Sentrifugointi Tämä on mekaanisten seosten erottamista niiden osiin.
keskipakovoiman vaikutuksesta. Tätä varten käytetyt instrumentit
kohteita kutsutaan sentrifugeiksi.
Sentrifugin pääosa on roottori, joka on asennettu sisään
se pesii sentrifugiputkia varten. Roottori pyörii kanssa
suuri nopeus, mikä johtaa merkittäviin
keskipakovoiman suuruus, jonka vaikutuksen alaisena
esimerkiksi mekaaniset seokset erotetaan toisistaan
nesteeseen suspendoituneiden hiukkasten sedimentaatio.

Sentrifugissa tapahtuvat prosessit

Sentrifugit jakavat seuraavat prosessit:
1) Keskipakosuodatus.
2) Keskipakoselkeytys.
3) Keskipakoispuhdistus.

keskipakosuodatus

Keskipakosuodatus on
prosessi suspensioiden erottamiseksi sentrifugeissa
rei'itetyt rummut. Sisäpinta
tällainen rumpu on peitetty suodatinkankaalla.
Suspensio heitetään keskipakovoimalla kohti
rummun seinät, kun kiinteä faasi pysyy päällä
kudoksen pinta ja toiminnan alla oleva neste
keskipakovoima kulkee sedimenttikerroksen läpi ja
kangas poistetaan ulospäin rummun reikien kautta.
Keskipakosuodatus koostuu yleensä
kolme peräkkäistä fyysistä prosessia:
1) suodatus, jolloin muodostuu saka;
2) sedimentin tiivistyminen;
3) jääneen nesteen poistaminen sedimentistä
molekyylivoimat;

keskipakoselkeytys

keskipakoselkeytys
Keskipakoselkeytys - erotusprosessi
suspensiot rummuilla varustetuissa sentrifugeissa
kiinteät seinät. Suspensio ruiskutetaan alaosaan
osa rumpua ja keskipakovoiman vaikutuksesta
heitetty seiniä vasten. Seinät muodostavat kerroksen
sedimenttiä, ja neste muodostaa sisäkerroksen ja
syrjäytynyt erottimeen tulevasta rummusta
jousitus. Neste nousee ylös
kaatuu rummun reunan päälle ja poistetaan
ulos.
Tässä tapauksessa tapahtuu kaksi fyysistä prosessia:
1) Kiinteän faasin laskeutuminen.
2) Sedimentin tiivistyminen.

Keskipakoispuhdistus

Keskipakokirkastus - erotusprosessi
ohuet suspensiot ja kolloidiset liuokset. Niin
sama suoritetaan kiinteissä tynnyreissä.
Fyysisesti keskipakoinen
selvitys on prosessi
kiinteiden hiukkasten vapaa laskeutuminen kentällä
keskipakovoimat.
Rumpuissa, joissa on kiinteät seinät
emulsioiden erotus suoritetaan myös. Alla
keskipakovoimakomponenttien vaikutus
emulsiot tiheyden mukaan
sijaitsevat rajattujen kerrosten muodossa:
nesteen ulkokerros, jonka tiheys on suurempi
ja sisäkerros kevyempää nestettä.
Nesteet poistetaan rummusta erikseen.

Kliinisissä ja saniteettilaboratorioissa
sentrifugoinnin käyttö
erytrosyyttien erottamiseen
veriplasma, verihyytymät
seerumi, tiheät hiukkaset
virtsan nestemäinen osa jne
tätä tarkoitusta varten tai
manuaaliset sentrifugit tai
sähkösentrifugit,
jonka pyörimisnopeus
voidaan säätää.
Ultrasentrifugit, nopeus
jonka roottoreiden pyöriminen
yli 40 000 rpm,
käytetään yleensä
kokeellinen käytäntö
erottamaan organelleja
solujen erottaminen kolloidista
hiukkaset, makromolekyylit,
polymeerit.

Sentrifugoinnin käyttö parasitologiassa

Menetelmää käytetään kompleksien erottamiseen
veriseos, virtsa tai ulosteet, jonka jälkeen
lomien eristäminen siitä edelleen
tutkimus mikroskoopilla ja materiaalin kiinnitys. AT
näytteessä käytettävissä oleva sentrifugointiprosessi
loiset kulkevat suodattimen läpi ja kerääntyvät sisään
putken alempi kartiomainen lokero. Suodatin Mesh
erikoiskokoisilla soluilla
koeputkessa sijaitsee pystysuorassa, minkä seurauksena
mitä tapahtuu vaakatasossa (sivusuunnassa)
näytteen suodatus. Seurauksena karkea
sulamattomien elintarvikkeiden hiukkasia, kuituja kertyy
sekoituskammio sekä loiset ja niiden munat
kulkea vapaasti suodattimen läpi. Niin
Siten loiset keskittyvät
pintakerros hienoa sedimenttiä ja
Laboratoriolääkäri voi vain huolellisesti valita
näyte mikroskopia varten
automaattinen pipetti ja levitä se
liukumäki.

Sentrifugointimenetelmä sytologiassa

Differentiaalinen menetelmä
sentrifugointia käytetään
solujen fraktiointi, eli niiden kerrostuminen
sisältö murto-osiksi tietystä riippuen
erilaisten organellien ja solusulkeutumien paino.
Tätä varten hienojakoiset solut pyöritetään sisään
erikoislaite - ultrasentrifugi. AT
sentrifugoinnin seurauksena solukomponentit
sakka pois liuoksesta ja laskeutuu
sen tiheyden mukaan. Tiheämpää
rakenteet kerrostetaan pienemmillä nopeuksilla
sentrifugointi ja vähemmän tiheä - korkealla
nopeudet. Tuloksena olevat kerrokset erotetaan ja tutkitaan
erikseen.

10. Sentrifugointi kasvitieteessä ja kasvifysiologiassa

Sentrifugoinnilla on mahdollista saada erilaisia
jakeet subsellulaarisista hiukkasista ja tutkia
kunkin ryhmän ominaisuudet ja toiminnot
erikseen. Esimerkiksi pinaatin lehdistä voit
eristää kloroplastit, pestä ne
uudelleensentrifugointi sopivassa paikassa
elatusaine solufragmenteista ja tutki niitä
käyttäytymistä erilaisissa kokeissa
olosuhteet tai määrittää niiden kemiallinen koostumus.
Lisäksi se on mahdollista käyttämällä erilaisia ​​​​muutoksia
tekniikoita, tuhota nämä plastidit ja eristää
kautta
differentiaalinen sentrifugointi (toistuvasti
hiukkasten kerrostumista eri arvoilla
kiihtyvyys) niiden ainesosia. Niin
oli mahdollista osoittaa, että plastidit sisältävät
rakenteet ovat erittäin tilattuja
rakenne, - niin sanotut jyvät; kaikki jyvät
ovat rajaavan kloroplastin sisällä
kalvot (kloroplastin kalvo). Edut
tämä menetelmä on yksinkertaisesti korvaamaton, koska se
paljastaa olemassaolon
toiminnallisia alayksiköitä, jotka muodostavat
suuremmat subsellulaariset hiukkaset; erityisesti,
menetelmää käyttämällä

