Un studiu bacteriologic este un studiu menit să izoleze și să studieze proprietățile acestora pentru a face un diagnostic microbiologic.

Materialul de testat trebuie luat în condiții aseptice în vase sterile și livrat la laborator cât mai curând posibil. Dacă este necesar, probele trebuie păstrate la frigider. Tehnica de prelevare depinde de obiect, natura bolii și proprietățile microorganismului. Una dintre cele mai comune metode de cercetare bacteriologică este bacterioscopia.

Pentru a studia bacteriile nefixate, se folosesc două metode: picătură zdrobită (între lamă și lamă) și. Trebuie amintit că preparatele din bacterii nefixate sunt contagioase.

Frotiurile sunt utilizate pentru bacterioscopia preparatelor fixe. Pentru a le pregăti, o picătură de lichid de testare este întinsă pe suprafața unei lame de sticlă și apoi uscată. Cea mai comună metodă de fixare a medicamentului este de a-l transporta prin flacăra unui arzător cu gaz. În unele cazuri, se folosesc compuși de fixare. Preparatele fixe sunt de obicei colorate (vezi Colorarea microorganismelor). Printre cele mai importante elemente ale cercetării bacteriologice se numără culturile și subculturile produse de o ansă bacteriană sau o pipetă Pasteur. Bucla este sterilizată prin prăjire la flacără, apoi răcită prin atingerea unei zone de agar neinoculat sau prin clătire cu lichid steril. Când se folosește o pipetă Pasteur, vârful acesteia este rupt cu o pensetă, pipeta este trecută de mai multe ori prin flacăra arzătorului și lăsată să se răcească. La însămânțare se folosesc medii nutritive lichide și solide. La însămânțarea pe agar înclinat, cultura bacteriilor este frecată cu o buclă peste suprafața agarului. La însămânțarea în grosimea unei coloane de agar sau gelatină, mediul nutritiv este străpuns în fundul eprubetei cu o buclă sau un ac special. La însămânțarea într-un mediu lichid, este necesar să vă asigurați că lichidul nu se revarsă și nu udă marginile eprubetelor și dopurilor. Inoculările și subculturile trebuie efectuate lângă flacăra unui arzător cu gaz, eprubetele nu trebuie să rămână deschise mult timp, bucla sau pipeta Pasteur cu cultura nu trebuie să atingă nimic; înainte de a închide tubul, marginile acestuia trebuie arse. Tuburile inoculate trebuie etichetate imediat.

Cel mai important pas în cercetarea bacteriologică este identificarea – determinarea speciei sau tipului de bacterii obținute sub forma unei culturi pure. La identificarea bacteriilor, proprietățile lor fiziologice și biochimice, se studiază formarea toxinelor. Metodele serologice de identificare a bacteriilor sunt utilizate pe scară largă (reacții și). În multe cazuri, metoda biologică de identificare a microorganismelor este eficientă, bazată pe infectarea animalelor de laborator cu materialul de testat sau cultura de bacterii rezultată și identificarea modificărilor patologice caracteristice la animale.

Pentru izolarea culturilor pure se folosesc metode mecanice și biologice. Un exemplu de metodă mecanică: o picătură de material de testat este frecată cu aceeași spatulă sterilă sau buclă bacteriană pe suprafața unui mediu nutritiv dens, secvenţial în primul, al doilea și al treilea. Izolarea unei culturi pure se face din colonii individuale crescute și constă în studiul și screeningul acestora pe un mediu nutritiv proaspăt. Metodele biologice de izolare a culturilor pure se bazează pe luarea în considerare a uneia sau a altei proprietăți a microbului izolat, care îl deosebește de alți microbi prezenți în materialul studiat.

În metoda biologică se utilizează acest tip de medii nutritive, în care se creează condiții favorabile dezvoltării unui anumit tip de microbi. Metodele biologice includ, de asemenea, infectarea animalelor de laborator sensibile la tipul izolat de bacterii.

Examenul bacteriologic este un set de metode de depistare a microorganismelor patogene la un pacient, într-un purtător sau pe obiecte din mediu. Studiile bacteriologice sunt folosite și pentru a detecta microbi condiționat patogeni și sanitar-indicativi care caracterizează gradul de poluare a mediului extern, pentru a studia peisajul microbian al unui anumit mediu (obiect). Cercetarea bacteriologică poate fi utilizată pentru diagnosticarea, prevenirea bolilor infecțioase, pentru caracteristicile sanitare și igienice ale mediului înconjurător al unei persoane, pentru cercetarea științifică.

Materialul și metoda cercetării bacteriologice depind de scopul analizei, condițiile de mediu, patogeneza și evoluția bolii. În prezența bacteriemiei, microbul este detectat prin hemocultură. În cazurile de leziuni locale pronunțate, agentul patogen trebuie căutat în secrețiile sau secrețiile organului afectat (difterie, dizenterie, gonoree etc.). În cele din urmă, în bolile cu evoluție complexă, când (ca, de exemplu, în febra tifoidă) bacteriemia este înlocuită cu leziuni ale intestinului subțire, se utilizează o metodă de cercetare adecvată în fiecare etapă: hemoculturi sunt efectuate în prima săptămână a boala, iar testarea serologică este cea mai fiabilă în a doua, începând din a treia săptămână se obține un rezultat pozitiv la însămânțarea fecalelor; cea din urmă metodă este folosită și ca studiu de control pentru a detecta purtătorii de bacterii în rândul convalescenților și pentru a le monitoriza.

Implementarea oricăreia dintre aceste sarcini se realizează folosind metode concepute pentru a izola și identifica microorganismele. În funcție de caracteristicile microbilor, se utilizează întregul complex de metode sau părți ale acestuia.

