Sentrifugasi Ini adalah pemisahan campuran mekanis menjadi bagian-bagian penyusunnya.
oleh aksi gaya sentrifugal. Instrumen yang digunakan untuk ini
target disebut sentrifugal.
Bagian utama dari centrifuge adalah rotor dengan terpasang di
itu sarang untuk tabung centrifuge. Rotor berputar dengan
kecepatan tinggi, menghasilkan signifikan
besarnya gaya sentrifugal, di bawah pengaruh yang
campuran mekanis dipisahkan, misalnya
sedimentasi partikel tersuspensi dalam cairan.

Proses yang terjadi di centrifuge

Centrifuge berbagi proses berikut:
1) Filtrasi sentrifugal.
2) Pengendapan sentrifugal.
3) Klarifikasi sentrifugal.

filtrasi sentrifugal

Filtrasi sentrifugal adalah
proses pemisahan suspensi dalam sentrifugal dengan
drum berlubang. Permukaan dalam
drum semacam itu ditutup dengan kain saring.
Suspensi dilemparkan oleh gaya sentrifugal ke arah
dinding drum, sedangkan fase padat tetap menyala
permukaan jaringan, dan cairan di bawah aksi
gaya sentrifugal melewati lapisan sedimen dan
kain dikeluarkan ke luar melalui lubang di drum.
Filtrasi sentrifugal biasanya terdiri dari:
tiga proses fisik berturut-turut:
1) penyaringan dengan pembentukan endapan;
2) pemadatan sedimen;
3) penghapusan dari sedimen cairan yang tertahan
kekuatan molekuler;

pengendapan sentrifugal

pengendapan sentrifugal
Pengendapan sentrifugal - proses pemisahan
suspensi dalam sentrifugal dengan drum
dinding yang kokoh. Suspensi disuntikkan ke bagian bawah
bagian dari drum dan di bawah aksi gaya sentrifugal
dilemparkan ke dinding. Dinding membentuk lapisan
sedimen, dan cairan membentuk lapisan dalam dan
dipindahkan dari drum memasuki pemisahan
penangguhan. Cairan naik
dituangkan di atas tepi drum dan dikeluarkan
keluar.
Dalam hal ini, dua proses fisik terjadi:
1) Pengendapan fase padat.
2) Pemadatan sedimen.

Klarifikasi sentrifugal

Klarifikasi sentrifugal - proses pemisahan
suspensi tipis dan larutan koloid. Jadi
hal yang sama dilakukan pada drum padat.
Secara fisik, sentrifugal
klarifikasi adalah sebuah proses
deposisi bebas partikel padat di lapangan
kekuatan sentrifugal.
Dalam drum dengan dinding kokoh
pemisahan emulsi juga dilakukan. Di bawah
aksi komponen gaya sentrifugal
emulsi menurut kepadatan
terletak dalam bentuk lapisan yang dibatasi:
lapisan terluar dari cairan dengan kepadatan yang lebih tinggi
dan lapisan dalam cairan yang lebih ringan.
Cairan dikeluarkan dari drum secara terpisah.

Di laboratorium klinis dan sanitasi
penggunaan sentrifugasi
untuk memisahkan eritrosit dari
plasma darah, bekuan darah
serum, partikel padat dari
bagian cair dari urin, dll. Untuk
untuk tujuan ini, atau
sentrifugal manual, atau
sentrifugal listrik,
yang kecepatan putarannya
dapat disesuaikan.
Ultrasentrifugal, kecepatan
rotasi rotor yang
melebihi 40.000 rpm,
biasanya digunakan dalam
praktek eksperimental
untuk memisahkan organel
sel, pemisahan koloid
partikel, makromolekul,
polimer.

Penggunaan sentrifugasi dalam parasitologi

Metode yang digunakan untuk membedakan kompleks
campuran darah, urin atau feses, diikuti oleh
isolasi cacing dari itu untuk lebih lanjut
pemeriksaan di bawah mikroskop dan fiksasi bahan. PADA
proses sentrifugasi tersedia dalam sampel
parasit melewati filter dan menumpuk di
kompartemen kerucut bawah tabung. Filter Jaring
dengan sel berukuran khusus
dalam tabung reaksi terletak vertikal, sebagai hasilnya
apa yang terjadi horizontal (lateral)
penyaringan sampel. Akibatnya, kasar
partikel makanan yang tidak tercerna, serat disimpan di
ruang pencampuran, dan parasit dan telurnya
melewati filter dengan bebas. Jadi
Dengan demikian, parasit terkonsentrasi di
lapisan permukaan sedimen halus, dan
dokter laboratorium hanya dapat dengan hati-hati memilih
sampel untuk mikroskop dengan
pipet otomatis dan terapkan ke
menggeser.

Metode sentrifugasi dalam sitologi

Metode diferensial
sentrifugasi digunakan untuk
fraksinasi sel, yaitu stratifikasinya
konten menjadi pecahan tergantung pada spesifiknya
berat berbagai organel dan inklusi seluler.
Untuk melakukan ini, sel-sel yang terbelah halus diputar dalam
peralatan khusus - ultracentrifuge. PADA
sebagai hasil dari sentrifugasi, komponen sel
mengendap dari larutan, mengendap
menurut kepadatannya. Lebih padat
struktur diendapkan pada kecepatan yang lebih rendah
sentrifugasi, dan kurang padat - pada tinggi
kecepatan. Lapisan yang dihasilkan dipisahkan dan dipelajari
terpisah.

10. Sentrifugasi dalam fisiologi botani dan tumbuhan

Sentrifugasi memungkinkan untuk memperoleh berbagai
fraksi partikel subseluler dan jelajahi
sifat dan fungsi masing-masing fraksi dalam
terpisah. Misalnya, dari daun bayam Anda bisa
pisahkan kloroplas, cuci dengan
re-sentrifugasi yang sesuai
media dari fragmen sel dan memeriksanya
perilaku dalam berbagai eksperimen
kondisi atau menentukan komposisi kimianya.
Selanjutnya dimungkinkan, menerapkan berbagai modifikasi
teknik, hancurkan plastida ini dan isolasi
melalui
sentrifugasi diferensial (berulang kali
deposisi partikel pada nilai yang berbeda
percepatan) elemen penyusunnya. Jadi
dengan itu mungkin untuk menunjukkan bahwa plastida mengandung
struktur yang sangat teratur
struktur, - yang disebut biji-bijian; semua biji-bijian
berada di dalam kloroplas pembatas
membran (selaput kloroplas). Keuntungan
metode ini sangat berharga karena
mengungkapkan keberadaan
subunit fungsional yang membentuk
partikel subselular yang lebih besar; secara khusus,
menggunakan metode