11. Sentrifugointimenetelmä virologiassa

Brakke-tiheysgradienttisentrifugointimenetelmä voi olla
käyttää sekä valinnassa että hankinnassa
kasvivirusten kvantitatiiviset ominaisuudet. Kuten kävi ilmi,
Tämä menetelmä on täynnä monia mahdollisuuksia ja on tällä hetkellä
käytetään laajalti virologian ja molekyylien alalla
biologia. Kun tehdään tutkimusta menetelmällä
tiheyssentrifugointi sentrifugiputki
osittain täytetty liuoksella, jonka tiheys pienenee
suunta pohjasta meniskille. Gradientin luominen
Kasvivirusten fraktiointia käytetään useimmiten
sakkaroosi. Ennen sentrifugoinnin aloittamista viruspartikkelit voivat
joko levitetään koko liuoksen tilavuuteen tai levitetään
kaltevuuden huipulla. Brakke ehdotti kolmea erilaista menetelmää
tiheysgradienttisentrifugointi. Isotyyppisessä
(tasapaino) sentrifugointiprosessi jatkuu, kunnes
kunnes kaikki gradientin hiukkaset saavuttavat tason, jolla tiheys on
medium on yhtä suuri kuin heidän oma tiheys. Täten,
hiukkasten fraktiointi tapahtuu tässä tapauksessa mukaisesti
erot niiden tiheydessä. Sakkaroosiliuoksilla ei ole
riittävä tiheys monien isopyknaaliseen erottamiseen
viruksia. Nopealla vyöhykesentrifugoinnilla virus
sovellettiin ensin aiemmin luotuun gradienttiin. Hiukkaset
kunkin tyypin sedimenttiä samanaikaisesti vyöhykkeen muodossa olevan gradientin läpi,
tai nauhoja, nopeudella, joka riippuu niiden koosta, muodosta ja
tiheys. Sentrifugointi lopetetaan, kun hiukkaset
edelleen sedimentoitua. Tasapainoalue
sentrifugointi, joka on samanlainen kuin nopeusalue
sentrifugointi, mutta tässä tapauksessa sentrifugointi

12. Vaikeudet sentrifugointimenetelmän käytössä

Differentiaalisen sentrifugointimenetelmän soveltaminen
täynnä monia metodologisia vaikeuksia. Ensin klo
hiukkasten vapautuminen voi vahingoittaa niiden rakennetta. Niin
oli tarpeen kehittää erityisiä menetelmiä solujen tuhoamiseksi,
joka ei vaurioittaisi subcellulaarista rakennetta
murto-osia. Toiseksi, koska subsellulaarisilla hiukkasilla on
kalvot niiden vapautumisprosessissa,
erilaisia ​​osmoottisia vaikutuksia. Siksi sitä varten
jotta tutkittavien kohteiden ultrarakenne ei tuhoudu
vaikka ne olisi eristetty, koostumus on valittava huolellisesti
ympäristö, jossa solujen tuhoutuminen ja laskeuma
hiukkasia. Ja lopuksi subsellulaaristen hiukkasten pesu
(suspendoimalla ne uudelleen väliaineeseen ja sitten uudelleen
sentrifugointi) voi johtaa joidenkin häviämiseen
niiden sisältämät aineet, jotka diffuusiovoimien vaikutuksesta
mennä ratkaisuun.
Tässä suhteessa on joskus vaikea ymmärtää, mikä pienistä molekyyleistä
ovat todellakin tutkittavien rakenteiden elementtejä ja mitkä
ne yksinkertaisesti adsorboituivat niiden pinnalle eristysprosessin aikana.
Tämä tilanne vaikeuttaa joidenkin määrittämistä
valittujen objektien toiminnalliset ominaisuudet.

Sentrifugointimenetelmä perustuu hiukkasten erilaiseen käyttäytymiseen sentrifugin luomassa keskipakokentässä. Sentrifugiastiassa oleva näyte asetetaan roottoriin, jota käyttää sentrifugikäyttö. Hiukkaseoksen erottamiseksi on valittava joukko olosuhteita, kuten pyörimisnopeus, sentrifugointiaika ja roottorin säde. Pallomaisten hiukkasten laskeutumisnopeus (sedimentaatio) ei riipu pelkästään kiihtyvyydestä, vaan myös hiukkasten säteestä ja tiheydestä sekä väliaineen viskositeetista, johon näyte kerrostetaan.

Sentrifugointi voidaan jakaa kahteen tyyppiin: preparatiivinen ja analyyttinen. Preparatiivista sentrifugointia käytetään, kun on tarpeen eristää osa näytteestä lisäanalyysiä varten. Tätä menetelmää käytetään solujen eristämiseen suspensiosta, biologisista makromolekyyleistä jne.

Analyyttistä sentrifugointia käytetään biologisten makromolekyylien käyttäytymisen tutkimiseen keskipakokentässä. Tällä menetelmällä on mahdollista saada tietoa molekyylien massasta, muodosta ja koosta suhteellisen pienissä näytetilavuuksissa. Preparatiivinen sentrifugointi on yleisimmin käytetty tekniikka päivittäisessä laboratoriokäytännössä.

Preparatiiviset laboratorion sentrifugit puolestaan ​​jaetaan ryhmiin käyttötarkoituksensa mukaan: preparatiiviset ultrasentrifugit, yleissentrifugit ja nopeat sentrifugit. Yleiskäyttöisillä sentrifugeilla on suurin käytännön sovellus lääketieteellisissä laboratorioissa, ja niiden enimmäisnopeus on jopa 6 000 rpm. Tämän tyyppisten laitteiden pääominaisuus on niiden suhteellisen suuri kapasiteetti - jopa 6 litraa, mikä mahdollistaa 100 ml:n sentrifugiputkien lisäksi jopa 1,25 litran astioiden käytön sentrifugointiin. Kaikissa yleiskäyttöisissä sentrifugeissa roottorit on asennettu jäykästi käyttöakselille, joten sentrifugoidut säiliöt on tasapainotettava melko tarkasti. Rikkoutumisen välttämiseksi roottoriin ei saa ladata paritonta määrää koeputkia, vaan jos täyttö on epätäydellinen, säiliö tulee asettaa vastakkain.

Suurinopeuksisten sentrifugien enimmäisnopeus on 25 tuhatta rpm ja kiihtyvyys jopa 89 tuhatta g. Roottorin ja sentrifugoidut näytteet sisältävä kammio on varustettu jäähdytysjärjestelmällä, joka estää kitkasta syntyvän lämmön, kun roottori pyörii suurilla nopeuksilla. Tyypillisesti nämä sentrifugit pystyvät käsittelemään jopa 1,5 litran tilavuuksia, ja ne on varustettu kulmalla tai vaihdettavilla kulhoroottoreilla.

Preparatiiviset ultrasentrifugit kiihtyvät 75 000 rpm:iin ja niiden keskipakokiihtyvyys on enintään 510 tuhatta g. Ne on varustettu jäähdytys- ja tyhjiöyksiköillä estämään roottorin ylikuumeneminen ilman kitkasta. Näiden sentrifugien roottorit on valmistettu erittäin lujasta titaanista tai alumiiniseoksesta. Ultrasentrifugien akseli, toisin kuin nopeiden ja valmistelevien, on tehty joustavaksi tärinän vähentämiseksi, kun roottori on epätasapainossa. Roottorin kapasiteetit on tasapainotettava huolellisesti gramman kymmenesosaan.

Suodatuksen lisäksi nestemäisten ja kiinteiden aineiden seoksen erottaminen on mahdollista myös sentrifugoimalla, eli aineiden erottelulla laitteissa, joita kutsutaan sentrifugeiksi.

Sentrifugin käyttö perustuu keskipakovoiman käyttöön. Nopean pyörityksen (sentrifugoinnin) aikana nesteeseen suspendoituneet kiinteät hiukkaset (joiden tiheys on suurempi kuin nesteen tiheys) heitetään pois keskustasta pyörimisen aikana kehittyvän keskipakovoiman vaikutuksesta ja erotetaan siten nesteestä.

