In einer lebenden Zelle versiegt der Informationsfluss zwischen Zellkern und Zytoplasma nie, aber das Verstehen all seiner „Wendungen“ und das Entschlüsseln der darin kodierten Informationen ist eine wahrhaft titanische Aufgabe. Einer der wichtigsten Durchbrüche in der Biologie des letzten Jahrhunderts kann als die Entdeckung von Informations- (oder Template-) RNA-Molekülen (mRNA oder mRNA) angesehen werden, die als Vermittler dienen, die Informations-„Botschaften“ vom Zellkern (von Chromosomen) zu den übertragen Zytoplasma. Die entscheidende Rolle der RNA bei der Proteinsynthese wurde bereits 1939 in der Arbeit von Thorbjorn Kaspersson vorhergesagt ( Torbjörn Caspersson), Jean Brachet ( Jean Brachet) und Jack Schultz ( Jack Schulz) und 1971 von George Marbeis ( Georg Marbaix) lösten die Synthese von Hämoglobin in Frosch-Oozyten aus, indem sie die erste isolierte Kaninchen-Boten-RNA injizierten, die dieses Protein codiert.
In den Jahren 1956–1957 bewiesen A. N. Belozersky und A. S. Spirin in der Sowjetunion unabhängig voneinander die Existenz von mRNA und fanden auch heraus, dass der Großteil der RNA in einer Zelle keineswegs Matrix ist, sondern ribosomale RNA(rRNA). Ribosomale RNA – die zweite „Haupt“-Art zellulärer RNA – bildet das „Skelett“ und funktionelle Zentrum der Ribosomen in allen Organismen; es ist rRNA (und nicht Proteine), die die Hauptstadien der Proteinsynthese reguliert. Gleichzeitig wurde der dritte "Haupt"-RNA-Typ beschrieben und untersucht - Transfer-RNA (tRNA), die in Kombination mit den anderen beiden - mRNA und rRNA - einen einzigen proteinsynthetisierenden Komplex bilden. Nach der recht populären Hypothese der „RNA-Welt“ war diese Nukleinsäure der eigentliche Ursprung des Lebens auf der Erde.
Da RNA im Vergleich zu DNA viel hydrophiler ist (durch den Ersatz von Desoxyribose durch Ribose), ist sie labiler und kann sich relativ frei in der Zelle bewegen und somit kurzlebige Repliken der genetischen Information (mRNA) liefern zum Ort der Proteinsynthese. Es sollte jedoch auf die damit verbundenen „Unannehmlichkeiten“ hingewiesen werden – RNA ist sehr instabil. Es wird viel schlechter gespeichert als DNA (sogar innerhalb der Zelle) und wird bei der geringsten Änderung der Bedingungen (Temperatur, pH-Wert) abgebaut. Neben der „eigenen“ Instabilität kommt ein großer Beitrag von Ribonukleasen (oder RNasen) – einer Klasse von RNA-spaltenden Enzymen, sehr stabil und „ubiquitär“ – sogar die Haut der Hände des Experimentators enthält eine ausreichende Menge dieser Enzyme, um sie zu überqueren das gesamte Experiment aus. Aus diesem Grund ist die Arbeit mit RNA viel schwieriger als mit Proteinen oder DNA – letztere können in der Regel Hunderttausende von Jahren ohne oder mit geringen Schäden gelagert werden.
Fantastische Genauigkeit bei der Arbeit, Tridistylat, sterile Handschuhe, Einweg-Laborglaswaren - all dies ist notwendig, um den RNA-Abbau zu verhindern, aber die Einhaltung solcher Standards war nicht immer möglich. Daher wurden lange Zeit kurze „Fragmente“ von RNA, die zwangsläufig Lösungen verschmutzten, einfach ignoriert. Im Laufe der Zeit wurde jedoch deutlich, dass trotz aller Bemühungen, die Sterilität des Arbeitsbereichs aufrechtzuerhalten, natürlich weiterhin „Trümmer“ nachgewiesen wurden, und dann stellte sich heraus, dass sich im Zytoplasma immer Tausende von kurzen doppelsträngigen RNAs befinden die ganz bestimmte Funktionen erfüllen und für eine normale Entwicklung absolut notwendig sind Zellen und Organismen.
Prinzip der RNA-Interferenz
Auch Pharmazeuten interessieren sich für die Möglichkeit des Einsatzes von siRNA, da die Möglichkeit, die Arbeit einzelner Gene direkt zu regulieren, ungeahnte Perspektiven bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten verspricht. Die geringe Größe und hohe Wirkspezifität versprechen eine hohe Wirksamkeit und geringe Toxizität von siRNA-basierten Arzneimitteln; löse das problem aber Lieferung siRNA an erkrankte Zellen im Körper zu bringen, ist bisher noch nicht gelungen – Grund dafür ist die Fragilität und Zerbrechlichkeit dieser Moleküle. Und obwohl jetzt Dutzende von Teams versuchen, einen Weg zu finden, diese „Wunderkugeln“ genau auf das Ziel (in erkrankten Organen) zu richten, haben sie noch keinen sichtbaren Erfolg erzielt. Darüber hinaus gibt es weitere Schwierigkeiten. Beispielsweise kann bei einer antiviralen Therapie die hohe Selektivität der Wirkung von siRNA ein Bärendienst sein – da Viren schnell mutieren, wird der modifizierte Stamm sehr schnell die Empfindlichkeit gegenüber der zu Beginn der Therapie ausgewählten siRNA verlieren: das ist bekannt der Austausch von nur einem Nukleotid in siRNA führt zu einer signifikanten Verringerung der Interferenzwirkung.
An dieser Stelle sei noch einmal daran erinnert, dass siRNAs gefunden wurden nur in Pflanzen, Wirbellosen und Einzellern; Obwohl Homologe von Proteinen für die RNA-Interferenz (Dicer, RISC-Komplex) auch in höheren Tieren vorhanden sind, wurden siRNAs mit herkömmlichen Methoden nicht nachgewiesen. Was für eine Überraschung war es, als künstlich eingeführt Synthetische siRNA-Analoga erzeugten in Säugerzellkulturen eine starke spezifische dosisabhängige Wirkung! Dies bedeutete, dass die RNA-Interferenz in Wirbeltierzellen nicht durch komplexere Immunsysteme ersetzt wurde, sondern sich zusammen mit Organismen entwickelte und zu etwas „Fortschrittlicherem“ wurde. Folglich war es notwendig, bei Säugetieren nicht nach exakten Analoga von siRNAs zu suchen, sondern nach ihren evolutionären Nachfolgern.
Spieler Nr. 2 – miRNA
Tatsächlich haben höher entwickelte Organismen auf der Grundlage des evolutionär recht alten Mechanismus der RNA-Interferenz zwei spezialisierte Systeme zur Steuerung der Arbeit von Genen entwickelt, von denen jedes seine eigene Gruppe kleiner RNAs verwendet - miRNA(microRNA) und piRNA(piRNA, Piwi-interagierende RNA). Beide Systeme tauchten in Schwämmen und Hohltieren auf und entwickelten sich zusammen mit ihnen, wobei sie siRNA und den Mechanismus der "nackten" RNA-Interferenz verdrängten. Ihre Rolle bei der Bereitstellung von Immunität nimmt ab, da diese Funktion von fortgeschritteneren Mechanismen der zellulären Immunität, insbesondere dem Interferonsystem, übernommen wurde. Dieses System ist jedoch so empfindlich, dass es auch auf siRNA selbst wirkt: Das Auftreten kleiner doppelsträngiger RNAs in einer Säugetierzelle löst ein „Alarmsignal“ aus (aktiviert die Sekretion von Interferon und bewirkt die Expression von Interferon-abhängigen Genen, die blockiert alle Übersetzungsprozesse vollständig). In dieser Hinsicht wird der Mechanismus der RNA-Interferenz bei höheren Tieren hauptsächlich durch microRNA und piRNA vermittelt, einzelsträngige Moleküle mit einer spezifischen Struktur, die vom Interferonsystem nicht erkannt werden.
Als das Genom komplexer wurde, wurden miRNAs und piRNAs zunehmend an der Regulation von Transkription und Translation beteiligt. Im Laufe der Zeit entwickelten sie sich zu einem zusätzlichen, präzisen und subtilen System der Genomregulation. Im Gegensatz zu siRNAs werden miRNAs und piRNAs (entdeckt 2001, siehe Kasten 3) nicht aus fremden doppelsträngigen RNA-Molekülen hergestellt, sondern zunächst im Genom des Wirts kodiert.
