Aproape toate reacțiile biochimice sunt enzimatice. Enzime(biocatalizatorii) sunt substanțe de natură proteică activate de cationi metalici. Sunt cunoscute aproximativ 2000 de enzime diferite, iar aproximativ 150 dintre ele au fost izolate, dintre care unele sunt folosite ca medicamente. Tripsina și chimotripsina sunt folosite pentru a trata bronșita și pneumonia; pepsină - pentru tratamentul gastritei; plasmină - pentru tratamentul atacului de cord; pancreatina - pentru tratamentul pancreasului. Enzimele diferă de catalizatorii convenționali prin (a) activitate catalitică mai mare; (b) specificitate ridicată, adică actiune selectiva.

Mecanismul unei reacții enzimatice cu un singur substrat poate fi reprezentat prin schema:

unde E este o enzimă,

S - substrat,

ES - complex enzimatic-substrat,

R este produsul reacției.

Caracteristica primei etape a reacţiei enzimatice este constanta Michaelis (K M). K M este reciproca constantei de echilibru:

constanta Michaelis (KM) caracterizează stabilitatea complexului enzimă-substrat (ES). Cu cât constanta Michaelis (KM) este mai mică, cu atât complexul este mai stabil.

Viteza unei reacții enzimatice este egală cu viteza etapei sale de limitare a vitezei:

unde k 2 este constanta vitezei, numită numărul de revoluții sau activitatea moleculară a enzimei.

activitatea moleculară a unei enzime(k 2) este egal cu numărul de molecule de substrat care suferă transformări sub influența unei molecule de enzimă într-un minut la 25 0 C. Această constantă ia valori în intervalul: 1 10 4< k 2 < 6·10 6 мин‾ 1 .

Pentru ureaza, care accelerează hidroliza ureei, k 2 = 1,85∙10 6 min‾ 1; pentru adenozin trifosfataza, care accelerează hidroliza ATP, k 2 = 6,24∙10 6 min‾ 1; pentru catalază, care accelerează descompunerea H 2 O 2, k 2 = 5∙10 6 min‾ 1.

Cu toate acestea, ecuația cinetică a reacției enzimatice în forma în care este dată mai sus este practic imposibil de utilizat din cauza imposibilității determinării experimentale a concentrației complexului enzimă-substrat (). Exprimarea în termeni de alte mărimi, ușor de determinat experimental, obținem ecuația cinetică a reacțiilor enzimatice, numit Ecuația Michaelis-Menten (1913):

,

unde produsul k 2 [E]tot este valoarea constantei, care se notează cu (viteza maximă).

Respectiv:

Luați în considerare cazuri speciale ale ecuației Michaelis-Menten.

1) La o concentrație scăzută de substrat, K M >> [S], prin urmare

care corespunde ecuaţiei cinetice a reacţiei de ordinul întâi.

2) La o concentrație mare a substratului K m<< [S], поэтому

care corespunde ecuaţiei cinetice a reacţiei de ordin zero.

Astfel, la o concentrație scăzută de substrat, viteza de reacție enzimatică crește odată cu creșterea conținutului de substrat din sistem, iar la o concentrație mare de substrat, curba cinetică atinge un platou (viteza de reacție nu depinde de concentrația de substrat) ( Fig. 30).

Figura 30. - Curba cinetică a reacţiei enzimatice

Dacă [S] = K M, atunci

care vă permite să determinați grafic constanta Michaelis K m (Fig. 31).

Figura 31. - Definirea grafică a constantei Michaelis

Activitatea enzimatică este influențată de: (a) temperatură, (b) aciditatea mediului, (c) prezența inhibitorilor. Efectul temperaturii asupra vitezei unei reacții enzimatice este discutat în capitolul 9.3.

Influența acidității mediului asupra vitezei reacției enzimatice este prezentată în Figura 32. Activitatea maximă a enzimei corespunde valorii optime a valorii pH-ului (pH opt).

Figura 32. - Influența acidității soluțiilor asupra activității enzimelor

Pentru majoritatea enzimelor, valorile optime ale pH-ului coincid cu valorile fiziologice (7,3 - 7,4). Cu toate acestea, există enzime care necesită un mediu puternic acid (pepsină - 1,5-2,5) sau destul de alcalin (arginaza - 9,5 - 9,9) pentru funcționarea lor normală.

Inhibitori de enzime- Sunt substanțe care ocupă o parte din centrii activi ai moleculelor enzimatice, în urma cărora viteza reacției enzimatice scade. Cationii de metale grele, acizii organici și alți compuși acționează ca inhibitori.

Cursul 11

Structura atomului

Există două definiții ale termenului „atom”. Atom este cea mai mică particulă a unui element chimic care își păstrează proprietățile chimice.

Atom este un microsistem neutru din punct de vedere electric format dintr-un nucleu încărcat pozitiv și un înveliș de electroni încărcat negativ.

Doctrina atomului a parcurs un drum lung de dezvoltare. Principalele etape ale dezvoltării atomisticii includ:

1) stadiu natural-filosofic - perioada de formare a conceptului de structura atomică a materiei, neconfirmată prin experiment (sec. V î.Hr. - sec. XVI d.Hr.);

2) stadiul formării ipotezei despre atom ca cea mai mică particulă a unui element chimic (secolele XVIII-XIX);

3) etapa creării de modele fizice care reflectă complexitatea structurii atomului și fac posibilă descrierea proprietăților acestuia (începutul secolului al XX-lea)

4) stadiul modern al atomisticii se numește mecanică cuantică. Mecanica cuantică este o ramură a fizicii care studiază mișcarea particulelor elementare.

PLAN

11.1. Structura nucleului. Izotopi.

11.2. Modelul mecanic cuantic al învelișului electronic al atomului.

11.3. Caracteristicile fizico-chimice ale atomilor.

Structura nucleului. izotopi

nucleul atomic- Aceasta este o particulă încărcată pozitiv, constând din protoni, neutroni și alte particule elementare.

Este în general acceptat că principalele particule elementare ale nucleului sunt protonii și neutronii. Proton (p) - este o particulă elementară a cărei masă atomică relativă este de 1 amu și a cărei sarcină relativă este + 1. Neutron (n) - este o particulă elementară care nu are o sarcină electrică, a cărei masă este egală cu masa unui proton.

Nucleul conține 99,95% din masa unui atom. Forțele nucleare speciale de extensie acționează între particulele elementare, depășind semnificativ forțele de repulsie electrostatică.

Caracteristica fundamentală a unui atom este încărca a lui nuclee, egal cu numărul de protoni și care coincide cu numărul de serie al elementului din sistemul periodic al elementelor chimice. Se numește o colecție (tip) de atomi cu aceeași sarcină nucleară element chimic. Elementele cu numere de la 1 la 92 se găsesc în natură.

izotopi- Aceștia sunt atomi ai aceluiași element chimic care conțin același număr de protoni și un număr diferit de neutroni în nucleu.

unde numărul de masă (A) este masa nucleului, z este sarcina nucleului.

Fiecare element chimic este un amestec de izotopi. De regulă, numele izotopilor coincide cu numele unui element chimic. Cu toate acestea, au fost introduse denumiri speciale pentru izotopii de hidrogen. Elementul chimic hidrogen este reprezentat de trei izotopi:

Numărul p Numărul n

Protium H10

Deuteriu D 1 1

Tritiu T 1 2

Izotopii unui element chimic pot fi stabili sau radioactivi. Izotopii radioactivi conțin nuclee care se prăbușesc spontan odată cu eliberarea de particule și energie. Stabilitatea unui nucleu este determinată de raportul neutron-protoni.

Intrând în organism, radionuclizii perturbă cursul celor mai importante procese biochimice, reduc imunitatea, condamnă organismul la boli. Organismul se protejează de efectele radiațiilor prin absorbția selectivă a elementelor din mediu. Izotopii stabili au prioritate față de izotopii radioactivi. Cu alte cuvinte, izotopii stabili blochează acumularea de izotopi radioactivi în organismele vii (Tabelul 8).

Cartea lui S. Shannon „Nutriția în era atomică” oferă următoarele date. Dacă o doză de blocare a unui izotop stabil de iod, egală cu ~100 mg, este luată nu mai târziu de 2 ore după ce I-131 intră în organism, atunci absorbția iodului radioactiv în glanda tiroidă va scădea cu 90%.

Radioizotopii sunt utilizați în medicină

pentru diagnosticul anumitor boli,

pentru tratamentul tuturor formelor de cancer,

pentru studii fiziopatologice.

Tabelul 8 - Efectul de blocare al izotopilor stabili

Cinetica reacțiilor enzimatice. Cinetica studiază vitezele, mecanismele reacțiilor și influența unor factori precum concentrația de enzime și substraturi, temperatura, pH-ul mediului, prezența inhibitorilor sau activatorilor.

La o concentrație constantă de substrat, viteza de reacție este direct proporțională cu concentrația de enzimă. Graficul dependenței vitezei reacției enzimatice de concentrația substratului are forma unei hiperbole isoscelă.

Dependența vitezei de reacție enzimatică de concentrația enzimei (a) și a substratului (b)

Este descrisă dependența vitezei de reacție enzimatică de concentrația substratului Ecuația Michaelis-Menten:

unde V este viteza staționară a reacției biochimice; Vmax - viteza maxima; Km - constanta Michaelis; [S] - concentrația substratului.

Dacă concentrația de substrat este scăzută, adică [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Apoi

Astfel, la concentrații scăzute de substrat, viteza de reacție este direct proporțională cu concentrația de substrat și este descrisă printr-o ecuație de ordinul întâi. Aceasta corespunde secțiunii drepte inițiale a curbei V = f[S] (figura b).

La concentrații mari de substrat [S] >> Km, când Km poate fi neglijat, ecuația Michaelis-Menten ia forma, i.e. V=Vmax.

Astfel, la concentrații mari de substrat, viteza de reacție devine maximă și este descrisă printr-o ecuație de ordin zero. Aceasta corespunde unei secțiuni a curbei V =f [S], paralelă cu axa x.

La concentrații de substrat comparabile numeric cu constanta Michaelis, viteza de reacție crește treptat. Acest lucru este destul de în concordanță cu ideile despre mecanismul reacției enzimatice:

unde S este substratul; E - enzimă; ES - complex enzima-substrat; P - produs; k1 este constanta de viteză pentru formarea complexului enzimă-substrat; k2 este constanta de viteză a descompunerii complexului enzimă-substrat cu formarea de reactivi inițiali; k3 este constanta de viteză a descompunerii complexului enzimă-substrat cu formarea produsului.

Rata de conversie a substratului cu formarea produsului (P) este proporţională cu concentraţia complexului enzimă-substrat. La concentrații scăzute de substrat, soluția conține un număr de molecule de enzime libere (E) care nu sunt legate într-un complex (ES). Prin urmare, odată cu creșterea concentrației substratului, concentrația complexelor crește și, în consecință, crește și viteza de formare a produsului. La concentrații mari de substrat, toate moleculele de enzime sunt legate într-un complex ES (fenomen de saturație enzimatică), prin urmare, o creștere suplimentară a concentrației de substrat practic nu crește concentrația de complexe, iar rata de formare a produsului rămâne constantă.

