enzimatik. enzim bakteri

Enzim adalah katalis untuk reaksi kimia yang bersifat protein, berbeda dalam kekhususan tindakannya dalam kaitannya dengan katalisis reaksi kimia tertentu. Mereka adalah produk dari biosintesis semua organisme tanah yang hidup: tanaman berkayu dan herba, lumut, lumut, ganggang, mikroorganisme, protozoa, serangga, invertebrata dan vertebrata, diwakili dalam pengaturan alami oleh agregat tertentu - biocenosis.

Biosintesis enzim dalam organisme hidup dilakukan karena faktor genetik yang bertanggung jawab atas transmisi herediter dari jenis metabolisme dan variabilitas adaptifnya. Enzim adalah alat kerja dimana aksi gen direalisasikan. Mereka mengkatalisis ribuan reaksi kimia dalam organisme, yang pada akhirnya membentuk metabolisme seluler. Berkat mereka, reaksi kimia dalam tubuh dilakukan dengan kecepatan tinggi.

Saat ini, lebih dari 900 enzim diketahui. Mereka dibagi menjadi enam kelas utama.

1. Oksireduktase mengkatalisis reaksi redoks.

2. Transferase mengkatalisis reaksi transfer antarmolekul dari berbagai kelompok kimia dan residu.

3. Hidrolase mengkatalisis reaksi pembelahan hidrolitik dari ikatan intramolekul.

4. Liase yang mengkatalisis penambahan gugus pada ikatan rangkap dan reaksi kebalikan dari abstraksi gugus tersebut.

5. Isomerase mengkatalisis reaksi isomerisasi.

6. Ligase yang mengkatalisis reaksi kimia dengan pembentukan ikatan karena ATP (adenosine triphosphoric acid).

Ketika organisme hidup mati dan membusuk, beberapa enzim mereka dihancurkan, dan beberapa, masuk ke tanah, mempertahankan aktivitas mereka dan mengkatalisis banyak reaksi kimia tanah, berpartisipasi dalam proses pembentukan tanah dan dalam pembentukan tanda kualitatif tanah - kesuburan. Di berbagai jenis tanah di bawah biocenosis tertentu, kompleks enzimatik mereka sendiri terbentuk, berbeda dalam aktivitas reaksi biokatalitik.

VF Kuprevich dan TA Shcherbakova (1966) mencatat bahwa fitur penting dari kompleks enzimatik tanah adalah keteraturan aksi kelompok enzim yang ada, yang dimanifestasikan dalam fakta bahwa aksi simultan dari sejumlah enzim yang mewakili kelompok yang berbeda dipastikan. ; pembentukan dan akumulasi senyawa yang ada di tanah secara berlebihan tidak termasuk; kelebihan senyawa sederhana bergerak yang terakumulasi (misalnya, NH 3) terikat sementara dalam satu atau lain cara dan dikirim ke siklus yang berpuncak pada pembentukan senyawa yang kurang lebih kompleks. Kompleks enzimatik adalah sistem pengaturan diri yang seimbang. Mikroorganisme dan tanaman memainkan peran utama dalam hal ini, terus-menerus mengisi kembali enzim tanah, karena banyak dari mereka berumur pendek. Jumlah enzim secara tidak langsung dinilai berdasarkan aktivitasnya dari waktu ke waktu, yang tergantung pada sifat kimia reaktan (substrat, enzim) dan pada kondisi interaksi (konsentrasi komponen, pH, suhu, komposisi medium, aksi aktivator, inhibitor, dll).

Bab ini membahas partisipasi dalam beberapa proses kimia tanah enzim dari kelas hidrolase - aktivitas invertase, urease, fosfatase, protease dan dari kelas oksireduktase - aktivitas katalase, peroksidase dan polifenol oksidase, yang sangat penting dalam konversi zat organik yang mengandung nitrogen dan fosfor, zat yang bersifat karbohidrat dan dalam proses pembentukan humus. Aktivitas enzim ini merupakan indikator penting kesuburan tanah. Selain itu, aktivitas enzim-enzim ini di hutan dan tanah subur dari berbagai tingkat budidaya akan dicirikan oleh contoh tanah soddy-podsolik, hutan abu-abu dan tanah soddy-kapur.

KARAKTERISTIK ENZIM TANAH

Invertase - mengkatalisis reaksi pemecahan hidrolitik sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dalam jumlah yang sama, juga bekerja pada karbohidrat lain dengan pembentukan molekul fruktosa - produk energi untuk aktivitas vital mikroorganisme, mengkatalisis reaksi fruktosa transferase. Studi oleh banyak penulis telah menunjukkan bahwa aktivitas invertase lebih baik daripada enzim lain mencerminkan tingkat kesuburan tanah dan aktivitas biologis.

Urease - mengkatalisis reaksi hidrolitik pembelahan urea menjadi amonia dan karbon dioksida. Sehubungan dengan penggunaan urea dalam praktik agronomi, harus diingat bahwa aktivitas urease lebih tinggi di tanah yang lebih subur. Itu naik di semua tanah selama periode aktivitas biologis terbesar mereka - pada bulan Juli - Agustus.

Fosfatase (basa dan asam) - mengkatalisis hidrolisis sejumlah senyawa organofosfat dengan pembentukan ortofosfat. Aktivitas fosfatase berbanding terbalik dengan penyediaan tanaman dengan fosfor yang tersedia, sehingga dapat digunakan sebagai indikator tambahan dalam menentukan kebutuhan pupuk fosfat yang akan diterapkan pada tanah. Aktivitas fosfatase tertinggi terdapat pada rizosfer tanaman.

Protease adalah sekelompok enzim, dengan partisipasi protein yang dipecah menjadi polipeptida dan asam amino, kemudian dihidrolisis menjadi amonia, karbon dioksida, dan air. Dalam hal ini, protease sangat penting dalam kehidupan tanah, karena mereka terkait dengan perubahan komposisi komponen organik dan dinamika bentuk nitrogen yang diasimilasi oleh tanaman.

Katalase - sebagai hasil dari aksi pengaktifannya, hidrogen peroksida, yang beracun bagi organisme hidup, dipecah menjadi air dan oksigen bebas. Vegetasi memiliki pengaruh besar pada aktivitas katalase tanah mineral. Sebagai aturan, tanah di bawah tanaman dengan sistem akar penetrasi dalam yang kuat dicirikan oleh aktivitas katalase yang tinggi. Sebuah fitur dari aktivitas katalase adalah bahwa ia berubah sedikit ke bawah profil, memiliki hubungan terbalik dengan kelembaban tanah dan hubungan langsung dengan suhu.

Polifenol oksidase dan peroksidase - mereka memainkan peran penting dalam proses pembentukan humus di tanah. Polifenol oksidase mengkatalisis oksidasi polifenol menjadi kuinon dengan adanya oksigen atmosfer bebas. Peroksidase mengkatalisis oksidasi polifenol dengan adanya hidrogen peroksida atau peroksida organik. Pada saat yang sama, perannya adalah untuk mengaktifkan peroksida, karena mereka memiliki efek pengoksidasi yang lemah pada fenol. Kondensasi lebih lanjut kuinon dengan asam amino dan peptida dapat terjadi dengan pembentukan molekul primer asam humat, yang selanjutnya dapat menjadi lebih kompleks karena kondensasi berulang (Kononova, 1963).

