. jún 1994; 16(6): 833-7.

15. Lissi EA, Salim-Hanna M, Pascual C, Del Castillo MD. Hodnotenie celkového antioxidačného potenciálu (TRAP) a celkovej antioxidačnej reaktivity z meraní chemiluminiscencie zosilnených luminolom. Free Radic Biol Med. februára 1995; 18(2):153-8.

17. Cormier MJ, premiér Prichard. Výskum mechanizmu luminiscenčnej peroxidácie luminolu technikami zastaveného toku. J Biol Chem. 25. septembra 1968; 243(18): 4706-14.

21. Alekseev A. V., Proskurnina E. V., Vladimirov Yu. A. Stanovenie antioxidantov aktivovanou chemiluminiscenciou s použitím 2,2'-azo-bis(2-amidinopropánu). Bulletin Moskovskej štátnej univerzity. Ser. 2. Khim. 2012; 53 ( 3): 187-93.

24. Ministerstvo zdravotníctva ZSSR Štátny liekopis ZSSR XI vyd. Problém. 2 „Všeobecné metódy analýzy. Liečivé rastlinné materiály“. M.: Medicína; 1987. s. 147-8.

25. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Kornyushina M. A. Štúdium prípravkov extraktu šípky. LEKÁREŇ. 2012; (2): 14-6.

26. Sergunova E. V., Sorokina A. A., Avrach A. S. Štúdium plodov hlohu rôznymi spôsobmi konzervácie a extrakcie vody. LEKÁREŇ. 2010; (5): 16-8.

27. Avrach A. S., Sergunova E. V., Kuksova Ya. V. Biologicky aktívne látky z ovocia a vodné extrakty maliny obyčajnej. LEKÁREŇ. 2014; (1): 8-10.

28. Avrach A. S., Samylina I. A., Sergunova E. V. Štúdium biologicky aktívnych látok plodov hlohu - suroviny na prípravu homeopatických matricových tinktúr. V sobotu vedecký tr. Na základe materiálov XXIV. Mosk. intl. homeopat. conf. „Vývoj homeopatickej metódy v modernej medicíne“; 24. – 25. januára 2014; Moskva. M.; 2014. s. 146-7.

29. Sergunova E. V., Sorokina A. A. Štúdium zloženia biologicky aktívnych látok v liečivých rastlinných materiáloch rôznych metód konzervácie. V sobotu abstrakty založené na XX Ross. nat. kongr. "Človek a medicína"; 15. – 19. apríla 2013; Moskva. Moskva: EkoOnis; 2013. s. 184-90.

30. Aleksandrova E. Yu., Orlova M. A., Neiman P. L. Štúdium aktivity peroxidázy v extraktoch z podzemkov a koreňov chrenu a jej stabilita voči rôznym vplyvom. Vestn. Moskovská štátna univerzita. Ser. 2. Chem. 2006; 47(5):350-2.

1. Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Voľný radikaly ako uchastniki regulyatornykh i patologicheskikh protsessov. In: Grigor "ev AI, Vladimirov YuA, editori. Fundamental" nye nauki - meditsine. Biofizicheskie meditsinskie techhnologii. Moskva: MAKS Press; 2015.v. 1. str. 38-71. ruský.

2. Chanda S, Dave R. Modely in vitro na hodnotenie antioxidačnej aktivity a niektoré liečivé rastliny s antioxidačnými vlastnosťami: Prehľad. Afr J Microbiol Res. decembra 2009; 3(13): 981-96.

3. Khasanov VV, Ryzhova GL, Mal "tseva EV. Metody issledovaniya antioksidantov. Khimija Rastitel "nogo Syr" ja. 2004; (3): 63-75. Rus.

4. Vasiľ "ev RF, K" "ncheva VD, Fedorova GF, B" "tovska DI, Trofimov AV. Antioksidantnaya aktivnost" khalkonov. Khemilyuminestsentnoe opredelenie reaktsionnoi sposobnosti i kvantovo-khimicheskii raschet energii a stroeniya reagentov a intermediatov. Kinetika a katalýza. 2010; 51(4): 533-41. ruský.