Astfel, sensul fizic al vitezei maxime a reacției enzimatice devine clar. Vmax este viteza cu care reacționează o enzimă, existând în întregime ca un complex enzimă-substrat..

Constanta Michaelis corespunde numeric unei astfel de concentrații de substrat la care viteza staționară este egală cu jumătate din maxim. Această constantă caracterizează constanta de disociere a complexului enzimă-substrat:

Semnificația fizică a constantei Michaelis prin aceea că caracterizează afinitatea enzimei pentru substrat. Km are valori mici atunci când k1 > (k2 + k3), adică. procesul de formare a complexului ES prevalează asupra proceselor de disociere a ES. Prin urmare, cu cât valoarea Km este mai mică, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru substrat. În schimb, dacă Km este mare, atunci (k2 + k3) > k1 și procesele de disociere ES predomină. În acest caz, afinitatea enzimei pentru substrat este scăzută.

Inhibitori și activatori de enzime . Inhibitori de enzime numite substanţe care reduc activitatea enzimelor. Orice agenți de denaturare (de exemplu, săruri de metale grele, acizi) sunt inhibitori de enzime nespecifici.

Inhibitori reversibile sunt compuși care interacționează necovalent cu o enzimă. inhibitori ireversibili- sunt compuși care leagă în mod specific grupările funcționale ale centrului activ și formează legături covalente cu enzima.

Inhibația reversibilă este împărțită în competitivă și necompetitivă. Inhibarea competitivă sugerează o asemănare structurală între inhibitor și substrat. Inhibitorul ocupă un loc în locul activ al enzimei și un număr semnificativ de molecule de enzime este blocat. Inhibarea competitivă poate fi eliminată prin creșterea concentrației substratului. În acest caz, substratul înlocuiește inhibitorul competitiv de la locul activ.

Inhibarea reversibilă poate fi necompetitiv referitor la substrat. În acest caz, inhibitorul nu concurează pentru locul de atașare la enzimă. Substratul și inhibitorul se leagă de situsuri diferite, deci există posibilitatea formării complexului IE, precum și a complexului ternar IES, care se poate descompune odată cu eliberarea produsului, dar cu o viteză mai mică decât complexul ES .

De natura acțiunii tale inhibitorii sunt împărțiți în:

• specific,
• nespecifice.

Inhibitori specificiîși au efectul asupra enzimei, unindu-se cu o legătură covalentă în centrul activ al enzimei și dezactivând-o din sfera de acțiune.

Inhibarea nespecifică implică efectul asupra enzimei a unor agenți de denaturare (săruri ale metalelor grele, uree etc.). În acest caz, ca urmare a distrugerii structurii cuaternare și terțiare a proteinei, activitatea biologică a enzimei se pierde.

Activatori enzimatici sunt substanțe care cresc viteza unei reacții enzimatice. Cel mai adesea, ionii metalici (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ etc.) acţionează ca activatori. Distingeți între metalele care fac parte din metaloenzime, care sunt cofactoriși acționând ca activatori enzimatici. Cofactorii se pot lega puternic de partea proteică a enzimei, dar în ceea ce privește activatorii, ei sunt ușor separați de apoenzimă. Astfel de metale sunt participanți obligatorii la actul catalitic, care determină activitatea enzimei. Activatori intensifică efectul catalitic, dar absența lor nu împiedică desfășurarea reacției enzimatice. De regulă, cofactorul metalic interacționează cu grupurile încărcate negativ ale substratului. Un metal cu valență variabilă participă la schimbul de electroni dintre substrat și enzimă. În plus, ele sunt implicate în formarea unei conformații de tranziție stabile a enzimei, care contribuie la o formare mai rapidă a complexului ES.

Reglarea activității enzimelor . Unul dintre principalele mecanisme de reglare a metabolismului este reglarea activității enzimelor. Un exemplu este reglarea alosterică, reglarea prin activatori și inhibitori. Este adesea cazul ca produsul final al căii metabolice să fie un inhibitor al enzimei de reglare. Acest tip de inhibiție se numește retroinhibarea sau inhibarea feedback-ului negativ.

Multe enzime sunt produse ca precursori inactivi ai proenzimei și apoi sunt activate la momentul potrivit prin proteoliză parțială. Proteoliză parțială- scindarea unei părți a moleculei, ceea ce duce la modificarea structurii terțiare a proteinei și formarea centrului activ al enzimei.

Unele enzime oligomerice își pot modifica activitatea datorită asocieri – disocieri de subunități incluse în componența lor.

Multe enzime pot fi găsite sub două forme: ca o simplă proteină și ca o fosfoproteină. Trecerea de la o formă la alta este însoțită de o schimbare a activității catalitice.

Viteza unei reacții enzimatice depinde de cantități de enzime, care în celulă este determinată de raportul dintre ratele sintezei și dezintegrarii sale. Acest mod de reglare a vitezei unei reacții enzimatice este un proces mai lent decât reglarea activității enzimatice.

Cinetica enzimatică studiază viteza reacțiilor catalizate de enzime în funcție de diferite condiții (concentrație, temperatură, pH etc.) de interacțiune a acestora cu substratul.

Cu toate acestea, enzimele sunt proteine ​​care sunt sensibile la influența diferitelor influențe externe. Prin urmare, atunci când se studiază viteza reacțiilor enzimatice, se iau în considerare în principal concentrațiile de reactanți și se încearcă să se minimizeze influența temperaturii, pH-ului mediului, activatorilor, inhibitorilor și alți factori și se creează condiții standard. În primul rând, aceasta este valoarea optimă a pH-ului mediului pentru această enzimă. În al doilea rând, se recomandă menținerea temperaturii la 25°C, acolo unde este posibil. În al treilea rând, se obține saturația completă a enzimei cu substratul. Acest punct este deosebit de important, deoarece la o concentrație scăzută de substrat, nu toate moleculele de enzimă participă la reacție (Fig. 6.5, A), ceea ce înseamnă că rezultatul va fi departe de maximul posibil. Cea mai mare putere a reacției catalizate, celelalte lucruri fiind egale, se realizează dacă fiecare moleculă de enzimă este implicată în transformare, adică. la o concentrație mare a complexului enzimă-substrat (Fig. 6.5, în). Dacă concentrația substratului nu asigură saturarea completă a enzimei (Fig. 6.5, b), atunci viteza reacției în curs nu atinge valoarea maximă.

Orez. 65.

A - la concentrație scăzută de substrat; 6 - cu concentrație insuficientă a substratului; in - când enzima este complet saturată cu substratul

Viteza unei reacții enzimatice, măsurată în condițiile de mai sus, și saturația completă a enzimei cu substratul se numește viteza maximă de reacție enzimatică (V).

Viteza reacției enzimatice, determinată atunci când enzima nu este complet saturată cu substratul, se notează v.

Cataliza enzimatică poate fi descrisă simplist de schemă

unde F este o enzimă; S - substrat; FS - complex enzima-substrat.

Fiecare etapă a acestui proces este caracterizată de o anumită viteză. Unitatea de măsurare a vitezei unei reacții enzimatice este numărul de moli ai substratului transformați într-o unitate de timp(ca viteza unei reacții normale).

Interacțiunea enzimei cu substratul duce la formarea unui complex enzimă-substrat, dar acest proces este reversibil. Vitezele reacțiilor directe și inverse depind de concentrațiile reactanților și sunt descrise prin ecuațiile corespunzătoare:

Ecuația (6.3) este valabilă în echilibru, deoarece vitezele reacțiilor directe și inverse sunt egale.

Înlocuind ratele reacțiilor directe (6.1) și inverse (6.2) în ecuația (6.3), obținem egalitatea:

Starea de echilibru se caracterizeaza prin corespondenta constanta de echilibru K p, egal cu raportul constantelor reacțiilor directe și inverse (6.5). Se numește reciproca constantei de echilibru constanta substratului K s , sau constanta de disociere a complexului enzimă-substrat:

Din ecuația (6.6) este clar că constanta substratului scade la o concentrație mare a complexului enzimă-substrat, adică. cu mare stabilitate. Prin urmare, constanta de substrat caracterizează afinitatea enzimei și a substratului și raportul constantelor de viteză pentru formarea și disocierea complexului enzimă-substrat.

Fenomenul de saturație a unei enzime cu un substrat a fost studiat de Leonor Michaelis și Maud Mepten. Pe baza prelucrării matematice a rezultatelor, au derivat ecuația (6.7), care și-a primit numele, din care reiese clar că la o concentrație mare a substratului și o valoare scăzută a constantei substratului, viteza reacției enzimatice tinde la maxim. Cu toate acestea, această ecuație este limitată deoarece nu ia în considerare toți parametrii:

Complexul enzimă-substrat în timpul reacției poate suferi transformări în diferite direcții:

• se disociază în substanțele originale;
• fi transformat într-un produs din care enzima este separată neschimbată.

Prin urmare, pentru a descrie efectul general al procesului enzimatic, conceptul constantele Michaelis Kt, care exprimă relaţia constantelor de viteză ale tuturor celor trei reacţii ale catalizei enzimatice (6.8). Dacă ambii termeni sunt împărțiți la constanta de viteză a reacției de formare a complexului enzimă-substrat, atunci se va obține expresia (6.9):

Un corolar important rezultă din ecuația (6.9): constanta Michaelis este întotdeauna mai mare decât constanta substratului prin k 2 /kv

Numeric K t este egală cu o astfel de concentrație a substratului la care viteza de reacție este jumătate din viteza maximă posibilă și corespunde unei astfel de saturații a enzimei cu substratul, ca în Fig. 6.5, b. Deoarece în practică nu este întotdeauna posibil să se obțină saturarea completă a enzimei cu substratul, așa este K t folosit pentru a compara caracteristicile cinetice ale enzimelor.

Viteza reacției enzimatice în cazul saturației incomplete a enzimei cu substratul (6.10) depinde de concentrația complexului enzimă-substrat. Coeficientul de proporționalitate este constanta de reacție pentru eliberarea enzimei și a produsului, deoarece aceasta modifică concentrația complexului enzimă-substrat:

După transformări, ținând cont de dependențele prezentate mai sus, viteza reacției enzimatice în cazul saturației incomplete a enzimei cu substratul este descrisă prin ecuația (6.11), i.e. depinde de concentrațiile enzimei, substratului și de afinitatea acestora Ks:

Dependența grafică a vitezei reacției enzimatice de concentrația substratului nu este liniară. După cum este evident din fig. 6.6, cu o creștere a concentrației substratului, se observă o creștere a activității enzimei. Cu toate acestea, când se atinge saturația maximă a enzimei cu substratul, viteza reacției enzimatice devine maximă. Prin urmare, factorul care limitează viteza de reacție este formarea unui complex enzimă-substrat.

Practica a arătat că concentrațiile de substraturi, de regulă, sunt exprimate în valori mult mai mici decât unitate (10 6 -10 3 mol). Este destul de dificil să operați cu astfel de cantități în calcule. Prin urmare, G. Lineweaver și D. Burke au propus să exprime dependența grafică a vitezei reacției enzimatice nu în coordonate directe, ci în coordonate inverse. Ei au pornit de la presupunerea că pentru valori egale, reciprocele lor sunt, de asemenea, egale:

Orez. 6.6.