Telah dicatat (Chunderova, 1970) bahwa rasio aktivitas polifenol oksidase (S) terhadap aktivitas peroksidase (D), dinyatakan sebagai persentase (), terkait dengan akumulasi humus di tanah, oleh karena itu nilai ini adalah disebut koefisien kondisional akumulasi humus (K). Di tanah Udmurtia yang dibudidayakan dengan buruk untuk periode Mei hingga September, itu adalah: di tanah soddy-podsolik - 24%, di tanah podsolik hutan abu-abu - 26% dan di tanah berkapur - 29%.

PROSES ENZIMASI DALAM TANAH

Aktivitas biokatalitik tanah sangat sesuai dengan tingkat pengayaan mereka dengan mikroorganisme (Tabel 11), tergantung pada jenis tanah, dan bervariasi di seluruh cakrawala genetik, yang terkait dengan perubahan kandungan humus, reaksi, Red-Ox potensi, dan indikator lainnya di sepanjang profil.

Di tanah hutan perawan, intensitas reaksi enzimatik terutama ditentukan oleh cakrawala serasah hutan, dan di tanah yang subur, oleh lapisan yang subur. Baik di beberapa tanah maupun di tanah lain, semua horizon genetik yang kurang aktif secara biologis yang terletak di bawah horizon A atau A p memiliki aktivitas enzim yang rendah, yang sedikit berubah ke arah positif ketika tanah diolah. Setelah pengembangan tanah hutan untuk lahan subur, aktivitas enzimatik dari cakrawala subur yang terbentuk dibandingkan dengan serasah hutan ternyata berkurang tajam, tetapi ketika dibudidayakan, aktivitas itu meningkat dan, pada spesies yang dibudidayakan, mendekati atau melebihi itu. dari serasah hutan.

11. Perbandingan biogenisitas dan aktivitas enzimatik tanah di Cis-Ural Tengah (Pukhidskaya dan Kovrigo, 1974)

nomor bagian, nama tanah	Horison, kedalaman pengambilan sampel, cm	Jumlah total mikroorganisme, ribu per 1 g abs. kering tanah (rata-rata untuk tahun 1962, 1964-1965)	Indikator aktivitas enzim (rata-rata untuk 1969-1971)
			Invertase, mg glukosa per 1 g tanah untuk hari pertama	Fosfatase, mg fenolftalein per 100 g tanah selama 1 jam	Urease, mg NH, per 1 g tanah selama 1 hari	Katalase, ml 0 2 per 1 g tanah selama 1 menit	Polifenol oksidase	Peroksidase
			Invertase, mg glukosa per 1 g tanah untuk hari pertama	Fosfatase, mg fenolftalein per 100 g tanah selama 1 jam	Urease, mg NH, per 1 g tanah selama 1 hari	Katalase, ml 0 2 per 1 g tanah selama 1 menit	mg purpurogallin per 100 g tanah
3. Sod-medium podsolik sedang lempung (di bawah hutan)


				Tidak terdefinisikan
1. Soddy medium podsolik medium lempung kurang dibudidayakan


10. Hutan abu-abu podzol, tanah liat berat tidak dibudidayakan dengan baik


2. Sod-karbonat, sedikit tercuci, lempung ringan, kurang dibudidayakan

Aktivitas reaksi biokatalitik dalam tanah berubah. Ini terendah di musim semi dan musim gugur, dan yang tertinggi biasanya pada Juli-Agustus, yang sesuai dengan dinamika proses biologis umum di tanah. Namun, tergantung pada jenis tanah dan lokasi geografisnya, dinamika proses enzimatik sangat berbeda.

Kontrol pertanyaan dan tugas

1. Senyawa apa yang disebut enzim? Apa produksi dan signifikansinya bagi organisme hidup? 2. Sebutkan sumber-sumber enzim tanah. Apa peran masing-masing enzim dalam kimia tanah? 3. Memberikan konsep kompleks enzimatik tanah dan fungsinya. 4. Berikan gambaran umum tentang proses enzimatik di tanah perawan dan subur.

Aktivitas enzimatik mikroorganisme kaya dan beragam. Dengan menggunakannya, seseorang tidak hanya dapat menetapkan spesies dan jenis mikroba, tetapi juga menentukan variannya (yang disebut biovar). Pertimbangkan sifat enzimatik utama dan definisi kualitatifnya.

Pemecahan karbohidrat (aktivitas sakarolitik), yaitu kemampuan untuk memecah gula dan alkohol polihidrat dengan pembentukan asam atau asam dan gas, dipelajari pada media Hiss, yang mengandung satu atau lain karbohidrat dan indikator. Di bawah aksi asam yang terbentuk selama pemecahan karbohidrat, indikator mengubah warna medium. Oleh karena itu, media ini disebut "seri beraneka ragam". Mikroba yang tidak memfermentasi karbohidrat ini tumbuh pada media tanpa mengubahnya. Adanya gas ditentukan oleh pembentukan gelembung di media dengan agar-agar atau dengan akumulasi dalam "mengambang" pada media cair. "Float" - tabung kaca sempit dengan ujung tertutup menghadap ke atas, yang ditempatkan dalam tabung reaksi dengan media sebelum sterilisasi.

Selain itu, aktivitas sakarolitik dipelajari pada media Endo, EMS, Ploskirev. Mikroorganisme, memfermentasi gula susu (laktosa) dalam media ini menjadi asam, membentuk koloni berwarna - asam mengubah warna indikator yang ada dalam media. Koloni mikroba yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna.

Susu dengan pertumbuhan mikroba fermentasi laktosa mengental.

Dengan tumbuhnya mikroorganisme yang membentuk amilase, pada media dengan pati yang larut, terbelah. Hal ini diketahui dengan menambahkan beberapa tetes larutan Lugol ke dalam kultur - warna medium tidak berubah. Pati yang tidak tercerna memberikan warna biru dengan larutan ini.

Sifat proteolitik (yaitu, kemampuan untuk memecah protein, polipeptida, dll.) dipelajari pada media dengan gelatin, susu, whey, pepton. Dengan tumbuhnya mikroba pemfermentasi gelatin pada media gelatin, media tersebut mencair. Sifat pencairan yang disebabkan oleh mikroba yang berbeda berbeda. Mikroba yang memecah kasein (protein susu) menyebabkan peptonisasi susu - hal ini menyebabkan munculnya whey. Selama pemecahan pepton, indol, hidrogen sulfida, amonia dapat dilepaskan. Formasi mereka dibuat dengan menggunakan kertas indikator. Kertas saring diresapi dengan larutan tertentu, dikeringkan, dipotong-potong tipis sepanjang 5–6 cm, dan setelah disemai biakan pada BCH, ditempatkan di bawah gabus di antara kertas saring dan dinding tabung reaksi. Setelah inkubasi dalam termostat, hasilnya diperhitungkan. Amonia menyebabkan kertas lakmus membiru; ketika hidrogen sulfida dilepaskan pada kertas yang direndam dalam larutan 20% timbal asetat dan natrium bikarbonat, timbal sulfat terbentuk - kertas menjadi hitam; indole menyebabkan kemerahan pada selembar kertas yang direndam dalam larutan asam oksalat.

Selain media tersebut, kemampuan mikroorganisme untuk memecah berbagai substrat nutrisi ditentukan dengan menggunakan cakram kertas yang diresapi dengan reagen tertentu (sistem indikator kertas "SIB"). Cakram ini dicelupkan ke dalam tabung reaksi dengan kultur yang sedang dipelajari, dan sudah setelah 3 jam inkubasi dalam termostat pada 37 ° C, penguraian karbohidrat, asam amino, protein, dll. dinilai berdasarkan perubahan warna cakram.