5. Slavova-Kazakova AK, Angelova SE, Veprintsev TL, Denev P, Fabbri D, Dettori MA, et al. Antioxidačný potenciál zlúčenín príbuzných kurkumínu študovaný chemiluminiscenčnou kinetikou, účinnosťou prerušenia reťazca, vychytávacou aktivitou (ORAC) a výpočtami DFT. Beilstein J Org Chem. 11. augusta 2015; 11:1398-411.

6. Fedorova GF, Trofimov AV, Vasiľev RF, Veprintsev TL. Chemiluminiscencia sprostredkovaná peroxyradikálom: mechanická diverzita a základy antioxidačného testu. Arkivoc. 2007; 8: 163-215.

7. Fedorova GF, Menshov VA, Trofimov AV, Vasiľev RF. Ľahký chemiluminiscenčný test na antioxidačné vlastnosti rastlinných lipidov: základy a ilustratívne príklady. Analytik. 2009 Október; 134 (10): 2128-34.

8. Bastos EL, Romoff P, Eckert ČR, Baader WJ. Hodnotenie antiradikálovej kapacity pomocou luminolu indukovaného H2O2 hemínom

9. Vladimirov YuA, Proskurnina EV. Voľný radikaly i kletochnaya khemilyuminestsentsiya. Usp Biol Khim. 2009; 49:341-88. ruský.

10. Vladimirov YuA, Proskurnina EV, Izmailov DYu. Kineticheskaya khemilyuminestsentsiya ako metóda izucheniya reaktsii svobodnykh radikalov. biofyzika. 2011; 56(6): 1081-90. ruský.

11. Izmailov DYu, Demin EM, Vladimirov YuA. Opredelenie aktivnosti antioksidantov metodom izmereniya kinetiki khemilyuminestsen-tsii. Biológia a fotomedicína. 2011; 7(2):70-6. ruský.

12. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. Luminolová luminiscencia indukovaná 2,2"-azo-bis(2-amidinopropán) termolýzou. Free Radic Res Commun. 1992; 17 (5): 299-311.

13. Lissi EA, Pascual C, Del Castillo MD. O použití zhášania luminolovej luminiscencie na vyhodnotenie aktivity SOD. Free Radic Biol Med. jún 1994; 16(6): 833-7.

14. Lissi EA, Escobar J, Pascual C, Del Castillo MD, Schmitt TH, Di Mascio P. Viditeľná chemiluminiscencia spojená s reakciou medzi methemoglobínom alebo oxyhemoglobínom s peroxidom vodíka. Photochem Photobiol. november 1994; 60(5):405-11.

16. Landi-Librandi AP, de Oliveira CA, Azzolini AE, Kabeya LM, Del Ciampo JO, Bentley MV a kol. In vitro hodnotenie antioxidačnej aktivity lipozomálnych flavonolov systémom HRP-H2O2-luminol. J Microencapsul. 2011; 28(4):258-67.

17. Cormier MJ, premiér Prichard. Prieskum mechanizmu

luminiscenčnej peroxidácie luminolu technikami zastaveného toku. J Biol Chem. 25. septembra 1968; 243(18): 4706-14.

18. Chang CL, Lin CS, Lai GH. Fytochemické vlastnosti, aktivity zachytávajúce voľné radikály a neuroprotekcia piatich liečivých rastlinných extraktov. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 984295. doi: 10.1155/2012/984295. Epub 2011, 10. august.

19. Chang CL, Lin CS. Fytochemické zloženie, antioxidačná aktivita a neuroprotektívny účinok extraktov z Terminalia chebula Retzius. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 125247. doi: 10.1155/2012/125247. Epub 2011 5. júla.

20. Georgetti SR, Casagrande R, Di Mambro VM, Azzolini AE, Fonseca MJ. Hodnotenie antioxidačnej aktivity rôznych flavonoidov chemiluminiscenčnou metódou. AAPS PharmSci. 2003; 5(2):111-5.

21. Alekseev AV, Proskurnina EV, Vladimirov YuA. Opredelenie antioksidantov metodom aktivirovannoi khemilyuminestsentsii s ispol "zovaniem 2.2" -azo-bis (2-amidinopropana). Chemický bulletin Moskovskej univerzity. 2012; 53(3): 187-93. ruský.

22. Pogáčnik L, Ulrih NP. Aplikácia optimalizovaného chemiluminiscenčného testu na stanovenie antioxidačnej kapacity bylinných extraktov. Luminiscencia. 2012 november-december; 27(6):505-10.