11. Metode sentrifugasi dalam virologi

Metode sentrifugasi gradien kerapatan Brakke dapat menjadi
digunakan untuk seleksi dan akuisisi
sifat kuantitatif virus tumbuhan. Ternyata,
Metode ini penuh dengan banyak kemungkinan dan saat ini
banyak digunakan di bidang virologi dan molekuler
biologi. Saat melakukan penelitian dengan metode
tabung sentrifugasi sentrifugasi kepadatan
sebagian diisi dengan larutan, yang kerapatannya berkurang
arah dari bawah ke meniskus. Untuk membuat gradien
fraksinasi virus tanaman paling sering digunakan
sukrosa. Sebelum memulai sentrifugasi, partikel virus mungkin
didistribusikan ke seluruh volume larutan, atau diterapkan pada
atas gradien. Brakke mengusulkan tiga metode berbeda
sentrifugasi gradien densitas. Pada isopypical
(keseimbangan) proses sentrifugasi berlanjut sampai
sampai semua partikel dalam gradien mencapai tingkat di mana kerapatan
medium sama dengan kerapatannya sendiri. Dengan demikian,
fraksinasi partikel terjadi dalam hal ini sesuai dengan
perbedaan kepadatan mereka. Larutan sukrosa tidak memiliki
kepadatan yang cukup untuk pemisahan isopik dari banyak
virus. Dengan sentrifugasi zona berkecepatan tinggi, virus
pertama kali diterapkan pada gradien yang dibuat sebelumnya. Partikel
setiap jenis sedimen sekaligus melalui suatu gradien berupa zona,
atau strip, dengan kecepatan tergantung pada ukuran, bentuk dan
kepadatan. Sentrifugasi dihentikan ketika partikel
masih terus mengendap. Zona keseimbangan
sentrifugasi mirip dengan zona kecepatan
sentrifugasi, tetapi dalam hal ini sentrifugasi

12. Kesulitan dalam menggunakan metode sentrifugasi

Penerapan metode sentrifugasi diferensial
penuh dengan banyak kesulitan metodologis. Pertama, pada
pelepasan partikel dapat merusak strukturnya. Jadi
perlu untuk mengembangkan metode khusus untuk penghancuran sel,
yang tidak akan menyebabkan kerusakan pada struktur subselular
pecahan. Kedua, karena partikel subselular memiliki
membran, dalam proses pelepasannya,
berbagai efek osmotik. Oleh karena itu, untuk itu
sehingga ultrastruktur objek yang diteliti tidak hancur
bahkan ketika mereka terisolasi, perlu untuk memilih komposisi dengan hati-hati
lingkungan di mana penghancuran sel dan pengendapan
partikel. Dan akhirnya, pencucian partikel subselular
(menangguhkannya kembali dalam medium dan kemudian kembali
sentrifugasi) dapat menyebabkan hilangnya beberapa
zat yang terkandung di dalamnya, yang, di bawah aksi kekuatan difusi
masuk ke solusi.
Dalam hal ini, terkadang sulit untuk memahami yang mana dari molekul kecil
memang elemen dari struktur yang diteliti, dan yang
hanya teradsorpsi pada permukaannya selama proses isolasi.
Situasi ini membuat sulit untuk menentukan beberapa
sifat fungsional dari objek yang dipilih.

Metode sentrifugasi didasarkan pada perilaku partikel yang berbeda di bidang sentrifugal yang dibuat oleh sentrifugal. Sampel di kapal centrifuge ditempatkan di rotor yang digerakkan oleh penggerak centrifuge. Untuk memisahkan campuran partikel, satu set kondisi harus dipilih, seperti kecepatan rotasi, waktu sentrifugasi, dan radius rotor. Untuk partikel berbentuk bola, laju pengendapan (sedimentasi) tidak hanya bergantung pada percepatan, tetapi juga pada jari-jari dan kerapatan partikel, serta pada viskositas medium tempat sampel diendapkan.

Sentrifugasi dapat dibagi menjadi dua jenis: preparatif dan analitis. Sentrifugasi preparatif digunakan bila perlu untuk mengisolasi sebagian sampel untuk analisis lebih lanjut. Metode ini digunakan untuk mengisolasi sel dari suspensi, makromolekul biologis, dll.

Sentrifugasi analitik digunakan untuk mempelajari perilaku makromolekul biologis dalam bidang sentrifugal. Metode ini memungkinkan untuk memperoleh data tentang massa, bentuk, dan ukuran molekul yang ada dalam volume sampel yang relatif kecil. Sentrifugasi preparatif adalah teknik yang paling umum digunakan dalam praktik laboratorium sehari-hari.

Sentrifugal laboratorium preparatif, pada gilirannya, dibagi menjadi beberapa kelompok sesuai dengan tujuannya: ultrasentrifugal preparatif, sentrifugal serba guna, dan sentrifugal berkecepatan tinggi. Sentrifugal serba guna memiliki aplikasi praktis terbesar di laboratorium medis, memiliki kecepatan maksimum hingga 6 ribu rpm. Fitur utama dari perangkat jenis ini adalah kapasitasnya yang relatif besar - hingga 6 liter, yang memungkinkan penggunaan tidak hanya tabung sentrifugal hingga 100 ml, tetapi juga wadah hingga 1,25 liter untuk sentrifugasi. Di semua sentrifugal serba guna, rotor dipasang secara kaku pada poros penggerak, sehingga wadah yang disentrifugasi harus seimbang dengan cukup akurat. Untuk menghindari kerusakan, jumlah tabung reaksi yang ganjil tidak boleh dimasukkan ke dalam rotor; dalam kasus pemuatan yang tidak lengkap, wadah harus ditempatkan saling berhadapan.

Sentrifugal berkecepatan tinggi memiliki kecepatan maksimum 25 ribu rpm dan akselerasi hingga 89 ribu g. Ruang yang berisi rotor dan sampel yang disentrifugasi dilengkapi dengan sistem pendingin untuk mencegah panas yang dihasilkan dari gesekan saat rotor berputar dengan kecepatan tinggi. Biasanya, sentrifugal ini dapat menangani volume hingga 1,5 liter dan dilengkapi dengan rotor mangkuk miring atau yang dapat diganti.

Ultrasentrifugal preparatif berakselerasi hingga 75.000 rpm dan memiliki akselerasi sentrifugal maksimum 510 ribu g. Mereka dilengkapi dengan unit pendingin dan vakum untuk mencegah panas berlebih pada rotor dari gesekan udara. Rotor untuk sentrifugal ini terbuat dari titanium atau paduan aluminium berkekuatan tinggi. Poros ultrasentrifugal, berbeda dengan yang berkecepatan tinggi dan preparatif, dibuat fleksibel untuk mengurangi getaran saat rotor tidak seimbang. Kapasitas dalam rotor harus diseimbangkan dengan hati-hati hingga sepersepuluh gram terdekat.

Selain penyaringan, pemisahan campuran zat cair dan zat padat juga dimungkinkan dengan sentrifugasi, yaitu pemisahan zat dalam alat yang disebut sentrifugal.

Penggunaan centrifuge didasarkan pada penggunaan gaya sentrifugal. Selama rotasi cepat (sentrifugasi), partikel padat tersuspensi dalam cairan (dengan kepadatan lebih besar dari kepadatan cairan) dibuang dari pusat di bawah aksi gaya sentrifugal yang berkembang selama rotasi dan dengan demikian dipisahkan dari cairan.