Sifat hemolitik (kemampuan untuk menghancurkan sel darah merah) dipelajari pada media dengan darah. Dalam hal ini, media cair menjadi transparan, dan zona transparan muncul di sekitar koloni pada media padat. Ketika methemoglobin terbentuk, medium berubah menjadi hijau.

PELESTARIAN TANAMAN

Budaya yang terisolasi dan dipelajari (strain) nilai untuk ilmu pengetahuan atau produksi disimpan di museum budaya hidup. Museum All-Union terletak di Institut Penelitian Negara untuk Standardisasi dan Kontrol Persiapan Biologi Medis dinamai V.I. L.A. Tarasevich (GISK).

Tugas penyimpanan adalah untuk menjaga kelangsungan hidup mikroorganisme dan mencegah variabilitasnya. Untuk melakukan ini, perlu untuk melemahkan atau menghentikan pertukaran dalam sel mikroba.

Salah satu metode pelestarian budaya jangka panjang yang paling canggih - liofilisasi - pengeringan dalam ruang hampa dari keadaan beku memungkinkan Anda untuk membuat keadaan mati suri. Pengeringan dilakukan di perangkat khusus. Kultur disimpan dalam ampul tertutup pada suhu 4 °C, lebih disukai pada -30-70 °C.

Pemulihan tanaman kering.

Ujung ampul dipanaskan dengan kuat dalam nyala api pembakar dan disentuh dengan kapas yang sedikit dibasahi dengan air dingin sehingga retakan mikro terbentuk pada kaca, di mana udara perlahan-lahan merembes ke dalam ampul. Pada saat yang sama, melewati tepi retakan yang dipanaskan, udara disterilkan.

Jangan lupa bahwa ada ruang hampa di dalam ampul yang disegel. Jika udara langsung masuk melalui lubang besar, biakan dalam ampul dapat disemprotkan dan dikeluarkan.

Setelah membiarkan udara masuk, cepat putus dengan pinset dan lepaskan bagian atas ampul. Lubang dibakar ringan dan pelarut (kaldu atau larutan isotonik) dimasukkan ke dalam ampul dengan pipet atau jarum suntik Pasteur steril. Campur isi ampul dan inokulasi pada media. Pertumbuhan tanaman yang diregenerasi pada tanaman pertama mungkin melambat.

Dimungkinkan juga untuk menyimpan kultur untuk waktu yang lama dalam nitrogen cair (-196 ° C) di perangkat khusus.

Metode pengawetan kultur jangka pendek adalah sebagai berikut: 1) subkultivasi (pemindahan berkala ke media segar) dengan interval tergantung pada sifat mikroorganisme, media dan kondisi budidaya. Kultur disimpan pada suhu 4°C di antara penyemaian ulang; 2) pengawetan di bawah lapisan minyak. Kultur ditumbuhkan dalam agar dalam kolom setinggi 5-6 cm, dituang dengan minyak vaselin steril (lapisan minyak sekitar 2 cm) dan disimpan secara vertikal di lemari es. Umur simpan mikroorganisme yang berbeda berbeda, oleh karena itu, kultur secara berkala ditaburkan dari tabung reaksi untuk memeriksa viabilitasnya; 3) penyimpanan pada -20-70 °С; 4) penyimpanan dalam tabung tertutup. Sesuai kebutuhan, bahan yang disimpan ditaburkan pada media segar.

Bab 8. FAGI

Fag adalah virus bakteri dan sejumlah mikroorganisme lainnya. Dalam kondisi tertentu, mereka menyebabkan lisis (pembubaran) inang mereka. Tindakan fag memanifestasikan dirinya di alam dan digunakan dalam praktik.

Gbr.42 Bakteriofag

Sejarah penemuan dan studi fag. Pada tahun 1898, N. F. Gamaleya menunjukkan bahwa filtrat basil antraks menyebabkan lisis kultur segar mikroorganisme ini, filter bakteri, sambil mempertahankan kemampuan untuk melarutkan kultur segar mikroorganisme. Fenomena lisis mikroorganisme telah dijelaskan, tetapi sifatnya belum dipelajari. Itulah mengapa kehormatan menemukan bakteriofag adalah milik ilmuwan Kanada d'Herelle.

D "Erell (1917) mempelajari filtrat tinja, yang diambilnya setiap hari dari seorang pasien dengan disentri dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan kultur agen penyebab penyakit ini yang baru ditanam. Setelah inkubasi dalam termostat, kultur tumbuh. Tetapi suatu hari itu tidak tumbuh, tetapi larut, ini bertepatan dengan awal pemulihan pasien.

D "Erell menunjukkan bahwa kemampuan melisiskan filtrat tinja meningkat dengan perjalanan berturut-turut pada kultur bakteri segar. Dari sini, ilmuwan menyimpulkan bahwa itu melarutkan agen hidup mereka melewati filter bakteri, yaitu virus. Saat ini, sudut pandangnya diterima oleh sebagian besar ilmuwan.

Virus terbuka d "Erell disebut bakteriofag-pemakan bakteri (dari bahasa Yunani phagos - melahap), dan fenomena - bakteriofag.

Dengan penemuan mikroskop elektron, sifat sel fag dikonfirmasi dan morfologinya dipelajari.

Penemuan d'Herelle menarik perhatian para dokter yang menggunakan fag untuk mengobati dan mencegah sejumlah penyakit menular. Saat ini, fag banyak digunakan dalam praktik medis dan dalam berbagai studi biologi. Ahli bakteriologi, virologi, ahli biokimia, ahli genetika, ahli biofisika, ahli biologi molekuler, ahli onkologi eksperimental terlibat dalam fag , spesialis dalam rekayasa genetika dan bioteknologi, dll. Studi tentang fag berlanjut sebagai salah satu bab biologi yang paling menarik.

SIFAT-SIFAT FAG

Morfologi fag. Kebanyakan fag terdiri dari kepala dan ekor, sehingga dibandingkan dengan berudu atau spermatozoa. Fag T dari Escherichia coli adalah yang paling banyak dipelajari). Proses mereka adalah silinder berongga (batang) yang ditutupi dengan selubung dan berakhir di pelat basal dengan duri dan fibril. Ukuran fag, bentuk dan ukuran kepala, panjang dan struktur proses berbeda pada fag yang berbeda. Misalnya, ada fag dengan proses panjang, selubungnya tidak berkontraksi, fag dengan proses pendek, tanpa proses, dan berfilamen.

Komposisi kimia fag. Seperti semua virus, fag terdiri dari satu jenis asam nukleat (fag DNA lebih umum) dan protein. Molekul asam nukleat, dipelintir menjadi spiral, terletak di kepala fag. Cangkang fag (kapsid) dan prosesnya bersifat protein. Ujung bebas dari proses ini mengandung enzim litik, biasanya lisozim atau hialuronidase.

Interaksi fag dengan sel sensitif melewati tahapan-tahapan yang berurutan. Seluruh siklus berlangsung dalam sistem fag-bakteri yang berbeda dari beberapa menit sampai 1-2 jam Mari kita menganalisis urutan proses ini menggunakan contoh fag T-genap dari Escherichia coli.

Tahap I - adsorpsi partikel fag pada reseptor permukaan sel dilakukan dengan bantuan filamen dari proses ekor. Ratusan fag dapat diadsorpsi pada satu sel (satu cukup untuk lisis sel). Adsorpsi fag bersifat spesifik.

