लगभग सभी जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं एंजाइमेटिक होती हैं। एंजाइमों(जैव उत्प्रेरक) धातु के पिंजरों द्वारा सक्रिय प्रोटीन प्रकृति के पदार्थ हैं। लगभग 2000 विभिन्न एंजाइम ज्ञात हैं, और उनमें से लगभग 150 को अलग कर दिया गया है, जिनमें से कुछ का उपयोग दवाओं के रूप में किया जाता है। ब्रोंकाइटिस और निमोनिया के इलाज के लिए ट्रिप्सिन और काइमोट्रिप्सिन का उपयोग किया जाता है; पेप्सिन - जठरशोथ के उपचार के लिए; प्लास्मिन - दिल के दौरे के इलाज के लिए; अग्नाशय - अग्न्याशय के उपचार के लिए। एंजाइम पारंपरिक उत्प्रेरक से (ए) उच्च उत्प्रेरक गतिविधि में भिन्न होते हैं; (बी) उच्च विशिष्टता, यानी। चयनात्मक कार्रवाई।

एकल-सब्सट्रेट एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया के तंत्र को योजना द्वारा दर्शाया जा सकता है:

जहां E एक एंजाइम है,

एस - सब्सट्रेट,

ES - एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स,

आर प्रतिक्रिया का उत्पाद है।

एंजाइमी प्रतिक्रिया के पहले चरण की विशेषता है माइकलिस स्थिरांक (K M). K M संतुलन स्थिरांक का व्युत्क्रम है:

माइकलिस स्थिरांक (KM) एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स (ES) की स्थिरता की विशेषता है। माइकलिस स्थिरांक (KM) जितना छोटा होगा, परिसर उतना ही अधिक स्थिर होगा।

एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर इसके दर-सीमित कदम की दर के बराबर होती है:

जहां k 2 दर स्थिर है, जिसे कहा जाता है क्रांतियों की संख्याया एंजाइम की आणविक गतिविधि।

एक एंजाइम की आणविक गतिविधि(के 2) 25 0 सी पर 1 मिनट में एक एंजाइम अणु के प्रभाव में परिवर्तन के दौर से गुजर रहे सब्सट्रेट अणुओं की संख्या के बराबर है। यह स्थिरांक सीमा में मान लेता है: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

यूरिया के लिए, जो यूरिया के हाइड्रोलिसिस को तेज करता है, के 2 = 1.85∙10 6 मिनट‾ 1; एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट के लिए, जो एटीपी के हाइड्रोलिसिस को तेज करता है, k 2 = 6.24∙10 6 मिनट‾ 1; उत्प्रेरक के लिए, जो एच 2 ओ 2, के 2 = 5∙10 6 मिनट‾ 1 के अपघटन को तेज करता है।

हालांकि, एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स () की एकाग्रता को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित करने की असंभवता के कारण एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया का गतिज समीकरण जिस रूप में ऊपर दिया गया है, उसका उपयोग करना व्यावहारिक रूप से असंभव है। अन्य मात्राओं के संदर्भ में व्यक्त करना, आसानी से प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाता है, हम एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के गतिज समीकरण प्राप्त करते हैं,बुलाया माइकलिस-मेंटेन समीकरण (1913):

,

जहाँ गुणन k 2 [E] tot स्थिरांक का मान है, जिसे (अधिकतम गति) द्वारा दर्शाया जाता है।

क्रमश:

माइकलिस-मेंटेन समीकरण के विशेष मामलों पर विचार करें।

1) कम सब्सट्रेट एकाग्रता पर, के एम >> [एस], इसलिए

जो पहले क्रम की प्रतिक्रिया के गतिज समीकरण से मेल खाती है।

2) सब्सट्रेट K m . की उच्च सांद्रता पर<< [S], поэтому

जो शून्य कोटि की अभिक्रिया के गतिज समीकरण से मेल खाती है।

इस प्रकार, कम सब्सट्रेट एकाग्रता पर, सिस्टम में सब्सट्रेट सामग्री में वृद्धि के साथ एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया दर बढ़ जाती है, और उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता पर, गतिज वक्र एक पठार तक पहुंच जाता है (प्रतिक्रिया दर सब्सट्रेट एकाग्रता पर निर्भर नहीं करती है) ( अंजीर। 30)।

चित्रा 30. - एंजाइमी प्रतिक्रिया का काइनेटिक वक्र

अगर [एस] = के एम, तो

जो आपको माइकलिस स्थिरांक K m (चित्र 31) को ग्राफिक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देता है।

चित्र 31. - माइकलिस स्थिरांक की चित्रमय परिभाषा

एन्जाइम की गतिविधि निम्न से प्रभावित होती है: (ए) तापमान, (बी) माध्यम की अम्लता, (सी) अवरोधकों की उपस्थिति। एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर पर तापमान के प्रभाव की चर्चा अध्याय 9.3 में की गई है।

एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर पर माध्यम की अम्लता का प्रभाव चित्र 32 में दिखाया गया है। एंजाइम की अधिकतम गतिविधि पीएच मान (पीएच ऑप्ट) के इष्टतम मूल्य से मेल खाती है।

चित्रा 32. - एंजाइमों की गतिविधि पर समाधान की अम्लता का प्रभाव

अधिकांश एंजाइमों के लिए, इष्टतम पीएच मान शारीरिक मूल्यों (7.3 - 7.4) के साथ मेल खाते हैं। हालांकि, ऐसे एंजाइम होते हैं जिन्हें अपने सामान्य कामकाज के लिए अत्यधिक अम्लीय (पेप्सिन - 1.5-2.5) या काफी क्षारीय वातावरण (आर्जिनेज - 9.5 - 9.9) की आवश्यकता होती है।

एंजाइम अवरोधक- ये ऐसे पदार्थ हैं जो एंजाइम अणुओं के सक्रिय केंद्रों के हिस्से पर कब्जा कर लेते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर कम हो जाती है। भारी धातु के धनायन, कार्बनिक अम्ल और अन्य यौगिक अवरोधक के रूप में कार्य करते हैं।

व्याख्यान 11

परमाणु की संरचना

"परमाणु" शब्द की दो परिभाषाएँ हैं। परमाणुएक रासायनिक तत्व का सबसे छोटा कण है जो अपने रासायनिक गुणों को बरकरार रखता है।

परमाणुएक विद्युत रूप से तटस्थ माइक्रोसिस्टम है जिसमें एक धनात्मक आवेशित नाभिक और एक ऋणात्मक आवेशित इलेक्ट्रॉन शेल होता है।

परमाणु के सिद्धांत ने विकास का एक लंबा सफर तय किया है। परमाणु के विकास में मुख्य चरणों में शामिल हैं:

1) प्राकृतिक-दार्शनिक चरण - पदार्थ की परमाणु संरचना की अवधारणा के गठन की अवधि, प्रयोग द्वारा पुष्टि नहीं की गई (5 वीं शताब्दी ईसा पूर्व - 16 वीं शताब्दी ईस्वी);

2) एक रासायनिक तत्व (XVIII-XIX सदियों) के सबसे छोटे कण के रूप में परमाणु के बारे में परिकल्पना के गठन का चरण;

3) भौतिक मॉडल बनाने का चरण जो परमाणु की संरचना की जटिलता को दर्शाता है और इसके गुणों का वर्णन करना संभव बनाता है (20 वीं शताब्दी की शुरुआत)

4) परमाणु के आधुनिक चरण को क्वांटम यांत्रिकी कहा जाता है। क्वांटम यांत्रिकीभौतिकी की एक शाखा है जो प्राथमिक कणों की गति का अध्ययन करती है।

योजना

11.1. नाभिक की संरचना। समस्थानिक।

11.2. परमाणु के इलेक्ट्रॉन खोल का क्वांटम-यांत्रिक मॉडल।

11.3. परमाणुओं की भौतिक और रासायनिक विशेषताएं।

नाभिक की संरचना। आइसोटोप

परमाणु नाभिक- यह एक धनावेशित कण है, जिसमें प्रोटॉन, न्यूट्रॉन और कुछ अन्य प्राथमिक कण होते हैं।

यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि नाभिक के मुख्य प्राथमिक कण प्रोटॉन और न्यूट्रॉन हैं। प्रोटॉन (पी) -यह एक प्राथमिक कण है जिसका सापेक्ष परमाणु द्रव्यमान 1 amu है और जिसका सापेक्ष आवेश + 1 है। न्यूट्रॉन (एन) -यह एक प्राथमिक कण है जिसमें विद्युत आवेश नहीं होता है, जिसका द्रव्यमान प्रोटॉन के द्रव्यमान के बराबर होता है।

नाभिक में परमाणु के द्रव्यमान का 99.95% होता है। प्राथमिक कणों के बीच, विस्तार के विशेष परमाणु बल, इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण की ताकतों से काफी अधिक होते हैं।

एक परमाणु की मौलिक विशेषता है शुल्कउसका नाभिक, प्रोटॉन की संख्या के बराबर और रासायनिक तत्वों की आवधिक प्रणाली में तत्व की क्रम संख्या के साथ मेल खाता है। समान नाभिकीय आवेश वाले परमाणुओं के संग्रह (प्रकार) को कहते हैं रासायनिक तत्व. प्रकृति में 1 से 92 तक की संख्या वाले तत्व पाए जाते हैं।

आइसोटोप- ये एक ही रासायनिक तत्व के परमाणु होते हैं जिनमें समान संख्या में प्रोटॉन होते हैं और नाभिक में अलग-अलग संख्या में न्यूट्रॉन होते हैं।

जहाँ द्रव्यमान संख्या (A) नाभिक का द्रव्यमान है, z नाभिक का आवेश है।

प्रत्येक रासायनिक तत्व समस्थानिकों का मिश्रण होता है। एक नियम के रूप में, आइसोटोप का नाम रासायनिक तत्व के नाम से मेल खाता है। हालांकि, हाइड्रोजन आइसोटोप के लिए विशेष नाम पेश किए गए हैं। रासायनिक तत्व हाइड्रोजन को तीन समस्थानिकों द्वारा दर्शाया जाता है:

नंबर पी नंबर n

प्रोटियम एच 1 0

ड्यूटेरियम डी 1 1

ट्रिटियम टी 1 2

किसी रासायनिक तत्व के समस्थानिक स्थिर या रेडियोधर्मी हो सकते हैं। रेडियोधर्मी समस्थानिकों में नाभिक होते हैं जो कणों और ऊर्जा की रिहाई के साथ अनायास ढह जाते हैं। एक नाभिक की स्थिरता उसके न्यूट्रॉन-प्रोटॉन अनुपात से निर्धारित होती है।

शरीर में प्रवेश करते हुए, रेडियोन्यूक्लाइड सबसे महत्वपूर्ण जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के पाठ्यक्रम को बाधित करते हैं, प्रतिरक्षा को कम करते हैं, शरीर को बीमारियों के लिए बर्बाद करते हैं। पर्यावरण से चुनिंदा तत्वों को अवशोषित करके शरीर खुद को विकिरण के प्रभाव से बचाता है। स्थिर समस्थानिकों को रेडियोधर्मी समस्थानिकों पर वरीयता दी जाती है। दूसरे शब्दों में, स्थिर समस्थानिक जीवित जीवों में रेडियोधर्मी समस्थानिकों के संचय को रोकते हैं (तालिका 8)।

एस. शैनन की पुस्तक "न्यूट्रिशन इन द एटॉमिक एज" निम्नलिखित डेटा प्रदान करती है। यदि I-131 के शरीर में प्रवेश करने के 2 घंटे बाद आयोडीन के स्थिर समस्थानिक की अवरुद्ध खुराक, ~ 100 मिलीग्राम के बराबर ली जाती है, तो थायरॉयड ग्रंथि में रेडियोआयोडीन का अवशोषण 90% तक कम हो जाएगा।

रेडियोआइसोटोप का उपयोग चिकित्सा में किया जाता है

कुछ रोगों के निदान के लिए,

सभी प्रकार के कैंसर के उपचार के लिए,

पैथोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए।

तालिका 8 - स्थिर समस्थानिकों का अवरोधन प्रभाव

एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स। काइनेटिक्स दर, प्रतिक्रियाओं के तंत्र और एंजाइमों और सबस्ट्रेट्स की एकाग्रता, तापमान, माध्यम के पीएच, अवरोधकों या सक्रियकर्ताओं की उपस्थिति जैसे कारकों के प्रभाव का अध्ययन करता है।

एक स्थिर सब्सट्रेट एकाग्रता पर, प्रतिक्रिया दर सीधे एंजाइम एकाग्रता के समानुपाती होती है। सब्सट्रेट की एकाग्रता पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर की निर्भरता के ग्राफ में एक समद्विबाहु हाइपरबोला का रूप होता है।

एंजाइम (ए) और सब्सट्रेट (बी) की एकाग्रता पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया दर की निर्भरता

सब्सट्रेट एकाग्रता पर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया दर की निर्भरता का वर्णन किया गया है माइकलिस-मेंटेन समीकरण:

जहां वी जैव रासायनिक प्रतिक्रिया की स्थिर दर है; वीमैक्स - अधिकतम गति; किमी - माइकलिस स्थिरांक; [एस] - सब्सट्रेट एकाग्रता।

यदि सब्सट्रेट एकाग्रता कम है, अर्थात [एस]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

फिर

इस प्रकार, कम सब्सट्रेट सांद्रता पर, प्रतिक्रिया दर सब्सट्रेट एकाग्रता के सीधे आनुपातिक होती है और इसे पहले-क्रम समीकरण द्वारा वर्णित किया जाता है। यह वक्र V = f[S] (चित्र b) के प्रारंभिक सीधे खंड से मेल खाता है।

उच्च सब्सट्रेट सांद्रता [एस] >> किमी पर, जब किमी की उपेक्षा की जा सकती है, तो माइकलिस-मेंटेन समीकरण रूप लेता है, यानी। वी = वीमैक्स।

इस प्रकार, उच्च सब्सट्रेट सांद्रता पर, प्रतिक्रिया दर अधिकतम हो जाती है और इसे शून्य क्रम समीकरण द्वारा वर्णित किया जाता है। यह वक्र V =f [S] के एक खंड के संगत है, जो x-अक्ष के समानांतर है।

सब्सट्रेट सांद्रता पर संख्यात्मक रूप से माइकलिस स्थिरांक की तुलना में, प्रतिक्रिया दर धीरे-धीरे बढ़ जाती है। यह एंजाइमी प्रतिक्रिया के तंत्र के बारे में विचारों के अनुरूप है:

जहां एस सब्सट्रेट है; ई - एंजाइम; ES - एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स; पी - उत्पाद; k1 एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के निर्माण के लिए स्थिर दर है; k2 प्रारंभिक अभिकर्मकों के गठन के साथ एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर के अपघटन की दर स्थिरांक है; k3 उत्पाद के निर्माण के साथ एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के अपघटन की दर स्थिरांक है।

सब्सट्रेट रूपांतरण दरउत्पाद के गठन के साथ (पी) एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है। कम सब्सट्रेट सांद्रता पर, समाधान में एक निश्चित संख्या में मुक्त एंजाइम अणु (ई) होते हैं जो एक जटिल (ईएस) में बंधे नहीं होते हैं। इसलिए, सब्सट्रेट की एकाग्रता में वृद्धि के साथ, परिसरों की एकाग्रता बढ़ जाती है, और, परिणामस्वरूप, उत्पाद निर्माण की दर भी बढ़ जाती है। उच्च सब्सट्रेट सांद्रता पर, सभी एंजाइम अणु एक ES कॉम्प्लेक्स (एंजाइम संतृप्ति घटना) में बंधे होते हैं, इसलिए, सब्सट्रेट एकाग्रता में और वृद्धि व्यावहारिक रूप से परिसरों की एकाग्रता में वृद्धि नहीं करती है, और उत्पाद निर्माण की दर स्थिर रहती है।

इस प्रकार, एंजाइमी प्रतिक्रिया की अधिकतम दर का भौतिक अर्थ स्पष्ट हो जाता है। Vmax वह दर है जिस पर एक एंजाइम प्रतिक्रिया करता है, जो पूरी तरह से एक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के रूप में विद्यमान है।.