După transformarea expresiei (6.13) se obține o expresie numită Ecuația Lineweaver-Burk (6.14):

Dependența grafică a ecuației Lineweaver-Burk este liniară (Fig. 6.7). Caracteristicile cinetice ale enzimei sunt determinate după cum urmează:

• segmentul tăiat pe axa y este egal cu 1/V;
• segmentul tăiat pe axa x este -1 /K t.

Orez. 6.7.

Se crede că metoda Lineweaver - Burke vă permite să determinați cu mai multă precizie viteza maximă de reacție decât în ​​coordonatele directe. Din acest grafic pot fi extrase și informații valoroase cu privire la inhibarea enzimelor.

Există și alte moduri de a transforma ecuația Michaelis-Menten. Dependențele grafice sunt folosite în studierea influenței diferitelor influențe externe asupra procesului enzimatic.

Această secțiune a enzimologiei studiază influența diverșilor factori asupra vitezei unei reacții enzimatice. Luând în considerare ecuația generală a catalizei enzimatice a reacției reversibile de transformare a unui substrat într-un singur produs (1),

principalii factori care influențează viteza unei reacții enzimatice ar trebui numiți: concentrația substratului [S], concentrația enzimei [E] și concentrația produsului de reacție [P].

Interacțiunea unor enzime cu substratul lor poate fi descrisă printr-o curbă hiperbolică a dependenței vitezei de reacție enzimatică V de concentrația substratului [S] (Fig. 19):

Fig. 19. Dependenţa vitezei reacţiei enzimatice de concentraţia substratului.

Pe această curbă pot fi distinse trei segmente, care pot fi explicate prin pozițiile mecanismului de interacțiune a enzimei cu substratul: OA este segmentul dependenței direct proporționale a lui V de [S], situsurile active ale enzimei. sunt umplute treptat cu molecule de substrat cu formarea unui complex ES instabil; secțiunea AB - dependența curbilinie a lui V de [S], saturația completă a centrilor activi ai enzimei cu molecule de substrat nu a fost încă atinsă. Complexul ES înainte de a ajunge la starea de tranziție este instabil, probabilitatea de disociere înapoi la E și S este încă mare; secțiunea BC - dependența este descrisă printr-o ecuație de ordin zero, secțiunea este paralelă cu axa [S], se realizează saturația completă a enzimelor active cu molecule de substrat, V=V max .

Forma caracteristică a curbei este descrisă matematic de ecuația Briggs-Haldane:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

unde Km este constanta Michaelis-Menten, numeric egală cu concentrația substratului la care viteza reacției enzimatice este egală cu jumătate de V max .

Cu cât este mai mic Km al enzimei, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru substrat, cu atât mai rapid este atinsă starea de tranziție pentru substrat și se transformă într-un produs de reacție. Căutarea valorilor Km pentru fiecare dintre substraturile enzimei cu specificitate de grup este importantă în determinarea rolului biologic al acestei enzime în celulă.

Pentru majoritatea enzimelor, este imposibil să se construiască o curbă hiperbolică (Fig. 19).În acest caz, se utilizează metoda dublelor reciproce (Lineweaver-Burk), adică. este reprezentată grafic o dependență de 1/[V] față de 1/[S] (Fig. 20). Metoda de construire a unor astfel de curbe într-un experiment este foarte convenabilă atunci când se studiază efectul diferitelor tipuri de inhibitori asupra activității enzimelor (a se vedea textul de mai jos).

Fig.20. Graficul 1/[V] versus 1/[S] (metoda Lineweaver-Burk),

unde zona de decuplare y - și x – zona de delimitare - , tangenta unghiului α - .

Dependența vitezei de reacție enzimatică V de concentrația enzimei [E].

Această dependență grafică (Fig. 21) este considerată la temperatura și pH-ul optime ale mediului, la concentrații de substrat care sunt semnificativ mai mari decât concentrația de saturație a situsurilor active ale enzimei.

Orez. 21. Influența concentrației enzimatice asupra vitezei de reacție enzimatică.

Dependența vitezei de reacție enzimatică de concentrația cofactorului sau coenzimei. Pentru enzimele complexe, trebuie avut în vedere că deficiența formelor coenzimatice de vitamine în hipovitaminoză, o încălcare a aportului de ioni metalici în organism duc în mod necesar la o scădere a concentrației enzimelor corespunzătoare necesare pentru cursul metabolic. proceselor. Prin urmare, trebuie concluzionat că activitatea enzimei este direct dependentă de concentrația cofactorului sau coenzimei.

Influența concentrației produselor asupra vitezei reacției enzimatice. Pentru reacțiile reversibile care apar în corpul uman, trebuie luat în considerare faptul că produsele reacției directe pot fi utilizate de enzimă ca substraturi pentru reacția inversă. Prin urmare, direcția curgerii și momentul atingerii V max sunt dependente de raportul dintre concentrațiile substraturilor inițiale și ale produselor de reacție. De exemplu, activitatea alanin aminotransferazei, care catalizează transformarea:

Alanină + Alfa-cetoglutarat ↔ Piruvat + Glutamat

depinde în celulă de raportul dintre concentrații:

[alanina + alfa-cetoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MECANISMUL DE ACȚIUNE A ENZIMELOR. TEORII ALE CALIZEI ENZIMATIVE

Enzimele, precum catalizatorii non-proteici, cresc viteza unei reacții chimice datorită capacității lor de a reduce energia de activare a acelei reacții. Energia de activare a unei reacții enzimatice se calculează ca diferența dintre valoarea energiei din sistem a reacției în curs care a atins starea de tranziție și energia determinată la începutul reacției (vezi dependența grafică din Fig. 22).

Orez. 22. Dependența grafică a stării energetice a unei reacții chimice fără o enzimă (1) și în prezența unei enzime (2) de timpul reacției.

Lucrările lui V. Henry și, în special, a lui L. Michaelis, M. Menten privind studiul mecanismului reacțiilor enzimatice reversibile monosubstrate au făcut posibilă postularea că enzima E se combină mai întâi reversibil și relativ rapid cu substratul său S pentru a forma un complex enzimă-substrat (ES):

E+S<=>ES (1)

Formarea ES are loc datorită legăturilor de hidrogen, interacțiunilor electrostatice, hidrofobe, în unele cazuri covalente, legăturilor de coordonare între radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi ai centrului activ și grupările funcționale ale substratului. În enzimele complexe, partea neproteică a structurii poate îndeplini și funcția de contact cu substratul.

Complexul enzimă-substrat se descompune apoi într-o a doua reacție reversibilă mai lentă pentru a forma produsul de reacție P și enzima liberă E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

În prezent, datorită lucrării oamenilor de știință menționați mai sus, precum și a lui Kaylin D., Chance B., Koshland D. (teoria „conformității induse”), există prevederi teoretice privind patru puncte principale în mecanismul de acțiunea enzimei asupra substratului, care determină capacitatea enzimelor de a accelera reacțiile chimice.

1. Orientare si proximitate . Enzima este capabilă să lege molecula de substrat în așa fel încât legătura atacată de enzimă să nu fie doar situată în imediata apropiere a grupării catalitice, ci și orientată corect față de aceasta. Probabilitatea ca complexul ES să ajungă la starea de tranziție datorită orientării și abordării este mult crescută.

2. Stresul și încordarea : potrivire indusă. Atașarea substratului poate provoca modificări conformaționale ale moleculei de enzimă, care conduc la tensiune în structura locului activ, precum și deformează oarecum substratul legat, facilitând astfel atingerea stării de tranziție de către complexul ES. Există o așa-numită corespondență indusă între moleculele E și S.

LUCRARE DE CURS

Cinetica reacțiilor enzimatice

Introducere

Baza vieții oricărui organism este procesele chimice. Aproape toate reacțiile dintr-un organism viu au loc cu participarea biocatalizatorilor naturali - enzime.

Berzelius în 1835 a sugerat pentru prima dată că reacțiile unui organism viu sunt efectuate datorită unei noi forțe, pe care a numit-o „catalitică”. El a fundamentat această idee în principal printr-o observație experimentală: diastaza din cartofi hidrolizează amidonul mai repede decât acidul sulfuric. Încă din 1878, Kuhne a numit enzimă o substanță care are putere catalitică într-un organism viu.

Cinetica acțiunii enzimatice este o ramură a enzimologiei care studiază dependența vitezei unei reacții catalizate de enzime de natura chimică și condițiile de interacțiune a substratului cu enzima, precum și de factorii de mediu. Cu alte cuvinte, cinetica enzimelor face posibilă înțelegerea naturii mecanismelor moleculare de acțiune a factorilor care afectează viteza catalizei enzimatice. Această secțiune a fost formată la intersecția unor științe precum biochimia, fizica și matematica. Cea mai veche încercare de a descrie matematic reacțiile enzimatice a fost făcută de Duclos în 1898.

De fapt, această secțiune privind studiul enzimelor este foarte importantă în vremea noastră, și anume pentru medicina practică. Oferă farmacologilor un instrument pentru a schimba metabolismul celular, un număr mare de produse farmaceutice și diverse otrăvuri - aceștia sunt inhibitori de enzime.

Scopul acestei lucrări este de a lua în considerare problema dependenței vitezei de reacție de diverși factori, cum poate fi controlată viteza de reacție și cum poate fi determinată.

1. Cinetica Michaelis-Menten

Experimentele preliminare privind studiul cineticii reacțiilor enzimatice au arătat că viteza de reacție, contrar așteptărilor teoretice, nu depinde de concentrația enzimei (E) și a substratului (S) în același mod ca și în cazul unei reacții convenționale. reacție de ordinul doi.

Brown și, independent de el, Henri au fost primii care au prezentat o ipoteză despre formarea unui complex enzimă-substrat în timpul reacției. Apoi această presupunere a fost confirmată de trei fapte experimentale:

a) papaina a format un compus insolubil cu fibrina (Wurtz, 1880);

b) substratul invertazei zaharoza ar putea proteja enzima de denaturarea termică (O'Sullivan și Thompson, 1890);

c) enzimele s-au dovedit a fi catalizatori stereochimic specifici (Fischer, 1898-1899).

Au introdus conceptul de viteză maximă și au arătat asta curba de saturație(adică dependența vitezei de reacție de concentrația substratului) este o hiperbolă isoscelă. Ei au demonstrat că viteza maximă observată este una dintre asimptotele curbei, iar segmentul tăiat pe axa absciselor (în zona valorilor sale negative) de a doua asimptotă, i.e. constantă în ecuația vitezei, egală în valoare absolută cu concentrația de substrat necesară pentru a atinge jumătate din rata maximă.

Michaelis și Menten au sugerat că viteza de reacție este determinată de descompunerea complexului ES, adică. constanta k 2 . Acest lucru este posibil numai cu condiția ca k 2 este cea mai mică dintre constantele vitezei. În acest caz, echilibrul dintre complexul enzimă-substrat, enzima liberă și substrat se stabilește rapid în comparație cu viteza reacției (echilibru rapid).