Tahap II - penetrasi (injeksi) asam nukleat fag ke dalam sel di fag yang berbeda terjadi dengan cara yang berbeda. Pada E. coli T-fag, paku lamina basal bersentuhan dengan dinding sel. Batang "menembus" dinding sel. Enzim yang ditemukan dalam proses tersebut, paling sering lisozim, menghancurkan membran sitoplasma. Pada saat yang sama, selubung proses berkontraksi, dan asam nukleat fag "disuntikkan" ke dalam sel melalui saluran batang. Cangkang protein kosong dari fag (“bayangan”) tetap berada di luar.

Tahap III - reproduksi protein dan asam nukleat fag di dalam sel.

Tahap IV - perakitan dan pembentukan partikel fag matang.

Gbr.43 Struktur fag.

1 - kepala; 2 - DNA; 3 - batang; 4 - kasus; 5 - pelat dasar; 6 paku; 7 - fibril ekor.

Gbr.44 Morfologi fag.

1 - fag dengan kepala, proses dan selubung berkontraksi; 2 - kepala dan proses, tanpa kontraktilitas; 3 - proses kepala dan pendek; 4 - fag tanpa ekor; fag berfilamen 5.

Tahap V - lisis sel dan pelepasan partikel fag matang darinya. Biasanya, dinding sel pecah dan beberapa ratus fag baru dilepaskan ke lingkungan, yang mampu menginfeksi sel segar. Lisis semacam itu disebut lisis dari dalam.

Berbeda dengan lisis dari dalam, lisis dari luar terjadi ketika sejumlah besar fag teradsorpsi pada sel sekaligus. Mereka membuat banyak lubang di dinding sel tempat isi sel mengalir keluar. Jadi, selama lisis dari luar, fag tidak berkembang biak, dan jumlah partikelnya tidak bertambah.

Menurut sifat aksi pada mikroorganisme, fag virulen dan sedang dibedakan.

Fag virulen menyebabkan lisis sel yang terinfeksi dengan pelepasan ke lingkungan sejumlah besar partikel fag yang mampu menginfeksi sel baru. Dalam hal ini, kultur mikroorganisme dilisiskan. Media cair menjadi transparan - pembentukan fagolisat terjadi - media di mana sejumlah besar fag berada. Dengan perkembangan fag virulen pada bakteri yang tumbuh pada media padat, baik area transparan lisis berkelanjutan terbentuk, atau formasi transparan terpisah tumbuh - koloni fag. Mereka disebut koloni negatif (plak). Koloni - fag yang berbeda berbeda dalam ukuran dan struktur.

Fag beriklim sedang tidak melisiskan semua sel dalam populasi. Dengan beberapa dari mereka, fag masuk ke dalam simbiosis: asam nukleat fag (genomnya) diintegrasikan ke dalam kromosom sel dan disebut pro Phage. Sebuah kromosom tunggal terbentuk. Sel bakteri tidak mati. Sebuah profag yang telah menjadi bagian dari genom sel dapat ditransmisikan ke sejumlah keturunan yang tidak terbatas selama reproduksinya, yaitu, ke sel-sel baru. Fenomena simbiosis sel mikroba dengan fag sedang (profag) disebut lisogeni, dan kultur di mana ada profag disebut lisogenik. Nama ini mencerminkan kemampuan profag untuk secara spontan meninggalkan kromosom sel dan, melewati sitoplasma, berubah menjadi fag virulen. Sel-sel kultur di mana fag virulen terbentuk mati (lisis), sisanya tetap lisogenik.

Skema tahapan utama interaksi antara fag dan sel bakteri.

1 – penyisipan asam nukleat fag ke petugas; 2-muda, berkembang biak

fag; 3 - fag dewasa; 4 - isolasi fag.

Kultur lisogenik tidak berbeda dalam sifat dasarnya dari yang asli, tetapi mereka tahan terhadap infeksi ulang dengan fag dengan nama yang sama. Ketika kultur lisogenik terkena radiasi penetrasi (dosis tertentu dan paparan sinar-X, sinar kosmik), bahan kimia tertentu dan sejumlah faktor lainnya, produksi fag virulen dan lisis sel kultur olehnya meningkat secara signifikan.

Fag yang beriklim sedang dapat merusak produksi mikrobiologis. Misalnya, jika galur yang memproduksi vaksin, antibiotik, dan zat biologis lainnya bersifat lisogenik, ada bahaya bahwa fag sedang akan menjadi virulen, yang akan menyebabkan lisis galur produksi.

Fag beriklim sedang merupakan faktor kuat dalam variabilitas mikroorganisme. Profage dapat mengubah beberapa sifat kultur mikroba, misalnya, membuatnya mampu menghasilkan toksin, yang diamati di antara basil difteri, agen penyebab demam berdarah, dll. Selain itu, dengan berubah menjadi bentuk virulen dan melisiskan sel , fag dapat menangkap bagian dari kromosom sel inang dan mentransfer bagian kromosom ini ke sel lain, di mana fag akan kembali berubah menjadi profag, dan sel akan memperoleh sifat baru.

Distribusi fag di alam ada di mana-mana. Fag ditemukan di tempat mikroorganisme yang sensitif terhadap mereka ditemukan: di air, tanah, kotoran, ekskresi manusia dan hewan, dll. Hampir semua bakteri yang diketahui adalah inang fag khusus untuk mereka.

Resistensi fag terhadap faktor fisik dan kimia lebih tinggi daripada bentuk vegetatif inangnya. Fag tahan terhadap pemanasan hingga 0,75 °C, pengeringan berkepanjangan, pH dari 2,0 hingga 8,5. Mereka tidak sensitif terhadap antibiotik, timol, kloroform dan sejumlah zat lain yang menghancurkan mikroflora yang menyertainya. Oleh karena itu, zat ini digunakan dalam isolasi dan pengawetan fag. Asam dan desinfektan merusak fag.

APLIKASI PRAKTIS FAG

Penggunaan fag didasarkan pada spesifisitas yang ketat dan kemampuan untuk menghancurkan sel mikroba atau masuk ke dalam simbiosis dengan mereka.

Profilaksis fag dan terapi fag, pencegahan dan pengobatan infeksi dengan bantuan fag, didasarkan pada fakta bahwa ketika fag bertemu dengan patogen di tubuh pasien, ia menghancurkannya. Saat ini, fag banyak digunakan dalam pengobatan dan pencegahan infeksi stafilokokus dan streptokokus, bahkan yang tidak dapat menerima antibiotik, serta kolera, wabah, dan sejumlah infeksi lain, seperti infeksi yang disebabkan oleh Escherichia coli dan Proteus.

Diagnostik fag meliputi: a) identifikasi kultur terisolasi menggunakan fag (diagnostik) yang diketahui. Kultur sesuai dengan fag yang melisiskannya. Misalnya, jika fag kolera menyebabkan lisis, maka ini adalah kultur vibrio cholerae. Kekhususan fag khas yang ketat memungkinkan untuk mengetik varian dalam suatu spesies (fagovar). Pengetikan fag sangat penting dalam epidemiologi, karena memungkinkan untuk menetapkan sumber infeksi dan memecahkan sejumlah masalah lain; b) identifikasi fag yang tidak diketahui dengan biakan mikroba uji. Jika fag melisiskan kultur agen penyebab disentri, maka ini adalah fag disentri; c) metode diagnostik yang dipercepat menggunakan reaksi peningkatan titer fag RNTF tidak memerlukan isolasi kultur murni patogen. Bahan uji (dari pasien atau dari benda-benda lingkungan) dan fag indikator, yang titernya ditetapkan secara ketat, ditambahkan ke kaldu.