Lernen Sie microRNA kennen
Der microRNA-Vorläufer wird von beiden Strängen der genomischen DNA durch RNA-Polymerase II transkribiert, was zu einer Zwischenform, pri-miRNA, führt, die die Merkmale herkömmlicher mRNA trägt – m 7 G-Kappe und polyA-Schwanz. Dieser Vorläufer bildet eine Schleife mit zwei einzelsträngigen „Schwänzen“ und mehreren ungepaarten Nukleotiden in der Mitte (Abb. 3). Eine solche Schleife durchläuft eine zweistufige Prozessierung (Abb. 4): Zuerst schneidet die Drosha-Endonuklease einzelsträngige RNA-„Schwänze“ von der Haarnadel ab, danach wird die geschnittene Haarnadel (Prä-Mikro-RNA) in das Zytoplasma exportiert, wo sie sich befindet es wird von Dicer erkannt, der zwei weitere Schnitte macht (ein doppelsträngiger Bereich wird ausgeschnitten). , in Abb. 3 farblich gekennzeichnet. In dieser Form ist reife miRNA, ähnlich wie siRNA, im RISC-Komplex enthalten.
Abbildung 3. Struktur eines doppelsträngigen microRNA-Vorläufermoleküls. Hauptmerkmale: das Vorhandensein von konservierten Sequenzen, die eine Haarnadel bilden; das Vorhandensein einer komplementären Kopie (microRNA*) mit zwei „zusätzlichen“ Nukleotiden am 3'-Ende; spezifische Sequenz (2–8 bp), die die Erkennungsstelle für Endonukleasen bildet. Die microRNA selbst ist rot hervorgehoben – das schneidet Dicer aus.
Der Wirkungsmechanismus vieler microRNAs ähnelt dem von siRNAs: Eine kurze (21–25 Nukleotide) einzelsträngige RNA im RISC-Proteinkomplex bindet mit hoher Spezifität an eine komplementäre Stelle in der 3'-untranslatierten Region der Ziel-mRNA . Die Bindung führt zur Spaltung der mRNA durch das Ago-Protein. Allerdings ist die Aktivität von microRNAs (im Vergleich zu siRNAs) bereits differenzierter – wenn die Komplementarität nicht absolut ist, wird die Ziel-mRNA möglicherweise nicht abgebaut, sondern nur reversibel blockiert (es findet keine Translation statt). Derselbe RISC-Komplex kann auch verwendet werden künstlich eingeführt siRNA. Dies erklärt, warum siRNAs, hergestellt in Analogie zu Protozoen, auch in Säugetieren aktiv sind.
Somit können wir die Darstellung des Wirkmechanismus der RNA-Interferenz in höheren (bilateral symmetrischen) Organismen vervollständigen, indem wir das Wirkschema von microRNAs und biotechnologisch eingeführten siRNAs in einer Abbildung zusammenfassen (Abb. 5).
Abbildung 5. Verallgemeinertes Wirkungsschema künstlicher miRNAs und siRNAs(künstliche siRNAs werden mit spezialisierten Plasmiden in die Zelle eingebracht - Targeting-siRNA-Vektor).
Funktionen von miRNA
Die physiologischen Funktionen von miRNAs sind äußerst vielfältig; tatsächlich fungieren sie als die wichtigsten Nicht-Protein-Regulatoren der Ontogenese. miRNAs heben das "klassische" Schema der Genregulation (Induktoren, Suppressoren, Chromatinverdichtung usw.) nicht auf, sondern ergänzen es. Darüber hinaus wird die Synthese von microRNAs selbst auf komplexe Weise reguliert (bestimmte Pools von microRNAs können durch Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und viele andere Zytokine angeschaltet werden). Als Ergebnis entsteht ein mehrstufiges Netzwerk zum Aufbau eines „Orchesters“ aus Tausenden von Genen, das in seiner Komplexität und Flexibilität erstaunlich ist, aber das ist noch nicht das Ende der Sache.
microRNAs sind „universeller“ als siRNAs: „Warte“-Gene müssen nicht zu 100 % komplementär sein – die Regulation erfolgt auch mit partieller Interaktion. Eines der heißesten Themen in der Molekularbiologie ist heute die Suche nach microRNAs, die als alternative Regulatoren bekannter physiologischer Prozesse fungieren. Beispielsweise wurden bereits miRNAs beschrieben, die an der Regulation des Zellzyklus und der Apoptose in Pflanzen, Drosophila und Nematoden beteiligt sind; Beim Menschen regulieren miRNAs das Immunsystem und die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen. Der Einsatz von Technologien auf Basis von Biochips (Mikroarray-Screening) hat gezeigt, dass ganze Pools kleiner RNAs in verschiedenen Stadien des Zelllebens an- und abgeschaltet werden. Für biologische Prozesse wurden Dutzende spezifischer microRNAs identifiziert, deren Expressionsniveau sich unter bestimmten Bedingungen tausendfach ändert, was die außergewöhnliche Kontrollierbarkeit dieser Prozesse unterstreicht.
Bis vor kurzem glaubte man, dass microRNAs nur die Arbeit von Genen ganz oder teilweise unterdrücken. Kürzlich stellte sich jedoch heraus, dass die Wirkung von miRNAs je nach Zustand der Zelle radikal unterschiedlich sein kann! In einer sich aktiv teilenden Zelle bindet miRNA an eine komplementäre Sequenz in der 3'-Stelle der mRNA und hemmt die Proteinsynthese (Translation). In einem Ruhe- oder Stresszustand (z. B. beim Wachstum auf einem schlechten Medium) führt dasselbe Ereignis jedoch zum gegenteiligen Effekt - einer Steigerung der Synthese des Zielproteins!
Evolution von miRNA
Die Anzahl der microRNA-Sorten in höheren Organismen ist noch nicht vollständig geklärt - einigen Daten zufolge übersteigt sie 1% der Anzahl der proteinkodierenden Gene (beim Menschen sprechen sie beispielsweise von 700 microRNAs, und diese Zahl ist konstant wachsend). microRNAs regulieren die Aktivität von etwa 30 % aller Gene (Ziele für viele von ihnen sind noch nicht bekannt), und es gibt sowohl allgegenwärtige als auch gewebespezifische Moleküle – zum Beispiel reguliert ein solcher wichtiger Pool von microRNAs die Reifung von Blutstammzellen .
Das breite Expressionsprofil in verschiedenen Geweben verschiedener Organismen und die biologische Häufigkeit von miRNAs weisen auf einen evolutionär alten Ursprung hin. Zum ersten Mal wurden miRNAs in Nematoden gefunden, und lange Zeit glaubte man, dass diese Moleküle nur in Schwämmen und Hohltieren vorkommen; Später wurden sie jedoch auch in einzelligen Algen entdeckt. Interessanterweise nehmen mit zunehmender Komplexität von Organismen auch die Anzahl und Heterogenität des microRNA-Pools zu. Dies weist indirekt darauf hin, dass die Komplexität dieser Organismen insbesondere durch die Funktionsweise von miRNAs gegeben ist. Die mögliche Evolution von miRNA ist in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 6. Diversität von miRNAs in verschiedenen Organismen. Je höher die Organisation des Organismus ist, desto mehr miRNAs finden sich darin (die Zahl in Klammern). Arten sind in denen rot markiert Single miRNA.
Zwischen siRNA und microRNA lässt sich anhand folgender Tatsachen eine klare evolutionäre Verwandtschaft feststellen:
- die Wirkung beider Arten ist austauschbar und wird durch homologe Proteine vermittelt;
- siRNAs, die in Säugerzellen eingeführt werden, „schalten“ spezifisch die notwendigen Gene aus (trotz einer gewissen Aktivierung des Interferonschutzes);
- miRNAs werden in immer mehr alten Organismen gefunden.
Diese und andere Daten deuten darauf hin, dass beide Systeme von einem gemeinsamen "Vorfahren" abstammen. Es ist auch interessant festzustellen, dass die "RNA"-Immunität als unabhängiger Vorläufer von Protein-Antikörpern die Theorie des Ursprungs der ersten Lebensformen auf der Grundlage von RNA und nicht von Proteinen bestätigt (erinnern Sie sich, dass dies die Lieblingstheorie des Akademiemitglieds A. S. Spirin ist).
