Centrifugácia Ide o separáciu mechanických zmesí na ich zložky.
pôsobením odstredivej sily. Nástroje používané na tento účel
terče sa nazývajú centrifúgy.
Hlavnou časťou odstredivky je rotor s namontovaným v
hniezdi pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča s
vysoká rýchlosť, čo má za následok významné
veľkosť odstredivej sily, pod vplyvom ktorej
mechanické zmesi sa separujú napr
sedimentácia častíc suspendovaných v kvapaline.

Procesy prebiehajúce v odstredivke

Centrifúgy zdieľajú nasledujúce procesy:
1) Odstredivá filtrácia.
2) Odstredivé usadzovanie.
3) Odstredivé čírenie.

odstredivá filtrácia

Odstredivá filtrácia je
proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s
perforované bubny. Vnútorný povrch
takéhoto bubna je pokrytý filtračnou tkaninou.
Suspenzia je vrhaná odstredivou silou smerom k
steny bubna, pričom tuhá fáza zostáva zapnutá
povrch tkaniva a pôsobená kvapalina
odstredivá sila prechádza vrstvou sedimentu a
tkanina sa odoberá von cez otvory v bubne.
Odstredivá filtrácia zvyčajne pozostáva z
tri po sebe idúce fyzikálne procesy:
1) filtrácia s tvorbou zrazeniny;
2) zhutnenie sedimentu;
3) odstránenie zadržanej kvapaliny zo sedimentu
molekulárne sily;

odstredivé usadzovanie

odstredivé usadzovanie
Odstredivé usadzovanie - separačný proces
suspenzie v odstredivkách s bubnami
pevné steny. Suspenzia sa vstrekuje do spodnej časti
časti bubna a pri pôsobení odstredivej sily
hodené o steny. Steny tvoria vrstvu
sediment, a kvapalina tvorí vnútornú vrstvu a
vytlačené z bubna vstupujúceho do separácie
pozastavenie. Kvapalina stúpa nahor
naleje cez okraj bubna a odstráni sa
von.
V tomto prípade prebiehajú dva fyzikálne procesy:
1) Depozícia tuhej fázy.
2) Zhutnenie sedimentu.

Odstredivé čírenie

Odstredivé čírenie - separačný proces
riedke suspenzie a koloidné roztoky. Takže
to isté sa vykonáva v pevných bubnoch.
Fyzikálne, odstredivé
objasnenie je proces
voľné usadzovanie pevných častíc v teréne
odstredivé sily.
V bubnoch s pevnými stenami
tiež sa vykonáva separácia emulzií. Pod
pôsobenie zložiek odstredivej sily
emulzie podľa hustoty
umiestnené vo forme ohraničených vrstiev:
vonkajšia vrstva kvapaliny s vyššou hustotou
a vnútorná vrstva svetlejšej kvapaliny.
Kvapaliny sa vypúšťajú z bubna oddelene.

V klinických a sanitárnych laboratóriách
použitie odstreďovania
na oddelenie erytrocytov od
krvná plazma, krvné zrazeniny
sérum, husté častice z
tekutá časť moču a pod
na tento účel, príp
ručné odstredivky, príp
elektrické odstredivky,
ktorého rýchlosť otáčania
možno upraviť.
Ultracentrifúgy, rýchlosť
rotácia rotorov ktorej
presahuje 40 000 otáčok za minútu,
zvyčajne sa používa v
experimentálna prax
na oddelenie organel
bunky, separácia koloid
častice, makromolekuly,
polyméry.

Využitie centrifugácie v parazitológii

Metóda sa používa na odlíšenie komplexu
krvnej zmesi, moču alebo výkalov a následne
izolácia helmintov z nej na ďalšie
vyšetrenie pod mikroskopom a fixácia materiálu. AT
centrifugačný proces dostupný vo vzorke
parazity prechádzajú cez filter a hromadia sa v
spodná kužeľová priehradka rúrky. Filtračná sieťka
s bunkami špeciálnej veľkosti
v skúmavke je v dôsledku toho umiestnená vertikálne
čo sa stane horizontálne (laterálne)
filtrácia vzorky. V dôsledku toho drsné
častice nestrávenej potravy, vlákniny sa ukladajú v
miešacej komory a parazitov a ich vajíčok
voľne prejsť cez filter. Takže
Parazity sa teda koncentrujú v
povrchová vrstva jemného sedimentu, a
laboratórny lekár môže len starostlivo vyberať
vzorka pre mikroskopiu s
automatickú pipetu a naneste ju na
šmykľavka.

Centrifugačná metóda v cytológii

Diferenciálna metóda
sa používa odstreďovanie
frakcionácia buniek, teda ich stratifikácia
obsah na zlomky v závislosti od špecif
hmotnosť rôznych organel a bunkových inklúzií.
Na tento účel sa jemne rozdelené bunky otáčajú dovnútra
špeciálny prístroj - ultracentrifúga. AT
ako výsledok centrifugácie, bunkové zložky
zrazenina z roztoku, usadzovanie sa
podľa jeho hustoty. Viac hustejšie
štruktúry sa ukladajú nižšími rýchlosťami
odstreďovanie a menej husté - pri vysokej
rýchlosti. Výsledné vrstvy sa oddelia a študujú
oddelene.

