Composição química das membranas. As membranas são compostas de moléculas lipídicas e proteicas, cujas quantidades relativas variam amplamente entre as diferentes membranas. Os carboidratos estão contidos na forma de glicoproteínas, glicolipídios e constituem 0,5% -10% das substâncias da membrana. De acordo com o mosaico fluido

Lipídios de membrana. Os lipídios da membrana são moléculas anfifílicas, ou seja, a molécula contém grupos hidrofílicos (cabeças polares) e radicais alifáticos (caudas hidrofóbicas), que formam espontaneamente uma bicamada na qual as caudas dos lipídios ficam voltadas uma para a outra. Grossura

Proteínas O valor nutricional das proteínas é garantido pela presença de aminoácidos essenciais, cujos esqueletos de hidrocarbonetos não podem ser sintetizados no corpo humano e, portanto, devem ser fornecidos com alimentos. Eles também são as principais fontes de nitrogênio. Subsídio diário

Proteínas do tecido muscular Existem três grupos de proteínas: 1. proteínas miofibrilares – 45%;2. proteínas sarcoplasmáticas – 35%;3. proteínas estromais – 20%. Proteínas miofibrilares Este grupo inclui: 1. miosina; actina;3. actomiosina, bem como as chamadas proteínas reguladoras: 4. tropomiosina;5.

Classificação

As proteínas da membrana podem ser classificadas de acordo com princípios topológicos ou bioquímicos. A classificação topológica é baseada na localização da proteína em relação à bicamada lipídica. A classificação bioquímica é baseada na força da interação da proteína com a membrana.

Várias categorias de proteínas politópicas. Ligação à membrana devido a (1) uma única hélice alfa transmembrana, (2) múltiplas hélices alfa transmembrana, (3) uma estrutura de folha beta.

Várias categorias de proteínas monotópicas integrais. Ligação à membrana devido a (1) uma hélice alfa anfipática paralela ao plano da membrana, (2) uma alça hidrofóbica, (3) um resíduo de ácido graxo ligado covalentemente, (4) interação eletrostática (direta ou mediada por cálcio). ).

Classificação topológica

Em relação à membrana, as proteínas da membrana são divididas em poli e monotópicas.

• Proteínas politópicas ou transmembranares penetram completamente na membrana e, assim, interagem com ambos os lados da bicamada lipídica. Tipicamente, o fragmento transmembranar de uma proteína é uma hélice alfa que consiste em aminoácidos hidrofóbicos (possivelmente de 1 a 20 desses fragmentos). Somente nas bactérias, assim como nas mitocôndrias e nos cloroplastos, os fragmentos transmembrana podem ser organizados como uma estrutura de folha beta (de 8 a 22 voltas da cadeia polipeptídica).
• Proteínas monotópicas integrais permanentemente incorporado na bicamada lipídica, mas conectado à membrana apenas de um lado, sem penetrar no lado oposto.

Classificação bioquímica

De acordo com a classificação bioquímica, as proteínas de membrana são divididas em integrante E periférico.

• Proteínas integrais de membrana firmemente incorporado na membrana e pode ser removido do ambiente lipídico apenas com a ajuda de detergentes ou solventes apolares. Em relação à bicamada lipídica, as proteínas integrais podem ser politópicas transmembrana ou monotópicas integrais.
• Proteínas de membrana periférica são proteínas monotópicas. Eles estão fracamente ligados à membrana lipídica ou associados a proteínas integrais devido a forças hidrofóbicas, eletrostáticas ou outras forças não covalentes. Assim, diferentemente das proteínas integrais, elas se dissociam da membrana quando tratadas com uma solução aquosa apropriada (por exemplo, pH baixo ou alto, alta concentração de sal ou um agente caotrópico). Esta dissociação não requer ruptura da membrana.

As proteínas da membrana podem ser integradas na membrana devido a resíduos de ácidos graxos ou prenil ou glicosilfosfatidilinositol ligados à proteína durante sua modificação pós-tradução.

Ligações

Fundação Wikimedia. 2010.

: características e princípios estruturais

1. Estrutura das proteínas de membrana

O principal papel dos lipídios nas membranas é estabilizar a estrutura da bicamada, e as proteínas são componentes ativos das biomembranas. Discutiremos alguns princípios que se mostraram úteis na elucidação das características estruturais das proteínas de membrana. Daremos exemplos para ilustrar esses princípios.