Je weiter, desto verwirrender. Spieler Nr. 3 – piRNA
Während es auf dem Gebiet der Molekularbiologie nur zwei "Spieler" gab - siRNA und microRNA - schien der Hauptzweck der RNA-Interferenz völlig klar zu sein. Tatsächlich: Eine Reihe homologer kurzer RNAs und Proteine in verschiedenen Organismen führt ähnliche Aktionen aus; Je komplexer Organismen werden, desto komplexer wird auch ihre Funktionalität.
Die Natur hat jedoch im Laufe der Evolution ein weiteres, evolutionär neuestes und hochspezialisiertes System geschaffen, das auf demselben Erfolgsprinzip der RNA-Interferenz basiert. Die Rede ist von piRNA (piRNA, von Piwi-Interaktions-RNA).
Je komplexer das Genom organisiert ist, desto weiter entwickelt und angepasst ist der Organismus (oder umgekehrt? ;-). Die Zunahme der Komplexität des Genoms hat jedoch eine Kehrseite: Das genetische System wird komplexer instabil. Dies führt zu der Notwendigkeit von Mechanismen, die für die Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms verantwortlich sind – andernfalls wird es durch spontanes „Mischen“ von DNA einfach deaktiviert. Bewegliche genetische Elemente ( SHP) - einer der Hauptfaktoren der Genominstabilität - sind kurze instabile Regionen, die autonom transkribiert werden und durch das Genom wandern können. Die Aktivierung solcher transponierbarer Elemente führt zu mehreren DNA-Brüchen in Chromosomen, die mit tödlichen Folgen verbunden sind.
Die Anzahl der MGEs steigt nichtlinear mit der Genomgröße, und ihre Aktivität muss kontrolliert werden. Tiere, die bereits mit Hohltieren beginnen, nutzen dazu das gleiche Phänomen der RNA-Interferenz. Diese Funktion übernehmen auch kurze RNAs, allerdings nicht die bereits besprochenen, sondern deren dritte Art, die piRNAs.
"Porträt" von piRNA
piRNA-Funktionen
Die Hauptfunktion von piRNA ist die Unterdrückung der MGE-Aktivität auf der Ebene der Transkription und Translation. Es wird angenommen, dass piRNAs nur während der Embryogenese aktiv sind, wenn ein unvorhersehbares Mischen des Genoms besonders gefährlich ist und zum Tod des Embryos führen kann. Das ist logisch – wenn das Immunsystem noch nicht funktioniert hat, brauchen die Zellen des Embryos einen einfachen, aber effektiven Schutz. Vor äußeren Krankheitserregern ist der Embryo durch die Plazenta (oder Eierschale) zuverlässig geschützt. Daneben ist aber auch die Abwehr körpereigener (innerer) Viren, vor allem MGE, erforderlich.
Diese Rolle der piRNA wurde durch Erfahrung bestätigt – „Knockout“ oder Mutationen der Ago3-, Piwi- oder Aub-Gene führen zu schweren Entwicklungsstörungen (und einem starken Anstieg der Anzahl von Mutationen im Genom eines solchen Organismus) und verursachen sie auch Unfruchtbarkeit durch gestörte Entwicklung der Keimzellen.
Verteilung und Evolution von piRNA
Die ersten piRNAs werden bereits in Seeanemonen und Schwämmen gefunden. Pflanzen gingen anscheinend den anderen Weg - Piwi-Proteine wurden in ihnen nicht gefunden, und die Rolle einer "Mündung" für Transposons wird von der Ago4-Endonuklease und siRNA übernommen.
Bei höheren Tieren, einschließlich Menschen, ist das piRNA-System sehr gut entwickelt, aber es kann nur in embryonalen Zellen und im Amnion-Endothel gefunden werden. Warum die Verteilung von piRNA im Körper so begrenzt ist, bleibt abzuwarten. Es kann davon ausgegangen werden, dass piRNA wie jede mächtige Waffe nur unter ganz bestimmten Bedingungen (während der fötalen Entwicklung) nützlich ist, und in einem erwachsenen Organismus wird ihre Aktivität mehr schaden als nützen. Dennoch ist die Anzahl der piRNAs um eine Größenordnung größer als die Anzahl bekannter Proteine, und die unspezifischen Wirkungen von piRNAs in reifen Zellen sind schwer vorherzusagen.
| siRNA | miRNA | piRNA | |
|---|---|---|---|
| Verbreitung | Pflanzen, Drosophila, C.elegans. Bei Wirbeltieren nicht gefunden | Eukaryoten | Embryonale Zellen von Tieren (beginnend mit Hohltieren). Nicht in Protozoen und Pflanzen |
| Länge | 21–22 Nukleotide | 19–25 Nukleotide | 24–30 Nukleotide |
| Struktur | Doppelsträngig, 19 komplementäre Nukleotide und zwei ungepaarte Nukleotide am 3'-Ende | Einzelsträngige komplexe Struktur | Einzelsträngige komplexe Struktur. U am 5'-Ende, 2'- Ö-methyliertes 3'-Ende |
| wird bearbeitet | Dicer-abhängig | Dicer-abhängig | Dicer-unabhängig |
| Endonukleasen | Vor2 | Vor1, Vor2 | Ago3, Piwi, Aub |
| Aktivität | Abbau komplementärer mRNAs, Acetylierung genomischer DNA | Abbau oder Hemmung der Ziel-mRNA-Translation | Abbau von mRNA, die MGE codiert, Regulierung der MGE-Transkription |
| Biologische Rolle | Antivirale Immunabwehr, Unterdrückung der Aktivität der eigenen Gene | Regulation der Genaktivität | Unterdrückung der MGE-Aktivität während der Embryogenese |
Fazit
Abschließend möchte ich eine Tabelle geben, die die Evolution des an der RNA-Interferenz beteiligten Proteinapparats veranschaulicht (Abb. 9). Es ist ersichtlich, dass Protozoen das am weitesten entwickelte siRNA-System haben (Proteinfamilien Ago, Dicer), und mit der Komplikation von Organismen verlagert sich der Schwerpunkt auf spezialisiertere Systeme - die Anzahl der Proteinisoformen für microRNA (Drosha, Pasha) und piRNA ( Piwi, Henne1) nimmt zu. Gleichzeitig nimmt die Vielfalt der Enzyme ab, die die Wirkung von siRNA vermitteln.
Abbildung 9. Verschiedene Proteine, die an der RNA-Interferenz beteiligt sind(Zahlen geben die Anzahl der Proteine in jeder Gruppe an). in Blau Elemente, die für siRNA und microRNA charakteristisch sind, sind hervorgehoben, und rot- Protein und mit piRNA assoziiert.
Das Phänomen der RNA-Interferenz wurde von den einfachsten Organismen genutzt. Basierend auf diesem Mechanismus hat die Natur einen Prototyp des Immunsystems geschaffen, und je komplexer Organismen werden, desto mehr wird die RNA-Interferenz zu einem unverzichtbaren Regulator der Genomaktivität. Zwei verschiedene Mechanismen plus drei Arten von kurzen RNAs ( cm. Tab. 1) - als Ergebnis sehen wir Tausende von subtilen Regulatoren verschiedener metabolischer und genetischer Wege. Dieses eindrucksvolle Bild verdeutlicht die Vielseitigkeit und evolutionäre Anpassung molekularbiologischer Systeme. Kurze RNAs beweisen einmal mehr, dass es in der Zelle keine „Kleinigkeiten“ gibt, sondern nur kleine Moleküle, deren Bedeutung wir gerade erst zu verstehen beginnen.
(Richtig, solch eine fantastische Komplexität spricht eher dafür, dass die Evolution „blind“ ist und ohne einen vorab genehmigten „Masterplan“ funktioniert“;
BIN. Deichman, S. V. Sinowjew, A. Yu. Baryshnikov
GENEXPRESSION UND KLEINE RNA IN DER ONKOLOGIE
GU RONTS im. N.N.Blokhina RAMS, Moskau
ZUSAMMENFASSUNG
Der Artikel stellt die Rolle kleiner RNAs vor, die die meisten lebenswichtigen Funktionen der Zelle und des Körpers steuern, und ihre mögliche Verbindung, insbesondere mit der Onkogenese und anderen (einschließlich hypothetischen) intrazellulären Mechanismen der genomischen Expression.