Bacterioscopia este cea mai accesibilă tehnică bazată pe examinarea microscopică a materialului. La microscopia preparatelor proaspete, se pot folosi unele reacții microchimice (de exemplu, colorarea bacteriilor iodofile cu soluție Lugol) sau colorarea selectivă a diferitelor părți structurale ale bacteriilor.

Bacteriile pot fi identificate mai clar în preparatul colorat. Materialul de testat este aplicat pe o lamă de sticlă într-un strat cât mai subțire și cât mai uniform posibil. Lăsați preparatul să se usuce la aer și fixați-l printr-una dintre metodele general acceptate, dar cel mai adesea prin flăcări, adică de două sau de trei ori ținând rapid preparatul peste flacăra arzătorului, astfel încât paharul să fie cald, dar nu fierbinte. Preparatul, răcit după fixare, se colorează cu o colorare simplă sau diferențială (vezi Colorarea microorganismelor). În microscopia fluorescentă se folosesc atât preparate native, cât și preparate uscate. În acest caz, tratamentul cu anumiți coloranți face ca structurile corpului microbian sau întregul microbi să strălucească în raze ultraviolete sau albastre scurte. Într-o altă modificare, microbii sunt tratați cu seruri specifice marcate cu fluorescenți (coloranți). Bacteriile corespunzătoare serului vor străluci pe măsură ce serul marcat este depus pe ele. Bacteriile heterologe nu vor străluci.

Metoda de bacterioscopie este utilizată pe scară largă pentru diagnosticul bacteriologic al anumitor boli infecțioase (gonoree, tuberculoză, febră recidivă), precum și în studiul întregului complex de microfloră a unui organ (amigdale, vagin), produs sau alt obiect.

Metoda de însămânțare, adică izolarea unei culturi pure a microorganismului dorit, este o metodă mai precisă și mai fiabilă de diagnostic bacteriologic decât bacterioscopia. Materialul proaspăt este uns pe suprafața unui mediu nutritiv dens turnat în vase Petri. Inocularea primară se efectuează pe medii convenționale favorabile unui anumit microb, pe medii diferențiale sau selective. Alegerea mediului nutritiv (vezi), precum și metoda de pretratare a materialului proaspăt pentru însămânțare, depinde de gradul de contaminare a acestuia cu microfloră străină concomitentă. După 24-48 de ore. conținutul într-un termostat la temperatura optimă pentru un anumit microb, cupele sunt examinate și coloniile suspecte sunt inoculate pe medii care favorizează reproducerea acestui agent patogen. Se obtine astfel o cultura de bacterii omogene, care trebuie identificate.

Identificarea unui microbi începe cu studierea morfologiei acestuia în preparatul pictat și într-o picătură zdrobită (vezi) pentru definirea unei forme de microbi și mobilitatea acestora. Următorul pas este studierea capacității enzimatice a bacteriilor de a descompune carbohidrații, aminoacizii și ureea în combinații specifice fiecărei specii. Bacteriile au cele mai studiate zahăr și enzime proteolitice.

Identificarea unui microbi ar trebui să fie completată de studiul altor proprietăți caracteristice fiecărui gen și specie de microorganisme. Aceste proprietăți includ capacitatea de a dizolva selectiv eritrocitele diferitelor animale (hemoliză), coagularea plasmei sanguine (coagularea plasmei), dizolvarea unui cheag de fibrină (fibrinoliza), etc. Toate aceste caracteristici ale bacteriilor pot fi utilizate în identificarea lor ca semne diferențiale.

Identificarea finală a microbilor unor specii, în principal a bacteriilor patogene din familia intestinală, include identificarea serologică (vezi Identificarea microbiană). De obicei, pentru aceasta este setată o reacție de aglutinare, adică acumularea de bacterii este detectată sub influența serului imunitar cu același nume. Aglutinarea microbilor în ser împotriva unei anumite specii indică apartenența la acea specie. De obicei, reacția de aglutinare se plasează aproximativ pe sticlă și pentru determinarea finală în eprubete cu diluții de ser.

Un număr de microbi nu poate fi pe deplin determinați în modul descris. Apoi, identificarea trebuie completată de infectarea animalelor de laborator, deoarece unele bacterii sunt caracterizate prin patogenitate sau toxicitate, care se dezvăluie atunci când animalele sunt infectate. În unele cazuri, infecția animalelor servește și ca metodă de acumulare a microbilor patogeni.

Numai o comparație a tuturor caracteristicilor unei culturi, colectate în timpul studiului morfologiei, biochimice, serologice și, acolo unde este necesar, proprietățile sale biologice, poate oferi temeiuri pentru identificare. Răspunsul cu un rezultat pozitiv al studiului nu este dificil dacă microbul izolat este tipic. În acest caz, sunt indicate genul, specia și, dacă se stabilește, tipul de bacterie. La izolarea unui microb care se abate în unele proprietăți de la o caracteristică tipică, se oferă un răspuns care indică caracteristica de abatere. În acest caz, este util să se repete studiul dacă evoluția bolii sau condițiile de colectare a materialului permit. De asemenea, este util să se supună cultura microbilor atipici unui studiu suplimentar prin alte metode mai complexe.

Rezultatele negative ale unui studiu bacteriologic au o importanță relativă și arată doar că porțiunea de material studiată nu conținea microbii doriti sau nu era viabilă. Cu toate acestea, ele pot fi prezente într-o porțiune diferită. Prin urmare, de exemplu, la examinarea purtătorilor de bacil (febră tifoidă, dizenterie, difterie), sunt necesare studii repetate.

Aceasta este metoda principală utilizată în diagnosticul de laborator al bolilor infecțioase. Esența metodei de cercetare bacteriologică este însămânțarea materialului patologic de la pacienți și izolarea unei culturi pure a agentului patogen, urmată de identificarea acestuia prin caracteristici morfologice, culturale, tinctoriale, biochimice și antigenice.

