GENTECHNIK(syn. Gentechnik) - eine Forschungsrichtung in Molekularbiologie und Genetik, deren oberstes Ziel darin besteht, unter Verwendung von Labortechniken Organismen mit neuen Kombinationen erblicher Eigenschaften zu erhalten, einschließlich solcher, die in der Natur nicht vorkommen. Im Herzen von G. und. die Möglichkeit der gezielten Manipulation mit Bruchstücken von Nukleinsäuren aufgrund neuester Errungenschaften der Molekularbiologie und Genetik liegt. Zu diesen Errungenschaften gehört die Feststellung der Universalität des genetischen Codes (siehe), dh die Tatsache, dass in allen lebenden Organismen der Einbau derselben Aminosäuren in ein Proteinmolekül durch dieselben Nukleotidsequenzen in der DNA-Kette codiert wird; die Erfolge der genetischen Enzymologie, die dem Forscher eine Reihe von Enzymen zur Verfügung stellte, die es ermöglichen, einzelne Gene oder Fragmente von Nukleinsäuren in isolierter Form zu erhalten, um eine In-vitro-Synthese von Fragmenten von Nukleinsäuren durchzuführen, um sie zu kombinieren die erhaltenen Fragmente zu einem Ganzen. So die Veränderung der erblichen Eigenschaften des Organismus mit Hilfe G. Und. reduziert sich auf die Konstruktion neuen genetischen Materials aus verschiedenen Fragmenten, die Einführung dieses Materials in den Empfängerorganismus, die Schaffung von Bedingungen für sein Funktionieren und seine stabile Vererbung.

Eine der Möglichkeiten, Gene zu erhalten, ist chem. Synthese. Nachdem es Holly (A. Holli) in den USA, A. A. Baev in der UdSSR und anderen Forschern gelungen war, die Struktur verschiedener Transport-RBGK (tRNA) zu entschlüsseln, führten X. Koran et al. eine chem. Synthese von DNA, die Alanin-tRNA aus Bäckerhefe codiert.

Die effektivste Methode der künstlichen Gensynthese ist jedoch mit der Verwendung des Enzyms RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) verbunden, das von Baltimore (D. Baltimore) und Temin (H. Temin) in onkogenen Viren entdeckt wurde (siehe). Dieses Enzym wurde aus Zellen isoliert und gereinigt, die mit bestimmten RNA-enthaltenden onkogenen Viren infiziert waren, einschließlich Vogel-Myeloblastose-Virus, Rous-Sarkom und Maus-Leukämie. Reverse Transkriptase sorgt für die DNA-Synthese auf der Boten-RNA (mRNA)-Matrize. Die Verwendung von mRNA-Molekülen als Matrizen für die DNA-Synthese erleichtert die künstliche Synthese einzelner Strukturgene höherer Organismen erheblich, da die Sequenz stickstoffhaltiger Basen in einem mRNA-Molekül eine exakte Kopie der Sequenz stickstoffhaltiger Basen der entsprechenden Strukturgene ist, und die Technik zur Isolierung verschiedener mRNA-Moleküle ist ziemlich weit entwickelt. Fortschritte bei der Isolierung der Globinprotein-mRNA, die Teil des menschlichen, tierischen und Vogelhämoglobins ist, der Augenlinsenprotein-mRNA, der Immunoglobin-mRNA, der mRNA eines spezifischen Proteins eines bösartigen Tumors (Myelom) ermöglichten die Synthese des strukturellen Teils der codierenden Gene einige dieser Proteine ​​unter Verwendung von reverser Transkriptase.

Allerdings funktionieren Strukturgene im Körper zusammen mit regulatorischen Genen, deren Nukleotidsequenz nicht durch das mRNA-Molekül reproduziert wird. Daher erlaubt keines dieser Verfahren die Synthese eines Satzes von strukturellen und regulatorischen Genen. Die Lösung dieses Problems wurde nach der Entwicklung von Methoden zur Isolierung einzelner Gene möglich. Um bakterielle Gene zu isolieren, werden kleine DNA-haltige zytoplasmatische Strukturen verwendet, die sich unabhängig vom Bakterienchromosom replizieren (siehe Replikation) können. Diese Strukturen bilden eine einzige Gruppe extrachromosomaler genetischer Elemente von Bakterien - Plasmide (siehe Plasmide). Einige von ihnen können in das bakterielle Chromosom eingeführt werden und dann beispielsweise spontan oder unter dem Einfluss von Induktionsmitteln. UV-Bestrahlung, bewegen sich vom Chromosom zum Zytoplasma und nehmen dabei die benachbarten chromosomalen Genzellen des Wirts mit. Extrachromosomale genetische Elemente von Bakterien mit solchen Eigenschaften werden als Episomen bezeichnet [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episomen (siehe) umfassen gemäßigte Phagen (siehe. Bakteriophage), Sexualfaktor von Bakterien, Arzneimittelresistenzfaktoren von Mikroorganismen (siehe), bakteriozinogene Faktoren (siehe). Im Zytoplasma replizieren sich von Episomen eingefangene Gene in ihrer Zusammensetzung und bilden oft viele Kopien. Die Entwicklung eines effektiven Verfahrens zur Isolierung von Plasmiden, insbesondere von gemäßigten Phagen, die das genetische Material des Bakterienchromosoms tragen, und die Isolierung eines Fragments des Bakterienzellchromosoms, das im Bakteriophagengenom enthalten ist, ermöglichte es 1969 für J. Beckwith et al isolieren das Lactose-Operon, eine Gruppe von Genen, die Syntheseenzyme steuern, die für die Aufnahme von Lactose durch Escherichia coli erforderlich sind. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um das Gen zu isolieren und zu reinigen, das die Synthese von Escherichia coli-Tyrosin-Transfer-RNA steuert (siehe Ribonukleinsäuren).

Die Verwendung von Plasmiden ermöglicht es, praktisch beliebige bakterielle Gene in isolierter Form zu erhalten und damit die Möglichkeit, DNA-Moleküle aus verschiedenen Quellen zu konstruieren. Solche Hybridstrukturen können in beträchtlichen Mengen in Zellen akkumuliert werden, da sich viele Plasmide unter bestimmten Bedingungen intensiv im bakteriellen Cytoplasma replizieren und Dutzende, Hunderte und sogar Tausende von Kopien bilden.

G.s Erfolge und. verbunden mit der Entwicklung von Techniken zur Kombination genetischer Strukturen aus verschiedenen Quellen in einem einzigen DNA-Molekül. Ausschlaggebend für das Design von Hybridmolekülen in vitro war der Einsatz von Restriktionsendonucleasen – speziellen Enzymen, die in der Lage sind, DNA-Moleküle in genau definierten Bereichen zu schneiden. Solche Enzyme finden sich in Escherichia coli-Zellen, die R-Typ-Plasmide tragen, die Bakterienresistenz gegen bestimmte Medikamente verursachen, in Zellen von Haemophilus influenzae, Serratia marcescens und anderen Mikroorganismen. Eines der am häufigsten verwendeten Enzyme dieses Typs ist die EcoRI-Restriktionsendonuclease, die vom RI-Plasmid in E. coli-Zellen synthetisiert wird. Das Enzym erkennt einen DNA-Abschnitt mit einer einzigartigen Abfolge von sechs Basenpaaren und schneidet die doppelsträngige DNA-Struktur in diesem Abschnitt, sodass auf beiden Seiten einzelsträngige Enden von vier Nukleotiden entstehen (sog. Sticky Ends). Da das Enzym DNA-Moleküle, unabhängig von ihrer Herkunft, auf genau definierte Weise schneidet, haben alle DNA-Fragmente, die aus der Wirkung des Enzyms resultieren, die gleichen klebrigen Enden. Komplementäre klebrige Enden beliebiger DNA-Fragmente werden durch Wasserstoffbrückenbindungen verbunden und bilden eine hybride zirkuläre DNA (Abb.). Um das hybride DNA-Molekül zu stabilisieren, wird ein anderes Enzym verwendet - Polynukleotid-Ligase, das kovalente Bindungen wiederherstellt, die durch das Restriktionsenzym gebrochen wurden. Die von EcoRI spezifisch erkannte Sequenz kommt in der DNA nicht mehr als 4.000-16.000 Basenpaare voneinander entfernt vor. Daher kann ein unter der Wirkung von EcoRI gebildetes DNA-Fragment mindestens ein durch das Enzym unbeschädigtes Gen enthalten (im Durchschnitt enthält ein Gen 1000–1500 Basenpaare).

Die Verwendung von Restriktionsendonucleasen und einer Reihe anderer Enzyme ermöglicht es, komplexe rekombinante DNA zu erhalten. Einer Forschergruppe in den Vereinigten Staaten unter der Leitung von P. Berg gelang es, genetische Informationen aus drei Quellen als Teil eines einzigen DNA-Moleküls zu kombinieren: das vollständige Genom (siehe) des onkogenen Affenvirus SV40, Teil des Genoms des gemäßigten Bakteriophagen λ und die Gruppe von E. coli-Genen, die für die Assimilation von Galactose verantwortlich sind. Das entworfene rekombinante Molekül wurde nicht auf funktionelle Aktivität getestet, da die Autoren dieser Arbeit vor der potenziellen Gefahr der Ausbreitung onkogener Tierviren in der im menschlichen Darm lebenden Bakterienpopulation Halt machten. Es ist bekannt, dass die gereinigte DNA von Viren in verschiedene Säugerzellen eindringen und von diesen stabil vererbt werden kann.

Funktionell aktive DNA-Hybridmoleküle wurden erstmals in den USA von S. Cohen et al. konstruiert. Cohens Gruppe löste konsequent das Problem der Kombination und Klonierung (selektive Akkumulation) von DNA-Molekülen, die aus phylogenetisch immer weiter voneinander entfernten Arten isoliert wurden. Das Klonierungsverfahren besteht in der Regel darin, dass DNA aus verschiedenen Quellen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen fragmentiert, diese Fragmente dann in vitro zu einer gemeinsamen Struktur zusammengefügt und in den Empfängerorganismus, in Cohens Experimenten Escherichia coli, eingebracht werden. Es wurde festgestellt, dass Zellen mehrerer Bakterienarten (einschließlich Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) unter Verwendung rekombinanter DNA-Moleküle transformiert werden können (siehe Transformation). Dabei dient der Plasmidteil des Hybridmoleküls (bzw. eines der Plasmide, falls zwei Plasmide aus unterschiedlichen Quellen in dem Hybridmolekül kombiniert sind) als Vektor, d.h. sorgt für die Übertragung von stammesfremdem Erbgut auf Empfängerzellen und seine Reproduktion in ihnen. Das erste von Cohen ua als Vektor verwendete Plasmid war das von ihm in vitro gewonnene Plasmid pSC101, das die Resistenz von Bakterien gegen Tetracyclin kontrolliert. Dieses kleine Plasmid ist nur 8000 bp lang. Es wird vom EcoRI-Enzym nur an einer Stelle angegriffen, und das Enzym beeinträchtigt nicht die Fähigkeit des Plasmids, sich in E. coli-Zellen zu replizieren und die Tetracyclin-Resistenz zu kontrollieren. Diese Eigenschaften machten es möglich, es für die Konstruktion von DNA-Hybridmolekülen in vitro zu verwenden. In den ersten Stadien wurde Plasmid-DNA, die aus verschiedenen Bakterienspezies und dann aus höheren Organismen isoliert wurde, an pSC101 angehängt. So wurden „chimäre“ Plasmide (d. h. nicht in der Lage, unter natürlichen Bedingungen vorzukommen) geschaffen, die in ihrer Zusammensetzung das genetische Material von Escherichia coli, einem DNA-Abschnitt aus Eizellen des Krallenfrosches Xenopus laevis, kombinierten, der die Synthese von kontrolliert ribosomale RNA und ein DNA-Segment eines Seeigels, das die Synthese von Histonproteinen steuert, oder mitochondriale DNA der Maus. In den Zellen von Escherichia coli, in die solche hybriden, "chimären" Plasmide eingeführt wurden, wurde die Arbeit der Gene höherer Organismen registriert.

Im Gegensatz zu pSC101, das in der Zelle nur in 4-6 Kopien vorhanden ist, können einige andere als Vektoren verwendete Plasmide unter bestimmten Bedingungen viele Male replizieren und mehrere tausend Kopien in einer Zelle bilden. Solche Eigenschaften besitzt beispielsweise das Plasmid ColEI, das die Synthese von Colicin steuert (siehe Bakteriozinogenese). Wie pSC101 wird ColEI durch das EcoRI-Enzym nur an einer Stelle gespalten, und Fremd-DNA, die ebenfalls mit EcoRI behandelt wurde, wird leicht an das resultierende lineare Molekül mit klebrigen Enden gebunden. So wurden die Gene des Tryptophan-Operons von Escherichia coli an ColEI "genäht". In Zellen, die viele Kopien des konstruierten Hybridplasmids trugen, nahm die Produktion von Enzymproteinen, die durch Tryptophan-Biosynthesegene kontrolliert werden, dramatisch zu. Im in vitro-System war es möglich, das ColEI-Plasmid an bestimmte R-Faktoren und einen temperenten Phagen zu binden. Solche Arbeiten wurden erstmals in der UdSSR unter der Leitung des Akademiemitglieds A. A. Baev und Professor S. I. Alikhanyan durchgeführt. Kombinierte Vektorplasmide aus ColEI und R-Faktoren können sich wie ColEI in Bakterienzellen intensiv vermehren und gleichzeitig die Resistenz von Zellen gegen Antibiotika bestimmen, was die Auswahl von Bakterien - Trägern von Hybridplasmiden - erheblich vereinfacht.

Temperente Phagen werden auch als Vektoren verwendet. Im In-vitro-System wurden hybride Bakteriophagen-Partikel konstruiert, die bakterielle Gene, DNA anderer Phagen oder höherer Organismen (z. B. DNA der Fruchtfliege Drosophila) in ihrer Struktur enthalten.