Viteza de reacție inițială poate fi exprimată prin următoarea formulă:

v = k2

Întrucât constanta de disociere a complexului enzimă-substrat este

K S \u003d [E] [S] / \u003d k -1 / k 1

atunci concentraţia enzimei libere poate fi exprimată ca

[E]=K S / [S]

Concentrația totală a enzimei în amestecul de reacție este determinată de formula

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Reacția atinge viteza maximă atunci când concentrația de substrat este suficient de mare astfel încât toate moleculele de enzime să fie sub forma unui complex ES (un exces infinit de mare de substrat). Raportul dintre viteza inițială și viteza maximă posibilă teoretic este egal cu raportul dintre [ES] și [E] t:

v / V max = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Aceasta este ecuația clasică Michaelisși Menten, care, de la publicarea sa în 1913, a fost principiul fundamental al tuturor studiilor cinetice enzimatice timp de decenii și, cu unele limitări, a rămas așa până în zilele noastre.

S-a demonstrat ulterior că ecuația originală Michaelis-Menten avea mai multe constrângeri. Este corect, adică descrie corect cinetica reacției catalizate de această enzimă numai dacă sunt îndeplinite toate următoarele condiții restrictive:

) se formează un complex enzimă-substrat stabil cinetic;

) constanta K S este constanta de disociere a complexului enzima-substrat: aceasta este adevarata numai daca ;

) concentrația substratului nu se modifică în timpul reacției, i.e. concentrația substratului liber este egală cu concentrația sa inițială;

) produsul de reacție este scindat rapid din enzimă, adică nu se formează o cantitate semnificativă cinetic de complex ES;

) a doua etapă a reacţiei este ireversibilă; mai exact, luam in calcul doar viteza initiala, cand reactia inapoi (din cauza lipsei efective de produs) poate fi totusi neglijata;

) doar o moleculă de substrat se leagă de fiecare situs activ al enzimei;

) pentru toți reactanții, concentrațiile lor pot fi utilizate în locul activităților.

Ecuația Michaelis-Menten servește ca punct de plecare pentru orice descriere cantitativă a acțiunii enzimelor. Trebuie subliniat faptul că comportamentul cinetic al majorității enzimelor este mult mai complicat decât rezultă din schema idealizată care stă la baza ecuației Michaelis-Menten. În derivarea acestei ecuații, se presupune că există un singur complex enzimă-substrat. Între timp, în realitate, în majoritatea reacțiilor enzimatice, se formează cel puțin două sau trei astfel de complexe, care apar într-o anumită secvență.

Aici, EZ desemnează complexul corespunzător stării de tranziție adevărată, iar EP reprezintă complexul dintre enzimă și produsul de reacție. De asemenea, se poate sublinia că în majoritatea reacțiilor enzimatice este implicat mai mult de un substrat și, respectiv, se formează doi sau mai mulți produși. Într-o reacție cu două substraturi, S 1 și S 2 , se pot forma trei complexe enzimă-substrat, și anume ES 1 , ES 2 și ES 1 S 2 . Dacă reacţia produce doi produşi, P1 şi P2, atunci pot exista cel puţin trei complecşi suplimentari EP1, EP2 şi EP1P2. În astfel de reacții, există mulți pași intermediari, fiecare dintre acestea fiind caracterizat de propria sa constantă de viteză. Analiza cinetică a reacțiilor enzimatice care implică doi sau mai mulți reactanți este adesea extrem de complexă și necesită utilizarea calculatoarelor electronice. Cu toate acestea, atunci când se analizează cinetica tuturor reacțiilor enzimatice, punctul de plecare este întotdeauna ecuația Michaelis-Menten discutată mai sus.

1.1 Natura constanteiKîn ecuație

ecuația cinetica reacției enzimatice

Al doilea postulat afirmă că constanta K S în ecuație se află constanta de disociere a complexului enzimă-substrat.

Briggs și Haldane au demonstrat în 1925 că ecuația originală Michaelis-Menten este valabilă numai pentru , i.e. când echilibrul etapei elementare E+S ES se stabileşte foarte repede în comparaţie cu ritmul etapei următoare. Prin urmare, astfel de mecanisme cinetice (supunând condiției inițiale Michaelis-Menten și având o etapă elementară lentă, în raport cu care echilibrele în toate celelalte stadii elementare sunt stabilite rapid) sunt numite satisfacerea ipotezei de „echilibru rapid”. Dacă, totuși, k 2 este comparabil în ordinea mărimii cu k -1 , modificarea concentrației complexului enzimă-substrat în timp poate fi exprimată prin următoarea ecuație diferențială:

d / dt \u003d k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Deoarece luăm în considerare viteza de reacție inițială, i.e. momentul în care reacția inversă nu are loc încă și stadiul pre-staționar a trecut deja, atunci din cauza excesului de substrat, cantitatea de complex enzimă-substrat format este egală cu cantitatea de descompus ( principiul staționarității sau cinetica lui Briggs și Haldane sau principiul Bodenstein în cinetica chimică) și este adevărat că

d/dt=0

Înlocuind aceasta în ecuația diferențială, obținem o expresie pentru concentrația de enzimă liberă:

[E] \u003d (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Ecuația la starea de echilibru:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

pentru că v = k 2 , atunci obținem asta

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

În acest caz

V max = k 2 [E] T

și este egală cu viteza maximă obținută din ecuația Michaelis-Menten. Cu toate acestea, constanta din numitorul ecuației Michaelis-Menten nu este K S , acestea. nu constanta de disociere a complexului enzimă-substrat, ci așa-numita constanta Michaelis:

K m \u003d (k -1 + k 2) / k 1

K m este egal cu K S numai dacă .

În cazul în care, constanta din numitorul ecuației vitezei este exprimată prin formula

K k \u003d k 2 / k 1

și se numește, potrivit lui Van Slyke, constantă cinetică.

Ecuația în regim de echilibru poate fi obținută și din ecuația diferențială fără a presupune că d / dt = 0. Dacă înlocuim valoarea [E] = [E] T - în ecuația diferențială, după transformări obținem

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

Pentru a obține ecuația în regim de echilibru din această ecuație, nu trebuie să fie d / dt = 0. Este suficient ca inegalitatea d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Ecuația diferențiată de stare staționară arată astfel:

d / dt \u003d T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2] (d [S] / dt)

Această expresie evident nu este egală cu 0.

1.2 Transformarea ecuației Michaelis-Menten

Ecuația originală Michaelis-Menten este o ecuație hiperbolică, în care una dintre constante (V max) este asimptota curbei. O altă constantă (K m), a cărei valoare negativă este determinată de a doua asimptotă, este egală cu concentrația de substrat necesară pentru a obține V max / 2. Acest lucru este ușor de verificat, deoarece dacă

v=Vmax / 2, atunci

Vmax / 2 = Vmax [S] / (Km + [S])

V max / V max = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], adică. [S] = K m pentru v = V max /2.

Ecuația Michaelis-Menten poate fi transformată algebric în alte forme care sunt mai convenabile pentru reprezentarea grafică a datelor experimentale. Una dintre cele mai frecvente transformări este pur și simplu să echivaleze reciprocele părților stânga și dreaptă ale ecuației

În urma transformării, obținem expresia

care poartă numele Ecuații Lineweaver-Burk. Conform acestei ecuații, un grafic trasat în coordonatele 1/[S] și 1/v este o dreaptă, a cărei panta este egală cu K m /V max , iar segmentul tăiat pe axa y este egal la 1/V max. Un astfel de graf dublu reciproc are avantajul că face posibilă determinarea mai precisă a V max; pe o curbă trasată în coordonatele [S] și v, V max este o mărime asimptotică și este determinată mult mai puțin precis. Segmentul tăiat pe axa x pe diagrama Lineweaver-Burk este egal cu -1/K m . Din acest grafic pot fi extrase și informații valoroase cu privire la inhibarea enzimelor.

O altă transformare a ecuației Michaelis-Menten este că ambele părți ale ecuației Lineweaver-Burk sunt înmulțite cu V max *v și după câteva transformări suplimentare obținem

Graficul corespunzător în coordonatele v și v/[S] reprezintă cu e 4, fig. unu]. Un astfel de grafic ( Graficul Edie-Hofsty) nu numai că face posibilă determinarea foarte ușor a valorilor V max și K m , dar vă permite și identificarea posibilelor abateri de la liniaritate care nu sunt detectate pe diagrama Lineweaver-Burk.

Ecuația poate fi liniarizată și sub altă formă

[S] / v = K m / V max + [S] / V max

În acest caz, ar trebui construită dependența [S] / v de [S]. Panta dreptei rezultate este 1/V max; segmentele tăiate pe axele ordonatelor și absciselor sunt egale cu (K m / V max) și respectiv (- K m). Această diagramă poartă numele autorului Diagrama Haynes.

Analiza statistică a arătat că metodele Edie-Hofstee și Haynes dau rezultate mai precise decât metoda Lineweaver-Burk. Motivul pentru aceasta este că în graficele lui Edie - Hofstee și Haynes, atât variabilele dependente, cât și cele independente sunt incluse în valorile reprezentate pe ambele axe de coordonate.

1.3 Efectul concentrației substratului asupra cineticii reacției

În multe cazuri, condiția de concentrare constantă a substratului nu este satisfăcută. Pe de o parte, un exces de substrat nu este utilizat în reacția in vitro cu unele enzime din cauza inhibării frecvente a activității enzimatice a substratului. În acest caz, se poate folosi doar concentrația optimă a acestuia, iar aceasta nu asigură întotdeauna excesul de substrat necesar îndeplinirii ecuațiilor cinetice ale mecanismelor discutate mai sus. Mai mult, în celulă in vivo, excesul de substrat necesar pentru a îndeplini această condiție nu este de obicei atins.

În reacțiile enzimatice în care substratul nu este în exces și, prin urmare, concentrația acestuia se modifică în timpul reacției, constanta de disociere a complexului enzimă-substrat este

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - concentrația substratului la t = 0). În acest caz, viteza de reacție inițială (în starea de echilibru) este dată de

v= V max / (K m + )

unde este concentrația substratului la un moment dat.

Cu toate acestea, este posibil să se scrie o soluție aproximativă pentru două cazuri în care [S] o = :

) dacă această inegalitate este satisfăcută datorită valorilor mari ale lui t, i.e. când mai mult de 5% din concentrația inițială a substratului a fost consumată în timpul reacției;

) dacă concentrația enzimei nu poate fi neglijată în comparație cu concentrația substratului și astfel trebuie luată în considerare concentrația complexului enzimă-substrat.

Dacă t este mare și concentrația este neglijabilă în comparație cu [S] 0 , atunci ecuația pentru constanta de disociere a complexului enzimă-substrat devine următoarea:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

Pentru valoarea concentrației , care se modifică în timpul reacției, valoarea ([S] 0 + )/2 servește ca o aproximare satisfăcătoare. Deoarece = [S] 0 - [P], viteza medie; poate fi exprimat ca

Înlocuind această expresie și valoarea aproximativă în

v= V max / (K m + ),

primim:

La compararea valorilor calculate pe baza acestei aproximări cu valorile obținute din ecuația exactă, integrată Michaelis-Menten, rezultă că eroarea în determinarea K m este de 1 și 4% atunci când cheltuiesc 30 și, respectiv, 50% din substrat. Prin urmare, eroarea în această aproximare este neglijabilă în comparație cu eroarea de măsurare.