Stichworte Schlüsselwörter: kleine RNAs, RNA-Interferenz (RNAi), doppelsträngige RNA (lncRNA), RNA-Editierung, Onkogenese.
BIN. Deichmann, S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.
DIE GENEXPRESSION UND KLEINE RNAS IN DER ONKOLOGIE
N.N. Blochin Russisches Krebsforschungszentrum RAMS, MoskauAu
ABSTRAKT
In der Veröffentlichung wird die Rolle kleiner RNAs, die die meisten lebenswichtigen Funktionen von Zellen und Organismen überwachen, und ihre mögliche Verbindung insbesondere mit der Onkogenese und anderen (einschließlich hypothetischen) intrazellulären Mechanismen der Genomexpression vorgelegt.
Schlüsselwörter: Kleine RNAs, Interferenz-RNAs (RNAi), Doppelstrang-RNAs (dsRNAs), RNA-Editierung, Tumorentstehung.
Einführung
Die Expression einzelner Gene und ganzer eukaryotischer Genome, einschließlich Prozessierung, verschiedene Arten der Transkription, Spleißen, Umlagerungen, RNA-Editierung, Rekombinationen, Translation, RNA-Interferenz, wird durch einige Proteine reguliert (Produkte regulatorischer, struktureller, homöotischer Gene, Transkriptionsfaktoren) , mobile Elemente, RNA und niedermolekulare Effektoren. Prozessierende RNAs umfassen rRNA, tRNA, mRNA, einige regulatorische RNAs und kleine RNAs.
Bis heute ist bekannt, dass kleine RNAs kein Protein kodieren, oft Hunderte pro Genom zählen und an der Regulation der Expression verschiedener eukaryotischer Gene (somatisch, Immun, Keimbahn, Stammzellen) beteiligt sind. Unter Kontrolle sind die Prozesse der Differenzierung (Hämatopoese, Angiogenese, Adipogenese, Myogenese, Neurogenese), Morphogenese (einschließlich embryonaler Stadien, Entwicklung/Wachstum, physiologische Regulation), Proliferation, Apoptose, Karzinogenese, Mutagenese, Immunogenese, Alterung (Lebensverlängerung), epigenetische Stilllegung; Fälle von Stoffwechselregulation (z. B. Glykosphingolipide) wurden festgestellt. Eine breitere Klasse von nicht-kodierenden RNAs von 20-300/500 Nukleotiden und ihre RNPs wurden nicht nur im Zellkern/Nukleolus/Zytoplasma gefunden, sondern auch in DNA-haltigen Zellorganellen (tierischen Mitochondrien; in Pflanzen Mikro-RNAs und Sequenzen von kleiner RNA).
Für die Verwaltung und Regulierung von V.N. Prozesse ist es wichtig: 1. dass kleine natürliche/künstliche RNAs (kleine RNAs, tRNAs usw.) und ihre Komplexe mit Proteinen (RNPs) zum transmembranen zellulären und mitochondrialen Transport fähig sind; 2. dass nach dem Zusammenbruch der Mitochondrien ein Teil ihres Inhalts, RNA und RNP, im Zytoplasma und Zellkern landen kann. Die aufgeführten Eigenschaften von kleinen RNAs (RNPs), deren funktionell bedeutsame Rolle im Laufe des Studiums immer mehr zunimmt, stehen offensichtlich in Zusammenhang mit dem Wachheitsfaktor gegenüber Krebs und anderen genetischen Erkrankungen. Gleichzeitig wurde die hohe Bedeutung epigenomischer Modifikationen des Chromatins bei der Entstehung von Tumoren deutlich. Wir werden nur eine sehr begrenzte Anzahl von Fällen aus vielen ähnlichen Fällen betrachten.
Kleine RNA
Der Wirkungsmechanismus kleiner RNAs ist ihre Fähigkeit, fast komplementär an 3'-untranslatierte Regionen (3'-UTRs) von Ziel-mRNAs (die manchmal DNA/RNA-transponierende MIR/LINE-2-Elemente sowie konservierte Alu-Wiederholungen enthalten) zu binden ) und induzieren RNA-Interferenz (RNAi=RNAi; insbesondere bei einer antiviralen Reaktion). Die Komplikation besteht jedoch darin, dass es neben zellulären auch viruskodierte kleine RNAs (Herpes, SV40 usw.; EBV enthält beispielsweise 23 und KSHV – 12 miRNAs) gibt, die mit den Transkripten von interagieren Sowohl das Virus als auch der Wirt. Allein mehr als 5.000 zelluläre/virale miRNAs in 58 Arten sind bekannt. RNAi initiiert entweder den Abbau (unter Beteiligung des RISC-Komplexes, RNA-Induced Silencing Complex) an Nuklease-gefährdeten Fragmenten kontinuierlicher Helices von lncRNA (doppelsträngige RNA mRNA usw.) oder eine teilweise reversible Hemmung von diskontinuierlich gewundener lncRNA während der Translation von mRNA-Targets. Reife kleine RNAs (~15-28 Nukleotide) werden im Zytoplasma aus ihren Vorläufern unterschiedlicher Länge (zehn und hundert Nukleotide) gebildet, die im Zellkern verarbeitet werden. Darüber hinaus sind kleine RNAs an der Bildung der Silencing-Struktur von Chromatin, der Regulation der Transkription einzelner Gene, der Unterdrückung der Transposon-Expression und der Aufrechterhaltung der funktionellen Struktur ausgedehnter Heterochromatin-Abschnitte beteiligt.
Es gibt mehrere Haupttypen kleiner RNAs. MicroRNAs (miRNAs) und kleine interferierende RNAs (siRNAs) sind am besten untersucht. Außerdem werden unter den kleinen RNAs die folgenden untersucht: piRNAs, die in Keimbahnzellen aktiv sind; kleine interferierende RNAs, die mit endogenen Retrotransposons und sich wiederholenden Elementen assoziiert sind (mit lokaler/globaler Heterochromatisierung – beginnend mit den frühen Stadien der Embryogenese; halten das Telomerniveau aufrecht), Drosophia rasiRNAs; häufig kodiert durch Introns von Proteingenen und funktionell wichtig für Translation, Transkription, Spleißen (De-/Methylierung, Pseuduridylation von Nukleinsäuren) kleiner nuklearer (snRNAs) und nukleolärer (snoRNAs) RNAs; komplementär zu DNA-bindenden NRSE-(Neuron Restrictive Silenser Element)-Motiven kleine modulatorische RNAs, smRNAs, mit wenig bekannten Funktionen; transaktivierende kleine interferierende Pflanzen-RNAs, tasiRNAs; kurze Haarnadel-RNAs, shRNAs, die langfristige RNAi (persistentes Gen-Silencing) von langen lncRNA-Strukturen in der antiviralen Reaktion bei Tieren bereitstellen.
Kleine RNAs (miRNAs, siRNAs usw.) interagieren mit neu synthetisierten Transkripten des Zellkerns/Zytoplasmas (regulieren Spleißen, Translation von mRNA; Methylierung/Pseudouridylation von rRNA usw.) und Chromatin (mit zeitlich lokaler und epigenetisch vererbter Heterochromatinisierung von sich teilenden somatischen Keimzellen). Insbesondere die Heterochromatinisierung geht einher mit De-/Methylierung der DNA, sowie Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung von Histonen (Modifikation des „Histon-Codes“).
Die miRNAs des Fadenwurms Caenorhabditis elegans (lin-4), ihre Eigenschaften und Gene wurden als erste unter den kleinen RNAs entdeckt und untersucht, und etwas später die miRNAs der Pflanze Arabidopsis thaliana. Derzeit werden sie mit vielzelligen Organismen in Verbindung gebracht, obwohl sie in der einzelligen Alge Chlamydomonas reinhardtii gezeigt werden, und RNAi-ähnliche Silencing-Wege, in Verbindung mit antiviralem/ähnlichem Schutz, der sog. psiRNAs werden für Prokaryoten diskutiert. Die Genome vieler Eukaryoten (einschließlich Drosophila und Menschen) enthalten mehrere hundert miRNAs-Gene. Diese stadien-/gewebespezifischen Gene (sowie ihre entsprechenden Ziel-mRNA-Regionen) sind in phylogenetisch entfernten Arten oft hochgradig homolog, aber einige von ihnen sind abstammungsspezifisch. miRNAs sind in Exons (proteinkodierende, RNA-Gene), Introns (meistens Prä-mRNA), intergenische Spacer (einschließlich Wiederholungen) enthalten, haben eine Länge von bis zu 70-120 Nukleotiden (oder mehr) und bilden Loop/Stem-Haarnadeln Strukturen. Um ihre Gene zu bestimmen, werden nicht nur biochemische und genetische, sondern auch Computeransätze verwendet.