Metoda de izolare a culturilor pure, care face posibilă izolarea anumitor tipuri de microbi dintr-unul sau altul habitat natural, este cea mai importantă metodă de cercetare microbiologică. Primul care a propus o metodă de izolare a unei culturi pure a fost L. Pasteur.

Metoda Pasteur, bazată pe utilizarea mediilor nutritive lichide, a asigurat izolarea unei culturi pure în principal dintr-un material care conține un tip de microbi (de exemplu, din sânge în septicemie etc.). A fost mai puțin eficient în cazurile în care a fost necesară izolarea anumitor tipuri de microorganisme din amestecul lor. Între timp, în condiții naturale, materialul pentru examinarea bacteriologică (sputa, puroi, sol, apă etc.) conține cel mai adesea un amestec de diferite microorganisme.

Izolarea cu succes a amestecurilor bacteriene și studiul izolat al speciilor individuale au devenit posibile datorită îmbunătățirii metodei de izolare a culturilor pure de către Robert Koch (R. Koch), care a folosit în acest scop în 1881. medii nutritive solide pe care în timpul semănării este posibil să se distribuie materialul în așa fel încât celulele microbiene individuale să fie izolate unele de altele. În condiții adecvate (mediu nutritiv, temperatură optimă), reproducerea celulelor izolate dă descendenți din aceeași specie, adică. o cultură pură a unei anumite specii microbiene.

După o anumită perioadă (cel mai adesea într-o zi), în acele locuri ale unui mediu nutritiv dens pe care se află celule izolate, se formează populații de microbi multiplicați - așa-numitele colonie, vizibil cu ochiul liber. Ele nu reprezintă o acumulare haotică de microbi, care poate fi deja judecată prin faptul că pentru multe tipuri de microbi coloniile au o structură caracteristică, datorită căreia este posibilă determinarea aproximativă a florei materialului studiat și selectarea acestora. colonii care fac obiectul unor studii suplimentare. Reînsămânțarea unor astfel de colonii pe un mediu nutritiv adecvat este izolarea unei culturi pure.

Izolarea culturilor pure cu identificarea lor ulterioară are o importanță capitală în diagnosticul bolilor infecțioase, asigurând recunoașterea rapidă a acestora, tratamentul și prevenirea în timp util. Nu este mai puțin importantă în determinarea microflorei în studiul stării sanitare și igienice a obiectelor de mediu (aer, apă, sol etc.), precum și în cercetarea științifică.

Numeroase metode pentru izolarea culturilor pure sunt acum disponibile. Unele dintre ele sunt utilizate într-o măsură limitată, altele sunt utilizate pe scară largă. Cele mai universale sunt metodele descrise mai jos pentru izolarea culturilor bacteriene pure (metoda lui Drigalsky). În timp ce alte microorganisme - spirochete, protozoare - necesită utilizarea unor metode speciale de izolare sau nu pot fi izolate deloc pe medii nutritive artificiale (unele protozoare, rickettsie, viruși).

Metodele pentru izolarea culturilor pure din amestecurile microbiene sunt de obicei împărțite în două grupe principale: metode bazate pe principiul separării mecanice a microbilor într-un mediu nutritiv și metode bazate pe utilizarea proprietăților biologice ale microbilor. Prima grupă include metode de izolare a celulelor individuale: 1) în adâncimea mediului nutritiv; 2) pe suprafața mediului și 3) sub controlul ochiului. Al doilea grup utilizează proprietăți ale microbilor precum mobilitatea lor, atitudinea față de temperatură, oxigenul și proprietățile lor patogene.

Tehnica de însămânțare și reînsămânțare

prin semănatîn practica microbiologică, se numește introducerea unui material de testat într-un mediu nutritiv steril pentru a detecta microorganismele.

Reînsămânțare este transferul microorganismelor de cultură într-un mediu steril. Culturile și subculturile de microbi sunt una dintre cele mai comune metode în practica microbiologică.

Reînsămânțarile sunt efectuate în așa fel încât microorganismele străine să nu pătrundă în mediul nutritiv din aer sau de pe suprafața obiectelor din jur. Pentru aceasta, trebuie respectați cu strictețe următorii pași:

1) culturile se fac direct lângă un arzător aprins, în flacăra căruia se sterilizează bucle, pensete, dopuri de bumbac, marginile eprubetelor;

2) o eprubetă cu o cultură de încrucișat se ia în mâna stângă, cealaltă (cu mediu nutritiv steril) este ținută în poziție înclinată între degetul mare și arătător;

3) bucla este ținută în poziție verticală deasupra flăcării arzătorului și partea sa metalică este calcinată la roșu, apoi înclinată orizontal și suportul buclei este sterilizat;

4) scoateți dopurile de bumbac și țineți-le cu degetul inelar și cu degetul mic de la mâna dreaptă; nu se recomanda punerea dopurilor pe masa sau pe orice obiect;

5) arde marginile ambelor tuburi;

6) introduceți o ansă în eprubeta cu cultura de subcultivat cu grijă, fără a atinge pereții, captați o picătură de lichid sau o cantitate mică de placă pe mediul solid și transferați, încercând să nu atingeți pereții, în al doilea eprubetă cu un mediu nutritiv epuizat;

7) bucla este scoasă, marginile eprubetelor și capetele interioare ale dopurilor sunt arse. Dacă dopul de bumbac ia foc, atunci închideți eprubeta cu el și stingeți capătul exterior cu o mână sau o pensetă;

8) bucla se trage din nou în flacără, se face o inscripție corespunzătoare pe eprubetă: denumirea culturii și data semănării.

Semănat în mediu lichid poate fi produs cu o pipetă Pasteur sau gradată. Când utilizați o pipetă Pasteur, folosiți penseta arse pentru a rupe capătul sigilat și a arde ușor întreaga pipetă. În mâna stângă se pune eprubeta cu cultura studiată, iar pipeta se pune în mâna dreaptă între degetul mare și mijlocul, ținându-și deschiderea superioară cu degetul arătător.