माइकलिस स्थिरांक संख्यात्मक रूप से ऐसी सब्सट्रेट सांद्रता से मेल खाता है जिस पर स्थिर वेग अधिकतम आधे के बराबर होता है। यह स्थिरांक एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर के पृथक्करण स्थिरांक की विशेषता है:

माइकलिस स्थिरांक का भौतिक अर्थइसमें यह सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की आत्मीयता की विशेषता है। K1> (k2 + k3), यानी जब Km के छोटे मान होते हैं। ES परिसर के गठन की प्रक्रिया ES के पृथक्करण की प्रक्रियाओं पर हावी है। इसलिए, किमी मान जितना कम होगा, सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की आत्मीयता उतनी ही अधिक होगी। इसके विपरीत, यदि Km बड़ा है, तो (k2 + k3) > k1 और ES वियोजन प्रक्रियाएं प्रबल होती हैं। इस मामले में, सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की आत्मीयता कम है।

एंजाइम अवरोधक और सक्रियकर्ता . एंजाइम अवरोधकपदार्थ कहलाते हैं जो एंजाइम की गतिविधि को कम करते हैं। कोई भी विकृतीकरण एजेंट (उदाहरण के लिए, भारी धातु लवण, एसिड) गैर-विशिष्ट एंजाइम अवरोधक हैं।

प्रतिवर्ती अवरोधकऐसे यौगिक हैं जो एक एंजाइम के साथ गैर-सहसंयोजक रूप से बातचीत करते हैं। अपरिवर्तनीय अवरोधक- ये ऐसे यौगिक हैं जो विशेष रूप से सक्रिय केंद्र के कार्यात्मक समूहों को बांधते हैं और एंजाइम के साथ सहसंयोजक बंधन बनाते हैं।

प्रतिवर्ती निषेध को प्रतिस्पर्धी और गैर-प्रतिस्पर्धी में विभाजित किया गया है। प्रतिस्पर्धी निषेधअवरोधक और सब्सट्रेट के बीच संरचनात्मक समानता का सुझाव देता है। अवरोधक एंजाइम के सक्रिय स्थल में एक स्थान रखता है, और एंजाइम अणुओं की एक महत्वपूर्ण संख्या अवरुद्ध हो जाती है। सब्सट्रेट की एकाग्रता को बढ़ाकर प्रतिस्पर्धी अवरोध को हटाया जा सकता है। इस मामले में, सब्सट्रेट सक्रिय साइट से प्रतिस्पर्धी अवरोधक को विस्थापित करता है।

प्रतिवर्ती निषेध हो सकता है ग़ैर प्रतियोगीसब्सट्रेट के संबंध में। इस मामले में, अवरोधक एंजाइम से लगाव की साइट के लिए प्रतिस्पर्धा नहीं करता है। सब्सट्रेट और अवरोधक अलग-अलग साइटों से जुड़ते हैं, इसलिए आईई कॉम्प्लेक्स के गठन की संभावना है, साथ ही टर्नरी आईईएस कॉम्प्लेक्स, जो उत्पाद की रिहाई के साथ विघटित हो सकता है, लेकिन ईएस कॉम्प्लेक्स की तुलना में धीमी गति से .

द्वारा आपकी कार्रवाई की प्रकृतिअवरोधकों में विभाजित हैं:

• विशिष्ट,
• गैर विशिष्ट।

विशिष्ट अवरोधकएंजाइम पर अपना प्रभाव डालते हैं, एंजाइम के सक्रिय केंद्र में एक सहसंयोजक बंधन के साथ जुड़ते हैं और इसे क्रिया के क्षेत्र से बंद कर देते हैं।

गैर-विशिष्ट निषेध denaturing एजेंटों (भारी धातुओं, यूरिया, आदि के नमक) के एंजाइम पर प्रभाव शामिल है। इस मामले में, प्रोटीन की चतुर्धातुक और तृतीयक संरचना के विनाश के परिणामस्वरूप, एंजाइम की जैविक गतिविधि खो जाती है।

एंजाइम उत्प्रेरकवे पदार्थ हैं जो एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर को बढ़ाते हैं। अधिकतर, धातु आयन (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, आदि) उत्प्रेरक के रूप में कार्य करते हैं। धातुओं के बीच भेद करें जो मेटलोएंजाइम का हिस्सा हैं, जो हैं सहकारकोंऔर एंजाइम उत्प्रेरक के रूप में कार्य करते हैं। कोफ़ैक्टर्स एंजाइम के प्रोटीन भाग से मजबूती से बंध सकते हैं, लेकिन सक्रियकर्ताओं के लिए, वे आसानी से एपोएंजाइम से अलग हो जाते हैं। ऐसी धातुएं उत्प्रेरक अधिनियम में अनिवार्य भागीदार हैं, जो एंजाइम की गतिविधि को निर्धारित करती हैं। सक्रियकर्ता उत्प्रेरक प्रभाव में वृद्धि, लेकिन उनकी अनुपस्थिति एंजाइमी प्रतिक्रिया को आगे बढ़ने से नहीं रोकती है। एक नियम के रूप में, धातु कोफ़ेक्टर सब्सट्रेट के नकारात्मक चार्ज समूहों के साथ बातचीत करता है। परिवर्तनशील संयोजकता वाली धातु सब्सट्रेट और एंजाइम के बीच इलेक्ट्रॉनों के आदान-प्रदान में भाग लेती है। इसके अलावा, वे एंजाइम के एक स्थिर संक्रमणकालीन रचना के निर्माण में शामिल हैं, जो ES परिसर के अधिक तेजी से गठन में योगदान देता है।

एंजाइम गतिविधि का विनियमन . चयापचय को विनियमित करने के लिए मुख्य तंत्रों में से एक एंजाइम गतिविधि का विनियमन है। एक उदाहरण एलोस्टेरिक विनियमन, सक्रियकर्ताओं और अवरोधकों द्वारा विनियमन है। अक्सर ऐसा होता है कि चयापचय पथ का अंतिम उत्पाद नियामक एंजाइम का अवरोधक होता है। इस प्रकार के निषेध को कहा जाता है पुन: निषेध, या नकारात्मक प्रतिक्रिया निषेध।

कई एंजाइम निष्क्रिय प्रोएंजाइम अग्रदूत के रूप में उत्पन्न होते हैं और फिर आंशिक प्रोटियोलिसिस द्वारा सही समय पर सक्रिय होते हैं। आंशिक प्रोटियोलिसिस- अणु के एक हिस्से की दरार, जिससे प्रोटीन की तृतीयक संरचना में परिवर्तन होता है और एंजाइम के सक्रिय केंद्र का निर्माण होता है।

कुछ ओलिगोमेरिक एंजाइम किसके कारण अपनी गतिविधि बदल सकते हैं संघों - उपइकाइयों का पृथक्करणउनकी रचना में शामिल है।

कई एंजाइम दो रूपों में पाए जा सकते हैं: एक साधारण प्रोटीन के रूप में और एक फॉस्फोप्रोटीन के रूप में। एक रूप से दूसरे रूप में संक्रमण उत्प्रेरक गतिविधि में परिवर्तन के साथ होता है।

एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर निर्भर करती है एंजाइम मात्रा, जो कोशिका में इसके संश्लेषण और क्षय की दर के अनुपात से निर्धारित होता है। एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर को विनियमित करने का यह तरीका एंजाइम गतिविधि के नियमन की तुलना में धीमी प्रक्रिया है।

एंजाइमेटिक कैनेटीक्स सब्सट्रेट के साथ उनकी बातचीत की विभिन्न स्थितियों (एकाग्रता, तापमान, पीएच, आदि) के आधार पर एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं की दर का अध्ययन करता है।

हालांकि, एंजाइम प्रोटीन होते हैं जो विभिन्न बाहरी प्रभावों के प्रभाव के प्रति संवेदनशील होते हैं। इसलिए, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की दर का अध्ययन करते समय, मुख्य रूप से अभिकारकों की सांद्रता को ध्यान में रखा जाता है, और तापमान, माध्यम के पीएच, सक्रियकर्ताओं, अवरोधकों और अन्य कारकों के प्रभाव को कम करने की कोशिश की जाती है और मानक स्थितियां बनाई जाती हैं। सबसे पहले, यह इस एंजाइम के लिए माध्यम का इष्टतम पीएच मान है। दूसरे, जहां संभव हो, तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर रखने की सिफारिश की जाती है। तीसरा, सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की पूर्ण संतृप्ति प्राप्त की जाती है। यह बिंदु विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि कम सब्सट्रेट एकाग्रता पर, सभी एंजाइम अणु प्रतिक्रिया में भाग नहीं लेते हैं (चित्र। 6.5)। ए), जिसका अर्थ है कि परिणाम अधिकतम संभव से बहुत दूर होगा। उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की उच्चतम शक्ति, अन्य चीजें समान होने पर, प्राप्त होती है यदि प्रत्येक एंजाइम अणु परिवर्तन में शामिल होता है, अर्थात। एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की उच्च सांद्रता पर (चित्र। 6.5, में)।यदि सब्सट्रेट की एकाग्रता एंजाइम की पूर्ण संतृप्ति सुनिश्चित नहीं करती है (चित्र 6.5, बी), तो कार्यवाही प्रतिक्रिया की दर अधिकतम मूल्य तक नहीं पहुंचती है।

चावल। 65.

ए -कम सब्सट्रेट एकाग्रता पर; 6 - सब्सट्रेट की अपर्याप्त एकाग्रता के साथ; में -जब एंजाइम सब्सट्रेट से पूरी तरह से संतृप्त हो जाता है

एक एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर, उपरोक्त शर्तों के तहत मापा जाता है, और सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की पूर्ण संतृप्ति को कहा जाता है एंजाइमी प्रतिक्रिया की अधिकतम दर (वी)।

एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर, निर्धारित की जाती है जब एंजाइम सब्सट्रेट के साथ पूरी तरह से संतृप्त नहीं होता है, इसे निरूपित किया जाता है वी

योजना द्वारा एंजाइमेटिक कटैलिसीस को सरल रूप से वर्णित किया जा सकता है

जहां F एक एंजाइम है; एस - सब्सट्रेट; एफएस - एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स।

इस प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को एक निश्चित गति की विशेषता है। एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर को मापने के लिए इकाई समय की एक इकाई में परिवर्तित सब्सट्रेट के मोल की संख्या है(एक सामान्य प्रतिक्रिया की दर की तरह)।

सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की बातचीत से एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का निर्माण होता है, लेकिन यह प्रक्रिया प्रतिवर्ती है। आगे और पीछे की प्रतिक्रियाओं की दरें अभिकारकों की सांद्रता पर निर्भर करती हैं और संबंधित समीकरणों द्वारा वर्णित हैं:

समीकरण (6.3) संतुलन में मान्य है, क्योंकि आगे और पीछे की प्रतिक्रियाओं की दरें समान हैं।

समीकरण (6.3) में प्रत्यक्ष (6.1) और रिवर्स (6.2) प्रतिक्रियाओं की दरों को प्रतिस्थापित करते हुए, हम समानता प्राप्त करते हैं:

संतुलन की स्थिति की विशेषता इसी द्वारा होती है संतुलन स्थिरांक K p,प्रत्यक्ष और विपरीत प्रतिक्रियाओं (6.5) के स्थिरांक के अनुपात के बराबर। संतुलन स्थिरांक के व्युत्क्रम को कहते हैं सब्सट्रेट स्थिरांक K s,या एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर का पृथक्करण स्थिरांक:

समीकरण (6.6) से यह स्पष्ट है कि एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की उच्च सांद्रता पर सब्सट्रेट स्थिरांक घटता है, अर्थात। बड़ी स्थिरता के साथ। इसलिए, सब्सट्रेट स्थिरांक एंजाइम और सब्सट्रेट की आत्मीयता और एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के गठन और पृथक्करण के लिए दर स्थिरांक के अनुपात की विशेषता है।

एक सब्सट्रेट के साथ एक एंजाइम की संतृप्ति की घटना का अध्ययन लियोनोर माइकलिस और मौड मेप्टेन द्वारा किया गया था। परिणामों के गणितीय प्रसंस्करण के आधार पर, उन्होंने समीकरण (6.7) प्राप्त किया, जिससे उनके नाम प्राप्त हुए, जिससे यह स्पष्ट है कि सब्सट्रेट की उच्च सांद्रता और सब्सट्रेट स्थिरांक के कम मूल्य पर, एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर बढ़ जाती है। अधिकतम करने के लिए। हालाँकि, यह समीकरण सीमित है क्योंकि यह सभी मापदंडों को ध्यान में नहीं रखता है:

प्रतिक्रिया के दौरान एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स विभिन्न दिशाओं में परिवर्तन से गुजर सकता है:

• मूल पदार्थों में अलग कर देना;
• एक उत्पाद में परिवर्तित किया जा सकता है जिससे एंजाइम अपरिवर्तित रूप से अलग हो जाता है।

इसलिए, एंजाइमी प्रक्रिया के समग्र प्रभाव का वर्णन करने के लिए, अवधारणा माइकलिस स्थिरांक K t,जो एंजाइमी कटैलिसीस (6.8) की तीनों प्रतिक्रियाओं के दर स्थिरांक के संबंध को व्यक्त करता है। यदि दोनों पदों को एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के गठन की प्रतिक्रिया की दर स्थिरांक से विभाजित किया जाता है, तो व्यंजक (6.9) प्राप्त होगा:

समीकरण (6.9) से एक महत्वपूर्ण परिणाम निकलता है: माइकलिस स्थिरांक हमेशा सब्सट्रेट स्थिरांक से अधिक होता है कश्मीर 2 / केवी

संख्यानुसार कश्मीरसब्सट्रेट की ऐसी सांद्रता के बराबर है जिस पर प्रतिक्रिया दर अधिकतम संभव दर से आधी है और सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की ऐसी संतृप्ति से मेल खाती है, जैसा कि अंजीर में है। 6.5, बी।चूंकि व्यवहार में सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की पूर्ण संतृप्ति प्राप्त करना हमेशा संभव नहीं होता है, यह है कश्मीरएंजाइमों की गतिज विशेषताओं की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है।

सब्सट्रेट (6.10) के साथ एंजाइम की अपूर्ण संतृप्ति के मामले में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता पर निर्भर करती है। आनुपातिकता का गुणांक एंजाइम और उत्पाद की रिहाई के लिए प्रतिक्रिया स्थिरांक है, क्योंकि इससे एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर की एकाग्रता में परिवर्तन होता है:

परिवर्तनों के बाद, ऊपर प्रस्तुत निर्भरता को ध्यान में रखते हुए, सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की अपूर्ण संतृप्ति के मामले में एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर समीकरण (6.11) द्वारा वर्णित है, अर्थात। एंजाइम, सब्सट्रेट और उनकी आत्मीयता की सांद्रता पर निर्भर करता है केएस:

सब्सट्रेट की एकाग्रता पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर की ग्राफिकल निर्भरता रैखिक नहीं है। जैसा कि अंजीर से स्पष्ट है। 6.6, सब्सट्रेट की एकाग्रता में वृद्धि के साथ, एंजाइम की गतिविधि में वृद्धि देखी जाती है। हालांकि, जब सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की अधिकतम संतृप्ति पहुंच जाती है, तो एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर अधिकतम हो जाती है। इसलिए, प्रतिक्रिया दर को सीमित करने वाला कारक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का निर्माण है।

अभ्यास से पता चला है कि सब्सट्रेट की सांद्रता, एक नियम के रूप में, एकता (10 6 -10 3 mol) से बहुत कम मूल्यों में व्यक्त की जाती है। गणना में इतनी मात्रा के साथ काम करना काफी मुश्किल है। इसलिए, जी। लाइनविवर और डी। बर्क ने एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया की दर की ग्राफिकल निर्भरता को प्रत्यक्ष निर्देशांक में नहीं, बल्कि व्युत्क्रम में व्यक्त करने का प्रस्ताव दिया। वे इस धारणा से आगे बढ़े कि समान मूल्यों के लिए, उनके व्युत्क्रम भी समान हैं:

चावल। 6.6.

व्यंजक (6.13) के रूपांतरण के बाद, एक व्यंजक प्राप्त होता है, जिसे कहा जाता है लाइनविवर-बर्क समीकरण (6.14):

लाइनविवर-बर्क समीकरण की चित्रमय निर्भरता रैखिक है (चित्र 6.7)। एंजाइम की गतिज विशेषताओं को निम्नानुसार निर्धारित किया जाता है:

• y-अक्ष पर कटा हुआ खंड बराबर है 1/वी;
• x-अक्ष पर कटा हुआ खंड -1 . है / के टी।

चावल। 6.7.