No início do desenvolvimento da membranologia, acreditava-se que as proteínas da membrana eram bastante homogêneas em sua estrutura e dispostas na forma de 3 camadas na superfície da bicamada. Agora estamos mais inclinados a acreditar que, pelo menos para as proteínas transmembrana, as partes delas que estão imersas na membrana contêm hélices α. É claro que gostaria muito de tirar algumas conclusões inequívocas sobre esta questão, mas estas devem basear-se em dados factuais. Diante da enorme diversidade estrutural das proteínas solúveis, chega-se à conclusão de que as proteínas integrais de membrana podem ser muito mais complexas do que imaginamos atualmente. A classificação das proteínas solúveis por tipo de estrutura foi realizada somente após as estruturas de mais de 100 proteínas diferentes terem sido determinadas em alta resolução. Quanto às proteínas transmembrana, isso foi feito apenas em um caso - para a proteína do centro de reação fotossintética das bactérias. Juntamente com dados de microscopia eletrônica de baixa resolução sobre a estrutura da bacteriorodopsina, esta é a única fonte na qual os modelos para a maioria das outras proteínas transmembrana podem ser baseados.

Outro ponto importante são os métodos de fixação das proteínas à membrana. Eles são mostrados esquematicamente na Fig. 3.1.

1. Ligação com proteínas imersas na bicamada. Os exemplos incluem a parte Fi da H + -ATPase, que se liga à parte Fo incorporada na membrana; Algumas proteínas do citoesqueleto também podem ser mencionadas.

2. Ligação à superfície da bicamada. Esta interação é principalmente de natureza eletrostática ou hidrofóbica. Na superfície de algumas proteínas de membrana existem domínios hidrofóbicos formados devido a características da estrutura secundária ou terciária. Essas interações superficiais podem ser usadas em adição a outras interações, como a ancoragem transmembrana.

3.Encadernação com “âncora” hidrofóbica; esta estrutura é geralmente revelada como uma sequência de resíduos de aminoácidos não polares. Algumas proteínas de membrana usam ácidos graxos ou fosfolipídios ligados covalentemente como âncoras.

4. Proteínas transmembrana. Alguns deles atravessam a membrana apenas uma vez, outros várias vezes.

As diferenças entre as proteínas da membrana externa e interna não determinam exclusivamente o método de sua ligação à bicamada; essas diferenças determinam apenas a força relativa de sua ligação.

2. Purificação de proteínas de membrana

Para purificar proteínas integrais de membrana e obtê-las em uma forma bioquimicamente ativa, são necessários detergentes para solubilizar as proteínas e preservá-las em solução. Os requisitos de detergente associados e o manuseio representam desafios adicionais além daqueles normalmente encontrados na purificação de proteínas. Muitos métodos específicos foram desenvolvidos para o isolamento de proteínas integrais de membrana, mas a maioria dos esquemas de purificação são baseados nas mesmas técnicas cromatográficas e hidrodinâmicas utilizadas para proteínas solúveis. Trata-se de cromatografia em DEAE-celulose, Sepharose ou hidroxilapatita, filtração em gel, centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, etc. A escolha correta do detergente é muito importante, pois é o detergente que destrói a biomembrana, substituindo os lipídios que envolve uma proteína específica e determina a estabilidade da proteína em solução. Os mecanismos de ação dos detergentes são discutidos na revisão.

2.1. DETERGENTES

Nas últimas duas décadas, um grande número de detergentes adequados para a purificação de proteínas integrais de membrana tornaram-se disponíveis. Em princípio, deve-se tentar encontrar um detergente que não perturbe as estruturas secundárias e terciárias das proteínas da membrana, mas que apenas substitua a maioria ou todos os lipídios da membrana em contato com as regiões hidrofóbicas da molécula da proteína. O objetivo final da solubilização é incorporar a proteína numa micela detergente; a estratégia de purificação subsequente é separar esses complexos proteína-detergente.

O primeiro problema é a seleção das condições ótimas para solubilização da proteína em estudo. Os detergentes desnaturantes de proteínas não são adequados para esta tarefa delicada. Por outro lado, muitos detergentes não rompem eficazmente as membranas e formam micelas mistas contendo proteínas. Tais detergentes podem ser demasiado hidrofóbicos ou demasiado hidrofílicos para se misturarem eficazmente com os lípidos da membrana e, se a sua concentração for suficientemente elevada, para converterem a bicamada em micelas globulares mistas. A princípio, esperava-se que a escolha do detergente requerido pudesse ser sistematizada utilizando um único parâmetro denominado equilíbrio hidrofílico-lipofílico. Este parâmetro, variando de 1 a 20, é utilizado na preparação de surfactantes como medida de hidrofobicidade relativa. Na verdade, foram obtidas algumas correlações, das quais se conclui que o valor HLB de um detergente pode ser utilizado para prever o seu comportamento em sistemas biológicos. De modo geral, os detergentes com um valor HLB na faixa de 12,5 a 14,5 podem ser considerados os solventes mais eficazes para proteínas de membrana integral. No entanto, posteriormente tornou-se claro que a procura de detergentes óptimos para uma determinada proteína de membrana requer a consideração de muitos factores e deve sempre ser acompanhada por testes empíricos. O seguinte deve ser levado em consideração.