După ce scoateți dopul de bumbac din eprubetă, ardeți marginile acesteia din urmă. Coborâți pipeta cu grijă în eprubetă și scoateți degetul arătător. Apoi închideți deschiderea superioară a pipetei cu degetul arătător, scoateți-o din eprubetă. dopul de bumbac și marginile eprubetei sunt arse înainte de a fi închise. Materialul de testat este transferat într-un mediu lichid. După inoculare, pipetele se pun într-o soluție dezinfectantă.

Semănat pe medii solide. La semănat pe agar oblic, se aplică o lovitură dreaptă sau în zig-zag. Pentru a face acest lucru, bucla cu materialul inoculat este introdusă în eprubetă până când apa de condensare s-a acumulat la fund și cu grijă, fără a slăbi agarul, se aplică o lovitură. Inocularea solidă se obține prin mânjirea inoculului pe întreaga suprafață a agarului oblic.

Pe un mediu dens într-o cutie Petri, inocularea se efectuează după cum urmează. Mediul nutritiv din eprubete se topește într-o baie de apă clocotită, se răcește la 48-50°C și se toarnă în cupe sterile într-un strat uniform de 3-5 mm înălțime. Mediul solidificat se usucă într-un termostat în pahare închise timp de 20-30 de minute. Ceștile deschise sunt așezate cu susul în jos pe rafturile termostatului acoperite cu hârtie sterilă. Capacele sunt așezate lângă cești. În timpul uscării, apa de condensare se evaporă de pe suprafața mediului nutritiv și de pe suprafața interioară a cupelor. Semănatul se face cu o buclă sub formă de mișcări paralele sau cu o spatulă de sticlă.

Atunci când se determină tipul de microbi și pentru creșterea anaerobilor, ei produc semănat prin injecțieîntr-o coloană de agar sau gelatină. Pentru a face acest lucru, eprubeta este întoarsă cu susul în jos și o coloană de mediu este străpunsă de sus în jos până în jos cu un ac lung drept cu inocul. Apoi acul este îndepărtat cu grijă și eprubeta este închisă cu un dop de bumbac ars. Dacă sunt necesare precauții speciale împotriva infecției, culturile sunt efectuate într-un cabinet special pentru reînsămânțarea culturilor pure. Tuburile inoculate și cutiile Petri sunt plasate într-un incubator de creștere.

Microorganismele si sporii situati in interiorul mediilor nutritive sau pe suprafata acestora nu se pot deplasa, dar raman in locul in care se aflau in momentul solidificarii. Fiecare celulă sau spor începe să se înmulțească și după 2-3 zile se formează colonie - un numar mare de celule de acelasi tip. Dacă s-a format o colonie dintr-o singură celulă, atunci va fi o cultură pură a microorganismului din a cărui celulă a crescut.

Coloniile în creștere sunt văzute mai întâi cu ochiul liber și apoi cu o lupă sau la microscop. În același timp, este imposibil să nu observați că coloniile diferă ca aspect, culoare, structură etc.

Metoda de cercetare culturală (bacteriologică) - un set de metode care vizează izolarea și identificarea culturilor pure de microorganisme (bacterii) prin cultivare pe medii nutritive.

O cultură pură este o colecție de microorganisme din aceeași specie. Cel mai adesea, o cultură pură se obține prin selectarea și cultivarea unei colonii izolate (descendența unei singure celule microbiene).

Etapele metodei:

1. Colectare de material pentru cercetare.

2. Izolarea culturii pure și identificarea acesteia.

3. Concluzie.

Colectare de materiale pentru cercetare. Tipul materialului studiat depinde de scopul studiului (diagnostic - de la pacient; analiză epidemiologică - din mediu, hrană, pacient și (sau) purtător de bacterii).

Izolarea culturii pure. Include 3 sau 4 etape:

1. Semănatul materialului (după microscopie preliminară) pe o cupă cu mediu nutritiv dens (de preferință diagnostic diferențial sau selectiv) pentru a obține colonii izolate. Se produce cel mai adesea prin metoda separării mecanice. În unele cazuri (de exemplu, sânge), materialul este pre-însămânțat într-un mediu lichid de îmbogățire, urmat de subcultură pe o placă cu mediu de agar. Uneori se efectuează un tratament selectiv al materialului înainte de inoculare (ținând cont de proprietățile microorganismului izolat; de exemplu, tratarea cu acid sau alcali pentru izolarea bacteriilor rezistente). Cultivat la o temperatură de 37°C timp de 18-24 ore. Timpul de cultivare pentru diferite tipuri de bacterii poate varia.

2(3): a) studiul coloniilor pe o placă de agar (trăsături culturale), selectarea celor mai tipice; b) pregătirea frotiurilor din aceste colonii cu colorare (după Gram sau alte metode); a) eliminarea restului coloniei studiate pe mediul de acumulare și creșterea într-un termostat la temperatura optimă.

3(4). Studiul purității culturii obținute pe mediul de acumulare. Cu asta

scopul este de a pregăti un frotiu, colorare (de obicei după Gram), studiu microscopic

omogenitatea morfologică şi tinctorială (în diferite câmpuri de vedere).

4(5). Identificarea culturii pure.

Concluzie.În funcție de totalitatea caracteristicilor în comparație cu proprietățile tulpinilor de referință (tipice), este indicat tipul de microorganism izolat din material.

Evaluarea metodei:

avantaje: sensibilitate și precizie relativ ridicate, capacitatea de a determina numărul de microbi din materialul de testat, precum și sensibilitatea la antibiotice; limitări: durata relativă, metoda este costisitoare.