Beras. 407. Peralatan Thyssen untuk pekerjaan mikroanalisis

Beras. 408. Centrifuge manual

Sentrifugal adalah: terbuka dan tertutup, dengan penggerak manual dan mekanis. Bagian utama dari sentrifus manual terbuka (Gbr. 408) adalah sumbu putar yang diatur secara vertikal, tegak lurus yang di ujung atasnya dipasang batang dengan dua (atau empat) selongsong logam yang diperkuat secara bergerak. Selongsong ini dimasukkan ke dalam tabung khusus yang dipersempit ke bawah (Gbr. 409) dengan cairan dari mana partikel tersuspensi harus dihilangkan,

Sepotong kapas ditempatkan di bagian bawah lengan, “untuk menghindari kontak langsung antara kaca dan logam. Ketika tabung dimasukkan ke dalam selongsong, centrifuge digerakkan dan setelah beberapa waktu (tergantung pada viskositas cairan, ukuran partikel tersuspensi dan perbedaan kepadatan), padatan tersuspensi dipisahkan dari cairan, setelah dimana centrifuge dihentikan. Di bagian bawah tabung reaksi, endapan padat padatan dikumpulkan, di atasnya adalah cairan bening.

W sentrifugal tertutup(Gbr. 410), tergantung pada ukurannya, berisi jumlah selongsong yang berbeda, dari 2 hingga 12 atau lebih, terletak secara simetris pada jarak yang sama satu sama lain dan dari sumbu centrifuge.

Sentrifugal tertutup mekanis(Gbr. 410, b) lebih nyaman daripada manual (Gbr. 410, a). Mereka biasanya memberikan 2000-3000 rpm, memungkinkan Anda untuk mencapai pemisahan cair dan padat yang lebih sempurna.

Tabung centrifuge harus memiliki massa yang sama setelah diisi dengan cairan. Jika sentrifus harus sering digunakan, direkomendasikan untuk memiliki timbangan khusus yang disesuaikan untuk penimbangan (atau lebih tepatnya, taring) tabung reaksi. Dalam timbangan ini, cangkir digantung dari balok menggunakan batang yang dipasang di tengah cangkir. Batang ini memiliki cincin di mana tabung reaksi dimasukkan.

Setelah memperkuat tabung reaksi, pertama-tama tuangkan cairan yang akan disentrifugasi ke dalam satu tabung reaksi (menggunakan, misalnya, pipet), dan kemudian ke dalam tabung kedua, mencoba menyeimbangkan cangkir.

Jangan pernah memasukkan terlalu banyak cairan ke dalam tabung reaksi; tabung reaksi diisi sedemikian rupa sehingga jarak dari tepi ke permukaan cairan tidak kurang dari 10 mm.

Bila Anda perlu menyeimbangkan banyak tabung reaksi, disarankan untuk menggunakan teknik berikut. Setelah pasangan tabung reaksi yang pertama diseimbangkan, salah satunya dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam soket sentrifus, dan yang lainnya dibiarkan di timbangan; tabung reaksi terakhir ini akan berfungsi sebagai standar untuk yang lainnya, masukkan tabung reaksi lain ke dalam ruang yang dikosongkan pada timbangan, seimbangkan dengan standar dan lepaskan. Juga disarankan untuk mengisi tabung reaksi terlebih dahulu (mengambil jumlah cairan sedikit lebih sedikit dari yang diperlukan) dan menambahkan jumlah cairan yang diperlukan selama penyeimbangan. Pendekatan ini mempercepat pekerjaan.

Beras. 409. Tabung reaksi untuk sentrifugal.

Tabung reaksi seimbang dimasukkan ke dalam soket centrifuge.

Centrifuge tidak boleh segera dimulai dengan kecepatan penuh, tetapi secara bertahap. Ini berlaku untuk sentrifugal manual dan mekanis.

Beras. 410. Sentrifugal tertutup: a - dengan penggerak manual; b - dengan motor listrik.

Sentrifugal mekanis untuk kontrol kecepatan memiliki perangkat yang sesuai. Jadi, sentrifugal listrik dilengkapi dengan rheostat untuk beralih secara bertahap ke jumlah putaran penuh. Dalam sentrifugal yang digerakkan oleh turbin air, peningkatan kecepatan secara bertahap dicapai dengan mengatur pancaran air. Semakin hati-hati penyertaan dilakukan, semakin andal mesin sentrifugal bekerja.

Centrifuge harus dipantau setiap saat; kontaminasi itu, terutama bagian yang bergerak, tidak dapat diterima. Selongsong logam harus berputar dengan mudah dan bebas. Roda gigi yang menggerakkan centrifuge harus mudah dipindahkan; mereka tidak boleh dilumasi dengan gemuk yang dapat mengental. Poros centrifuge juga harus dalam keadaan rapi dan selalu bersih.

Penanganan sentrifugal yang ceroboh, terutama sentrifugal manual, dapat menekuk poros dan dengan demikian menonaktifkan sentrifugal.

Setelah mematikan centrifuge, self-starter dibiarkan berhenti dan baru setelah itu tabung reaksi dilepas.

Baru-baru ini, apa yang disebut supersentrifugal, yang menghasilkan hingga 40.000 rpm, menjadi lebih luas (Gbr. 411).

Beras. 411 super sentrifugal

Sentrifugal semacam itu sangat cocok untuk sentrifugasi semua jenis larutan kental, seperti pernis, dispersi halus, dan emulsi.

Cairan yang akan disupersentrifugasi memasuki nosel 1 yang terletak di bagian bawah peralatan. Kemudian cairan dituangkan ke dalam silinder kerja 2, berputar dengan kecepatan hingga 40.000 rpm, di mana partikel yang lebih berat tersuspensi dalam cairan dipisahkan. Cairan secara bertahap naik di sepanjang silinder 2 hingga pemisah 5, dan jika emulsi dihancurkan, maka cairan yang lebih ringan mengalir keluar melalui saluran 8, dan yang lebih berat - melalui saluran 4. Saat memisahkan partikel padat dengan kepadatan lebih besar dari satu, cairan mengalir keluar melalui saluran pembuangan 3. Di dinding bagian dalam silinder kerja diendapkan sedimen padat yang dapat dipisahkan. Supersentrifugasi. Dari waktu ke waktu, supercentrifuge dihentikan, silinder kerja 2 dilepas, dibersihkan dari endapan, dan dipasang kembali, pekerjaan dilanjutkan. Seluruh proses pembersihan silinder kerja, dari saat berhenti hingga saat supercentrifuge baru dimulai, tidak lebih dari 15 menit. Jika Anda harus memurnikan cairan dalam jumlah yang relatif besar, maka gunakan tiga8 supersentrifugal: satu berfungsi, yang lain sedang dimurnikan, yang ketiga cadangan,

Sentrifugasi adalah pemisahan campuran mekanis menjadi bagian-bagian komponennya dengan aksi gaya sentrifugal. Perangkat yang digunakan untuk tujuan ini disebut sentrifugal. Bagian utama dari centrifuge adalah rotor dengan sarang untuk tabung centrifuge yang terpasang di dalamnya. Rotor berputar dengan kecepatan tinggi, sebagai akibatnya tercipta gaya sentrifugal yang signifikan, di bawah aksi yang memisahkan campuran mekanis, misalnya, partikel yang tersuspensi dalam cairan diendapkan.