23. Saleh L, Plieth C. Celkové antioxidanty s nízkou molekulovou hmotnosťou ako súhrnný parameter, kvantifikované v biologických vzorkách testom inhibície chemiluminiscencie. Nat protokol. september 2010; 5(10): 1627-34.

24. Ministerstvo zdravookhraneniya SSSR. Gosudarsvennaya farmakopeya SSSR. 11. vyd. Iss. 2. "Analýza Obshchie metódy.

Lekarstvennoe rastitel "noe syr" e", Moskva: Medltsina, 1987, s. 147 – 8. Rus.

25. Sergunova EV, Sorokina AA, Kornyushina MA. Izuchenie ekstraktsionnykh preparatov shipovnika. LEKÁREŇ. 2012; (2): 14-6. ruský.

26. Sergunova EV, Sorokina AA, Avrach AS. Izuchenie plodov boyaryshnika razlichnykh sposobov konservatsii a vodnykh izvlechenii. Farmatsia. 2010; (5): 16-8. ruský.

27. Avrach AS, Sergunova EV, Kuksova YaV. Biologicheski aktivnye veshchestva plodov a vodnykh izvlechenii maliny obyknovennoi. Farmatsia. 2014; (1): 8-10. ruský.

28. Avrach AS, Samylina IA, Sergunova EV. Izuchenie biologicheski aktivnykh veshchestv plodov boyaryshnika - syr "ya dlya prigotovleniya nastoek gomeopaticheskikh matrichnykh. Zborník zo 14. moskovskej medzinárodnej homeopatickej konferencie "Razvtie gomeopaticheskogo metoda v sovremennoi meditsine"; 27. 2. 2014. jan.; jan.

29. Sergunová EV, Sorokina AA. Izuchenie sostava biologicheski aktivnykh veshchestv v lekarstvennom rastitel "nom syr" e razlichnykh sposobov konservatsii. Zborník z 20. ruského národného kongresu „Čelovek i lekárstvo“; 2013 apríla 1519; Moskva. Moskva: EkOOnis; 2013. s. 184-90. ruský.

30. Aleksandrová EYu, Orlová MA, Neiman PL. Izuchenie peroksidaznoi aktivnosti v ekstraktakh iz kornevishcha i kornei khrena i ee stabil "nosti k razlichnym vozdeistviyam. Moskovská univerzita Chemistry Bulletin. 2006; 47 (5): 350-2. Rus.

1 Milentiev V.N. 2Sannikov D.P. 3Kazmin V.M. 2

1 Štátny inštitút ekonomiky a obchodu Oryol

2 Federálna štátna rozpočtová inštitúcia "Centrum pre chemizáciu a poľnohospodársku rádiológiu "Orlovský"

3 Federálna štátna rozpočtová vzdelávacia inštitúcia vyššieho odborného vzdelávania "Štátna univerzita - vzdelávací, vedecký a priemyselný komplex"

Študovala sa možnosť využitia chemiluminiscencie na hodnotenie antioxidačnej aktivity potravinových látok. Navrhovaná metóda je založená na chemiluminiscencii luminolu v alkalickom prostredí, ktorej intenzita závisí od množstva peroxidov v chemiluminiscenčnej vzorke. Chemiluminiscencia sa zaznamenávala pomocou vyvinutého zariadenia obsahujúceho dávkovaciu pumpu, svetlotesnú komoru, sklenenú vákuovú fotonásobič a počítačový systém. Na zvýšenie chemiluminiscencie sa do luminolu pridal roztok ferrikyanidu draselného. Zmeny v intenzite chemiluminiscencie boli zaznamenané v momente zavedenia analyzovanej vzorky do roztoku luminolu. Ako analyzovaná vzorka bol použitý extrakt z púpavy získaný suchou nízkoteplotnou destiláciou. Obsahuje fenolové zlúčeniny známe pre svoju vysokú antioxidačnú aktivitu. Zistilo sa, že chemiluminiscenčnú metódu možno použiť na stanovenie antioxidačných vlastností rôznych potravinárskych zlúčenín.

chemiluminiscencia

antioxidačná aktivita

peroxidy

živiny

1. Vasiliev R.F. Chemická žiara // Chémia a chemici, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (dátum prístupu: 22.08.13).