ऐसा माना जाता है कि लाइनविवर - बर्क विधि आपको प्रत्यक्ष निर्देशांक की तुलना में अधिकतम प्रतिक्रिया दर को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने की अनुमति देती है। इस ग्राफ से एंजाइम निषेध के संबंध में मूल्यवान जानकारी भी निकाली जा सकती है।

माइकलिस-मेंटेन समीकरण को बदलने के अन्य तरीके हैं। एंजाइमी प्रक्रिया पर विभिन्न बाहरी प्रभावों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ग्राफिक निर्भरता का उपयोग किया जाता है।

एंजाइमोलॉजी का यह खंड एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर पर विभिन्न कारकों के प्रभाव का अध्ययन करता है। एक सब्सट्रेट के एक उत्पाद में परिवर्तन की प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया के एंजाइमैटिक कटैलिसीस के सामान्य समीकरण को ध्यान में रखते हुए (1),

एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर को प्रभावित करने वाले मुख्य कारकों का नाम दिया जाना चाहिए: सब्सट्रेट एकाग्रता [एस], एंजाइम एकाग्रता [ई], और प्रतिक्रिया उत्पाद एकाग्रता [पी]।

अपने सब्सट्रेट के साथ कुछ एंजाइमों की बातचीत को सब्सट्रेट [एस] (छवि 1 9) की एकाग्रता पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया दर वी की निर्भरता के हाइपरबॉलिक वक्र द्वारा वर्णित किया जा सकता है:

अंजीर। 19. सब्सट्रेट की एकाग्रता पर एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर की निर्भरता।

इस वक्र पर तीन खंडों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जिसे सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की बातचीत के तंत्र की स्थिति द्वारा समझाया जा सकता है: ओए एंजाइम की सक्रिय साइटों [एस] पर वी की सीधे आनुपातिक निर्भरता का खंड है। एक अस्थिर जटिल ES के गठन के साथ धीरे-धीरे सब्सट्रेट अणुओं से भर जाते हैं; खंड एबी - [एस] पर वी की वक्रता निर्भरता, सब्सट्रेट अणुओं के साथ एंजाइम के सक्रिय केंद्रों की पूर्ण संतृप्ति अभी तक प्राप्त नहीं हुई है। संक्रमण की स्थिति में पहुंचने से पहले ES परिसर अस्थिर है, E और S के लिए वापस पृथक्करण की संभावना अभी भी अधिक है; खंड ईसा पूर्व - निर्भरता एक शून्य-क्रम समीकरण द्वारा वर्णित है, खंड [एस] अक्ष के समानांतर है, सब्सट्रेट अणुओं के साथ सक्रिय एंजाइमों की पूर्ण संतृप्ति प्राप्त की जाती है, वी = वी अधिकतम।

वक्र की विशेषता आकृति को ब्रिग्स-हाल्डेन समीकरण द्वारा गणितीय रूप से वर्णित किया गया है:

वी = वी अधिकतम ● [एस] / किमी + [एस] (2),

जहां किमी माइकलिस-मेंटेन स्थिरांक है, संख्यात्मक रूप से सब्सट्रेट एकाग्रता के बराबर है जिस पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर आधे वी अधिकतम के बराबर है।

एंजाइम का Km जितना कम होता है, सब्सट्रेट के लिए एंजाइम की आत्मीयता उतनी ही अधिक होती है, सब्सट्रेट के लिए संक्रमण की स्थिति उतनी ही तेजी से पहुंचती है, और यह एक प्रतिक्रिया उत्पाद में बदल जाता है। कोशिका में इस एंजाइम की जैविक भूमिका को निर्धारित करने में समूह विशिष्टता के साथ एंजाइम के प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए किमी मूल्यों की खोज महत्वपूर्ण है।

अधिकांश एंजाइमों के लिए, अतिपरवलयिक वक्र बनाना असंभव है (चित्र 19)। इस मामले में, दोहरी पारस्परिक विधि (लाइनविवर-बर्क) का उपयोग किया जाता है, अर्थात। 1/[S] पर 1/[V] की एक ग्राफिकल निर्भरता प्लॉट की गई है (चित्र 20)। एंजाइम की गतिविधि पर विभिन्न प्रकार के अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करते समय एक प्रयोग में ऐसे वक्र बनाने की विधि बहुत सुविधाजनक है (नीचे पाठ देखें)।

चित्र.20. 1/[वी] बनाम 1/[एस] (लाइनवीवर-बर्क विधि) का प्लॉट,

जहां y-कट-ऑफ क्षेत्र - , और x - कट-ऑफ क्षेत्र - , कोण α - की स्पर्शरेखा।

एंजाइमी प्रतिक्रिया दर वी की निर्भरता एंजाइम एकाग्रता [ई] पर।

यह ग्राफिकल निर्भरता (चित्र। 21) को पर्यावरण के इष्टतम तापमान और पीएच पर सब्सट्रेट सांद्रता पर माना जाता है जो एंजाइम की सक्रिय साइटों की संतृप्ति एकाग्रता से काफी अधिक है।

चावल। 21. एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर पर एंजाइम एकाग्रता का प्रभाव।

कोफ़ेक्टर या कोएंजाइम की सांद्रता पर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया दर की निर्भरता।जटिल एंजाइमों के लिए, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि हाइपोविटामिनोसिस में विटामिन के कोएंजाइम रूपों की कमी, शरीर में धातु आयनों के सेवन का उल्लंघन आवश्यक रूप से चयापचय के दौरान आवश्यक एंजाइमों की एकाग्रता में कमी का कारण बनता है। प्रक्रियाएं। इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला जाना चाहिए कि एंजाइम की गतिविधि सीधे कोफ़ेक्टर या कोएंजाइम की एकाग्रता पर निर्भर करती है।

एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर पर उत्पादों की एकाग्रता का प्रभाव।मानव शरीर में होने वाली प्रतिवर्ती प्रतिक्रियाओं के लिए, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया के उत्पादों को एंजाइम द्वारा रिवर्स प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, प्रवाह की दिशा और वी अधिकतम तक पहुंचने का क्षण प्रारंभिक सब्सट्रेट और प्रतिक्रिया उत्पादों की सांद्रता के अनुपात पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एलेनिन एमिनोट्रांस्फरेज़ की गतिविधि, जो परिवर्तन को उत्प्रेरित करती है:

ऐलेनिन + अल्फा-कीटोग्लूटारेट पाइरूवेट + ग्लूटामेट

सेल में सांद्रता के अनुपात पर निर्भर करता है:

[अलैनिन + अल्फा-कीटोग्लूटारेट] / [पाइरूवेट + ग्लूटामेट]।

एंजाइम क्रिया का तंत्र। एंजाइमी उत्प्रेरक के सिद्धांत

एंजाइम, गैर-प्रोटीन उत्प्रेरक की तरह, उस प्रतिक्रिया की सक्रियता ऊर्जा को कम करने की उनकी क्षमता के कारण रासायनिक प्रतिक्रिया की दर में वृद्धि करते हैं। एक एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया की सक्रियता ऊर्जा की गणना चल रही प्रतिक्रिया की प्रणाली में ऊर्जा मूल्य के बीच अंतर के रूप में की जाती है जो संक्रमण की स्थिति में पहुंच गई है और प्रतिक्रिया की शुरुआत में निर्धारित ऊर्जा (चित्र 22 में चित्रमय निर्भरता देखें)।

चावल। 22. एक एंजाइम (1) के बिना रासायनिक प्रतिक्रिया की ऊर्जा अवस्था की चित्रमय निर्भरता और प्रतिक्रिया के समय एक एंजाइम (2) की उपस्थिति में।

वी। हेनरी और, विशेष रूप से, एल। माइकलिस, एम। मेंटेन के कार्यों ने मोनोसुबस्ट्रेट प्रतिवर्ती एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के तंत्र के अध्ययन पर यह पोस्ट करना संभव बना दिया कि एंजाइम ई पहले प्रतिवर्ती रूप से और अपेक्षाकृत जल्दी से अपने सब्सट्रेट एस के साथ मिलकर बनता है। एक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स (ES):

ई+एस<=>ईएस (1)

ES का निर्माण हाइड्रोजन बांड, इलेक्ट्रोस्टैटिक, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के कारण होता है, कुछ मामलों में सहसंयोजक, सक्रिय केंद्र के अमीनो एसिड अवशेषों के साइड रेडिकल्स और सब्सट्रेट के कार्यात्मक समूहों के बीच समन्वय बंधन। जटिल एंजाइमों में, संरचना का गैर-प्रोटीन हिस्सा सब्सट्रेट के साथ संपर्क का कार्य भी कर सकता है।

एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स तब प्रतिक्रिया उत्पाद पी और मुक्त एंजाइम ई बनाने के लिए दूसरी धीमी प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया में टूट जाता है:

तों<=>ईपी<=>ई + पी (2)

वर्तमान में, उपर्युक्त वैज्ञानिकों के काम के लिए धन्यवाद, साथ ही कायलिन डी।, चांस बी।, कोशलैंड डी। ("प्रेरित अनुरूपता" का सिद्धांत), के तंत्र में चार मुख्य बिंदुओं पर सैद्धांतिक प्रावधान हैं। सब्सट्रेट पर एंजाइम क्रिया, जो रासायनिक प्रतिक्रियाओं को तेज करने के लिए एंजाइमों की क्षमता निर्धारित करती है।

1. अभिविन्यास और निकटता . एंजाइम सब्सट्रेट अणु को इस तरह से बांधने में सक्षम है कि एंजाइम द्वारा हमला किया गया बंधन न केवल उत्प्रेरक समूह के तत्काल आसपास के क्षेत्र में स्थित है, बल्कि इसके संबंध में सही ढंग से उन्मुख भी है। अभिविन्यास और दृष्टिकोण के कारण ES परिसर संक्रमण की स्थिति में पहुंचने की संभावना बहुत बढ़ जाती है।

2. दबाव और तनाव : प्रेरित फिट। सब्सट्रेट का लगाव एंजाइम अणु में गठनात्मक परिवर्तन का कारण बन सकता है, जो सक्रिय साइट की संरचना में तनाव पैदा करता है, साथ ही साथ बाध्य सब्सट्रेट को कुछ हद तक विकृत करता है, जिससे ईएस कॉम्प्लेक्स द्वारा संक्रमण राज्य की उपलब्धि की सुविधा मिलती है। ई और एस अणुओं के बीच एक तथाकथित प्रेरित पत्राचार है।

पाठ्यक्रम कार्य

एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स

परिचय

किसी भी जीव के जीवन का आधार रासायनिक प्रक्रियाएं होती हैं। एक जीवित जीव में लगभग सभी प्रतिक्रियाएं प्राकृतिक जैव उत्प्रेरक - एंजाइमों की भागीदारी के साथ आगे बढ़ती हैं।

1835 में बर्ज़ेलियस ने पहली बार सुझाव दिया कि एक जीवित जीव की प्रतिक्रियाएं एक नई शक्ति के कारण होती हैं, जिसे उन्होंने "उत्प्रेरक" कहा। उन्होंने मुख्य रूप से प्रायोगिक अवलोकन द्वारा इस विचार की पुष्टि की: आलू से डायस्टेस सल्फ्यूरिक एसिड की तुलना में स्टार्च को तेजी से हाइड्रोलाइज करता है। 1878 की शुरुआत में, कुहने ने एक ऐसे पदार्थ का नाम दिया जिसमें एक जीवित जीव में उत्प्रेरक शक्ति होती है, एक एंजाइम।

एंजाइम क्रिया का कैनेटीक्स एंजाइम विज्ञान की एक शाखा है जो रासायनिक प्रकृति पर एंजाइम द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की दर की निर्भरता और एंजाइम के साथ सब्सट्रेट की बातचीत की स्थितियों के साथ-साथ पर्यावरणीय कारकों पर निर्भरता का अध्ययन करती है। दूसरे शब्दों में, एंजाइमों के कैनेटीक्स एंजाइमेटिक कटैलिसीस की दर को प्रभावित करने वाले कारकों की कार्रवाई के आणविक तंत्र की प्रकृति को समझना संभव बनाता है। इस खंड का गठन जैव रसायन, भौतिकी और गणित जैसे विज्ञानों के प्रतिच्छेदन पर किया गया था। एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का गणितीय रूप से वर्णन करने का सबसे पहला प्रयास 1898 में डुक्लोस द्वारा किया गया था।

वास्तव में, एंजाइमों के अध्ययन पर यह खंड हमारे समय में व्यावहारिक चिकित्सा के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यह फार्माकोलॉजिस्ट को सेल चयापचय को बदलने के लिए एक उपकरण देता है, बड़ी संख्या में फार्मास्यूटिकल्स और विभिन्न जहर - ये एंजाइम अवरोधक हैं।

इस कार्य का उद्देश्य विभिन्न कारकों पर प्रतिक्रिया दर की निर्भरता के प्रश्न पर विचार करना है कि प्रतिक्रिया दर को कैसे नियंत्रित किया जा सकता है और इसे कैसे निर्धारित किया जा सकता है।

1. माइकलिस-मेंटेन कैनेटीक्स

एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स के अध्ययन पर प्रारंभिक प्रयोगों से पता चला है कि प्रतिक्रिया दर, सैद्धांतिक अपेक्षाओं के विपरीत, एंजाइम (ई) और सब्सट्रेट (एस) की एकाग्रता पर उसी तरह निर्भर नहीं करती है जैसे पारंपरिक के मामले में दूसरे क्रम की प्रतिक्रिया।

ब्राउन और, स्वतंत्र रूप से, हेनरी प्रतिक्रिया के दौरान एक एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर के गठन के बारे में एक परिकल्पना को सामने रखने वाले पहले व्यक्ति थे। तब इस धारणा की पुष्टि तीन प्रायोगिक तथ्यों से हुई:

ए) पपैन ने फाइब्रिन के साथ एक अघुलनशील यौगिक बनाया (वर्ट्ज़, 1880);

बी) इनवर्टेज सब्सट्रेट सुक्रोज थर्मल विकृतीकरण से एंजाइम की रक्षा कर सकता है (ओ'सुलिवन और थॉम्पसन, 1890);

ग) एंजाइमों को स्टिरियोकेमिकली विशिष्ट उत्प्रेरक के रूप में दिखाया गया है (फिशर, 1898-1899)।

उन्होंने अधिकतम गति की अवधारणा पेश की और दिखाया कि संतृप्ति वक्र(यानी, सब्सट्रेट की एकाग्रता पर प्रतिक्रिया दर की निर्भरता) एक समद्विबाहु अतिपरवलय है। उन्होंने साबित कर दिया कि अधिकतम प्रेक्षित गति वक्र के स्पर्शोन्मुख में से एक है, और खंड दूसरे स्पर्शोन्मुख द्वारा एब्सिसा अक्ष (इसके नकारात्मक मूल्यों के क्षेत्र में) को काट देता है, अर्थात। दर समीकरण में स्थिर, अधिकतम दर का आधा प्राप्त करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट एकाग्रता के पूर्ण मूल्य के बराबर।

माइकलिस और मेंटेन ने सुझाव दिया कि प्रतिक्रिया दर ES परिसर के टूटने से निर्धारित होती है, अर्थात। निरंतर कश्मीर 2 . यह केवल तभी संभव है जब k 2 दर स्थिरांक में सबसे छोटा है। इस मामले में, एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स, मुक्त एंजाइम और सब्सट्रेट के बीच संतुलन प्रतिक्रिया की दर (तेजी से संतुलन) की तुलना में जल्दी से स्थापित होता है।

प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर निम्न सूत्र द्वारा व्यक्त की जा सकती है:

वी = के2

चूंकि एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का पृथक्करण स्थिरांक है

के एस \u003d [ई] [एस] / \u003d के -1 / के 1

तब मुक्त एंजाइम की सांद्रता को इस प्रकार व्यक्त किया जा सकता है

[ई] = के एस / [एस]

प्रतिक्रिया मिश्रण में एंजाइम की कुल सांद्रता सूत्र द्वारा निर्धारित की जाती है

[ई] टी = [ई] + [ईएस] = के एस [ईएस] / [एस] + [ईएस]

प्रतिक्रिया अपनी अधिकतम दर तक पहुँचती है जब सब्सट्रेट की सांद्रता इतनी अधिक होती है कि सभी एंजाइम अणु एक ES कॉम्प्लेक्स (सब्सट्रेट की असीम रूप से बड़ी अतिरिक्त) के रूप में होते हैं। सैद्धांतिक रूप से संभव अधिकतम गति के लिए प्रारंभिक गति का अनुपात [ES] से [E] t के अनुपात के बराबर है:

वी / वी अधिकतम = / [ई] टी = / (के एस / [एस] +) = 1 / (के एस + [एस] +1)

यह क्लासिक समीकरण है Michaelisऔर मेंटेन,जो, 1913 में अपने प्रकाशन के बाद से, दशकों से सभी एंजाइम गतिज अध्ययनों का मूल सिद्धांत रहा है, और, कुछ सीमाओं के साथ, आज भी ऐसा ही बना हुआ है।

बाद में यह दिखाया गया कि मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण में कई बाधाएं थीं। यह उचित है, अर्थात्। इस एंजाइम द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की गतिकी का सही वर्णन केवल तभी होता है जब निम्नलिखित सभी प्रतिबंधात्मक शर्तें पूरी होती हैं:

) एक काइनेटिक रूप से स्थिर एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स बनता है;

) निरंतर के एस एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर का पृथक्करण स्थिरांक है: यह तभी सत्य है जब ;

) प्रतिक्रिया के दौरान सब्सट्रेट एकाग्रता नहीं बदलता है, अर्थात। मुक्त सब्सट्रेट की एकाग्रता इसकी प्रारंभिक एकाग्रता के बराबर है;

) प्रतिक्रिया उत्पाद तेजी से एंजाइम से अलग हो जाता है, अर्थात। ES कॉम्प्लेक्स की कोई काइनेटिक रूप से महत्वपूर्ण मात्रा नहीं बनती है;

) प्रतिक्रिया का दूसरा चरण अपरिवर्तनीय है; अधिक सटीक रूप से, हम केवल प्रारंभिक गति को ध्यान में रखते हैं, जब पिछली प्रतिक्रिया (उत्पाद की वास्तविक कमी के कारण) को अभी भी उपेक्षित किया जा सकता है;

) केवल एक सब्सट्रेट अणु एंजाइम की प्रत्येक सक्रिय साइट से बांधता है;

) सभी अभिकारकों के लिए, गतिविधियों के बजाय उनकी सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है।

माइकलिस-मेंटेन समीकरण एंजाइमों की क्रिया के किसी भी मात्रात्मक विवरण के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है। इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि अधिकांश एंजाइमों का गतिज व्यवहार माइकलिस-मेंटेन समीकरण में अंतर्निहित आदर्श योजना की तुलना में बहुत अधिक जटिल है। इस समीकरण को प्राप्त करने में, यह माना जाता है कि केवल एक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स है। इस बीच, वास्तव में, अधिकांश एंजाइमी प्रतिक्रियाओं में, कम से कम दो या तीन ऐसे कॉम्प्लेक्स बनते हैं, जो एक निश्चित क्रम में उत्पन्न होते हैं।

यहाँ, EZ वास्तविक संक्रमण अवस्था के अनुरूप जटिल को दर्शाता है, और EP एंजाइम और प्रतिक्रिया उत्पाद के बीच के परिसर को दर्शाता है। यह भी बताया जा सकता है कि अधिकांश एंजाइमी प्रतिक्रियाओं में एक से अधिक सब्सट्रेट शामिल होते हैं और क्रमशः दो या दो से अधिक उत्पाद बनते हैं। दो सब्सट्रेट, एस 1 और एस 2 के साथ प्रतिक्रिया में, तीन एंजाइम-सब्सट्रेट परिसरों का निर्माण किया जा सकता है, अर्थात् ईएस 1, ईएस 2 और ईएस 1 एस 2। यदि प्रतिक्रिया दो उत्पादों, पी 1 और पी 2 का उत्पादन करती है, तो कम से कम तीन अतिरिक्त कॉम्प्लेक्स ईपी 1 , ईपी 2 और ईपी 1 पी 2 हो सकते हैं। ऐसी प्रतिक्रियाओं में, कई मध्यवर्ती चरण होते हैं, जिनमें से प्रत्येक की अपनी दर स्थिरांक की विशेषता होती है। दो या दो से अधिक अभिकारकों वाली एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का गतिज विश्लेषण अक्सर अत्यंत जटिल होता है और इसके लिए इलेक्ट्रॉनिक कंप्यूटरों के उपयोग की आवश्यकता होती है। हालांकि, सभी एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स का विश्लेषण करते समय, शुरुआती बिंदु हमेशा ऊपर चर्चा की गई माइकलिस-मेन्टेन समीकरण होता है।

1.1 स्थिरांक की प्रकृतिकसमीकरण में

समीकरण एंजाइमेटिक रिएक्शन कैनेटीक्स

दूसरी अभिधारणा में कहा गया है कि स्थिर K S समीकरण में एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर का पृथक्करण स्थिरांक है।

ब्रिग्स और हाल्डेन ने 1925 में साबित किया कि मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण केवल के लिए मान्य है, अर्थात। जब प्रारंभिक चरण E+S ES का संतुलन अगले चरण की दर की तुलना में बहुत जल्दी स्थापित हो जाता है। इसलिए, इस तरह के गतिज तंत्र (माइकलिस-मेंटेन की प्रारंभिक स्थिति का पालन करना और एक धीमी प्रारंभिक अवस्था होना, जिसके संबंध में अन्य सभी प्रारंभिक चरणों में संतुलन जल्दी से स्थापित हो जाता है) को "तेज संतुलन" की धारणा को संतुष्ट करना कहा जाता है। यदि, हालांकि, k 2 परिमाण के क्रम में k -1 . के बराबर है , समय के साथ एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता में परिवर्तन को निम्नलिखित अंतर समीकरण द्वारा व्यक्त किया जा सकता है:

डी / डीटी \u003d के 1 [ई] [एस] - के -1 - के 2

चूंकि हम प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर पर विचार कर रहे हैं, अर्थात। वह क्षण जब रिवर्स रिएक्शन अभी तक नहीं हुआ है, और पूर्व-स्थिर चरण पहले ही बीत चुका है, तो सब्सट्रेट की अधिकता के कारण, गठित एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की मात्रा विघटित की मात्रा के बराबर होती है (स्थिरता सिद्धांत, या ब्रिग्स और हाल्डेन के कैनेटीक्स, या रासायनिक कैनेटीक्स में बोडेनस्टीन सिद्धांत) और यह सच है कि

डी/डीटी = 0

इसे अवकल समीकरण में प्रतिस्थापित करते हुए, हम मुक्त एंजाइम की सांद्रता के लिए एक व्यंजक प्राप्त करते हैं:

[ई] \u003d (के -1 + के 2) / के 1 [एस]

[ई] टी = [ई] + = [(के -1 + के 2) / के -1 [एस] + 1] =

= (के -1 + के 2 + के -1 [एस]) / के 1 [एस]

स्थिर अवस्था समीकरण:

के 1 [एस] [ई] टी / (के -1 + के 2 + के 1 [एस])

क्योंकि v = k 2 , तो हम पाते हैं कि

वी = के 1 के 2 [एस] [ई] टी / (के -1 + के 2 + के 1 [एस]) = के 2 [एस] [ई] टी / [(के -1 + के 2) / के 1 + [एस]]

इस मामले में

वी अधिकतम = के 2 [ई] टी

और माइकलिस-मेंटेन समीकरण से प्राप्त अधिकतम गति के बराबर है। हालांकि, माइकलिस-मेंटेन समीकरण के हर में स्थिरांक K S . नहीं है , वे। एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का पृथक्करण स्थिरांक नहीं, बल्कि तथाकथित माइकलिस स्थिरांक:

के एम \u003d (के -1 + के 2) / के 1

K m केवल K S के बराबर है यदि ।

मामले में, वेग समीकरण के हर में स्थिरांक को सूत्र द्वारा व्यक्त किया जाता है

के के \u003d के 2 / के 1

और वैन स्लीके के अनुसार कहा जाता है, गतिज स्थिरांक।

स्थिर अवस्था समीकरण भी अवकल समीकरण से इस धारणा के बिना प्राप्त किया जा सकता है कि d / dt = 0. यदि हम मान [E] = [E] T - को अवकल समीकरण में प्रतिस्थापित करते हैं, तो परिवर्तन के बाद हम प्राप्त करते हैं

= (के 1 [एस] [ई] टी - डी / डीटी) / (के 1 [एस] + के -1 + के 2)

इस समीकरण से स्थिर अवस्था समीकरण प्राप्त करने के लिए, यह d / dt = 0 होना आवश्यक नहीं है। यह पर्याप्त है कि असमानता d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

विभेदित स्थिर अवस्था समीकरण इस तरह दिखता है:

डी / डीटी \u003d टी / (के 1 [एस] + के -1 + के 2) 2] (डी [एस] / डीटी)

यह अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से 0 के बराबर नहीं है।

1.2 माइकलिस-मेंटेन समीकरण का परिवर्तन

मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण एक अतिपरवलयिक समीकरण है, जहां एक स्थिरांक (V अधिकतम) वक्र का स्पर्शोन्मुख है। एक और स्थिरांक (K m), जिसका ऋणात्मक मान दूसरे स्पर्शोन्मुख द्वारा निर्धारित किया जाता है, V अधिकतम / 2 प्राप्त करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट एकाग्रता के बराबर है। यह सत्यापित करना आसान है, क्योंकि यदि

वी = वीमैक्स / 2, फिर

वीमैक्स / 2 = वीमैक्स [एस] / (किमी + [एस])

वी अधिकतम / वी अधिकतम = 1 = 2 [एस] / (के एम + [एस]) एम + [एस] = 2 [एस], यानी। [एस] = वी के लिए के एम = वी अधिकतम / 2।

माइकलिस-मेंटेन समीकरण को बीजगणितीय रूप से अन्य रूपों में परिवर्तित किया जा सकता है जो प्रयोगात्मक डेटा के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए अधिक सुविधाजनक हैं। सबसे आम परिवर्तनों में से एक बस समीकरण के बाएँ और दाएँ पक्षों के व्युत्क्रमों की बराबरी करना है

परिवर्तन के परिणामस्वरूप, हम अभिव्यक्ति प्राप्त करते हैं

जिसका नाम है लाइनविवर-बर्क समीकरण. इस समीकरण के अनुसार, निर्देशांक 1/[S] और 1/v में प्लॉट किया गया एक ग्राफ एक सीधी रेखा है, जिसका ढलान K m /V अधिकतम के बराबर है, और y-अक्ष पर कटा हुआ खंड बराबर है 1 / वी अधिकतम करने के लिए। इस तरह के दोहरे पारस्परिक ग्राफ का यह लाभ है कि यह V अधिकतम को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करना संभव बनाता है; [एस] और वी निर्देशांक में प्लॉट किए गए वक्र पर, वी मैक्स एक एसिम्प्टोटिक मात्रा है और इसे बहुत कम सटीक रूप से निर्धारित किया जाता है। लाइनविवर-बर्क प्लॉट पर x-अक्ष पर कटा हुआ खंड -1/K m के बराबर है। इस ग्राफ से एंजाइम निषेध के संबंध में मूल्यवान जानकारी भी निकाली जा सकती है।

माइकलिस-मेंटेन समीकरण का एक और परिवर्तन यह है कि लाइनविवर-बर्क समीकरण के दोनों पक्षों को वी मैक्स * वी से गुणा किया जाता है और कुछ अतिरिक्त परिवर्तनों के बाद हमें मिलता है

v और v/[S] निर्देशांकों में संगत प्लॉट के साथ निरूपित करता है ई 4, अंजीर। एक]. ऐसा ग्राफ ( एडी-होफ्स्टी चार्ट) न केवल वी मैक्स और के एम के मूल्यों को निर्धारित करना बहुत आसान बनाता है, बल्कि आपको रैखिकता से संभावित विचलन की पहचान करने की भी अनुमति देता है जो लाइनविवर-बर्क प्लॉट पर नहीं पाए जाते हैं।

समीकरण को दूसरे रूप में भी रैखिक किया जा सकता है

[एस] / वी = के एम / वी अधिकतम + [एस] / वी अधिकतम

इस मामले में, [एस] पर निर्भरता [एस] / वी का निर्माण किया जाना चाहिए। परिणामी सीधी रेखा का ढलान 1 / V अधिकतम है; कोर्डिनेट और एब्सिस्सा कुल्हाड़ियों पर कटे हुए खंड क्रमशः (के एम / वी मैक्स) और (- के एम) के बराबर हैं। इस चार्ट का नाम लेखक के नाम पर रखा गया है हेन्स चार्ट.

सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि एडी-होफ्स्टी और हेन्स विधियाँ लाइनविवर-बर्क पद्धति की तुलना में अधिक सटीक परिणाम देती हैं। इसका कारण यह है कि एडी - हॉफस्टी और हेन्स के रेखांकन में, आश्रित और स्वतंत्र चर दोनों समन्वय अक्षों पर अंकित मूल्यों में शामिल हैं।

1.3 प्रतिक्रिया कैनेटीक्स पर सब्सट्रेट एकाग्रता का प्रभाव

कई मामलों में, निरंतर सब्सट्रेट एकाग्रता की स्थिति संतुष्ट नहीं होती है। एक ओर, सब्सट्रेट की एंजाइमेटिक गतिविधि के अक्सर होने वाले अवरोध के कारण कुछ एंजाइमों के साथ इन विट्रो प्रतिक्रिया में सब्सट्रेट की अधिकता का उपयोग नहीं किया जाता है। इस मामले में, केवल इसकी इष्टतम एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है, और यह हमेशा ऊपर वर्णित तंत्र के गतिज समीकरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की अधिकता प्रदान नहीं करता है। इसके अलावा, विवो में सेल में, इस स्थिति को पूरा करने के लिए आवश्यक सब्सट्रेट की अधिकता आमतौर पर हासिल नहीं की जाती है।

एंजाइमी प्रतिक्रियाओं में जहां सब्सट्रेट अधिक नहीं होता है और इसलिए, प्रतिक्रिया के दौरान इसकी एकाग्रता में परिवर्तन होता है, एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का पृथक्करण स्थिरांक होता है

के एस = ([एस] 0 - - [पी]) [ई] टी -)/

([एस] 0 - टी = 0 पर सब्सट्रेट एकाग्रता)। इस मामले में, प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर (स्थिर अवस्था में) द्वारा दी जाती है

वी = वी अधिकतम / (के एम +)

एक समय में सब्सट्रेट की एकाग्रता कहां है।

हालांकि, दो मामलों के लिए अनुमानित समाधान लिखना संभव है जहां [एस] ओ =:

) यदि यह असमानता टी के बड़े मूल्यों के कारण संतुष्ट है, अर्थात। जब प्रतिक्रिया के दौरान सब्सट्रेट की प्रारंभिक एकाग्रता का 5% से अधिक उपभोग किया गया था;

) यदि सब्सट्रेट की एकाग्रता की तुलना में एंजाइम की एकाग्रता की उपेक्षा नहीं की जा सकती है और इस प्रकार एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

यदि t बड़ा है, और [S] 0 की तुलना में सांद्रता नगण्य है, तो एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण स्थिरांक के लिए समीकरण निम्न हो जाता है:

के एस = ([एस] 0 - [पी]) ([ई] टी -) /

एकाग्रता के मूल्य के लिए, जो प्रतिक्रिया के दौरान बदलता है, मान ([एस] 0 +)/2 एक संतोषजनक सन्निकटन के रूप में कार्य करता है। चूंकि = [एस] 0 - [पी], औसत गति; के रूप में व्यक्त किया जा सकता है

इस व्यंजक और सन्निकट मान को में प्रतिस्थापित करना

वी = वी अधिकतम / (के एम +),

हम पाते हैं:

सटीक, एकीकृत माइकलिस-मेंटेन समीकरण से प्राप्त मूल्यों के साथ इस सन्निकटन के आधार पर गणना किए गए मूल्यों की तुलना करते समय, यह पता चलता है कि के एम निर्धारित करने में त्रुटि सब्सट्रेट का क्रमशः 30 और 50% खर्च करते समय 1 और 4% है। इसलिए, माप त्रुटि की तुलना में इस सन्निकटन में त्रुटि नगण्य है।

जब सब्सट्रेट की खपत प्रारंभिक एकाग्रता के 5% से अधिक नहीं होती है, लेकिन एंजाइम की एकाग्रता इतनी अधिक होती है कि इसे [एस] 0 की तुलना में नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है, एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स का पृथक्करण स्थिरांक बराबर है:

के एस = ([एस] 0 -) ([ई] टी -) /

उसके समाधान के बारे में देता है

दो संभावित समाधानों में से, केवल नकारात्मक को चुना जा सकता है, क्योंकि केवल यह प्रारंभिक शर्तों को पूरा करता है: = 0 [एस] 0 = 0 या [ई] टी = 0 पर। अनुपात v/V के समीकरण के अनुरूप द्वारा अधिकतम, हमने प्रारंभिक वेग समीकरण प्राप्त किया है। एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण स्थिरांक के समीकरण से प्राप्त द्विघात समीकरण, थोड़ा अधिक पाया गया, सूत्र v \u003d k 2 और V अधिकतम \u003d k 2 [E] T का उपयोग करके, निम्न रूप में घटाया जा सकता है :

[एस] 0 वी अधिकतम / वी = के एस वी अधिकतम / (वी अधिकतम - वी) + [ई] टी

दो सीमित मामलों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। पहले मामले में [एस]<

वी = (वीमैक्स / किमी) [एस] = के [एस]

इस प्रकार, हमने प्रत्यक्ष प्रथम कोटि की अभिक्रिया प्राप्त की है और k=V max /K m - प्रत्यक्ष प्रथम कोटि गतिज स्थिरांक प्राप्त किया है। इसका वास्तविक आयाम समय -1 है, लेकिन यह कई प्रारंभिक चरणों के पहले और दूसरे क्रम दर स्थिरांक का संयोजन है, अर्थात। के 1 के 2 [ई] टी / (के -1 + के 2) . स्पष्ट प्रथम आदेश k . की शर्तों के तहत प्रतिक्रिया की प्रगति का एक उपाय है।

एक और सीमित मामला: [एस] >> के एम। यहाँ स्थिर K m [एस] की तुलना में नगण्य है, और इस प्रकार हमें वी = वी मैक्स मिलता है।

1.4 काइनेटिक रूप से स्थिर एंजाइम-उत्पाद परिसर का निर्माण

यदि प्रतिक्रिया के दौरान गतिज रूप से स्थिर एंजाइम-उत्पाद परिसर बनता है, तो प्रतिक्रिया तंत्र इस प्रकार है:

स्थिर अवस्था की धारणा को लागू करते हुए, हम अवकल समीकरण लिख सकते हैं:

डी / डीटी = के 1 [ई] [एस] + के -2 - (के -1 + के 2) = 0 / डीटी = के 2 - (के -2 + के 3) = 0

इन समीकरणों से यह इस प्रकार है कि

= [(के -2 + के 3) / के 2]

[ई] = [(के -1 के -2 + के -1 के -3 + के 2 के 3) / के 1 के 2 [एस]]

चूंकि वी = के 3

और [ई] टी = [ई] + + =

= [(के -1 के -2 + के -1 के -3 + के 2 के 3) / के 1 के 2 [एस] + (के -2 + के 3) / के 2 + 1] =

= ((के -2 + के 3) + के 1 के 2 [एस]] / के 1 के 2 [एस])

हम पाते हैं

के 1 के 2 [एस] [ई] टी / (के -2 + के 3 + के 2)] = के 1 के 2 के 3 [एस] [ई] टी / (के -2 + के 3 + के 2) ]=

= [ई] टी [एस] / [(के -1 के -2 + के -1 के -3 + के 2 के 3) / के 1 (के -2 + के 3 + के 2) + [एस]]

अर्थात

वी अधिकतम \u003d [ई] टीएम \u003d (के -1 के -2 + के -1 के -3 + के 2 के 3) / के 1 (के -2 + के 3 + के 2)

इस मामले में, व्यक्तिगत दर स्थिरांक के विशिष्ट मूल्यों की गणना करना पहले से ही बहुत मुश्किल है, क्योंकि केवल उनके अनुपात को सीधे मापा जा सकता है। स्थिति और भी जटिल हो जाती है जब एंजाइमी प्रतिक्रिया का तंत्र अधिक जटिल हो जाता है, जब प्रतिक्रिया में दो से अधिक कॉम्प्लेक्स शामिल होते हैं, क्योंकि समीकरण में दर स्थिरांक की संख्या, निश्चित रूप से बहुत अधिक होती है, और उनके अनुपात भी होते हैं अधिक जटिल।

हालाँकि, स्थिति को सरल बनाया जाता है, यदि पहले कॉम्प्लेक्स के गठन की प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया के बाद, बाद के प्राथमिक चरण अपरिवर्तनीय हैं। इस तंत्र का पालन करने वाले एंजाइमों के महत्वपूर्ण प्रतिनिधि प्रोटीयोलाइटिक एंजाइम और एस्टरेज़ हैं। उनकी प्रतिक्रिया तंत्र को निम्नानुसार लिखा जा सकता है:

जहां ES` एक एसाइल-एंजाइम मध्यवर्ती है जो पानी के संपर्क में आने पर विघटित हो जाता है। हम लिख सकते हैं

वी अधिकतम \u003d के 2 के 3 [ई] 0 / (के 2 + के 3) \u003d के बिल्ली [ई] 0 एम \u003d के 3 (के -1 + के 2) / (के 2 + के 3) के 1 बिल्ली / के एम \u003d के 2 के 1 / (के -1 + के 2) \u003d के 2 / के एम '

एसाइलेशन चरण का माइकलिस स्थिरांक K m "K s है। k बिल्ली / K m का अनुपात जितना अधिक होगा, सब्सट्रेट की विशिष्टता उतनी ही अधिक होगी।

यदि पानी के साथ प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम न्यूक्लियोफिलिक एजेंट (एन) की उपस्थिति में प्रयोग किया जाता है तो स्थिरांक का निर्धारण बहुत सरल होता है। फिर

k 3 \u003d k 3 ' और P i (i \u003d 1, 2, 3) उत्पाद हैं।

वी आई = के बिल्ली, मैं [एस] / (के एम + [एस]) बिल्ली, 1 = के 2 (के 3 + के 4 [एन]) / (के 2 + के 3 + के 4 [एन]) बिल्ली, 2 = के 2 के 3 / (के 2 + के 3 + के 4 [एन]) बिल्ली, 3 = के 2 के 4 [एन] / (के 2 + के 3 + के 4 [एन]) एम = के एस ( के 3 + के 4 [एन]) / (के 2 + के 3 + के 4 [एन])

/ वी एन = के एस (के 3 + के 4 [एन]) / के 2 के 3 [एस] + (के 2 + के 3 + के 4 [एन]) / के 2 के 3

चूंकि यह ज्ञात है कि के एस / के 2 = के एम / के बिल्ली, और यदि न्यूक्लियोफाइल अनुपस्थित है, तो

1/वी = के एस / के 2 [एस] + (के 2 + के 3) / के 2 के 3

और स्थिरांक निर्धारित करने के लिए, आप निर्देशांक 1/v N (और 1/v) - 1/[S] में रेखाओं के प्रतिच्छेदन बिंदु का उपयोग कर सकते हैं। दोहरे व्युत्क्रम निर्देशांक में दो सीधी रेखाएं दूसरे चतुर्थांश में प्रतिच्छेद करती हैं। न्यूक्लियोफाइल की अनुपस्थिति में, ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ रेखा के प्रतिच्छेदन बिंदु को 1/V अधिकतम और 1/k बिल्ली के रूप में परिभाषित किया गया है, और क्षैतिज अक्ष -1/K मीटर के रूप में परिभाषित किया गया है। दो रेखाओं के प्रतिच्छेदन बिंदु के निर्देशांक: -1/K s और 1/k 3 । 1/वी अधिकतम और 1/के 3 के बीच की दूरी 1/के 2 है।

1.5 पूर्ण प्रतिक्रिया गतिज वक्र का विश्लेषण

माइकलिस - मेंटेन समीकरण अपने मूल रूप में केवल अपरिवर्तनीय प्रतिक्रियाओं को संदर्भित करता है, अर्थात। प्रतिक्रियाओं के लिए जहां केवल प्रारंभिक दर पर विचार किया जाता है, और उत्पाद की अपर्याप्त मात्रा के कारण रिवर्स प्रतिक्रिया प्रकट नहीं होती है और प्रतिक्रिया दर को प्रभावित नहीं करती है। एक अपरिवर्तनीय प्रतिक्रिया के मामले में, पूर्ण गतिज वक्र का आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है (मनमाने समय अंतराल के लिए t ), मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण को एकीकृत करना। इस मामले में, इसलिए, यह धारणा बनी हुई है कि प्रतिक्रिया के दौरान केवल एक मध्यवर्ती एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स बनता है। चूँकि समय अंतराल t . के लिए कोई प्रतिबंध नहीं हैं, विश्लेषण के समय सब्सट्रेट की एकाग्रता शुरू में शुरू की गई एकाग्रता के बराबर नहीं हो सकती है। इस प्रकार, प्रतिक्रिया के दौरान [एस] में परिवर्तन को भी ध्यान में रखना आवश्यक है। मान लें कि S 0 सब्सट्रेट की प्रारंभिक सांद्रता है, (S 0 - y .) ) - समय पर एकाग्रता . फिर, मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण के आधार पर (यदि y परिवर्तित सब्सट्रेट की मात्रा है), हम लिख सकते हैं

डाई / डीटी \u003d वी अधिकतम (एस 0 - वाई) / (के एम + एस 0 - वाई)

व्युत्क्रम लेते हुए और चर को विभाजित करते हुए, हम y . पर एकीकृत करते हैं 0 और y . के बीच (वी अधिकतम के रूप में दर्शाया गया है वी):

(2.303 / टी) एलजी = वी / के एम - (1 / के एम) (वाई / टी)

इस प्रकार, y / t (फोस्टर-नीमैन निर्देशांक) पर समीकरण के बाईं ओर निर्भरता की साजिश रचने के बाद , ढलान के साथ एक सीधी रेखा प्राप्त करें (-1/K m) , y-अक्ष पर कटऑफ खंड (V/K m) , और भुज अक्ष पर - खंड V। अभिन्न समीकरण को एक अलग तरीके से भी रैखिक किया जा सकता है:

टी / 2.3031 एलजी = वाई / 2.303 वी एलजी + के एम / वी

या टी/वाई = 2.3031 के एम एलजी / वी वाई +1/वी

यदि हम एक प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया का अध्ययन कर रहे हैं, तो यह ध्यान देना आवश्यक है कि हम किस समय अंतराल से निपट रहे हैं। सब्सट्रेट के साथ एंजाइम के मिश्रण के समय, तथाकथित पूर्व-स्थिर चरण शुरू होता है, जो कई माइक्रो- या मिलीसेकंड तक रहता है, जिसके दौरान स्थिर अवस्था के अनुरूप एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स बनते हैं। पर्याप्त लंबे समय के अंतराल पर प्रतिवर्ती प्रतिक्रियाओं के अध्ययन में, यह चरण महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाता है, क्योंकि इस चरण में प्रतिक्रिया किसी भी दिशा में पूर्ण गति से आगे नहीं बढ़ती है।

बाएं से दाएं जाने वाली प्रतिक्रिया के लिए, प्रतिक्रिया में शामिल एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स केवल प्रीस्टेशनरी चरण के अंत में दर-सीमित एकाग्रता तक पहुंचते हैं। अर्ध-स्थिर अवस्था, जिसमें दर-निर्धारण एंजाइम-सब्सट्रेट परिसरों की सांद्रता स्थिर अवस्था में सांद्रता के अधिकतम मूल्यों तक पहुँचती है, एक सेकंड या एक सेकंड के कुछ दसवें हिस्से तक रहती है। इस चरण के दौरान, उत्पाद निर्माण (या सब्सट्रेट खपत) की दर समय में लगभग रैखिक होती है। सैद्धांतिक रूप से, उत्पाद का गठन अभी तक यहां नहीं हुआ है, लेकिन व्यवहार में इसकी एकाग्रता इतनी कम है कि रिवर्स प्रतिक्रिया की दर प्रत्यक्ष की दर को प्रभावित नहीं करती है। इस रैखिक चरण को प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर कहा जाता है, और अभी तक हमने इसे केवल ध्यान में रखा है।

उत्पाद की सांद्रता में क्रमिक वृद्धि के कारण अगले चरण में दाएं से बाएं की प्रतिक्रिया भी तेज हो जाती है। (संक्रमण की स्थिति;समय में अब तक देखी गई रैखिकता गायब हो जाती है)। यह चरण तब तक जारी रहता है जब तक कि बाएँ से दाएँ प्रतिक्रिया दर दाएँ से बाएँ प्रतिक्रिया दर के बराबर न हो जाए। यह है राज्य गतिशील संतुलन,क्योंकि अभिक्रिया दोनों दिशाओं में समान दर से चलती रहती है।

2. वे कारक जिन पर एंजाइमी अभिक्रिया की दर निर्भर करती है

.1 तापमान पर एंजाइमी प्रतिक्रिया दर की निर्भरता

माध्यम के तापमान में वृद्धि के साथ, एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर बढ़ जाती है, कुछ इष्टतम तापमान पर अधिकतम तक पहुंच जाती है, और फिर शून्य हो जाती है। रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए, एक नियम है कि तापमान में 10 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि के साथ, प्रतिक्रिया दर दो से तीन गुना बढ़ जाती है। एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए, यह तापमान गुणांक कम है: प्रत्येक 10 डिग्री सेल्सियस के लिए, प्रतिक्रिया दर 2 या उससे भी कम के कारक से बढ़ जाती है। प्रतिक्रिया दर में बाद में शून्य तक कमी एंजाइम ब्लॉक के विकृतीकरण को इंगित करती है। अधिकांश एंजाइमों के लिए इष्टतम तापमान मान 20 - 40 0 ​​C की सीमा में होते हैं। एंजाइमों की थर्मोलेबिलिटी उनकी प्रोटीन संरचना से जुड़ी होती है। कुछ एंजाइम पहले से ही लगभग 40 0 ​​C के तापमान पर विकृत हो जाते हैं, लेकिन उनमें से अधिकांश 40 - 50 0 C से ऊपर के तापमान पर निष्क्रिय हो जाते हैं। कुछ एंजाइम ठंड से निष्क्रिय हो जाते हैं, अर्थात। 0 डिग्री सेल्सियस के करीब तापमान पर विकृतीकरण होता है।

शरीर के तापमान में वृद्धि (बुखार) एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को तेज करती है। यह गणना करना आसान है कि प्रत्येक डिग्री के लिए शरीर के तापमान में वृद्धि से प्रतिक्रिया दर लगभग 20% बढ़ जाती है। लगभग 39-40 डिग्री सेल्सियस के उच्च तापमान पर, रोगग्रस्त जीव की कोशिकाओं में अंतर्जात सब्सट्रेट के बेकार उपयोग को भोजन के साथ उनके सेवन को फिर से भरने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, लगभग 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, कुछ बहुत ही थर्मोलैबाइल एंजाइमों को विकृत किया जा सकता है, जो जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के प्राकृतिक पाठ्यक्रम को बाधित करता है।

कम तापमान इसकी स्थानिक संरचना में मामूली बदलाव के कारण एंजाइमों की प्रतिवर्ती निष्क्रियता का कारण बनता है, लेकिन सक्रिय केंद्र और सब्सट्रेट अणुओं के संगत विन्यास को बाधित करने के लिए पर्याप्त है।

2.2 माध्यम के पीएच पर प्रतिक्रिया दर की निर्भरता

अधिकांश एंजाइमों के लिए, एक निश्चित पीएच मान होता है जिस पर उनकी गतिविधि अधिकतम होती है; इस पीएच मान के ऊपर और नीचे, इन एंजाइमों की गतिविधि कम हो जाती है। हालांकि, सभी मामलों में पीएच पर एंजाइम गतिविधि की निर्भरता का वर्णन करने वाले वक्र घंटी के आकार के नहीं होते हैं; कभी-कभी यह निर्भरता सीधे तौर पर भी व्यक्त की जा सकती है। पीएच पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया दर की निर्भरता मुख्य रूप से एंजाइम के सक्रिय केंद्र के कार्यात्मक समूहों की स्थिति को इंगित करती है। माध्यम के पीएच में परिवर्तन सक्रिय केंद्र के अमीनो एसिड अवशेषों के अम्लीय और मूल समूहों के आयनीकरण को प्रभावित करता है, जो या तो सब्सट्रेट (संपर्क क्षेत्र में) या इसके परिवर्तन (उत्प्रेरक क्षेत्र में) के बंधन में शामिल होते हैं। इसलिए, पीएच का विशिष्ट प्रभाव या तो एंजाइम के लिए सब्सट्रेट की आत्मीयता में बदलाव, या एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि में बदलाव, या दोनों के कारण हो सकता है।