1.Máxima solubilização da proteína em estudo. O critério é a transferência da proteína para o sobrenadante após a centrifugação, durante a qual a membrana sedimenta.

2.Solubilização da proteína na forma desejada. Normalmente estamos falando de preservar sua atividade enzimática, mas às vezes são utilizadas certas características espectrais ou a presença de proteínas associadas específicas. Além disso, a estabilidade da proteína após a solubilização é um pré-requisito. Em alguns casos, fosfolipídios exógenos são adicionados juntamente com o detergente para manter a atividade bioquímica. Um exemplo é a produção de lactose permease de E. coli e proteína do canal de sódio. Às vezes, é adicionado glicerol ou outro poliol para estabilizar a proteína após a solubilização. Faz sentido utilizar também inibidores de protease e realizar a solubilização sob condições que minimizem a probabilidade de sua degradação proteolítica.

3. Possibilidade de utilização de detergente nesta técnica. É necessário, em primeiro lugar, ter em conta a carga do detergente, o comportamento a um determinado valor de pH, o CMC e o tamanho das micelas do detergente. Estas últimas propriedades são especialmente importantes. Detergentes com baixo CMC que formam micelas grandes não são removidos por diálise ou ultrafiltração porque a concentração de monômeros de detergente é muito baixa. Em termos práticos, isto significa que se uma proteína for concentrada por ultrafiltração, a concentração de um detergente com baixo CMC também aumentará, o que pode levar à desnaturação da proteína. Por esta razão, muitos investigadores preferem utilizar detergentes com CMC elevados, tais como octil glucosídeo, sais biliares ou detergentes zwitteriónicos mais modernos. As resinas de poliestireno, como o Biobidz SM-2, são muito valiosas. Eles se ligam seletivamente a detergentes como o Triton X-100, removendo-os da solução e tornando possível dispensar totalmente a diálise. Outro fator a considerar é a absorção de luz do detergente. Alguns detergentes, como o Triton X-100, absorvem na região próxima do UV, tornando impossível determinar a concentração de proteína medindo a absorvância a 280 nm.

Levando em consideração todos esses fatores, fica claro porque em muitos casos é necessário utilizar diferentes detergentes no isolamento de proteínas integrais de membrana. Por exemplo, Triton X-100 pode ser utilizado para solubilização, mas a separação com DEAE-celulose é melhor realizada na presença de octil glucósido. Os detergentes podem ser trocados na fase de cromatografia, durante a centrifugação em gradiente de densidade e, em alguns casos, por meio de diálise. Deve-se ter em mente que um detergente inadequado para solubilizar uma determinada proteína pode ser muito eficaz na manutenção da proteína em solução após uma troca de detergente. A purificação deve quase sempre ser realizada com excesso de detergente em solução, caso contrário o equilíbrio será deslocado para a agregação de proteínas de membrana e não para a formação de complexos proteína-detergente. Em alguns casos, tal agregação pode até ser desejável, e a etapa final de purificação pode ser a remoção do detergente. Mas, via de regra, com a falta de detergente ocorre precipitação irreversível e perda de proteínas.

A necessidade de manter a concentração de detergente a um certo nível cria dificuldades adicionais para além daquelas normalmente encontradas na purificação de proteínas; Já falamos sobre alguns deles. Também surgem problemas quando se utiliza o método padrão de salga em altas concentrações de sulfato de amônio: em muitos casos, a proteína é precipitada em combinação com o detergente e o lipídio. Como a solução salina tem alta densidade e o detergente no agregado é relativamente baixo, durante a centrifugação o precipitado permanecerá na superfície. É importante lembrar que os complexos proteína-detergente estão sujeitos a purificação, muitas vezes com uma quantidade significativa de fosfolípidos ligados. Isto afeta a qualidade da separação durante a cromatografia, bem como os resultados da caracterização das proteínas pró-solúveis finais, é necessário determinar o número e peso molecular das subunidades polipeptídicas, sua estequiometria, tamanho e, possivelmente, forma das; molécula, bem como, se necessário, atividade bioquímica.