Riisi. 407. Thyssen-laite mikroanalyyttiseen työhön

Riisi. 408. Manuaalinen sentrifugi

Sentrifugit ovat: avoimia ja suljettuja, käsikäyttöisiä ja mekaanisia. Avoimen manuaalisen sentrifugin pääosa (kuva 408) on pystysuoraan asetettu pyörivä akseli, jonka yläpäähän on kiinnitetty tanko, jossa on liikkuvasti vahvistetut kaksi (tai neljä) metalliholkkia. Nämä holkit työnnetään erityisiin alaspäin kaventuviin putkiin (kuva 409) nesteellä, josta on poistettava suspendoituneet hiukkaset,

Hihan pohjalle laitetaan pala puuvillaa, jotta vältetään suora kosketus lasin ja metallin välillä. Kun putket työnnetään holkkiin, sentrifugi käynnistetään ja jonkin ajan kuluttua (riippuen nesteen viskositeetista, suspendoituneiden hiukkasten koosta ja tiheyserosta) suspendoituneet kiinteät aineet erotetaan nesteestä, kun jolloin sentrifugi pysäytetään. Koeputken pohjalle kerätään kiinteä kiinteä sakka, jonka yläpuolella on kirkasta nestettä.

Z peitetyt sentrifugit(Kuva 410), koosta riippuen, sisältävät eri määrän holkkeja, 2-12 tai enemmän, jotka sijaitsevat symmetrisesti samalla etäisyydellä toisistaan ​​ja sentrifugin akselista.

Mekaaniset suljetut sentrifugit(Kuva 410, b) ovat kätevämpiä kuin manuaaliset (Kuva 410, a). Ne antavat yleensä 2000-3000 rpm, joten voit saavuttaa täydellisemmän nesteen ja kiinteän aineen erottamisen.

Sentrifugiputkien massa on oltava sama, kun ne on täytetty nesteellä. Jos sentrifugia on käytettävä usein, on suositeltavaa käyttää erityisiä vaakoja, jotka on mukautettu koeputkien punnitsemiseen (tai pikemminkin taaraukseen). Näissä vaa'oissa kupit ripustetaan palkkiin kuppien keskelle kiinnitetyillä tankoilla. Näissä sauvoissa on renkaat, joihin koeputket työnnetään.

Kun olet vahvistanut koeputket, kaada ensin sentrifugoitava neste yhteen koeputkeen (esimerkiksi pipetillä) ja sitten toiseen yrittäen tasapainottaa kupit.

Älä koskaan laita liikaa nestettä koeputkiin; koeputket täytetään siten, että etäisyys reunasta nestetasoon on vähintään 10 mm.

Kun sinun on tasapainotettava paljon koeputkia, on suositeltavaa käyttää seuraavaa tekniikkaa. Kun ensimmäinen koeputkipari on tasapainotettu, yksi niistä otetaan pois ja asetetaan sentrifugin kantaan ja toinen jätetään vaa'alle; tämä viimeinen koeputki toimii vakiona muille, aseta toinen koeputki vaa'alla vapautuneeseen tilaan, tasapainota se standardin kanssa ja poista se. Myös koeputket kannattaa esitäyttöä (nestemäärä hieman vähemmän kuin on tarpeen) ja lisätä tarvittava määrä nestettä jo tasapainotuksen yhteydessä. Tämä lähestymistapa nopeuttaa työtä.

Riisi. 409. Koeputket sentrifugeja varten.

Tasapainotetut koeputket asetetaan sentrifugin pistokkeisiin.

Sentrifugia ei pidä käynnistää täydellä nopeudella heti, vaan asteittain. Tämä koskee sekä manuaalisia että mekaanisia sentrifugeja.

Riisi. 410. Suljetut sentrifugit: a - käsikäyttöinen; b - sähkömoottorilla.

Nopeudensäätöön tarkoitetuissa mekaanisissa sentrifugeissa on asianmukaiset laitteet. Joten sähkösentrifugit on varustettu reostaateilla asteittaista kytkemistä varten täydelle kierrosluvulle. Vesiturbiinilla toimivissa sentrifugeissa nopeuden asteittainen lisäys saavutetaan säätämällä vesisuihkua. Mitä huolellisemmin liittäminen suoritettiin, sitä luotettavammin sentrifugi toimii.

Sentrifugia tulee seurata koko ajan; sen, erityisesti liikkuvien osien, saastumista ei voida hyväksyä. Metalliholkkien tulee kääntyä helposti ja vapaasti. Sentrifugia käyttävien hammaspyörien on oltava helposti liikuteltavia; niitä ei saa voidella rasvoilla, jotka voivat sakeutua. Myös sentrifugin akselin tulee olla kunnossa ja aina puhdas.

Sentrifugien, varsinkin manuaalisten sentrifugien, huolimaton käsittely voi taivuttaa akselia ja siten estää sentrifugin toimivuuden.

Kun sentrifugi on sammutettu, itsekäynnistimen annetaan pysähtyä ja vasta sen jälkeen koeputket poistetaan.

Viime aikoina niin sanotut supersentrifugit, jotka antavat jopa 40 000 rpm, ovat yleistyneet (kuva 411).

Riisi. 411 supersentrifugi

Tällaiset sentrifugit soveltuvat erityisen hyvin kaikenlaisten viskoosien liuosten, kuten lakkojen, hienojakoisten dispersioiden ja emulsioiden sentrifugoimiseen.

Supersentrifugoitava neste tulee laitteen alaosassa sijaitsevaan suuttimeen 1. Sitten neste kaadetaan työsylinteriin 2, joka pyörii jopa 40 000 rpm:n nopeudella, jossa nesteeseen suspendoituneet raskaammat hiukkaset erotetaan. Neste nousee vähitellen sylinteriä 2 pitkin erottimeen 5, ja jos emulsio tuhoutuu, kevyempi neste virtaa ulos viemärin 8 kautta ja raskaampi - viemärin 4 kautta. Erotettaessa kiinteitä hiukkasia, joiden tiheys on suurempi. kuin yksi, neste virtaa ulos viemärin 3 kautta. Työsylinterin sisäseinään kerrostetaan erotettavaa kiinteää sedimenttiä. Supersentrifugi. Ajoittain supersentrifugi pysäytetään, työsylinteri 2 poistetaan, se puhdistetaan sedimentistä ja laitetaan takaisin paikoilleen, työ jatkuu. Koko työsylinterin puhdistusprosessi pysäyttämisestä supersentrifugin uuteen käynnistykseen kestää enintään 15 minuuttia. Jos joudut puhdistamaan suhteellisen suuria määriä nestettä, käytä kolmea kahdeksaa supersentrifugia: yksi toimii, toinen puhdistetaan, kolmas on varassa,

Sentrifugointi on mekaanisten seosten erottamista osiin keskipakovoiman vaikutuksesta. Tähän tarkoitukseen käytettyjä laitteita kutsutaan sentrifugeiksi. Sentrifugin pääosa on roottori, johon on asennettu pesät sentrifugiputkille. Roottori pyörii suurella nopeudella, minkä seurauksena syntyy merkittäviä keskipakovoimia, joiden vaikutuksesta mekaaniset seokset erottuvat, esimerkiksi nesteeseen suspendoituneet hiukkaset kerrostuvat.

Sentrifugit: 1 - manuaalinen: 2 - sähkökäyttöinen.