Die funktionelle Aktivität von Hybrid-DNA wird durch die Möglichkeit ihres Transfers in die Zellen von Empfängerorganismen und die anschließende Vermehrung (Amplifikation) in diesen Zellen bestimmt. Als Rezipienten werden nicht nur Bakterien, wie oben erwähnt, sondern auch Zellen höherer Organismen bereits effektiv genutzt, bisher allerdings nur in Form einer außerhalb des Körpers gezüchteten Gewebekultur. Es gibt Hinweise darauf, dass die DNA von Phagen, die bakterielle Gene tragen, in menschliche Bindegewebszellen (Fibroblasten), in Protoplasten oder in eine undifferenzierte Kultur (Kallus) von Pflanzenzellen eindringen kann. 1971 Amer. Forscher Merrill (S. R. Merril) et al. berichteten über Experimente zur Korrektur eines erblichen Defekts - Galaktosämie (siehe) durch Einführen von Galactose-Genen von Bakterien, die in der DNA des transduzierenden Phagen enthalten sind, in "kranke" Zellen. Als Ergebnis stellten die Zellen eines Patienten mit Galaktosämie, der das Enzym beta-D-Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase defekt war, Galactose nicht assimilieren konnte, ihre normale Fähigkeit wieder her, in Gegenwart von Galactose zu wachsen, und zeigten zuvor keine enzymatische Aktivität in ihren Auszügen eingetragen. Ein ähnliches Ergebnis wurde von Horst (J. Horst) et al. mit der Einführung eines bakteriellen Gens erzielt, das die Synthese von Beta-Galactosidase in den Fibroblasten eines Patienten mit generalisierter Gangliosidose steuert, die durch einen schweren Mangel an diesem Enzym gekennzeichnet ist. Manion (W. Munyon) und seine Mitarbeiter. Unter Verwendung des Herpesvirus übertrugen sie das Gen, das die Synthese von Thymidinkinase steuert, von menschlichen Zellen auf Mauszellen und stellten so die Fähigkeit defekter Mausfibroblasten wieder her, dieses Enzym zu synthetisieren.

Eine der Möglichkeiten, genetische Informationen in die Kultur menschlicher, tierischer und pflanzlicher Zellen zu übertragen, ist die von Ephrussi (V. Ephrussi) und Barsky (G. Barski) entwickelte Hybridisierung somatischer Zellen. Die Wirksamkeit dieser Methode hat sich erheblich verbessert, seit festgestellt wurde, dass Partikel des inaktivierten Parainfluenzavirus vom Sendai-Typ die Häufigkeit der Zellfusion aus einer Vielzahl von Quellen erhöhen. Die Möglichkeit, einzelne Gene aus isolierten Chromosomen des Chinesischen Hamsters in Bindegewebszellen der Maus zu übertragen, wurde gezeigt. Es werden Hybride aus menschlichen und Mauszellen beschrieben, bei denen ein Teil der menschlichen Chromosomen entfernt wird, während der andere Teil funktionell aktiv bleibt. Die Entwicklung zellmikrochirurgischer Methoden ermöglichte es, Zellkerne aus somatischen Zellen in befruchtete Eizellen zu transplantieren und dadurch absolut identische Organismen zu erhalten. Durch Zellhybridisierung war es möglich, die Synthese von menschlichem Globin in Froschkeimzellen zu induzieren. All diese Beispiele zeigen das Potenzial von G. und.

Praktischer Wert von G. und. für die Medizin ist mit den Aussichten verbunden, erbliche Stoffwechselstörungen beim Menschen zu korrigieren (siehe Gentherapie), Mikroorganismen zu schaffen, die ihre Pathogenität verloren haben, aber die Fähigkeit zur Bildung von Immunität behalten haben, die Synthese von Antibiotika, Aminosäuren, Hormonen, Vitaminen, Enzymen, Immunglobuline usw., basierend auf der Verwendung von Mikroorganismen, die die entsprechenden Gene enthalten haben. Außergewöhnliche Ergebnisse können in naher Zukunft G. und erzielt werden. Pflanzen. Mit Hilfe der Methoden von G. und. Sie versuchen, Pflanzen zu schaffen, die atmosphärischen Stickstoff absorbieren und die Proteinzusammensetzung pflanzlicher Lebensmittel verbessern können. Die erfolgreiche Lösung dieser Probleme wird die Produktivität von Pflanzen dramatisch steigern, die Produktion und den Verbrauch von mineralischem Stickstoff reduzieren und dadurch die Umwelt erheblich verbessern (siehe). Untersucht wird die Möglichkeit, durch Überwindung interspezifischer Kreuzungsbarrieren völlig neue Formen von Tieren und Pflanzen zu schaffen. Jedoch bei der Einschätzung von G. und. Als neue Form der Beherrschung von Wildtieren sollte man nicht nur ihre mögliche revolutionäre Rolle in Biologie, Medizin und Landwirtschaft berücksichtigen, sondern auch die Chancen, die sich im Zusammenhang mit ihrer Entwicklung für die Entstehung neuer Formen pathogener Mikroorganismen ergeben, die Gefahr der Verbreitung von Hybrid-DNA in Populationen von Bakterien, die beim Menschen leben, Träger onkogener Viren usw. Natürlich ist die bewusste Nutzung der Errungenschaften der Wissenschaft, einschließlich G. und., für menschenverachtende, menschenverachtende Zwecke nur in einer Gesellschaft möglich, in der die Das Gute des Menschen wird Profit und Aggression geopfert.

Aus Zusatzmaterialien

Die Gentechnik ist nach wie vor eine sich schnell entwickelnde Forschungsmethode in der Molekularbiologie und Genetik. Es sei darauf hingewiesen, dass die Begriffe „Gentechnik“ und „Gentechnik“ nicht vollständig synonym sind, da die gentechnische Forschung nicht auf Manipulationen mit Genen als solchen beschränkt ist. Gegenwärtig ermöglichen gentechnische Methoden die tiefgreifendste und detaillierteste Analyse natürlicher Nukleinsäuren – Substanzen, die für die Speicherung, Übertragung und Implementierung genetischer Informationen verantwortlich sind (siehe Nukleinsäuren), sowie die Schaffung modifizierter oder vollständig neuer nicht in der Natur vorkommende Gene (siehe Gen), Kombinationen von Genen und exprimieren sie mit hoher Effizienz in einer lebenden Zelle (siehe Genexpression). Von den konkreten praktischen Errungenschaften der Gentechnologie im letzten Jahrzehnt sollte die wichtigste die Schaffung von Produzenten von biologisch aktiven Proteinen sein - Insulin (siehe), Interferon (siehe), Wachstumshormon (siehe Somatotropes Hormon) usw. ebenfalls wie die Entwicklung gentechnologischer Methoden die Aktivierung jener Glieder des Stoffwechsels, des Roggens mit der Bildung niedermolekularer biologisch aktiver Substanzen verbindet. Auf diese Weise werden Produzenten bestimmter Antibiotika, Aminosäuren und Vitamine gewonnen, die um ein Vielfaches wirksamer sind als die Produzenten dieser Substanzen, die durch traditionelle Methoden der Genetik und Selektion gewonnen werden. Es werden Methoden entwickelt, um reine Proteinimpfstoffe gegen Hepatitis-, Influenza-, Herpes- und Maul- und Klauenseuche-Viren zu erhalten, die Idee, eine Impfung mit Vacciniavirus zu verwenden, wurde umgesetzt, in dessen Genom Gene für die Synthese von Proteinen kodieren anderer Viren (z. B. Hepatitis- oder Influenzaviren) eingebettet sind: Durch Impfungen mit einem so konstruierten Virus entwickelt der Körper eine Immunität nicht nur gegen Pocken, sondern auch gegen Hepatitis, Influenza oder andere durch dieses Virus verursachte Krankheiten, das protein to-rogo wird durch das eingebaute gen kodiert.

Die weltweite Sammlung von Restriktionsendonucleasen - Restriktasen, die wichtigsten "Werkzeuge" gentechnischer Manipulationen, ist erheblich gewachsen. Mehr als 400 Restriktionen "erkennen" ca. 100 spezifische Stellen (Sites) unterschiedlicher Struktur in DNA-Molekülen (siehe Desoxyribonukleinsäuren) und Aufspaltung der DNA-Polynukleotidkette an diesen Stellen. Unter Verwendung eines solchen Enzyms oder einer Kombination mehrerer Restriktionsenzyme kann fast jedes Gen als Teil eines oder mehrerer DNA-Fragmente (sog. Restriktionsfragmente) isoliert werden. Dies erweiterte die Möglichkeiten der Gentechnik nicht nur in Bezug auf die Isolierung von Genen, sondern auch in Bezug auf die Aktivierung ihrer Arbeit, die Analyse der Struktur von Genen und ihrer molekularen Umgebung. Verfahren zur Synthese ganzer Gene mit einer vorgegebenen Sequenz von Nukleotiden wurden entwickelt, es ist möglich geworden, synthetisierte und natürliche Gene mit verschiedenen regulatorischen Nukleotidsequenzen zu versehen, einzelne Nukleotide in genau festgelegten Abschnitten eines Gens zu ersetzen, einzufügen, zu löschen, zu verkürzen oder seine Nukleotidkette mit einer Genauigkeit von einem Nukleotid vervollständigen.

Die Errungenschaft der Gentechnik war ihr Eindringen in die Organisation und Funktionsweise der Vererbungsmechanismen in den Zellen höherer Organismen, einschließlich des Menschen. An höheren Eukaryoten wurden die interessantesten Daten mit gentechnischen Methoden gewonnen. Der Erfolg der Gentechnik hängt weitgehend mit der Herstellung neuer spezialisierter Vektoren zusammen, die eine effiziente Klonierung (Vermehrung) einzelner DNA-Fragmente (Gene) und die Synthese von Proteinen ermöglichen, die von diesen Genen codiert werden.

Restriktionsfragmente, die mit DNA-Vektoren verbunden sind, werden in eine lebende Zelle kloniert, wobei die Fähigkeit solcher Vektoren genutzt wird, sich in einer Zelle in mehreren Kopien zu reproduzieren (zu replizieren). Abhängig von der Größe der zu klonierenden Fragmente und dem Zweck der Studie werden Vektoren einer von vier Arten verwendet - Plasmide (siehe), Phagen (siehe. Bakteriophage), Cosmide oder Derivate von Phagen mit einzelsträngiger DNA.

Zur Klonierung relativ kleiner DNA-Fragmente (bis zu 10.000 Basenpaare) werden Plasmidvektoren (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19 usw.) verwendet. Die Errungenschaft der Gentechnik in den letzten Jahren war die Herstellung von Vektoren auf der Basis des Phagen X (Charon 4A, gtwes-B), bei denen ein Teil des Genoms durch ein Fragment fremder DNA ersetzt wird. Das hybride Genom wird künstlich in eine Proteinhülle „verpackt“ und Bakterien mit diesem rekonstruierten Phagen infiziert. Der rekonstruierte Phage bildet während der Reproduktion mehrere tausend Kopien in der Zelle, lysiert sie und wird in das Kulturmedium freigesetzt. Mit Hilfe solcher Vektoren werden DNA-Fragmente von 10-25.000 Basenpaaren kloniert.

Cosmidvektoren (pIB8, MUA-3) sind ein Hybrid aus Phagen X und einem Plasmid. Sie enthalten die sog COS-Sequenzen von Phagen-DNA, die zum Verpacken von Phagengenomen in eine Proteinhülle erforderlich sind, und ein Segment von Plasmid-DNA, das es Cosmidvektoren ermöglicht, sich in Bakterien auf die gleiche Weise wie Plasmide zu replizieren. Das resultierende rekombinante Genom infiziert also Bakterien mit hoher Effizienz wie ein Bakteriophage, vermehrt sich aber in ihnen wie ein Plasmid, ohne den Tod einer Bakterienzelle zu verursachen. Cosmide werden zum Klonen von DNA-Fragmenten mit einer Länge von bis zu 35-45.000 Basenpaaren verwendet.

Die Vektoren, die Derivate von Phagen mit einzelsträngiger DNA (M13 mp8, M13, mp73 usw.) sind, werden auf der Basis des ringförmigen DNA-Moleküls des Bakteriophagen M13 konstruiert. Zum Einbetten von Fremd-DNA wird ein replikatives doppelsträngiges Phagen-DNA-Molekül verwendet. Ein Vektor, der ein fremdes DIC trägt, wird in Bakterienzellen eingeführt, wo sich die rekombinanten Moleküle vermehren, ohne diese Zelle zu lysieren, und als virales Partikel mit einem einzelsträngigen DNA-Molekül in das Kulturmedium "abknospen". Diese Vektoren werden verwendet, um DNA-Fragmente (bis zu 300-400 Basenpaare) zu klonieren.

Das für gentechnische Manipulationen erforderliche Gen wird durch Klonieren der geeigneten rekombinanten DNA-Moleküle und Selektieren solcher Klone erhalten. In den Fällen, in denen die Gene von höheren Organismen und Menschen geklont werden / die Expression von to-rykh in E. coli (am häufigsten für solche Zwecke verwendet) unmöglich ist, wird das Klonierungs- und Selektionsverfahren in mehreren Schritten durchgeführt. In der ersten Stufe wird ein sog eine Bibliothek von Genen aus DNA-Fragmenten (direkt aus dem Zellgenom geklont) oder aus klonierten DNA-Kopien (cDNA) der entsprechenden Boten-RNA. Durch den Vergleich der Struktur von Fragmenten genomischer DNA und der entsprechenden cDNA erhalten sie wichtige Informationen über die Organisation des Erbguts und bei Erbkrankheiten über die Art der Anomalien im Erbgut, die daraus resultieren Krankheit. Aus der Genbibliothek ist es mit modernen Techniken möglich, das benötigte Gen mit den umliegenden Genomregionen zu extrahieren. Derzeit sind vollständige Bibliotheken von Genen vieler Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere (bis hin zu Säugetieren und Menschen) erstellt worden. Mehrere hundert Gene und andere Nukleotidsequenzen in menschlicher DNA wurden bereits kloniert und teilweise untersucht.

Die Möglichkeiten der gentechnischen Forschung beschränken sich nicht darauf, ein Gen zu klonen und eine große Anzahl seiner Kopien zu erhalten. Oft ist es notwendig, ein Gen nicht nur zu klonieren, sondern auch seine Expression in einer Zelle sicherzustellen, also die darin enthaltene Information in die Aminosäuresequenz der Polypeptidkette des von diesem Gen kodierten Proteins einzubauen. Wenn ein in eine Bakterienzelle eingeführtes Gen aus Bakterien der gleichen (oder nahen) Spezies erhalten wird, dann kann es ausreichend sein, das Gen mit regulatorischen Elementen zu isolieren, die seine Expression steuern. Die regulatorischen Nukleotidsequenzen evolutionär entfernter Organismen sind jedoch bis auf wenige Ausnahmen nicht austauschbar. Um beispielsweise die Expression eines eukaryotischen Gens in E. coli-Zellen zu erreichen, wird daher die regulatorische Region daraus entfernt und der strukturelle Teil eines solchen Gens (in einem bestimmten Abstand) an die regulatorische Region angehängt des bakteriellen Gens. Bedeutende Fortschritte in der Entwicklung dieser Technik wurden nach der Entdeckung des Ba131-Nukleaseenzyms erzielt, das die einzigartige Eigenschaft besitzt, beide Ketten eines doppelsträngigen linearen DNA-Moleküls ausgehend vom Ende des Moleküls zu hydrolysieren, d ” Nukleotidsequenzen beliebiger Länge vom Ende des DNA-Fragments. Derzeit werden die strukturellen und regulatorischen Bereiche mit solchen Restriktasen getrennt isoliert, deren "Erkennungs"-Stellen am erfolgreichsten auf der Polynukleotidkette lokalisiert sind, dann werden die "überzähligen" Nukleotidsequenzen entfernt und der strukturelle Bereich des eukaryotischen Gens verbunden die regulatorische Region des bakteriellen Gens. Auf diese Weise kann nicht nur die Expression eukaryotischer Gene in Bakterienzellen erreicht werden, sondern umgekehrt bakterielle Gene in den Zellen höherer und niederer Eukaryoten.