Când consumul de substrat nu depășește 5% din concentrația inițială, dar concentrația enzimei este atât de mare încât nu poate fi ignorată în comparație cu [S] 0, constanta de disociere a complexului enzimă-substrat este egală cu:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Soluția lui cu privire la dă

Dintre cele două soluții posibile se poate alege doar cea negativă, întrucât numai aceasta îndeplinește condițiile inițiale: = 0 la [S] 0 = 0 sau [E] T = 0. Prin analogie cu ecuația pentru raportul v/V max, am obținut ecuația vitezei inițiale. Ecuația pătratică obținută din ecuația constantei de disociere a complexului enzimă-substrat, găsită puțin mai sus, folosind formulele v \u003d k 2 și V max \u003d k 2 [E] T, poate fi redusă la următoarea formă :

[S] 0 V max / v = K s V max / (V max - v) + [E] T

Trebuie luate în considerare două cazuri limitative. În primul caz [S]<

v = (Vmax / Km) [S] = k[S]

Astfel, am obținut reacția aparentă de ordinul întâi și k=V max /K m - constanta cinetică aparentă de ordinul întâi. Dimensiunea sa reală este timpul -1, dar este o combinație a constantelor vitezei de ordinul întâi și al doilea ale mai multor etape elementare, de exemplu. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . În condiţii de ordinul întâi aparent k este o măsură a progresului reacției.

Un alt caz limitativ: [S] >> K m . Aici constanta K m este neglijabilă în comparație cu [S] și astfel obținem v = V max .

1.4 Formarea unui complex enzimă-produs stabil cinetic

Dacă în timpul reacției se formează un complex enzimă-produs stabil cinetic, mecanismul de reacție este următorul:

Aplicând ipoteza regimului staționar, putem scrie ecuațiile diferențiale:

d / dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 / dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Din aceste ecuaţii rezultă că

= [(k -2 + k 3) / k 2]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Deoarece v = k 3

și [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

primim

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ]=

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

i.e

V max \u003d [E] Tm \u003d (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

În acest caz, este deja foarte dificil să se calculeze valorile specifice ale constantelor individuale ale ratei, deoarece doar raportul lor poate fi măsurat direct. Situația devine și mai complicată atunci când mecanismul reacției enzimatice devine mai complex, când în reacție sunt implicați mai mult de doi complecși, deoarece numărul constantelor de viteză din ecuație, desigur, este mult mai mare, iar rapoartele lor sunt, de asemenea, mai complicat.

Situația este însă simplificată dacă, după reacția reversibilă de formare a primului complex, etapele elementare ulterioare sunt ireversibile. Reprezentanți importanți ai enzimelor care se supun acestui mecanism sunt enzimele proteolitice și esterazele. Mecanismul lor de reacție poate fi scris după cum urmează:

unde ES` este un intermediar acil-enzimă care se descompune la expunerea la apă. Putem scrie

V max \u003d k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) \u003d k cat [E] 0m \u003d k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 pisică / K m \u003d k 2 k 1 / (k -1 + k 2) \u003d k 2 / K m '

Constanta Michaelis a etapei de acilare este K m "K s. Cu cât este mai mare raportul k cat / K m , cu atât este mai mare specificitatea substratului.

Determinarea constantelor este mult simplificată dacă experimentul este efectuat în prezența unui agent nucleofil (N) capabil să concureze cu apa. Apoi

k 3 \u003d k 3 ’ și Pi (i \u003d 1, 2, 3) sunt produse.

v i = k pisică, i [S] / (K m + [S]) pisică, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) pisică, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) cat, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Deoarece se știe că K s / k 2 = K m / k cat și dacă nucleofilul este absent, atunci

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

iar pentru a determina constantele, puteți folosi punctul de intersecție al liniilor în coordonatele 1/v N (și 1/v) - 1/[S]. Două drepte în coordonate duble inverse se intersectează în al doilea cadran. În absența unui nucleofil, punctul de intersecție a liniei cu axa verticală este definit ca 1/V max și 1/k cat , iar cu axa orizontală ca -1/K m . Coordonatele punctului de intersecție a două drepte: -1/K s și 1/k 3 . Distanța dintre 1/V max și 1/k 3 este 1/k 2 .

1.5 Analiza curbei cinetice complete a reacției

Ecuația Michaelis - Menten în forma sa inițială se referă doar la reacții ireversibile, i.e. la reacții în care se ia în considerare doar viteza inițială, iar reacția inversă nu apare din cauza unei cantități insuficiente de produs și nu afectează viteza de reacție. În cazul unei reacții ireversibile, curba cinetică completă poate fi ușor analizată (pentru un interval de timp arbitrar t ), integrând ecuația originală Michaelis-Menten. În acest caz, prin urmare, rămâne presupunerea că în cursul reacției se formează un singur complex intermediar enzimă-substrat. Deoarece pentru intervalul de timp t nu exista restrictii, concentratia substratului in momentul analizei nu poate fi egala cu concentratia introdusa initial. Astfel, este de asemenea necesar să se ia în considerare modificarea [S] în timpul reacției. Fie S 0 concentrația inițială a substratului, (S 0 - y ) - concentrarea la timpul t . Apoi, pe baza ecuației originale Michaelis-Menten (dacă y este cantitatea de substrat convertită), putem scrie

dy / dt \u003d V max (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Luând reciprocele și împărțind variabilele, integrăm peste y intre 0 si y (V max este indicat ca V):

(2,303 / t) lg = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Astfel, după ce am trasat dependența părții stângi a ecuației de y / t (coordonatele Foster-Niemann) , obțineți o dreaptă cu o pantă (-1/K m) , segment de tăiere pe axa y (V/K m) , iar pe axa absciselor - segmentul V. Ecuația integrală poate fi liniarizată și în alt mod:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

sau t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Dacă studiem o reacție reversibilă, este necesar să fim atenți la ce interval de timp avem de-a face. În momentul amestecării enzimei cu substratul începe așa-numita fază pre-staționară, care durează câteva micro- sau milisecunde, timp în care se formează complexele enzimă-substrat corespunzătoare stării staționare. În studiul reacțiilor reversibile pe intervale de timp suficient de lungi, această fază nu joacă un rol semnificativ, deoarece în această fază reacția nu decurge cu viteză maximă în niciuna dintre direcții.

Pentru o reacție care se desfășoară de la stânga la dreapta, complexele enzimă-substrat implicate în reacție ating concentrația limitatoare de viteză abia la sfârșitul fazei de prestație. Stare cvasi-staționară, în care concentrațiile complexelor enzimă-substrat care determină viteza se apropie de valorile maxime ale concentrațiilor în starea de echilibru, durează câteva zecimi de secundă sau o secundă. În această fază, rata de formare a produsului (sau consumul de substrat) este aproape liniară în timp. Teoretic, formarea produsului nu a avut loc încă aici, dar în practică concentrația sa este atât de scăzută încât viteza reacției inverse nu afectează viteza celei directe. Această fază liniară se numește viteza de reacție inițială și până acum am luat în considerare doar ea.

Reacția de la dreapta la stânga în faza următoare este, de asemenea, accelerată datorită creșterii treptate a concentrației produsului. (starea de tranziție; liniaritatea observată până acum în timp dispare). Această fază continuă până când viteza de reacție de la stânga la dreapta devine egală cu viteza de reacție de la dreapta la stânga. Acesta este statul echilibru dinamic, deoarece reacția continuă în ambele sensuri cu aceeași viteză.

2. Factori de care depinde viteza reacţiei enzimatice

.1 Dependenţa vitezei de reacţie enzimatică de temperatură

Odată cu creșterea temperaturii mediului, viteza reacției enzimatice crește, atingând un maxim la o temperatură optimă și apoi scade la zero. Pentru reacțiile chimice, există o regulă că, odată cu creșterea temperaturii cu 10 ° C, viteza de reacție crește de două până la trei ori. Pentru reacțiile enzimatice, acest coeficient de temperatură este mai mic: la fiecare 10°C, viteza de reacție crește cu un factor de 2 sau chiar mai puțin. Scăderea ulterioară a vitezei de reacție la zero indică denaturarea blocului enzimatic. Valorile optime de temperatură pentru majoritatea enzimelor sunt în intervalul 20 - 40 0 ​​C. Termolabilitatea enzimelor este asociată cu structura lor proteică. Unele enzime sunt deja denaturate la o temperatură de aproximativ 40 0 ​​C, dar cele mai multe dintre ele sunt inactivate la temperaturi peste 40 - 50 0 C. Unele enzime sunt inactivate de frig, adică. la temperaturi apropiate de 0°C are loc denaturarea.

O creștere a temperaturii corpului (febra) accelerează reacțiile biochimice catalizate de enzime. Este ușor de calculat că o creștere a temperaturii corpului pentru fiecare grad crește viteza de reacție cu aproximativ 20%. La temperaturi ridicate, de aproximativ 39-40°C, este necesară utilizarea risipitoare a substraturilor endogene în celulele unui organism bolnav pentru a-și completa aportul cu alimente. În plus, la o temperatură de aproximativ 40°C, o parte din enzimele foarte termolabile poate fi denaturată, ceea ce perturbă cursul natural al proceselor biochimice.

Temperatura scăzută determină o inactivare reversibilă a enzimelor din cauza unei ușoare modificări în structura sa spațială, dar suficientă pentru a perturba configurația corespunzătoare a centrului activ și a moleculelor de substrat.

2.2 Dependența vitezei de reacție de pH-ul mediului

Pentru majoritatea enzimelor, există o anumită valoare a pH-ului la care activitatea lor este maximă; peste și sub această valoare a pH-ului, activitatea acestor enzime scade. Cu toate acestea, nu în toate cazurile curbele care descriu dependența activității enzimelor de pH sunt în formă de clopot; uneori această dependenţă poate fi exprimată şi direct. Dependența vitezei de reacție enzimatică de pH indică în principal starea grupelor funcționale ale centrului activ al enzimei. Modificarea pH-ului mediului afectează ionizarea grupurilor acide și bazice de reziduuri de aminoacizi ale centrului activ, care sunt implicate fie în legarea substratului (în zona de contact), fie în transformarea acestuia (în zona catalitică). Prin urmare, efectul specific al pH-ului poate fi cauzat fie de o modificare a afinității substratului pentru enzimă, fie de o modificare a activității catalitice a enzimei, sau ambele.

Majoritatea substraturilor au grupe acide sau bazice, deci pH-ul afectează gradul de ionizare al substratului. Enzima se leagă de preferinţă la forma ionizată sau neionizată a substratului. Evident, la pH optim, ambele grupări funcționale ale centrului activ sunt în starea cea mai reactivă, iar substratul este într-o formă care este preferabilă pentru legarea de către aceste grupări ale enzimei.

Atunci când se construiesc curbe care descriu dependența activității enzimei de pH, măsurătorile la toate valorile pH-ului sunt de obicei efectuate în condiții de saturație a enzimei cu substratul, deoarece valoarea K m pentru multe enzime se modifică odată cu pH-ul.