अधिकांश सब्सट्रेट में अम्लीय या मूल समूह होते हैं, इसलिए पीएच सब्सट्रेट के आयनीकरण की डिग्री को प्रभावित करता है। एंजाइम सब्सट्रेट के आयनित या गैर-आयनित रूप में अधिमानतः बांधता है। जाहिर है, इष्टतम पीएच पर, सक्रिय केंद्र के दोनों कार्यात्मक समूह सबसे अधिक प्रतिक्रियाशील अवस्था में होते हैं, और सब्सट्रेट एक ऐसे रूप में होता है जो एंजाइम के इन समूहों द्वारा बंधन के लिए बेहतर होता है।

पीएच पर एंजाइम गतिविधि की निर्भरता का वर्णन करने वाले वक्रों का निर्माण करते समय, सभी पीएच मानों पर माप आमतौर पर सब्सट्रेट के साथ एंजाइम की संतृप्ति की शर्तों के तहत किया जाता है, क्योंकि कई एंजाइमों के लिए के एम मान पीएच के साथ बदलता है।

पीएच पर एंजाइम गतिविधि की निर्भरता की विशेषता वाले वक्र का उन मामलों में विशेष रूप से सरल रूप हो सकता है जब एंजाइम इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से तटस्थ सब्सट्रेट या सब्सट्रेट पर कार्य करता है जिसमें चार्ज समूह उत्प्रेरक अधिनियम में महत्वपूर्ण भूमिका नहीं निभाते हैं। ऐसे एंजाइमों का एक उदाहरण पपैन, साथ ही इनवर्टेज है, जो तटस्थ सुक्रोज अणुओं के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है और 3.0-7.5 के पीएच रेंज में निरंतर गतिविधि बनाए रखता है।

एंजाइम की अधिकतम गतिविधि के अनुरूप पीएच मान जरूरी नहीं कि इस एंजाइम के सामान्य इंट्रासेल्युलर वातावरण की पीएच मान विशेषता के साथ मेल खाता हो; उत्तरार्द्ध पीएच इष्टतम के ऊपर और नीचे दोनों हो सकता है। इससे पता चलता है कि एंजाइम गतिविधि पर पीएच का प्रभाव कोशिका के भीतर एंजाइमी गतिविधि के नियमन के लिए जिम्मेदार कारकों में से एक हो सकता है। चूंकि कोशिका में सैकड़ों एंजाइम होते हैं, और उनमें से प्रत्येक पीएच में परिवर्तन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करता है, सेल के अंदर पीएच मान शायद सेलुलर चयापचय के नियमन की जटिल प्रणाली में महत्वपूर्ण तत्वों में से एक है।

2.3 अपनी गतिविधि द्वारा एंजाइम की मात्रा का निर्धारण

) उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की कुल स्टोइकोमेट्री;

) कोफ़ैक्टर्स की संभावित आवश्यकता - धातु आयनों या कोएंजाइम में;

) सब्सट्रेट और कॉफ़ेक्टर की सांद्रता पर एंजाइम गतिविधि की निर्भरता, अर्थात। सब्सट्रेट और कॉफ़ेक्टर दोनों के लिए K मीटर मान;

) एंजाइम की अधिकतम गतिविधि के अनुरूप पीएच मान;

) तापमान सीमा जिस पर एंजाइम स्थिर होता है और उच्च गतिविधि को बरकरार रखता है।

इसके अलावा, आपके निपटान में कुछ काफी सरल विश्लेषणात्मक तकनीक होना आवश्यक है जो आपको सब्सट्रेट के गायब होने की दर या प्रतिक्रिया उत्पादों की उपस्थिति की दर निर्धारित करने की अनुमति देता है।

जब भी संभव हो, एंजाइम विश्लेषण मानक परिस्थितियों में किया जाता है जो इष्टतम पीएच बनाए रखते हैं और संतृप्ति एकाग्रता से ऊपर एक सब्सट्रेट एकाग्रता बनाए रखते हैं; इस मामले में, प्रारंभिक दर सब्सट्रेट के संबंध में प्रतिक्रिया के शून्य क्रम से मेल खाती है और केवल एंजाइम की एकाग्रता के समानुपाती होती है। एंजाइमों के लिए सहकारकों, धातु आयनों या सहएंजाइमों की आवश्यकता होती है, इन सहकारकों की सांद्रता भी संतृप्ति सांद्रता से अधिक होनी चाहिए ताकि एंजाइम सांद्रता दर-सीमित कारक हो। सामान्य तौर पर, प्रतिक्रिया उत्पाद के गठन की दर की माप सब्सट्रेट के गायब होने की दर की माप की तुलना में अधिक सटीकता के साथ की जा सकती है, क्योंकि सब्सट्रेट आमतौर पर शून्य क्रम कैनेटीक्स को बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता में मौजूद होना चाहिए। प्रतिक्रिया उत्पाद (या उत्पादों) के गठन की दर को रासायनिक या स्पेक्ट्रम-फोटोमेट्रिक विधियों द्वारा मापा जा सकता है। दूसरी विधि अधिक सुविधाजनक है, क्योंकि यह आपको रिकॉर्डर के घुन पर प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम को लगातार रिकॉर्ड करने की अनुमति देती है।

अंतरराष्ट्रीय समझौते के अनुसार, एंजाइमी गतिविधि की एक इकाई एंजाइम की मात्रा है जो इष्टतम परिस्थितियों में प्रति मिनट सब्सट्रेट के एक माइक्रोमोल को 25 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तित करने में सक्षम है। निश्चित गतिविधिएंजाइम प्रति 1 मिलीग्राम प्रोटीन में एंजाइमी गतिविधि की इकाइयों की संख्या है। इस मान का उपयोग एंजाइम की तैयारी की शुद्धता के लिए एक मानदंड के रूप में किया जाता है; एंजाइम के शुद्ध होने पर यह बढ़ जाता है और एक आदर्श शुद्ध तैयारी के लिए अपने अधिकतम मूल्य तक पहुँच जाता है। नीचे क्रांतियों की संख्याएंजाइम के एक अणु (या प्रति एक सक्रिय केंद्र) के प्रति इकाई समय में परिवर्तन के दौर से गुजर रहे सब्सट्रेट अणुओं की संख्या को उन परिस्थितियों में समझ सकते हैं जहां प्रतिक्रिया दर एंजाइम की एकाग्रता से सीमित होती है।

2.4 एंजाइम सक्रियण

एंजाइमों का विनियमन उनके साथ विभिन्न जैविक घटकों या विदेशी यौगिकों (उदाहरण के लिए, ड्रग्स और जहर) के साथ बातचीत करके किया जा सकता है, जिन्हें आमतौर पर कहा जाता है संशोधकया नियामक एंजाइम।एंजाइम पर संशोधक के प्रभाव में, प्रतिक्रिया को तेज (सक्रियकर्ता) या धीमा किया जा सकता है (अवरोधक)।

एंजाइमों की सक्रियता जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के त्वरण से निर्धारित होती है जो संशोधक की कार्रवाई के बाद होती है। सक्रियकों के एक समूह में ऐसे पदार्थ होते हैं जो एंजाइम की सक्रिय साइट के क्षेत्र को प्रभावित करते हैं। इनमें एंजाइम कॉफ़ैक्टर्स और सबस्ट्रेट्स शामिल हैं। कॉफ़ैक्टर्स (धातु आयन और कोएंजाइम) न केवल जटिल एंजाइमों के अनिवार्य संरचनात्मक तत्व हैं, बल्कि अनिवार्य रूप से उनके सक्रियकर्ता भी हैं।

धातु आयन काफी विशिष्ट सक्रियक हैं। अक्सर, कुछ एंजाइमों को एक नहीं, बल्कि कई धातुओं के आयनों की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, Na + , K + -ATPase के लिए, जो कोशिका झिल्ली के माध्यम से मोनोवैलेंट धनायनों को स्थानांतरित करता है, उत्प्रेरक के रूप में मैग्नीशियम, सोडियम और पोटेशियम आयन आवश्यक हैं।

धातु आयनों की मदद से सक्रियण विभिन्न तंत्रों द्वारा किया जाता है। कुछ एंजाइमों में, वे उत्प्रेरक साइट का हिस्सा होते हैं। कुछ मामलों में, धातु आयन सब्सट्रेट को एंजाइम के सक्रिय केंद्र से बांधने की सुविधा प्रदान करते हैं, जिससे एक प्रकार का पुल बनता है। अक्सर, धातु एंजाइम के साथ नहीं, बल्कि सब्सट्रेट के साथ मिलकर एक धातु-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स बनाता है, जो एंजाइम की क्रिया के लिए बेहतर होता है।

सब्सट्रेट के बंधन और उत्प्रेरण में कोएंजाइम की भागीदारी की विशिष्टता उनके द्वारा एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की सक्रियता की व्याख्या करती है। कॉफ़ैक्टर्स का सक्रिय प्रभाव विशेष रूप से ध्यान देने योग्य होता है जब एक एंजाइम पर कार्य करते हैं जो कॉफ़ैक्टर्स से संतृप्त नहीं होता है।

सब्सट्रेट भी ज्ञात एकाग्रता सीमा के भीतर एक उत्प्रेरक है। सब्सट्रेट की संतृप्त सांद्रता तक पहुंचने के बाद, एंजाइम की गतिविधि नहीं बढ़ती है। सब्सट्रेट एंजाइम की स्थिरता को बढ़ाता है और एंजाइम की सक्रिय साइट की वांछित संरचना के गठन की सुविधा प्रदान करता है।

धातु आयन, कोएंजाइम और उनके अग्रदूत और सक्रिय एनालॉग्स,

सब्सट्रेट का उपयोग अभ्यास में एंजाइमों को सक्रिय करने वाली तैयारी के रूप में किया जा सकता है।

कुछ एंजाइमों का सक्रियण संशोधन द्वारा किया जा सकता है जो उनके अणुओं के सक्रिय केंद्र को प्रभावित नहीं करता है। कई संशोधन संभव हैं:

1) एक निष्क्रिय पूर्ववर्ती की सक्रियता - प्रोएंजाइम,या ज़ाइमोजेन. उदाहरण के लिए, पेप्सिनोजेन का पेप्सिन में रूपांतरण ;

2) एंजाइम अणु के लिए किसी विशिष्ट संशोधित समूह को जोड़कर सक्रियण;

3) एक निष्क्रिय जटिल प्रोटीन - सक्रिय एंजाइम के पृथक्करण द्वारा सक्रियण।

2.5 एंजाइम निषेध

ऐसे अभिकर्मक हैं जो कमोबेश विशेष रूप से प्रोटीन की एक या दूसरी साइड चेन के साथ बातचीत कर सकते हैं, जिससे एंजाइम गतिविधि का निषेध होता है। यह घटना इस एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया में शामिल अमीनो एसिड साइड अवशेषों की प्रकृति का अध्ययन करना संभव बनाती है। हालांकि, व्यवहार में, किसी को कई सूक्ष्मताओं को ध्यान में रखना चाहिए जो विशिष्ट अवरोधकों के साथ प्राप्त परिणामों की स्पष्ट व्याख्या करना मुश्किल और अक्सर संदिग्ध बनाते हैं। सबसे पहले, एक अवरोधक के साथ प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया में शामिल पक्ष श्रृंखलाओं की प्रकृति का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त होने के लिए, इसे निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना होगा:

) विशिष्ट हो, अर्थात। अवरोधक को केवल वांछित समूहों को अवरुद्ध करना चाहिए;

) एंजाइम की गतिविधि को रोकना, और संशोधित समूहों की संख्या में वृद्धि के साथ यह निषेध पूरा हो जाना चाहिए;

) अभिकर्मक को प्रोटीन के गैर-विशिष्ट विकृतीकरण का कारण नहीं बनना चाहिए।

अवरोधकों के 2 समूह हैं: प्रतिवर्ती और अपरिवर्तनीय क्रिया। विभाजन डायलिसिस के बाद एंजाइम गतिविधि की बहाली या एक अवरोधक के साथ एक एंजाइम समाधान के मजबूत कमजोर पड़ने की कसौटी पर आधारित है।

क्रिया के तंत्र के अनुसार, प्रतिस्पर्धी, गैर-प्रतिस्पर्धी, गैर-प्रतिस्पर्धी, सब्सट्रेट और एलोस्टेरिक निषेध प्रतिष्ठित हैं।

प्रतिस्पर्धी निषेध

सब्सट्रेट के एनालॉग्स के कारण होने वाले अवरोध के अध्ययन में प्रतिस्पर्धी निषेध की खोज की गई थी। यह सब्सट्रेट की संरचना के समान एक अवरोधक के एंजाइम के सक्रिय केंद्र के लिए बाध्यकारी और एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के गठन को रोकने के कारण एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया का निषेध है। प्रतिस्पर्धी निषेध में, अवरोधक और सब्सट्रेट, संरचना में समान होने के कारण, एंजाइम की सक्रिय साइट के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं। अणुओं का यौगिक, जो बड़ा होता है, सक्रिय केंद्र से जुड़ जाता है।

निषेध के तंत्र के बारे में इस तरह के विचारों की पुष्टि प्रतिस्पर्धी निषेध प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स पर प्रयोगों द्वारा की गई थी। इस प्रकार, यह दिखाया गया कि, प्रतिस्पर्धी अवरोध के मामले में, सब्सट्रेट एनालॉग पहले से बने एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के अपघटन की दर को प्रभावित नहीं करता है; सब्सट्रेट के "असीम रूप से बड़े" अतिरिक्त का उपयोग करते समय, एक ही अधिकतम दर उपस्थिति और अवरोधक की अनुपस्थिति दोनों में प्राप्त की जाती है। इसके विपरीत, अवरोधक पृथक्करण स्थिरांक और माइकलिस स्थिरांक के मान को प्रभावित करता है। इससे हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि अवरोधक सब्सट्रेट को बांधने में किसी न किसी तरह से शामिल प्रोटीन समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है, इसलिए, इन समूहों के साथ इसकी बातचीत के कारण, सब्सट्रेट की बाध्यकारी ताकत कम हो जाती है (यानी, एंजाइम अणुओं की संख्या सक्षम है सब्सट्रेट को बांधना कम हो जाता है)।

बाद में, यह दिखाया गया कि काइनेटिक रूप से प्रतिस्पर्धी निषेध न केवल सब्सट्रेट एनालॉग्स के कारण हो सकता है, बल्कि अन्य अभिकर्मकों द्वारा भी हो सकता है, जिसकी रासायनिक संरचना सब्सट्रेट से पूरी तरह से अलग है। इन मामलों में, यह भी माना गया कि यह अभिकर्मक सब्सट्रेट को बांधने के लिए जिम्मेदार समूह के साथ बातचीत करता है।

प्रतिस्पर्धी निषेध के लिए सैद्धांतिक रूप से दो संभावनाएं हैं:

1) एंजाइम की बाध्यकारी और उत्प्रेरक साइट ओवरलैप; अवरोधक उन्हें बांधता है, लेकिन केवल बाध्यकारी केंद्र समूहों को प्रभावित करता है;

2) एंजाइम अणु में बाध्यकारी केंद्र और उत्प्रेरक केंद्र स्थानिक रूप से पृथक होते हैं; अवरोधक बाध्यकारी साइट के साथ बातचीत करता है।

जहां I एक अवरोधक है, और K I एंजाइम-अवरोधक परिसर का पृथक्करण स्थिरांक है।

सापेक्ष दर (एक अवरोधक की उपस्थिति में मापा गया एंजाइमी प्रतिक्रिया दर का अनुपात (v i) , अधिकतम गति के लिए) के बराबर है

वी मैं / वी = / [ई] टी

चूंकि एंजाइम की कुल सांद्रता के लिए यह सत्य है

[ई] टी = [ई] + +

फिर 1 / वी मैं = (के एस / वी [एस]) (1 + [आई] / के आई) + 1 / वी

जाहिर है, अगर [I] = K I , तब सीधी रेखा का ढलान [S] पर 1/v 0 की निर्भरता के मुकाबले दोगुना बड़ा हो जाता है (v 0 एक अवरोधक की अनुपस्थिति में एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर है)।