Kliinisissä ja saniteettilaboratorioissa sentrifugoinnilla erotetaan veriplasmasta, tiheistä hiukkasista virtsan nesteosasta jne. Tätä tarkoitusta varten käytetään joko manuaalisia sentrifugeja (kuva 1) tai sähkösentrifugeja, joiden pyörimisnopeus on jota voidaan säätää (kuva, 2).

Ultrasentrifugeja, joiden roottorin nopeus ylittää 40 000 rpm, käytetään yleensä kokeellisessa käytännössä soluorganellien, kolloidisten hiukkasten, makromolekyylien jne. erottamiseen.

Sentrifugointi on karkeiden järjestelmien erottamista, jotka koostuvat nestemäisistä ja kiinteistä komponenteista, joilla on eri tiheydet, käyttämällä erityisiä laitteita, joita kutsutaan sentrifugeiksi. Sentrifugin toimintaperiaate perustuu suuren keskipakovoiman luomiseen, jonka vaikutuksesta sentrifugiin asetettavan seoksen komponenttien erotusnopeus kasvaa moninkertaisesti verrattuna niiden vaikutuksen alaisena tapahtuvan erottumisnopeuteen. painovoimasta.

Sentrifugointimenetelmää käytetään laajalti biologiassa, lääketieteessä ja tekniikassa, ja se usein korvaa suodatus-, laskeutus- ja puristusprosessit.

Sentrifugissa on kotelo, käyttömekanismi, roottori, työkammio (suljettava) ja ohjauspaneeli. Jotkut sentrifugit on varustettu sähkökellolla, joka mahdollistaa automaattisen sammutuksen ja jarrutuksen välillä 5-60 minuuttia. Erikoissentrifugeissa on jäähdytys- ja tyhjiöyksiköt seuranta- ja automaattisilla ohjauslaitteilla. Minkä tahansa sentrifugin pääosa on roottori (laboratoriosentrifugeissa se sijaitsee yleensä pystysuoraan asennetulla sähkömoottorin akselilla tai pyöritetään eri vaihteilla moottorin akselilta, joskus jopa manuaalisesti). Sentrifugiroottori on levy (risti), jossa on saranoidut metalliholkit, joihin sijoitetaan koeputket, jotka ottavat vaaka-asennon pyörimisen aikana.

Joskus roottori on tehty kiinteän metallisen katkaistun kartion muodossa, jossa on kennoja koeputkia varten (kulmaroottori); siinä olevat putket sijaitsevat vakiokulmassa pyörimisakseliin nähden (yleensä 40°). Koeputkien kaltevassa asennossa seoksen komponentit erottuvat nopeammin. Seoksen erotus suoritetaan erimuotoisissa ja -tilavuuksissa koeputkissa (kuva 1). Suurilla nopeuksilla työskenneltäessä käytetään polyeteenistä valmistettuja koeputkia, koska lasit räjähtävät. Koeputket, joissa käsitelty materiaali on sijoitettu toisiaan vasten roottorissa, on tasapainotettava. Tämä antaa tasaisen kuormituksen roottorin akselille ja varmistaa sentrifugin akselin tasaisen pyörimisen. Koeputkien tasapainottamiseksi käytetään erityisiä vaakoja (kuva 2).

Riisi. 1. Putket sentrifugointia varten.

Riisi. 2. Sentrifugivaa'at.

Teollisuudessa käytettävät sentrifugit eroavat laboratoriosentrifugeista monimutkaisemmalla roottorirakenteella, mikä mahdollistaa suuren materiaalimäärän sentrifugoinnin samanaikaisesti tai erotusprosessien jatkuvan suorittamisen.

Hitaalla roottorinopeudella toimivia sentrifugeja käytetään lääketieteessä virtsan sedimenttien, veriseerumin erottamiseen hyytymistä, punasolujen sedimentaatiosta, serologisissa tutkimuksissa jne.

Mikrosentrifugi (kuvio 4) on käsikäyttöinen; varustettu kahdella vaihdettavalla suuttimella, joista toisessa on pesät mikroputkille ja joita käytetään veren yhteensopivuuden määrittämiseen; toinen - jossa on pistorasia asteikolla varustetun mikropipetin (hematokriitti) asettamiseen - on tarkoitettu verisolujen prosenttiosuuden määrittämiseen.

Riisi. 3. Manuaalinen sentrifugi.

Riisi. 4. Mikrosentrifugi.

Manuaalisessa sentrifugissa (kuva 3) on neljä metalli- tai muoviholkkia 15 ml:n putkille.

Laboratoriokliinisen sentrifugissa TsLK-1 (kuvat 5, 7) on kolme pyörimisnopeutta (1000, 1500, 3000 rpm). Ristiroottori on sovitettu 12 perinteiselle sentrifugiputkelle. Suurin sentrifugoidun nesteen tilavuus on 150 ml.

Suuren roottorinopeuden sentrifugit on useimmiten varustettu vaihdettavilla roottorilla, jotka on suunniteltu eri tilavuuksille nestettä ja niitä käytetään hienojen suspensioiden erottamiseen.

Laboratorion pöytäsentrifugissa TsLN-2 (kuva 5, 2) on kulmassa oleva roottori kuudelle lyhyelle koeputkelle, joiden kokonaiskapasiteetti on 72 ml. Suurin pyörimisnopeus -9000 rpm.

Riisi. 5. Erilaiset laboratoriosentrifugit: 1 - kliiniset; 2 - työpöytä; 3 - pieni kulma; 4 - paikallaan; 5 - jääkaappi.

Pienikulmasentrifugissa TsUM-1 (kuva 5, 3) on kolme vaihdettavaa kulmaroottoria, joissa on eri määrä koeputkia ja hematokriittiä: roottori 6 koeputkelle, joiden kokonaiskapasiteetti on 150 ml, roottori 10 koeputkelle, joissa on yhteensä tilavuus 120 ml, roottori 24 koeputkelle, joiden kokonaiskapasiteetti on 120 ml, hematokriitti kahdelle kapillaarille. Suurin pyörimisnopeus on 10 000 rpm.

Sentrifugi on varustettu sähköisellä kellomekanismilla.

Laboratorion kiinteässä sentrifugissa TsLS-2 (kuvat 5, 4) on kaksi vaihdettavaa roottoria. Ristiroottori on varustettu neljällä teräsholkilla, joiden kapasiteetti on 500 ml, ja neljällä lasikoeputkella niitä varten, joiden tilavuus on 250 ml. Kulmaroottori toimitetaan 8 polyeteeni- ja teräskoeputkella, joiden tilavuus on 50-75 ml. Roottoreiden suurin pyörimisnopeus on jopa 6000 rpm. Sentrifugi on varustettu sähköisellä kellomekanismilla.

Erikoissentrifugien joukossa on laboratoriojäähdytyssentrifugi CLR-1 (kuva 5.5), joka on tarkoitettu erilaisten, jopa huoneenlämpötilassa muuttuvien aineiden - lähinnä proteiinisuspensioiden - sentrifugointiin matalissa lämpötiloissa (-5 ° ja yli). Sentrifugissa on kolme vaihdettavaa roottoria, jotka tarjoavat erilaisia ​​sentrifugointitiloja. Kaksi roottoria ovat teknisiltä ominaisuuksiltaan identtisiä TsLS-2-tyypin sentrifugin roottoreiden kanssa, kolmas roottori, joka on asetettu lisäakselille, kehittää 18 000-18 500 rpm. Tutkimuslääkkeen enimmäistilavuus on 48 ml. Sentrifugi on varustettu sähköisellä kellomekanismilla. Työkammion jäähdytys suoritetaan jäähdytyskoneella.