Der Erfolg der Gentechnik hängt eng mit der Entwicklung und Verbesserung von Methoden zur Bestimmung der Nukleotidsequenz (Sequenzierung) in DNA-Molekülen zusammen. Eine beträchtliche Anzahl von Restriktasen, die den Forschern zur Verfügung stehen, ermöglicht es, bestimmte DNA-Fragmente mit absoluter Spezifität zu isolieren, und die Entwicklung und Verbesserung von Klonierungsverfahren ermöglicht es, Fragmente sogar einzigartiger Gene in Mengen zu erhalten, die für die Analyse erforderlich sind. DNA-Sequenzierungsverfahren haben sich als so effektiv erwiesen, dass häufig durch Bestimmung der DNA-Nukleotidsequenz Daten über die Nukleotidsequenz in den entsprechenden RNA-Molekülen und über die Abfolge von Aminosäureresten im synthetisierten Proteinmolekül gewonnen werden. Bei der Verarbeitung der Ergebnisse der DNA-Sequenzierung werden Computer häufig verwendet. Für eine vollständigere und schnellere Interpretation der erhaltenen experimentellen Daten werden nationale und internationale Computer-„Banken“ von Nukleotidsequenzen erstellt. Gegenwärtig sind die vollständigen Nukleotidsequenzen der Genome einer Reihe von bakteriellen Plasmiden und Viren bestimmt worden, und das Problem der Bestimmung der vollständigen Nukleotidsequenzen zuerst einzelner Chromosomen und dann des gesamten Genoms höherer Organismen, einschließlich des Menschen, besteht bereits gelöst werden.

Mit Hilfe gentechnischer Methoden wurden Abweichungen in der Struktur bestimmter Abschnitte menschlicher Gene gefunden, die die Ursache für Erbkrankheiten waren. Meistens ist diese Methode die sogenannte. b-Lot-Analyse. Die isolierte zelluläre DNA wird einer Restriktionsenzymhydrolyse unterzogen, die resultierenden Fragmente werden mittels Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Die getrennten Fragmente werden auf speziell behandeltes Chromatographiepapier, Nitrozellulose- oder Nylonfilter übertragen ("nachgedruckt") und erneut einer elektrophoretischen Trennung unterzogen. Schneiden Sie Stellen aus Elektropherogrammen aus, die einzelnen Fraktionen entsprechen und denselben Typ von DNA-Fragmenten enthalten; Schnitte von Elektrophoregrammen werden mit einem zuvor klonierten Gen oder einem Teil davon oder mit einem chemisch gewonnenen inkubiert. Synthese durch eine Nukleotidsequenz, die eine radioaktive Markierung enthält. Die markierte DNA kontaktiert nur diejenigen Fragmente der analysierten zellulären DNA, die dazu komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen. Eine Veränderung der Verteilung und Menge einer fixierten Markierung im Vergleich zur Norm ermöglicht es, Umlagerungen im analysierten Gen oder daran angrenzenden Nukleotidsequenzen zu beurteilen.

Die "Erkennungsstellen" bestimmter Restriktasen im DNA-Molekül sind ungleichmäßig verteilt, daher wird das DNA-Molekül während der Hydrolyse durch diese Enzyme in eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Länge gespalten. Die Umordnung der DNA-Struktur, wodurch die vorhandenen „Erkennungs“-Stellen verschwinden oder erscheinen, führt zu einer Änderung des Satzes dieser Fragmente (der sogenannten Restriktionsfragmente), d. h. zum Erscheinen der Länge der Restriktionsfragmente Polymorphismus (GVDRF). Umlagerungen im DNA-Molekül können während der Synthese oder in der Struktur des kodierten Proteins Veränderungen verursachen oder auch nicht; Umlagerungen, die keine Änderungen verursachen, sind die Mehrheit, und sie verursachen einen normalen RFLP. Es stellte sich heraus, dass RFLP ein klares genetisches Merkmal ist. Derzeit ist die RFLP-Analyse zu einer der genauesten Methoden geworden, die in der Humangenetik und medizinischen Genetik verwendet werden. Für eine Reihe von Erbkrankheiten sind RFLP-Formen beschrieben, die direkt auf das Vorliegen einer Krankheit oder den Träger eines pathologisch veränderten Gens hinweisen.

Die Gentechnik markierte den Beginn einer neuen Forschungsrichtung, die als "Genetik in umgekehrter Richtung" bezeichnet wird. Die traditionelle genetische Analyse (siehe) wird in der folgenden Reihenfolge durchgeführt: Das Zeichen wird ausgewählt, die Zeichenverbindung mit einer genetischen Determinante und die Lokalisierung dieser Determinante in Bezug auf bereits bekannte wird hergestellt. Bei der reversen Genetik läuft alles in umgekehrter Reihenfolge ab: Es wird ein DNA-Fragment mit unbekannter Funktion ausgewählt, die Verknüpfung dieses DNA-Fragments mit anderen Regionen des Genoms und seine Verbindung mit bestimmten Merkmalen hergestellt. Dieser Ansatz ermöglichte die Entwicklung von Methoden zur Früherkennung und Erkennung von Trägern solcher Krankheiten wie Chorea Huntington, Morbus Duchenne, Mukoviszidose, bei denen die biochemische Natur von Erbfehlern noch nicht bekannt ist. Unter Verwendung der genealogischen Methode zur Bestimmung der Muster der erblichen Übertragung von Chorea Huntington wurde gezeigt, dass das aus dem menschlichen Genom isolierte G8-DNA-Fragment eng mit dem Gen verbunden ist, das die Krankheit und die Form des RFLP-G8-Fragments in dieser Population bestimmt kann diese Krankheit diagnostizieren und Träger defekter Gene identifizieren.

Auf dem Weg zur Einführung gentechnischer Verfahren in die medizinische Praxis stehen noch viele technische Schwierigkeiten im Weg. Viele Laboratorien auf der ganzen Welt entwickeln aktiv praktisch geeignete gentechnische Diagnoseverfahren, und es ist zu hoffen, dass solche Verfahren in naher Zukunft Anwendung finden werden, wenn nicht für das massengenetische Screening (Screening) während der medizinischen Untersuchung der Bevölkerung, dann bei zumindest für eine Stichprobenerhebung von Risikogruppen für Erbkrankheiten.

Die Gentechnik ermöglicht es, natürliche Verbindungen und Verfahren nicht nur zu kopieren, sondern auch zu verändern und effizienter zu machen. Ein Beispiel dafür ist eine neue Forschungsrichtung namens Protein Engineering. Berechnungen, die auf der Grundlage von Daten über die Aminosäuresequenz und die räumliche Organisation von Proteinmolekülen durchgeführt wurden, zeigen, dass durch bestimmte Ersetzungen bestimmter Aminosäurereste in den Molekülen einer Reihe von Enzymen eine signifikante Steigerung ihrer enzymatischen Aktivität möglich ist. In einem isolierten Gen, das für die Synthese eines bestimmten Enzyms kodiert, wird durch gentechnische Methoden ein streng kontrollierter Austausch bestimmter Nukleotide durchgeführt. Bei der Synthese eines enzymatischen Proteins unter der Kontrolle eines solchen modifizierten Gens kommt es zu einem vorgeplanten Austausch streng definierter Aminosäurereste in der Polypeptidkette, was eine Steigerung der enzymatischen Aktivität um ein Vielfaches gegenüber der Aktivität eines natürlichen bewirkt Prototyp.

Im Bereich der Landwirtschaft soll die Gentechnik einen wesentlichen Beitrag zur Selektion neuer ertragreicher Pflanzensorten leisten, die gegen Dürre, Krankheiten und Schädlinge resistent sind, sowie zur Entwicklung neuer hochproduktiver Nutzpflanzensorten. Tiere.

Wie jede Errungenschaft der Wissenschaft können auch die Erfolge der Gentechnik nicht nur zum Nutzen, sondern auch zum Schaden der Menschheit eingesetzt werden. Eigens durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die Gefahr einer unkontrollierten Verbreitung rekombinanter DNA nicht so groß ist wie bisher angenommen. Rekombinante DNA und sie tragende Bakterien erwiesen sich als sehr instabil gegenüber Umwelteinflüssen, nicht lebensfähig bei Mensch und Tier. Es ist bekannt, dass es in der Natur und ohne menschliches Eingreifen Bedingungen gibt, die einen aktiven Austausch genetischer Informationen ermöglichen, dies ist der sogenannte. Genfluss. Die Natur hat jedoch viele wirksame Barrieren gegen das Eindringen fremder genetischer Informationen in den Körper geschaffen. Derzeit ist es offensichtlich, dass bei der Arbeit mit den meisten rekombinanten DNA-Molekülen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen völlig ausreichend sind, die zum Beispiel von Mikrobiologen bei der Arbeit mit infektiösem Material verwendet werden. Für besondere Fälle wurden wirksame Methoden entwickelt, um sowohl den biologischen Schutz als auch die physische Isolierung von Versuchsobjekten von Mensch und Umwelt zu gewährleisten. Daher wurden die sehr strengen ersten Versionen der Regeln für das Arbeiten mit rekombinanter DNA überarbeitet und deutlich aufgeweicht. Was die bewusste Nutzung der Errungenschaften der Gentechnik zum Schaden des Menschen betrifft, so müssen Wissenschaftler und Öffentlichkeit aktiv dafür kämpfen, dass diese Gefahr nur theoretisch möglich bleibt.

Siehe auch Biotechnologie.

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L. S. Chernin, V. H. Kalinin.

Gentechnik

Die moderne Biologie unterscheidet sich grundlegend von der traditionellen Biologie nicht nur durch die größere Tiefe der Entwicklung kognitiver Ideen, sondern auch durch eine engere Verbindung mit dem Leben der Gesellschaft, mit der Praxis. Wir können sagen, dass die Biologie in unserer Zeit zu einem Mittel geworden ist, um die lebende Welt zu verändern, um die materiellen Bedürfnisse der Gesellschaft zu befriedigen. Diese Schlussfolgerung wird vor allem durch die enge Beziehung zwischen Biologie und Biotechnologie verdeutlicht, die zum wichtigsten Bereich der Materialproduktion geworden ist, ein gleichberechtigter Partner der von Menschenhand geschaffenen mechanischen und chemischen Technologien sowie der Medizin.

Seit ihren Anfängen haben sich Biologie und Biotechnologie immer gemeinsam entwickelt, und von Anfang an war die Biologie die wissenschaftliche Grundlage der Biotechnologie. Mangels eigener Daten konnte die Biologie jedoch lange Zeit keinen großen Einfluss auf die Biotechnologie nehmen. Mit der Gründung in der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts änderte sich die Situation dramatisch. gentechnische Methoden, was als Genmanipulation mit dem Ziel der Konstruktion neuer und der Rekonstruktion bestehender Genotypen verstanden wird. Als methodische Leistung ihrer Natur nach führte die Gentechnik nicht zu einem Zusammenbruch der vorherrschenden Vorstellungen von biologischen Phänomenen, berührte die Grundbestimmungen der Biologie nicht, ebenso wenig wie die Radioastronomie die Grundbestimmungen der Astrophysik, deren Etablierung, erschütterte "mechanisches Wärmeäquivalent" führte nicht zu einer Änderung der Wärmeleitungsgesetze, und der Beweis Die atomistische Theorie der Materie änderte nicht die Beziehungen der Thermodynamik, Hydrodynamik und Elastizitätstheorie (A.A. Baev).

Dennoch hat die Gentechnik eine neue Ära in der Biologie eröffnet, weil sich neue Möglichkeiten ergeben haben, in die Tiefen biologischer Phänomene vorzudringen, um die Existenzformen lebender Materie weiter zu charakterisieren, die Struktur und Funktion von Genen besser zu studieren auf molekularer Ebene, und verstehen Sie die subtilen Mechanismen der genetischen Apparatur. Fortschritte in der Gentechnik bedeuten eine Revolution in der Moderne

Naturwissenschaft. Sie bestimmen die Kriterien für den Wert moderner Ideen über die strukturellen und funktionellen Merkmale der molekularen und zellulären Ebenen lebender Materie. Moderne Daten über Lebewesen sind von gigantischer kognitiver Bedeutung, weil sie einen der wichtigsten Aspekte der organischen Welt verstehen und damit einen unschätzbaren Beitrag zur Schaffung eines wissenschaftlichen Weltbildes leisten. So hatte die Biologie durch die Gentechnik, nachdem sie ihre kognitive Basis stark erweitert hatte, auch einen führenden Einfluss auf den Aufstieg der Biotechnologie.

Die Gentechnik schafft Grundlagen auf dem Weg zum Verständnis der Mittel und Wege, neue Organismen zu "designen" oder bestehende zu verbessern, ihnen einen großen wirtschaftlichen Wert zu verleihen und die Produktivität biotechnologischer Prozesse dramatisch zu steigern. Die Gentechnik hat jedoch neue Horizonte für die Medizin auf dem Gebiet der Diagnose und Behandlung vieler Krankheiten, sowohl nicht-erblicher als auch erblicher Art, geschaffen. Sie eröffnete neue Wege bei der Suche nach neuen Medikamenten und Materialien, die in der Medizin verwendet werden. Gentechnik und Biotechnologie haben die Entwicklung bionanotechnologischer Verfahren vorangetrieben.

Im Rahmen der Gentechnik gibt es genetisch und zellular Ingenieurwesen. Gentechnik ist die Manipulation zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle. Diese Methode wird oft als molekulares Klonen, Genklonen, rekombinante DNA-Technologie oder einfach genetische Manipulation bezeichnet. Es ist wichtig zu betonen, dass das Objekt der Gentechnik DNA-Moleküle, einzelne Gene sind. Im Gegensatz dazu versteht man unter Zell-Engineering genetische Manipulationen mit isolierten Einzelzellen oder Gruppen von pflanzlichen und tierischen Zellen.