Fag beriklim sedang banyak digunakan dalam memecahkan masalah utama biologi. Dengan bantuan mereka, kode genetik telah dipelajari, kesuksesan besar telah dicapai dalam rekayasa genetika, mereka digunakan untuk mempelajari pertumbuhan tumor, sebagai faktor dalam variabilitas mikroorganisme, dan dalam penelitian lain. Karena budaya lisogenik, berbeda dengan budaya "sehat", sensitif terhadap radiasi, mereka berfungsi untuk menentukan keandalan perlindungan pesawat ruang angkasa dari sinar kosmik: dengan perlindungan yang tidak dapat diandalkan, profag berubah menjadi bentuk yang mematikan dan melisiskan budaya.

PERSIAPAN FAGE

Dalam produksi preparat fag, strain mikroorganisme dan fag yang dipelajari dengan baik digunakan, yang biasanya ditanam dalam reaktor, yang memungkinkan untuk memperoleh fagolisat dalam jumlah besar.

Fag diproduksi dalam bentuk cair (ampul dan vial), dalam bentuk tablet dan supositoria. Tablet fag yang ditujukan untuk pemberian oral dilapisi dengan lapisan tahan asam yang melindungi fag dari aksi asam klorida lambung.

Semua persiapan fag tunduk pada kontrol wajib untuk tidak adanya flora asing, tidak berbahaya dan aktivitas (titer), yang dilakukan di fasilitas produksi yang memproduksinya. Kontrol selektif dilakukan di State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Preparat yang dinamai V.I. LA. Tarasevich. Fag yang dilepaskan diberi label, yang menunjukkan: institusi yang memproduksinya, nama fag, seri, nomor kontrol, dan tanggal kedaluwarsa. Setiap paket dilengkapi dengan petunjuk penggunaan dan penyimpanan fag.

Aktivitas enzim. Dibawah aktivitas enzim memahami jumlahnya, yang mengkatalisis transformasi sejumlah substrat per unit waktu. Untuk mengekspresikan aktivitas preparasi enzim, dua unit alternatif digunakan: internasional (IU) dan katal (kucing). Per unit kegiatan internasional jumlah enzim yang diambil sedemikian rupa sehingga mengkatalisis konversi 1 mol substrat menjadi produk dalam 1 menit dalam kondisi standar (biasanya optimal). Satu digulung menunjukkan jumlah enzim yang mengkatalisis konversi 1 mol substrat dalam 1 detik (1 cat = 6 10 7 IU). Dalam reaksi bimolekular A + B = C + D, unit aktivitas enzim dianggap sebagai jumlah yang mengkatalisis konversi 1 mol A atau B, atau 2 mol A (jika B = A), selama 1 menit.

Seringkali persiapan enzim dicirikan oleh aktivitas spesifik, yang mencerminkan tingkat pemurnian enzim. Aktivitas tertentu adalah jumlah unit aktivitas enzim per 1 mg protein.

Aktivitas molekul (jumlah pergantian enzim) adalah jumlah molekul substrat yang diubah oleh satu molekul enzim dalam 1 menit ketika enzim benar-benar jenuh dengan substrat. Ini sama dengan jumlah unit aktivitas enzim dibagi dengan jumlah enzim, yang dinyatakan dalam mikromol. Konsep aktivitas molekuler hanya berlaku untuk enzim murni.

Ketika jumlah pusat aktif dalam molekul enzim diketahui, konsep ini diperkenalkan aktivitas situs katalitik . Hal ini ditandai dengan jumlah molekul substrat yang mengalami transformasi dalam 1 menit per satu pusat aktif.

Aktivitas enzim sangat tergantung pada kondisi eksternal, di antaranya suhu dan pH medium sangat penting. Peningkatan suhu dalam kisaran 0–50 ° C biasanya menyebabkan peningkatan bertahap dalam aktivitas enzim, yang dikaitkan dengan percepatan proses pembentukan kompleks enzim-substrat dan semua peristiwa katalisis selanjutnya. Untuk setiap kenaikan suhu 10°C, laju reaksi kira-kira dua kali lipat (aturan van't Hoff). Namun, peningkatan suhu lebih lanjut (>50 ° C) disertai dengan peningkatan jumlah enzim yang tidak aktif karena denaturasi bagian proteinnya, yang dinyatakan dalam penurunan aktivitas. Setiap enzim dicirikan suhu optimal- nilai suhu di mana aktivitas terbesarnya dicatat.

Ketergantungan aktivitas enzim pada nilai pH medium adalah kompleks. Setiap enzim memiliki sendiri pH optimal lingkungan di mana ia paling aktif. Saat Anda menjauh dari nilai ini ke satu arah atau lainnya, aktivitas enzimatik menurun. Hal ini disebabkan oleh perubahan keadaan pusat aktif enzim (penurunan atau peningkatan ionisasi gugus fungsi), serta struktur tersier dari seluruh molekul protein, yang tergantung pada rasio pusat kationik dan anionik. di dalamnya. Kebanyakan enzim memiliki pH optimum dalam kisaran netral. Namun, ada enzim yang menunjukkan aktivitas maksimum pada pH 1,5 (pepsin) atau 9,5 (arginase). Saat bekerja dengan enzim, pH harus dijaga dengan larutan buffer yang sesuai.

Aktivitas enzim tunduk pada fluktuasi yang signifikan tergantung pada paparan penghambat(zat yang sebagian atau seluruhnya mengurangi aktivitas) dan aktivator(zat yang meningkatkan aktivitas). Peran mereka dimainkan oleh kation logam, beberapa anion, pembawa gugus fosfat, ekuivalen pereduksi, protein spesifik, produk antara dan akhir metabolisme, dll.

Prinsip kinetika enzim. Inti dari studi kinetik adalah untuk menentukan laju maksimum reaksi enzimatik ( V max) dan konstanta Michaelis K M. Kinetika enzimatik mempelajari laju transformasi kuantitatif beberapa zat menjadi zat lain di bawah aksi enzim. Laju reaksi enzimatik diukur dengan hilangnya substrat atau peningkatan produk yang dihasilkan per satuan waktu, atau dengan perubahan konsentrasi salah satu bentuk koenzim yang berdekatan.

Pengaruh konsentrasi enzim pada laju reaksi dinyatakan sebagai berikut: jika konsentrasi substrat konstan (dengan asumsi substrat berlebih), maka laju reaksi sebanding dengan konsentrasi enzim. Untuk studi kinetik, konsentrasi enzim 10-8 M dari pusat aktif digunakan. Nilai optimal konsentrasi enzim ditentukan dari grafik ketergantungan aktivitas enzim terhadap konsentrasinya. Nilai optimal dianggap terletak di dataran tinggi grafik yang diperoleh dalam kisaran nilai aktivitas enzim yang sedikit bergantung pada konsentrasinya (Gbr. 4.3).

Beras. 4.3. Ketergantungan laju reaksi enzimatik

pada konsentrasi enzim

Untuk mempelajari pengaruhnya konsentrasi substrat pada laju reaksi enzimatik, pertama buat kurva kinetik yang mencerminkan perubahan konsentrasi substrat (S 1) atau produk (P 1) dari waktu ke waktu (Gbr. 4.4) dan ukur laju awal ( V 1) reaksi sebagai garis singgung kemiringan garis singgung kurva di titik nol.

Beras. 4.4. Kurva kinetik reaksi enzimatik

Dengan membuat kurva kinetik untuk konsentrasi lain dari substrat tertentu (S 2 , S 3 , S 4 , dll.) atau produk (P 2 , P 3 , P 4 , dll.) dan menentukan laju awal ( V 2, V 3 , V 4, dll.) dari reaksi, plot ketergantungan laju awal reaksi enzimatik pada konsentrasi substrat (pada konsentrasi enzim yang konstan), yang berbentuk hiperbola (Gbr. 4.5).