Die charakteristischste Länge der "Arbeitsregion" reifer miRNAs beträgt 21-22 Nukleotide. Dies sind vielleicht die zahlreichsten der nicht-proteinkodierenden Gene. Sie können als separate Kopien (häufiger) oder Cluster angeordnet sein, die viele ähnliche oder verschiedene miRNAs-Gene enthalten, die (nicht selten von autonomen Promotoren) als längere Vorläufer transkribiert und in mehreren Stufen zu einzelnen miRNAs prozessiert werden. Es wird angenommen, dass es ein regulatorisches miRNA-Netzwerk gibt, das viele grundlegende biologische Prozesse (einschließlich Onkogenese/Metastasierung) steuert; wahrscheinlich werden mindestens 30 % der vom Menschen exprimierten Gene durch miRNAs reguliert.
An diesem Prozess sind die lncRNA-spezifischen RNase-III-ähnlichen Enzyme Drosha (nukleare Ribonuklease; initiiert die Verarbeitung von Intron-prä-miRNAs nach dem Spleißen des Haupttranskripts) und Dicer beteiligt, das im Zytoplasma wirkt und Haarnadel-Prä-miRNAs spaltet bzw. abbaut. miRNAs (zu reifen miRNAs). ) und später hybride miRNAs/mRNA-Strukturen. Kleine RNAs werden zusammen mit mehreren Proteinen (u. a. h.p. RNasen, Proteine der AGO-Familie, Transmethylasen / Acetylasen etc.) und unter Beteiligung der sog. RISC- und RITS-ähnliche Komplexe (der zweite induziert Transkriptions-Silencing) sind jeweils in der Lage, RNAi/Abbau und anschließendes Gen-Silencing auf RNA- (vor/während der Translation) und DNA-Ebene (während der Transkription von Heterochromatin) zu induzieren.
Jede miRNA paart sich potenziell mit mehreren Zielen, und jedes Ziel wird von einer Reihe von miRNAs kontrolliert (ähnlich der gRNAs-vermittelten Prä-mRNA-Bearbeitung in Trypanosomen-Kinetoplasten). In-vitro-Analysen zeigten, dass die miRNA-Regulation (sowie die RNA-Bearbeitung) ein wichtiger posttranskriptioneller Modulator der Genexpression ist. Ähnliche miRNAs, die um dasselbe Ziel konkurrieren, sind potenzielle Transregulatoren von RNA-RNA- und RNA-Protein-Interaktionen.
Bei Tieren werden miRNAs am besten für den Nematoden Caenorhabditis Elegans untersucht; über 112 Gene wurden beschrieben. Hier wurden auch Tausende von endogenen siRNAs gefunden (es gibt keine Gene; sie sind insbesondere assoziiert mit Spermatogenese-vermittelten Transkripten und Transposons). Beide kleinen multizellulären RNAs können durch RNA-Polymerasen erzeugt werden, die Aktivität (keine Homologie) von RdRP-II- (wie für die meisten anderen RNAs) und RdRP-III-Typen zeigen. Reife kleine RNAs sind in Zusammensetzung (einschließlich terminaler 5'-Phosphate und 3'-OH), Länge (typischerweise 21–22 Nukleotide) und Funktion ähnlich und können um dasselbe Ziel konkurrieren. Der RNA-Abbau ist jedoch häufiger mit siRNAs verbunden, selbst wenn das Ziel vollständig komplementär ist; translationale Repression mit partieller Komplementarität mit miRNAs, normalerweise 5-6 Nukleotide; bzw. die Vorläufer sind exo-/endogen (Hunderte/Tausende von Nukleotiden) für siRNAs und gewöhnlich endogen (Zehner/Hunderte von Nukleotiden) für miRNAs, und ihre Biogenese ist unterschiedlich; in einigen Systemen sind diese Unterschiede jedoch reversibel.
Durch siRNAs und miRNAs vermittelte RNAi hat eine Vielzahl natürlicher Rollen: von der Regulation der Genexpression und des Heterochromatins bis zum Schutz des Genoms vor Transposons und Viren; aber siRNAs und einige miRNAs sind zwischen Arten nicht konserviert. Pflanzen (Arabidopsis thaliana) haben: siRNAs, die sowohl Genen als auch intergenischen (einschließlich Spacern, Repeats) Regionen entsprechen; eine große Anzahl potenzieller Genomstellen für verschiedene Arten kleiner RNAs. Nematoden haben auch sog. variable autonom exprimierte 21U-RNAs (dasRNAs); sie haben 5"-Y-Monophosphat, machen 21 Nukleotide aus (20 davon sind variabel) und befinden sich zwischen oder innerhalb der Introns von proteinkodierenden Genen an mehr als 5700 Stellen in zwei Regionen von Chromosom IV.
MiRNAs spielen eine wichtige Rolle bei der Genexpression bei Gesundheit und Krankheit; ein Mensch hat mindestens 450-500 solcher Gene. Indem sie normalerweise an die 3"-UTR-Regionen von mRNA (andere Ziele) binden, können sie selektiv und quantitativ (insbesondere wenn Produkte von schwach exprimierten Genen aus dem Kreislauf entfernt werden) die Arbeit einiger und die Aktivität anderer Gene blockieren. Es stellte sich heraus, dass sich die Profile der exprimierten Mikro-RNAs (und ihrer Ziele) während der Ontogenese, der Differenzierung von Zellen und Geweben, dynamisch ändern. Diese Änderungen sind spezifisch, insbesondere während der Kardiogenese, dem Prozess der Optimierung der Größe der Länge Dendriten und die Anzahl der Synapsen einer Nervenzelle (unter Beteiligung von miRNA-134, anderen kleinen RNAs), die Entwicklung vieler Pathologien (Onkogenese, Immundefekte, genetische Erkrankungen, Parkinsonismus, Alzheimer-Krankheit, Augenerkrankungen (Retinoblastom usw.) im Zusammenhang mit Infektionen verschiedener Art) Die Gesamtzahl der nachgewiesenen miRNAs wächst viel schneller als die Beschreibung ihrer regulatorischen Rolle und Assoziation mit spezifischen Zielen .
Die Computeranalyse sagt Hunderte von Ziel-mRNAs für einzelne miRNAs und die Regulierung einzelner mRNAs durch mehrere miRNAs voraus. Somit können miRNAs dazu dienen, Transkripte von Zielgenen zu eliminieren oder ihre Expression auf Transkriptions-/Translationsebene fein abzustimmen. Theoretische Überlegungen und experimentelle Ergebnisse unterstützen die Existenz unterschiedlicher Rollen für miRNAs.
Eine vollständigere Liste von Aspekten im Zusammenhang mit der grundlegenden Rolle kleiner RNAs in Eukaryoten in Wachstums-/Entwicklungsprozessen und in einigen Pathologien (einschließlich Krebs-Epigenomik) spiegelt sich in der Übersicht wider.
Kleine RNAs in der Onkologie
Die Prozesse des Wachstums, der Entwicklung, der Progression und der Metastasierung von Tumoren werden von vielen epigenetischen Veränderungen begleitet, die sich zu selteneren, dauerhaft vererbten genetischen Veränderungen entwickeln. Seltene Mutationen können jedoch viel Gewicht haben (für ein bestimmtes Individuum, Nosologie), weil. in Bezug auf einzelne Gene (z. B. APC, K-ras, p53), die sog. der „Trichter“-Effekt verbunden mit einer nahezu irreversiblen Entstehung/Folgen onkologischer Erkrankungen. Die tumorspezifische Heterogenität der Vorläuferzellen in Bezug auf das Expressionsprofil verschiedener Gene (Proteine, RNA, kleine RNA) ist auf gekoppelte Variationen umgelagerter epigenomischer Strukturen zurückzuführen. Das Epigenom wird moduliert durch Methylierung, posttranslationale Modifikationen/Substitutionen von Histonen (mit nicht-kanonischen), Umbau der nukleosomalen Struktur von Genen/Chromatin (einschließlich genomischer Prägung, d. h. Dysfunktion bei der Expression von Allelen der Elterngene und X Chromosomen). All dies führt unter Beteiligung von RNAi, die durch kleine RNAs reguliert wird, zum Auftreten defekter heterochromatischer (einschließlich hypomethylierter zentromerer) Strukturen.