10. Centrifugácia v botanike a fyziológii rastlín

Centrifugácia umožňuje získať rôzne
frakcie subcelulárnych častíc a preskúmať
vlastnosti a funkcie každej frakcie v
oddelene. Napríklad zo špenátových listov môžete
izolujte chloroplasty, umyte ich
opätovná centrifugácia vo vhodnom
médium z bunkových fragmentov a skúmajte ich
správanie v rôznych experimentálnych
podmienky alebo určiť ich chemické zloženie.
Ďalej je to možné použitím rôznych modifikácií
techniky, zničte tieto plastidy a izolujte
cez
diferenciálna centrifugácia (opakovane).
ukladanie častíc v rôznych hodnotách
zrýchlenie) ich základné prvky. Takže
tým bolo možné ukázať, že plastidy obsahujú
štruktúry, ktoré sú vysoko usporiadané
štruktúra, - takzvané zrná; všetky zrná
sú vo vnútri ohraničujúceho chloroplastu
membrány (membrána chloroplastu). Výhody
táto metóda je jednoducho neoceniteľná, pretože to
odhaľuje existenciu
funkčné podjednotky, ktoré tvoria
väčšie subcelulárne častice; najmä
pomocou metódy

11. Centrifugačná metóda vo virológii

Metóda odstreďovania s gradientom hustoty Brakke môže byť
použiť na výber aj akvizíciu
kvantitatívne charakteristiky rastlinných vírusov. Ako sa ukázalo,
Táto metóda je plná mnohých možností a v súčasnosti je
široko používané v oblasti virológie a molekulárnej
biológia. Pri vykonávaní výskumu metódou
hustotná centrifugácia centrifugačná skúmavka
čiastočne naplnené roztokom, ktorého hustota klesá v
smerom zdola k menisku. Na vytvorenie gradientu
najčastejšie sa používa frakcionácia rastlinných vírusov
sacharóza. Pred začatím centrifugácie môžu vírusové častice
byť buď distribuované v celom objeme roztoku, alebo nanesené na
vrchol gradientu. Brakke navrhol tri rôzne metódy
centrifugácia v hustotnom gradiente. Pri izotypickom
(rovnovážny) proces odstreďovania pokračuje až do
kým všetky častice v gradiente nedosiahnu úroveň, kde je hustota
médium sa rovná ich vlastnej hustote. teda
frakcionácia častíc nastáva v tomto prípade v súlade s
rozdiely v ich hustote. Roztoky sacharózy nemajú
dostatočná hustota na izopyknálnu separáciu mnohých
vírusy. Pri vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii sa vírus
najprv aplikovaný na predtým vytvorený gradient. Častice
sediment každého typu súčasne cez gradient vo forme zóny,
alebo pásiky, rýchlosťou v závislosti od ich veľkosti, tvaru a
hustota. Odstreďovanie sa ukončí, keď sa častice
naďalej sedimentovať. Rovnováha zonálna
centrifugácia podobná rýchlostnej zónovej
odstreďovanie, ale v tomto prípade odstreďovanie

12. Ťažkosti pri použití metódy odstreďovania

Aplikácia metódy diferenciálnej centrifugácie
s mnohými metodologickými ťažkosťami. Najprv o
uvoľnenie častíc môže poškodiť ich štruktúru. Takže
bolo potrebné vyvinúť špeciálne metódy na ničenie buniek,
ktoré by nespôsobili poškodenie štruktúry subcelulárneho
zlomky. Po druhé, keďže subcelulárne častice majú
membrány v procese ich uvoľňovania,
rôzne osmotické účinky. Preto za to
aby nedošlo k zničeniu ultraštruktúry skúmaných objektov
aj keď sú izolované, je potrebné starostlivo vybrať zloženie
prostredie, v ktorom dochádza k deštrukcii buniek a usadzovaniu
častice. A nakoniec umývanie subcelulárnych častíc
(opätovne ich suspendujte v médiu a potom znova
centrifugácia) môže viesť k strate niektorých
látky v nich obsiahnuté, ktoré pôsobením difúznych síl
ísť do riešenia.
V tomto ohľade je niekedy ťažké pochopiť, ktorá z malých molekúl
sú skutočne prvkami skúmaných štruktúr a ktoré
boli jednoducho adsorbované na ich povrchu počas procesu izolácie.
Táto situácia sťažuje určenie niektorých
funkčné vlastnosti vybraných objektov.

Metóda odstreďovania je založená na rozdielnom správaní častíc v odstredivom poli vytvorenom odstredivkou. Vzorka v nádobe odstredivky je umiestnená v rotore poháňanom pohonom odstredivky. Na oddelenie zmesi častíc je potrebné zvoliť súbor podmienok, ako je rýchlosť otáčania, čas odstreďovania a polomer rotora. U guľovitých častíc rýchlosť usadzovania (sedimentácie) závisí nielen od zrýchlenia, ale aj od polomeru a hustoty častíc, ako aj od viskozity média, v ktorom je vzorka uložená.

Centrifugáciu možno rozdeliť na dva typy: preparatívnu a analytickú. Preparatívna centrifugácia sa používa vtedy, keď je potrebné izolovať časť vzorky na ďalšiu analýzu. Táto metóda sa používa na izoláciu buniek zo suspenzie, biologických makromolekúl atď.

Analytická centrifugácia sa používa na štúdium správania biologických makromolekúl v odstredivom poli. Táto metóda umožňuje získať údaje o hmotnosti, tvare a veľkosti molekúl prítomných v relatívne malých objemoch vzoriek. Preparatívna centrifugácia je najbežnejšie používanou technikou v každodennej laboratórnej praxi.

Preparatívne laboratórne centrifúgy sa zase delia do skupín podľa účelu: preparatívne ultracentrifúgy, centrifúgy na všeobecné použitie a vysokorýchlostné centrifúgy. Univerzálne centrifúgy majú najväčšie praktické uplatnenie v lekárskych laboratóriách, majú maximálnu rýchlosť až 6 tisíc otáčok za minútu. Hlavným znakom tohto typu prístrojov je ich pomerne veľká kapacita - až 6 litrov, čo umožňuje použiť na odstreďovanie nielen centrifugačné skúmavky do 100 ml, ale aj nádoby do 1,25 l. Vo všetkých odstredivkách na všeobecné použitie sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli, takže odstredené nádoby musia byť pomerne presne vyvážené. Aby sa predišlo rozbitiu, do rotora by sa nemal vkladať nepárny počet skúmaviek, v prípade neúplného naplnenia by mala byť nádoba umiestnená oproti sebe.