Sentrifugal: 1 - manual: 2 - dengan penggerak listrik.

Di laboratorium klinis dan sanitasi, sentrifugasi digunakan untuk memisahkan dari plasma darah, dari partikel padat dari bagian cair urin, dll. Untuk tujuan ini, baik sentrifugal manual (Gbr., 1) atau sentrifugal listrik digunakan, kecepatan rotasi yang dapat disesuaikan (Gbr., 2).

Ultrasentrifugal, yang kecepatan rotornya melebihi 40.000 rpm, biasanya digunakan dalam praktik eksperimental untuk memisahkan organel sel, memisahkan partikel koloid, makromolekul, dll.

Sentrifugasi adalah pemisahan sistem kasar, yang terdiri dari komponen cair dan padat dengan kepadatan berbeda, menggunakan alat khusus yang disebut sentrifugal. Prinsip pengoperasian centrifuge didasarkan pada penciptaan gaya sentrifugal yang besar, di bawah pengaruh yang laju pemisahan komponen campuran yang ditempatkan di centrifuge meningkat berkali-kali dibandingkan dengan laju pemisahannya di bawah aksi. gravitasi.

Metode sentrifugasi banyak digunakan dalam biologi, kedokteran dan teknologi, sering menggantikan proses penyaringan, pengendapan dan pengepresan.

Centrifuge memiliki rumahan, mekanisme penggerak, rotor, ruang kerja (penutup) dan panel kontrol. Beberapa sentrifugal dilengkapi dengan jam listrik yang menyediakan shutdown otomatis dan pengereman dalam kisaran 5 hingga 60 menit. Sentrifugal khusus memiliki unit pendingin dan vakum dengan pelacakan dan perangkat kontrol otomatis. Bagian utama dari setiap centrifuge adalah rotor (dalam sentrifugal laboratorium biasanya terletak pada poros motor listrik yang dipasang secara vertikal atau diputar oleh berbagai roda gigi dari poros motor, kadang-kadang bahkan secara manual). Rotor sentrifus adalah piringan (silang) dengan soket berengsel untuk selongsong logam, di mana tabung reaksi ditempatkan, yang mengambil posisi horizontal selama rotasi.

Kadang-kadang rotor dibuat dalam bentuk kerucut terpotong logam padat dengan sel-sel untuk tabung reaksi (rotor sudut); tabung reaksi di dalamnya terletak pada sudut konstan terhadap sumbu rotasi (biasanya 40°). Dengan posisi tabung reaksi yang miring, komponen-komponen campuran lebih cepat terpisah. Pemisahan campuran dilakukan dalam tabung reaksi dengan berbagai bentuk dan volume (Gbr. 1). Saat bekerja pada kecepatan tinggi, tabung reaksi yang terbuat dari polietilen digunakan, karena kaca pecah. Tabung reaksi dengan bahan yang diproses terletak satu sama lain di dalam rotor harus seimbang. Ini memberikan beban yang seragam pada poros rotor dan memastikan rotasi poros sentrifugal yang seragam. Untuk menyeimbangkan tabung reaksi, digunakan timbangan khusus (Gbr. 2).

Beras. 1. Tabung untuk sentrifugasi.

Beras. 2. Centrifuge timbangan.

Mesin sentrifugal yang digunakan dalam industri berbeda dari sentrifugal laboratorium dalam desain rotor yang lebih kompleks, yang memungkinkan untuk melakukan sentrifugasi sejumlah besar material pada saat yang sama atau untuk melakukan proses pemisahan terus menerus.

Centrifuge dengan kecepatan rotor rendah digunakan dalam pengobatan untuk memisahkan sedimen urin, serum darah dari gumpalan, sedimentasi eritrosit, dalam studi serologis, dll.

Microcentrifuge (Gbr. 4) dioperasikan secara manual; dilengkapi dengan dua nozel yang dapat diganti, salah satunya memiliki sarang untuk tabung mikro dan digunakan untuk menentukan kompatibilitas darah; yang lain - dengan soket untuk memasukkan mikropipet bertingkat (hematokrit) - dimaksudkan untuk menentukan persentase sel darah.

Beras. 3. Sentrifugasi manual.

Beras. 4. Mikrosentrifugasi.

Centrifuge manual (Gbr. 3) memiliki empat selongsong logam atau plastik untuk tabung 15 ml.

Centrifuge klinis laboratorium TsLK-1 (Gbr. 5, 7) memiliki tiga kecepatan putaran (1000, 1500, 3000 rpm). Cross-rotor disesuaikan untuk 12 tabung centrifuge konvensional. Volume terbesar dari cairan yang disentrifugasi adalah 150 ml.

Sentrifugal dengan kecepatan rotor tinggi dalam banyak kasus dilengkapi dengan rotor yang dapat dipertukarkan yang dirancang untuk volume cairan yang berbeda dan digunakan untuk memisahkan suspensi halus.

Centrifuge meja laboratorium TsLN-2 (Gbr. 5, 2) memiliki rotor miring untuk enam tabung reaksi pendek dengan kapasitas total 72 ml. Kecepatan putaran maksimum -9000 rpm.

Beras. 5. Berbagai sentrifugal laboratorium: 1 - klinis; 2 - meja; 3 - sudut kecil; 4 - stasioner; 5 - kulkas.

Centrifuge sudut kecil TsUM-1 (Gbr. 5, 3) memiliki tiga rotor sudut yang dapat dipertukarkan dengan jumlah tabung reaksi dan hematokrit yang berbeda: sebuah rotor untuk 6 tabung reaksi dengan kapasitas total 150 ml, sebuah rotor untuk 10 tabung reaksi dengan total kapasitas 120 ml, rotor untuk 24 tabung reaksi dengan kapasitas total 120 ml, hematokrit untuk dua kapiler. Kecepatan putaran maksimum adalah 10.000 rpm.

Centrifuge dilengkapi dengan mekanisme jam listrik.

Centrifuge stasioner laboratorium TsLS-2 (Gbr. 5, 4) memiliki dua rotor yang dapat diganti. Cross-rotor dilengkapi dengan empat selongsong baja dengan kapasitas 500 ml dan empat tabung reaksi kaca untuk mereka dengan kapasitas 250 ml. Rotor sudut dilengkapi dengan 8 tabung reaksi polietilen dan baja dengan kapasitas 50-75 ml. Rotasi maksimum rotor hingga 6000 rpm. Centrifuge dilengkapi dengan mekanisme jam listrik.