21. Medii nutritive pentru aerobi și anaerobi. Cerințe pentru mediile nutritive, clasificare.

Cerințe:

1. mediile trebuie să fie hrănitoare

2. trebuie să aibă un anumit ph

3. trebuie să fie izotonic, adică. presiunea osmotică în mediu trebuie să fie aceeași ca în celulă.

4. trebuie să fie umed și nu prea lichid

5. trebuie să aibă un anumit potenţial redox

6. trebuie să fie steril

7. trebuie să fie unificate, adică conțin cantități constante de ingrediente individuale.

Mediile nutritive pot fi împărțite:

A) Originea

1) natural - hrană naturală (carne, lapte, cartofi);

2) artificiale - special preparate pentru creșterea microbilor: - medii din produse naturale (apă de carne, bulion de peptonă de carne (MPB), agar peptonă de carne (MPA), - neavând o compoziție constantă; - medii nutritive sintetice - soluții de strict cantități definite de săruri, aminoacizi, baze azotate, vitamine din apa distilată - au o compoziție constantă, sunt utilizate pentru creșterea microorganismelor și a culturilor celulare în producerea de vaccinuri, seruri imune și antibiotice;

B) Prin programare:

1) scop general (MPB, MPA) - majoritatea microbilor cresc pe ei;

2) electivă - promovează selectiv creșterea unui tip de microbi dintr-un amestec (de exemplu, agar-sare de gălbenuș pentru stafilococi);

TEMA: Sterilizare, asepsie, antisepsie, dezinfectare.

Principii, metode de cultivare a microorganismelor și izolarea culturilor pure.

Metoda de cercetare bacteriologică. Etapa 1.

1. Familiarizați-vă cu principalele metode de dezinfecție și sterilizare utilizate în microbiologie și medicină.

2. Cunoașteți caracteristicile metabolismului microorganismelor, principiile cultivării lor în laborator.

3. Master etapa 1 a metodei bacteriologice de diagnosticare a bolilor infectioase.

1. Metode, dispozitive și moduri de sterilizare a mediilor nutritive, sticlărie de laborator, instrumentar medical.

2. Principalele grupe de dezinfectanti, mecanismul lor de actiune, zona si metoda de aplicare.

3. Numirea mediilor nutritive în practica microbiologică.

4. Principiul obținerii de culturi pure de microorganisme și esența metodei bacteriologice, ca „standard de aur” în diagnosticul bolilor infecțioase.

5. Scopul și succesiunea efectuării etapei I a metodei bacteriologice de izolare a culturilor pure de microorganisme.

1. Selectați mijloacele, modul de sterilizare și dezinfecție în conformitate cu sarcinile specifice.

2. Descrieți mediile nutritive propuse utilizate în practica microbiologică.

3. Efectuați etapa I a metodei bacteriologice de izolare a culturilor pure de microorganisme aerobe.

Întrebări de test:

1. Efect bacteriostatic și bactericid al temperaturilor scăzute și ridicate asupra microorganismelor.

2. Efectul substanțelor chimice de diferite clase asupra microorganismelor. Antiseptice și dezinfectante.

3. Concepte: sterilizare, dezinfectare, asepsie, antisepsie.

4. Metode, echipamente și moduri de sterilizare, alegerea acestora în funcție de proprietățile obiectului de sterilizat.

5. Principalele grupe de dezinfectanți și tacticile de utilizare a acestora în unitățile sanitare.

6. Principii și metode de cultivare a microorganismelor.

7. Medii nutritive: concept; cerințe pentru ei; clasificare.

8. Conceptul de specie, tulpină, colonie, cultură pură de microorganisme.

9. Esența metodei bacteriologice și domeniul de aplicare a acesteia.

10. Scopul și succesiunea etapei I a metodei bacteriologice pentru izolarea aerobilor.

Sarcini efectuate în timpul lecției (UIRS):

1. Familiarizați-vă cu aparatele folosite pentru sterilizare în practica medicală și microbiologică: sterilizator cu abur (autoclavă), cuptor Pasteur.

2. Selectați dispozitive și moduri de sterilizare a mediilor nutritive, sticlărie de laborator, instrumente medicale.

3. Familiarizați-vă cu dezinfectanții utilizați în practica medicală și microbiologică. Selectați dezinfectanții și modul de dezinfecție pentru obiectele propuse.

4. Familiarizați-vă cu diversele medii nutritive utilizate în practica microbiologică, caracterizați-le din punct de vedere al compoziției, consistenței și scopului.

5. Efectuați etapa 1 a metodei bacteriologice pentru izolarea culturilor pure de aerobi:

5.1. Se prepară un preparat fix din materialul de testat, se colorează cu Gram, microscopic și se identifică microorganismele identificate prin proprietăți morfologice și tinctoriale.

5.2. Semănați materialul de testat folosind metoda „lovitură cu platformă”.

5.3. Semănați materialul de testat folosind metoda Drygalski (demonstrație).

6. Familiarizați-vă cu setul de instrumente pentru colectarea și transportul materialelor patologice.

Ghid pentru implementarea sarcinii de cercetare:

1. Cunoașterea aparatelor folosite pentru sterilizare: sterilizator cu abur (autoclavă), cuptor Pasteur.

1.1. Sterilizator cu abur (autoclav) - sterilizare cu abur sub presiune.

Cea mai fiabilă și universală metodă de sterilizare în practica medicală și microbiologică este sterilizarea cu abur sub presiune. Este produs într-o autoclavă, în care obiectele de sterilizat sunt încălzite cu abur saturat la o presiune peste cea atmosferică. Între citirile manometrului și temperatura aburului saturat există următoarea relație:

Presiunea zero este considerată presiune atmosferică normală (760 mm Hg).