Curba care caracterizează dependența activității enzimatice de pH poate avea o formă deosebit de simplă în acele cazuri când enzima acționează pe substraturi neutre electrostatic sau substraturi în care grupările încărcate nu joacă un rol semnificativ în actul catalitic. Un exemplu de astfel de enzime este papaina, precum și invertaza, care catalizează hidroliza moleculelor neutre de zaharoză și menține o activitate constantă în intervalul de pH de 3,0-7,5.

Valoarea pH-ului corespunzătoare activității maxime a enzimei nu coincide neapărat cu valoarea pH-ului caracteristică mediului intracelular normal al acestei enzime; acesta din urmă poate fi atât peste cât și sub pH-ul optim. Acest lucru sugerează că efectul pH-ului asupra activității enzimatice poate fi unul dintre factorii responsabili pentru reglarea activității enzimatice în interiorul celulei. Deoarece celula conține sute de enzime și fiecare dintre ele reacționează diferit la modificările pH-ului, valoarea pH-ului din interiorul celulei este poate unul dintre elementele importante în sistemul complex de reglare a metabolismului celular.

2.3 Determinarea cantității de enzimă prin activitatea sa

) stoichiometria totală a reacţiei catalizate;

) eventuala nevoie de cofactori - în ioni metalici sau coenzime;

) dependența activității enzimatice de concentrațiile substratului și cofactorului, i.e. Valori K m atât pentru substrat, cât și pentru cofactor;

) valoarea pH-ului corespunzătoare activității maxime a enzimei;

) intervalul de temperatură la care enzima este stabilă și își păstrează activitate ridicată.

În plus, este necesar să aveți la dispoziție o tehnică analitică destul de simplă care să vă permită să determinați viteza de dispariție a substratului sau viteza de apariție a produselor de reacție.

Ori de câte ori este posibil, analiza enzimatică este efectuată în condiții standard care mențin pH-ul optim și mențin o concentrație de substrat peste concentrația de saturație; în acest caz, viteza inițială corespunde ordinului zero al reacției față de substrat și este proporțională doar cu concentrația enzimei. Pentru enzimele care necesită cofactori, ioni metalici sau coenzime, concentrația acestor cofactori trebuie să depășească, de asemenea, concentrația de saturație, astfel încât concentrația enzimei să fie factorul limitator de viteză. În general, măsurarea vitezei de formare a produsului de reacție poate fi efectuată cu o precizie mai mare decât măsurarea vitezei de dispariție a substratului, deoarece substratul în general trebuie să fie prezent în concentrații relativ mari pentru a menține cinetica de ordin zero. Viteza de formare a produsului (sau produselor) de reacție poate fi măsurată prin metode chimice sau spectru-fotometrice. A doua metodă este mai convenabilă, deoarece vă permite să înregistrați continuu cursul reacției pe acarianul înregistratorului.

Prin acord internațional, o unitate de activitate enzimatică este cantitatea de enzimă capabilă să provoace conversia unui micromol de substrat pe minut la 25°C în condiții optime. Activitate specifică enzima este numărul de unități de activitate enzimatică per 1 mg de proteină. Această valoare este utilizată ca criteriu pentru puritatea preparatului enzimatic; crește pe măsură ce enzima este purificată și atinge valoarea maximă pentru un preparat ideal pur. Sub numărul de revoluțiiînțelegeți numărul de molecule de substrat care suferă transformare pe unitatea de timp per o moleculă a enzimei (sau per un loc activ) în condițiile în care viteza de reacție este limitată de concentrația enzimei.

2.4 Activarea enzimatică

Reglarea enzimelor poate fi efectuată prin interacțiunea cu ele a diferitelor componente biologice sau compuși străini (de exemplu, medicamente și otrăvuri), care sunt denumite în mod obișnuit. modificatori sau de reglementare enzime. Sub influența modificatorilor asupra enzimei, reacția poate fi accelerată (activatori) sau încetinită ( inhibitori).

Activarea enzimelor este determinată de accelerarea reacțiilor biochimice care are loc după acțiunea modificatorului. Un grup de activatori este format din substanțe care afectează regiunea locului activ al enzimei. Acestea includ cofactorii și substraturile enzimatice. Cofactorii (ionii metalici și coenzimele) nu sunt doar elemente structurale obligatorii ale enzimelor complexe, ci și activatori ai acestora.

Ionii metalici sunt activatori destul de specifici. Adesea, unele enzime necesită ioni de nu unul, ci mai multe metale. De exemplu, pentru Na + , K + -ATPaza, care transportă cationi monovalenți prin membrana celulară, sunt necesari ionii de magneziu, sodiu și potasiu ca activatori.

Activarea cu ajutorul ionilor metalici se realizează prin diferite mecanisme. În unele enzime, ele fac parte din situsul catalitic. În unele cazuri, ionii metalici facilitează legarea substratului de centrul activ al enzimei, formând un fel de punte. Adesea, metalul se combină nu cu enzima, ci cu substratul, formând un complex metal-substrat, care este de preferat pentru acțiunea enzimei.

Specificul participării coenzimelor la legarea și cataliza substratului explică activarea reacțiilor enzimatice de către acestea. Efectul de activare al cofactorilor este vizibil mai ales atunci când acționează asupra unei enzime care nu este saturată cu cofactori.

Substratul este, de asemenea, un activator în limitele de concentrație cunoscute. După atingerea concentrațiilor de saturatie ale substratului, activitatea enzimei nu crește. Substratul crește stabilitatea enzimei și facilitează formarea conformației dorite a situsului activ al enzimei.

Ioni metalici, coenzime și precursorii lor și analogi activi,

substraturile pot fi folosite în practică ca preparate care activează enzimele.

Activarea unor enzime poate fi efectuată prin modificare care nu afectează centrul activ al moleculelor lor. Sunt posibile mai multe modificări:

1) activarea unui predecesor inactiv - proenzima, sau zimogen. De exemplu, conversia pepsinogenului în pepsină ;

2) activare prin atașarea oricărei grupări modificatoare specifice la molecula de enzimă;

3) activarea prin disocierea unui complex proteină inactiv - enzimă activă.

2.5 Inhibarea enzimatică

Există reactivi care pot interacționa mai mult sau mai puțin specific cu una sau alta catenă laterală de proteine, ceea ce duce la inhibarea activității enzimatice. Acest fenomen face posibilă studierea naturii resturilor secundare de aminoacizi implicate în această reacție enzimatică. Cu toate acestea, în practică, ar trebui să se țină seama de numeroase subtilități care fac destul de dificilă și adesea îndoielnică o interpretare fără ambiguitate a rezultatelor obținute cu inhibitori specifici. În primul rând, pentru ca o reacție cu un inhibitor să fie adecvată pentru studiul naturii catenelor laterale implicate în reacție, aceasta trebuie să îndeplinească următoarele criterii:

) să fie specific, adică inhibitorul ar trebui să blocheze numai grupurile dorite;

) inhibă activitatea enzimei, iar această inhibare ar trebui să devină completă cu o creștere a numărului de grupe modificate;

) reactivul nu trebuie să provoace denaturarea nespecifică a proteinei.

Există 2 grupe de inhibitori: acțiune reversibilă și ireversibilă. Împărțirea se bazează pe criteriul de restabilire a activității enzimatice după dializă sau o diluare puternică a unei soluții de enzime cu un inhibitor.

După mecanismul de acțiune se disting inhibiția competitivă, necompetitivă, necompetitivă, de substrat și alosterică.

Inhibarea competitivă

Inhibarea competitivă a fost descoperită în studiul inhibiției cauzate de analogi ai substratului. Aceasta este inhibarea reacției enzimatice cauzată de legarea la centrul activ al enzimei a unui inhibitor similar ca structură cu substratul și prevenirea formării unui complex enzimă-substrat. În inhibarea competitivă, inhibitorul și substratul, fiind similare ca structură, concurează pentru locul activ al enzimei. Compusul de molecule, care este mai mare, se leagă de centrul activ.

Asemenea idei despre mecanismul inhibiției au fost confirmate de experimente privind cinetica reacțiilor de inhibiție competitivă. Astfel, s-a demonstrat că în cazul inhibării competitive, analogul substratului nu afectează viteza de descompunere a complexului enzimă-substrat deja format; atunci când se utilizează un exces „infinit de mare” de substrat, se obține aceeași rată maximă atât în ​​prezența, cât și în absența unui inhibitor. Dimpotrivă, inhibitorul afectează valoarea constantei de disociere și a constantei Michaelis. Din aceasta putem concluziona că inhibitorul reacţionează cu grupările proteice implicate într-un fel sau altul în legarea substratului, prin urmare, datorită interacţiunii sale cu aceste grupări, puterea de legare a substratului scade (adică, numărul de molecule de enzime capabile de legarea substratului scade) .

Mai târziu s-a demonstrat că inhibarea competitivă cinetic poate fi cauzată nu numai de analogii substratului, ci și de alți reactivi, a căror structură chimică este complet diferită de cea a substratului. În aceste cazuri, s-a presupus și că acest reactiv interacționează cu grupul responsabil de legarea substratului.

Există, teoretic, două posibilități de inhibiție competitivă:

1) situsurile de legare și catalitice ale enzimei se suprapun; inhibitorul se leagă de ele, dar afectează numai grupurile centrale de legare;

2) centrul de legare și centrul catalitic din molecula de enzimă sunt izolate spațial; inhibitorul interacționează cu locul de legare.

unde I este un inhibitor, iar K I este constanta de disociere a complexului enzimă-inhibitor.

Viteza relativă (raportul vitezei de reacție enzimatică măsurată în prezența unui inhibitor (v i) , la viteza maximă) este egală cu

v i / V = ​​​​/ [E] T

întrucât pentru concentraţia totală a enzimei este adevărat

[E]T = [E] + +

atunci 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Evident, dacă [I] = K I , atunci panta dreptei devine de două ori mai mare decât pentru dependența lui 1/v 0 de [S] (v 0 este viteza reacției enzimatice în absența unui inhibitor).

Tipul de inhibiție este de obicei determinat grafic. Inhibarea competitivă este cel mai ușor recunoscută prin reprezentarea diagramelor Lineweaver-Burk (adică diagrame în 1/v i și 1/[S]) la diferite concentrații de inhibitor. Cu o adevărată inhibiție competitivă se obține un set de drepte care diferă în tangenta unghiului de înclinare și intersectează axa ordonatelor (axa 1/v i) la un moment dat. La orice concentrație a inhibitorului, este posibil să se utilizeze o concentrație atât de mare a substratului încât activitatea enzimei să fie maximă.

Un exemplu de inhibiție competitivă este efectul diferitelor substanțe asupra activității succinat dehidrogenazei. Această enzimă face parte din sistemul ciclic enzimatic - ciclul Krebs. Substratul său natural este succinatul, iar inhibitorul său competitiv este oxalacetatul, un produs intermediar al aceluiași ciclu Krebs:

Un inhibitor competitiv similar al succinat dehidrogenazei este acidul malonic, care este adesea folosit în cercetarea biochimică.

Acțiunea multor preparate farmacologice, pesticide folosite pentru a distruge dăunătorii agricoli și agenții de război chimic se bazează pe principiul inhibiției competitive.