3. CARACTERÍSTICAS DAS PROTEÍNAS DE MEMBRANA INTEGRAL PURIFICADAS

A caracterização de proteínas de membrana purificadas, mesmo as mais simples, pode ser um desafio. Como no caso

3.1 PESO MOLECULAR DAS SUBUNIDADES

A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio é uma técnica comum, mas no caso de proteínas de membrana integral apresenta problemas especiais. Neste método, o dodecil sulfato é acoplado a cadeias polipeptídicas e os complexos proteína-DNS são separados em um gel de poliacrilamida de acordo com seus raios de Stokes, que na maioria dos casos dependem do peso molecular. A massa molecular é determinada comparando a mobilidade eletroforética de um determinado complexo e um padrão conhecido. No entanto, a ligação do SDS a uma proteína desconhecida pode ser qualitativamente diferente da ligação aos padrões e, então, será obtido um resultado incorreto. Uma situação semelhante é observada para proteínas integrais de membrana com alto teor de resíduos de aminoácidos apolares. O SDS forma complexos com a maioria das proteínas solúveis na proporção de 1,4 g de SDS por 1 g de proteína, e mais detergente pode se ligar a proteínas contendo uma grande porcentagem de resíduos apolares. A carga negativa adicional que surge neste caso leva a um aumento anormal na mobilidade eletroforética, e o peso molecular determinado acaba sendo menor do que realmente é. Outra situação também é possível. A proteína de membrana que se liga ao SDS pode não ser totalmente desdobrada, o que também levará a um aumento anormal na mobilidade eletroforética devido à formação de um complexo proteína-SDS mais compacto. Todos esses efeitos são bastante significativos. Por exemplo, a lactose permease tem um mol aparente. massa 33.000 quando medida por PAGE na presença de SDS; na realidade, como mostram os resultados da análise genética, diz ela. a massa é 46.000. Em muitos casos, é possível estimar o peso molecular com mais precisão através da construção de um gráfico de Ferguson, que representa a dependência da mobilidade eletroforética do teor de acrilamida tanto para as proteínas padrão quanto para a proteína em estudo. Este gráfico depende do raio de Stokes e, em menor grau, da carga do complexo. Por exemplo, de acordo com os resultados da eletroforese em gel de acrilamida a 12%, uma das subunidades do complexo citocromo O de E. coli tem peso molecular aparente. massa 28.000, e no gráfico de Ferguson o valor é 43.000, o que coincide com o mol. massa calculada a partir de dados de sequenciamento do DNA correspondente.

Outro problema é a possível presença de estrutura quaternária. Algumas proteínas de membrana agregam-se mesmo na presença de SDS. Por exemplo, a glicoforina A ou a proteína do envelope do bacteriófago M13 são encontradas principalmente na forma de dímeros durante a eletroforese em géis de poliacrilamida com SDS. Às vezes, a agregação é ainda melhorada pelo aquecimento da mistura proteína-SDS. Este quadro é observado, por exemplo, para subunidades de oxidases terminais mitocondriais e bacterianas. Para avaliar a capacidade de agregação irreversível de uma proteína, deve ser realizada uma análise comparativa dos resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS para amostras aquecidas e não aquecidas. Um problema semelhante surge por vezes devido à presença de detergente utilizado na purificação de proteínas de membrana. Este detergente deve ser retirado e substituído por SDS, pois em alguns casos existe uma clara dependência da mobilidade eletroforética da presença do detergente com o qual a enzima foi solubilizada.

Assim, há razões para pensar que a avaliação do peso molecular das subunidades de proteínas de membrana integrais altamente apolares, determinada utilizando SDS-PAGE, pode estar incorreta. Infelizmente, não existe uma alternativa simples a este método, e o valor correto é frequentemente obtido a partir de dados completos da sequência primária ou de análises hidrodinâmicas precisas.

3.2 DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR DA PROTEÍNA NATIVA USANDO MÉTODOS HIDRODINÂMICOS

A aplicação destes métodos a proteínas de membrana pode estar repleta de dificuldades devido à ligação do detergente. Para apreciar isto plenamente, consideremos primeiro uma proteína solúvel simples, para a qual o mol. massa de subunidades usando SDS-PAGE e é necessário descobrir o que é em sua forma ativa não desnaturada - um monômero, dímero ou oligômero de ordem superior. A filtração em gel, que envolve comparação com proteínas padrão, é frequentemente usada para determinar o peso molecular das proteínas; Aqui surgem problemas devido ao fato de que todas as proteínas padrão têm uma forma globular, e a proteína em estudo pode não ser globular, mas ligeiramente alongada. Tal proteína com mol. pesando 50.000 pode eluir a uma velocidade correspondente a mol. Poderia

se 100 LLC. Neste sentido, a coluna de filtração em gel deve ser calibrada de acordo com o raio de Stokes, ou seja, as dimensões da “esfera hidrodinâmica equivalente”, e além disso, algum outro método deve ser utilizado em paralelo. Normalmente, as taxas de sedimentação são medidas usando ultracentrifugação analítica ou centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. O coeficiente de sedimentação é igual a

onde m é o peso molecular da proteína,

v é o seu volume específico parcial, ij é a viscosidade da solução, b é a densidade da solução.