2. Vladimirov Yu.A. Voľné radikály a antioxidanty // Vestn. RAMN. - 1998. - Číslo 7. - S. 43-51.

3. Kondrashová E.A. Chemiluminiscencia ako najcitlivejšia metóda enzýmovej imunoanalýzy a jej aplikácia.Klinická laboratórna diagnostika. - 1999. - Číslo 9. - S. 32.

4. Lyubimov, G.Yu. Chemiluminiscenčná analýza // Imunológia. - 1991. - č. 1. - S. 40–49.

5. Mayansky A.N., Nevmyatullin A.L., Chebotar I.V. Reaktívna chemiluminiscencia v systéme fagocytózy // Mikrobiológia. - 1987. - č. 1. - S. 109–115.

6. Sherstnev M.P. Vápnik-dependentné a vápnik-nezávislé dráhy tvorby chemiluminiscencie buniek.Chemiluminiscenčné problémy. - 1991. - č. 2. - S. 1–4.

Dnes je chemiluminiscencia veľkou oblasťou vedy, ktorá sa nachádza na rozhraní medzi chémiou, fyzikou a biológiou. Pri chemiluminiscencii dochádza k priamej premene chemickej energie na energiu elektromagnetických kmitov, t.j. do sveta. Pomocou chemiluminiscencie sa možno dozvedieť, ako reakcia prebieha, aký je jej mechanizmus, ktorý je potrebný na efektívne a racionálne vedenie technologických procesov. Ak je technologický proces získavania akéhokoľvek chemického produktu sprevádzaný chemiluminiscenciou, potom jeho intenzita môže slúžiť ako miera rýchlosti procesu: čím rýchlejšia je reakcia, tým jasnejšia je žiara. Pri chemiluminiscenčnej reakcii sa získajú energeticky bohaté produkty, ktoré potom vyžarovaním svetla uvoľňujú energiu, t.j. chemická energia sa premieňa na energiu elektromagnetického žiarenia.

Cieľom štúdie bolo preskúmať možnosť využitia chemiluminiscencie na hodnotenie antioxidačnej aktivity látok v potravinách.

Výsledky výskumu a diskusia

Problém hodnotenia antioxidačnej aktivity látok v potravinách je veľmi aktuálny. Použitie termínu "antioxidačná aktivita" na preukázanie užitočnosti konkrétneho produktu sa často robí bez akéhokoľvek chemického a biochemického argumentu. Antioxidačná aktivita akejkoľvek látky sa spravidla vzťahuje na účinnosť znižovania peroxidového čísla. Samotný pojem peroxidového čísla tiež úplne neodhaľuje jeho chemickú podstatu, pretože úplne nezodpovedá kinetike a termodynamike štádií metabolizmu konkrétneho potravinového produktu. Okrem toho sa táto hodnota používa na charakterizáciu lipidov vo forme tukov. K procesom oxidácie a tvorbe peroxidov v tele však dochádza nielen pri použití tukov, ale aj pri iných produktoch. Inými slovami, o obsahu peroxidu v konkrétnom produkte možno povedať, že je „vážený“ na akejsi váhe, kde „referenčná hmotnosť“ je jednotka koncentrácie jodidového iónu oxidovaného peroxidmi v kyslom prostredí. výsledkom čoho je tvorba molekulárneho jódu:

I- - e → I; (jeden)

I + I → I20. (2)

Pri titrácii molekulárneho jódu roztokom obsahujúcim tiosíran sodný sa stanoví jeho koncentrácia a následne sa stanoví množstvo oxidačných činidiel jodidových iónov, t.j. peroxidové zlúčeniny, čo sa v skutočnosti nazýva peroxidové číslo. Stanovenie peroxidového čísla pomocou tohto druhu "váženia" je založené na reakcii znázornenej na obr. jeden.

Ryža. 1. Stanovenie peroxidového čísla pomocou tiosíranu sodného

Z rovnice sa teda určí koncentrácia peroxidov

С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)

kde ϒ je korelačný koeficient medzi koncentráciou molekulárneho jódu a koncentráciou peroxidov.