Vysokorýchlostné odstredivky majú maximálnu rýchlosť 25 tisíc otáčok za minútu a zrýchlenie až 89 tisíc g. Komora obsahujúca rotor a odstredené vzorky je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje teplu generovanému trením, keď sa rotor otáča vysokou rýchlosťou. Typicky tieto odstredivky zvládnu objemy do 1,5 litra a sú vybavené šikmými alebo vymeniteľnými rotormi misy.

Preparatívne ultracentrifúgy zrýchľujú na 75 000 otáčok za minútu a majú maximálne odstredivé zrýchlenie 510 tisíc g. Sú vybavené chladiacimi a vákuovými jednotkami, aby sa zabránilo prehriatiu rotora trením vzduchu. Rotory pre tieto odstredivky sú vyrobené z vysokopevnostného titánu alebo zliatin hliníka. Hriadeľ ultracentrifúg je na rozdiel od vysokorýchlostných a preparatívnych vyrobených flexibilne, aby sa znížili vibrácie, keď je rotor nevyvážený. Kapacity v rotore musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na desatinu gramu.

Okrem filtrácie je separácia zmesi kvapalných a pevných látok možná aj centrifugáciou, teda separáciou látok v zariadeniach nazývaných centrifúgy.

Použitie odstredivky je založené na využití odstredivej sily. Pri rýchlej rotácii (odstreďovaní) sú pevné častice suspendované v kvapaline (s väčšou hustotou ako je hustota kvapaliny) pôsobením odstredivej sily vznikajúcej pri rotácii odmrštené zo stredu a tým sú oddelené od kvapaliny.

Ryža. 407. Thyssenov prístroj na mikroanalytické práce

Ryža. 408. Ručná odstredivka

Centrifúgy sú: otvorené a zatvorené, s ručným a mechanickým pohonom. Hlavnou časťou otvorenej ručnej odstredivky (obr. 408) je vertikálne nastavená rotačná os, na ktorú je na jej hornom konci pripevnená tyč s pohyblivo vystuženými dvoma (alebo štyrmi) kovovými objímkami. Tieto návleky sa vkladajú do špeciálnych rúrok zúžených nadol (obr. 409) s kvapalinou, z ktorej sa musia odstraňovať suspendované častice,

Kus vaty sa umiestni na spodok rukáva, „aby sa zabránilo priamemu kontaktu skla a kovu. Po vložení skúmaviek do objímok sa odstredivka uvedie do pohybu a po určitom čase (v závislosti od viskozity kvapaliny, veľkosti suspendovaných častíc a rozdielu hustoty) sa suspendované látky oddelia od kvapaliny, po ktorým sa odstredivka zastaví. Na dne skúmavky sa zhromažďuje hustá zrazenina tuhej látky, nad ktorou je číra kvapalina.

W zakryté odstredivky(obr. 410), v závislosti od veľkosti, obsahujú rôzny počet objímok, od 2 do 12 alebo viac, umiestnených symetricky v rovnakej vzdialenosti od seba a od osi odstredivky.

Mechanické uzavreté odstredivky(obr. 410, b) sú pohodlnejšie ako manuálne (obr. 410, a). Zvyčajne dávajú 2000-3000 otáčok za minútu, umožňujú dosiahnuť dokonalejšie oddelenie kvapaliny a pevnej látky.

Skúmavky odstredivky musia mať po naplnení kvapalinou rovnakú hmotnosť. Ak sa musí odstredivka často používať, odporúča sa mať špeciálne váhy prispôsobené na váženie (alebo skôr tárovanie) skúmaviek. V týchto mierkach sú poháre zavesené na nosníku pomocou tyčí pripevnených k stredu pohárov. Tieto tyčinky majú krúžky, do ktorých sa vkladajú skúmavky.

Po spevnení skúmaviek najskôr nalejte kvapalinu, ktorá sa má odstrediť, do jednej skúmavky (napríklad pomocou pipety) a potom do druhej, pričom sa snažte vyvážiť poháre.

Nikdy nedávajte do skúmaviek príliš veľa tekutiny; skúmavky sa plnia tak, aby vzdialenosť od okraja k hladine kvapaliny nebola menšia ako 10 mm.

Keď potrebujete vyvážiť veľa skúmaviek, je vhodné použiť nasledujúcu techniku. Po vyvážení prvého páru skúmaviek sa jedna z nich vyberie a vloží do objímky odstredivky a druhá sa ponechá na váhe; táto posledná skúmavka bude slúžiť ako štandard pre zvyšok, vložte ďalšiu skúmavku do voľného priestoru na váhe, vyvážte ju štandardom a vyberte ju. Skúmavky je tiež vhodné vopred naplniť (o niečo menšie množstvo tekutiny, ako je potrebné) a doplniť potrebné množstvo tekutiny už pri bilancovaní. Tento prístup urýchľuje prácu.

Ryža. 409. Skúmavky do centrifúg.

Vyvážené skúmavky sa vložia do objímok odstredivky.

Odstredivka by sa nemala spúšťať na plné otáčky okamžite, ale postupne. To platí pre manuálne aj mechanické odstredivky.

Ryža. 410. Uzavreté odstredivky: a - s ručným pohonom; b - s elektromotorom.

Mechanické odstredivky na reguláciu otáčok majú vhodné zariadenia. Elektrické odstredivky sú teda vybavené reostatmi pre postupné zapínanie na plný počet otáčok. V odstredivkách poháňaných vodnou turbínou sa postupné zvyšovanie otáčok dosahuje reguláciou vodného lúča. Čím starostlivejšie bola inklúzia vykonaná, tým spoľahlivejšie centrifúga funguje.