GENTECHNIK UND IHRE WERKZEUGE

Gentechnik ist eine Reihe verschiedener experimenteller Techniken (Methoden), die die Konstruktion (Rekonstruktion), das Klonen von DNA-Molekülen und Genen mit bestimmten Zielen ermöglichen.

Gentechnische Methoden werden in einer bestimmten Reihenfolge angewendet (Abb. 127), und in der Ausführung werden mehrere Stufen unterschieden

ein typisches gentechnisches Experiment, das darauf abzielt, ein Gen zu klonen, nämlich:

1. Isolierung von Plasmid-DNA aus den Zellen des interessierenden Organismus (anfänglich) und Isolierung des DNA-Vektors.

2. Schneiden (Restriktion) der DNA des ursprünglichen Organismus in Fragmente, die die interessierenden Gene enthalten, unter Verwendung eines der Restriktionsenzyme und Isolieren dieser Gene aus dem Restriktionsgemisch. Gleichzeitig wird die Vektor-DNA geschnitten (eingeschränkt), wodurch sie von einer kreisförmigen Struktur in eine lineare umgewandelt wird.

3. Verknüpfung des interessierenden DNA-Segments (Gens) mit der Vektor-DNA, um hybride DNA-Moleküle zu erhalten.

4. Einbringen rekombinanter DNA-Moleküle durch Transformation in einen anderen Organismus, zum Beispiel in E coli oder somatische Zellen.

5. Inokulation von Bakterien, in die Hybrid-DNA-Moleküle eingeführt wurden, auf Nährmedien, die das Wachstum nur von Zellen ermöglichen, die Hybrid-DNA-Moleküle enthalten.

6. Identifizierung von Kolonien, die aus Bakterien bestehen, die hybride DNA-Moleküle enthalten.

7. Isolierung von klonierter DNA (klonierte Gene) und ihre Charakterisierung, einschließlich Sequenzierung von stickstoffhaltigen Basen in dem klonierten DNA-Fragment.

Reis. 127.Aufeinanderfolgende Stufen des gentechnischen Experiments

Bakterien entwickelten im Laufe der Evolution die Fähigkeit, sogenannte Restriktionsenzyme (Endonukleasen) zu synthetisieren, die Teil des zellulären (bakteriellen) Restriktions-Modifikationssystems wurden. Bei Bakterien sind Restriktions-Modifikations-Systeme das intrazelluläre Immunabwehrsystem gegen fremde DNA. Im Gegensatz zu höheren Organismen, bei denen die Erkennung und Zerstörung von Viren, Bakterien und anderen Krankheitserregern extrazellulär erfolgt, erfolgt bei Bakterien der Schutz vor fremder DNA (DNA von Pflanzen und Tieren, in denen sie leben) intrazellulär, d.h. wenn fremde DNA in das Zytoplasma von Bakterien gelangt. Um sich zu schützen, haben Bakterien auch die Fähigkeit entwickelt, ihre eigene DNA an bestimmten Sequenzen mit methylierenden Basen zu „markieren“. Aus dem gleichen Grund wird fremde DNA aufgrund des Fehlens von Methylgruppen an denselben Sequenzen von verschiedenen bakteriellen Restriktasen in Fragmente geschmolzen (geschnitten) und dann von bakteriellen Exonukleasen zu Nukleotiden abgebaut. Wir können sagen, dass sich Bakterien auf diese Weise vor der DNA von Pflanzen und Tieren schützen, in deren Organismus sie vorübergehend (als Krankheitserreger) oder dauerhaft (als Saprophyten) leben.

Aus Restriktionsenzymen wurden zunächst isoliert E coli im Jahr 1968. Es stellte sich heraus, dass sie in der Lage sind, DNA-Moleküle an verschiedenen Stellen (Orten) der Restriktion zu schneiden (zu schmelzen). Diese Enzyme wurden als Klasse-I-Endonukleasen bezeichnet, dann wurden in Bakterien Klasse-II-Endonukleasen gefunden, die spezifisch Restriktionsstellen in fremder DNA erkennen und an diesen Stellen auch Restriktionen durchführen. Es sind die Enzyme dieser Klasse, die in der Gentechnik eingesetzt wurden. Gleichzeitig wurden Klasse-III-Enzyme entdeckt, die DNA in der Nähe von Erkennungsstellen schmelzen, aber diese Enzyme spielen in der Gentechnik keine Rolle.

Die Wirkung des Restriktions-Modifikationssystems wird durch die sogenannten palindromischen (erkennenden) Sequenzen stickstoffhaltiger Basen, die DNA-Restriktionsstellen sind, "rationalisiert". Palindromische Sequenzen sind Sequenzen von Basen, die sich vorwärts und rückwärts gleich lesen, wie zum Beispiel die Buchstabenfolge Radar. Da die DNA-Stränge eine antiparallele Richtung haben, gilt eine Sequenz als palindromisch, wenn sie beim Lesen in Richtung vom 5"- zum 3"-Ende am oberen und am unteren Strang vom 3"- zum 5"-Ende identisch ist. Ende, nämlich:

Palindrome können jede Größe haben, aber die meisten Palindrome, die als Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme verwendet werden, sind 4, 5, 6 und selten 8 Basen lang.

Restriktionsenzyme sind ein absolut unverzichtbares Werkzeug in der Gentechnik, um interessierende Fragmente (Gene) aus großen DNA-Molekülen herauszuschneiden. Da mehr als 100 Restriktionsenzyme bekannt sind, erlaubt dies die Auswahl von Restriktionsenzymen und das selektive Ausschneiden von Fragmenten aus der ursprünglichen DNA.

Bemerkenswert an Restriktasen ist, dass sie in Leisten Schnitte von Molekülen in mehrere Fragmente (Restriktionen) der DNA erzeugen, wodurch an den entstehenden Enden ein Strang länger als der andere ist und eine Art Schwanz bildet. Solche Enden (Schwänze) werden "klebrige" Enden genannt, da sie zur Selbstkomplementarität fähig sind.

Betrachten Sie die Ergebnisse der Restriktion am Beispiel einer der bekanntesten Restriktasen EcoRI aus dem Restriktions-Modifikationssystem E. coi. Anstatt die DNA im Zentrum der palindromischen Erkennungssequenz zu schmelzen, schmilzt dieses Enzym die DNA außerhalb des Zentrums und erzeugt 4 selbstkomplementäre („klebrige“) Enden, die aus einer unterschiedlichen Anzahl von Nukleotiden bestehen, nämlich:

Diese "klebrigen" Enden sind in der Gentechnik nützlich, da sie bei niedrigen Temperaturen komplementär wieder verbunden werden können, was einen effizienten Verschluss von DNA-Fragmenten ermöglicht.

Erkennungsstellen und Schmelzstellen bei anderen Restriktionasen haben einen anderen Inhalt, nämlich:

Nach der DNA-Restriktion werden aus dem Restriktionsgemisch Restriktions-DNA-Fragmente (DNA-Restriktionen) isoliert, die dann für die Assoziation mit dem Vektor benötigt werden. Restringierte DNA wird mittels Elektrophorese isoliert, da es aufgrund der Größe der restringierten Fragmente und konstanter elektrischer Ladungs-Masse-Verhältnisse sehr einfach ist, restringierte DNA mit dieser Methode zu fraktionieren. Fragmente in einem elektrischen Feld wandern während der Elektrophorese mit einer von ihrer Größe (Masse) abhängigen Frequenz. Je größer (länger) das Bruchstück ist, desto langsamer wandert es im elektrischen Feld. Das Material, in dem die Elektrophorese durchgeführt wird, ist nicht aufladbare Agarose oder Polyacrylamid. Zur Identifizierung der Fragmente wird Ethidiumbromid verwendet, das die Fragmente anfärbt, was zu ihrem leichteren Nachweis führt.

Die Effizienz der Elektrophorese ist sehr hoch, da sie zur Trennung von Fragmenten im Größenbereich von 2 bis 50.000 Basen verwendet werden kann.

Nach der Elektrophorese werden Fragmente aus Agarose mit verschiedenen Verfahren isoliert. Basierend auf den Ergebnissen des Größenvergleichs

Restriktionen derselben DNA, die unter Verwendung unterschiedlicher Restriktionsenzyme erhalten wurden, bilden Restriktionskarten, die die Restriktionsstellen von jedem der verwendeten Restriktionsenzyme zeigen. Restriktionskarten ermöglichen es praktisch, nicht nur die Größe der Restriktionen zu bestimmen, sondern auch die Lage der Loci bestimmter Gene in DNA-Molekülen herauszufinden.

Da in höheren Organismen bei der Transkription heterogene DNA synthetisiert und durch Prozessierung korrigiert wird, wird in der Gentechnik üblicherweise komplementäre DNA (cDNA) verwendet, die unter Verwendung von mRNA als Matrize gewonnen wird, auf der die Reverse Transkriptase einzelsträngige DNA synthetisiert ( cDNA), die eine Kopie der mRNA ist. Anschließend werden diese einzelsträngigen DNAs in doppelsträngige DNAs umgewandelt. Bedenken Sie, dass cDNA kontinuierliche Nukleotidsequenzen enthält (transkribiert und translatiert). Es ist cDNA, die für die Restriktion verwendet wird.

DNA-Fragmente (Restriktionen), die nach der Elektrophorese aus Agarosegelen isoliert wurden, können einer vorläufigen Sequenzierung unterzogen werden; ihre Nukleotidsequenz bestimmen. Dazu werden chemische und enzymatische Sequenzierungsverfahren eingesetzt. Das chemische Verfahren basiert darauf, mit radioaktivem Phosphor ( 32 P) markierte Fragmente zu erhalten und eine der Basen von diesen Fragmenten zu entfernen, gefolgt von der Berücksichtigung der Ergebnisse der Radioautographie von Gelen, die diese Fragmente enthalten. Das enzymatische Verfahren basiert darauf, dass am Ende des analysierten Fragments ein Nukleotid eingeführt wird, das dann zur Synthese verschiedener Fragmente verwendet wird. in vitro, elektrophoretisch auf die Nukleotidsequenz analysiert. Um bestimmte Nukleotidsequenzen in einem DNA-Molekül zu untersuchen, verwenden Sie

auch Hybridisierung von DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern-

und Southern-Blots.

Genetische Vektoren. Der für die molekulare Klonierung vorgesehene DNA-Abschnitt (Gen) muss sich bei der Übertragung in eine Bakterienzelle replizieren können, d.h. eine Replik sein. Diese Fähigkeit besitzt er jedoch nicht. Um den Transfer und Nachweis geklonter Gene in Zellen zu gewährleisten, werden sie daher mit sogenannten genetischen Vektoren kombiniert. Letztere müssen mindestens zwei Eigenschaften haben. Erstens müssen Vektoren in der Lage sein, sich zu replizieren

in Zellen und an mehreren Enden. Zweitens sollten sie die Selektion von Zellen ermöglichen, die den Vektor enthalten, d. h. einen Marker besitzen, für den es möglich ist, Zellen gegenzuselektieren, die den Vektor zusammen mit dem klonierten Gen (rekombinante DNA-Moleküle) enthalten. Plasmide und Phagen erfüllen diese Anforderungen. Plasmide sind gute Vektoren, weil sie Replikons sind und Gene für Resistenz gegen jedes Antibiotikum enthalten können, was die Selektion von Bakterien auf Resistenz gegen dieses Antibiotikum und daher den einfachen Nachweis rekombinanter DNA-Moleküle ermöglicht.

(Abb. 128).

Reis. 128. Vektor pBRl

Da es keine natürlichen Plasmidvektoren gibt, wurden alle bisher bekannten Plasmidvektoren künstlich konstruiert. R-Plasmide dienten als Ausgangsmaterial für die Erstellung einer Reihe genetischer Vektoren, bei denen mit Hilfe von Restriktasen überzählige DNA-Sequenzen, auch solche mit mehreren Restriktionsstellen, entfernt wurden. Diese Entfernung wurde dadurch bestimmt, dass der Plasmidvektor nur eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym haben sollte und diese Stelle in einem funktionell unwichtigen Bereich des Plasmidgenoms liegen sollte. Zum Beispiel der Plasmidvektor pBR 322, der Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenzgene hat, was ihn sehr praktisch macht

für die Selektion von Bakterien, die das klonierte DNA-Segment enthalten, hat es einzelne Restriktionsstellen für mehr als 20 Restriktionsenzyme, einschließlich so gut bekannter Restriktionsenzyme wie Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II und Sal I.

Phagenvektoren haben auch eine Reihe von Vorteilen. Sie können im Vergleich zu Plasmavektoren größere (längere) klonierte DNA-Fragmente enthalten. Außerdem ist der Transfer des klonierten Fragments durch Phagen in Zellen als Folge einer Infektion der letzteren effizienter als eine DNA-Transformation. Schließlich ermöglichen Phagenvektoren ein effizienteres Screening (Erkennung) auf der Agaroberfläche von Kolonien, die Zellen enthalten, die das klonierte Gen tragen. Viele Phagenvektoren basieren auf dem Lambda-Phagen.

Neben Phagen werden auch andere virale Vektoren verwendet, die auf der Basis des Herpesvirus konstruiert wurden, sowie Vektoren, die auf der Basis von Hefe-DNA konstruiert wurden.

Erfolgt die Genklonierung mit Säuger- oder Pflanzenzellen, so gelten die gleichen Anforderungen an Vektoren wie bei der Klonierung in Bakterienzellen.

Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle. Die direkte Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle folgt, nachdem die Restriktion der untersuchten DNA und Vektor-DNA erhalten wurde. Es besteht in der Schließung der Restriktionssegmente der untersuchten DNA mit der Vektor-DNA-Restriktion, die infolge der Restriktion von zirkulärer in lineare DNA umgewandelt wird.

Um die zu untersuchenden DNA-Fragmente mit der DNA des Vektors zu schließen, wird DNA-Ligase verwendet (Abb. 129). Die Ligation gelingt, wenn die zu verbindenden Strukturen 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphatgruppen aufweisen und diese Gruppen in einem geeigneten Verhältnis zueinander stehen. Fragmente werden durch ihre "klebrigen" Enden als Ergebnis der Selbstkomplementarität kombiniert. Bei hohen Fragmentkonzentrationen geraten diese von Zeit zu Zeit in die richtige Position (gegenüber). Viele Restriktasen, wie etwa Eco RI, erzeugen "klebrige" Enden mit vier Basen. Der Prozess der Ligation von "klebrigen" Enden, die aus vier Basen bestehen, erfolgt bei niedriger Temperatur (bis zu 12 ° C).