Katso myös Ultrasentrifugointi.

2.5.1 Gradienttien luonne

Liuosten tiheysgradienttien luomiseen käytetään useimmiten sakkaroosiliuoksia, joissa on joskus kiinteä pH. Joissakin tapauksissa hyvä erotus saadaan käyttämällä D 2 0:aa tavallisen veden sijasta. 2.1 esittää joidenkin sakkaroosiliuosten ominaisuuksia.

Gradientin valinnan määräävät fraktioinnin erityistehtävät. Esimerkiksi Pharmacia Fine Chemicalsin valmistama ficol voi korvata sakkaroosin tapauksissa, joissa on tarpeen luoda gradientteja, joilla on suuri tiheys ja alhainen osmoottinen paine. Toinen ficolin etu on, että se ei läpäise solukalvoja. Raskasmetallisuoloja, kuten rubidiumia ja cesiumia, käytetään luomaan suurempia tiheysgradientteja, mutta CsCl:n syövyttävän vaikutuksen vuoksi tällaisia ​​gradientteja käytetään vain kestävistä metalleista, kuten titaanista, valmistetuissa roottoreissa.

2.5.2 Askeltiheysgradienttitekniikka

Tiheysgradientin luomiseksi useita liuoksia, joiden tiheys pienenee peräkkäin, lisätään varovasti sentrifugiputkeen pipetillä. Sitten ylimmälle kerrokselle, jolla on pienin tiheys, näyte kerrostetaan kapean vyöhykkeen muodossa, minkä jälkeen putki sentrifugoidaan. Tasaisia ​​lineaarisia gradientteja voidaan saada tasoittamalla vaiheittaisia ​​gradientteja liuoksen pitkittyneen seisomisen aikana. Prosessia voidaan nopeuttaa sekoittamalla varovasti putken sisältöä langalla tai ravistamalla putkea kevyesti.

2.5.3 Tekniikka tasaisen tiheysgradientin luomiseksi

Useimmissa tapauksissa käytetään erityistä laitetta tasaisen tiheysgradientin luomiseen. Se koostuu kahdesta sylinterimäisestä astiasta, joilla on tiukasti määritelty identtinen halkaisija ja jotka ovat yhteydessä toisiinsa pohjassa lasiputkella, jossa on ohjausventtiili, jonka avulla voit säätää suhteita, joissa molempien astioiden sisältö sekoitetaan. Yksi niistä on varustettu sekoittimella ja siinä on ulostulo, jonka kautta liuos virtaa sentrifugiputkiin. Tiheämpi liuos laitetaan sekoittimeen; toinen sylinteri on täytetty pienemmän tiheyden omaavalla liuoksella. Liuoskolonnin korkeus molemmissa sylintereissä on asetettu siten, että niiden hydrostaattinen paine on sama. Tiheämpi liuos puretaan vähitellen sekoittimesta sentrifugiputkiin ja korvataan samanaikaisesti yhtä suurella määrällä pienempitiheyksistä liuosta, joka tulee sekoittimeen toisesta sylinteristä ohjausventtiilin kautta. Liuoksen homogeenisuus sekoittimessa varmistetaan sekoittamalla liuosta jatkuvasti sekoittimella. Kun liuos valutetaan sentrifugiputkiin, sen tiheys pienenee ja putkiin muodostuu lineaarinen tiheysgradientti. Epälineaarisia gradientteja voidaan luoda käyttämällä järjestelmää, joka koostuu kahdesta halkaisijaltaan epätasaisesta sylinteristä.

Eri jyrkkyyksien tiheysgradienttien muodostamiseksi käytetään kahden mekaanisesti ohjatun ruiskun järjestelmää, jotka on täytetty eri tiheyksillä olevilla liuoksilla. Erilaisia ​​gradientteja voidaan luoda muuttamalla mäntien suhteellista nopeutta.

2.5.4 Gradienttien erottaminen sentrifugiputkista

Kun sentrifugointi on suoritettu ja hiukkaset erotettu, muodostuneet vyöhykkeet on poistettava. Tämä tehdään useilla tavoilla, useimmiten siirtomenetelmällä. Sentrifugiputki lävistetään pohjaan ja sen alaosaan syötetään hitaasti erittäin tiivistä väliainetta, esimerkiksi 60-70 % sakkaroosiliuosta. Yläpuolella oleva liuos syrjäytetään ja fraktiot kerätään ruiskulla, pipetillä tai erikoislaitteella, joka on liitetty putken kautta fraktionkerääjään. Jos putket on valmistettu selluloidista tai nitroselluloosasta, fraktiot uutetaan leikkaamalla putki erityisellä terällä. Tätä varten telineeseen kiinnitetty sentrifugiputki leikataan suoraan halutun alueen alle ja fraktio imetään pois ruiskulla tai pipetillä. Leikkuulaitteen sopivalla rakenteella liuoshäviö on minimaalinen. Fraktioiden kerääminen suoritetaan myös lävistämällä koeputken pohja ohuella ontolla neulalla. Putkesta neulan läpi virtaavat pisarat kerätään fraktionkerääjään lisäanalyysiä varten.

2.5.5 Preparatiiviset sentrifugit ja niiden sovellukset

Preparatiiviset sentrifugit voidaan luokitella kolmeen pääryhmään: yleiskäyttöiset sentrifugit, nopeat sentrifugit ja preparatiiviset ultrasentrifugit. Yleiskäyttöiset sentrifugit antaa maksiminopeudeksi 6000 rpm -1 ja OCU:ksi jopa 6000 g . Ne eroavat toisistaan ​​vain kapasiteetissa ja niissä on useita vaihdettavia roottoreita: kulmikkaita ja riippulaseilla. Yksi tämäntyyppisten sentrifugien ominaisuuksista on niiden suuri kapasiteetti - 4 - 6 dm 3 , mikä mahdollistaa niiden lataamisen paitsi 10,50 ja 100 cm 3 sentrifugiputkilla, myös astioilla, joiden kapasiteetti on jopa 1,25 dm3. Kaikissa tämän tyyppisissä sentrifugeissa roottorit on asennettu jäykästi käyttöakselille, ja sentrifugiputket sisältöineen on tasapainotettava huolellisesti ja niiden paino ei saa olla enempää kuin 0,25 g. tulee sijoittaa symmetrisesti, yksi sentrifugia vasten. muut, mikä varmistaa koeputkien tasaisen jakautumisen roottorin pyörimisakselin suhteen.

Nopeat sentrifugit huippunopeus on 25 000 rpm -1 ja OCU jopa 89 000 g. Roottorikammio on varustettu jäähdytysjärjestelmällä, joka estää kitkan aiheuttaman kuumenemisen roottorin pyörimisen aikana. Nopeiden sentrifugien kapasiteetti on pääsääntöisesti 1,5 dm 3 ja ne on varustettu vaihdettavilla roottoreilla, sekä vinoilla että riippulaseilla.

Valmistelevat ultrasentrifugit antaa huippunopeuden jopa 75 000 rpm -1 ja keskipakokiihtyvyyden 510 000 g . Ne on varustettu sekä jääkaapilla että tyhjiöyksiköllä estämään roottorin ylikuumeneminen sen kitkasta ilmaan. Tällaisten sentrifugien roottorit on valmistettu erittäin lujasta alumiinista tai titaaniseoksista. Pääasiassa käytetään alumiiniseosroottoreita, mutta tapauksissa, joissa vaaditaan erityisen suuria nopeuksia, käytetään titaaniroottoreita. Sentrifugiputkien epätasaisesta täytöstä johtuvan roottorin epätasapainon aiheuttaman tärinän vähentämiseksi ultrasentrifugeissa on joustava akseli. Sentrifugiputket ja niiden sisältö on tasapainotettava huolellisesti 0,1 g:n tarkkuudella. Samanlaisia ​​vaatimuksia tulee noudattaa kuormitettaessa sentrifugien roottoreita yleiskäyttöön.