Centrifúgu treba neustále monitorovať; jeho kontaminácia, najmä pohyblivé časti, je neprijateľná. Kovové rukávy by sa mali ľahko a voľne otáčať. Ozubené kolesá poháňajúce odstredivku sa musia dať ľahko pohybovať; nesmú byť mazané tukami, ktoré môžu zhustnúť. Aj hriadeľ odstredivky musí byť v poriadku a vždy čistý.

Neopatrné zaobchádzanie s odstredivkami, najmä s ručnými odstredivkami, môže ohnúť nápravu a tým odstredivku znefunkčniť.

Po vypnutí centrifúgy sa samoštartér zastaví a až potom sa skúmavky vyberú.

V poslednej dobe sa čoraz viac rozširujú takzvané supercentrifúgy, ktoré dávajú až 40 000 otáčok za minútu (obr. 411).

Ryža. 411 supercentrifúga

Takéto odstredivky sú obzvlášť vhodné na odstreďovanie všetkých druhov viskóznych roztokov, ako sú laky, jemné disperzie a emulzie.

Kvapalina, ktorá sa má superodstrediť, vstupuje do dýzy 1 umiestnenej v spodnej časti zariadenia. Potom sa kvapalina naleje do pracovného valca 2, rotujúceho rýchlosťou až 40 000 otáčok za minútu, v ktorom sa oddelia ťažšie častice suspendované v kvapaline. Kvapalina postupne stúpa pozdĺž valca 2 až po separátor 5, a ak je emulzia zničená, potom ľahšia kvapalina vyteká cez odtok 8 a ťažšia - cez odtok 4. Pri oddeľovaní pevných častíc s hustotou väčšou ako jeden, kvapalina vyteká odtokom 3. Na vnútornej stene pracovného valca je uložený oddeliteľný pevný sediment. Supercentrifúga. Z času na čas sa supercentrifúga zastaví, pracovný valec 2 sa odstráni, vyčistí sa od sedimentu a vráti sa späť na miesto, práca pokračuje. Celý proces čistenia pracovného valca od momentu zastavenia až po moment nového štartu supercentrifúgy netrvá dlhšie ako 15 minút. Ak musíte čistiť relatívne veľké množstvá kvapaliny, použite tri8 supercentrifúgy: jedna funguje, druhá sa čistí, tretia je v rezerve,

Centrifugácia je separácia mechanických zmesí na ich zložky pôsobením odstredivej sily. Zariadenia používané na tento účel sa nazývajú centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor, v ktorom sú namontované hniezda pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča vysokou rýchlosťou, v dôsledku čoho vznikajú značné odstredivé sily, pôsobením ktorých sa oddeľujú mechanické zmesi, napríklad sa ukladajú častice suspendované v kvapaline.

Centrifúgy: 1 - ručné: 2 - s elektrickým pohonom.

V klinických a sanitárnych laboratóriách sa centrifugácia používa na oddelenie krvnej plazmy, od hustých častíc z tekutej časti moču a pod. Na tento účel sa používajú buď manuálne centrifúgy (obr., 1) alebo elektrické centrifúgy, rýchlosť otáčania ktorý je možné nastaviť (obr., 2).

Ultracentrifúgy, ktorých otáčky rotora presahujú 40 000 otáčok za minútu, sa zvyčajne používajú v experimentálnej praxi na separáciu bunkových organel, separáciu koloidných častíc, makromolekúl atď.

Centrifugácia je separácia hrubých systémov, pozostávajúcich z kvapalných a pevných zložiek s rôznou hustotou, pomocou špeciálnych prístrojov nazývaných odstredivky. Princíp činnosti odstredivky je založený na vytvorení veľkej odstredivej sily, pod vplyvom ktorej sa rýchlosť oddeľovania zložiek zmesi umiestnenej v odstredivke mnohonásobne zvyšuje v porovnaní s rýchlosťou ich oddeľovania pri pôsobení gravitácie.

Metóda odstreďovania je široko používaná v biológii, medicíne a technológii, často nahrádza procesy filtrovania, usadzovania a lisovania.

Odstredivka má kryt, pohonný mechanizmus, rotor, pracovnú (uzavieraciu) komoru a ovládací panel. Niektoré odstredivky sú vybavené elektrickými hodinami, ktoré zabezpečujú automatické vypnutie a brzdenie v rozsahu od 5 do 60 minút. Špeciálne centrifúgy majú chladiace a vákuové jednotky so sledovacím a automatickým riadiacim zariadením. Hlavnou časťou každej odstredivky je rotor (v laboratórnych odstredivkách býva umiestnený na zvisle uloženom hriadeli elektromotora alebo otáčaný rôznymi prevodmi z hriadeľa motora, niekedy aj ručne). Rotor odstredivky je disk (kríž) s odklopnými objímkami pre kovové objímky, v ktorých sú umiestnené skúmavky, ktoré pri otáčaní zaujmú vodorovnú polohu.

Niekedy je rotor vyrobený vo forme pevného kovového zrezaného kužeľa s bunkami pre skúmavky (uhlový rotor); rúrky v ňom sú umiestnené v konštantnom uhle k osi otáčania (zvyčajne 40 °). Pri naklonenej polohe skúmaviek sa zložky zmesi oddeľujú rýchlejšie. Separácia zmesi sa uskutočňuje v skúmavkách rôznych tvarov a objemov (obr. 1). Pri práci pri vysokých rýchlostiach sa používajú skúmavky vyrobené z polyetylénu, pretože sklenené prasknú. Skúmavky so spracovávaným materiálom umiestnené jedna proti druhej v rotore musia byť vyvážené. To poskytuje rovnomerné zaťaženie hriadeľa rotora a zabezpečuje rovnomerné otáčanie hriadeľa odstredivky. Na vyváženie skúmaviek sa používajú špeciálne váhy (obr. 2).