Reis. 129. DNA-Ligation

Entstehen bei der Restriktion Fragmente ohne „klebrige“ Enden, so werden diese mit Hilfe des Enzyms Transferase „zwangsweise“ in Moleküle mit „klebrigen“ Enden umgewandelt. Dieses Enzym fügt Nukleotide an das 3"-Ende der DNA an. An einem Fragment kann ein Poly-A-Schwanz angefügt werden, am anderen ein Poly-T-Schwanz. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird auch verwendet, um beliebige DNA-Enden zu erzeugen Das Prinzip der PCR beruht auf der Denaturierung von aus Zellen isolierter DNA und deren „Anlagerung" durch Hinzufügen von DNA-Oligonukleotiden bestehend aus jeweils 15–20 Nukleotiden zu den renaturierenden Ketten. Diese Oligonukleotide müssen zu Sequenzen in den durch Abstände von getrennten Ketten komplementär sein 50-2000 Nukleotide DNA-Synthese in vitro, Sie ermöglichen der DNA-Polymerase, die Regionen zu kopieren, die sich zwischen den "Samen" befinden. Dieses Kopieren ergibt eine große Anzahl von Kopien des untersuchten DNA-Fragments.

Einführung rekombinanter DNA-Moleküle in Zellen. Nachdem das interessierende DNA-Fragment (Gen) mit einem genetischen Vektor unter Verwendung von DNA-Ligase fusioniert wurde, werden die resultierenden rekombinanten Moleküle in Zellen eingeführt, um ihre Replikation (aufgrund des genetischen Vektors) zu erreichen und die Anzahl der Kopien zu erhöhen. Die beliebteste Art, rekombinante DNA-Moleküle in Zellen einzuführen, in denen der Vektor ein Plasmid ist, ist die Transformation E coli. Dazu werden Bakterienzellen mit Calcium oder Rubidium (Ionen) vorbehandelt, um

damit sie in der Wahrnehmung rekombinanter DNA "kompetent" werden. Um die Häufigkeit des Eindringens von DNA in Zellen zu erhöhen, wird das Elektroporationsverfahren verwendet, bei dem Zellen kurzzeitig einem starken elektrischen Feld ausgesetzt werden. Durch diese Behandlung entstehen Hohlräume in den Zellmembranen, die den Zellen die Aufnahme von DNA erleichtern. Nach dem Einbringen rekombinanter DNA-Moleküle in Bakterien werden diese auf mit Antibiotika angereichertem MPA (Fleisch-Pepton-Agar) ausgesät, um die gewünschten Zellen zu selektieren, d.h. Zellen, die rekombinante DNA-Moleküle enthalten. Die Transformationshäufigkeit ist gering. Typischerweise tritt eine Transformante pro 10 5 ausgesäten Zellen auf. Wenn der Vektor ein Phage ist, dann werden die Zellen (Bakterien oder Hefe) mit dem Phagen transfiziert. Tierische somatische Zellen werden in Gegenwart von Chemikalien, die den Durchgang von DNA durch Plasmamembranen erleichtern, mit DNA transfiziert. Eine direkte Mikroinjektion von DNA in Eizellen, kultivierte somatische Zellen und Säugetierembryonen ist ebenfalls möglich.

Der wichtigste Punkt im Zusammenhang mit dem molekularen Klonen ist die Suche nach einer Methode, um festzustellen, ob das geklonte Fragment wirklich in dem Vektor enthalten ist und zusammen mit dem Vektor ein rekombinantes DNA-Molekül bildet, das in die Zellen gelangt ist. Wenn wir über Bakterienzellen sprechen, dann basiert eine der Methoden darauf, die Insertionsinaktivierung des Plasmid(Vektor)-Resistenzgens zu berücksichtigen. Beispielsweise befindet sich in dem Plasmidvektor pBR 322, der die Resistenz gegen Ampicillin und Tetracyclin bestimmt, die einzige Stelle für das Restriktionsenzym PstI in dem Locus, der durch das Ampicillin-Resistenzgen besetzt ist. PstI, das an dieser Stelle schmilzt, erzeugt klebrige Enden, die die Ligation des klonierten Fragments an die Vektor-DNA ermöglichen. Allerdings wird in diesem Fall das Ampicillin-Resistenzgen des Plasmids (Vektors) inaktiviert, während das Tetracyclin-Resistenzgen auf dem Vektor intakt bleibt. Es ist das Tetracyclin-Resistenzgen, das verwendet wird, um Zellen zu selektieren, die durch rekombinante DNA-Moleküle transformiert wurden. Damit nachgeprüft werden kann, dass die Zellen der auf dem Medium mit Tetracyclin gewachsenen Kolonien tatsächlich rekombinante DNA-Moleküle enthalten, werden diese mit dem sogenannten „Spot-Test“ auf zwei Schalen mit festem Medium, davon einer, überprüft enthält Ampicillin, während das andere dieses Antibiotikum nicht enthält. Die zu klonierende DNA ist

nur in Tetracyclin-resistenten Transformanten. Die Transformanten, die sowohl gegen Ampicillin als auch gegen Tetracyclin (ArTc) resistent sind, enthalten Plasmid-(Vektor-)Moleküle, die spontan eine kreisförmige Form annahmen, ohne dass fremde (geklonte) DNA darin eingeschlossen war.

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis der Insertion fremder (klonierter) Fragmente in einen Plasmidvektor basiert auf der Verwendung eines Vektors, der das β-Galactosidase-Gen enthält. Die Insertion fremder DNA in dieses Gen inaktiviert unvermeidlich die Synthese von β-Galactosidase, was nachgewiesen werden kann, indem die transformierten Zellen auf einem Medium ausgesät werden, das β-Galactosidase-Substrate enthält. Dieses Medium ermöglicht die Selektion gefärbter Zellkolonien. Es gibt auch andere Methoden.

Wie bereits erwähnt, sind lineare Restriktionsfragmente von Vektor-DNA in der Lage, die kreisförmige Struktur wiederherzustellen, ohne klonierte Segmente darin einzuschließen. Um die Häufigkeit der spontanen Bildung solcher zirkulärer Vektor-DNA-Moleküle zu verringern, wird die Vektor-DNA-Restriktion mit Phosphatase behandelt. Dadurch wird die Bildung ringförmiger DNA-Moleküle unmöglich, da die für die Wirkung der Ligase notwendigen Enden des 5'-PO 4 fehlen.

Der Satz von Transformantenkolonien, die auf einem selektiven Medium gezüchtet werden, ist ein Satz von Zellen, die Klone verschiedener Fragmente (Gene) der klonierten genomischen oder cDNA enthalten. Sammlungen dieser Klone bilden die sogenannten DNA-Bibliotheken, die in der Gentechnik weit verbreitet sind.

Die letzte Phase der Genklonierung ist die Isolierung und Untersuchung der geklonten DNA, einschließlich der Sequenzierung. Vielversprechende Bakterienstämme oder somatische Zellen, die rekombinante DNA-Moleküle enthalten, die die Synthese von interessierenden Proteinen mit kommerziellem Wert steuern, werden an die Industrie weitergegeben.

ZELLTECHNIK

Wie zu Beginn des Kapitels erwähnt, bezieht sich Cell Engineering auf die genetische Manipulation isolierter tierischer und pflanzlicher Zellen. Diese Manipulationen sind oft in vitro, und ihr Hauptziel ist es, Genotypen dieser Organismen mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten, die hauptsächlich wirtschaftlich nützlich sind. Apropos-

Xia man, dann war Cell Engineering auf seine Keimzellen anwendbar.

Voraussetzung für die Entwicklung des Zell-Engineering bei Mensch und Tier war die Entwicklung von Methoden zur Kultivierung ihrer somatischen Zellen auf künstlichen Nährmedien sowie die Gewinnung von Hybriden somatischer Zellen, einschließlich interspezifischer Hybriden. Fortschritte bei der Kultivierung somatischer Zellen wiederum haben die Erforschung von Keimzellen und der Befruchtung bei Mensch und Tier beeinflusst. Seit den 60er Jahren. 20. Jahrhundert In mehreren Laboratorien auf der ganzen Welt wurden zahlreiche Experimente zur Transplantation somatischer Zellkerne in künstlich kernlose Eier durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente waren oft widersprüchlich, führten aber im Allgemeinen zur Entdeckung der Fähigkeit der Zellkerne, die normale Entwicklung des Eies zu gewährleisten (siehe Kapitel IV).

Basierend auf den Ergebnissen der Untersuchung der Entwicklung befruchteter Eier in den 60er Jahren. 20. Jahrhundert Es wurden auch Studien begonnen, um die Möglichkeit der Befruchtung von Eiern außerhalb des Körpers der Mutter festzustellen. Diese Studien führten sehr schnell zur Entdeckung der Möglichkeit der Befruchtung von Eizellen mit Spermien in vitro und der Weiterentwicklung der so gebildeten Embryonen bei der Implantation in die Gebärmutter einer Frau. Die weitere Verbesserung der in diesem Bereich entwickelten Methoden hat dazu geführt, dass die Geburt von „Reagenzglas“-Kindern Realität geworden ist. Bereits 1981 wurden 12 Kinder auf der Welt geboren, deren Leben im Labor, im Reagenzglas gegeben wurde. Gegenwärtig ist dieser Teil des Zell-Engineerings weit verbreitet, und die Zahl der „Reagenzglas“-Kinder beträgt bereits Zehntausende (Abb. 130). In Russland wurde erst 1986 mit der Gewinnung von "Reagenzglas" -Kindern begonnen.

1993 wurde eine Technik entwickelt, um eineiige menschliche Zwillinge zu erhalten in-vitro indem die Embryonen in Blastomere geteilt und letztere auf bis zu 32 Zellen gezüchtet wurden, wonach sie in die Gebärmutter der Frau implantiert werden konnten.

Beeinflusst von den Ergebnissen im Zusammenhang mit Reagenzglasbabys haben Tiere auch eine Technologie namens entwickelt Transplantationen Embryonen. Es ist mit der Entwicklung einer Methode zur Induktion der Poliovulation, Methoden zur künstlichen Befruchtung von Eiern und der Implantation von Embryonen in den Körper von Tieren - Pflegemüttern - verbunden. Die Essenz dieser Technologie ist wie folgt:

schuschy. Einer hochproduktiven Kuh werden Hormone injiziert, was zu einer Poliovulation führt, die aus der Reifung von 10-20 Zellen auf einmal besteht. Die Eizellen werden dann künstlich mit männlichen Keimzellen im Eileiter befruchtet. Am 7.-8. Tag werden die Embryonen aus der Gebärmutter ausgewaschen und in die Gebärmutter anderer Kühe (Pflegemütter) transplantiert, die dann Zwillingskälber gebären. Kälber erben den genetischen Status ihrer ursprünglichen Eltern.

Reis. 130."Tube" Kinder

Ein weiterer Bereich des Zell-Engineerings bei Tieren ist die Schaffung von transgenen Tieren. Der einfachste Weg, solche Tiere zu erhalten, besteht darin, lineare DNA-Moleküle in die Eier der ursprünglichen Tiere einzubringen. Tiere, die sich aus so befruchteten Eiern entwickeln, tragen eine Kopie des eingeführten Gens in einem ihrer Chromosomen und übertragen dieses Gen zusätzlich durch Vererbung. Ein komplexeres Verfahren zum Erhalten transgener Tiere wurde an Mäusen entwickelt, die sich in der Fellfarbe unterscheiden, und ist wie folgt. Zunächst werden vier Tage alte Embryonen aus dem Körper einer schwangeren grauen Maus entnommen und in einzelne Zellen zerkleinert. Dann werden die Kerne aus den embryonalen Zellen extrahiert und in die Eier schwarzer Mäuse übertragen, denen zuvor die Kerne entzogen wurden. Eier der schwarzen Maus, die Fremdkerne enthalten, werden in Reagenzgläser gegeben

mit Nährlösung zur Weiterentwicklung. Aus den Eiern schwarzer Mäuse entwickelte Embryonen werden in die Gebärmutter weißer Mäuse implantiert. Somit war es in diesen Experimenten möglich, einen Klon von Mäusen mit einer grauen Fellfarbe zu erhalten, d. h. Embryonale Zellen mit den gewünschten Eigenschaften klonen. In Kapitel IV haben wir die Ergebnisse der Befruchtung künstlich kernloser Schafeier mit dem Kernmaterial somatischer Zellen von Tieren der gleichen Art untersucht. Insbesondere wurden die Kerne aus den Eiern von Schafen entfernt und dann die Kerne von somatischen Zellen (Embryonen-, Frucht- oder Zellen von erwachsenen Tieren) in solche Eier eingeführt, wonach die auf diese Weise befruchteten Eier in die Gebärmutter von eingeführt wurden erwachsene Schafe. Es stellte sich heraus, dass die geborenen Lämmer mit dem Spenderschaf identisch waren. Ein Beispiel ist Dolly das Schaf. Klonkälber, Mäuse, Kaninchen, Katzen, Maultiere und andere Tiere wurden ebenfalls erhalten. Eine solche Konstruktion von transgenen Tieren ist ein direkter Weg zum Klonen von Tieren mit wirtschaftlich nützlichen Merkmalen, einschließlich Individuen eines bestimmten Geschlechts.

Transgene Tiere wurden auch unter Verwendung von Ausgangsmaterial erhalten, das zu verschiedenen Arten gehört. Insbesondere ist ein Verfahren zur Übertragung eines Gens, das das Wachstumshormon steuert, von Ratten auf Mäuseeier bekannt, sowie ein Verfahren zur Kombination von Schaf-Blastomeren mit Ziegen-Blastomeren, was zur Entstehung von Hybridtieren (Kühen) führte. Diese Experimente weisen auf die Möglichkeit hin, Artenunverträglichkeiten in den frühesten Entwicklungsstadien zu überwinden. Besonders verlockende Aussichten eröffnen sich (bei vollständiger Überwindung der Artenunverträglichkeit) auf dem Weg der Befruchtung der Eier einer Art durch die Kerne somatischer Zellen einer anderen Art. Wir sprechen über die reale Aussicht, wirtschaftlich wertvolle Hybriden von Tieren zu schaffen, die nicht durch Kreuzung erhalten werden können.

Es sollte beachtet werden, dass die Kerntransplantationsarbeit noch nicht sehr effektiv ist. An Amphibien und Säugetieren durchgeführte Experimente haben im Allgemeinen gezeigt, dass ihre Wirksamkeit gering ist und von der Inkompatibilität zwischen Spenderkernen und Empfängereizellen abhängt. Auch die im Laufe der weiteren Entwicklung entstehenden Chromosomenaberrationen in den transplantierten Zellkernen, die mit dem Tod transgener Tiere einhergehen, stehen dem Erfolg entgegen.