Como e e H são conhecidos, aRc pode ser determinado usando filtração em gel, restando apenas duas quantidades desconhecidas - v e m. Para proteínas solúveis em água, v pode ser calculado com base na composição de aminoácidos ou medido diretamente, ou simplesmente considerado igual a. 0,72-0,75 ml/g. Assim, medindo S 0, podemos encontrar m.

Consideremos agora a situação com uma proteína de membrana. Problemas adicionais surgem aqui, uma vez que a partícula hidrodinâmica é um complexo proteína-detergente, portanto m e v neste caso são o peso molecular e o volume específico do complexo, M k e K,. Infelizmente, K não pode ser avaliado sem saber nada sobre a composição do complexo. Neste caso, dois métodos são utilizados para encontrar a massa molecular da proteína.

1. Meça diretamente a quantidade de detergente ligado por 1 g de proteína. Para tanto, são utilizados métodos espectrais ou detergentes marcados radioativamente, e vários métodos, como filtração em gel, são utilizados para isolar complexos. Tendo estabelecido o teor relativo de proteína e detergente no complexo, o valor K é obtido como uma média ponderada dos valores correspondentes para proteína pura e detergente puro. Depois disso, m é facilmente encontrado, e como a proporção entre a proteína e o detergente no complexo é conhecida, o peso molecular da proteína é encontrado.

2. O S0 é medido em meios com diferentes densidades de solução. Esses meios são geralmente preparados utilizando misturas de HgO e D2O. A partir do gráfico de S° versus q, tanto L/„ quanto v t são encontrados. Supõe-se que K é a média ponderada dos valores correspondentes para proteína pura e detergente puro.

Avaliando Kvelo* e retirando o detergente das tabelas, obtém-se o peso molecular do componente proteico m.

Para traçar a dependência de 5° em q, é realizada centrifugação analítica. A centrifugação também pode ser realizada em gradiente de densidade de sacarose utilizando misturas de H2O e D2O, mas a análise dos resultados neste caso é muito mais complicada, embora não seja fundamentalmente diferente do caso anterior.

Um método alternativo para determinar o peso molecular da forma nativa de uma proteína de membrana é por ultracentrifugação de equilíbrio. A distribuição de uma substância em equilíbrio é tal que a inclinação do gráfico do logaritmo da concentração versus r 2 é igual a

onde r é a distância do centro do rotor a um determinado ponto no tubo da centrífuga, W é a frequência de rotação.

Se o valor de Y for conhecido ou fácil de estimar, como acontece com a maioria das proteínas solúveis, este problema é resolvido de forma bastante simples. Quanto às proteínas de membrana, neste caso o

Tabela 3. Ligação de detergentes a algumas proteínas de membrana

um clone da linha reta indicada em diferentes valores de q obtido pela mistura de HgO e D2O. Como antes, Mk e K são encontrados simultaneamente e então o peso molecular da proteína é determinado.

Se um terceiro componente estiver presente no complexo, surgem problemas adicionais. Em qualquer caso, todos os procedimentos descritos são muito complexos e podem dar resultados erróneos. A quantidade de detergente associada às proteínas de membrana integrais purificadas pode ser bastante significativa - de 0,3 a 1,5 em peso da proteína, e mesmo pequenos erros neste valor levarão a uma distorção significativa do peso molecular da proteína. Na tabela A Tabela 3.3 fornece dados sobre a quantidade de detergentes presentes em algumas preparações proteicas. Observe que as proteínas solúveis não se ligam a esses detergentes; isto novamente indica que é a parte apolar da proteína, geralmente em contato com os lipídios da membrana, que é responsável pela ligação ao detergente.