Ryža. 1. Skúmavky na odstreďovanie.

Ryža. 2. Odstredivé váhy.

Centrifúgy používané v priemysle sa líšia od laboratórnych centrifúg zložitejšou konštrukciou rotora, ktorá umožňuje súčasne odstreďovať veľké množstvo materiálu alebo kontinuálne vykonávať separačné procesy.

Centrifúgy s nízkou rýchlosťou rotora sa používajú v medicíne na separáciu močových sedimentov, krvného séra od zrazenín, sedimentáciu erytrocytov, pri sérologických štúdiách atď.

Mikrocentrifúga (obr. 4) je ovládaná ručne; vybavená dvoma vymeniteľnými dýzami, z ktorých jedna má hniezda pre mikroskúmavky a používa sa na stanovenie kompatibility krvi; druhý - s hrdlom na vloženie odmernej mikropipety (hematokrit) - je určený na stanovenie percenta krviniek.

Ryža. 3. Ručná odstredivka.

Ryža. 4. Mikrocentrifúga.

Manuálna odstredivka (obr. 3) má štyri kovové alebo plastové návleky na 15 ml skúmavky.

Laboratórna klinická centrifúga TsLK-1 (obr. 5, 7) má tri rýchlosti otáčania (1000, 1500, 3000 ot./min.). Krížový rotor je prispôsobený pre 12 bežných odstredivkových skúmaviek. Najväčší objem odstredenej kvapaliny je 150 ml.

Centrifúgy s vysokou rýchlosťou rotora sú vo väčšine prípadov vybavené výmennými rotormi určenými pre rôzne objemy kvapaliny a slúžia na separáciu jemných suspenzií.

Laboratórna stolná centrifúga TsLN-2 (obr. 5, 2) má šikmý rotor pre šesť krátkych skúmaviek s celkovou kapacitou 72 ml. Maximálna rýchlosť otáčania -9000 ot./min.

Ryža. 5. Rôzne laboratórne centrifúgy: 1 - klinické; 2 - pracovná plocha; 3 - roh malý; 4 - stacionárne; 5 - chladnička.

Malouhlová odstredivka TsUM-1 (obr. 5, 3) má tri vymeniteľné uhlové rotory s rôznym počtom skúmaviek a hematokritom: rotor na 6 skúmaviek s celkovou kapacitou 150 ml, rotor na 10 skúmaviek s celkovým objem 120 ml, rotor pre 24 skúmaviek s celkovou kapacitou 120 ml, hematokrit pre dve kapiláry. Maximálna rýchlosť otáčania je 10 000 ot./min.

Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Laboratórna stacionárna odstredivka TsLS-2 (obr. 5, 4) má dva vymeniteľné rotory. Krížový rotor je vybavený štyrmi oceľovými objímkami s objemom 500 ml a štyrmi sklenenými skúmavkami k nim s objemom 250 ml. Uhlový rotor je dodávaný s 8 polyetylénovými a oceľovými skúmavkami s objemom 50-75 ml. Maximálne otáčky rotorov sú až 6000 ot./min. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Medzi špeciálne centrifúgy patrí laboratórna chladená centrifúga CLR-1 (obr. 5.5), určená na odstreďovanie pri nízkych teplotách (-5 ° a viac) rôznych látok, ktoré sa menia aj pri izbovej teplote – väčšinou sú to proteínové suspenzie. Odstredivka má tri vymeniteľné rotory poskytujúce rôzne režimy odstreďovania. Dva rotory sú zhodné s technickými charakteristikami rotorov odstredivky typu TsLS-2, tretí rotor, ktorý je umiestnený na prídavnej náprave, vyvinie 18 000-18 500 ot./min. Maximálny objem skúšaného lieku je 48 ml. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom. Chladenie pracovnej komory sa vykonáva pomocou chladiaceho stroja.

Pozri tiež Ultracentrifugácia.

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov roztokov sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dobrá separácia dosiahne použitím D20 namiesto obyčajnej vody. 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Voľba gradientu je daná špecifickými úlohami frakcionácie. Napríklad fikol vyrábaný spoločnosťou Pharmacia Fine Chemicals môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou ficol je, že neprechádza cez bunkové membrány. Soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, sa používajú na vytváranie gradientov vyššej hustoty, avšak v dôsledku korozívneho účinku CsCl sa takéto gradienty používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán.

2.5.2 Technika stupňovitého gradientu hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa niekoľko roztokov s postupne klesajúcou hustotou opatrne zavedie do centrifugačnej skúmavky pomocou pipety. Potom sa na najvrchnejšiu vrstvu, ktorá má najnižšiu hustotu, navrství vzorka vo forme úzkej zóny, po ktorej sa skúmavka odstredí. Hladké lineárne gradienty možno získať vyhladzovaním postupných gradientov počas dlhšieho státia roztoku. Proces je možné urýchliť jemným premiešaním obsahu skúmavky drôtom alebo jemným potrasením skúmavky.

2.5.3 Technika vytvárania hladkého gradientu hustoty

Vo väčšine prípadov sa na vytvorenie hladkého gradientu hustoty používa špeciálne zariadenie. Skladá sa z dvoch valcových nádob presne definovaného identického priemeru, navzájom komunikujúcich v spodnej časti sklenenou trubicou s regulačným ventilom, čo umožňuje nastaviť pomery, v ktorých sa obsah oboch nádob mieša. Jedna z nich je vybavená miešadlom a má výstup, ktorým roztok prúdi do centrifugačných skúmaviek. Hustší roztok sa umiestni do mixéra; druhý valec je naplnený roztokom nižšej hustoty. Výška stĺpca roztokov v oboch valcoch je nastavená tak, aby hydrostatický tlak v nich bol rovnaký. Hustší roztok sa postupne vypúšťa z mixéra do skúmaviek odstredivky a súčasne sa nahrádza rovnakým objemom roztoku s nižšou hustotou vstupujúceho do mixéra z druhého valca cez riadiaci ventil. Homogenita roztoku v miešačke je zabezpečená neustálym miešaním roztoku pomocou miešadla. Keď je roztok odvádzaný do centrifugačných skúmaviek, jeho hustota klesá a v skúmavkách sa vytvára lineárny gradient hustoty. Nelineárne gradienty môžu byť vytvorené pomocou systému pozostávajúceho z dvoch valcov nerovnakého priemeru.