Di antara sentrifugal khusus adalah laboratorium berpendingin centrifuge CLR-1 (Gbr. 5.5), dimaksudkan untuk sentrifugasi pada suhu rendah (-5 ° ke atas) dari berbagai zat yang berubah bahkan pada suhu kamar - sebagian besar suspensi protein. Centrifuge memiliki tiga rotor yang dapat diganti yang menyediakan mode sentrifugasi yang berbeda. Dua rotor identik dengan karakteristik teknis rotor centrifuge tipe TsLS-2, rotor ketiga, yang dipasang pada poros tambahan, berkembang 18.000-18.500 rpm. Volume maksimum obat studi adalah 48 ml. Centrifuge dilengkapi dengan mekanisme jam listrik. Pendinginan ruang kerja dilakukan dengan menggunakan mesin refrigerasi.

Lihat juga Ultrasentrifugasi.

2.5.1 Sifat gradien

Untuk membuat gradien densitas larutan, larutan sukrosa paling sering digunakan, terkadang dengan pH tetap. Dalam beberapa kasus, pemisahan yang baik diperoleh dengan menggunakan D 2 0 sebagai pengganti air biasa. 2.1 menunjukkan sifat-sifat beberapa larutan sukrosa.

Pilihan gradien ditentukan oleh tugas khusus fraksinasi. Misalnya, ficol, yang diproduksi oleh Pharmacia Fine Chemicals, dapat menggantikan sukrosa jika diperlukan untuk membuat gradien dengan kepadatan tinggi dan tekanan osmotik rendah. Keuntungan lain dari ficol adalah tidak melewati membran sel. Garam logam berat, seperti rubidium dan cesium, digunakan untuk membuat gradien dengan kepadatan lebih tinggi, namun, karena efek korosif CsCl, gradien tersebut hanya digunakan pada rotor yang terbuat dari logam tahan, seperti titanium.

2.5.2 Langkah Teknik Gradien Kepadatan

Untuk membuat gradien densitas, beberapa larutan dengan penurunan densitas berturut-turut dimasukkan dengan hati-hati ke dalam tabung sentrifus menggunakan pipet. Kemudian pada lapisan paling atas yang memiliki densitas paling rendah, sampel dilapis membentuk zona sempit, setelah itu tabung disentrifugasi. Gradien linier halus dapat diperoleh dengan menghaluskan gradien bertahap selama larutan dibiarkan lama. Prosesnya dapat dipercepat dengan mengaduk isi tabung secara perlahan dengan kawat atau dengan menggoyangkan tabung secara perlahan.

2.5.3 Teknik untuk membuat gradien kepadatan yang halus

Dalam kebanyakan kasus, perangkat khusus digunakan untuk membuat gradien kepadatan yang halus. Ini terdiri dari dua bejana silinder dengan diameter identik yang ditentukan secara ketat, berkomunikasi satu sama lain di bagian bawah dengan tabung kaca dengan katup kontrol, yang memungkinkan Anda untuk menyesuaikan proporsi di mana isi kedua bejana dicampur. Salah satunya dilengkapi dengan pengaduk dan memiliki saluran keluar dimana larutan mengalir ke dalam tabung centrifuge. Solusi yang lebih padat ditempatkan dalam mixer; silinder kedua diisi dengan larutan dengan kepadatan lebih rendah. Ketinggian kolom larutan di kedua silinder diatur sedemikian rupa sehingga tekanan hidrostatik di dalamnya sama. Larutan yang lebih padat secara bertahap dikeluarkan dari mixer ke dalam tabung centrifuge dan secara bersamaan diganti dengan volume yang sama dari larutan dengan kepadatan lebih rendah yang memasuki mixer dari silinder kedua melalui katup kontrol. Homogenitas larutan dalam mixer dipastikan dengan pencampuran konstan larutan dengan pengaduk. Saat larutan dikeringkan ke dalam tabung sentrifus, densitasnya menurun dan gradien densitas linier dibuat di dalam tabung. Gradien nonlinier dapat dibuat menggunakan sistem yang terdiri dari dua silinder dengan diameter yang tidak sama.

Untuk membentuk gradien densitas dengan kecuraman yang berbeda, sistem dua jarum suntik yang dikontrol secara mekanis digunakan, yang diisi dengan larutan dengan densitas yang tidak sama. Berbagai gradien dapat dibuat dengan mengubah kecepatan relatif piston.

2.5.4 Ekstraksi gradien dari tabung centrifuge

Setelah sentrifugasi selesai dan partikel dipisahkan, zona yang terbentuk harus dihilangkan. Ini dilakukan dengan beberapa cara, paling sering dengan metode perpindahan. Sebuah tabung centrifuge ditusuk di dasar dan media yang sangat padat, misalnya, larutan sukrosa 60-70%, perlahan dimasukkan ke bagian bawahnya. Larutan di atas dipindahkan dan pecahan diambil menggunakan spuit, pipet atau alat khusus yang dihubungkan melalui tabung ke pengumpul pecahan. Jika tabung terbuat dari seluloid atau nitroselulosa, fraksi diekstraksi dengan memotong tabung dengan pisau khusus. Untuk melakukan ini, tabung sentrifus yang dipasang pada dudukan dipotong langsung di bawah zona yang diinginkan dan fraksi disedot dengan jarum suntik atau pipet. Dengan desain alat pemotong yang sesuai, hilangnya solusi akan menjadi minimal. Pengumpulan pecahan juga dilakukan dengan cara menusuk pangkal tabung reaksi dengan jarum tipis berlubang. Tetesan yang mengalir dari tabung melalui jarum dikumpulkan dalam pengumpul fraksi untuk analisis lebih lanjut.

2.5.5 Sentrifugal preparatif dan aplikasinya

Sentrifugal preparatif dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok utama: sentrifugal serba guna, sentrifugal berkecepatan tinggi, dan ultra sentrifugal preparatif. Sentrifugal serba guna memberikan kecepatan maksimum 6000 rpm -1 dan OCU hingga 6000 g . Mereka berbeda satu sama lain hanya dalam kapasitas dan memiliki sejumlah rotor yang dapat dipertukarkan: sudut dan dengan kacamata gantung. Salah satu fitur dari sentrifugal jenis ini adalah kapasitasnya yang besar - dari 4 hingga 6 dm 3, yang memungkinkannya untuk dimuat tidak hanya dengan tabung sentrifugal 10,50 dan 100 cm 3, tetapi juga dengan bejana dengan kapasitas hingga 1,25 dm3 . Pada semua sentrifugal jenis ini, rotor dipasang secara kaku pada poros penggerak, dan tabung sentrifugal, bersama dengan isinya, harus diseimbangkan dengan hati-hati dan berbeda beratnya tidak lebih dari 0,25 g. harus ditempatkan secara simetris, satu terhadap lainnya, sehingga memastikan distribusi tabung reaksi yang seragam relatif terhadap sumbu rotasi rotor.

Sentrifugal berkecepatan tinggi memberikan kecepatan tertinggi 25.000 rpm -1 dan OCU hingga 89.000g. Ruang rotor dilengkapi dengan sistem pendingin yang mencegah pemanasan yang terjadi akibat gesekan selama putaran rotor. Sebagai aturan, sentrifugal berkecepatan tinggi memiliki kapasitas 1,5 dm 3 dan dilengkapi dengan rotor yang dapat diganti, baik miring maupun dengan kaca gantung.