Navrhovaná metóda stanovenia peroxidov vo výrobkoch je založená na chemiluminiscencii luminolu (C[lm]) v alkalickom prostredí, ktorej intenzita (Ichl) závisí od koncentrácie peroxidov (C[-O-O-]), v chemiluminiscenčná vzorka:

MHP. = Ϧchl ω, (4)

kde Ϧchl je kvantový výťažok chemiluminiscencie; ω - reakčná rýchlosť zahŕňajúca peroxidy:

khlC[-O-O-] C[lm] = ω, (5)

kde kchl je konštanta rýchlosti reakcie alebo pri:

C[lm] kchl Ϧchl = K, (6)

IХЛ = K C[-O-O-]. (7).

Množstvo peroxidov (-O-O-) je určené svetelným súčtom (S):

Hodnota S závisí od stupňa spotreby peroxidu pri chemiluminiscenčnej reakcii.

Na určenie konštanty K sa zostrojí kalibračná krivka pre závislosť sumy svetla S od koncentrácie peroxidu, ktorá sa stanoví titráciou:

S = f(C[-0-0-]). (deväť)

Ako peroxidy sa používa peroxid vodíka H2O2.

Potom sa porovnajú údaje získané z rovnice (3) a (9). Na základe porovnania ϒ a K sa robí záver o koordinácii reakčných mechanizmov, ktoré sú základom stanovenia peroxidov týmito metódami. Zistilo sa, že v tomto rozsahu koncentrácií peroxidu ϒ a K skutočne navzájom súhlasia, a preto ich možno použiť na stanovenie peroxidového čísla.

Chemiluminiscencia sa pozorovala v alkalickom médiu obsahujúcom luminol (5-amino-1,2,3,4-tetrahydro-1,4-ftalazíndión, hydrazid kyseliny 3-aminoftalovej, H2L). Zaznamenal sa pomocou chemiluminiscenčného zariadenia vrátane skleneného vákuového fotonásobiča. Fotonásobič je napájaný vysokonapäťovým usmerňovačom (7) spojeným s blokom (9), ktorý zosilňuje signál fotonásobiča, ktorý je zaznamenaný na displeji (5) počítačového monitora.

Ryža. 2. Registrácia chemiluminiscencie analyzovaného produktu: 1 - dávkovacie čerpadlo; 2 - svetlotesná komora; 3 - zrkadlo; 4 - kyveta; 5 - počítačový systém; 6 - fotonásobič; 7 - vysokonapäťový usmerňovač; 8 - zariadenie, ktoré umožňuje určiť spektrálnu oblasť chemiluminiscenčného žiarenia; 9 - blok zosilňujúci signál fotonásobiča

Na zavedenie analyzovanej vzorky do kyvety (4) obsahujúcej chemiluminiscenčný roztok luminolu je potrebné dávkovacie čerpadlo (1). Tento dávkovač funguje ako miešadlo pre vstreknutú vzorku s chemiluminiscenčným roztokom. Na zvýšenie reakčnej rýchlosti a intenzity chemiluminiscencie sa k luminolu pridal roztok ferrikyanidu draselného. Miešanie sa uskutočňuje pomocou vzduchových bublín, ktoré sa získajú čerpaním vzduchu cez kvapalinu roztoku pomocou čerpadla. Zrkadlo (3) umiestnené v nepriehľadnej komore (2) slúži na lepší zber svetla chemiluminiscenčného žiarenia dopadajúceho na fotokatódu fotonásobiča (6) namontovaného v nepriehľadnej komore. Dávkovač umožňuje vložiť požadované zložky kvapaliny do kyvety bez otvárania svetlotesnej komory (2) počas experimentov. V tomto prípade tieto kvapaliny vstupujú do kyvety (4) cez sklenené alebo plastové rúrky. Počítačový systém umožňuje zaregistrovať závislosť intenzity luminiscencie I od času t, teda kinetiky chemiluminiscencie:

Počítačový systém odráža konštanty vzostupu a poklesu vo funkcii I = f(t), ktoré sú konjugované s rýchlostnými konštantami reakcií, ktoré spôsobujú chemiluminiscenciu, teda s ich kinetikou. V chemiluminiscenčnej komore je zahrnuté zariadenie (8), ktoré umožňuje určiť spektrálnu oblasť chemiluminiscenčného žiarenia, teda závislosť:

I = f1(λ). (jedenásť)

Tento blok je kazeta vo forme disku, v ktorej sú namontované hraničné filtre. Výmena svetelných filtrov sa vykonáva otáčaním kotúčovej kazety okolo horizontálnej osi spájajúcej stredy roviny svetelných filtrov a roviny fotokatódy fotonásobiča.