An der Schnittstelle von Arbeiten zur Untersuchung der Zellhybridisierung und immunologischen Studien trat ein Problem auf, das mit der Herstellung und Untersuchung sogenannter monoklonaler Antikörper verbunden war. Wie oben erwähnt, sind die vom Körper als Reaktion auf die Einführung eines Antigens (Bakterien, Viren, rote Blutkörperchen usw.) produzierten Antikörper Proteine, die als Immunglobuline bezeichnet werden und einen grundlegenden Teil des körpereigenen Abwehrsystems gegen Krankheitserreger bilden. Aber jeder Fremdkörper, der in den Körper eingeführt wird, ist eine Mischung verschiedener Antigene, die die Produktion verschiedener Antikörper stimulieren. Zum Beispiel haben menschliche Erythrozyten nicht nur Antigene für die Blutgruppen A (II) und B (III), sondern auch viele andere Antigene, einschließlich des Rh-Faktors. Darüber hinaus können auch bakterielle Zellwandproteine ​​oder das Kapsid von Viren als unterschiedliche Antigene wirken und die Bildung verschiedener Antikörper bewirken. Gleichzeitig werden die lymphatischen Zellen des körpereigenen Immunsystems meist durch Klone repräsentiert. Das bedeutet, dass Antikörper im Blutserum immunisierter Tiere schon aus diesem Grund immer ein Gemisch aus Antikörpern sind, die von Zellen verschiedener Klone produziert werden. Inzwischen werden für praktische Zwecke nur Antikörper eines Typs benötigt; sogenannte monospezifische Seren, die Antikörper nur eines Typs oder, wie sie genannt werden, monoklonale Antikörper enthalten.

Auf der Suche nach Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper entdeckten Schweizer Forscher 1975 ein Hybridisierungsverfahren zwischen mit dem einen oder anderen Antigen immunisierten Mauslymphozyten und kultivierten Knochenmarktumorzellen. Solche Hybriden werden "Hybridoma" genannt. Aus dem „lymphozytären“ Teil, dargestellt durch einen Lymphozyten eines Klons, erbt ein einzelnes Hybridom die Fähigkeit, die Bildung der erforderlichen Antikörper des gleichen Typs zu bewirken, und dank des „Tumor (Myelom)“-Teils wird es wie alle Tumorzellen in der Lage, sich auf künstlichen Nährmedien unbegrenzt zu vermehren, wodurch eine große Population von Hybriden entsteht. Auf Abb. 131 zeigt ein Schema zur Isolierung von Zellinien, die monoklonale Antikörper synthetisieren. Mauszelllinien, die monoklonale Antikörper produzieren, werden isoliert, indem Myelomzellen mit Lymphozyten aus der Milz von fünf Tage zuvor immunisierten Mäusen fusioniert werden.

gewünschtes Antigen. Die Zellfusion wird erreicht, indem sie in Gegenwart von Polyethylenglycol gemischt werden, das die Fusion von Zellmembranen induziert, und sie dann auf ein Nährmedium geimpft werden, das das Wachstum und die Reproduktion von nur Hybridzellen (Hybridom) ermöglicht. Die Vermehrung von Hybridomen erfolgt in einem flüssigen Medium, wo sie weiter wachsen und Antikörper in die Kulturflüssigkeit sezernieren, und zwar nur eine Sorte in unbegrenzter Menge. Diese Antikörper werden monoklonal genannt. Um die Häufigkeit der Antikörperbildung zu erhöhen, wird auf das Klonen von Hybridomen zurückgegriffen, d.h. auf die Auswahl einzelner Kolonien von Hybridomen, die in der Lage sind, die größte Menge an Antikörpern des gewünschten Typs zu produzieren. Monoklonale Antikörper haben in der Medizin eine breite Anwendung zur Diagnose und Behandlung einer Reihe von Krankheiten gefunden. Gleichzeitig besteht der wichtigste Vorteil der monoklonalen Technologie darin, dass sie verwendet werden kann, um Antikörper gegen Materialien zu erzeugen, die nicht gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu ist es möglich, monoklonale Antikörper gegen Zell-(Plasma-)Membranen tierischer Neuronen zu erhalten. Dazu werden Mäuse mit isolierten neuronalen Membranen immunisiert, danach werden ihre Milz-Lymphozyten mit Myelomzellen kombiniert und dann wie oben beschrieben vorgegangen.

Reis. 131. Erhalten von monoklonalen Antikörpern

GENTECHNIK UND MEDIZIN

Die Gentechnik hat sich für die Medizin als sehr vielversprechend erwiesen, vor allem bei der Schaffung neuer Technologien zur Gewinnung physiologisch aktiver Proteine, die als Arzneimittel verwendet werden (Insulin, Somatostatin, Interferone, Somatotropin usw.).

Insulin wird zur Behandlung von Menschen mit Diabetes eingesetzt, der nach Herzkrankheiten und Krebs die dritthäufigste Todesursache ist. Der Weltbedarf an Insulin beträgt mehrere zehn Kilogramm. Traditionell wird es aus den Bauchspeicheldrüsen von Schweinen und Kühen gewonnen, aber die Hormone dieser Tiere unterscheiden sich geringfügig von menschlichem Insulin. Schweineinsulin unterscheidet sich in einer Aminosäure, während sich Rinderinsulin in drei unterscheidet. Es wird angenommen, dass tierisches Insulin häufig Nebenwirkungen verursacht. Die chemische Synthese von Insulin wird zwar schon lange betrieben, aber die industrielle Herstellung von Hormonen blieb bisher sehr teuer. Jetzt wird billiges Insulin gentechnisch durch chemisch-enzymatische Synthese des Insulin-Gens gewonnen, gefolgt von der Einführung dieses Gens in E. coli, die dann das Hormon synthetisieren. Ein solches Insulin ist "biologischer", da es chemisch mit dem Insulin identisch ist, das von Zellen der menschlichen Bauchspeicheldrüse produziert wird.

Interferone sind Proteine, die von Zellen hauptsächlich als Reaktion auf eine Infektion des Körpers durch Viren synthetisiert werden. Interferone sind artspezifisch. Beispielsweise gibt es beim Menschen drei Gruppen von Interferonen, die von verschiedenen Zellen unter der Kontrolle der entsprechenden Gene produziert werden. Das Interesse an Interferonen wird durch die Tatsache bestimmt, dass sie in der klinischen Praxis zur Behandlung vieler Erkrankungen des Menschen, insbesondere viraler Erkrankungen, weit verbreitet sind.

Aufgrund ihrer großen Größe sind Interferonmoleküle für die Synthese kaum verfügbar. Daher werden die meisten Interferone heute aus menschlichem Blut gewonnen, aber die Ausbeute bei diesem Gewinnungsverfahren ist gering. Inzwischen ist der Bedarf an Interferon extrem hoch. Dabei stellte sich die Herausforderung, ein effizientes Verfahren zur Herstellung von Interferon in industriellen Mengen zu finden. Gentechnik liegt der modernen Produktion von "bakteriellem" Interferon zugrunde.

Der Einfluss der Gentechnik auf die Technologie der längst biologisch hergestellten Arzneistoffe hat zugenommen. Zurück in die 40er und 50er Jahre. 20. Jahrhundert wurde erstellt

biologische Industrie zur Herstellung von Antibiotika, die der wirksamste Teil des Arzneimittelarsenals der modernen Medizin sind. In den letzten Jahren ist jedoch eine deutliche Zunahme der Arzneimittelresistenz von Bakterien, insbesondere gegenüber Antibiotika, zu verzeichnen. Der Grund liegt in der weiten Verbreitung in der mikrobiellen Welt von Plasmiden, die die Arzneimittelresistenz von Bakterien bestimmen. Aus diesem Grund haben viele früher berühmte Antibiotika ihre frühere Wirksamkeit verloren. Bislang ist die einzige Möglichkeit, die bakterielle Resistenz gegen Antibiotika zu überwinden, die Suche nach neuen Antibiotika. Experten zufolge werden weltweit jährlich etwa 300 neue Antibiotika entwickelt. Die meisten von ihnen sind jedoch entweder unwirksam oder giftig. Jährlich werden nur wenige Antibiotika in die Praxis eingeführt, was es erforderlich macht, die Kapazitäten der Antibiotikaindustrie auf Basis gentechnischer Entwicklungen nicht nur zu erhalten, sondern auch zu erhöhen.

Die Hauptaufgaben der Gentechnik in den Arzneistofftechnologien, in denen Mikroorganismen Arzneimittelproduzenten sind, werden durch die Notwendigkeit ihrer gentechnischen Rekonstruktion zur Steigerung ihrer Aktivität bestimmt. Gleichzeitig

Gleichzeitig begann die Idee, Medikamente in Form kleiner Moleküle herzustellen, zu verwirklichen, was zu ihrer größeren Wirksamkeit beiträgt.

Die Immunbiotechnologie ist in erster Linie mit der Herstellung von Impfstoffen der neuen Generation zur Vorbeugung von Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier verbunden. Die ersten kommerziellen Produkte, die mit Hilfe der Gentechnik hergestellt wurden, waren Impfstoffe gegen menschliche Hepatitis, tierische Maul- und Klauenseuche und einige andere. Eine äußerst wichtige Richtung in diesem Bereich ist mit der Herstellung von monoklonalen Antikörpern verbunden, Reagenzien, die für die Diagnose von Krankheitserregern sowie für die Reinigung von Hormonen, Vitaminen und Proteinen verschiedener Art (Enzyme, Toxine usw.) erforderlich sind.

Von beträchtlichem praktischem Interesse ist das Verfahren zur Gewinnung von künstlichem Hämoglobin durch Einbringen von Hämoglobingenen in Tabakpflanzen, wo α- und β-Globinketten unter der Kontrolle dieser Gene produziert werden, die zu Hämoglobin kombiniert werden. Das in den Zellen von Tabakpflanzen synthetisierte Hämoglobin ist voll funktionsfähig (bindet Sauerstoff). Beim Menschen angewandtes Cell Engineering ist nicht nur mit der Lösung grundlegender Probleme der Humanbiologie verbunden, sondern auch mit der Überwindung vor allem der weiblichen Unfruchtbarkeit. Da die Häufigkeit positiver Fälle der Implantation von Embryonen in die Gebärmutter von Frauen erhalten wurde in vitro, klein ist und dann eineiige Zwillingsembryonen erhält in-vitro ist auch wichtig, da die Möglichkeit einer Reimplantation durch „Reserve“-Embryonen zunimmt. Von besonderem Interesse sind die Aussichten für die Verwendung von Stammzellen als Quelle für Zell- und Gewebeersatz bei der Behandlung von Krankheiten wie Diabetes, Rückenmarksverletzungen, Herzschmerzen, Osteoarthritis und Parkinson-Krankheit. Aber um diese Aussichten zu verwirklichen, ist eine gründliche Untersuchung der Biologie von Stammzellen erforderlich.

Bei der Nutzung der Gentechnik im Zusammenhang mit medizinischen Problemen hat die Aufgabe, gentechnische Verfahren zur radikalen Behandlung von Erbkrankheiten zu entwickeln, die leider noch nicht mit bestehenden Methoden behandelbar sind, besondere Bedeutung erlangt. Inhalt dieser Aufgabe ist es, Wege zur Korrektur (Normalisierung) von Mutationen, die zu Erbkrankheiten führen, zu entwickeln und die Übertragung von „Korrekturen“ durch Vererbung sicherzustellen. Es wird angenommen, dass die Entwicklung gentechnischer Verfahren zur Behandlung von Erbkrankheiten erfolgreich sein wird

zu den Daten über das menschliche Genom beitragen, die im Rahmen der Umsetzung des internationalen wissenschaftlichen Programms "Human Genome" gewonnen werden.

UMWELTPROBLEME DER GENTECHNIK

Die Gentechnik hat die Biotechnologie auf eine neue Ebene gehoben und findet auch Anwendung bei der Entwicklung von Methoden zur Bestimmung und Beseitigung von Umweltverschmutzungen. Insbesondere wurden Bakterienstämme konstruiert, die eine Art Indikator für die mutagene Aktivität chemischer Kontaminanten sind. Andererseits wurden Bakterienstämme, die Plasmide enthalten, gentechnisch verändert, um die Synthese von Enzymen zu kontrollieren, die in der Lage sind, viele chemische Verbindungen zu zerstören, die die Umwelt verschmutzen. Insbesondere einige plasmidhaltige Bakterien sind in der Lage, Öl und Ölprodukte, die durch verschiedene Unfälle oder andere ungünstige Ursachen in die Umwelt gelangt sind, in unschädliche Verbindungen zu zersetzen.

Gentechnik ist jedoch die Umwandlung von genetischem Material, das in der Natur nicht vorkommt. Gentechnische Produkte sind also absolut neue Produkte, die es in der Natur nicht gibt. Sie stellt daher aufgrund der unbekannten Natur ihrer Produkte selbst eine Gefahr sowohl für Natur und Umwelt als auch für das Personal dar, das in Laboratorien arbeitet, die gentechnische Methoden anwenden oder mit im Zuge gentechnischer Arbeiten entstandenen Strukturen arbeiten.

Da die Möglichkeiten des Klonens von Genen endlos sind, stellten sich unter den Wissenschaftlern schon zu Beginn dieser Studien Fragen zur Natur der geschaffenen Organismen. Gleichzeitig gab es Vorschläge zu einer Reihe unerwünschter Folgen dieser Methode, die auch in der Öffentlichkeit Unterstützung fanden. Insbesondere über die Eigenschaften von Bakterien, die in gentechnischen Experimenten tierische Gene erhielten, kam es zu Meinungsverschiedenheiten. Beispielsweise halten sich Bakterien zurück E coli ihre Artzugehörigkeit aufgrund des Gehalts an tierischen Genen, die in sie eingeführt wurden (z. B. das Insulin-Gen), oder sollten sie als neue Art betrachtet werden? Außerdem, wie langlebig solche Bakterien sind, in welchen ökologischen Nischen sie sich aufhalten können

existieren? Aber das Wichtigste war die Entstehung von Befürchtungen, dass bei der Herstellung und Manipulation rekombinanter DNA-Moleküle genetische Strukturen mit unvorhergesehenen und für die menschliche Gesundheit gefährlichen Eigenschaften für das historisch gewachsene ökologische Gleichgewicht geschaffen werden könnten. Gleichzeitig wurden Rufe nach einem Moratorium für die Gentechnik laut. Diese Aufrufe lösten einen internationalen Aufschrei aus und führten 1975 zu einer internationalen Konferenz in den USA, auf der die möglichen Folgen der Forschung auf diesem Gebiet breit diskutiert wurden. Dann wurden in Ländern, in denen sich die Gentechnik zu entwickeln begann, Regeln für die Arbeit mit rekombinanten DNA-Molekülen entwickelt. Diese Regeln sollen verhindern, dass Produkte aus der Tätigkeit gentechnischer Laboratorien in den Lebensraum gelangen.