Beras. 4.5. Ketergantungan pada laju awal reaksi enzimatik

dari konsentrasi substrat

Kinetika banyak reaksi enzimatik dijelaskan oleh persamaan Michaelis-Menten. Pada konsentrasi enzim konstan dan konsentrasi substrat rendah[S] Laju reaksi awal berbanding lurus dengan [S] (Gbr. 4.5). Dalam hal ini, kita berbicara tentang setengah-jenuh enzim dengan substrat, ketika setengah dari molekul enzim dalam bentuk kompleks enzim-substrat dan laju reaksi V = 1/2V maks. Sehubungan dengan substrat, reaksi memiliki orde 1 (laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi satu reaktan) atau orde 2 (laju reaksi sebanding dengan produk dari konsentrasi dua reaktan).

Pada nilai tinggi konsentrasi substrat[S] laju reaksi hampir tidak tergantung pada [S]: dengan peningkatan [S] lebih lanjut, laju reaksi tumbuh lebih lambat dan akhirnya menjadi konstan (maksimum) (Gbr. 4.5). Dalam hal ini, saturasi lengkap enzim dengan substrat tercapai, ketika semua molekul enzim dalam bentuk kompleks enzim-substrat dan V = V maks. Berkenaan dengan substrat, reaksi memiliki orde 0 (laju reaksi tidak tergantung pada konsentrasi reaktan).

Pada tahun 1913, L. Michaelis dan M. Menten mengusulkan model sederhana untuk menjelaskan kinetika tersebut. Menurut model ini, pembentukan kompleks enzim-substrat spesifik merupakan langkah perantara yang diperlukan dalam katalisis.

k 1 k 3

E + S ES → E + P

Enzim E bergabung dengan substrat S untuk membentuk kompleks ES. Konstanta laju dari proses ini k satu . Nasib kompleks ES ada dua: ia dapat berdisosiasi menjadi enzim E dan substrat S dengan laju konstan. k 2 , atau mengalami transformasi lebih lanjut, membentuk produk P dan enzim bebas E, dengan konstanta laju k 3 . Hal ini mendalilkan bahwa produk reaksi tidak diubah menjadi substrat asli. Kondisi ini diamati pada tahap awal reaksi, sedangkan konsentrasi produk rendah.

Laju katalisis ditentukan dalam kondisi stasioner, ketika konsentrasi produk antara tetap konstan, sedangkan konsentrasi bahan awal dan produk akhir berubah. Ini terjadi ketika laju pembentukan kompleks ES sama dengan laju peluruhannya.

Anda dapat memperkenalkan konstanta baru K M - Konstanta Michaelis(mol/l), yang sama dengan

Persamaan Michaelis-Menten, yang menyatakan hubungan kuantitatif antara laju reaksi enzimatik dan konsentrasi substrat, memiliki bentuk

(4.2)

Persamaan ini sesuai dengan plot laju reaksi versus konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat rendah ketika [S] jauh lebih rendah dari K M, V = V max [S] / K M, yaitu laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat tinggi ketika [S] jauh lebih tinggi dari K M, V = V max , yaitu, laju reaksi maksimum dan tidak tergantung pada konsentrasi substrat.

Jika [S] = K M, maka V = V maks/2.

Jadi, K M sama dengan konsentrasi substrat di mana laju reaksi setengah maksimum.

Konstanta Michaelis (KM) dan laju reaksi maksimum ( V max) adalah karakteristik kecepatan yang penting pada konsentrasi substrat yang berbeda. V max adalah nilai konstan untuk setiap enzim, yang memungkinkan untuk mengevaluasi efektivitas aksinya.

Konstanta Michaelis menunjukkan afinitas substrat untuk enzim (dalam kasus ketika k 2 >> k 3): semakin rendah K M, semakin besar afinitas dan semakin tinggi laju reaksi, dan sebaliknya. Setiap substrat dicirikan oleh nilai KM untuk enzim tertentu, dan nilainya dapat digunakan untuk menilai spesifisitas substrat enzim. Konstanta Michaelis tergantung pada sifat substrat, suhu, pH, kekuatan ionik larutan, dan adanya inhibitor.

Karena kenyataan bahwa definisi V max dan K M langsung dari ketergantungan grafis Michaelis - Menten (Gbr. 4.5) adalah ambigu, gunakan linearisasi persamaan ini. Untuk melakukan ini, itu diubah menjadi bentuk sedemikian rupa sehingga secara grafis dinyatakan sebagai garis lurus. Ada beberapa metode linierisasi, di antaranya adalah metode Lineweaver-Burk dan Edie-Hofstee yang paling umum digunakan.

transformasi Lineweaver-Burke memiliki bentuk

(4.3)

Buat grafik ketergantungan 1/ V = f(1/[S]) dan mendapatkan garis lurus, yang perpotongannya dengan sumbu y memberikan nilai 1/ V maksimal ; ruas yang dipotong oleh garis lurus pada sumbu absis memberikan nilai 1 / K M, dan garis singgung sudut kemiringan garis lurus terhadap sumbu absis adalah K M / V maks (Gbr. 4.6). Grafik ini memungkinkan Anda untuk lebih akurat menentukan V maks. Seperti yang akan kita lihat di bawah, informasi berharga mengenai penghambatan aktivitas enzim juga dapat diekstraksi dari plot ini.

Beras. 4.6. Metode linearisasi persamaan Michaelis–Menten

(menurut Lineweaver-Burke)

metode Edie – Hofsty didasarkan pada transformasi persamaan Michaelis–Menten dengan mengalikan kedua ruas dengan V maks:

(4.4)

Grafik dalam koordinat V dan V/[S] adalah garis lurus, perpotongannya dengan sumbu y memberikan nilai V max, dan segmen yang dipotong oleh garis lurus pada sumbu absis adalah nilainya V maks / K M (Gbr. 4.7). Itu membuatnya sangat mudah untuk menentukan K M dan V max , serta mendeteksi kemungkinan penyimpangan dari linearitas yang tidak terdeteksi pada grafik sebelumnya.

Beras. 4.7. Metode linearisasi persamaan Michaelis–Menten

(menurut Edie-Hofsty)

Penghambatan aktivitas enzim. Tindakan enzim dapat sepenuhnya atau sebagian ditekan oleh bahan kimia tertentu - penghambat . Berdasarkan sifat kerjanya, inhibitor dibagi menjadi reversibel dan ireversibel. Pembagian ini didasarkan pada kekuatan pengikatan inhibitor terhadap enzim.

Inhibitor reversibel - Ini adalah senyawa yang berinteraksi secara non-kovalen dengan enzim dan ketika mereka dihilangkan, aktivitas enzim dipulihkan. Inhibisi reversibel dapat bersifat kompetitif, non-kompetitif dan non-kompetitif.

Sebuah contoh penghambatan kompetitif adalah tindakan analog struktural substrat, yang dapat mengikat ke pusat aktif enzim dengan cara yang sama seperti substrat, tetapi tanpa berubah menjadi produk dan mencegah interaksi enzim dengan substrat yang sebenarnya, yaitu ada persaingan antara substrat dan inhibitor untuk mengikat pusat aktif enzim. Sebagai hasil dari pembentukan kompleks enzim-inhibitor (EI), konsentrasi kompleks ES menurun dan, sebagai akibatnya, laju reaksi menurun. Dengan kata lain, inhibitor kompetitif mengurangi laju katalisis dengan mengurangi proporsi molekul enzim yang mengikat substrat.