निषेध का प्रकार आमतौर पर रेखांकन द्वारा निर्धारित किया जाता है। लिनेविवर-बर्क प्लॉट (अर्थात् 1/v i में प्लॉट) को प्लॉट करके प्रतिस्पर्धी अवरोध को सबसे आसानी से पहचाना जाता है और 1/[एस]) विभिन्न अवरोधक सांद्रता पर। सच्चे प्रतिस्पर्धी अवरोध के साथ, सीधी रेखाओं का एक सेट प्राप्त होता है जो ढलान कोण के स्पर्शरेखा में भिन्न होता है और y-अक्ष (अक्ष 1/v i) को प्रतिच्छेद करता है। एक बिंदु पर। अवरोधक की किसी भी सांद्रता पर, सब्सट्रेट की इतनी उच्च सांद्रता का उपयोग करना संभव है कि एंजाइम की गतिविधि अधिकतम हो।

प्रतिस्पर्धी अवरोध का एक उदाहरण सक्सेनेट डिहाइड्रोजनेज की गतिविधि पर विभिन्न पदार्थों का प्रभाव है। यह एंजाइम एंजाइमी चक्रीय प्रणाली - क्रेब्स चक्र का हिस्सा है। इसका प्राकृतिक सब्सट्रेट सक्सेनेट है, और इसका प्रतिस्पर्धी अवरोधक ऑक्सालोसेटेट है, जो उसी क्रेब्स चक्र का एक मध्यवर्ती उत्पाद है:

सक्सेनेट डिहाइड्रोजनेज का एक समान प्रतिस्पर्धी अवरोधक मेलोनिक एसिड है, जिसका उपयोग अक्सर जैव रासायनिक अनुसंधान में किया जाता है।

कई औषधीय तैयारियों, कृषि कीटों को नष्ट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कीटनाशकों और रासायनिक युद्ध एजेंटों की कार्रवाई प्रतिस्पर्धी निषेध के सिद्धांत पर आधारित है।

उदाहरण के लिए, एंटीकोलिनेस्टरेज़ दवाओं का एक समूह, जिसमें चतुर्धातुक अमोनियम बेस और ऑर्गनोफॉस्फोरस यौगिकों के डेरिवेटिव शामिल हैं, इसके सब्सट्रेट एसिटाइलकोलाइन के संबंध में कोलिनेस्टरेज़ एंजाइम के प्रतिस्पर्धी अवरोधक हैं। कोलिनेस्टरेज़ एसिटाइलकोलाइन के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है, जो कोलीनर्जिक सिस्टम (न्यूरोमस्कुलर सिनेप्स, पैरासिम्पेथेटिक सिस्टम, आदि) का मध्यस्थ है। एंटीकोलिनेस्टरेज़ पदार्थ एंजाइम की सक्रिय साइट के लिए एसिटाइलकोलाइन के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं, इसे बांधते हैं, और एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि को बंद कर देते हैं। प्रोजेरिन, फिजियोस्टिग्माइन, सेविन जैसी दवाएं एंजाइम को विपरीत रूप से रोकती हैं, जबकि ऑर्गनोफॉस्फोरस दवाएं जैसे आर्मिन, निबुफिन, क्लोरोफोस, सोमन अपरिवर्तनीय रूप से कार्य करती हैं, एंजाइम के उत्प्रेरक समूह को फॉस्फोराइलेट करती हैं। उनकी कार्रवाई के परिणामस्वरूप, एसिटाइलकोलाइन उन सिनेप्स में जमा हो जाता है जहां यह तंत्रिका उत्तेजना का मध्यस्थ होता है, अर्थात। संचित एसिटाइलकोलाइन द्वारा जीव को जहर दिया जाता है। प्रतिवर्ती अवरोधकों की क्रिया धीरे-धीरे गायब हो जाती है, क्योंकि जितना अधिक एसिटाइलकोलाइन जमा होता है, उतनी ही तेजी से यह अवरोधक को चोलिनेस्टरेज़ के सक्रिय केंद्र से विस्थापित करता है। अपरिवर्तनीय अवरोधकों की विषाक्तता अतुलनीय रूप से अधिक है; इसलिए, उनका उपयोग कृषि कीटों, घरेलू कीड़ों और कृन्तकों (उदाहरण के लिए, क्लोरोफोस) और रासायनिक युद्ध एजेंटों (उदाहरण के लिए, सरीन, सोमन, आदि) के रूप में किया जाता है।

अप्रतिस्पर्धी निषेध

गैर-प्रतिस्पर्धी निषेध में, एक विशिष्ट अवरोधक एंजाइम-सब्सट्रेट परिसर के पृथक्करण स्थिरांक को प्रभावित नहीं करता है। दूसरी ओर, सब्सट्रेट की असीम रूप से बड़ी अधिकता पर भी, इसकी अनुपस्थिति की तुलना में अवरोधक की उपस्थिति में अधिकतम प्राप्त करने योग्य प्रतिक्रिया दर कम होती है। निषेध की उपस्थिति यह साबित करती है कि अवरोधक प्रोटीन को बांधता है। अवरोधक की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों में पृथक्करण स्थिरांक का अपरिवर्तन, बदले में, इंगित करता है कि, सब्सट्रेट के विपरीत, अवरोधक दूसरे समूह से बांधता है। सैद्धांतिक दृष्टिकोण से, इस तरह के निषेध के तंत्र की व्याख्या विभिन्न तरीकों से की जा सकती है।

ए) एंजाइम की बाध्यकारी साइट और उत्प्रेरक साइट अलग-अलग हैं। इस मामले में, उत्प्रेरक केंद्र से जुड़ा अवरोधक एंजाइम की गतिविधि को कम कर देता है और अधिकतम प्राप्त होता है
एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के गठन को प्रभावित किए बिना गति।

बी) बाध्यकारी साइट और उत्प्रेरक साइट पर ओवरलैप होता है
एंजाइम की सतह, और अवरोधक प्रोटीन के अन्य समूहों को बांधता है। एंजाइम की सतह पर अवरोधक के बंधन के कारण, प्रोटीन की जानकारी बदल जाती है और कटैलिसीस के कार्यान्वयन के लिए प्रतिकूल हो जाती है।

सी) अवरोधक या तो उत्प्रेरक साइट या बाध्यकारी साइट से नहीं बांधता है, और इस प्रकार प्रोटीन की संरचना को प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, यह स्थानीय रूप से प्रोटीन सतह के एक क्षेत्र पर चार्ज वितरण को बदल सकता है। इस मामले में गतिविधि का निषेध भी हो सकता है, उदाहरण के लिए, गतिविधि की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक समूहों का आयनीकरण असंभव बना दिया जाता है, या यदि, इसके विपरीत, केवल गैर-आयनित रूप में सक्रिय समूहों का आयनीकरण होता है। यह घटना मुख्य रूप से दृढ़ता से अम्लीय या दृढ़ता से क्षारीय अभिकर्मकों का उपयोग करते समय देखी जाती है।

अवरोधक और सब्सट्रेट एक दूसरे के एंजाइम के बंधन को प्रभावित नहीं करते हैं, लेकिन अवरोधक युक्त एंजाइम कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से निष्क्रिय हैं। इस मामले में, निम्नलिखित प्रारंभिक चरणों को माना जा सकता है:

वी मैं / वी = / [ई] टी

[ई] टी = [ई] + + +

/ वी आई = (के एस / वी [एस]) (1 + [आई] / के आई) + (1 / वी) (1 + [आई] / के आई)

यदि [I] = K I, सीधी रेखाओं के ढलान और लंबवत अक्ष के साथ चौराहे के बिंदु के निर्देशांक 1/v 0 की तुलना में दोगुना हो जाते हैं।

गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक, उदाहरण के लिए, साइनाइड हैं, जो फेरिक आयरन से दृढ़ता से जुड़े हुए हैं, जो हेमिक एंजाइम - साइटोक्रोम ऑक्सीडेज के उत्प्रेरक साइट का हिस्सा है। इस एंजाइम की नाकाबंदी श्वसन श्रृंखला को बंद कर देती है, और कोशिका मर जाती है। गैर-प्रतिस्पर्धी एंजाइम अवरोधकों में भारी धातु आयन और उनके कार्बनिक यौगिक शामिल हैं। इसलिए, पारा, सीसा, कैडमियम, आर्सेनिक और अन्य के भारी धातु आयन बहुत जहरीले होते हैं। वे अवरुद्ध करते हैं, उदाहरण के लिए, एंजाइम की उत्प्रेरक साइट में शामिल एसएच-समूह।

गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक साइनाइड हैं, जो दृढ़ता से फेरिक आयरन से जुड़े होते हैं, जो हेमिक एंजाइम - साइटोक्रोम ऑक्सीडेज की उत्प्रेरक साइट का हिस्सा है। इस एंजाइम की नाकाबंदी श्वसन श्रृंखला को बंद कर देती है, और कोशिका मर जाती है। सब्सट्रेट की अधिकता (प्रतिस्पर्धी की कार्रवाई के रूप में) के साथ एक गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक की कार्रवाई को हटाना असंभव है, लेकिन केवल उन पदार्थों के साथ जो अवरोधक - रिएक्टिवेटर को बांधते हैं।

गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधकों का उपयोग औषधीय एजेंटों, कृषि में कीट नियंत्रण और सैन्य उद्देश्यों के लिए जहरीले पदार्थों के रूप में किया जाता है। चिकित्सा में, पारा, आर्सेनिक, बिस्मथ युक्त तैयारी का उपयोग किया जाता है, जो शरीर की कोशिकाओं या रोगजनक बैक्टीरिया में एंजाइमों को गैर-प्रतिस्पर्धी रूप से रोकता है, जो उनके एक या दूसरे प्रभाव को निर्धारित करता है। नशा के मामले में, जहर का बंधन या एंजाइम-अवरोधक परिसर से इसका विस्थापन पुनर्सक्रियकों की मदद से संभव है। इनमें सभी एसएच युक्त कॉम्प्लेक्सोन (सिस्टीन, डिमरकैप्टोप्रोपेनॉल), साइट्रिक एसिड, एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड आदि शामिल हैं।

अप्रतिस्पर्धी निषेध

इस प्रकार के निषेध को साहित्य में प्रतिस्पर्द्धात्मक निषेध भी कहा जाता है। या संबद्ध निषेध , हालांकि, शब्द "अप्रतिस्पर्धी निषेध" सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस प्रकार के निषेध की विशेषता यह है कि अवरोधक एंजाइम से जुड़ने में सक्षम नहीं है, लेकिन यह एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स से जुड़ जाता है।

अप्रतिस्पर्धी निषेध के मामले में, अवरोधक युक्त परिसर निष्क्रिय है:

वी मैं / वी = / [ई]

[ई] टी = [ई] + +

/ वी आई = केएस / वी [एस] + (1 / वी) (1 + [आई] / के आई)

सब्सट्रेट निषेध

सब्सट्रेट निषेध सब्सट्रेट की अधिकता के कारण होने वाली एंजाइमी प्रतिक्रिया का निषेध है। इस तरह का अवरोध एक एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स के गठन के कारण होता है जो उत्प्रेरक परिवर्तनों से गुजरने में सक्षम नहीं है।ईएस 2 कॉम्प्लेक्स अनुत्पादक है और एंजाइम अणु को निष्क्रिय बनाता है। सब्सट्रेट अवरोध सब्सट्रेट की अधिकता के कारण होता है, इसलिए, इसकी एकाग्रता कम होने पर इसे हटा दिया जाता है।

एलोस्टेरिक निषेध

एलोस्टेरिक विनियमन केवल एक चतुर्धातुक संरचना वाले एंजाइमों के एक विशेष समूह के लिए विशेषता है, जिसमें एलोस्टेरिक प्रभावकों को बांधने के लिए नियामक केंद्र हैं। नकारात्मक प्रभावकारक जो एंजाइम की सक्रिय साइट में सब्सट्रेट के रूपांतरण को रोकते हैं, एलोस्टेरिक अवरोधक के रूप में कार्य करते हैं। सकारात्मक एलोस्टेरिक प्रभावकारक, इसके विपरीत, एंजाइमी प्रतिक्रिया को तेज करते हैं, और इसलिए उन्हें एलोस्टेरिक सक्रियक कहा जाता है। एंजाइमों के एलोस्टेरिक प्रभावक अक्सर विभिन्न चयापचयों के साथ-साथ हार्मोन, धातु आयन और कोएंजाइम होते हैं। दुर्लभ मामलों में, सब्सट्रेट अणुओं द्वारा एंजाइमों के एलोस्टेरिक प्रभावकारक की भूमिका निभाई जाती है।

एंजाइम पर एलोस्टेरिक इनहिबिटर की क्रिया का तंत्र सक्रिय साइट की संरचना को बदलना है। एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया की दर में कमी या तो Km में वृद्धि या समान संतृप्त सब्सट्रेट सांद्रता पर अधिकतम दर V अधिकतम में कमी का परिणाम है, अर्थात। एंजाइम आंशिक रूप से निष्क्रिय है।

एलोस्टेरिक एंजाइम अन्य एंजाइमों से उनके विशिष्ट एस-आकार की प्रतिक्रिया दर बनाम सब्सट्रेट एकाग्रता में भिन्न होते हैं। यह वक्र हीमोग्लोबिन के ऑक्सीजन संतृप्ति वक्र के समान है; यह इंगित करता है कि उप-इकाइयों के सक्रिय केंद्र स्वायत्त रूप से नहीं, बल्कि सहकारी रूप से कार्य करते हैं, अर्थात। सब्सट्रेट के लिए प्रत्येक अगले सक्रिय केंद्र की आत्मीयता पिछले केंद्रों की संतृप्ति की डिग्री से निर्धारित होती है। केंद्रों का समन्वित कार्य एलोस्टेरिक प्रभावकों द्वारा निर्धारित किया जाता है।

श्रृंखला में पहले एंजाइम के अंतिम उत्पाद द्वारा अवरोध के रूप में एलोस्टेरिक विनियमन प्रकट होता है। प्रारंभिक पदार्थ (सब्सट्रेट) के परिवर्तनों की एक श्रृंखला के बाद अंतिम उत्पाद की संरचना सब्सट्रेट के समान नहीं है, इसलिए अंतिम उत्पाद श्रृंखला के प्रारंभिक एंजाइम पर केवल एक एलोस्टेरिक अवरोधक (प्रभावक) के रूप में कार्य कर सकता है। बाह्य रूप से, इस तरह का विनियमन प्रतिक्रिया तंत्र द्वारा विनियमन के समान है और आपको अंतिम उत्पाद के उत्पादन को नियंत्रित करने की अनुमति देता है, जिसके संचय की स्थिति में श्रृंखला में पहले एंजाइम का काम बंद हो जाता है। उदाहरण के लिए, एस्पार्टेट कार्बामॉयलट्रांसफेरेज़ (एसीटीज़) साइटिडीन ट्राइफॉस्फेट (सीटीपी) के संश्लेषण में छह प्रतिक्रियाओं में से पहली को उत्प्रेरित करता है। CTP एक एलोस्टेरिक AKTase अवरोधक है। इसलिए, जब CTP जमा होता है, AKTase अवरोध होता है और आगे CTP संश्लेषण रुक जाता है। हार्मोन की सहायता से एंजाइमों के ऐलोस्टेरिक नियमन की खोज की गई है। उदाहरण के लिए, एस्ट्रोजेन एंजाइम ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज का एक एलोस्टेरिक अवरोधक है, जो ग्लूटामिक एसिड के बहरापन को उत्प्रेरित करता है।

इस प्रकार, एक एंजाइमी प्रतिक्रिया के लिए सबसे सरल गतिज समीकरण में कई गतिज पैरामीटर होते हैं, जिनमें से प्रत्येक तापमान और पर्यावरण पर निर्भर करता है जिसमें प्रतिक्रिया होती है।

अवरोधक न केवल एंजाइमेटिक कटैलिसीस के सार को समझना संभव बनाते हैं, बल्कि व्यक्तिगत रासायनिक प्रतिक्रियाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रकार का उपकरण भी हैं, जिसे विशेष रूप से किसी दिए गए एंजाइम के अवरोधक की मदद से बंद किया जा सकता है।

3. प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर निर्धारित करने के लिए उपयोगी कुछ उपकरण

एंजाइमी कैनेटीक्स की कई समस्याएं प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर (v 0) के निर्धारण की ओर ले जाती हैं। इस पद्धति का मुख्य लाभ यह है कि समय के प्रारंभिक क्षण में निर्धारित v0 के मान अध्ययन के तहत एंजाइमों की गतिविधि का सबसे सटीक प्रतिनिधित्व देंगे, क्योंकि संचित प्रतिक्रिया उत्पादों के पास अभी तक एक निरोधात्मक को लागू करने का समय नहीं है। एंजाइम पर प्रभाव और, इसके अलावा, प्रतिक्रिया प्रणाली स्थिर संतुलन की स्थिति में है।