Sterilizarea poate fi realizată numai dacă autoclava este pe deplin operațională și este operată corespunzător de către personal special instruit. Prin urmare, este necesar să se monitorizeze constant regimul de sterilizare, care se realizează prin metode fizice (termometru maxim etc.), biologice (biotest cu spori ai culturilor de microorganisme testate) și chimice (teste chimice, indicatori precum IS).

Controlul modului de sterilizare a autoclavelor se realizează printr-o metodă chimică la fiecare încărcare a autoclavului. Test chimic - un tub de sticlă cu o substanță chimică având un anumit punct de topire: antipirină, resorcinol - 110 ± 1 °, acid benzoic - 120 ± 2 °, benzamidă - 126 ± 1 °, uree, nicotinamidă, D (+)-manoză - 132 ±2°. În compoziția testelor chimice se introduce un colorant de anilină (magenta, violet de gențiană etc.), care colorează uniform substanța atunci când este topită. În prezent, indicatorii de tip IS (Vinar, Rusia) sunt mai des utilizați, reprezentând o bandă de hârtie cu un strat de amestec indicator aplicat pe ea și concepute pentru controlul vizual operațional nu numai al temperaturii, ci și al timpului de sterilizare (IS- 120, IS-132). Regimul de sterilizare este monitorizat trimestrial folosind un biotest cu spori ai culturii de testat Bacil stearotermophilus BKM B-718.

1.2. Cuptor Pasteur - sterilizare la caldura uscata.

In cuptorul Pasteur se sterilizeaza produse din sticla, metale si cauciucuri pe baza de cauciuc siliconic. Mod de sterilizare: 160°C - 150 min; 180°С - 60 min. Controlul modului de sterilizare la fiecare ciclu se realizează cu ajutorul indicatorilor de sterilizare IS-160, IS-180; trimestrial - folosind un biotest cu spori de cultură de testare Bacil licheniformis PCS. G BKM B-1711 D.

2. Completați Case tabelul numarul 1.

Tabelul 1.

Sterilizarea

3. Familiarizați-vă cu dezinfectanții și umpleți in clasa tabelul nr. 2, folosind aplicațiile nr. 1, 2.

Masa 2.

Dezinfectare

4. Familiarizați-vă cu mediile nutritive și umpleți in clasa tabelul nr 3 „Medii nutritive”.

Tabelul 3

5. Microbiologia clinică ca ramură a microbiologiei medicale rezolvă două sarcini principale: diagnosticul etiologic al unei boli infecțioase și alegerea rațională a terapiei etiotrope.

Principala metodă de diagnostic microbiologic a rezolva aceste probleme este metoda bacteriologica. Esența metodei bacteriologice este de a izola o cultură pură a agentului patogen, de a determina tipul și sensibilitatea acesteia la medicamentele antimicrobiene.

Selectarea materialului studiat depinde de tipul bolii și de localizarea predominantă a agentului patogen într-un anumit stadiu al dezvoltării sale (patogeneză). Materialul poate fi sânge, lichid cefalorahidian, scurgeri de plăgi, spută, fecale, urină etc. Tehnica de prelevare a materialului este de mare importanță în obținerea unui rezultat fiabil.

Succesul izolării unei culturi pure este determinat de corectitudine alegerea mediului nutritiv și a condițiilor de cultivare. Nu există un mediu nutritiv universal, a cărui utilizare va face posibilă izolarea oricăror microorganisme din orice material de testat. Prin urmare, ținând cont de caracteristicile fiziologice ale posibililor agenți patogeni, materialul este însămânțat pe un mediu nutritiv specific sau un complex de medii nutritive (special, electiv, diagnostic diferențial). Unele microorganisme necesită și condiții speciale de cultivare (anaerobe, microaerofile, cu conținut ridicat de dioxid de carbon).

Materialul patologic de la un pacient este adesea un amestec de microorganisme. În acest sens, sarcina este de a le separa și obținând colonii izolate. O colonie izolată, ca urmare a reproducerii unei celule microbiene și constând dintr-un tip de celulă, este baza pentru obținerea unei culturi pure. În practica microbiologică se folosesc diverse metode pentru a obține colonii izolate. Următoarele sunt cele mai frecvent utilizate:

1. Semănat materialul de testare metoda „lovitură cu tampon”.- materialul de testat se aplică pe suprafața unui mediu nutritiv dens pe o zonă limitată, apoi se distribuie prin însămânțare cu mișcări paralele frecvente.

2. Metoda Drygalski- materialul aplicat la prima cana cu mediu nutritiv si semanat cu o spatula se inoculeaza secvential cu aceeasi spatula, fara a o steriliza, pentru inca 1-2 cani.

3. Metoda culturii sectoriale– materialul studiat se seamănă secvenţial cu o buclă pe mai multe sectoare. În același timp, o anumită tehnică de semănat (metoda gould) permite nu numai obținerea de colonii izolate, ci și determinarea numărului de microorganisme în 1 ml (g) de material de testat, ceea ce este important în aprecierea rolului etiologic al microorganismelor oportuniste (OPM).

5.1.Efectuarea etapei I a metodei bacteriologice pentru izolarea aerobilor:

Se prepară un preparat fix din materialul de testat, se colorează după metoda Gram, microscopic, se identifică microorganismele detectate prin proprietăți morfo-tinctoriale; acordați atenție numărului de microorganisme. Înregistrați rezultatele în protocol și trageți o concluzie;

Semănați materialul de testat pe o jumătate de cană cu un mediu nutritiv dens folosind metoda „lovitură cu platformă”;

· semăna materialul de testat pe trei plăci cu mediu nutritiv folosind metoda Drygalski (demonstrație);

Etichetați vasele cu data inoculării și puneți-le cu capul în jos într-un termostat la 37°C timp de 18-24 ore.

6. Mijloace de colectare și livrare a materialului patologic

Notă: * - utilizat dacă timpul de livrare a materialului la laborator după primirea acestuia depășește 1,5-2 ore.