Pengukuran laju reaksi pada konsentrasi substrat yang berbeda memungkinkan untuk membedakan penghambatan kompetitif dari penghambatan nonkompetitif. Dengan penghambatan kompetitif pada grafik ketergantungan 1/ V=f(1/[S]) garis memotong sumbu y di satu titik 1/ V max terlepas dari adanya inhibitor, tetapi dengan adanya inhibitor, garis singgung kemiringan garis lurus ke sumbu absis meningkat, mis. V max tidak berubah, sedangkan KM meningkat, yang menunjukkan penurunan afinitas substrat untuk enzim dengan adanya inhibitor (Gbr. 4.8). Oleh karena itu, pada konsentrasi substrat yang cukup tinggi di bawah kondisi persaingan untuk situs aktif enzim, ketika substrat menggantikan inhibitor dari situs aktif, penghambatan dapat dihilangkan dan laju reaksi yang dikatalisis dipulihkan. Dalam hal ini, persamaan Michaelis Menten berbentuk

(4.5)

di mana [I] adalah konsentrasi inhibitor; K saya adalah konstanta penghambatan.

Konstanta penghambatan mencirikan afinitas enzim untuk inhibitor dan merupakan konstanta disosiasi kompleks EI:

(4.6)

Dengan adanya inhibitor kompetitif, kemiringan garis lurus terhadap sumbu x meningkat (1 + [I]/ K saya).

Beras. 4.8. Penghambatan kompetitif:

sebuah skema; b - ekspresi grafis menurut Lineweaver - Burke

Pada penghambatan non-kompetitif inhibitor berbeda dalam struktur dari substrat dan tidak mengikat aktif, tetapi ke situs alosterik enzim. Hal ini menyebabkan perubahan konformasi situs aktif enzim, yang disertai dengan penurunan aktivitas katalitik enzim. Selain itu, inhibitor dapat mengikat tidak hanya pada enzim bebas (E + I → EI), tetapi juga pada kompleks enzim-substrat (ES + I → ESI). Kedua bentuk EI dan ESI tidak aktif. Substrat dan inhibitor dapat secara bersamaan terikat oleh molekul enzim, tetapi situs pengikatannya tidak tumpang tindih. Tindakan inhibitor non-kompetitif adalah untuk mengurangi jumlah pergantian enzim, dan bukan untuk mengurangi proporsi molekul enzim yang mengikat substrat. Inhibitor tidak mencegah pembentukan kompleks ES, tetapi menghambat konversi substrat menjadi produk. Dengan demikian V max menurun, yaitu, dengan adanya inhibitor, perpotongan garis lurus dengan sumbu y akan terjadi pada titik yang lebih tinggi (Gbr. 4.9). Demikian pula, garis singgung sudut kemiringan garis lurus terhadap sumbu absis, sama dengan K M / V maks saya. K M berbeda dengan V max tidak berubah, sehingga penghambatan non-kompetitif tidak dapat dihilangkan dengan meningkatkan konsentrasi substrat.

Beras. 4.9. Inhibisi nonkompetitif:

sebuah skema; b - ekspresi grafis menurut Lineweaver - Burke

Laju reaksi maksimum V max I dengan adanya inhibitor nonkompetitif dijelaskan oleh persamaan

(4.7)

Dalam kasus tertentu penghambatan tidak kompetitif, ketika inhibitor hanya mengikat ES-kompleks dan tidak mengikat enzim bebas, pada grafik ketergantungan 1/ V = f Garis (1/[S]) sejajar satu sama lain dan memotong sumbu ordinat dan absis pada titik yang berbeda (Gbr. 4.10).

Beras. 4.10. Inhibisi tidak kompetitif:

sebuah skema; b - ekspresi grafis menurut Lineweaver - Burke

inhibitor ireversibel - ini adalah senyawa yang sangat reaktif dari berbagai sifat kimia, yang dapat berinteraksi dengan gugus fungsi penting dari pusat aktif, membentuk ikatan kovalen yang kuat. Hal ini menyebabkan hilangnya aktivitas enzim yang ireversibel. Dalam hal ini, teori Michaelis-Menten, yang didasarkan pada asumsi bahwa pengikatan inhibitor pada enzim bersifat reversibel, tidak berlaku dalam kasus ini.

Contoh penghambatan ireversibel adalah interaksi enzim dengan ion logam berat, yang melekat pada gugus sulfhidril dari residu sistein enzim dan membentuk merkaptida, yang praktis merupakan senyawa yang tidak terdisosiasi, atau modifikasi kovalen enzim di bawah aksi agen alkilasi.

Konsep aktivitas enzim

Dalam praktik biokimia sehari-hari, jumlah enzim praktis tidak diperkirakan, tetapi hanya aktivitasnya. Aktivitas adalah konsep yang lebih luas daripada kuantitas. Ini menyiratkan terutama hasil reaksi, yaitu hilangnya substrat atau akumulasi produk. Secara alami, seseorang tidak dapat mengabaikan waktu kerja enzim dan jumlah molekul enzim. Tetapi karena biasanya tidak realistis untuk menghitung jumlah molekul enzim, jumlah bahan biologis yang mengandung enzim (volume atau massa) digunakan.

Jadi, ketika menentukan aktivitas enzim, tiga variabel harus diperhitungkan secara bersamaan:

massa produk yang diperoleh atau substrat yang hilang;
waktu yang dihabiskan untuk reaksi;
jumlah enzim, tetapi sebenarnya massa atau volume bahan biologis yang mengandung enzim.

Untuk memahami hubungan antara faktor-faktor ini, contoh yang jelas dan sederhana dapat berupa konstruksi dua bangunan. Bangunan disamakan dengan produk reaksi, pekerja adalah enzim, biarkan tim sesuai dengan volume bahan biologis. Jadi, tugas dari kelas 3:

Sebuah tim yang terdiri dari 10 orang mengerjakan pembangunan satu gedung, sebuah tim yang terdiri dari 5 orang mengerjakan gedung lain yang sejenis. Pembangunannya diselesaikan secara serentak dan penuh. Di mana aktivitas pekerja lebih tinggi?
Sebuah tim yang terdiri dari 10 orang mengerjakan pembangunan satu gedung dengan 3 lantai, gedung lain dengan 12 lantai - sebuah tim yang terdiri dari 10 orang. Pembangunannya diselesaikan secara serentak dan penuh. Di mana aktivitas pekerja lebih tinggi?
Pada pembangunan satu gedung 5 lantai, sebuah tim yang terdiri dari 10 orang bekerja, yang lain dari gedung yang sama - sebuah tim yang terdiri dari 10 orang. Pembangunan gedung pertama memakan waktu 20 hari, gedung kedua selesai dalam 10 hari. Di mana aktivitas pekerja lebih tinggi?

Dasar-dasar Kuantifikasi Aktivitas Enzim

1. Aktivitas enzim dinyatakan sebagai laju akumulasi produk atau laju hilangnya substrat dalam hal jumlah bahan yang mengandung enzim.

Dalam praktiknya, mereka biasanya menggunakan:

satuan kuantitas zat - mol (dan turunannya mmol, mol), gram (kg, mg),
satuan waktu - menit, jam, detik,
satuan massa atau volume - gram (kg, mg), liter (ml).

Turunan lain juga aktif digunakan - katal (mol / dtk), satuan aktivitas internasional (IU, Satuan) sesuai dengan mol / mnt.

Jadi, aktivitas enzim dapat dinyatakan, misalnya, dalam mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml, dll.