Ein weiterer Aspekt der unerwünschten Folgen gentechnischer Arbeiten betrifft die Gesundheitsgefährdung des Personals, das in Laboratorien arbeitet, in denen gentechnische Methoden eingesetzt werden, da in diesen Laboratorien gesundheitsschädliche Phenole, Ethidiumbromide, UV-Strahlung verwendet werden. Darüber hinaus besteht in diesen Labors die Möglichkeit einer Kontamination mit Bakterien, die rekombinante DNA-Moleküle enthalten, die unerwünschte Eigenschaften, wie z. B. die Arzneimittelresistenz von Bakterien, kontrollieren. Diese und weitere Punkte bestimmen die Notwendigkeit, das Sicherheitsniveau bei gentechnischen Arbeiten zu verbessern.

Schließlich das Problem der Gefährlichkeit von gentechnisch veränderten Produkten (gentechnisch veränderte Tomaten, Kartoffeln, Mais, Sojabohnen) sowie von Produkten wie Brot, Nudeln, Süßigkeiten, Eiscreme, Käse, Pflanzenöl, Fleischprodukten, die in einer Reihe von Ländern, insbesondere in den Vereinigten Staaten, sind weit verbreitet. Seit 12.000 Jahren Landwirtschaft nutzt der Mensch Naturprodukte. Daher wird davon ausgegangen, dass mit gentechnisch veränderten Lebensmitteln neue Toxine, Allergene, Bakterien und Karzinogene in den menschlichen Körper gelangen, was zu völlig neuen Krankheiten zukünftiger Generationen führen wird. Damit stellt sich die Frage nach einer wirklich wissenschaftlichen Bewertung gentechnisch veränderter Lebensmittel.

THEMEN ZUR DISKUSSION

1. Was versteht man unter Gen-, Zell- und Gentechnik? Gibt es einen Unterschied zwischen diesen Konzepten und dem molekularen Klonen?

2. Was ist der fortschrittliche Charakter der Gentechnik im Vergleich zu anderen Methoden der Biologie?

3. Nennen Sie die wichtigsten „Werkzeuge“ der Gentechnik.

4. Was sind Restriktionsenzyme, was sind ihre Eigenschaften und ihre Rolle in der Gentechnik?

5. Bilden alle Restriktasen "klebrige" Enden der untersuchten DNA und hängt die Struktur der "klebrigen" Enden von der Art der Restriktase ab?

6. Genetische Vektoren definieren. Gibt es natürliche Vektoren?

7. Wie werden genetische Vektoren im Labor gewonnen? Welche biologischen Objekte sind das Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Vektoren?

8. Was ist die maximale Länge von DNA-Stickstoffbasensequenzen, die noch in einem genetischen Vektor enthalten sein können? Unterscheiden sich Vektoren in "Macht"?

9. Beschreiben Sie die Eigenschaften der DNA-Ligase und bestimmen Sie ihre Rolle in der Gentechnik.

10. Wie wird ein geklontes DNA-Segment (Gen) mit einem genetischen Vektor verknüpft?

11. Wie häufig werden rekombinante DNA-Moleküle in Bakterienzellen eingeführt?

12. Auf welchem ​​Prinzip basiert die Selektion von Bakterienzellen, die rekombinante DNA-Moleküle enthalten? Geben Sie ein Beispiel für eine solche Auswahl.

14. Viele Bakterienstämme haben die gleichen Enzyme, die für fast den gleichen Stoffwechsel sorgen. Unterdessen ist die Nukleotidspezifität bakterieller Restriktionsmodifikationssysteme unterschiedlich. Können Sie sich dieses Phänomen erklären?

15. Warum können DNA-Sequenzen, die Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme darstellen, nicht mehr als acht Basenpaare enthalten?

16. Wie oft kommt die vom Hae III-Restriktionsenzym erkannte HHCC-Sequenz in einem 50.000 bp großen DNA-Segment mit 30, 50 und 70 Prozent HC-Gehalt vor?

17. Die Restriktionsenzyme Bam HI und Bgl I schmelzen die G-GATCC- bzw. T-GATCA-Sequenzen. Können durch BglI-Restriktion produzierte DNA-Fragmente in die BamHI-Stelle aufgenommen werden? Wenn ja, warum? Wenn das verwendete Plasmid (Vektor) eine Bgl I-Restriktionsstelle enthält, dann auf welchem ​​Nährmedium können Bakterien selektiert werden, dieses Plasmid?

18. Berechnen Sie die Häufigkeit der bakteriellen Transformation pro DNA-Molekül, wenn 5-10 5 Transformanten pro 5000 Plasmid-Basenpaare gebildet werden?

19. Ist es möglich, den 0-Punkt der DNA-Replikation zu klonen? E coli und wenn ja, wie?

20. Ist es möglich zu bestimmen, wie viele DNA-Moleküle benötigt werden, um eine Zelle zu transformieren? E coli?

21. Ist es möglich, die Spleißstelle auf mRNA mittels Polymerase-Kettenreaktion zu bestimmen?

22. Wie kann die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, um die gewünschte Restriktionsstelle an der interessierenden Stelle auf dem zu klonierenden DNA-Fragment einzuführen?

23. Nennen Sie die Methoden der Zellzüchtung, wie sie bei Tieren angewendet werden. Welchen wirtschaftlichen Wert haben die mit diesen Methoden produzierten Tiere?

24. Definieren Sie die Begriffe „transgene Pflanzen“ und „transgene Tiere“. Behalten transgene Organismen ihre Art oder können sie als Organismen einer neuen Art betrachtet werden?

25. Was sind Hybridome und monoklonale Antikörper? Wie werden sie aufgenommen?

26. Ist Zell-Engineering auf den Menschen anwendbar?

27. Angenommen, die Injektion fremder DNA in ein Mäuseei und die Implantation des auf diese Weise befruchteten Eies in den Körper einer Maus endete mit ihrer Trächtigkeit und der Geburt von Mäusen, die Kopien der injizierten DNA im Genom enthalten. Die Mäuse entpuppten sich jedoch als Mosaike; Einige ihrer Zellen enthalten Kopien der injizierten DNA, anderen fehlt diese DNA. Können Sie die Natur dieses Phänomens erklären?

28. Halten Sie Lebensmittel, die aus gentechnisch veränderten Lebensmitteln hergestellt wurden, für genetisch gefährlich?

29. Ist eine wissenschaftliche Überprüfung gentechnisch veränderter Lebensmittel notwendig?

Erkenntnis wird durch das bestimmt, was wir als Wahrheit bestätigen.

PA Florensky, 1923

Beim Menschen angewendet, könnte die Gentechnik zur Behandlung von Erbkrankheiten eingesetzt werden. Technisch gesehen besteht jedoch ein erheblicher Unterschied zwischen der Behandlung des Patienten selbst und der Veränderung des Genoms seiner Nachkommen.

Die Aufgabe, das Genom eines Erwachsenen zu verändern, ist etwas schwieriger als die Züchtung neuer gentechnisch veränderter Tierrassen, da in diesem Fall das Genom zahlreicher Zellen eines bereits gebildeten Organismus und nicht nur einer embryonalen Eizelle verändert werden muss. Dazu wird vorgeschlagen, virale Partikel als Vektor zu verwenden. Viruspartikel können in einen erheblichen Prozentsatz erwachsener Zellen eindringen und ihre Erbinformationen darin einbetten; mögliche kontrollierte Vermehrung von Viruspartikeln im Körper. Gleichzeitig versuchen Wissenschaftler, um Nebenwirkungen zu reduzieren, die Einführung von gentechnisch veränderter DNA in die Zellen der Geschlechtsorgane zu vermeiden, wodurch eine Exposition gegenüber den zukünftigen Nachkommen des Patienten vermieden wird. Bemerkenswert ist auch die erhebliche Kritik an dieser Technologie in den Medien: Die Entwicklung gentechnisch veränderter Viren wird von vielen als Bedrohung für die gesamte Menschheit wahrgenommen.

Mit Hilfe der Gentherapie ist es in Zukunft möglich, das menschliche Genom zu verändern. Derzeit werden wirksame Methoden zur Modifikation des menschlichen Genoms entwickelt und an Primaten getestet. Die Gentechnik von Affen hatte lange Zeit mit großen Schwierigkeiten zu kämpfen, doch 2009 waren die Experimente von Erfolg gekrönt: In der Zeitschrift Nature erschien eine Veröffentlichung über den erfolgreichen Einsatz gentechnisch veränderter viraler Vektoren zur Heilung eines erwachsenen männlichen Affen von Farbenblindheit. Im selben Jahr brachte der erste gentechnisch veränderte Primat (aus einem veränderten Ei gezüchtet) Nachkommen hervor - das Weißbüschelaffen.

Gentechnik wird, wenn auch in geringem Umfang, bereits eingesetzt, um Frauen mit einigen Arten von Unfruchtbarkeit eine Chance zu geben, schwanger zu werden. Verwenden Sie dazu die Eier einer gesunden Frau. Das Kind erbt somit den Genotyp von einem Vater und zwei Müttern.

Die Möglichkeit, bedeutendere Veränderungen im menschlichen Genom einzuführen, steht jedoch vor einer Reihe ernsthafter ethischer Probleme.

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Gentechnik (Gentechnik)

Dies ist eine Reihe von Techniken, Methoden und Technologien zum Gewinnen rekombinanter RNA und DNA, zum Isolieren von Genen aus einem Organismus (Zellen), zum Manipulieren von Genen und zum Einführen dieser in andere Organismen.

Die Gentechnik ist keine Wissenschaft im weitesten Sinne, sondern ein Werkzeug Biotechnologie mit den Methoden biologischer Wissenschaften wie Molekular- und Zellbiologie, Zytologie, Genetik, Mikrobiologie, Virologie.

Ein wichtiger Bestandteil der Biotechnologie ist die Gentechnik. Anfang der 70er Jahre geboren, hat sie heute große Erfolge vorzuweisen. Gentechnische Techniken verwandeln Bakterien-, Hefe- und Säugetierzellen in „Fabriken“ für die großtechnische Produktion beliebiger Proteine. Dadurch ist es möglich, die Struktur und Funktion von Proteinen im Detail zu analysieren und als Arzneimittel einzusetzen.

Derzeit ist Escherichia coli (E. coli) zu einem Lieferanten von so wichtigen Hormonen wie Insulin und Somatotropin geworden. Früher wurde Insulin aus tierischen Bauchspeicheldrüsenzellen gewonnen, daher waren die Kosten sehr hoch. Um 100 g kristallines Insulin zu erhalten, werden 800-1000 kg Bauchspeicheldrüse benötigt, und eine Drüse einer Kuh wiegt 200-250 Gramm. Dies machte Insulin teuer und für viele Diabetiker schwer zugänglich. 1978 stellten Forscher bei Genentech das erste Insulin in einem speziell konstruierten Stamm von Escherichia coli her. Insulin besteht aus zwei Polypeptidketten A und B, 20 und 30 Aminosäuren lang. Wenn sie durch Disulfidbindungen verbunden sind, wird natives doppelkettiges Insulin gebildet. Es hat sich gezeigt, dass es keine E. coli-Proteine, Endotoxine und andere Verunreinigungen enthält, keine Nebenwirkungen wie tierisches Insulin hat und sich von diesem in der biologischen Aktivität nicht unterscheidet. Anschließend wurde Proinsulin in E. coli-Zellen synthetisiert, wofür mittels reverser Transkriptase eine DNA-Kopie auf der RNA-Matrize synthetisiert wurde. Nach der Reinigung des gewonnenen Proinsulins wurde es gespalten und natives Insulin gewonnen, während die Stufen der Extraktion und Isolierung des Hormons minimiert wurden. Aus 1000 Liter Kulturflüssigkeit können bis zu 200 Gramm des Hormons gewonnen werden, was der Insulinmenge entspricht, die von 1600 kg Bauchspeicheldrüse eines Schweins oder einer Kuh ausgeschieden wird.

Somatotropin ist ein menschliches Wachstumshormon, das von der Hypophyse ausgeschüttet wird. Der Mangel an diesem Hormon führt zu Hypophysen-Zwergwuchs. Wenn Somatotropin dreimal pro Woche in Dosen von 10 mg pro kg Körpergewicht verabreicht wird, kann ein Kind, das an seinem Mangel leidet, in einem Jahr um 6 cm wachsen. Somit waren die verfügbaren Hormonmengen begrenzt, außerdem war das durch dieses Verfahren produzierte Hormon heterogen und konnte sich langsam entwickelnde Viren enthalten. Das Unternehmen "Genentec" entwickelte 1980 eine Technologie zur Herstellung von Somatotropin unter Verwendung von Bakterien, die diese Mängel nicht aufwies. 1982 wurde menschliches Wachstumshormon in der Kultur von E. coli und tierischen Zellen am Institut Pasteur in Frankreich gewonnen, und seit 1984 hat die industrielle Produktion von Insulin in der UdSSR begonnen. Bei der Produktion von Interferon werden sowohl E. coli, S. cerevisae (Hefe) als auch eine Kultur von Fibroblasten oder transformierten Leukozyten verwendet. Sichere und billige Impfstoffe werden auch durch ähnliche Verfahren erhalten.

Die Herstellung hochspezifischer DNA-Sonden basiert auf der Technologie der rekombinanten DNA, mit deren Hilfe sie die Genexpression in Geweben, die Lokalisierung von Genen in Chromosomen untersuchen und Gene mit verwandten Funktionen (z. B. bei Menschen und Hühnern) identifizieren ). DNA-Sonden werden auch bei der Diagnose verschiedener Krankheiten verwendet.
Die rekombinante DNA-Technologie hat einen unkonventionellen Protein-Gen-Ansatz ermöglicht, der als reverse Genetik bezeichnet wird. Bei diesem Ansatz wird ein Protein aus der Zelle isoliert, das Gen dieses Proteins kloniert und modifiziert, wodurch ein mutiertes Gen entsteht, das eine veränderte Form des Proteins codiert. Das resultierende Gen wird in die Zelle eingeführt. Wenn es exprimiert wird, synthetisieren die Zelle, die es trägt, und ihre Nachkommen das veränderte Protein. So können defekte Gene korrigiert und Erbkrankheiten behandelt werden.