Ultrasentrifugal preparatif memberikan kecepatan tertinggi hingga 75.000 rpm -1 dan percepatan sentrifugal maksimum 510.000 g . Mereka dilengkapi dengan lemari es dan unit vakum untuk mencegah panas berlebih pada rotor karena gesekannya dengan udara. Rotor sentrifugal semacam itu terbuat dari paduan aluminium atau titanium berkekuatan tinggi. Rotor paduan aluminium terutama digunakan, namun, dalam kasus di mana kecepatan sangat tinggi diperlukan, rotor titanium digunakan. Untuk mengurangi getaran akibat ketidakseimbangan rotor karena pengisian tabung centrifuge yang tidak merata, ultracentrifuge memiliki poros yang fleksibel. Tabung sentrifugal dan isinya harus diseimbangkan dengan hati-hati hingga 0,1 g terdekat Persyaratan serupa harus diperhatikan saat memuat rotor sentrifugal untuk keperluan umum.

2.6 Desain rotor

2.6.1 Rotor sudut dan rotor dengan ember gantung

Rotor sentrifugal preparatif biasanya terdiri dari dua jenis - ember miring dan menggantung. Disebut sudut karena tabung sentrifus yang ditempatkan di dalamnya selalu berada pada sudut tertentu terhadap sumbu rotasi. Pada rotor dengan kaca gantung, tabung reaksi dipasang secara vertikal, dan ketika diputar di bawah aksi gaya sentrifugal yang dihasilkan, tabung tersebut bergerak ke posisi horizontal; sudut kemiringan terhadap sumbu rotasi adalah 90°.

Dalam rotor bersudut, jarak yang ditempuh partikel ke dinding tabung reaksi yang sesuai sangat kecil, dan oleh karena itu sedimentasi terjadi relatif cepat. Setelah bertabrakan dengan dinding tabung reaksi, partikel meluncur ke bawah dan membentuk sedimen di bagian bawah. Selama sentrifugasi, aliran konveksi muncul, yang sangat mempersulit pemisahan partikel dengan sifat sedimentasi yang serupa. Namun demikian, rotor dengan desain serupa berhasil digunakan untuk memisahkan partikel yang laju sedimentasinya cukup bervariasi.

Pada rotor dengan cangkir gantung, fenomena konveksi juga diamati, tetapi tidak begitu menonjol. Konveksi adalah hasil dari fakta bahwa, di bawah aksi percepatan sentrifugal, partikel mengendap dalam arah yang tidak sepenuhnya tegak lurus terhadap sumbu rotasi, dan oleh karena itu, seperti pada sudut rotor, partikel tersebut menabrak dinding tabung reaksi dan meluncur ke bagian bawah.

Efek konveksi dan pusaran dapat dihindari sampai batas tertentu dengan menggunakan tabung berbentuk sektoral pada rotor cangkir gantung dan dengan menyesuaikan kecepatan rotor; tercantum di atas, metode sentrifugasi dalam gradien kepadatan juga menghilangkan kerugiannya.

2.6.2 Rotor terus menerus

Rotor kontinu dirancang untuk fraksinasi kecepatan tinggi dari sejumlah kecil bahan padat dari suspensi volume besar, misalnya, untuk isolasi sel dari media nutrisi. Selama sentrifugasi, suspensi partikel ditambahkan ke rotor secara terus menerus; throughput rotor tergantung pada sifat persiapan yang diendapkan dan bervariasi dari 100 cm 3 hingga 1 dm 3 per 1 menit. Keunikan rotor adalah bahwa itu adalah ruang berinsulasi dengan desain khusus; isinya tidak berkomunikasi dengan lingkungan eksternal, dan karena itu tidak tercemar atau disemprot.

2.6.3 Rotor zonal atau Anderson

Rotor zonal terbuat dari paduan aluminium atau titanium, yang mampu menahan akselerasi sentrifugal yang sangat signifikan. Biasanya mereka memiliki rongga silinder, ditutup dengan penutup yang bisa dilepas. Di dalam rongga, pada sumbu rotasi, ada tabung aksial, di mana nosel dengan bilah diletakkan, membagi rongga rotor menjadi empat sektor. Bilah atau baffle memiliki saluran radial yang melaluinya gradien disuntikkan dari tabung aksial ke pinggiran rotor. Berkat desain bilah ini, konveksi berkurang seminimal mungkin.

Pengisian rotor dilakukan selama putarannya dengan kecepatan sekitar 3000 rpm -1 . Gradien yang telah dibuat sebelumnya dipompa ke dalam rotor, mulai dari lapisan dengan kepadatan terendah, yang didistribusikan secara merata di sepanjang pinggiran rotor dan ditahan di dinding luarnya tegak lurus terhadap sumbu rotasi karena gaya sentrifugal. . Dengan penambahan berikutnya dari lapisan gradien kepadatan yang lebih tinggi, pergeseran terus menerus menuju pusat lapisan kurang padat terjadi. Setelah seluruh gradien dipompa ke dalam rotor, ia diisi hingga volume penuh dengan larutan yang disebut "bantalan", yang densitasnya sama atau sedikit melebihi densitas tertinggi dari gradien yang dibentuk sebelumnya.

Kemudian, melalui tabung aksial, sampel uji berlapis , yang dipindahkan dari tabung ke dalam volume rotor menggunakan larutan dengan kepadatan lebih rendah, sedangkan volume "bantalan" yang sama dikeluarkan dari pinggiran. Setelah semua prosedur ini, kecepatan rotasi rotor dibawa ke kecepatan kerja dan fraksinasi zonal-kecepatan atau zonal-isopiknik dilakukan selama periode waktu yang diperlukan. . Ekstraksi fraksi dilakukan pada kecepatan rotor 3000 rpm -1 . Isi rotor dipindahkan dengan menambahkan "bantalan" dari pinggiran, pertama-tama, lapisan yang kurang padat dipindahkan . Karena desain khusus saluran aksial rotor Anderson, tidak ada pencampuran zona selama perpindahannya. Gradien keluar dilewatkan melalui alat perekam, misalnya sel spektrofotometer, yang kandungan proteinnya dapat ditentukan dengan penyerapan pada 280 nm, atau melalui detektor radioaktivitas khusus, setelah itu fraksi dikumpulkan.

Kapasitas rotor zonal yang digunakan pada kecepatan sedang bervariasi dari 650 hingga 1600 cm 3 , yang memungkinkan untuk memperoleh bahan dalam jumlah yang cukup besar. Rotor zonal digunakan untuk menghilangkan kontaminan protein dari berbagai persiapan dan untuk mengisolasi dan memurnikan mitokondria, lisosom, polisom, dan protein.