Misalnya diketahui

2. Penciptaan kondisi standar untuk dapat membandingkan hasil yang diperoleh di laboratorium yang berbeda - pH optimal dan suhu tetap, misalnya, 25 ° C atau 37 ° C, kepatuhan terhadap waktu inkubasi substrat dengan enzim.

Pemecahan karbohidrat(aktivitas saccharolytic), yaitu kemampuan untuk memecah gula dan alkohol polihidrat dengan pembentukan asam atau asam dan gas, dipelajari pada media Giss yang mengandung satu atau lain karbohidrat dan indikator. Di bawah aksi asam yang terbentuk selama pemecahan karbohidrat, indikator mengubah warna medium. Oleh karena itu, media ini disebut "seri beraneka ragam". Mikroba yang tidak memfermentasi karbohidrat ini tumbuh pada media tanpa mengubahnya. Adanya gas ditentukan oleh pembentukan gelembung di media dengan agar-agar atau dengan akumulasi dalam "mengambang" pada media cair. "Float" - tabung kaca sempit dengan ujung tertutup menghadap ke atas, yang ditempatkan dalam tabung reaksi dengan media sebelum sterilisasi (Gbr. 18).

Beras. 18. Studi aktivitas sakarolitik mikroorganisme. I - "seri beraneka ragam": a - medium cair dengan karbohidrat dan indikator Andrede; b - medium semi cair dengan indikator tekanan darah: 1 - mikroorganisme tidak memfermentasi karbohidrat; 2 - mikroorganisme memfermentasi karbohidrat dengan pembentukan asam; 3 - mikroorganisme memfermentasi karbohidrat dengan pembentukan asam dan gas; II - koloni mikroorganisme yang tidak terurai (tidak berwarna) dan menguraikan laktosa (ungu pada media EMS - di sebelah kiri, merah pada media Endo - di sebelah kanan)

Susu dengan pertumbuhan mikroba fermentasi laktosa mengental.

Sifat proteolitik(yaitu, kemampuan untuk memecah protein, polipeptida, dll.) dipelajari pada media dengan gelatin, susu, whey, pepton. Dengan tumbuhnya mikroba pemfermentasi gelatin pada media gelatin, media tersebut mencair. Sifat pencairan yang disebabkan oleh mikroba yang berbeda berbeda (Gbr. 19). Mikroba yang memecah kasein (protein susu) menyebabkan peptonisasi susu - hal ini menyebabkan munculnya whey. Selama pemecahan pepton, indol, hidrogen sulfida, amonia dapat dilepaskan. Formasi mereka dibuat dengan menggunakan kertas indikator. Kertas saring diresapi terlebih dahulu dengan larutan tertentu, dikeringkan, dipotong menjadi potongan-potongan sempit sepanjang 5-6 cm, dan setelah menabur kultur pada BCH, ditempatkan di bawah gabus di antara itu dan dinding tabung reaksi. Setelah inkubasi dalam termostat, hasilnya diperhitungkan. Amonia menyebabkan kertas lakmus membiru; ketika hidrogen sulfida dilepaskan pada kertas yang direndam dalam larutan 20% timbal asetat dan natrium bikarbonat, timbal sulfat terbentuk - kertas menjadi hitam; indole menyebabkan kemerahan pada selembar kertas yang direndam dalam larutan asam oksalat (lihat Gambar 19).

Beras. 19. Sifat proteolitik mikroorganisme. 1 - bentuk pencairan gelatin; II - penentuan hidrogen sulfida; III - penentuan indole: 1 - hasil negatif; 2 - hasil positif

Selain media tersebut, kemampuan mikroorganisme untuk mendegradasi berbagai substrat nutrisi ditentukan dengan menggunakan kertas cakram yang diresapi dengan reagen tertentu (sistem indikator kertas "SIB"). Disk ini dicelupkan ke dalam tabung reaksi dengan kultur yang sedang dipelajari, dan sudah setelah 3 jam inkubasi dalam termostat pada 37 ° C, dekomposisi karbohidrat, asam amino, protein, dll. dinilai berdasarkan perubahan warna disk.

Sifat hemolitik (kemampuan untuk menghancurkan sel darah merah) dipelajari pada media dengan darah. Dalam hal ini, media cair menjadi transparan, dan zona transparan muncul di sekitar koloni pada media padat (Gbr. 20). Ketika methemoglobin terbentuk, medium berubah menjadi hijau.

Beras. 20. Hemolisis di sekitar koloni yang tumbuh pada agar darah

Pelestarian tanaman

Tugas penyimpanan adalah untuk menjaga kelangsungan hidup mikroorganisme dan mencegah variabilitasnya. Untuk melakukan ini, perlu untuk melemahkan atau menghentikan pertukaran dalam sel mikroba.

Pemulihan tanaman kering. Ujung ampul dipanaskan dengan kuat dalam nyala api pembakar dan disentuh dengan kapas yang sedikit dibasahi dengan air dingin sehingga retakan mikro terbentuk pada kaca, di mana udara perlahan-lahan merembes ke dalam ampul. Pada saat yang sama, melewati tepi retakan yang dipanaskan, udara disterilkan.

* (Dengan kelebihan air pada swab, itu bisa masuk ke ampul dan melanggar sterilitas kultur: itu akan tersedot melalui microcracks yang terbentuk, karena ada ruang hampa di ampul.)

Perhatian! Jangan lupa bahwa ada ruang hampa di dalam ampul yang disegel. Jika udara langsung masuk melalui lubang besar, biakan dalam ampul dapat disemprotkan dan dikeluarkan.

Dimungkinkan juga untuk melestarikan budaya untuk waktu yang lama dalam nitrogen cair (-196 ° C) di perangkat khusus.

Metode pengawetan kultur jangka pendek adalah sebagai berikut: 1) subkultivasi (pemindahan berkala ke media segar) dengan interval tergantung pada sifat mikroorganisme, media dan kondisi budidaya. Kultur disimpan pada suhu 4°C di antara penyemaian ulang; 2) pengawetan di bawah lapisan minyak. Kultur ditumbuhkan dalam agar dalam kolom setinggi 5-6 cm, dituang dengan minyak vaselin steril (lapisan minyak sekitar 2 cm) dan disimpan secara vertikal di lemari es. Umur simpan mikroorganisme yang berbeda berbeda, oleh karena itu, kultur secara berkala ditaburkan dari tabung reaksi untuk memeriksa viabilitasnya; 3) penyimpanan pada -20-70 °C; 4) penyimpanan dalam tabung tertutup. Sesuai kebutuhan, bahan yang disimpan ditaburkan pada media segar.

pertanyaan tes

1. Apa yang termasuk dalam konsep "penelitian bakteriologis"?

2. Apa yang seharusnya menjadi budaya untuk penelitian semacam itu?

3. Apa yang dimaksud dengan koloni mikroba, kultur, galur, klon?

4. Apa yang termasuk dalam konsep "sifat budaya mikroba"?

Latihan

1. Pelajari dan jelaskan beberapa koloni. Pindahkan ke agar miring dan ke sektor.

2. Mempelajari dan mendeskripsikan pola pertumbuhan - kultur miring agar. Tentukan kemurnian dan morfologi kultur dalam sediaan yang diwarnai.

3. Pindahkan biakan dari agar miring ke media kaldu dan media diagnostik diferensial. Periksa dan catat dalam protokol pola pertumbuhan kultur pada media ini dan sifat enzimatiknya.

Portal untuk siswa. Latihan mandiri

KARAKTERISTIK ENZIM TANAH

PROSES ENZIMASI DALAM TANAH

Konsep aktivitas enzim

Dasar-dasar Kuantifikasi Aktivitas Enzim

ARTIKEL TERKAIT