2.6 Roottoreiden suunnittelu

2.6.1 Kulmaroottorit ja roottorit ripustuskauhoilla

Preparatiivisten sentrifugien roottoreita on yleensä kahta tyyppiä - kulma- ja riippukauhoja. Niitä kutsutaan kulmiksi, koska niihin sijoitetut sentrifugiputket ovat aina tietyssä kulmassa pyörimisakseliin nähden. Roottoreissa, joissa on roikkuvat lasit, koeputket asennetaan pystysuoraan, ja kun niitä pyöritetään tuloksena olevan keskipakovoiman vaikutuksesta, ne siirtyvät vaaka-asentoon; kaltevuuskulma pyörimisakseliin nähden on 90°.

Kulmaroottoreissa hiukkasten kulkema etäisyys koeputken vastaavaan seinämään on hyvin pieni, joten sedimentaatiota tapahtuu suhteellisen nopeasti. Törmäyksen jälkeen koeputken seiniin hiukkaset liukuvat alas ja muodostavat pohjaan sedimentin. Sentrifugoinnin aikana syntyy konvektiovirtoja, jotka vaikeuttavat suuresti samankaltaisten sedimentaatioominaisuuksien omaavien hiukkasten erottamista. Kuitenkin samankaltaisia ​​roottoreita käytetään menestyksekkäästi erottamaan hiukkasia, joiden sedimentaationopeudet vaihtelevat melko paljon.

Roottoreissa, joissa on roikkuvat kupit, havaitaan myös konvektioilmiöitä, mutta ne eivät ole niin voimakkaita. Konvektio on seurausta siitä, että keskipakokiihtyvyyden vaikutuksesta hiukkaset asettuvat suuntaan, joka ei ole täysin kohtisuorassa pyörimisakseliin nähden, ja siksi, kuten kulmaroottoreissa, ne osuvat koeputken seinämiin ja liukuvat pohja.

Konvektio- ja pyörrevaikutuksia voidaan jossain määrin välttää käyttämällä sektorimuotoisia putkia riippukuppiroottoreissa ja säätämällä roottorin nopeutta; Edellä lueteltu sentrifugointimenetelmä tiheysgradientissa on myös vailla haittoja.

2.6.2 Jatkuvat roottorit

Jatkuvat roottorit on suunniteltu suhteellisen pienten kiintoainemäärien nopeaan fraktiointiin suuritilavuuksisista suspensioista, esimerkiksi solujen eristämiseen viljelyalustasta. Sentrifugoinnin aikana roottoriin lisätään jatkuvasti hiukkassuspensiota; roottorin teho riippuu kerrostetun valmisteen laadusta ja vaihtelee välillä 100 cm 3 - 1 dm 3 / 1 min. Roottorin erikoisuus on, että se on eristetty kammio, jolla on erityinen rakenne; sen sisältö ei ole yhteydessä ulkoiseen ympäristöön, joten se ei ole saastunut tai ruiskutettu.

2.6.3 Vyöhyke- tai Anderson-roottorit

Vyöhykeroottorit on valmistettu alumiinista tai titaaniseoksesta, jotka kestävät erittäin merkittäviä keskipakokiihtyvyyttä. Yleensä niissä on sylinterimäinen ontelo, joka on suljettu irrotettavalla kannella. Ontelon sisällä, pyörimisakselilla, on aksiaalinen putki, johon laitetaan siipillä varustettu suutin, joka jakaa roottorin ontelon neljään sektoriin. Lapoissa tai ohjauslevyissä on radiaaliset kanavat, joiden kautta gradientti ruiskutetaan aksiaalisesta putkesta roottorin kehälle. Tämän terien rakenteen ansiosta konvektio on vähennetty minimiin.

Roottorin täyttö tapahtuu sen pyöriessä nopeudella noin 3000 rpm -1. Roottoriin pumpataan valmiiksi luotu gradientti alkaen pienitiheyksisestä kerroksesta, joka on tasaisesti jakautunut roottorin kehälle ja pysyy sen ulkoseinämässä kohtisuorassa pyörimisakseliin nähden keskipakovoiman vaikutuksesta. . Kun myöhemmin lisätään tiheämpiä gradienttikerroksia, tapahtuu jatkuva siirtyminen kohti vähemmän tiheiden kerrosten keskustaa. Kun koko gradientti on pumpattu roottoriin, se täytetään täyteen tilavuuteensa "tyynyksi" kutsutulla liuoksella, jonka tiheys on sama tai hieman suurempi kuin esimuodostetun gradientin suurin tiheys.

Sitten testinäyte kerrostetaan aksiaaliputken läpi , joka siirretään putkesta roottorin tilavuuteen käyttämällä pienemmän tiheyden liuosta, samalla kun sama tilavuus "tyynyä" poistetaan kehältä. Kaikkien näiden toimenpiteiden jälkeen roottorin pyörimisnopeus saatetaan työnopeuteen ja suoritetaan joko vyöhykenopeus tai vyöhyke-isopykninen fraktiointi vaaditun ajan. . Fraktioiden uutto suoritetaan roottorin nopeudella 3000 rpm -1. Roottorin sisältö siirretään lisäämällä "tyyny" reunalta, ensinnäkin vähemmän tiheät kerrokset siirtyvät . Anderson-roottorin aksiaalikanavan erityisrakenteen ansiosta vyöhykkeet eivät sekoitu niiden siirtymisen aikana. Lähtevä gradientti johdetaan tallennuslaitteen, esimerkiksi spektrofotometrikennon, läpi, jolla proteiinipitoisuus voidaan määrittää absorptiolla 280 nm:ssä, tai erityisen radioaktiivisuusdetektorin kautta, jonka jälkeen fraktiot kerätään.

Keskinopeuksilla käytettävien vyöhykeroottoreiden kapasiteetti vaihtelee 650 - 1600 cm 3 , mikä mahdollistaa melko suuren materiaalimäärän saamisen. Vyöhykeroottoreita käytetään proteiinikontaminanttien poistamiseen erilaisista valmisteista sekä mitokondrioiden, lysosomien, polysomien ja proteiinien eristämiseen ja puhdistamiseen.

2.6.4 Subsellulaaristen fraktioiden analyysi

Fraktioimalla saatujen subsellulaaristen hiukkasten valmisteen ominaisuudet voidaan katsoa itse hiukkasten ominaisuuksiksi vain, jos valmiste ei sisällä epäpuhtauksia. Siksi on aina tarpeen arvioida saatujen valmisteiden puhtaus. Homogenisoinnin tehokkuus ja epäpuhtauksien esiintyminen valmisteessa voidaan määrittää mikroskooppisella tutkimuksella. Näkyvien epäpuhtauksien puuttuminen ei kuitenkaan vielä ole luotettava todiste lääkkeen puhtaudesta. Saadun valmisteen puhtauden kvantifioimiseksi se alistetaan kemialliseen analyysiin, jonka avulla voidaan määrittää proteiinien tai DNA:n pitoisuus siinä, määrittää sen entsymaattinen aktiivisuus, jos mahdollista, ja immunologiset ominaisuudet.