De exemplu, un grup de medicamente anticolinesteraze, care includ derivați ai bazelor cuaternare de amoniu și compuși organofosforici, sunt inhibitori competitivi ai enzimei colinesterazei în raport cu substratul său acetilcolină. Colinesteraza catalizează hidroliza acetilcolinei, un mediator al sistemelor colinergice (sinapsele neuromusculare, sistemul parasimpatic etc.). Substanțele anticolinesterazice concurează cu acetilcolina pentru locul activ al enzimei, se leagă de acesta și opresc activitatea catalitică a enzimei. Medicamente precum prozerina, fizostigmina, sevinul inhibă enzima în mod reversibil, în timp ce medicamentele organofosforice precum arminul, nibufina, clorofosul, somanul acționează ireversibil, fosforilând grupul catalitic al enzimei. Ca urmare a acțiunii lor, acetilcolina se acumulează în acele sinapse în care este un mediator al excitației nervoase, adică. organismul este otrăvit de acetilcolina acumulată. Acțiunea inhibitorilor reversibili dispare treptat, deoarece cu cât se acumulează mai multă acetilcolină, cu atât mai repede înlocuiește inhibitorul din centrul activ al colinesterazei. Toxicitatea inhibitorilor ireversibili este incomparabil mai mare; prin urmare, aceștia sunt utilizați pentru combaterea dăunătorilor agricoli, insectelor de uz casnic și rozătoarelor (de exemplu, clorofos) și ca agenți de război chimic (de exemplu, sarin, soman etc.).

Inhibarea necompetitivă

În inhibarea necompetitivă, un inhibitor specific nu afectează constanta de disociere a complexului enzimă-substrat. Pe de altă parte, viteza maximă de reacție realizabilă este mai mică în prezența unui inhibitor decât în ​​absența acestuia, chiar și la un exces infinit de mare de substrat. Prezența inhibiției demonstrează că inhibitorul se leagă de proteină. Invarianța constantei de disociere atât în ​​prezența, cât și în absența inhibitorului, la rândul său, indică faptul că, spre deosebire de substrat, inhibitorul se leagă de un alt grup. Din punct de vedere teoretic, mecanismul unei astfel de inhibiții poate fi interpretat în diverse moduri.

a) Locul de legare și locul catalitic al enzimei sunt diferite. În acest caz, inhibitorul asociat cu centrul catalitic reduce activitatea enzimei și maximul realizabil.
viteza fara a afecta formarea complexului enzima-substrat.

b) Locul de legare și locul catalitic se suprapun
suprafața enzimei, iar inhibitorul se leagă de alte grupe de proteine. Datorită legării inhibitorului de suprafața enzimei, informațiile proteinei se modifică și devin nefavorabile pentru implementarea catalizei.

c) Inhibitorul nu se leagă nici la locul catalitic, nici la locul de legare și, prin urmare, nu afectează conformația proteinei. Cu toate acestea, poate modifica local distribuția sarcinii pe o regiune a suprafeței proteinei. Inhibarea activității poate apărea și în acest caz, dacă, de exemplu, ionizarea grupărilor esențiale pentru manifestarea activității este imposibilă sau dacă, dimpotrivă, are loc ionizarea grupărilor active numai în formă neionizată. Acest fenomen se observă în principal atunci când se utilizează reactivi puternic acizi sau puternic alcalini.

Inhibitorul și substratul nu afectează reciproc legarea de enzimă, dar complexele enzimatice care conțin inhibitorul sunt complet inactive. În acest caz, se pot presupune următoarele etape elementare:

v i / V = ​​​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Dacă [I] = K I, pantele dreptelor și ordonatele punctului de intersecție cu axa verticală se dublează față de 1/v 0 .

Inhibitorii necompetitivi sunt, de exemplu, cianurile, care sunt puternic asociate cu fierul feric, care face parte din situsul catalitic al enzimei hemice - citocrom oxidaza. Blocarea acestei enzime oprește lanțul respirator și celula moare. Inhibitorii de enzime necompetitivi includ ionii de metale grele și compușii lor organici. Prin urmare, ionii de metale grele de mercur, plumb, cadmiu, arsen și altele sunt foarte toxici. Ele blochează, de exemplu, grupările SH incluse în situsul catalitic al enzimei.

Inhibitorii necompetitivi sunt cianurile, care sunt puternic asociate cu fierul feric, care face parte din situsul catalitic al enzimei hemice - citocrom oxidaza. Blocarea acestei enzime oprește lanțul respirator și celula moare. Este imposibil de îndepărtat acțiunea unui inhibitor necompetitiv cu un exces de substrat (ca acțiune a unuia competitiv), dar numai cu substanțe care leagă inhibitorul - reactivatori.

Inhibitorii necompetitivi sunt utilizați ca agenți farmacologici, substanțe toxice pentru combaterea dăunătorilor în agricultură și în scopuri militare. În medicină se folosesc preparate care conțin mercur, arsen, bismut, care inhibă necompetitiv enzimele din celulele corpului sau bacteriile patogene, ceea ce determină unul sau altul dintre efectele acestora. În caz de intoxicație, legarea otravii sau deplasarea acesteia din complexul enzimă-inhibitor este posibilă cu ajutorul reactivatorilor. Acestea includ toate complexele care conțin SH (cisteină, dimercaptopropanol), acid citric, acid etilendiaminotetraacetic etc.

Inhibarea necompetitivă

Acest tip de inhibiție este numit și inhibiție anticoncurențială în literatură. sau inhibiție asociată , cu toate acestea, termenul „inhibare necompetitivă” este cel mai utilizat. Caracteristica acestui tip de inhibiție este că inhibitorul nu este capabil să se atașeze de enzimă, dar se atașează de complexul enzimă-substrat.

În cazul inhibiției necompetitive, complexul care conține inhibitorul este inactiv:

v i / V = ​​​​/ [E]

[E]T = [E] + +

/ v i = Ks / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

inhibarea substratului

Inhibarea substratului este inhibarea unei reacții enzimatice cauzată de un exces de substrat. O astfel de inhibare are loc datorită formării unui complex enzimă-substrat care nu este capabil să sufere transformări catalitice.Complexul ES 2 este neproductiv și face molecula de enzimă inactivă. Inhibarea substratului este cauzată de un exces de substrat, prin urmare, acesta este îndepărtat atunci când concentrația acestuia scade.

Inhibarea alosterică

Reglarea alosterică este caracteristică doar pentru un grup special de enzime cu structură cuaternară, care au centre de reglare pentru legarea efectorilor alosterici. Efectorii negativi care inhibă conversia substratului în situsul activ al enzimei acționează ca inhibitori alosterici. Efectorii alosterici pozitivi, dimpotrivă, accelerează reacția enzimatică și, prin urmare, sunt numiți activatori alosterici. Efectori alosterici ai enzimelor sunt cel mai adesea diverși metaboliți, precum și hormoni, ioni metalici și coenzime. În cazuri rare, moleculele de substrat joacă rolul unui efector alosteric al enzimelor.

Mecanismul de acțiune al inhibitorilor alosterici asupra enzimei este modificarea conformației situsului activ. Scăderea vitezei reacției enzimatice este fie o consecință a unei creșteri a Km, fie a unei scăderi a vitezei maxime V max la aceleași concentrații de substrat saturat, adică. enzima este parțial inactivă.

Enzimele alosterice diferă de alte enzime prin curba lor specifică în formă de S a vitezei de reacție în funcție de concentrația substratului. Această curbă este similară cu curba de saturație în oxigen a hemoglobinei; indică faptul că centrii activi ai subunităților nu funcționează autonom, ci cooperant, adică. afinitatea fiecărui centru activ următor pentru substrat este determinată de gradul de saturație al centrilor anteriori. Munca coordonată a centrelor este determinată de efectori alosterici.

Reglarea alosterică se manifestă sub formă de inhibare de către produsul final al primei enzime din lanț. Structura produsului final după o serie de transformări ale substanței inițiale (substrat) nu este similară cu substratul, astfel că produsul final poate acționa asupra enzimei inițiale a lanțului doar ca inhibitor alosteric (efector). În exterior, o astfel de reglare este similară cu reglarea prin mecanismul de feedback și vă permite să controlați producția produsului final, în cazul acumulării căreia se oprește activitatea primei enzime din lanț. De exemplu, aspartat carbamoiltransferaza (ACTaza) catalizează prima dintre cele șase reacții în sinteza citidin trifosfat (CTP). CTP este un inhibitor alosteric de AKTază. Prin urmare, atunci când CTP se acumulează, are loc inhibarea AKTazei și sinteza ulterioară a CTP se oprește. S-a descoperit reglarea alosterică a enzimelor cu ajutorul hormonilor. De exemplu, estrogenii sunt un inhibitor alosteric al enzimei glutamat dehidrogenază, care catalizează dezaminarea acidului glutamic.

Astfel, chiar și cea mai simplă ecuație cinetică pentru o reacție enzimatică conține mai mulți parametri cinetici, fiecare dintre care depinde de temperatura și mediul în care are loc reacția.

Inhibitorii fac posibilă nu numai înțelegerea esenței catalizei enzimatice, ci și un fel de instrument pentru studierea rolului reacțiilor chimice individuale, care pot fi oprite în mod specific cu ajutorul unui inhibitor al unei anumite enzime.

3. Unele dispozitive utile pentru determinarea vitezei de reacție inițiale

Multe probleme de cinetică enzimatică duc la determinarea vitezelor inițiale de reacție (v 0). Principalul avantaj al acestei metode este că valorile lui v0 determinate la momentul inițial de timp vor oferi cea mai precisă reprezentare a activității enzimelor studiate, deoarece produsele de reacție care se acumulează nu au încă timp să exercite un efect inhibitor. efect asupra enzimei și, în plus, a sistemului de reacție este într-o stare de echilibru staționar.

În practica de laborator, totuși, atunci când se utilizează tehnici convenționale spectrofotometrice, titrimetrice sau alte tehnici pentru înregistrarea progresului unor astfel de reacții, în cel mai bun caz, până la 15-20 de secunde de la momentul inițial pentru introducerea enzimei în substrat, amestecarea sistemului de reacție, se pierde instalarea celulei etc. Și acest lucru este inacceptabil, deoarece în acest caz tangenta este adusă în punctul în care tg ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без amestecarea constantă este complicată și de fluctuațiile concentrațiilor de reactivi în volum.

Dispozitivele simple propuse mai jos pentru un spectrofotometru, un pH-metru și altele asemenea fac posibilă reducerea semnificativă a surselor erorilor indicate în determinarea v 0 .

3.1 Dispozitiv la spectrofotometru

Dispozitivul pentru spectrofotometru constă dintr-un distribuitor 1, un fir de teflon rotativ 2 (un agitator) și un capac de fixare 3.

Dozatorul este o micropipetă, al cărei capăt este format cu un ac 4, celălalt - cu un lărgire 5 (pentru a preveni intrarea enzimei în vârful de cauciuc 6).