Der Entstehung genspezifischer Mutationen kann zumindest bei Tumoren mit einem Mikrosatelliten-Mutator-Phänotyp (MMP) die bekannte Akkumulation von Hunderttausenden somatischer klonaler Mutationen in einfachen Wiederholungen oder Mikrosatelliten der nicht-kodierenden (selten kodierenden) Region vorausgehen. ; sie machen einen erheblichen Teil der kolorektalen, sowie Lungen-, Magen-, Endometriumkrebse etc. aus. Instabile Mono-/Heteronukleotid-Mikrosatelliten-Repeats (Poly-A6-10, ähnlich) werden um ein Vielfaches häufiger in regulatorischer Nichtkodierung gefunden Gene, die die Expression von Genen (Introns, intergenetisch) kontrollieren, als in den codierenden (Exons) Regionen des Genoms von Mikrosatelliten-instabilen, MSI+, Tumoren. Obwohl die Art des Auftretens und die Mechanismen der Lokalisierung von MS-stabilen/instabilen Regionen nicht vollständig klar sind, korrelierte die Bildung von MS-Instabilität mit der Häufigkeit von Mutationen vieler Gene, die nicht früher in MSI-positiven Tumoren mutierten und wahrscheinlich die Signalwege kanalisierten ihres Fortschreitens; außerdem erhöhte sich die Mutationsrate von MSI-Wiederholungen in diesen Tumoren um mehr als zwei Größenordnungen. Nicht alle Gene wurden auf das Vorhandensein von Wiederholungen analysiert, aber der Grad ihrer Mutabilität in codierenden/nicht codierenden Regionen ist unterschiedlich, und die Genauigkeit der Methoden zur Bestimmung der Mutationshäufigkeit ist relativ. Es ist wichtig, dass nicht-codierende Regionen für MSI-mutable Repeats häufig biallelisch sind, während codierende Regionen monoallelisch sind.
Eine globale Abnahme der Methylierung in Tumoren ist charakteristisch für Wiederholungen, transponierbare Elemente (MEs; ihre Transkription steigt), Promotoren, CpG-Stellen von Tumorsuppressor-miRNA-Genen und korreliert mit der Hypertranskription von Retrotransposons in fortgeschrittenen Krebszellen. Normalerweise sind „Methylom“-Schwankungen mit elterlichen/stadien-/gewebespezifischen „Methylierungswellen“ und starker Methylierung von zentromerischen Satellitenregionen von Heterochromatin, die durch kleine RNAs reguliert werden, verbunden. Wenn Satelliten untermethyliert sind, wird die gebildete Chromosomeninstabilität von einer Zunahme der Rekombination begleitet, und eine Verletzung der ME-Methylierung kann ihre Expression auslösen. Diese Faktoren begünstigen die Entwicklung des Tumorphänotyps. Die Small-RNA-Therapie kann hochspezifisch sein, sollte aber kontrolliert werden, weil Ziele können nicht nur einzelne, sondern auch viele mRNA/RNA-Moleküle und neu synthetisierte RNA verschiedener (einschließlich nicht-kodierender intergenischer Wiederholungen) Regionen von Chromosomen sein.
Der größte Teil des menschlichen Genoms besteht aus Repeats und TEs. Retrotransposon L1 (LINE-Element) enthält, wie endogene Retroviren, Reversetase (RTase), Endonuclease und ist möglicherweise in der Lage, nicht-autonome (Alu, SVA usw.) Retroelemente zu tragen; Die Stummschaltung von L1/ähnlichen Elementen erfolgt als Ergebnis der Methylierung an CpG-Stellen. Beachten Sie, dass unter den CpG-Stellen des Genoms CpG-Inseln von Genpromotoren schwach methyliert sind und 5-Methylcytosin selbst eine potenziell mutagene Base ist, die zu Thymin desaminiert wird (chemisch oder unter Beteiligung von RNA/(DNA)-Editierung, DNA Reparatur); Einige der CpG-Inseln unterliegen jedoch einer übermäßigen aberranten Methylierung, die von einer Unterdrückung des Suppressor-Gens und der Entwicklung von Krebs begleitet wird. Weiter: Das von L1 codierte RNA-bindende Protein, das mit den Proteinen AGO2 (der Argo-naute-Familie) und FMRP (fragile mental retardation, effector RISC-complex protein) interagiert, fördert die Bewegung des L1-Elements – was auf eine mögliche gegenseitige Regulation hinweist von Systemen RNAi und Retropositionen menschlicher LINE-Elemente. Wichtig ist insbesondere, dass Alu-Repeats in den Bereich des Intron/Exon-Raums von Genen vordringen können.
Diese und ähnliche Mechanismen können die pathologische Plastizität des Tumorzellgenoms verstärken. Die Unterdrückung von RTase (kodiert wie Endonuclease durch L1-Elemente; RTase wird auch durch endogene Retroviren kodiert) durch den RNAi-Mechanismus wurde von einer Abnahme der Proliferation und einer Zunahme der Differenzierung in einer Reihe von Krebszelllinien begleitet. Bei der Einführung des L1-Elements in ein Proto-Onkogen oder ein Suppressor-Gen wurden DNA-Doppelstrangbrüche beobachtet. In Geweben der Keimbahn (Maus/Mensch) ist das Niveau der L1-Expression erhöht, und seine Methylierung hängt vom piRNAs-(26-30-bp)-assoziierten Silencing-System ab, wobei PIWI-Proteine Varianten der großen Familie von Argo sind -naute-Proteine, Mutationen, die zu einer Demethylierung/Derepression von L1/like-Elementen mit langen terminalen Wiederholungen führen. Die Stummschaltungswege von rasiRNAs sind stärker mit PIWI-Proteinen assoziiert als mit Dicer-1/2- und Ago-Proteinen. Die piRNAs/siRNAs-vermittelten Silencing-Wege werden durch intranukleäre Körper realisiert, die große evolutionär konservierte Multiprotein-PcG-Komplexe enthalten, deren Funktionen in Tumorzellen oft beeinträchtigt sind. Diese Komplexe sind für die langreichweitige Wirkung (über mehr als 10 kb zwischen den Chromosomen) verantwortlich und regulieren den Cluster von HOX-Genen, die für den Körperplan verantwortlich sind.
Neue Prinzipien der Antisense-Therapie können unter Berücksichtigung des Wissens über hochspezifischere (als Histon-modifizierende Inhibitoren der DNA/Protein-Methylierung) epigenomische Antitumormittel, die grundlegenden Prinzipien des epigenomischen RNA-Silencing und die Rolle kleiner RNAs bei der Karzinogenese entwickelt werden.
Mikro-RNA in der Onkologie
Es ist bekannt, dass eine Zunahme des Tumorwachstums und der Metastasierung von einer Zunahme einiger und einer Abnahme der Expression anderer Individuen/Gruppen von miRNAs begleitet sein kann (Tabelle 1). Einige von ihnen können eine ursächliche Rolle bei der Onkogenese spielen; und sogar dieselben miRNAs (wie miR-21/-24) in verschiedenen Tumorzellen können sowohl onkogene als auch unterdrückende Eigenschaften aufweisen. Jede Art menschlicher bösartiger Tumore ist durch ihren "miRNA-Abdruck" klar unterscheidbar, und einige miRNAs können als Onkogene, Tumorsuppressoren, Initiatoren von Zellmigration, Invasion und Metastasierung fungieren. In pathologisch veränderten Geweben wird oft eine reduzierte Anzahl wichtiger miRNAs gefunden, die wahrscheinlich in den Anti-Krebs-Abwehrsystemen enthalten sind. miRNAs (miRs), die an der Onkogenese beteiligt sind, haben das Konzept der sogenannten gebildet. „oncomirax“: Die Analyse der Expression von mehr als 200 miRNAs aus mehr als 1000 Proben von Lymphomen und soliden Krebserkrankungen hat es ermöglicht, Tumore nach Herkunft und Differenzierungsstadium erfolgreich in Subtypen einzuteilen. Die Funktionen und Rolle von miRNAs werden erfolgreich untersucht unter Verwendung von: Anti-miR-Oligonukleotiden, modifiziert (um die Lebensdauer zu erhöhen) an 2'-O-Methyl- und 2'-O-Methoxyethylgruppen; sowie LNA-Oligonukleotide, bei denen die Sauerstoffatome der Ribose in den Positionen 2" und 4" durch eine Methylenbrücke verbunden sind.