3.3 MÉTODO DE INATIVAÇÃO DE RADIAÇÃO

O método de inativação de radiação para determinar o tamanho do alvo é cada vez mais utilizado no estudo de proteínas de membrana. Tanto proteínas purificadas quanto preparações brutas, incluindo biomembranas intactas, podem ser estudadas. A essência do método é determinar a proporção de moléculas de proteína que são danificadas pela irradiação. Para tanto, são utilizados métodos enzimáticos de ligação de hormônios ou outros ligantes ou métodos espectrais. O procedimento é o seguinte. A amostra, geralmente congelada, é exposta a radiação de alta energia. Em intervalos diferentes, amostras são coletadas, descongeladas e medidas são feitas. Danos a uma proteína sob a influência da radiação são detectados, por exemplo, usando SDS-PAGE. A experiência mostra que algumas subunidades perdem completamente a sua atividade biológica quando o dano da radiação é introduzido em qualquer lugar da cadeia polipeptídica. O ponto chave é que quanto maior a molécula da proteína, maior a probabilidade de dano e, portanto, a probabilidade de inativação. Esta probabilidade não depende da forma da molécula, mas da sua massa. Normalmente, uma proteína de peso molecular conhecido é irradiada em paralelo para facilitar a interpretação dos resultados. Se a proteína em estudo contiver mais de uma subunidade, surgem certas dificuldades na análise dos resultados. O dano a uma subunidade não é necessariamente acompanhado pela ruptura de ligações covalentes em outras subunidades. Portanto, para enzimas que consistem em subunidades diferentes com atividades diferentes, podem ser obtidos diferentes tamanhos de alvo dependendo do método para determinar o grau de inativação.

Uma característica notável do método é que ele pode ser usado para estudar proteínas integrais de membrana in situ. Os artefatos e problemas que surgem neste caso são discutidos no trabalho. Um problema óbvio é a necessidade de usar radiação de alta energia. A este respeito, a maior parte do trabalho deve ser realizada em colaboração com laboratórios que possuam fontes apropriadas e que dominem métodos de análise especiais.

3.4 MÉTODOS ESPECTRAIS E ESTRUTURA SECUNDÁRIA

Vários métodos são usados ​​para determinar o conteúdo de hélices α e folhas β em proteínas de membrana. Na ausência de uma organização tridimensional, pode-se tentar construir modelos apropriados com base nelas. O método mais comumente usado é o dicroísmo circular. A espectroscopia infravermelha e Raman, bem como a RMN, são cada vez mais utilizadas.

1. O método do dicroísmo circular baseia-se na medição da diferença na absorção da luz polarizada esquerda e direita; esta atividade óptica é uma medida da quiralidade das moléculas, ou uma medida de sua assimetria. Na região do ultravioleta distante, a CD é determinada principalmente pela absorção de amidas de grupos carbonila da estrutura polipeptídica. Na presença de seções de estrutura secundária, por exemplo, hélices α, o espectro CD apresenta características muito específicas associadas às características do ambiente eletrônico dos grupos amido nessas estruturas. Ao analisar o espectro CD das proteínas, ele geralmente é representado como a soma dos componentes correspondentes à absorção de diferentes partes da molécula da proteína: hélices α, camadas β e bobinas aleatórias. Tendo determinado os espectros de cada uma destas estruturas de uma forma ou de outra, eles são somados, selecionando os coeficientes adequados de forma que se consiga a melhor correspondência com o espectro medido. Os coeficientes de ponderação selecionados representam a proporção que cai na molécula para cada tipo de estrutura secundária.

Estes métodos foram desenvolvidos para proteínas solúveis, mas não há razão para duvidar que possam ser aplicados com sucesso a proteínas de membrana. Muito provavelmente, estas últimas possuem regiões com os mesmos tipos de estrutura secundária das proteínas solúveis, e as mesmas dificuldades surgirão ao estudá-las. Algumas proteínas podem ser estudadas in situ utilizando suspensões de membrana. Exemplos desse tipo são a bacteriorodopsina da membrana púrpura do Halobacteriumhalobium e a Ca 2 + -ATPase da membrana do retículo sarcoplasmático. As proteínas de membrana purificadas podem ser examinadas usando CD e na presença de detergentes, se a absorção destes últimos na região do UV distante não for muito alta, ou na composição de vesículas reconstruídas. Dois problemas surgem aqui: 1) espalhamento diferencial da luz, quando o tamanho das partículas da membrana é muito maior que o comprimento de onda da luz; 2) equalização da absorção devido à concentração da proteína em membranas ou vesículas, ou seja, devido à heterogeneidade de sua distribuição em solução. Esses artefatos podem ser bastante significativos, mas podem ser contabilizados usando métodos apropriados.