Capacul din teflon 3 care acoperă cuva spectrală 7 are două orificii: unul (8) în centrul capacului, al doilea (9) deasupra mijlocului golului dintre peretele opac al cuvei 7 și fasciculul luminos 10. Teflon tubul 11 ​​(diametrul interior 1 -1,5 mm) este fixat la un capăt în orificiul 9, celălalt - pe o margine fixă ​​12 în fața rotorului motorului 13. Filetul de teflon 2 este introdus în interiorul tubului (grosimea firului 0,5-0,6 mm). ). Un capăt al firului este fixat pe rotorul rotativ al motorului 13, al doilea - trecut în cuva 7 - este modelat sub formă de spirală (pentru a îmbunătăți amestecarea). Poziția filetului este determinată de capacul de fixare 3, indiferent de distanța motorului, ceea ce este convenabil atunci când se lucrează care necesită schimbări frecvente de cuve.

Principiul de funcționare. Cuva de cuarț a spectrofotometrului 7 este umplută cu substratul 14 (aproximativ 1,5-2,0 ml), introdus în suportul de cuvetă termostatic al spectrofotometrului, închis cu un capac 3 cu fir de teflon rotativ 2, care este scufundat în substratul 14, iar toate operațiunile ulterioare sunt efectuate deja în fasciculul de lumină al spectrofotometrului și înregistrate pe înregistrator.

La începutul lucrării, substratul este amestecat, iar stiloul reportofonului scrie o linie plată orizontală (sau „zero”). Dozatorul (cu enzima) este introdus în orificiul 8 (acul este scufundat în soluția de substrat 14), prin strângerea rapidă a vârfului 6, enzima (de obicei aproximativ 0,03-0,05 ml) este introdusă în substrat, iar dozatorul este eliminat. Amestecarea componentelor se termină în 2,5-3 s, iar stiloul înregistratorului fixează începutul reacției prin devierea curbei densității optice (ΔA) în funcție de timp.

Un astfel de dispozitiv face, de asemenea, posibilă prelevarea de probe din sistemul de reacție pentru analiză; adăugați inhibitori și activatori în sistem; modificați condițiile de reacție (modificați pH-ul, tăria ionică etc.) fără a perturba înregistrarea cursului de reacție, ceea ce este foarte convenabil, de exemplu, atunci când se studiază divizarea n-NFF fosfataze „acide”, unde se scindează n-NFF se efectuează la pH 5,0 (sau pH 6-7), iar activitatea enzimelor este determinată de acumulare n-ioni nitrofenolat la pH 9,5-10,0.

Un astfel de dispozitiv este, de asemenea, convenabil pentru efectuarea titrarii spectrofotometrice a enzimelor etc.

3.2 Dispozitiv pentru pH-metru

Dispozitivul pentru pH-metru constă dintr-un vârf modificat al electrodului de curgere 1, o semi-microcelulă 2, un distribuitor 3 și un circuit electronic pentru conectarea pH-metrului la înregistrator. În plus, dispozitivul include un electrod de pH-metru standard (4), un capac de suport pentru celule (5), o cameră de curgere termostatică (6), o soluție de substrat (7), un magnet pasiv (8) și un magnet activ ( 9).

Vârful standard al electrodului de debit al pH-metrului (LPU-01) este înlocuit cu un tub de teflon 1 (diametru interior 1,3-1,5 mm), umplut cu fir de azbest, pretratat cu o soluție saturată de KCl. Densitatea de umplere a firului este controlată astfel încât debitul soluției de KCl prin tub să fie aproape de debitul electrodului original nemodificat. Această înlocuire a vârfului face posibilă reducerea dimensiunii celulei de lucru inițiale de la 20-25 la 2 ml, ceea ce face posibilă gestionarea cu volume minime (1,5 ml) de soluții de preparate biochimice scumpe.

Circuitul electronic pentru conectarea pH-metrului (LPU-01) la reportofon constă dintr-o sursă de alimentare (baterie DC 12 V), o rezistență variabilă a firului R 1 (10 - 100 Ohm), care stabilește o tensiune de 9 V la Dioda zener D809 în funcție de citirea voltmetrului, o rezistență variabilă a firului R 2 (15-150 Ohm), care reglează setarea „zero” (punctul de referință) a citirilor pH-metrului pe scara reportofonului și un fir variabil rezistența R 3 (35-500 Ohm), care reglează scara de expansiune (amplificare) a citirilor scalei pH - contoare de pe reportofon. Circuitul funcționează fiabil până când tensiunea sursei scade sub 9 V.

Principiul de funcționare.În celulă se introduc 1,5 ml de substrat (un cilindru de sticlă de 1,7x2,4 cm), iar celula este fixată pe capacul de fixare 5. Se pornește agitarea 9, iar stiloul reportofonului scrie un uniform (de bază) nota de subsol. Cu ajutorul unui dozator se introduc în substrat 0,03 ml de soluție de enzimă, iar stiloul înregistratorului fixează începutul reacției prin devierea curbei pH-ului în funcție de timp (t).

Un astfel de dispozitiv nu înlocuiește o statistică de pH, dar ținând cont de posibilitatea extinderii scalei pH-metrului, vă permite să înregistrați în mod fiabil modificări minore ale pH-ului 0,004-0,005.

3.3 Rigle de nomogramă, convenabile pentru determinarea vitezei inițiale

O complexitate considerabilă a determinării vitezei inițiale în metoda tangentelor este calculul rapoartelor modificărilor concentrațiilor de reactivi (Δ[S]) pe unitatea de timp (Δt), adică. expresia v 0 în M/min din condiţiile care

v 0 = lim Δ[S] / Δt, at, t 0.

În practică, o astfel de procedură constă de obicei din trei sau patru operații separate: o tangentă este trasă la secțiunea inițială a curbei de reacție, apoi numărul de unități ale valorii înregistrate (densitate optică, unghi de rotație etc.) pe un anumit intervalul de timp este numărat, iar aceasta duce la unitatea de timp și, în final, se recalculează citirile înregistratorului pentru modificarea concentrației reactivului timp de 1 min (M/min). Cele două tipuri de rigle de nomogramă propuse fac posibilă simplificarea acestei proceduri.

Riglă dreptunghiulară. v 0 este raportul Δ[S]/Δt, adică. tg ά, unde ά este unghiul de înclinare al tangentei la axa timpului t. Aceeași tangentă este și ipotenuza triunghiului dreptunghic corespunzător cu catetele [S] și t. Cu cât v 0 este mai mare, cu atât panta tangentei este mai abruptă. Prin urmare, dacă ne limităm la un anumit interval de timp, de exemplu 1 min, atunci vom obține o serie de triunghiuri dreptunghiulare cu valori diferite ale catetei [S] (de fapt, valori diferite ale lui v 0) . Dacă, totuși, ambele picioare sunt gradate: orizontal - în unități de referință de timp (1 min), și vertical - în unități de modificare a concentrațiilor de reactiv, de exemplu, în milimoli (mM), și aplicați segmentele rezultate într-un format adecvat dintr-un material transparent (plexiglas de aproximativ 2 mm grosime), atunci puteți obține o riglă convenabilă pentru determinarea vitezei de reacție inițiale. Toate numerele și liniile sunt imprimate pe reversul riglei pentru a elimina erorile de paralaxă la determinarea v 0 .

Procedura de determinare a v 0 se reduce în acest caz la două operații simple: se trasează o tangentă la secțiunea inițială a curbei cinetice t 2 și combină punctul zero al catetei orizontale t al riglei cu începutul tangentei, continuarea tangentei va traversa acum scara de concentrare [S] în punctul care determină valoarea lui v 0 în M/min (când piciorul t este orizontal, nu sunt necesare operații suplimentare.

Linia arcului. Procedura de determinare a v 0 poate fi simplificată la o singură operație dacă scara de concentrație este trasată de-a lungul unui arc de o anumită rază.

O linie dreaptă („de bază”) 2 este aplicată pe o placă de material transparent (toate numerele și liniile sunt aplicate și pe reversul riglei) și din punctul zero (t=0, min) al acestei linii cu un raza egala cu lungimea piciorului t=1 min [ , desenați un arc [S], de sus în jos, de-a lungul căruia este așezată scara modificărilor concentrațiilor reactivului (de exemplu, substrat în mM).

Tipurile de rigle descrise, un dispozitiv pentru un spectrofotometru și un pH-metru sunt folosite de câțiva ani pentru a determina vitezele inițiale de reacție (v 0), în studiul specificității substratului enzimelor, pentru titrarea spectrofotometrică etc.

Concluzie

În această lucrare s-a luat în considerare o secțiune de enzimologie care studiază dependența vitezei reacțiilor chimice catalizate de enzime de o serie de factori de mediu. Fondatorii acestei științe sunt considerați a fi Michaelis și Menten, care și-au publicat teoria mecanismului general reacții enzimatice, a derivat o ecuație care a devenit principiul fundamental al tuturor studiilor cinetice ale enzimelor, ea servește drept punct de plecare pentru orice descriere cantitativă a acțiunii enzimelor. Ecuația originală Michaelis-Menten este o ecuație hiperbolică; Lineweaver și Burke și-au adus contribuția la cinetică, care au transformat ecuația Michaelis-Menten și au obținut un grafic al unei linii drepte, din care valoarea lui V max poate fi determinată cel mai precis.

În timp, modificarea vitezei reacției enzimatice în reacția enzimatică în condiții experimentale scade. O scădere a ratei poate apărea din cauza unui număr de factori: o scădere a concentrației substratului, o creștere a concentrației unui produs care poate avea un efect inhibitor, modificări ale pH-ului soluției și modificări ale poate apărea temperatura mediului. Astfel, pentru fiecare creștere cu 10°C a temperaturii, viteza de reacție se dublează sau chiar mai puțin. Temperatura scăzută inactivează reversibil enzimele. Dependența vitezei reacției enzimatice de pH indică starea grupelor funcționale ale centrului activ al enzimei. Fiecare enzimă reacționează diferit la modificările pH-ului. Reacțiile chimice pot fi oprite acționând asupra lor cu diferite tipuri de inhibiție. Viteza de reacție inițială poate fi determinată rapid și precis cu ajutorul unor dispozitive precum rigle de nomogramă, un dispozitiv spectrofotometru și un pH-metru. Aceasta permite reprezentarea cât mai exactă a activității enzimelor studiate.

Toate acestea sunt utilizate în mod activ astăzi în practica medicală.

Lista surselor utilizate

1. Belyasova N.A. Biochimie și biologie moleculară. - Minsk: casa de carte, 2004. - 416 p., ill.

Keleti T. Fundamentele cineticii enzimatice: Per. din engleza. - M.: Mir, 1990. -350 p., ill.

3. Knorre D.G. Chimie biologică: Proc. pentru chimie, biol. si miere. specialist. universități. - Ed. a 3-a, Rev. - M.: Mai sus. şcoală 2002. - 479 p.: ill.

4. Krupyanenko V.I. Metoda vectoriala pentru reprezentarea reactiilor enzimatice. - M.: Nauka, 1990. - 144 p.

5. Lehninger A. Biochimie. Bazele moleculare ale structurii și funcției celulei: Per. din engleza. - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Chimie biologică: un manual pentru farmacie. in-tov și pharmac. fals. Miere. în-tovarăș. - M.: Şcoala superioară, 1986. - 479 p., ill.

Severin E.S. Biochimie. A. - Ed. a 5-a. - M.: GEOTAR - Media, 2009. - 786 p., ill.