2.6.4 Analisis fraksi subselular

Sifat preparasi partikel subselular yang diperoleh dengan fraksinasi dapat dikaitkan dengan sifat partikel itu sendiri hanya jika preparasi tidak mengandung pengotor. Oleh karena itu, selalu perlu untuk mengevaluasi kemurnian preparat yang diperoleh. Efisiensi homogenisasi dan adanya pengotor dalam sediaan dapat ditentukan dengan pemeriksaan mikroskopis. Namun, tidak adanya pengotor yang terlihat belum merupakan bukti kemurnian obat yang dapat diandalkan. Untuk mengukur kemurnian sediaan yang diperoleh, ia menjalani analisis kimia, yang memungkinkan seseorang untuk menentukan kandungan protein atau DNA di dalamnya, untuk menentukan aktivitas enzimatiknya, jika mungkin, dan sifat imunologisnya.

Analisis distribusi enzim dalam jaringan yang difraksinasi didasarkan pada dua prinsip umum. Yang pertama adalah bahwa semua partikel dari populasi subselular tertentu mengandung set enzim yang sama. Yang kedua mengasumsikan bahwa setiap enzim terlokalisasi di beberapa tempat tertentu di dalam sel. Jika posisi ini benar, maka enzim dapat bertindak sebagai penanda untuk organel yang sesuai: misalnya, sitokrom oksidase dan monoamine oksidase akan berfungsi sebagai enzim penanda mitokondria, hidrolase asam sebagai penanda lisosom, katalase sebagai penanda peroksisom, dan glukosa-6- fosfatase - penanda membran mikrosomal. Namun, ternyata beberapa enzim, seperti malat dehidrogenase, R-glucuronidase, NADP "H-cytochrome-c-reductase, terlokalisasi di lebih dari satu fraksi. Oleh karena itu, pilihan penanda enzim fraksi subselular dalam setiap kasus spesifik harus didekati dengan sangat hati-hati. Selain itu, tidak adanya enzim penanda tidak berarti tidak adanya Organel yang sesuai Kemungkinan enzim hilang oleh organel selama fraksinasi, atau dihambat atau dinonaktifkan, jadi setidaknya dua enzim penanda biasanya ditentukan untuk setiap fraksi.

Pecahan	Volume, cm"	Pemuliaan umum	Eksnulasi, 660 nm	Satuan aktivitas enzim	Hasil aktivitas dalam pecahan,%

2.7 Fraksinasi dengan sentrifugasi diferensial

2.7.1 Presentasi hasil

Hasil yang diperoleh dari fraksinasi jaringan paling mudah disajikan dalam bentuk grafik. Jadi, ketika mempelajari distribusi enzim dalam jaringan, data paling baik disajikan dalam bentuk histogram, yang memungkinkan untuk mengevaluasi hasil eksperimen secara visual.

Aktivitas enzimatik kandungan protein dalam sampel ditentukan baik dalam homogenat asli maupun di setiap fraksi subselular yang diisolasi secara terpisah. Aktivitas enzimatik total dan kandungan protein dalam fraksi tidak boleh berbeda secara signifikan dari nilai yang sesuai dalam homogenat asli.

Kemudian, aktivitas enzimatik dan kandungan protein di setiap fraksi dihitung dalam % dari hasil total, yang menjadi dasar pembuatan histogram. Jumlah relatif protein dalam setiap fraksi secara berurutan diplot sepanjang sumbu absis dalam urutan isolasinya, dan aktivitas spesifik relatif dari setiap fraksi diplot sepanjang sumbu ordinat. Dengan demikian, aktivitas enzimatik masing-masing fraksi ditentukan dari luas kolom.

2.7.2 Ultrasentrifugasi analitis

Tidak seperti sentrifugasi preparatif, yang tujuannya adalah untuk memisahkan zat dan memurnikannya, ultrasentrifugasi analitik terutama digunakan untuk mempelajari sifat sedimentasi makromolekul biologis dan struktur lainnya. Oleh karena itu, dalam sentrifugasi analitik, rotor dan sistem perekaman dengan desain khusus digunakan: mereka memungkinkan Anda untuk terus memantau sedimentasi material. di bidang sentrifugal.

Ultrasentrifugal analitis dapat mencapai kecepatan hingga 70.000 rpm -1, sekaligus menghasilkan akselerasi sentrifugal hingga 500.000 g . Rotornya, sebagai suatu peraturan, memiliki bentuk ellipsoid dan dihubungkan dengan tali ke motor, yang memungkinkan untuk memvariasikan kecepatan putaran rotor. Rotor berputar di ruang vakum yang dilengkapi dengan perangkat pendingin dan memiliki dua sel, analitis dan penyeimbang, yang dipasang di centrifuge secara vertikal, sejajar dengan sumbu rotasi. Sel balancing berfungsi untuk menyeimbangkan sel analitik dan merupakan blok logam dengan sistem presisi. Ini juga memiliki dua lubang indeks yang terletak pada jarak yang ditentukan secara ketat dari sumbu rotasi, dengan bantuan yang menentukan jarak yang sesuai dalam sel analitik. Sel analitik, yang biasanya berkapasitas 1 cm 3 , memiliki bentuk sektoral. Ketika dipasang dengan benar di rotor, meskipun tegak, ia bekerja dengan prinsip yang sama seperti rotor dengan ember gantung, menciptakan kondisi sedimentasi yang hampir ideal. Di ujung sel analitik ada jendela dengan kaca kuarsa. Ultrasentrifugal analitik dilengkapi dengan sistem optik yang memungkinkan pemantauan sedimentasi partikel selama seluruh periode sentrifugasi. Pada interval waktu yang telah ditentukan, material sedimentasi dapat difoto. Ketika fraksinasi protein dan DNA, sedimentasi dipantau dengan penyerapan di ultraviolet, dan dalam kasus di mana solusi yang dipelajari memiliki indeks bias yang berbeda, menggunakan sistem schlieren atau sistem interferensi Rayleigh. Dua metode terakhir didasarkan pada fakta bahwa ketika cahaya melewati larutan transparan yang terdiri dari zona dengan kepadatan berbeda, cahaya dibiaskan pada batas zona. Selama sedimentasi, batas terbentuk antara zona dengan partikel berat dan ringan, yang bertindak sebagai lensa bias; dalam hal ini, sebuah puncak muncul pada pelat fotografi yang digunakan sebagai detektor. Selama sedimentasi, batas bergerak, dan, akibatnya, puncak, kecepatan yang dapat digunakan untuk menilai laju sedimentasi material. Sistem interferometrik lebih sensitif daripada sistem schlieren. Sel analitik adalah sektor tunggal, yang paling sering digunakan, dan dua sektor, yang digunakan untuk studi perbandingan pelarut dan zat terlarut.

Dalam biologi, ultrasentrifugasi analitik digunakan untuk menentukan berat molekul makromolekul, memeriksa kemurnian sampel yang diperoleh, dan mempelajari perubahan konformasi makromolekul.

2.8 Penerapan ultrasentrifugasi analitis

2.8.1 Penentuan berat molekul

Ada tiga metode utama untuk menentukan berat molekul menggunakan ultrasentrifugasi analitik: penentuan laju sedimentasi, metode kesetimbangan sedimentasi, dan metode pendekatan kesetimbangan sedimentasi.