प्रयोगशाला अभ्यास में, हालांकि, ऐसी प्रतिक्रियाओं की प्रगति को रिकॉर्ड करने के लिए पारंपरिक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक, टाइट्रिमेट्रिक या अन्य तकनीकों का उपयोग करते समय, सब्सट्रेट में एंजाइम को पेश करने के लिए प्रारंभिक समय से 15-20 सेकंड तक, प्रतिक्रियाशील प्रणाली को मिलाकर, सेल आदि की स्थापना खो गई है। और यह अस्वीकार्य है, क्योंकि इस मामले में स्पर्शरेखा को उस बिंदु पर लाया जाता है जहां tg 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без मात्रा के हिसाब से अभिकर्मकों की सांद्रता में उतार-चढ़ाव से निरंतर मिश्रण और अधिक जटिल हो जाता है।

एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एक पीएच मीटर, और इसी तरह के लिए नीचे प्रस्तावित सरल उपकरण v 0 को निर्धारित करने में संकेतित त्रुटियों के स्रोतों को काफी कम करना संभव बनाते हैं।

3.1 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए डिवाइस

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपकरण में एक डिस्पेंसर 1, एक घूर्णन टेफ्लॉन थ्रेड 2 (एक स्टिरर) और एक फिक्सिंग कैप 3 होता है।

डिस्पेंसर एक माइक्रोपिपेट है, जिसका एक सिरा सुई 4 से बनता है, दूसरा - चौड़ा 5 के साथ (एंजाइम को रबर टिप 6 में प्रवेश करने से रोकने के लिए)।

स्पेक्ट्रल क्यूवेट 7 को कवर करने वाले टेफ्लॉन कवर 3 में दो छेद होते हैं: एक (8) कवर के केंद्र में, दूसरा (9) क्युवेट 7 की अपारदर्शी दीवार और प्रकाश किरण 10 के बीच की खाई के बीच के ऊपर। टेफ्लॉन ट्यूब 11 (आंतरिक व्यास 1 -1.5 मिमी) छेद 9 में एक छोर पर तय किया गया है, दूसरा - मोटर रोटर के सामने एक निश्चित कगार 12 पर। टेफ्लॉन थ्रेड 2 ट्यूब के अंदर डाला जाता है (थ्रेड मोटाई 0.5-0.6 मिमी ) धागे का एक सिरा मोटर 13 के घूर्णन रोटर पर तय किया गया है, दूसरा - क्युवेट 7 में पारित - एक सर्पिल (मिश्रण को बढ़ाने के लिए) के रूप में आकार दिया गया है। थ्रेड की स्थिति फिक्सिंग कैप 3 द्वारा निर्धारित की जाती है, मोटर की दूरी की परवाह किए बिना, जो काम करते समय सुविधाजनक होता है, जिसमें क्युवेट के लगातार परिवर्तन की आवश्यकता होती है।

संचालन का सिद्धांत।स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 7 का क्वार्ट्ज क्युवेट सब्सट्रेट 14 (लगभग 1.5-2.0 मिली) से भरा होता है, जिसे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के थर्मोस्टेटिक क्युवेट होल्डर में डाला जाता है, एक ढक्कन 3 के साथ एक घूर्णन टेफ्लॉन थ्रेड 2 के साथ बंद किया जाता है, जो सब्सट्रेट 14 में डूबा हुआ है, और आगे के सभी ऑपरेशन स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के प्रकाश की किरण में पहले से ही किए जाते हैं और रिकॉर्डर पर दर्ज किए जाते हैं।

काम की शुरुआत में, सब्सट्रेट मिलाया जाता है, और रिकॉर्डर की कलम एक सपाट क्षैतिज (या "शून्य") रेखा लिखती है। डिस्पेंसर (एंजाइम के साथ) को छेद 8 में डाला जाता है (सुई को सब्सट्रेट के घोल 14 में डुबोया जाता है), टिप 6 को जल्दी से निचोड़कर, एंजाइम (आमतौर पर लगभग 0.03-0.05 मिली) को सब्सट्रेट में पेश किया जाता है, और डिस्पेंसर हटा दी है। घटकों का मिश्रण 2.5-3 सेकंड में समाप्त होता है, और रिकॉर्डर की कलम ऑप्टिकल घनत्व (ΔA) बनाम समय के वक्र को विचलित करके प्रतिक्रिया की शुरुआत को ठीक करती है।

ऐसा उपकरण विश्लेषण के लिए प्रतिक्रियाशील प्रणाली से नमूने लेना भी संभव बनाता है; सिस्टम में अवरोधक और सक्रियकर्ता जोड़ें; प्रतिक्रिया पाठ्यक्रम के पंजीकरण को परेशान किए बिना प्रतिक्रिया की स्थिति बदलें (पीएच, आयनिक ताकत, आदि बदलें), जो बहुत सुविधाजनक है, उदाहरण के लिए, विभाजन का अध्ययन करते समय एन-एनएफएफ "अम्लीय" फॉस्फेटेस, जहां दरार एन-एनएफएफ पीएच 5.0 (या पीएच 6-7) पर किया जाता है, और एंजाइम की गतिविधि संचय द्वारा निर्धारित की जाती है एन-नाइट्रोफेनोलेट आयन पीएच 9.5-10.0 पर।

ऐसा उपकरण एंजाइम आदि के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अनुमापन करने के लिए भी सुविधाजनक है।

3.2 पीएच मीटर के लिए उपकरण

पीएच मीटर के लिए डिवाइस में फ्लो इलेक्ट्रोड 1, एक सेमी-माइक्रोसेल 2, एक डिस्पेंसर 3 और पीएच मीटर को रिकॉर्डर से जोड़ने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक सर्किट का एक संशोधित टिप होता है। इसके अलावा, डिवाइस में एक मानक पीएच मीटर इलेक्ट्रोड (4), एक सेल धारक कैप (5), एक थर्मोस्टेटिक प्रवाह कक्ष (6), एक सब्सट्रेट समाधान (7), एक निष्क्रिय चुंबक (8), और एक सक्रिय चुंबक ( 9)।

पीएच मीटर (एलपीयू-01) के प्रवाह इलेक्ट्रोड के मानक सिरे को टेफ्लॉन ट्यूब 1 (आंतरिक व्यास 1.3-1.5 मिमी) से बदल दिया जाता है, जो एस्बेस्टस धागे से भरा होता है, जिसे संतृप्त केसीएल समाधान के साथ पूर्व-उपचार किया जाता है। धागे के भरने के घनत्व को नियंत्रित किया जाता है ताकि ट्यूब के माध्यम से KCl समाधान की प्रवाह दर मूल असंशोधित इलेक्ट्रोड की प्रवाह दर के करीब हो। टिप के इस प्रतिस्थापन से मूल कामकाजी सेल के आकार को 20-25 से 2 मिलीलीटर तक कम करना संभव हो जाता है, जिससे महंगी जैव रासायनिक तैयारी के समाधान के न्यूनतम मात्रा (1.5 मिलीलीटर) के साथ प्रबंधन करना संभव हो जाता है।

पीएच मीटर (एलपीयू -01) को रिकॉर्डर से जोड़ने के लिए इलेक्ट्रॉनिक सर्किट में एक शक्ति स्रोत (डीसी बैटरी 12 वी), एक चर तार प्रतिरोध आर 1 (10 - 100 ओम) होता है, जो 9 वी का वोल्टेज सेट करता है वोल्टमीटर रीडिंग के अनुसार D809 जेनर डायोड, एक चर तार प्रतिरोध R 2 (15-150 ओम), जो रिकॉर्डर के पैमाने पर पीएच मीटर रीडिंग के "शून्य" (संदर्भ बिंदु) की सेटिंग को नियंत्रित करता है, और चर तार प्रतिरोध आर 3 (35-500 ओम), जो रिकॉर्डर पर पीएच पैमाने - मीटर के रीडिंग के विस्तार (प्रवर्धन) के पैमाने को नियंत्रित करता है। सर्किट तब तक मज़बूती से काम करता है जब तक कि स्रोत वोल्टेज 9 वी से कम न हो जाए।

संचालन का सिद्धांत।सब्सट्रेट के 1.5 मिलीलीटर को सेल (एक ग्लास सिलेंडर 1.7x2.4 सेमी) में पेश किया जाता है, और सेल फिक्सिंग कैप 5 पर तय होता है। स्टिरिंग 9 चालू होता है, और रिकॉर्डर का पेन एक सम (मूल) लिखता है। संदर्भ लाइन। एक डिस्पेंसर की मदद से, एंजाइम समाधान के 0.03 मिलीलीटर को सब्सट्रेट में पेश किया जाता है, और रिकॉर्डर की कलम पीएच बनाम समय (टी) के वक्र को विचलित करके प्रतिक्रिया की शुरुआत को ठीक करती है।

ऐसा उपकरण पीएच स्टेट को प्रतिस्थापित नहीं करता है, लेकिन पीएच मीटर के पैमाने के विस्तार की संभावना को ध्यान में रखते हुए, यह आपको पीएच 0.004-0.005 में मामूली परिवर्तनों को विश्वसनीय रूप से रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है।

3.3 नाममात्र शासक, प्रारंभिक गति निर्धारित करने के लिए सुविधाजनक

स्पर्शरेखा की विधि में प्रारंभिक वेग का निर्धारण करने की काफी जटिलता अभिकर्मकों (Δ[S]) प्रति इकाई समय (Δt) की सांद्रता में परिवर्तन के अनुपात की गणना है, अर्थात। व्यंजक v 0 में M/मिनट की स्थिति से कि

वी 0 = लिम Δ [एस] / Δt, पर, टी 0।

व्यवहार में, ऐसी प्रक्रिया में आमतौर पर तीन या चार अलग-अलग ऑपरेशन होते हैं: एक स्पर्शरेखा प्रतिक्रिया वक्र के प्रारंभिक खंड में खींची जाती है, फिर एक निश्चित प्रति पंजीकृत मूल्य (ऑप्टिकल घनत्व, रोटेशन कोण, आदि) की इकाइयों की संख्या। समय अंतराल की गणना की जाती है, और यह समय की इकाई की ओर जाता है और अंत में, 1 मिनट (एम/मिनट) के लिए अभिकर्मक की एकाग्रता को बदलने के लिए रिकॉर्डर की रीडिंग की पुनर्गणना करता है। प्रस्तावित दो प्रकार के नाममात्र शासक इस प्रक्रिया को सरल बनाना संभव बनाते हैं।

आयताकार शासक। v 0 अनुपात Δ[S]/Δt है, अर्थात। tg , जहाँ समय अक्ष t पर स्पर्शरेखा के झुकाव का कोण है। वही स्पर्शरेखा पैरों [S] और t के साथ संबंधित समकोण त्रिभुज का कर्ण भी है। v 0 जितना बड़ा होगा, स्पर्शरेखा का ढाल उतना ही अधिक होगा। इसलिए, यदि हम खुद को एक निश्चित समय अंतराल तक सीमित रखते हैं, उदाहरण के लिए, 1 मिनट, तो हमें पैर के विभिन्न मूल्यों के साथ समकोण त्रिभुजों की एक श्रृंखला मिलेगी [S] (वास्तव में, v 0 के विभिन्न मान) ) यदि, हालांकि, दोनों पैरों को स्नातक किया जाता है: क्षैतिज - समय संदर्भ की इकाइयों में (1 मिनट), और लंबवत - अभिकर्मक सांद्रता में परिवर्तन की इकाइयों में, उदाहरण के लिए, मिलीमोल्स (एमएम) में, और परिणामी खंडों को उपयुक्त प्रारूप में लागू करें एक पारदर्शी सामग्री (लगभग 2 मिमी मोटी) से, तो आप प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर निर्धारित करने के लिए एक सुविधाजनक शासक प्राप्त कर सकते हैं। v 0 का निर्धारण करते समय लंबन त्रुटियों को समाप्त करने के लिए सभी संख्याओं और रेखाओं को रूलर के पीछे की ओर मुद्रित किया जाता है।

इस मामले में v 0 के निर्धारण की प्रक्रिया को दो सरल संक्रियाओं में घटा दिया गया है: गतिज वक्र t के प्रारंभिक खंड के लिए एक स्पर्शरेखा खींची जाती है। 2 और रूलर के क्षैतिज पैर टी के शून्य बिंदु को स्पर्शरेखा की शुरुआत के साथ जोड़ दें, स्पर्शरेखा की निरंतरता अब एकाग्रता पैमाने [एस] को उस बिंदु पर पार करेगी जो एम/मिनट में वी 0 का मान निर्धारित करती है (जब लेग टी क्षैतिज है, किसी अतिरिक्त ऑपरेशन की आवश्यकता नहीं है।

चाप रेखा।यदि एकाग्रता पैमाने को एक निश्चित त्रिज्या के चाप के साथ प्लॉट किया जाता है तो v 0 निर्धारित करने की प्रक्रिया को एक ऑपरेशन में सरल बनाया जा सकता है।

एक सीधी ("बेसिक") लाइन 2 को पारदर्शी सामग्री की प्लेट पर लगाया जाता है (सभी संख्याएं और रेखाएं रूलर के रिवर्स साइड पर भी लगाई जाती हैं) और इस लाइन के शून्य बिंदु (t=0, min) से एक के साथ पैर की लंबाई के बराबर त्रिज्या t=1 मिनट [ , ऊपर से नीचे तक एक चाप [S] खीचें, जिसके साथ अभिकर्मक की सांद्रता में परिवर्तन का पैमाना (उदाहरण के लिए, mM में सब्सट्रेट) रखा गया है।

वर्णित प्रकार के शासक, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए एक उपकरण और एक पीएच मीटर का उपयोग कई वर्षों से प्रारंभिक प्रतिक्रिया दर (v 0) निर्धारित करने के लिए, एंजाइमों की सब्सट्रेट विशिष्टता के अध्ययन में, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अनुमापन आदि के लिए किया जाता है।

निष्कर्ष

इस पत्र में, एंजाइमोलॉजी के एक खंड पर विचार किया गया था जो कई पर्यावरणीय कारकों पर एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित रासायनिक प्रतिक्रियाओं की दर की निर्भरता का अध्ययन करता है। इस विज्ञान के संस्थापक माइकलिस और मेंटेन माने जाते हैं, जिन्होंने सामान्य तंत्र के अपने सिद्धांत को प्रकाशित किया एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं, एक समीकरण व्युत्पन्न जो एंजाइमों के सभी गतिज अध्ययनों का मूल सिद्धांत बन गया है, यह एंजाइमों की क्रिया के किसी भी मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है। मूल माइकलिस-मेंटेन समीकरण एक अतिपरवलयिक समीकरण है; लाइनविवर और बर्क ने माइकलिस-मेंटेन समीकरण को बदलकर और एक सीधी रेखा का ग्राफ प्राप्त करके कैनेटीक्स में योगदान दिया जो कि वी मैक्स के मूल्य को सबसे सटीक रूप से निर्धारित कर सकता है।

समय के साथ, प्रायोगिक परिस्थितियों में एंजाइमी प्रतिक्रिया में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया की दर में परिवर्तन कम हो जाता है। दर में कमी कई कारकों के कारण हो सकती है: सब्सट्रेट की एकाग्रता में कमी, एक उत्पाद की एकाग्रता में वृद्धि जिसका निरोधात्मक प्रभाव हो सकता है, समाधान के पीएच में परिवर्तन, और में परिवर्तन माध्यम का तापमान हो सकता है। तो प्रत्येक 10 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान में वृद्धि के साथ, प्रतिक्रिया दर 2 गुना या उससे भी कम बढ़ जाती है। कम तापमान एंजाइमों को विपरीत रूप से निष्क्रिय करता है। पीएच पर एंजाइमी प्रतिक्रिया की दर की निर्भरता एंजाइम के सक्रिय केंद्र के कार्यात्मक समूहों की स्थिति को इंगित करती है। प्रत्येक एंजाइम पीएच में परिवर्तन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करता है। विभिन्न प्रकार के अवरोधों के साथ उन पर क्रिया करके रासायनिक प्रतिक्रियाओं को रोका जा सकता है। प्रतिक्रिया की प्रारंभिक दर को नॉमोग्राम शासकों, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए एक उपकरण और एक पीएच मीटर जैसे उपकरणों का उपयोग करके जल्दी और सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है। यह अध्ययन किए गए एंजाइमों की गतिविधि का सबसे सटीक प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देता है।

यह सब आज चिकित्सा पद्धति में सक्रिय रूप से उपयोग किया जाता है।

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