Na vytváranie hustotných gradientov rôznej strmosti sa používa systém dvoch mechanicky ovládaných striekačiek, ktoré sú naplnené roztokmi s nerovnakou hustotou. Zmenou relatívnej rýchlosti piestov možno vytvoriť rôzne gradienty.

2.5.4 Extrakcia gradientov z centrifugačných skúmaviek

Po dokončení odstreďovania a oddelení častíc musia byť vytvorené zóny odstránené. Robí sa to niekoľkými spôsobmi, najčastejšie metódou posunu. Na dne sa prepichne centrifugačná skúmavka a do jej spodnej časti sa pomaly zavedie veľmi husté médium, napríklad 60-70% roztok sacharózy. Horný roztok sa vytlačí a frakcie sa odoberú pomocou injekčnej striekačky, pipety alebo špeciálneho zariadenia pripojeného cez hadičku k zberaču frakcií. Ak sú rúrky vyrobené z celuloidu alebo nitrocelulózy, frakcie sa extrahujú rezaním rúrky špeciálnou čepeľou. Na tento účel sa odstredivková skúmavka upevnená v stojane nareže priamo pod želanou zónou a frakcia sa odsaje injekčnou striekačkou alebo pipetou. Pri vhodnej konštrukcii rezacieho zariadenia bude strata roztoku minimálna. Zber frakcií sa tiež uskutočňuje prepichnutím dna skúmavky tenkou dutou ihlou. Kvapky vytekajúce zo skúmavky cez ihlu sa zachytávajú v zberači frakcií na ďalšiu analýzu.

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich aplikácie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy. Odstredivky na všeobecné použitie daj maximálne otáčky 6000 ot/min -1 a OCU až 6000 g . Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranaté a so závesnými okuliarmi. Jednou z vlastností tohto typu centrifúg je ich veľká kapacita - od 4 do 6 dm 3 , čo umožňuje ich nakladanie nielen centrifúgami s objemom 10,50 a 100 cm 3 , ale aj nádobami s objemom až 1,25 dm 3. Vo všetkých centrifúgach tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a rúrky centrifúgy spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a musia sa líšiť v hmotnosti nie viac ako 0,25 g, mali by byť umiestnené symetricky, jedna proti sebe. iné, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie skúmaviek vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky poskytujú maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min -1 a OCU až 89 000 g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje zahrievaniu, ku ktorému dochádza v dôsledku trenia počas otáčania rotora. Rýchlobežné odstredivky majú spravidla objem 1,5 dm 3 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, ako uhlovými, tak aj so závesnými sklami.

Preparatívne ultracentrifúgy poskytujú maximálnu rýchlosť až 75 000 ot./min -1 a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000 g . Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby nedochádzalo k prehrievaniu rotora v dôsledku jeho trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory z hliníkovej zliatiny, avšak v prípadoch, keď sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia skúmaviek odstredivky majú ultracentrifúgy flexibilný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g. Podobné požiadavky by sa mali dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné účely.

2.6 Konštrukcia rotorov

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so závesnými vedrami

Rotory preparatívnych centrifúg sú zvyčajne dvojakého typu - uhlové a závesné vedierka. Nazývajú sa uhlové, pretože odstredivkové trubice v nich umiestnené sú vždy v určitom uhle k osi otáčania. V rotoroch so závesnými okuliarmi sú skúmavky inštalované vertikálne a pri otáčaní pôsobením výslednej odstredivej sily sa pohybujú do horizontálnej polohy; uhol sklonu k osi otáčania je 90°.

V uhlových rotoroch je vzdialenosť, ktorú prejdú častice k zodpovedajúcej stene skúmavky, veľmi malá, a preto k sedimentácii dochádza pomerne rýchlo. Po zrážke so stenami skúmavky častice skĺznu dolu a na dne vytvoria sediment. Pri odstreďovaní vznikajú konvekčné prúdy, ktoré značne komplikujú separáciu častíc s podobnými sedimentačnými vlastnosťami. Napriek tomu sa rotory podobnej konštrukcie úspešne používajú na separáciu častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie sa značne líši.

V rotoroch so závesnými pohármi sa tiež pozorujú konvekčné javy, ale nie sú také výrazné. Konvekcia je výsledkom skutočnosti, že pri pôsobení odstredivého zrýchlenia sa častice usadzujú v smere, ktorý nie je striktne kolmý na os rotácie, a preto, ako pri uhlových rotoroch, narážajú na steny skúmavky a skĺznu do dno.

Efektom konvekcie a vírenia je možné do určitej miery zabrániť použitím sektorovo tvarovaných rúrok v rotoroch so závesnými miskami a nastavením rýchlosti rotora; vyššie uvedené, je spôsob odstreďovania v hustotnom gradiente tiež zbavený nevýhod.

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; prietok rotora závisí od charakteru ukladaného prípravku a pohybuje sa od 100 cm 3 do 1 dm 3 za 1 min. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto nie je znečistený ani postriekaný.