(Tabelle 1)……………….
Tumor | miRNAs |
Lungenkrebs | 17-92 , let-7↓ , 124a↓ , 126 ↓ , 143 ↓ , 145 ↓ , 155 , 191 , 205 , 210 |
Brustkrebs | 21 , 125b↓ , 145 ↓ , 155 |
Prostatakrebs | 15a ↓ , 16-1 ↓ , 21 , 143 ↓ ,145 ↓ |
Darmkrebs | 19a , 21 , 143 ↓ , 145 ↓ |
Bauchspeicheldrüsenkrebs | 21 , 103 , 107 , 155 v |
Ovarialkarzinom | 210 |
Chronischer lymphatischer Leukämie | 15a ↓ , 16-1 ↓ , 16-2 , 23 b , 24-1 , 29 ↓ , 146 , 155 , 195 , 221 , 223 ↓ |
Tabelle 1 .
miRNAs, deren Expression zunimmt () oder abnimmt ( ↓ ) in einigen der häufigeren Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe (siehe auch ).
Es wird angenommen, dass die regulatorische Rolle der Expression, des Verschwindens und der Amplifikation von miRNA-Genen bei der Prädisposition für die Initiierung, das Wachstum und die Progression der meisten Tumoren signifikant ist und Mutationen in miRNA/mRNA-Zielpaaren synchronisiert sind. Das Expressionsprofil von miRNAs kann zur Klassifizierung, Diagnose und klinischen Prognose in der Onkologie verwendet werden. Veränderungen in der Expression von miRNAs können den Zellzyklus, das Überlebensprogramm der Zelle, beeinflussen. Mutationen von miRNAs in Stamm- und somatischen Zellen (sowie die Auswahl polymorpher Ziel-mRNA-Varianten) können zum Wachstum, Fortschreiten und zur Pathophysiologie vieler (wenn nicht aller) bösartiger Neubildungen beitragen oder sogar eine entscheidende Rolle dabei spielen. Mit Hilfe von miRNAs ist eine Apoptosekorrektur möglich.
Neben einzelnen miRNAs wurden deren Cluster gefunden, die als Onkogen wirken, das bei Versuchsmäusen insbesondere die Entstehung von hämatopoetischem Gewebekrebs provoziert; miRNAs-Gene mit onkogenen und Suppressor-Eigenschaften können sich im selben Cluster befinden. Die Clusteranalyse von miRNAs-Expressionsprofilen in Tumoren ermöglicht die Bestimmung ihres Ursprungs (Epithel, blutbildendes Gewebe usw.) und die Klassifizierung verschiedener Tumore desselben Gewebes mit nicht identischen Transformationsmechanismen. Das miRNAs-Expressionsprofiling kann unter Verwendung von Nano-/Mikroarrays durchgeführt werden; Die Genauigkeit einer solchen Klassifizierung erweist sich bei der Entwicklung der Technologie (was nicht einfach ist) als höher als bei der Verwendung von mRNA-Profilen. Einige der miRNAs sind an der Differenzierung hämatopoetischer Zellen (Maus, Mensch) beteiligt und leiten die Progression von Krebszellen ein. Menschliche miRNA-Gene befinden sich häufig in den sogenannten. „fragile“ Stellen, Bereiche mit überwiegenden Deletionen/Insertionen, Point Breaks, Translokationen, Transpositionen, minimal deletierbare und amplifizierte Heterochromatin-Regionen, die an der Onkogenese beteiligt sind.
Angiogenese . Die Rolle von miRNAs bei der Angiogenese ist wahrscheinlich signifikant. Eine Zunahme der Angiogenese in einigen Myc-aktivierten humanen Adenokarzinomen ging mit einer Veränderung des Expressionsmusters einiger miRNAs einher, während der Gen-Knockdown anderer miRNAs zu einer Schwächung und Unterdrückung des Tumorwachstums führte. Das Tumorwachstum wurde von Mutationen in K-ras-, Myc- und TP53-Genen, einer erhöhten Produktion des angiogenen VEGF-Faktors und dem Grad der Myc-assoziierten Vaskularisierung begleitet; während die antiangiogenen Faktoren Tsp1 und CTGF durch miR-17-92 und andere Cluster-assoziierte miRNAs unterdrückt wurden. Die Tumorangiogenese und Vaskularisierung wurden verstärkt (insbesondere in Kolonozyten), wenn zwei Onkogene in größerem Ausmaß koexprimiert wurden als eines.
Die Neutralisierung des antiangiogenen Faktors LATS2, eines Inhibitors der tierischen Cyclin-abhängigen Kinase (CDK2; Mensch/Maus), mit miRNAs-372/373 („potentielle Onkogene“) stimulierte das Wachstum von Hodentumoren, ohne das p53-Gen zu schädigen.
Potenzielle Modulatoren angiogenetischer Eigenschaften (in-vitro/in-vivo) sind miR-221/222, deren Ziele, c-Kit-Rezeptoren (andere), Angiogenesefaktoren von Nabelschnur-Endothelvenen-HUVEC-Zellen usw. sind. Diese miRNAs und c- Kit interagieren als Teil eines komplexen Zyklus, der die Fähigkeit von Endothelzellen steuert, neue Kapillaren zu bilden.
Chronische lymphatische Leukämie (CLL). Bei chronischer lymphatischer B-Zell-Leukämie (CLL) wird ein reduziertes Expressionsniveau der miR-15a/miR-16-1-Gene (und anderer) in der 13q14-Region des menschlichen Chromosoms festgestellt – der Stelle der häufigsten Struktur Anomalien (einschließlich Deletionen der 30-kb-Region), obwohl das Genom Hunderte von reifen und prähumanen miRNAs exprimierte. Beide in der Tumortherapie potenziell wirksamen miRNAs enthielten Antisense-Regionen des anti-apoptotischen Bcl2-Proteins, unterdrückten dessen Überexpression, stimulierten die Apoptose, fehlten aber in zwei Dritteln der streunenden CLL-Zellen fast/vollständig. Häufige Mutationen sequenzierter miRNAs in Stamm-/Körperzellen wurden bei 11 von 75 Patienten (14,7 %) mit familiärer Prädisposition für CLL (Vererbungsart unbekannt), nicht aber bei 160 gesunden Patienten identifiziert. Diese Beobachtungen lassen auf eine direkte Funktion von miRNAs bei der Leukämogenese schließen. Derzeit ist noch nicht alles über die Beziehung zwischen den Genexpressionsniveaus von miRNAs (und ihren Funktionen) und anderen Genen in normalen/Tumorzellen bekannt.
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Wissenschaftler glauben, dass die falsche Expression kleiner RNAs eine der Ursachen für eine Reihe von Krankheiten ist, die die Gesundheit vieler Menschen auf der ganzen Welt ernsthaft beeinträchtigen. Zu diesen Erkrankungen gehören kardiovaskuläre 23 und onkologische 24 . Letzteres ist nicht verwunderlich: Krebs weist auf Anomalien in der Entwicklung von Zellen und ihrem Schicksal hin, und kleine RNAs spielen bei den entsprechenden Prozessen eine entscheidende Rolle. Hier ist eines der aufschlussreichsten Beispiele für den enormen Einfluss, den kleine RNAs auf den Körper bei Krebs haben. Wir sprechen von einem bösartigen Tumor, der durch eine falsche Expression jener Gene gekennzeichnet ist, die während der anfänglichen Entwicklung des Organismus und nicht in der postnatalen Phase wirken. Dies ist eine Art von Hirntumor im Kindesalter, der normalerweise vor dem zweiten Lebensjahr auftritt. Leider ist dies eine sehr aggressive Form von Krebs, und die Prognose hier ist selbst bei intensiver Behandlung ungünstig. Der onkologische Prozess entwickelt sich als Folge einer falschen Umverteilung von genetischem Material in Gehirnzellen. Ein Promotor, der normalerweise eine starke Expression eines der proteinkodierenden Gene bewirkt, wird mit einem bestimmten Cluster kleiner RNAs rekombiniert. Dann wird diese gesamte umgeordnete Region amplifiziert, dh es werden viele Kopien davon im Genom erstellt. Folglich werden kleine RNAs, die sich "stromabwärts" des verschobenen Promotors befinden, viel stärker exprimiert, als sie sollten. Der Gehalt an aktiven kleinen RNAs ist etwa 150-1000-mal höher als die Norm.