Întrebări pentru autocontrol:

1. Numiți și justificați principiile de cultivare a microorganismelor.

2. De ce se folosesc medii elective, de diagnostic diferențial și de acumulare pentru însămânțarea materialului patologic?

3. Justificați principiul obținerii de culturi pure de microorganisme.

4. De ce este metoda bacteriologică „standardul de aur” în diagnosticul microbiologic al bolilor infecțioase?

5. Pe care sunt metodele chimice si biologice de obtinere a culturilor pure de microorganisme pe baza?

6. Care este diferența dintre sterilizare și dezinfecție?

7. Justificați scopul sterilizării și dezinfectării în practica microbiologică și medicală.

8. Justificați avantajul utilizării sistemelor de indicatori termici pentru monitorizarea regimului de sterilizare (pe exemplul unui indicator IS din Vinar, Rusia).

Literatură:

Tutoriale:

1. Borisov L. B. Microbiologie medicală, virologie, imunologie. - M .: SRL „MIA”, 2002. - S. 26-29, 63-66, 150-159.

2. Pozdeev O. K. Microbiologie medicală / Ed. acad. RAMS V. I. Pokrovsky. - M.: Medicina GEOTAR, 2001. - S. 76-77, 126-130, 253-265.

Literatură suplimentară:

1. Siguranța muncii cu microorganisme din grupele III - IV de patogenitate și helminți: Reguli sanitare. - M.: Centrul Federal pentru Supravegherea Sanitară și Epidemiologică de Stat al Ministerului Sănătății al Rusiei, 1999. - 107p.

Prelegeri de microbiologie.

Teste.

În conformitate cu programele moderne ale OMS, baza depistarii tuberculozei în străinătate este microscopia frotiurilor de spută obținute de la pacienții cu tuse care au aplicat la medicii generaliști; frotiurile sunt colorate conform lui Ziehl-Neelsen. Această tehnică este inclusă în policlinica domestică și examenul clinic minim al unui pacient care produce spută. În 1995, Ministerul Sănătății și Industriei Medicale din Rusia, prin ordinul nr. 8 „Cu privire la dezvoltarea și îmbunătățirea activităților de microbiologie clinică de laborator (bacteriologie) a instituțiilor medicale” a confirmat această obligație a laboratoarelor de diagnostic clinic. Examinarea bacteriologică obligatorie a sputei pentru M. tuberculosis ar trebui organizată pentru pacienții netransportabili, pacienții cu boli cronice ale organelor respiratorii și ale sistemului urinar, precum și pentru lucrătorii fermelor de animale care sunt nefavorabile pentru tuberculoză. Această metodă cea mai veche își păstrează pe deplin semnificația datorită disponibilității pentru laboratoarele practice de diagnostic clinic, a costurilor reduse și a vitezei de implementare.

Cu o bacterioscopie a unui frotiu colorat conform Ziehl-Neelsen, Mycobacterium tuberculosis poate fi detectat în prezența a cel puțin 100.000 - 1.000.000 de celule bacteriene în 1 ml de material patologic (sputa). Un număr atât de mare de micobacterii apare la pacienții cu forme avansate progresive ale bolii (diseminate și fibros-cavernoase). La un numar mult mai mare de pacienti, numarul de micobacterii izolate de acestia este sub limita metodei bacterioscopiei, ceea ce reprezinta un mare dezavantaj al acestei metode. Numai cu îndeplinirea perfectă a tuturor condițiilor cerute specificate în Ordinul nr. 109 al Ministerului Sănătății al Federației Ruse - studiul a cel puțin trei mostre de material de diagnostic, colectarea corectă a sputei, disponibilitatea unui microscop binocular modern și reactivi de înaltă calitate, vizând până la 300 de câmpuri vizuale - este posibilă creșterea sensibilității la 10.000 de celule microbiene.

Micobacteriile tuberculoase au aspectul unor tije subțiri, ușor curbate, de lungimi diferite, cu îngroșări la capete sau la mijloc, dispuse în grupuri și individual (Figura 1, a).

Microscopie fluorescentă

Metoda se bazează pe pătrunderea unui derivat carbolic al unui colorant fluorescent (auramină, rodamină) într-o celulă microbiană. Atunci când sunt colorate cu un colorant fluorescent auramină-rodamină, micobacteriile pot fi văzute la o mărire fără imersie de 100x. Rezultatul este mai precis atunci când este colorat de Ziehl-Neelsen cu carbol fuchsin și microscopie prin imersie la o mărire de 1000x. Colorația cu frotiu Ziehl-Nielsen este recomandată atunci când se utilizează tehnologii DOTS. Micobacteriile în acest caz arată ca niște tije galbene luminoase (Figura 1, b). Metoda are avantaje incontestabile, deoarece permite vizualizarea practic a întregului frotiu la o mărire mai mică la microscop, iar această metodă este, de asemenea, mai rentabilă, deoarece timpul petrecut pentru vizualizarea frotiurilor este redus.

Dezavantajele metodei LM includ un cost semnificativ mai mare al unui microscop luminiscent, în timpul procedurii de colorare, respectarea și corectarea pH-ului frotiului, precum și eliberarea micobacteriilor în materialul de diagnostic (în special în spută) din mucusul inconjurator, care impiedica patrunderea colorantului fluorescent in celula microbiana. Prin urmare, nu este recomandabil să se utilizeze LM pentru spută nativă, dar se recomandă utilizarea acestei metode la examinarea frotiurilor preparate după centrifugare din sedimentul de material prelucrat pentru cultură și neutralizat după decontaminare. Prin urmare, metoda LM trebuie utilizată în laboratoarele bacteriologice, unde se pot efectua examene culturale și microscopice din aceeași porțiune a materialului de diagnostic.