Infelizmente, dados estruturais de alta resolução não estão disponíveis para proteínas intrínsecas de membrana, portanto a interpretação precisa dos espectros de CD não é possível. Com algumas exceções, diferentes métodos espectrais não foram utilizados para estudar a mesma proteína, e nenhuma comparação quantitativa dos resultados foi feita. É interessante que para a bacteriorodopsina, que foi estudada pelos métodos CD, IR e RMN, nos três casos foram obtidos os mesmos resultados, indicando um conteúdo significativo de 3 camadas nesta proteína. No entanto, cada método tem desvantagens significativas. Assim, os dados sobre o alto teor de camadas D na bacteriorodopsina dependem em grande parte do método de contabilização dos artefatos ópticos. A julgar pelos dados de reconstrução microscópica eletrônica, caracterizados por uma resolução relativamente baixa, 80% da bacteriorodopsina consiste em hélices α e as camadas 0 estão completamente ausentes. Para entender o motivo dessas discrepâncias, é necessário realizar a análise estrutural da proteína em resolução atômica. Existem duas outras proteínas que atravessam a membrana de alta abundância e a toxina a de Staphylococcus aureus. Ambas as proteínas estão envolvidas na formação de poros na bicamada.

2. Espectroscopia no infravermelho e espectroscopia Raman. Estes métodos não só fornecem informações sobre a conformação dos lipídios da membrana, mas também podem ser usados ​​para estudar a estrutura secundária das proteínas. O espectro vibracional da estrutura polipeptídica depende do tipo de estrutura secundária e fornece informações sobre o conteúdo das estruturas a e /3 na molécula. Esses métodos podem ser usados ​​para estudar filmes secos ao ar, suspensões aquosas de membranas, bem como proteínas purificadas, tanto na presença de um detergente quanto como parte de vesículas reconstruídas. Por exemplo, de acordo com a espectroscopia IR com transformada de Fourier, o complexo Ca 2+ -ATPase na membrana consiste principalmente em regiões α-helicoidais e regiões com uma conformação de bobina estatística, e a proteína hidrofóbica mielina nas vesículas reconstruídas tem α- e / 3 parcelas.

3. A espectroscopia de RMN também pode ser usada para estudar proteínas de membrana. No entanto, as capacidades do método neste caso são limitadas, o que se deve principalmente aos movimentos relativamente lentos das proteínas integrais da membrana in situ e em complexos com detergente. Portanto, um método tão poderoso como a RMN bidimensional, que pode fornecer uma imagem detalhada do estado conformacional de proteínas relativamente pequenas em solução, ainda não é adequado para o estudo de proteínas de membrana. O método de RMN de amostras sólidas é mais aceitável. Os métodos de RMN de 2H e 3C têm grande potencial, embora até agora não tenham sido amplamente utilizados. Foram obtidos dados sobre a conformação média do núcleo e a dinâmica das cadeias laterais. Deve-se notar que os métodos de RMN de estado sólido não apenas não são amplamente utilizados, mas na maioria dos casos não podem ser utilizados. No entanto, nas raras situações em que a sua utilização é possível, são muito valiosos.

3.5 ATIVIDADE ENZIMA

Um dos métodos mais importantes para caracterizar proteínas de membrana purificadas é, sem dúvida, a determinação da atividade bioquímica. Neste caso, são utilizados basicamente os mesmos critérios que para proteínas solúveis, mas podem surgir dificuldades próprias. A primeira delas se deve ao fato de que a atividade bioquímica das proteínas de membrana é frequentemente muito dependente da ligação de lipídios e detergentes à proteína. A perda de atividade pode ser reversível ou irreversível. É aconselhável ter algum tipo de estimativa da atividade específica da proteína em estudo in vivo ou como parte de membranas antes da solubilização. O excesso de detergente pode ter um efeito inibitório, por exemplo, diluindo substratos não polares na população micelar e reduzindo a atividade enzimática. Ao medir a atividade de qualquer proteína de membrana, deve-se ter em mente que in situ ela está rodeada por lipídios que garantem atividade ideal. O segundo problema diz respeito às proteínas que possuem atividade “transbicamada”; exemplos incluem proteínas formadoras de canais e proteínas de transporte. Nestes casos, deve-se levar em consideração a movimentação dos solutos de um compartimento para outro.

3.6 ESTRUTURA QUATERNÁRIA E REVESTIMENTO QUÍMICO

Muitas enzimas de membrana são complexos que consistem em várias subunidades. Exemplos incluem H + -ATPase, Na + /K + -ATPase, complexos de transporte de elétrons mitocondriais e centros de reação fotossintética. Algumas proteínas integrais de membrana estão fortemente associadas a proteínas solúveis através de interações não covalentes. Na E. coli, o componente Fo, que segundo a eletroforese SDS-PAGE contém três tipos de subunidades, forma um canal de prótons aFi, composto por cinco tipos de subunidades, contém um centro ativo envolvido na hidrólise do ATP; Para tais proteínas, é muito importante determinar a natureza das subunidades, a estequiometria do complexo e as interações imediatas dos seus componentes. Esta é uma tarefa muito difícil mesmo quando o complexo proteico já está isolado. Os problemas que surgem aqui não são essencialmente diferentes daqueles dos complexos proteicos solúveis, mas existem dificuldades adicionais.