Reis. 18.3. Durch Alkohol aktivierte kleine RNAs können an Boten-RNAs binden, die die Alkoholresistenz des Körpers nicht beeinträchtigen. Aber diese kleinen RNAs binden nicht an die Boten-RNA-Moleküle, die eine solche Resistenz fördern. Dies führt zu einer relativen Dominanz des Anteils an Boten-RNA-Molekülen, die für mit Alkoholresistenz assoziierte Proteinvariationen kodieren.
Dieser Cluster codiert über 40 verschiedene kleine RNAs. Tatsächlich ist dies im Allgemeinen der größte solcher Cluster, den Primaten haben. Es wird normalerweise nur in einem frühen Stadium der menschlichen Entwicklung, in den ersten 8 Wochen des embryonalen Lebens, exprimiert. Seine starke Aktivierung im kindlichen Gehirn führt zu einer katastrophalen Wirkung auf die genetische Expression. Eine Folge davon ist die Expression eines epigenetischen Proteins, das der DNA Modifikationen hinzufügt. Dies führt zu weitreichenden Veränderungen im gesamten DNA-Methylierungsmuster und damit zur abnormalen Expression aller Arten von Genen, von denen viele nur exprimiert werden sollten, wenn sich unreife Gehirnzellen in den frühen Stadien der Entwicklung eines Organismus teilen. So wird das Krebsprogramm in den Zellen des Babys gestartet 25 .
Eine ähnliche Kommunikation zwischen kleinen RNAs und der epigenetischen Hardware der Zelle kann einen erheblichen Einfluss auf andere Situationen haben, in denen Zellen eine Prädisposition für Krebs entwickeln. Dieser Mechanismus führt wahrscheinlich dazu, dass der Einfluss der Störung der Expression kleiner RNAs durch die Veränderung epigenetischer Modifikationen verstärkt wird, die von der Mutter auf Tochterzellen übertragen werden. Auf diese Weise kann ein Schema potenziell gefährlicher Veränderungen in der Art der Genexpression erstellt werden.
Bisher haben Wissenschaftler nicht alle Stadien der Interaktion kleiner RNAs mit epigenetischen Prozessen herausgefunden, aber sie schaffen es immer noch, einige Hinweise auf die Merkmale dessen zu bekommen, was passiert. So stellte sich beispielsweise heraus, dass eine bestimmte Klasse kleiner RNAs, die die Aggressivität von Brustkrebs erhöhen, auf bestimmte Enzyme in Boten-RNAs abzielt, die wichtige epigenetische Modifikationen entfernen. Dies verändert das Muster der epigenetischen Modifikationen in der Krebszelle und stört die genetische Expression weiter 26 .
Viele Formen von Krebs sind bei einem Patienten schwer nachzuverfolgen. Onkologische Prozesse können an schwer zugänglichen Stellen stattfinden, was die Probenahme erschwert. In solchen Fällen ist es für den Arzt nicht einfach, die Entwicklung des Krebsprozesses und das Ansprechen auf die Behandlung zu überwachen. Oft sind Ärzte gezwungen, sich auf indirekte Messungen zu verlassen – beispielsweise auf eine tomographische Aufnahme eines Tumors. Einige Forscher glauben, dass kleine RNA-Moleküle helfen könnten, eine neue Technik zur Überwachung der Entwicklung eines Tumors zu entwickeln, die es auch ermöglicht, seinen Ursprung zu untersuchen. Wenn Krebszellen sterben, verlassen kleine RNAs die Zelle, wenn sie aufbricht. Diese kleinen Junk-Moleküle bilden oft Komplexe mit zellulären Proteinen oder hüllen sich in Fragmente von Zellmembranen ein. Dadurch sind sie in Körperflüssigkeiten sehr stabil, sodass solche RNAs isoliert und analysiert werden können. Da ihre Anzahl gering ist, müssen die Forscher sehr empfindliche Analysemethoden anwenden. Allerdings ist hier nichts unmöglich: Die Sensitivität der Nukleinsäuresequenzierung nimmt stetig zu 27 . Es wurden Daten veröffentlicht, die das Versprechen dieses Ansatzes in Bezug auf Brustkrebs 28 , Eierstockkrebs 29 und eine Reihe anderer onkologischer Erkrankungen bestätigen. Die Analyse zirkulierender kleiner RNAs bei Lungenkrebspatienten zeigte, dass diese RNAs helfen, zwischen Patienten mit einem einzelnen Lungenknoten (die keiner Therapie bedürfen) und Patienten zu unterscheiden, die bösartige Tumorknoten entwickeln (die eine Behandlung benötigen) 30 .
), die die Translation von mRNA auf Ribosomen in das Protein, für das sie kodiert, verhindert. Letztlich ist der Effekt kleiner interferierender RNAs identisch mit dem einer einfachen Reduktion der Genexpression.
Kleine interferierende RNAs wurden 1999 von der Gruppe um David Baulcombe in Großbritannien als Bestandteil des posttranskriptionellen Gen-Silencing-Systems in Pflanzen entdeckt (eng. PTGS, posttranskriptionelles Gen-Silencing). Ihre Ergebnisse veröffentlichte die Gruppe im Fachblatt „Science“.
Doppelsträngige RNAs können die Genexpression durch einen Mechanismus erhöhen, der als RNA-abhängige Genaktivierung bezeichnet wird. RNAa, kleine RNA-induzierte Genaktivierung). Es wurde gezeigt, dass doppelsträngige RNAs, die komplementär zu Promotoren von Zielgenen sind, eine Aktivierung der entsprechenden Gene bewirken. Eine RNA-abhängige Aktivierung nach Verabreichung von synthetischen doppelsträngigen RNAs wurde in menschlichen Zellen gezeigt. Es ist nicht bekannt, ob ein ähnliches System in den Zellen anderer Organismen existiert.
Mit der Fähigkeit, im Wesentlichen jedes Gen nach Belieben auszuschalten, hat die RNA-Interferenz auf der Grundlage kleiner interferierender RNAs ein enormes Interesse in der Grundlagen- und angewandten Biologie geweckt. Die Zahl weitreichender RNAi-basierter Assays zur Identifizierung wichtiger Gene in biochemischen Signalwegen wächst ständig. Da die Entstehung von Krankheiten auch durch die Aktivität von Genen bestimmt wird, ist zu erwarten, dass in einigen Fällen das Abschalten eines Gens durch kleine interferierende RNA einen therapeutischen Effekt haben kann.
Die Anwendung von RNA-Interferenz basierend auf kleinen interferierenden RNAs bei Tieren und insbesondere bei Menschen ist jedoch mit vielen Schwierigkeiten konfrontiert. Experimente haben gezeigt, dass die Wirksamkeit kleiner interferierender RNAs für verschiedene Zelltypen unterschiedlich ist: Einige Zellen reagieren leicht auf die Wirkung kleiner interferierender RNAs und zeigen eine Abnahme der Genexpression, während dies bei anderen trotz effektiver Transfektion nicht beobachtet wird. Die Gründe für dieses Phänomen sind noch kaum verstanden.
Die Ende 2005 veröffentlichten Ergebnisse der ersten Phase der Studien mit den ersten beiden RNAi-Therapeutika (zur Behandlung der Makuladegeneration) zeigen, dass Medikamente auf Basis kleiner interferierender RNAs von Patienten gut vertragen werden und akzeptable pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen.
Vorläufige klinische Studien mit kleinen interferierenden RNAs, die auf das Ebola-Virus abzielen, weisen darauf hin, dass sie für die Post-Expositions-Prophylaxe der Krankheit wirksam sein könnten. Dieses Medikament ermöglichte das Überleben der gesamten Gruppe von Versuchsprimaten, die eine tödliche Dosis des Zairischen Ebolavirus erhielten.