În timpul examinării histologice sau citologice, uneori este posibilă detectarea celulelor caracteristice tuberculozei, care sunt rezultatul unei reacții de protecție a organismului la introducerea bacilului tuberculozei. Prezența celulelor gigantice Langhans în citogramă decide fără îndoială diagnosticul de tuberculoză. Aceste celule sunt foarte mari (80 - 90 microni sau mai mult în diametru). Citoplasma este colorată cu gri-albastru. De-a lungul periferiei sale, un număr mare de nuclee (până la 20) sunt amplasate într-un rând, dispuse sub formă de inel (Figura 1, c).

Un alt semn al tuberculozei este prezența în prepararea așa-numitelor celule epitelioide, din care se dezvoltă celulele Langhans. Acest lucru se întâmplă cu o creștere a numărului de nuclei fără diviziunea citoplasmei, care crește doar în dimensiune (Figura 1, d).

Microscopia vă permite să obțineți rapid rezultatul, dar are sensibilitate și specificitate scăzute, imposibilitatea diferențierii micobacteriilor acido-rezistente.

Figura 1 - Mycobacterium tuberculosis
a - Metoda de colorare Ziehl-Nelsen
b - metoda de microscopie cu luminescenţă
c - celule Langhas
d - celule epitelioide

Metoda culturală

Cea mai comună metodă de depistare a Mycobacterium tuberculosis în țara noastră este metoda culturală. Acesta este „standardul de aur” al diagnosticului bacteriologic al tuberculozei, deoarece sensibilitatea metodei este semnificativ mai mare decât cea microscopică și face posibilă obținerea unei culturi pure de micobacterii pentru identificarea ulterioară și studiile de rezistență la medicamente. Această metodă dă rezultate pozitive în prezența a 20 până la 100 de celule microbiene viabile per 1 ml în materialul de testat. Este insa laborioasa si indelungata datorita faptului ca Mycobacterium tuberculosis creste foarte lent iar depistarea lor se poate inregistra doar dupa 3 saptamani de cultivare.

Din punct de vedere istoric, mediile nutritive pe bază de ou (Levenshtein-Jensen, Finn-2, Ogawa, Anikin, Novaya, Popescu) sunt mediile nutritive solide cele mai utilizate pentru izolarea MBT. Inocularea materialului pe mediul Levenstein-Jensen se efectuează într-un laborator bacteriologic. Creșterea primelor colonii pe medii clasice se observă după 4 până la 8 săptămâni. Cu toate acestea, mediile de agar Middlebrook (7H10, 7H11), care au apărut în ultimii ani, permit detectarea mai rapidă a creșterii micobacteriilor (de la două până la patru săptămâni) și oferă oportunități mai bune pentru studiul morfologiei coloniilor decât pe mediul de ouă. Dezavantajul mediilor nutritive agar este necesitatea de a incuba semințele într-un termostat cu dioxid de carbon, astfel încât mediile de agar nu sunt practic utilizate în Rusia.

Trebuie remarcat faptul că, datorită selectivității ridicate a diferitelor tulpini de micobacterii și a necesității de proteine ​​complete, nu există încă un mediu nutritiv universal care să le poată înlocui pe toate celelalte. În Ordinul nr. 109 al Ministerului Sănătății al Federației Ruse, se recomandă utilizarea unei eprubete din mediul nutritiv internațional Levenshtein-Jensen și Finn-2 pentru însămânțarea materialului de diagnosticare pe MBT. Cu toate acestea, practica arată că, pe lângă aceste medii, este recomandabil să se folosească oricare dintre cele suplimentare, iar inocularea mediului nutritiv în trei eprubete crește și eficiența diagnosticului cultural.

Pentru un diagnostic cultural cu drepturi depline al tuberculozei, este necesar să existe facilități și echipamente adecvate. Deosebit de importantă este prezența unei centrifuge și protecție anti-aerosol și capacitatea de a oferi o accelerație de 3000g. Precum și dulapuri de siguranță biologică pentru prevenirea infecțiilor intralaboratoare.

Principalul dezavantaj al diagnosticului cultural al tuberculozei este durata studiului - de la trei săptămâni la trei luni. Prin urmare, cercetările suplimentare privind dezvoltarea metodelor de accelerare a creșterii micobacteriilor rămân relevante.

sisteme BACTEC

Diagnosticul cultural al tuberculozei suferă în prezent modificări fundamentale asociate cu introducerea în practică a sistemelor de cultivare MBT complet automatizate. Principala diferență dintre aceste metode este utilizarea mediilor nutritive lichide pentru cultivare, urmată de detectia radiometrică (BACTEC 460), colorimetrică (Mb-Bact, BactALERT) și luminiscentă (BACTEC MGIT 960). Creșterea MBT pe un mediu nutritiv lichid în aceste sisteme poate fi detectată după 1-2 săptămâni, în funcție de cantitatea lor inițială din materialul de diagnostic. Frecvența de detectare a micobacteriilor este, de asemenea, puțin mai mare decât pe mediile nutritive dense. Sistemele automate BACTEC care utilizează flacoane adecvate care conțin diferite medicamente antituberculoase pot reduce timpul de testare a rezistenței la medicamente a micobacteriilor la 10-14 zile.

Dintre sistemele automatizate enumerate, sistemul BACTEC MGIT 960BD este în prezent cel mai eficient. Flacoanele MGIT cu mediu de cultură lichid 7H9 conțin un indicator fluorescent în partea inferioară sub silicon, „stins” de concentrații mari de oxigen. În prezența creșterii micobacteriilor în procesul de absorbție a oxigenului, indicatorul începe să strălucească, înregistrarea fluorescenței în sistemul BACTEC MGIT se realizează automat. Utilizarea flacoanelor MGIT este posibilă și „manual”, apoi înregistrarea luminiscenței se efectuează folosind un transiluminator pe flacoanele MGIT timp de 11 zile.