2.6.3 Zonálne alebo Andersonove rotory

Zonálne rotory sú vyrobené z hliníka alebo zliatin titánu, ktoré sú schopné odolávať veľmi výrazným odstredivým zrýchleniam. Zvyčajne majú valcovú dutinu uzavretú odnímateľným krytom. Vo vnútri dutiny je na osi otáčania axiálna rúrka, na ktorú je nasadená tryska s lopatkami, ktorá rozdeľuje dutinu rotora na štyri sektory. Lopatky alebo usmerňovače majú radiálne kanály, cez ktoré je gradient vstrekovaný z axiálnej rúrky k obvodu rotora. Vďaka tomuto dizajnu lopatiek je konvekcia znížená na minimum.

Plnenie rotora prebieha pri jeho otáčaní rýchlosťou cca 3000 ot/min -1. Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počínajúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je udržiavaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily. . S následným pridávaním vrstiev s vyšším hustotným gradientom nastáva kontinuálny posun smerom k stredu menej hustých vrstiev. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota je rovnaká alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka , ktorý je vytlačený z rúrky do objemu rotora pomocou roztoku s nižšou hustotou, pričom rovnaký objem "vankúše" je odstránený z obvodu. Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora upraví na pracovnú rýchlosť a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknická frakcionácia. . Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot./min. Obsah rotora sa premiestňuje pridaním „vankúše“ z periférie, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy . Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestňovaní. Výstupný gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad spektrofotometrickú celu, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorpciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa odoberajú frakcie.

Kapacita zonálnych rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm 3 , čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zonálne rotory sa používajú na odstránenie proteínových kontaminantov z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Vlastnosti prípravku subcelulárnych častíc získaných frakcionáciou možno pripísať vlastnostiam samotných častíc iba vtedy, ak prípravok neobsahuje nečistoty. Preto je vždy potrebné hodnotiť čistotu získaných prípravkov. Účinnosť homogenizácie a prítomnosť nečistôt v prípravku možno určiť mikroskopickým vyšetrením. Neprítomnosť viditeľných nečistôt však zatiaľ nie je spoľahlivým dôkazom čistoty drogy. Aby sa kvantifikovala čistota získaného prípravku, je podrobený chemickej analýze, ktorá umožňuje určiť obsah proteínov alebo DNA v ňom, určiť jeho enzymatickú aktivitu, ak je to možné, a imunologické vlastnosti.

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na nejakom špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako mitochondriálne markerové enzýmy, kyslé hydrolázy ako lyzozómové markery, kataláza ako peroxizómový marker a glukóza-6- fosfatáza - marker mikrozomálnej membrány. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, ako je malátdehydrogenáza, R-glukuronidáza, NADP "H-cytochróm-c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii. Preto by sa k výberu enzýmových markerov subcelulárnych frakcií v každom konkrétnom prípade malo pristupovať veľmi opatrne. Navyše absencia markerového enzýmu neznamená absenciu vhodných organel Je pravdepodobné, že enzým sa organelami počas frakcionácie stratí, alebo je inhibovaný či inaktivovaný, preto sa pre každú frakciu zvyčajne stanovujú aspoň dva markerové enzýmy.

Zlomok	Objem, cm"	Všeobecný chov	Exnulácia, 660 nm	Jednotky aktivity enzýmov	Výťažok aktivity vo frakciách,%

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

Výsledky získané z frakcionácie tkaniva sú najvýhodnejšie prezentované vo forme grafov. Pri štúdiu distribúcie enzýmov v tkanivách sa teda údaje najlepšie prezentujú vo forme histogramov, ktoré umožňujú vizuálne vyhodnotiť výsledky experimentov.

Enzymatická aktivita obsahu bielkovín vo vzorke sa zisťuje ako v pôvodnom homogenáte, tak aj v každej izolovanej subcelulárnej frakcii samostatne. Celková enzymatická aktivita a obsah bielkovín vo frakciách by sa nemali výrazne líšiť od zodpovedajúcich hodnôt v pôvodnom homogenáte.

Potom sa vypočíta enzymatická aktivita a obsah proteínu v každej frakcii v % z celkového výťažku, na základe čoho sa urobí histogram. Relatívne množstvo proteínu v každej frakcii je postupne vynesené pozdĺž osi x v poradí ich izolácie a relatívna špecifická aktivita každej frakcie je vynesená pozdĺž osi y. Enzymatická aktivita každej frakcie sa teda určuje z plochy stĺpcov.

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separácia látok a ich čistenie, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickom odstreďovaní používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržite monitorovať sedimentáciu materiálu. v odstredivé pole.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosiahnuť rýchlosť až 70 000 ot./min., pričom generujú odstredivé zrýchlenie až 500 000 ot./min. g . Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je pomocou struny spojený s motorom, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú inštalované v odstredivke striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, ktorej kapacita je zvyčajne 1 cm3, má sektorový tvar. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že je vzpriamený, funguje na rovnakom princípe ako rotor so zavesenými vedrami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú sledovať sedimentáciu častíc počas celej doby centrifugácie. Vo vopred stanovených časových intervaloch je možné sedimentujúci materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia monitoruje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď majú študované roztoky rôzne indexy lomu, pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou sa svetlo láme na hranici zóny. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. V priebehu sedimentácie sa pohybuje hranica a tým aj vrchol, ktorého rýchlosť môže byť použitá na posúdenie rýchlosti sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

V biológii sa analytická ultracentrifugácia používa na stanovenie molekulových hmotností makromolekúl, na kontrolu čistoty získaných vzoriek a na štúdium konformačných zmien makromolekúl.

2.8 Aplikácia analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Existujú tri hlavné metódy na stanovenie molekulových hmotností pomocou analytickej ultracentrifugácie: stanovenie rýchlosti sedimentácie, metóda sedimentačnej rovnováhy a metóda aproximácie sedimentačnej rovnováhy.

Stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou - toto je najbežnejšia metóda. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú pohybovať v poradí pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a tou jeho časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pohybuje počas odstreďovania, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou jednej z vyššie uvedených metód, pričom tento pohyb zaznamenávame na fotografickú platňu.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

kde X - vzdialenosť od osi otáčania v cm,

t - čas v s,

w je uhlová rýchlosť v rad-s-1,

s - sedimentačný koeficient „molekul.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia, meria sa v Seedbergove jednotky ; 1 Swedbergova jednotka sa rovná 10 _13 s. Číselná hodnota s závisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15 S; kataláza má sedimentačný koeficient 11,35S, bakteriálne ribozómové podjednotky od 30 do 50S a eukaryotické ribozómové podjednotky od 40 do 60S.

kde M je molekulová hmotnosť molekuly, R je plyn konštantný, T - absolútna teplota, s - sedimentačný koeficient molekuly, D je difúzny koeficient molekuly, v - čiastočný špecifický objem, ktorý možno považovať za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p - hustota rozpúšťadla.

Metóda sedimentačnej bilancie. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa uskutočňuje pri relatívne nízkych otáčkach rotora, rádovo 7 000-8 000 ot./min.-1, aby sa molekuly s veľkou molekulovou hmotnosťou neusadzovali na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa nastolí pôsobením odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, to znamená, kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa podľa výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky „podľa vzorca

kde R je plyn konštantný, T - absolútna teplota, o - uhlová rýchlosť, p - hustota rozpúšťadla, v - čiastočný špecifický objem, s X a s 2 je koncentrácia rozpustenej látky na vzdialenosti G G a r2 od osi otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho – od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda približovania sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinutá s cieľom zbaviť sa nedostatkov predchádzajúcej metódy, spojených s veľkou investíciou času potrebného na "ustanovenie rovnováhy. Pomocou tejto metódy možno určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok v stav priblíženia k rovnováhe. Najprv sa makromolekuly rovnomerne rozložia po celom objeme analytickej kyvety, potom sa pri postupujúcej centrifugácii molekuly usadzujú a hustota roztoku v oblasti menisku sa postupne znižuje. starostlivo zaznamenané a potom zložitými výpočtami zahŕňajúcimi veľký počet premenných sa molekulová hmotnosť danej zlúčeniny určí podľa vzorcov:

kde R je plyn konštantný, T je absolútna teplota, v - čiastočný špecifický objem, p - hustota rozpúšťadla, dcldr - koncentračný gradient makromolekuly, g m a g d - vzdialenosť k menisku a dnu skúmavky, c m a s d - koncentrácia makromolekúl v menisku a na dne skúmavky, v tomto poradí, M m a M R - hodnoty molekulových hmotností, určené distribúciou koncentrácie látky v menisku a na dne skúmavky.

2.8.2 Hodnotenie čistoty prípravkov

Analytická ultracentrifugácia sa široko používa na hodnotenie čistoty DNA, vírusov a proteínových prípravkov. Čistota prípravkov je nepochybne veľmi dôležitá v prípadoch, keď je potrebné presne určiť molekulovú hmotnosť molekuly. Vo väčšine prípadov možno homogenitu prípravku posúdiť podľa povahy sedimentačnej hranice, pričom sa použije metóda rýchlosti sedimentácie: homogénny prípravok zvyčajne poskytuje jednu ostro definovanú hranicu. Nečistoty prítomné v prípravku sa javia ako ďalší vrchol alebo rameno; určujú aj asymetriu hlavného vrcholu.

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách

Ďalšou oblasťou použitia analytickej ultracentrifugácie je štúdium konformačných zmien v makromolekulách. Molekula DNA môže byť napríklad jednovláknová alebo dvojvláknová, lineárna alebo kruhová. Vplyvom rôznych zlúčenín alebo pri zvýšených teplotách dochádza v DNA k množstvu reverzibilných a ireverzibilných konformačných zmien, ktoré možno určiť zmenou rýchlosti sedimentácie vzorky. Čím je molekula kompaktnejšia, tým je jej koeficient trenia v roztoku nižší a naopak: čím je menej kompaktná, tým je koeficient trenia väčší a tým pomalšie sedimentuje. Rozdiely v rýchlosti sedimentácie vzorky pred a po rôznych dopadoch na ňu teda umožňujú odhaliť konformačné zmeny vyskytujúce sa v makromolekulách.

V alosterických proteínoch, ako je napríklad aspartáttranskarbamoyláza, dochádza ku konformačným zmenám v dôsledku ich väzby na substrát a malé ligandy. Disociácia proteínu na podjednotky môže byť vyvolaná pôsobením látok, ako je močovina alebo parachlórortuťibenzoát. Všetky tieto zmeny možno ľahko monitorovať pomocou analytickej ultracentrifugácie.

Formovanie rúrkových výrobkov metódou odstreďovanie. Pod odstreďovanie v priemysle stavebných hmôt ... ktoré sa takýto dopad vykonáva sa nazývajú odstreďovanie. V priemysle Bieloruskej republiky sa používajú horizontálne odstredivky ...

Ukladanie častíc

Laboratórne práce >> Chémia

Bunky sú už uvoľnené nízkou rýchlosťou odstreďovanie z jadra, mitochondrií a... ultracentrifugácia Vlastnosti tohto typu odstreďovanie odráža v jeho veľmi... pre nás prípadov použitia odstreďovanie v hustotnom gradiente sacharózy, ...

Pomocou odstredivky

Kurz >> Priemysel, výroba

V dávkových odstredivkách rôzne operácie odstreďovanie- nakladanie, oddeľovanie, vykladanie - prebieha ... rozlišovať medzi prípravnými a analytickými odstreďovanie. S prípravným odstreďovanie odoberá sa zdrojový biologický materiál...