Entsyymien jakautumisen analyysi fraktioiduissa kudoksissa perustuu kahteen yleiseen periaatteeseen. Ensimmäinen näistä on, että kaikki tietyn subsellulaarisen populaation hiukkaset sisältävät saman entsyymijoukon. Toinen olettaa, että jokainen entsyymi on paikantunut johonkin tiettyyn paikkaan solussa. Jos tämä asema olisi totta, entsyymit voisivat toimia vastaavien organellejen markkereina: esimerkiksi sytokromioksidaasi ja monoamiinioksidaasi toimisivat mitokondrioiden markkerientsyymeinä, happamat hydrolaasit lysosomimarkkereina, katalaasi peroksisomimarkkerina ja glukoosi-6- fosfataasi - mikrosomaalisen kalvon merkkiaine. Kävi kuitenkin ilmi, että jotkut entsyymit, kuten malaattidehydrogenaasi, R-glukuronidaasi, NADP "H-sytokromi-c-reduktaasi, lokalisoituu useampaan kuin yhteen fraktioon. Siksi solunvälisten fraktioiden entsyymimarkkerien valintaan tulee kussakin tapauksessa suhtautua erittäin huolellisesti. Lisäksi markkerientsyymin puuttuminen ei tarkoita sopivien organellien puuttumista On todennäköistä, että organellit menettävät entsyymin fraktioinnin aikana tai se inhiboituu tai inaktivoituu, joten jokaiselle fraktiolle määritetään yleensä vähintään kaksi markkerientsyymiä.

Murto-osa	Tilavuus, cm"	Yleinen jalostus	Eksnulaatio, 660 nm	Entsyymiaktiivisuuden yksiköt	Aktiivisuus murto-osina,%

2.7 Fraktiointi differentiaalisella sentrifugoinnilla

2.7.1 Tulosten esittäminen

Kudosfraktioinnista saadut tulokset esitetään kätevimmin graafien muodossa. Siten tutkittaessa entsyymien jakautumista kudoksissa tiedot esitetään parhaiten histogrammin muodossa, mikä mahdollistaa kokeiden tulosten visuaalisen arvioinnin.

Näytteen proteiinipitoisuuden entsymaattinen aktiivisuus määritetään sekä alkuperäisessä homogenaatissa että kussakin eristetyssä subsellulaarisessa fraktiossa erikseen. Entsymaattinen kokonaisaktiivisuus ja proteiinipitoisuus fraktioissa eivät saa poiketa merkittävästi alkuperäisen homogenaatin vastaavista arvoista.

Sitten kunkin fraktion entsymaattinen aktiivisuus ja proteiinipitoisuus lasketaan prosentteina kokonaissaannosta, jonka perusteella tehdään histogrammi. Proteiinin suhteellinen määrä kussakin fraktiossa piirretään peräkkäin abskissa-akselia pitkin niiden eristämisjärjestyksessä, ja kunkin fraktion suhteellinen spesifinen aktiivisuus piirretään ordinaatta-akselia pitkin. Siten kunkin fraktion entsymaattinen aktiivisuus määritetään sarakkeiden pinta-alasta.

2.7.2 Analyyttinen ultrasentrifugointi

Toisin kuin preparatiivinen sentrifugointi, jonka tarkoituksena on aineiden erottaminen ja puhdistaminen, analyyttistä ultrasentrifugointia käytetään pääasiassa biologisten makromolekyylien ja muiden rakenteiden sedimentaatio-ominaisuuksien tutkimiseen. Siksi analyyttisessä sentrifugoinnissa käytetään erityisiä roottoreita ja tallennusjärjestelmiä: niiden avulla voit seurata jatkuvasti materiaalin sedimentaatiota. sisään keskipakokenttä.

Analyyttiset ultrasentrifugit voivat saavuttaa jopa 70 000 rpm -1 nopeuden samalla kun ne tuottavat keskipakokiihtyvyyttä jopa 500 000 g . Niiden roottori on pääsääntöisesti muodoltaan ellipsoidi ja se on kytketty nauhalla moottoriin, mikä mahdollistaa roottorin pyörimisnopeuden muuttamisen. Roottori pyörii jäähdytyslaitteella varustetussa tyhjiökammiossa ja siinä on kaksi analyyttistä ja tasapainottavaa kennoa, jotka on asennettu sentrifugiin tiukasti pystysuoraan, yhdensuuntaisesti pyörimisakselin kanssa. Tasapainotuskenno tasapainottaa analyyttistä kennoa ja on metallikappale tarkkuusjärjestelmällä. Siinä on myös kaksi indeksireikää, jotka sijaitsevat tiukasti määritellyllä etäisyydellä pyörimisakselista, joiden avulla määritetään vastaavat etäisyydet analyyttisessä solussa. Analyyttinen kenno, jonka tilavuus on yleensä 1 cm 3, on sektorimuotoinen. Oikein asennettuna roottoriin, vaikka se on pystyasennossa, se toimii samalla periaatteella kuin roottori ripustetuilla kauhoilla, mikä luo lähes ihanteelliset sedimentaatioolosuhteet. Analyyttisen kennon päissä on ikkunat, joissa on kvartsilasit. Analyyttiset ultrasentrifugit on varustettu optisilla järjestelmillä, joiden avulla voidaan seurata hiukkasten sedimentaatiota koko sentrifugointijakson ajan. Sedimentoituva materiaali voidaan kuvata ennalta määrätyin aikavälein. Proteiinia ja DNA:ta fraktioitaessa tarkkaillaan sedimentaatiota absorptiolla ultraviolettisäteilyssä ja tapauksissa, joissa tutkituilla liuoksilla on erilaiset taitekertoimet, käyttämällä schlieren-järjestelmää tai Rayleigh-interferenssijärjestelmää. Kaksi viimeistä menetelmää perustuvat siihen, että kun valo kulkee läpinäkyvän liuoksen läpi, joka koostuu eri tiheydeltään vyöhykkeistä, valo taittuu vyöhykkeen rajalla. Sedimentaation aikana raskaiden ja kevyiden hiukkasten vyöhykkeiden välille muodostuu raja, joka toimii taittolinssinä; tässä tapauksessa ilmaisimena käytettävään valokuvalevyyn ilmestyy huippu. Sedimentaation aikana raja liikkuu ja sitä kautta huippu, jonka nopeuden perusteella voidaan arvioida materiaalin sedimentaationopeutta. Interferometriset järjestelmät ovat herkempiä kuin Schlieren-järjestelmät. Analyyttiset kennot ovat yksisektoriisia, joita käytetään eniten, ja kaksisektoriisia, joita käytetään liuottimen ja liuenneen aineen vertailevaan tutkimukseen.

Biologiassa analyyttistä ultrasentrifugointia käytetään makromolekyylien molekyylipainojen määrittämiseen, saatujen näytteiden puhtauden tarkistamiseen sekä makromolekyylien konformaatiomuutosten tutkimiseen.

2.8 Analyyttisen ultrasentrifugoinnin käyttö

2.8.1 Molekyylipainojen määritys

Molekyylipainojen määrittämiseen analyyttisen ultrasentrifugoinnin avulla on kolme päämenetelmää: sedimentaationopeuden määritys, sedimentaatiotasapainomenetelmä ja sedimentaatiotasapainon approksimaatiomenetelmä.