Em primeiro lugar, deve-se ter em mente que a interação entre as subunidades é muito dependente do tipo de lipídios e detergentes aos quais as proteínas estão associadas. Por exemplo, a succinato desidrogenase de E. coli, quando solubilizada com Lubrol PX, parece consistir em quatro subunidades, mas quando solubilizada com a maioria dos outros detergentes, incluindo Triton X-100, apenas duas. Sabe-se que o operon sdh codifica todos os quatro polipeptídeos, e a forma de duas subunidades possui um espectro de RE anormal. Assim, é claro que in vivo a enzima consiste em quatro subunidades. No entanto, ambas as formas possuem atividade succinato desidrogenase, portanto os critérios bioquímicos utilizados são importantes para concluir se a forma correta foi solubilizada.

Outro problema é que as proteínas de membrana podem formar complexos na bicamada devido à sua alta concentração local. Durante a solubilização, independente do detergente utilizado, pode ocorrer diluição das proteínas da membrana e sua separação. De acordo com a lei da ação das massas, isso levará à dissociação de complexos nos quais a interação entre os componentes não é muito forte. Muitas vezes é difícil determinar qual complexo é formado in situ e qual após solubilização e purificação. Problemas semelhantes surgem no estudo de muitos sistemas complexos, por exemplo, o sistema receptor /3-adrenérgico-adeilacil ciclase, cadeias de transporte de elétrons nas mitocôndrias e o sistema microssomal do citocromo P450 e b$.

Para estudar a estequiometria das subunidades e sua associação em um complexo purificado, apenas alguns métodos são utilizados: 1) reticulação química; 2) análise quantitativa de aminoácidos N-terminais; 3) determinação da proporção de massa de subunidades em géis de SDS-poliacrilamida através da determinação da intensidade da coloração usando autorradiografia ou imunotransferência. Cada método tem suas limitações, mas todos eles foram utilizados na prática. Por exemplo, a estequiometria de cinco subunidades do receptor nicotínico acetilcólico foi determinada por análise quantitativa de aminoácidos N-coicos, e três subunidades do componente Fo de E. coli H+-ATPase por separação em géis de SDS-poliacrilamida. Observe que o azul brilhante de Coomassie, comumente usado para corar proteínas após a separação por SDS-PAGE, liga-se preferencialmente a proteínas contendo resíduos de aminoácidos básicos, e há exemplos de proteínas de membrana interna altamente apolares que são apenas pouco coradas.

A reticulação química tem sido usada para determinar interações de curto alcance em complexos proteicos purificados e complexos in situ. Vários reticuladores hidrofóbicos específicos têm sido usados ​​para analisar interações de curto alcance em proteínas de membrana. Alguns deles são apresentados na tabela. 3.4. Os métodos utilizados não diferem daqueles para sistemas solúveis. Os produtos de reticulação são normalmente analisados ​​por PAGE, muitas vezes utilizando agentes de reticulação cliváveis, permitindo a análise de polipéptidos. Anticorpos para polipéptidos individuais também são utilizados para imunotransferência após SDS-PAGE para identificar os componentes de cada um dos produtos resultantes. Pode-se supor que, dada a vida útil relativamente longa dos reagentes, as proteínas nas biomembranas seriam reticuladas como resultado da simples difusão na bicamada. No entanto, de acordo com vários estudos, este não é o caso: os produtos de reticulação são associados específicos de proteínas, e não formações aleatórias. Assim, na membrana fotossintética de Rhodobacter capsulata, as ligações cruzadas são formadas apenas entre as subunidades dos componentes do centro de reação, bem como entre o centro de reação e o complexo “antena” B870, que está envolvido na transferência de energia para o centro de reação.

Finalmente, notamos que a reticulação química tem sido frequentemente utilizada para identificar proteínas integrais de membrana que se ligam a componentes solúveis conhecidos. Um exemplo é a ligação cruzada de 1) as subunidades a e b do componente Fo-kom da H + -ATPase com a subunidade /3 do componente solúvel Fi; 2) subunidades do citocromo c c da citocromo c oxidase mitocondrial; 3) hormônios peptídicos com receptores hormonais.

Tabela 4. Alguns reagentes de reticulação utilizados para determinar a estrutura quaternária de proteínas de membrana"