Wird die Hybrid-DNA in ein befruchtetes Ei eingebracht, können transgene Organismen erhalten werden, die das mutierte Gen exprimieren und an die Nachkommen weitergeben. Die genetische Transformation von Tieren ermöglicht es, die Rolle einzelner Gene und ihrer Proteinprodukte sowohl bei der Regulation der Aktivität anderer Gene als auch bei verschiedenen pathologischen Prozessen festzustellen. Mit Hilfe der Gentechnik wurden Tierlinien geschaffen, die gegen Viruskrankheiten resistent sind, sowie Tierrassen mit für den Menschen nützlichen Eigenschaften. Beispielsweise ermöglichte die Mikroinjektion von rekombinanter DNA, die das Rinder-Somatotropin-Gen enthielt, in eine Kaninchen-Zygote, ein transgenes Tier mit einer Hyperproduktion dieses Hormons zu erhalten. Die resultierenden Tiere hatten eine ausgeprägte Akromegalie.
Jetzt ist es sogar schwierig, alle Möglichkeiten vorherzusagen, die sich in den nächsten Jahrzehnten realisieren werden.

Gentechnik ist ein Gebiet der Biotechnologie, das die Aktionen der Umordnung von Genotypen umfasst. Schon heute ermöglicht die Gentechnik das An- und Abschalten einzelner Gene und damit die Steuerung der Aktivität von Organismen sowie die Übertragung genetischer Anweisungen von einem Organismus auf einen anderen, auch auf Organismen einer anderen Art. Da Genetiker mehr und mehr über die Arbeit von Genen und Proteinen lernen, wird es immer realer, den Genotyp (hauptsächlich den Menschen) willkürlich programmieren zu können, um leicht beliebige Ergebnisse zu erzielen: wie zum Beispiel Strahlungsresistenz, die Fähigkeit, unter Wasser zu leben , die Fähigkeit zur Regeneration geschädigter Organe und sogar Unsterblichkeit.

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  Die Gentechnik dient dazu, die gewünschten Eigenschaften eines veränderten oder gentechnisch veränderten Organismus zu erreichen. Im Gegensatz zur traditionellen Züchtung, bei der das Erbgut nur indirekt verändert wird, ermöglicht die Gentechnik mit der Technik des molekularen Klonens einen direkten Eingriff in den genetischen Apparat. Anwendungsbeispiele der Gentechnik sind die Produktion neuer gentechnisch veränderter Nutzpflanzen, die Produktion von Humaninsulin mit gentechnisch veränderten Bakterien, die Produktion von Erythropoietin in Zellkultur oder neue Züchtungen von Versuchsmäusen für die wissenschaftliche Forschung.

  Die Basis der mikrobiologischen, biosynthetischen Industrie ist die Bakterienzelle. Die für die industrielle Produktion notwendigen Zellen werden nach bestimmten Kriterien ausgewählt, von denen das wichtigste die Fähigkeit ist, eine bestimmte Verbindung - eine Aminosäure oder ein Antibiotikum, ein Steroidhormon oder eine organische Säure - in möglichst großen Mengen herzustellen und zu synthetisieren . Manchmal ist es notwendig, einen Mikroorganismus zu haben, der beispielsweise Öl oder Abwasser als „Nahrung“ nutzen und zu Biomasse oder sogar Protein verarbeiten kann, das sich gut für Futterzusatzstoffe eignet. Manchmal werden Organismen benötigt, die bei erhöhten Temperaturen oder in Gegenwart von Substanzen wachsen können, die für andere Arten von Mikroorganismen zweifellos tödlich sind.

  Die Aufgabe, solche Industriestämme zu gewinnen, ist sehr wichtig, zu ihrer Modifikation und Selektion wurden zahlreiche Methoden der aktiven Beeinflussung der Zelle entwickelt - von der Behandlung mit starken Giften bis zur radioaktiven Bestrahlung. Der Zweck dieser Techniken ist derselbe - eine Veränderung des erblichen, genetischen Apparats der Zelle zu erreichen. Ihr Ergebnis ist die Produktion zahlreicher mutierter Mikroben, von denen Wissenschaftler dann versuchen, aus Hunderten und Tausenden die für einen bestimmten Zweck am besten geeignete auszuwählen. Die Entwicklung von Techniken zur chemischen Mutagenese oder Strahlungsmutagenese war eine herausragende Errungenschaft in der Biologie und wird in der modernen Biotechnologie häufig verwendet.

  Ihre Fähigkeiten sind jedoch durch die Natur der Mikroorganismen selbst begrenzt. Sie sind nicht in der Lage, eine Reihe wertvoller Substanzen zu synthetisieren, die sich in Pflanzen, vor allem in Arznei- und ätherischen Ölpflanzen, anreichern. Sie können Substanzen, die für das Leben von Tieren und Menschen sehr wichtig sind, eine Reihe von Enzymen, Peptidhormonen, Immunproteinen, Interferonen und viele andere einfach aufgebaute Verbindungen, die in Tieren und Menschen synthetisiert werden, nicht synthetisieren. Natürlich sind die Möglichkeiten der Mikroorganismen noch lange nicht ausgeschöpft. Von der Fülle an Mikroorganismen wurde bisher nur ein winziger Bruchteil von der Wissenschaft und insbesondere von der Industrie genutzt. Für die Zwecke der Mikroorganismenselektion von großem Interesse sind zum Beispiel anaerobe Bakterien, die in Abwesenheit von Sauerstoff leben können, Phototrophe, die Lichtenergie nutzen wie Pflanzen, Chemoautotrophe, thermophile Bakterien, die bei einer Temperatur leben können, wie sie kürzlich entdeckt wurde , von etwa 110 ° C usw.

  Und doch liegen die Grenzen des „Naturmaterials“ auf der Hand. Sie versuchten und versuchen, die Beschränkungen mit Hilfe von Zellkulturen und Geweben von Pflanzen und Tieren zu umgehen. Dies ist ein sehr wichtiger und vielversprechender Weg, der auch in der Biotechnologie umgesetzt wird. In den vergangenen Jahrzehnten haben Wissenschaftler Methoden entwickelt, mit denen einzelne Zellen eines pflanzlichen oder tierischen Gewebes wie Bakterienzellen getrennt vom Körper wachsen und sich vermehren können. Das war eine wichtige Errungenschaft – die entstandenen Zellkulturen werden für Experimente und für die industrielle Produktion bestimmter Substanzen verwendet, die mit Bakterienkulturen nicht gewonnen werden können.

  Eine weitere Forschungsrichtung ist die Entfernung von Genen aus der DNA, die für die Codierung von Proteinen und das Funktionieren von Organismen unnötig sind, und die Schaffung künstlicher Organismen auf der Grundlage solcher DNA mit einem "verkürzten Satz" von Genen. Dadurch ist es möglich, die Resistenz modifizierter Organismen gegenüber Viren stark zu erhöhen.

  Entwicklungsgeschichte und erreichter Stand der Technik

  In der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts wurden mehrere wichtige Entdeckungen und Erfindungen gemacht, die zugrunde liegen Gentechnik. Langjährige Versuche, die in den Genen „aufgezeichnete“ biologische Information zu „lesen“, wurden erfolgreich abgeschlossen. Diese Arbeit wurde von dem englischen Wissenschaftler Frederick Senger und dem amerikanischen Wissenschaftler Walter Gilbert (Nobelpreis für Chemie 1980) begonnen. Wie Sie wissen, enthalten Gene Informationen – Anweisungen für die Synthese von RNA-Molekülen und Proteinen im Körper, einschließlich Enzymen. Um eine Zelle dazu zu zwingen, neue, für sie ungewöhnliche Substanzen zu synthetisieren, ist es notwendig, dass die entsprechenden Enzymsätze in ihr synthetisiert werden. Und dazu ist es notwendig, entweder die Gene darin gezielt zu verändern oder neue, bisher fehlende Gene einzuführen. Veränderungen in Genen in lebenden Zellen sind Mutationen. Sie treten beispielsweise unter dem Einfluss von Mutagenen - chemischen Giften oder Strahlung - auf. Aber solche Veränderungen können nicht kontrolliert oder gesteuert werden. Deshalb haben Wissenschaftler ihre Bemühungen darauf konzentriert, Methoden zu entwickeln, um neue, sehr spezifische Gene, die ein Mensch braucht, in die Zelle einzubringen.

  Die Hauptschritte zur Lösung des Gentechnikproblems sind wie folgt:

  1. Erhalten eines isolierten Gens.
  2. Einschleusen eines Gens in einen Vektor zum Transfer in einen Organismus.
  3. Transfer eines Vektors mit einem Gen in einen veränderten Organismus.
  4. Transformation von Körperzellen.
  5. Auswahl gentechnisch veränderter Organismen ( GVO) und Entfernen derjenigen, die nicht erfolgreich geändert wurden.

  Der Prozess der Gensynthese ist derzeit sehr weit entwickelt und sogar weitgehend automatisiert. Es gibt spezielle Geräte, die mit Computern ausgestattet sind, in deren Speicher Programme zur Synthese verschiedener Nukleotidsequenzen gespeichert sind. Eine solche Vorrichtung synthetisiert DNA-Segmente mit einer Länge von bis zu 100-120 stickstoffhaltigen Basen (Oligonukleotide). Eine Technik ist weit verbreitet, die die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion für die DNA-Synthese, einschließlich mutanter DNA, erlaubt. Darin wird ein thermostabiles Enzym, DNA-Polymerase, zur Matrizensynthese von DNA verwendet, die als Keim für künstlich synthetisierte Nukleinsäurestücke - Oligonukleotide - verwendet wird. Das Reverse-Transkriptase-Enzym ermöglicht es, DNA unter Verwendung solcher Primer (Primer) auf einer aus Zellen isolierten RNA-Matrix zu synthetisieren. Auf diese Weise synthetisierte DNA wird als komplementäre (RNA) oder cDNA bezeichnet. Ein isoliertes, "chemisch reines" Gen kann auch aus einer Phagenbibliothek gewonnen werden. Dies ist der Name eines Bakteriophagenpräparats, in dessen Genom zufällige Fragmente des Genoms oder der cDNA eingefügt werden, die vom Phagen zusammen mit seiner gesamten DNA reproduziert werden.

  Die Technik des Einschleusens von Genen in Bakterien wurde entwickelt, nachdem Frederick Griffith das Phänomen der bakteriellen Transformation entdeckt hatte. Dieses Phänomen basiert auf einem primitiven Sexualprozess, der in Bakterien mit dem Austausch kleiner Fragmente nicht-chromosomaler DNA, Plasmiden, einhergeht. Plasmidtechnologien bildeten die Grundlage für das Einbringen künstlicher Gene in Bakterienzellen.

  Die Einführung eines vorgefertigten Gens in den Erbapparat pflanzlicher und tierischer Zellen war mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden. In der Natur gibt es jedoch Fälle, in denen fremde DNA (eines Virus oder eines Bakteriophagen) in den genetischen Apparat einer Zelle aufgenommen wird und mit Hilfe ihrer Stoffwechselmechanismen beginnt, „ihr eigenes“ Protein zu synthetisieren. Wissenschaftler untersuchten die Merkmale der Einführung fremder DNA und verwendeten sie als Prinzip für die Einführung von genetischem Material in eine Zelle. Dieser Vorgang wird als Transfektion bezeichnet.

  Werden Einzeller oder Mehrzellerkulturen verändert, beginnt hier das Klonen, also die Selektion der veränderten Organismen und ihrer Nachkommen (Klone). Wenn es darum geht, vielzellige Organismen zu erhalten, werden Zellen mit verändertem Genotyp zur vegetativen Vermehrung von Pflanzen verwendet oder bei Tieren in die Blastozysten einer Leihmutter injiziert. Als Ergebnis werden Jungtiere mit verändertem oder unverändertem Genotyp geboren, von denen nur diejenigen ausgewählt und miteinander gekreuzt werden, die die erwarteten Veränderungen aufweisen.

  Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung

  Gentechnik wird, wenn auch in geringem Umfang, bereits eingesetzt, um Frauen mit einigen Arten von Unfruchtbarkeit eine Chance zu geben, schwanger zu werden. Verwenden Sie dazu die Eier einer gesunden Frau. Das Kind erbt somit den Genotyp von einem Vater und zwei Müttern.

  Die Möglichkeit, größere Veränderungen am menschlichen Genom vorzunehmen, steht jedoch vor einer Reihe ernsthafter ethischer Probleme. Im Jahr 2016 erhielt eine Gruppe von Wissenschaftlern in den Vereinigten Staaten die Genehmigung für klinische Studien einer Krebsbehandlungsmethode unter Verwendung der eigenen Immunzellen des Patienten, die einer Genmodifikation mithilfe der CRISPR / Cas9-Technologie unterzogen wurden.

  Zelltechnik

  Cellular Engineering basiert auf der Kultivierung von pflanzlichen und tierischen Zellen und Geweben, die in der Lage sind, für den Menschen notwendige Substanzen außerhalb des Körpers zu produzieren. Diese Methode dient der klonalen (asexuellen) Vermehrung wertvoller Pflanzenformen; um Hybridzellen zu erhalten, die die Eigenschaften von beispielsweise Blutlymphozyten und Tumorzellen vereinen, wodurch Sie schnell Antikörper erhalten können.

  Gentechnik in Russland

  Es wird darauf hingewiesen, dass nach der Einführung der staatlichen Registrierung von GVO die Aktivität einiger öffentlicher Organisationen und einzelner Abgeordneter der Staatsduma, die versuchen, die Einführung innovativer Biotechnologien in die russische Landwirtschaft zu verhindern, merklich zugenommen hat. Mehr als 350 russische Wissenschaftler haben einen offenen Brief der Gesellschaft der Wissenschaftler zur Unterstützung der Entwicklung der Gentechnik in der Russischen Föderation unterzeichnet. Der offene Brief stellt fest, dass ein Verbot von GVO in Russland nicht nur den gesunden Wettbewerb auf dem Agrarmarkt beeinträchtigen, sondern auch zu einer erheblichen Verzögerung bei den Technologien zur Lebensmittelproduktion führen, die Abhängigkeit von Lebensmittelimporten erhöhen und das Ansehen Russlands als Staat untergraben wird dem der Kurs für innovative Entwicklung offiziell angekündigt wurde [ die Bedeutung der Tatsache? ] .

  siehe auch

  Anmerkungen

  1. Alexander Panchen Gott schlagen // Populäre Mechanik . - 2017. - Nr. 3. - S. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo Genomeditierung mit einem hocheffizienten TALEN System(Englisch) . Natur. Abgerufen am 10. Januar 2017.
  3. Elements - Neuigkeiten aus der Wissenschaft: Affen mit Gentherapie von Farbenblindheit geheilt (unbestimmt) (18. September 2009). Abgerufen am 10. Januar 2017.