Molekyylipainon määritys sedimentaationopeudella - tämä on yleisin tapa. Sentrifugointi suoritetaan suurilla nopeuksilla, jotta hiukkaset, jotka ovat alun perin jakautuneet tasaisesti koko tilavuuteen, alkavat liikkua järjestyksessä säteellä pyörimiskeskuksesta. Hiukkasista jo vapaan liuottimen alueen ja niitä sisältävän osan välille muodostuu selkeä rajapinta. Tämä raja liikkuu sentrifugoinnin aikana, mikä mahdollistaa hiukkasten sedimentaationopeuden määrittämisen yhdellä yllä olevista menetelmistä rekisteröimällä tämän liikkeen valokuvauslevylle.

Sedimentaationopeus määräytyy seuraavalla suhteella:

missä X - etäisyys pyörimisakselista cm,

t - aika s,

w on kulmanopeus rad-s -1 ,

s - sedimentaatiokerroin "molekyyli.

Sedimentaatiokerroin on nopeus kiihtyvyysyksikköä kohti, se mitataan Seedbergin yksiköt ; 1 Swedbergin yksikkö on 10 _13 s. S:n numeerinen arvo riippuu hiukkasten molekyylipainosta ja muodosta ja on tietylle molekyylille tai supramolekyylirakenteelle ominaista arvo. Esimerkiksi lysotsyymin sedimentaatiokerroin on 2,15 S; katalaasin sedimentaatiokerroin on 11,35S, bakteerien ribosomialayksiköiden 30-50S ja eukaryoottisten ribosomien alayksiköiden 40-60S.

missä M on molekyylin molekyylipaino, R on kaasun vakio, T - absoluuttinen lämpötila, s - molekyylin sedimentaatiokerroin, D on molekyylin diffuusiokerroin, v - osittainen ominaistilavuus, jota voidaan pitää tilavuutena, jonka yksi gramma liukenevaa ainetta vie, p - liuottimen tiheys.

Sedimentaatiotasapainomenetelmä. Molekyylipainojen määritys tällä menetelmällä suoritetaan suhteellisen alhaisilla roottorin nopeuksilla, luokkaa 7000-8000 rpm -1, jotta suuren molekyylipainon omaavat molekyylit eivät laskeudu pohjalle. Ultrasentrifugointi suoritetaan, kunnes hiukkaset saavuttavat tasapainon, joka muodostuu toisaalta keskipakovoimien ja toisaalta diffuusiovoimien vaikutuksesta, eli kunnes hiukkaset lakkaavat liikkumasta. Sitten saadun pitoisuusgradientin mukaan aineen molekyylipaino lasketaan "kaavan mukaan

missä R on kaasun vakio, T - absoluuttinen lämpötila, o - kulmanopeus, p - liuottimen tiheys, v - osittainen tilavuus, kanssa X ja kanssa 2 on liuenneen aineen pitoisuus etäisyyksillä G G ja r 2 pyörimisakselilta.

Tämän menetelmän haittana on, että sedimentaatiotasapainon saavuttaminen kestää kauan - useista päivistä useisiin viikkoihin jatkuvalla sentrifugilla.

Sedimentaatiotasapainon lähestymismenetelmä kehitettiin, jotta päästäisiin eroon edellisen menetelmän haitoista, jotka liittyivät suureen aikainvestointiin, joka vaadittiin tasapainon saavuttamiseksi. Tällä menetelmällä voidaan määrittää molekyylipainot, kun sentrifugoitu liuos on Ensin makromolekyylit jakautuvat tasaisesti koko analyyttisen solun tilavuuteen, sitten sentrifugoinnin edetessä molekyylit asettuvat ja liuoksen tiheys meniskin alueella pienenee vähitellen. huolellisesti kirjattu, ja sitten monimutkaisilla laskelmilla, joihin liittyy suuri määrä muuttujia, tietyn yhdisteen molekyylipaino määritetään kaavoilla:

missä R on kaasun vakio, T on absoluuttinen lämpötila, v - osittainen ominaistilavuus, p - liuottimen tiheys, dcldr - makromolekyylin pitoisuusgradientti, g m ja g d - etäisyys meniskistä ja putken pohjasta, c m ja s d - makromolekyylien pitoisuus meniskissä ja putken pohjassa, vastaavasti, M m ja M R -molekyylipainojen arvot, jotka määritetään aineen pitoisuuden jakautumisen perusteella meniskissä ja vastaavasti koeputken pohjassa.

2.8.2 Valmisteiden puhtauden arviointi

Analyyttistä ultrasentrifugointia käytetään laajasti DNA-, virus- ja proteiinivalmisteiden puhtauden arvioinnissa. Valmisteiden puhtaus on epäilemättä erittäin tärkeä tapauksissa, joissa molekyylin molekyylipaino on määritettävä tarkasti. Useimmissa tapauksissa valmisteen homogeenisuus voidaan arvioida sedimentaatiorajan luonteen perusteella sedimentaationopeusmenetelmällä: homogeeninen valmiste antaa yleensä yhden jyrkästi määritellyn rajan. Valmisteen sisältämät epäpuhtaudet näkyvät ylimääräisenä piikkinä tai olakkeena; ne määrittävät myös päähuipun epäsymmetrian.

2.8.3 Makromolekyylien konformaatiomuutosten tutkimus

Toinen analyyttisen ultrasentrifugoinnin sovellusalue on makromolekyylien konformaatiomuutosten tutkimus. DNA-molekyyli voi esimerkiksi olla yksi- tai kaksijuosteinen, lineaarinen tai pyöreä. Erilaisten yhdisteiden vaikutuksesta tai korotetuissa lämpötiloissa DNA:ssa tapahtuu useita palautuvia ja palautumattomia konformaatiomuutoksia, jotka voidaan määrittää muuttamalla näytteen sedimentaationopeutta. Mitä kompaktimpi molekyyli, sitä pienempi sen kitkakerroin liuoksessa ja päinvastoin: mitä pienempi se on, sitä suurempi on kitkakerroin ja sen seurauksena se sedimentoituu hitaammin. Näin ollen erot näytteen sedimentaationopeudessa ennen ja jälkeen erilaisia ​​siihen kohdistuvia vaikutuksia mahdollistavat makromolekyyleissä tapahtuvien konformaatiomuutosten havaitsemisen.

Allosteerisissa proteiineissa, kuten esimerkiksi, tapahtuu konformaatiomuutoksia johtuen niiden sitoutumisesta substraattiin ja pieniin ligandeihin. Proteiinin hajoaminen alayksiköiksi voidaan indusoida käsittelemällä sitä aineilla, kuten urealla tai parakloorimerkuribentsoaatilla. Kaikkia näitä muutoksia voidaan helposti seurata käyttämällä analyyttistä ultrasentrifugointia.

Putkimaisten tuotteiden muovaus menetelmällä sentrifugointi. Alla sentrifugointi ... joita tällainen vaikutus suoritetaan, kutsutaan sentrifugointi. Valko-Venäjän tasavallan teollisuudessa käytetään vaakasuuntaisia ​​sentrifugeja ...

Hiukkasten laskeuma

Laboratoriotyöt >> Kemia

Solut ovat jo vapautuneet hitaalla nopeudella sentrifugointi ytimestä, mitokondrioista ja... ultrasentrifugointi Tämän tyypin ominaisuudet sentrifugointi heijastuu sen hyvin... meille käyttötapauksiin sentrifugointi sakkaroosin tiheysgradientissa...

Sentrifugin käyttö

Kurssityöt >> Teollisuus, tuotanto

Eräsentrifugeissa erilaisia ​​toimintoja sentrifugointi- lastaus, erottelu, purkaminen - tapahtuvat ... erotella preparatiivinen ja analyyttinen sentrifugointi. Preparatiivisen kanssa sentrifugointi biologista lähdemateriaalia otetaan...