Proces merania sa vykonáva takto:

1. Nastaví sa odozva fotonásobiča na zmeny jeho napájacieho napätia a na zmeny intenzity referenčného svetelného zdroja, ktorý dopadá na jeho katódu.

2. Kyveta sa naplní roztokom luminolu v alkalickom prostredí.

3. Dávkovač sa naplní analyzovanou vzorkou.

4. Zaznamenáva sa závislosť intenzity chemiluminiscencie od času t. Chemiluminiscencia sa sleduje do času t1, kedy je zmena I1 od času t minimálna: I1 = f1(t).

5. Časť analyzovaného roztoku sa podáva pomocou dávkovača.

6. Pozoruje sa chemiluminiscencia analyzovanej vzorky, ktorej kinetika je I = f(t).

Na obr. Obrázok 3 ukazuje graf závislosti funkcií (I1 = f1(t)), konjugovaný s grafom (I = f(t)), po zavedení analyzovaného riešenia.

Ako je možné vidieť na obr. 3, intenzita luminolovej chemiluminiscencie sa mení: prudký nárast je nasledovaný prudkým poklesom luminiscencie po pridaní analyzovanej vzorky.

Keďže zosilnenie chemiluminiscencie pri oxidácii luminolu je spojené s tvorbou peroxidov, pokles intenzity chemiluminiscencie po zavedení analyzovanej vzorky indikuje pokles ich počtu. Preto môžeme hovoriť o prítomnosti antioxidačnej aktivity v zlúčeninách, ktoré tvoria analyzovanú vzorku.

Je potrebné poznamenať, že ako analyzovaná vzorka bol použitý extrakt z púpavy získaný suchou nízkoteplotnou destiláciou, ktorý obsahuje fenolové zlúčeniny známe svojou vysokou antioxidačnou aktivitou.

Ryža. Obr. 3. Graf závislosti funkcií (I1 = f1(t)), konjugovaný s grafom (I = f(t)), po zavedení analyzovaného riešenia

Okrem toho sa počas experimentu zistilo, že pomocou chemiluminiscencie je možné určiť množstvo peroxidov v superriedených systémoch, čo je dôležité pre posúdenie nástupu oxidácie produktov napríklad pri ich skladovaní.

Vykonané štúdie teda ukázali, že metóda na stanovenie peroxidov vo výrobkoch, založená na chemiluminiscencii luminolu v alkalickom prostredí, umožňuje vyhodnotiť antioxidačnú aktivitu potravinárskych látok a možno ju použiť na stanovenie antioxidačných vlastností rôznych potravín. zlúčeniny.

Recenzenti:

Litvinová E.V., doktorka technických vied, profesorka Katedry technológie, organizácie a hygieny potravín, OrelGIET, Orel;

Kovaleva O.A., doktor biologických vied, riaditeľ INIT, FSBEI HPE "Oryol State Agrarian University", Orel.

Dielo sa do redakcie dostalo 8. novembra 2013.

Bibliografický odkaz

Panichkin A.V., Bolshakova L.S., Milentiev V.N., Sannikov D.P., Kazmin V.M. VYUŽITIE CHEMILUMINESCENCIE NA HODNOTENIE ANTIOXIDANTNÝCH VLASTNOSTÍ ŽIVÍN // Základný výskum. - 2013. - č.10-11. – S. 2436-2439;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (dátum prístupu: 17.12.2019). Dávame do pozornosti časopisy vydávané vydavateľstvom "Academy of Natural History"

Portál pre študenta. Samotréning

1.4 Metódy výskumu antioxidantov

anotácia vedecký článok o chemických vedách, autor vedeckého článku - Georgij Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Súvisiace témy vedecké práce v chemických vedách, autor vedeckého článku - Georgy Konstantinovič Vladimirov, E. V. Sergunova, D. Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov

Chemiluminiscenčné stanovenie celkovej antioxidačnej kapacity v liečivom rastlinnom materiáli

Text vedeckej práce na tému "Chemiluminiscenčná metóda stanovenia celkovej antioxidačnej kapacity v liečivých rastlinných materiáloch"

Bibliografický odkaz

SÚVISIACE ČLÁNKY