Penentuan berat molekul dengan laju sedimentasi - ini adalah metode yang paling umum. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan tinggi, sehingga partikel-partikel, yang awalnya merata di seluruh volume, mulai bergerak secara berurutan sepanjang jari-jari dari pusat rotasi. Di antara area pelarut, yang sudah bebas dari partikel, dan bagian yang mengandung mereka, antarmuka yang jelas terbentuk. Batas ini bergerak selama sentrifugasi, yang memungkinkan untuk menentukan laju sedimentasi partikel menggunakan salah satu metode di atas, mencatat pergerakan ini pada pelat fotografi.

Laju sedimentasi ditentukan oleh hubungan berikut:

di mana X - jarak dari sumbu rotasi dalam cm,

t - waktu dalam s,

w adalah kecepatan sudut dalam rad-s -1 ,

s - koefisien sedimentasi "molekul.

Koefisien sedimentasi adalah kecepatan per satuan percepatan, diukur dalam Unit Seedberg ; 1 unit Swedberg sama dengan 10 _13 detik. Nilai numerik s tergantung pada berat molekul dan bentuk partikel dan merupakan karakteristik nilai dari molekul atau struktur supramolekul tertentu. Misalnya, koefisien sedimentasi lisozim adalah 2,15 S; katalase memiliki koefisien sedimentasi 11,35S, subunit ribosom bakteri dari 30 hingga 50S, dan subunit ribosom eukariotik dari 40 hingga 60S.

di mana M adalah berat molekul molekul, R adalah konstanta gas, T - suhu absolut, s - koefisien sedimentasi molekul, D adalah koefisien difusi molekul, v - volume spesifik parsial, yang dapat dianggap sebagai volume yang ditempati oleh satu gram zat terlarut, p - kerapatan pelarut.

Metode keseimbangan sedimentasi. Penentuan berat molekul dengan metode ini dilakukan pada kecepatan rotor yang relatif rendah, yaitu orde 7.000-8.000 rpm -1, sehingga molekul dengan berat molekul besar tidak mengendap di dasar. Ultrasentrifugasi dilakukan sampai partikel mencapai keseimbangan, yang ditetapkan di bawah aksi gaya sentrifugal, di satu sisi, dan gaya difusi, di sisi lain, yaitu, sampai partikel berhenti bergerak. Kemudian, menurut gradien konsentrasi yang dihasilkan, berat molekul zat dihitung "menurut rumus"

di mana R adalah konstanta gas, T - suhu mutlak, o - kecepatan sudut, p - kerapatan pelarut, v - volume spesifik parsial, dengan X dan dengan 2 adalah konsentrasi zat terlarut terhadap jarak G G dan r 2 dari sumbu rotasi.

Kerugian dari metode ini adalah membutuhkan waktu lama untuk mencapai keseimbangan sedimentasi - dari beberapa hari hingga beberapa minggu dengan pengoperasian sentrifus yang terus menerus.

Metode mendekati kesetimbangan sedimentasi dikembangkan untuk menghilangkan kelemahan dari metode sebelumnya, terkait dengan investasi besar waktu yang dibutuhkan untuk "menetapkan kesetimbangan. Dengan menggunakan metode ini, berat molekul dapat ditentukan ketika larutan yang disentrifugasi berada dalam keadaan mendekati kesetimbangan Pertama, makromolekul didistribusikan ke seluruh volume sel analitik secara merata, kemudian, saat sentrifugasi berlangsung, molekul mengendap, dan kerapatan larutan di daerah meniskus berangsur-angsur berkurang. Perubahan kerapatannya adalah dicatat dengan hati-hati, dan kemudian, dengan perhitungan kompleks yang melibatkan sejumlah besar variabel, berat molekul senyawa tertentu ditentukan oleh rumus:

di mana R adalah konstanta gas, T adalah suhu mutlak, v - volume spesifik parsial, p - kerapatan pelarut, dcldr - gradien konsentrasi makromolekul, g m dan g d - jarak ke meniskus dan bagian bawah tabung, masing-masing, c m dan s d - konsentrasi makromolekul masing-masing di meniskus dan di bagian bawah tabung, M m dan M R -nilai berat molekul, masing-masing ditentukan oleh distribusi konsentrasi zat di meniskus dan bagian bawah tabung reaksi.

2.8.2 Evaluasi kemurnian sediaan

Ultrasentrifugasi analitik banyak digunakan untuk menilai kemurnian DNA, virus, dan preparat protein. Kemurnian sediaan tidak diragukan lagi sangat penting dalam kasus di mana diperlukan untuk secara akurat menentukan berat molekul molekul. Dalam kebanyakan kasus, homogenitas preparasi dapat dinilai dari sifat batas sedimentasi, dengan menggunakan metode penentuan laju sedimentasi: preparasi homogen biasanya memberikan satu batas yang jelas. Kotoran yang ada dalam sediaan muncul sebagai puncak atau bahu tambahan; mereka juga menentukan asimetri puncak utama.

2.8.3 Studi perubahan konformasi makromolekul

Area lain penerapan ultrasentrifugasi analitik adalah studi tentang perubahan konformasi makromolekul. Molekul DNA, misalnya, mungkin beruntai tunggal atau ganda, linier atau melingkar. Di bawah aksi berbagai senyawa atau pada suhu tinggi, DNA mengalami sejumlah perubahan konformasi reversibel dan ireversibel, yang dapat ditentukan dengan mengubah laju sedimentasi sampel. Semakin kompak molekulnya, semakin rendah koefisien gesekannya dalam larutan dan sebaliknya: semakin kecil kekompakannya, semakin besar koefisien gesekannya dan, akibatnya, semakin lambat mengendap. Dengan demikian, perbedaan laju sedimentasi sampel sebelum dan sesudah berbagai dampaknya memungkinkan untuk mendeteksi perubahan konformasi yang terjadi pada makromolekul.

Dalam protein alosterik, seperti, misalnya, aspartat transkarbamoylase, perubahan konformasi terjadi sebagai akibat dari pengikatannya pada substrat dan ligan kecil. Disosiasi protein menjadi subunit dapat diinduksi dengan memperlakukannya dengan zat seperti urea atau parachloromercuribenzoate. Semua perubahan ini dapat dengan mudah dipantau menggunakan ultrasentrifugasi analitis.

Pencetakan produk tubular dengan metode sentrifugasi. Di bawah sentrifugasi di industri bahan bangunan ... yang berdampak seperti itu disebut sentrifugasi. Dalam industri Republik Belarus, sentrifugal horizontal digunakan ...

Deposisi partikel

Pekerjaan laboratorium >> Kimia

Sel sudah dirilis dengan kecepatan rendah sentrifugasi dari nukleus, mitokondria, dan... fitur ultrasentrifugasi jenis ini sentrifugasi tercermin dalam sangat ... bagi kami menggunakan kasus sentrifugasi dalam gradien kerapatan sukrosa, ...

Menggunakan centrifuge

Kursus >> Industri, produksi

Dalam sentrifugal batch, berbagai operasi sentrifugasi- pemuatan, pemisahan, pembongkaran - berlangsung ... membedakan antara preparatif dan analitis sentrifugasi. Dengan persiapan sentrifugasi sumber bahan biologis diambil ...